JP5307538B2 - Ugt1a1遺伝子増幅用プライマーセット、それを含むugt1a1遺伝子増幅用試薬およびその用途 - Google Patents
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Description
PMID:11156391 Cancer Res. 2000 Dec 15;60(24):6921−6.
プライマーセット(1)
下記(F1)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記(R1)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F1)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における2120番目のアデニン塩基(A)を1塩基目として5’方向に向かって18〜22塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基(A)を3’末端とするオリゴヌクレオチド、
および、
配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における2140番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として5’方向に向かって18〜34塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基(C)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(R1)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における2226番目のグアニン塩基(G)を1塩基目として3’方向に向かって17〜27塩基目までの領域に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記2226番目のグアニン塩基(G)に相補的なシトシン塩基(C)を3’末端とするオリゴヌクレオチド、
および、
配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における2198番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として3’方向に向かって22〜39塩基目までの領域に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記2198番目のシトシン塩基(C)に相補的なグアニン塩基(G)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
プライマーセット(2)
下記(F2)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記(R2)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F2)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における2622番目のグアニン塩基(G)を1塩基目として5’方向に向かって15〜27塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニン塩基(G)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
(R2)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における2687番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として3’方向に向かって17〜26塩基目までの領域に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記2687番目のシトシン塩基(C)に相補的なグアニン塩基(G)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
プライマーセット(3)
下記(F3)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記(R3)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F3)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における1863番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として5’方向に向かって17〜31塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基(C)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
(R3)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における1928番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として3’方向に向かって16〜20塩基目までの領域に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記1928番目のシトシン塩基(C)に相補的なグアニン塩基(G)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
(I)試料中の核酸を鋳型として、本発明のUGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、反応液中で、前記UGT1A1遺伝子の増幅を行う工程
(i)本発明の増幅産物の製造方法により、UGT1A1遺伝子における検出対象部位を含む領域を反応液中で増幅させる工程
(ii)前記(i)工程における増幅産物と、前記検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブとを含む反応液を準備する工程
(iii)前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
(iv)温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の多型を決定する工程
本発明のUGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットは、前述のように、前記プライマーセット(1)〜(3)からなる群から選択された少なくとも1つのプライマーセットを含むことを特徴とする。少なくともいずれかのプライマーセットを含むことによって、例えば、UGT1A1遺伝子における特定の目的領域を特異的に増幅することが可能である。
(F1)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における2120番目のアデニン塩基(A)を1塩基目として5’方向に向かって18〜22塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基(A)を3’末端とするオリゴヌクレオチド、
および、
配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における2140番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として5’方向に向かって18〜34塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基(C)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(R1)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における2226番目のグアニン塩基(G)を1塩基目として3’方向に向かって17〜27塩基目までの領域に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記2226番目のグアニン塩基(G)に相補的なシトシン塩基(C)を3’末端とするオリゴヌクレオチド、
および、
配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における2198番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として3’方向に向かって22〜39塩基目までの領域に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記2198番目のシトシン塩基(C)に相補的なグアニン塩基(G)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(F2)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における2622番目のグアニン塩基(G)を1塩基目として5’方向に向かって15〜27塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニン塩基(G)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
(R2)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における2687番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として3’方向に向かって17〜26塩基目までの領域に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記2687番目のシトシン塩基(C)に相補的なグアニン塩基(G)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
(F3)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における1863番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として5’方向に向かって17〜31塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基(C)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
(R3)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における1928番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として3’方向に向かって16〜20塩基目までの領域に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記1928番目のシトシン塩基(C)に相補的なグアニン塩基(G)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
本発明のUGT1A1遺伝子増幅用試薬は、前述のように、遺伝子増幅法によりUGT1A1遺伝子を増幅するための試薬であって、本発明のUGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットを含むことを特徴とする。本発明のUGT1A1遺伝子増幅用試薬は、本発明のプライマーセットを含むことが特徴であり、これ以外の組成等については何ら制限されない。
本発明の増幅産物の製造方法は、前述のように、遺伝子増幅法によりUGT1A1遺伝子の増幅産物を製造する方法であって、下記(I)工程を含むことを特徴とする。
(I)試料中の核酸を鋳型として、本発明のUGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、反応液中で、前記UGT1A1遺伝子の増幅を行う工程
本発明のUGT1A1遺伝子の多型解析方法は、UGT1A1遺伝子における検出対象部位の多型を解析する方法であって、下記(i)〜(iv)工程を含むことを特徴とする。
(i)本発明の増幅産物の製造方法により、UGT1A1遺伝子における検出対象部位を含む領域を反応液中で増幅させる工程
(ii)前記(i)工程における増幅産物と、前記検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブとを含む反応液を準備する工程
(iii)前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
(iv)温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の多型を決定する工程
配列番号1における2173番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として5’方向に向かって17〜25塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基を3’末端とするオリゴヌクレオチド
プローブ(2)
(2−1)配列番号1における2645番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として5’方向に向かって15〜22塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基を3’末端とするオリゴヌクレオチド、
および、
(2−2)配列番号1における2625番目のグアニン塩基(G)を1塩基目として3’方向に向かって17〜22塩基目までの領域に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニン塩基に相補的なシトシン塩基(C)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
プローブ(3)
配列番号1における1892番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として3方向に向かって25〜31塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基を3’末端とするオリゴヌクレオチド
UGT1A1*6用プローブ
5’−agagacaGagcattttacac−(Pacific Blue)−3’ (配列番号55)、または、
5’−gagacaGagcattttacac−(Pacific Blue)−3’ (配列番号56)
UGT1A1*27用プローブ
5’−ttattcccAgtatgcaacc−(TAMRA)−3’ (配列番号62)、または、
5’−gttgcatacTgggaataaac−(TAMRA)−3’ (配列番号102)
UGT1A1*28用プローブ
5’−(BODIPY FL)−ccaTATATATATATATAtaagtaggagag−3’ (配列番号69)
UGT1A1*6用プローブ
5’−agagacagagcattttacac−(Pacific Blue)−3’ (配列番号55)
UGT1A1*27用プローブ1
5’−ttattcccagtatgcaacc−(TAMRA)−3’ (配列番号62)
UGT1A1*27用プローブ2
5’−ttattcccagtatgcaacc−P−3’ (配列番号62)
UGT1A1*28用プローブ
5’−(BODIPY FL)−ccatatatatatatatataagtaggagag−P−3’ (配列番号69)
UGT1A1*6 F1プライマー
5'-agcagaggggacatgaaata-3' (配列番号4)
UGT1A1*6 R1プライマー
5'-aacattatgcccgagactaac-3' (配列番号13)
UGT1A1*27 F2プライマー
5'-agaactttctgtgcgacg-3' (配列番号21)
UGT1A1*27 R2プライマー
5'-cagatgcagagctcaatagg-3' (配列番号29)
UGT1A1*28 F3プライマー
5'-gtcacgtgacacagtcaaac-3' (配列番号42)
UGT1A1*28 R3プライマー
5'-cctttgctcctgccagag-3' (配列番号48)
10mM Tris−HCl(pH8)、0.1mM EDTA、0.05% NaN3、0.3% SDS
(希釈液B)
10mM Tris−HCl(pH8)、0.1mM EDTA、0.05% NaN3
UGT1A1*6用プローブ
5’−gagacagagcattttacac−(Pacific Blue)−3’ (配列番号56)
UGT1A1*27用プローブ
5’−gttgcatacTgggaataaac−(TAMRA)−3’ (配列番号102)
UGT1A1*28用プローブ
5’−(BODIPY FL)−ccatatatatatatatataagtaggagag−P−3’ (配列番号69)
UGT1A1*6 F1プライマー
5'-tgaaatagttgtcctagcacctgacgc-3' (配列番号81)
UGT1A1*6 R1プライマー
5'-caaaagactctttcacatcctccctttgg-3' (配列番号91)
UGT1A1*27 F2プライマー
5'-ccttttcacagaactttctgtgcgacg-3' (配列番号92)
UGT1A1*27 R2プライマー
5'-gccagacagatgcagagctcaatagg-3' (配列番号98)
UGT1A1*28 F3プライマー
5'-agctttttatagtcacgtgacacagtcaaac-3' (配列番号123)
UGT1A1*28 R3プライマー
5'-cgcctttgctcctgccagag-3' (配列番号46)
Claims (14)
- UGT1A1遺伝子の多型を検出するためのプローブであって、
下記(3)のオリゴヌクレオチドからなるプローブを含むことを特徴とするプローブ。
(3)配列番号69の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド - 前記プローブが、蛍光標識化プローブである、請求項1記載のプローブ。
- UGT1A1遺伝子の多型を検出するための試薬であって、
請求項1または2記載のプローブを含むことを特徴とする試薬。 - さらに、下記(2−1)のオリゴヌクレオチドからなるプローブおよび下記(2−2)のオリゴヌクレオチドからなるプローブの少なくとも一方を含む、請求項3記載の試薬。
(2−1)配列番号62の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、
(2−2)配列番号102の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド - さらに、プライマーセットを含む、請求項3または4のいずれか一項に記載の試薬。
- 前記プライマーセットが、下記プライマーセット(3)である、請求項5記載の試薬。
プライマーセット(3)
下記(F3)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記(R3)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F3)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における1863番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として5’方向に向かって17〜31塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基(C)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
(R3)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における1928番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として3’方向に向かって16〜20塩基目までの領域に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記1928番目のシトシン塩基(C)に相補的なグアニン塩基(G)を3’末端とするオリゴヌクレオチド - UGT1A1遺伝子における検出対象部位の多型を解析する方法であって、
下記(i)〜(iv)工程を含むことを特徴とする多型解析方法。
(i)試料中の核酸を鋳型として、UGT1A1遺伝子における検出対象部位を含む領域を反応液中で増幅させる工程
(ii)前記(i)工程における増幅産物と、請求項1または2記載のプローブとを含む反応液を準備する工程
(iii)前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
(iv)温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の多型を決定する工程 - 前記(i)工程において、増幅反応に先立って、前記反応液に、請求項1または2記載のプローブを添加する、請求項7記載の多型解析方法。
- 前記試料が、生体試料である、請求項7または8記載の多型解析方法。
- 前記生体試料が、全血である、請求項9記載の多型解析方法。
- 前記(ii)工程において、さらに、下記(2−1)のオリゴヌクレオチドからなるプローブおよび下記(2−2)のオリゴヌクレオチドからなるプローブの少なくとも一つを使用する、請求項7から10のいずれか一項に記載の多型解析方法。
(2−1)配列番号1における2645番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として5’方向に向かって15〜22塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基(C)を3’末端とするオリゴヌクレオチド、
および、
(2−2)配列番号1における2625番目のグアニン塩基(G)を1塩基目として3’方向に向かって17〜22塩基目までの領域に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニン塩基(G)に相補的なシトシン塩基(C)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド - 前記(i)工程において、下記プライマーセット(3)を用いて、反応液中で、前記UGT1A1の増幅を行う、請求項7から11のいずれか一項に記載の多型解析方法。
プライマーセット(3)
下記(F3)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記(R3)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F3)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における1863番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として5’方向に向かって17〜31塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基(C)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
(R3)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における1928番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として3’方向に向かって16〜20塩基目までの領域に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記1928番目のシトシン塩基(C)に相補的なグアニン塩基(G)を3’末端とするオリゴヌクレオチド - 前記プライマーセット(3)が、下記プライマーセット(3’)である、請求項12記載の多型解析方法。
プライマーセット(3’)
下記(F3’)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記(R3’)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F3’)配列番号42の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号123の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(R3’)配列番号46の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号48の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド - 前記(i)工程において、前記プライマーセット(3)と、下記プライマーセット(2)を用いて、反応液中で、前記UGT1A1の増幅を行う、請求項12または13記載の多型解析方法。
プライマーセット(2)
下記(F2)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記(R2)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F2)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における2622番目のグアニン塩基(G)を1塩基目として5’方向に向かって15〜27塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニン塩基(G)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
(R2)配列番号1の塩基配列からなるUGT1A1遺伝子における2687番目のシトシン塩基(C)を1塩基目として3’方向に向かって17〜26塩基目までの領域に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、前記2687番目のシトシン塩基(C)に相補的なグアニン塩基(G)を3’末端とするオリゴヌクレオチド
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