JP5294509B2 - シクロアストラゲノールモノグルコシド、その製造方法及び医薬用組成物としての使用 - Google Patents
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Description
すなわち、本発明は、
1.以下のステップを含むことを特徴とするシクロアストラゲノール−6−O−β−D−グルコシドの製造方法:
a.アストラガロサイドIV又は常法により調製したオウギエキスを原料として使用し、適当な溶媒を添加して、原料液を調製するステップであって、
原料がアストラガロサイドIVである場合、溶液中のアストラガロサイドIVの濃度が0.01〜1%W/Vであり、原料がオウギエキスである場合、エキス:溶液の比が1:2〜1:1000W:Vであるステップ;
b.加水分解酵素を添加し、一定温度で加水分解し、加水分解液を得るステップであって、該加水分解酵素が、β−グリコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、並びにこれらの酵素のうちの1つとセルラーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ及びアミラーゼから選択される1又は2種以上の酵素との混合物から選択され;原料がアストラガロサイドIVである場合、原料と酵素の比が1:1〜1:50W:Wであり;原料がオウギエキスである場合,酵素と原料比が1:100〜10:1W:Wであるステップ;
c.前記加水分解液をマクロ多孔性吸着樹脂により分離するステップであって、原料がオウギエキスである場合、原料:樹脂の比が1:20〜4:1g:mlであり;原料がアストラガロサイドIVである場合、原料:樹脂の比が0.1:1〜20:1mg:mlであるステップ;及び
d.分離した前記産物を精製するステップ、
2.ステップaにおいて、原料がアストラガロサイドIVの場合、溶液中のアストラガロサイドIVの濃度が0.01〜0.5%W/Vであることを特徴とする、上記1に記載の方法、
3.溶液中のアストラガロサイドIVの濃度が、0.01〜0.1%W/Vであることを特徴とする、上記2に記載の方法、
4.ステップaにおいて、原料がオウギエキスである場合、エキス:溶液の比が1:15〜1:1000W:Vであることを特徴とする、上記1〜3のいずれかに記載の方法、
5.ステップbにおいて、加水分解酵素がβ−グリコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、又はキシラナーゼであることを特徴とする、上記1〜4のいずれかに記載の方法、
6.加水分解酵素がキシラナーゼであることを特徴とする、上記5に記載の方法、
7.ステップbにおいて、原料がオウギエキスである場合、酵素と原料との比が1:50〜10:1W:Wであることを特徴とする、上記1〜6のいずれかに記載の方法、
8.ステップcにおいて、原料がオウギエキスである場合、原料:樹脂の比が1:10〜3:1g:mlであることを特徴とする、上記1〜7のいずれかに記載の方法、
9.ステップcにおいて、原料がアストラガロサイドIVの場合、原料:樹脂の比が2:1〜10:1mg:mlであることを特徴とする、上記1〜8のいずれかに記載の方法、
10.溶媒が、水、低級アルコール、及び含水低級アルコールから選択されることを特徴とする上記1〜9のいずれかに記載の方法、
11.低級アルコールが、炭素数1〜3の一価アルコールであることを特徴とする、上記10に記載の方法、
12.低級アルコールが、エタノール及びメタノールからなる群から選択されることを特徴とする、上記11に記載の方法、
13.低級アルコールがエタノールであることを特徴とする、上記12に記載の方法、
14.原料液中のアルコール濃度が1〜30%V/Vであることを特徴とする上記1〜13のいずれかに記載の方法、
15.原料溶液中のアルコール濃度が、5〜20%V/Vであることを特徴とする、上記14に記載の方法、
16.加水分解が、40〜55℃の一定温度で、12〜72時間行われ、その溶液の適宜なPH値が4〜7であることを特徴とする上記1〜15のいずれかに記載の方法、
17.加水分解が、48〜72時間行われることを特徴とする、上記16に記載の方法、
18.以下のステップを含む工程により分離を行うことを特徴とする上記1〜17のいずれかに記載の方法:
加水分解液をスチレン骨格を有するマクロ多孔性吸着樹脂に供し、まず1〜2カラム体積の水、次に1〜2カラム体積の0.5〜2%のアルカリ性溶液、その次に1〜3カラム体積の20〜40%エタノール水溶液、最後に1〜3カラム体積の70〜95%のエタノールで溶出し、高濃度のエタノールで溶出した溶出液部分を回収し、その後減圧濃縮するステップ、
19.以下のステップを含む工程により精製を行うことを特徴とする上記1〜18のいずれかに記載の方法:
分離された産物を濾過し、低級アルコール又は含水低級アルコールに再溶解し、濾過し、濾過液を濃縮して結晶が析出するまで放置し、濾過して結晶を得た後、それを低級アルコール又は含水アルコールで再結晶を行い、95%を超える純度のシクロアストラゲノール6−O−β−D−グルコシドを得るステップ、
20.再結晶用の低級アルコールが、炭素数1〜5の一価アルコール及び多価アルコールからなる群から選択されることを特徴とする、上記19に記載の方法、
21.再結晶用の低級アルコールが、メタノール及びエタノールからなる群から選択されることを特徴とする、上記20に記載の方法、
22.治療有効量のシクロアストラゲノール6−O−β−D−グルコシドと医薬的に許容されるアジュバントとを含む、シクロアストラゲノール−6−O−β―D―グルコシド注射剤であって、
バイアル注射剤、点滴液又は注射用凍結乾燥粉末であり、
注射用凍結乾燥粉末におけるシクロアストラゲノール6−O−β−D−グルコシドと医薬的に許容されるアジュバントの重量比が1:10〜1:200である注射剤、
23.バイアル注射剤中のシクロアストラゲノール6−O−β−D−グルコシドの濃度が、0.01%〜1%g/100mlであることを特徴とする、上記22に記載の注射剤、
24.点滴液中のシクロアストラゲノール6−O−β−D−グルコシドの濃度が、0.001%〜0.1%g/100mlであることを特徴とする、上記22に記載の注射剤、
25.医薬組成物がバイアル注射剤である場合、注射用蒸留水の他に、適切な割合の、グルコース、塩化ナトリウム、ソルビトール及びリン酸塩から選択される医薬的に許容されるアジュバント;エタノール、グリセリン及びプロパンジオールから選択される有機溶媒;又は注射用PEG及びヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンから選択される共溶媒;をさらに含み;点滴液である場合、注射用蒸留水の他に、必要に応じて添加されるグルコース、塩化ナトリウム及び/又は等張剤をさらに含み;注射用の凍結乾燥粉末である場合、適切な割合の凍結乾燥支持剤をさらに含むことを特徴とする、上記22〜24のいずれかに記載の注射剤、
26.凍結乾燥支持剤が、マンニトール、グルコース、ソルビトール、塩化ナトリウム、デキストラン、シュクロース、ラクトース、加水分解ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテルシクロデキストリン、ポロキサマー及びポリエチレングリコールの1、又は2以上の組合せからなる群から選択されることを特徴とする、上記25に記載の注射剤、
27.凍結乾燥支持剤が、マンニトール、ラクトース、又はマンニトール−ラクトース組成物であり、該マンニトール−ラクトース組成物中のマンニトールとラクトースとの重量比が10:1〜1:1であることを特徴とする、上記26に記載の注射剤、
28.マンニトール−ラクトース組成物中のマンニトールとラクトースとの重量比が5:1〜1:1であることを特徴とする、上記27に記載の注射剤、
29.注射用の凍結乾燥粉末におけるシクロアストラゲノール−6−O−β−D−グルコシドと医薬的に許容されるアジュバントとの重量比が、1:50〜1:200であることを特徴とする、上記22〜28のいずれかに記載の注射剤、
30.注射用の凍結乾燥粉末におけるシクロアストラゲノール−6−O−β−D−グルコシドと医薬的に許容されるアジュバントとの重量比が、1:100〜1:150であることを特徴とする、上記29に記載の注射剤、
31.バイアル注射剤におけるシクロアストラゲノール−6−O−β−D−グルコシドの濃度が、0.01〜0.2%g/100mlであることを特徴とする、上記22〜30のいずれかに記載の注射剤、
32.点滴液におけるシクロアストラゲノール−6−O−β−D−グルコシドの濃度が、0.002〜0.05g/100mlであることを特徴とする、上記22〜31のいずれかに記載の注射剤、
33.凍結乾燥支持剤が、デキストラン、ポリエチレングリコール−マンニトール、又はデキストラン−ポリエチレングリコール−マンニトール組成物であることを特徴とする、上記25〜32のいずれかに記載の注射剤、
34.凍結乾燥支持剤が、ポリエチレングリコール−マンニトール組成物であることを特徴とする、上記33に記載の注射剤、
35.ポリエチレングリコールが、ポリエチレングリコール200−600であり、ポリエチレングリコール−マンニトール組成物におけるポリエチレングリコール:マンニトールの重量比が1:1〜1:10であることを特徴とする上記33又は34に記載の注射剤、
36.ポリエチレングリコールが、ポリエチレングリコール400であり、ポリエチレングリコール−マンニトール組成物におけるポリエチレングリコール:マンニトールの重量比が1:1〜1:5であることを特徴とする上記35に記載の注射剤、
37.凍結乾燥粉末注射剤が、以下のステップで調製されることを特徴とする、上記22〜36のいずれかに記載の注射剤:
a.所定量のサンプルを0.1〜0.5%の活性炭素で処理した溶媒に溶解するステップ;
b.ステップaのサンプル溶液を0.1〜0.5%の活性炭素で処理した凍結乾燥支持剤溶液に攪拌しながら滴加するステップ;及び
c.所定量まで水を添加し、メンブレン濾過し、サブパッケージし、凍結乾燥するステップ、
38.ステップaの溶媒が、所定量の溶液の全体量に対して1〜10%のエタノール、プロパンジオール又はポリエチレングリコールであることを特徴とする、上記37記載の注射剤、
39.心臓血管疾患の治療薬の調製における、シクロアストラゲノール−6−O−β−D−グルコシドの使用、
に関する。
a.アストラガロサイドIV又は常法により調製したオウギエキスを原料として使用し、適当な溶媒を添加して、原料液を調製するステップ;
b.加水分解酵素を添加し、一定温度で加水分解し、加水分解液を得るステップ;
c.前記加水分解液をマクロ多孔性吸着樹脂により分離するステップ;及び
d.分離した前記産物を精製するステップ。
上記溶媒は、水、低級アルコール、含水低級アルコールからなる群より選択される。前記低級アルコールは、好ましくは炭素数1〜3の一価アルコールから選択され、より好ましくはエタノール及びメタノールから選択され、さらに好ましくはエタノールである。原料が、アストラガロサイドIV、或いは水に溶けにくいエキスである場合には、可溶化するために原料に適切な濃度の低級アルコールを組み入れ、加水分解の効率を高める必要がある。本発明の医薬組成物中の低級アルコールの最終濃度は好ましくは1〜30%(V/V)であるが、さらに好ましくは5〜20%(V/V)である。
加水分解液をスチレン骨格を有するマクロ多孔性吸着樹脂に供し、まず1〜2カラム体積の水、次に1〜2カラム体積の0.5〜2%のアルカリ性溶液、その次に1〜3カラム体積の20〜40%エタノール水溶液、最後に1〜3カラム体積の70〜95%のエタノールで溶出し、高濃度のエタノールで溶出した溶出液部分を回収し、その後、白色沈殿物が視覚的に生じるよう、少量のエタノールを含む溶液、すなわちアルコールの臭いがしない溶液に減圧濃縮するステップであって、原料がエキスである場合、原料:樹脂の比が好ましくは1:20〜4:1g:ml、より好ましくは1:10〜3:1g:mlであり;原料がアストラガロサイドIVである場合、原料:樹脂の比が好ましくは0.1:1〜20:1mg:ml、より好ましくは2:1〜10:1mg:mlであるステップ。
分離して得られた白色沈殿物を濾過し、低級アルコールに再溶解し、濾過し、濾過液を濃縮して少しの濁度が観察されるまで濃縮し、結晶が析出するステップ;濾過して結晶を得て、それを低級アルコール又は含水アルコールで再結晶化し、95%を超える純度のシクロアストラゲノール6−O−β−D−グルコシドを得るステップ。ここで使用される低級アルコールは、好ましくは炭素数1〜5の一価アルコール及び多価アルコールから選択され、より好ましくはメタノール及びエタノールから選択される。
a.所定量のサンプルを0.1〜0.5%の活性炭素で処理した溶媒に溶解する。
b.aのサンプル溶液を0.1〜0.5%の活性炭素で処理した凍結乾燥支持剤の溶液に攪拌しながら滴下する。
c.所定量まで水を加え、メンブレン濾過し、サブパッケージし、凍結乾燥する。
以下、当業者の本発明の理解を深めるため、実施例を挙げ、本発明を詳しく説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
方法:Wistarラット(250〜280g)をクロラールハイドレート(360mg/kg;腹腔内)で麻酔した。舌下静脈からヘパリンナトリウム(1mg)を与え、ヘパリン化した。胸腔を切開し、心臓を迅速に摘出し、冷却したKrebs-Henselei (K−H)溶液に浸漬させた。ランゲンドルフ装置内で95%O2+5%CO2の混合物をバブリングしたK−H溶液で、大動脈を介して心臓に逆行的に74水柱cmで潅流した。心尖部に固定された縫合糸は、ポリグラフ(RM6300、日本光電社製)及びデータ取得ワークステーション(MP150、BIOPAC System社製)、コンピューターランニングアクノレッジ(computer running Acknowldge (version 3.7.1) に接続された張力変換器に接続した。
1.CMGが心拍数(HR)に及ぼす影響
CMG群とアストラガロサイドIV群の両方で心拍数が減少し、両者に有意差はなかった(表1)。
2.CMGが収縮性に及ぼす影響
CMG群とアストラガロサイドIV群の両方で収縮性が増強し、両者に有意差はなかった(表2)。
CMG群とアストラガロサイドIV群の両方で収縮性の変化率が増加したが、両者に有意差はなかった(表3)。
CMG群とアストラガロサイドIV群の両方で拡張力の変化率が増加したが、両者に有意差はなかった(表4)。
1.実験目的
静脈投与時に麻酔して胸を切開した犬における、心臓機能の様々な指標に対するアストラガロサイドIVと比較したCMGの影響を考察し、CMGのさらなる開発の根拠を提供することである。
2.1 薬剤と調製
(1)CMG注射液:無色透明な液体、0.35mg/mL−1、製造番号:041230。天津薬物研究院創新センターから提供。
(2)アストラガロサイドIV注射液:無色透明な液体、1.5mg/mL−1、製造番号:041323。天津薬物研究院創新センターから提供。
健康な雑種成犬を天津市郊区から購入した。
2.3 実験用機械
(1)RM−6300型8チャネルポリグラフレコーダー(日本光電社製)
(2)MFV−3200型電磁血液流量計(日本光電社製)
(3)MP−100データ取得ワークステーション(BIOPAC社製)
(4)SC−3型電動呼吸器(上海第四医療機器社製)
ペントバルビタール30mg/kgを動物に静脈注射して麻酔した。気管挿管し、SC―3型電気呼吸器に連結し、陽性気圧で人工呼吸を行った。第IV肋間腔から左開胸し、心膜クレイドルに心臓を吊るし、大動脈基部を単離して、血流計のプローブ(直径12又は14mm)を固定し、心拍出量(CO)として大動脈血流を測定した。左冠動脈の回旋枝を単離し、血流計のプローブ(直径2又は2.5mm)を固定し、冠血流量(CBF)を測定した。心尖部を通してヘパリン生理食塩水を充填したPEカテーテルを左心室まで挿入し、左心室圧(LVP)及び左心室拡張末期圧(LVEDP)を測定した。LVPの陽性ピークと陰性ピークの第一変化(first derivatives)を(+LVdp/dt及び−LVdp/dt)をAknowledgeソフトウエアで計算した。大腿動脈を通して、PEカテーテルで、最大血圧(SBP)、最小血圧(DBP)及び平均動脈圧(MAP)を測定し、ECGIIは、AC−601GECG増幅器で測定した。上記アナログ信号をデータ取得ワークステーション(MP100、BIOPAC Systems)に入力し、Acknowledge(3.7.1バージョン)を使用したコンピュータに入力した。
CF=CBF×300/心臓重量
CR=MAP/CF
CI=CO/0.11×(体重)2/3
LVW=CO×(MAP−5)×1.052×0.0136
TPR=MAP×79.92/CO
データは
で表し、t検定で投薬前後の有意性を比較。対応のないt検定で2つの群の比較を行った。
4.1 CMGが血圧、心拍数に与える影響
CMGを0.15、0.3、及び0.6mg/kg投与後120分以内のSBP、DBP、MAP及びHRには有意差はなかった。アストラガロサイドIV投与後の血圧は、投与前と比較して有意な変化はなかったのに対し、心拍数は少し減少した。
同じ用量(0.3mg/kg)のASP−IIとアストラガロサイドIVの間に有意な差はなかった。
麻酔し、開胸した犬において対照溶剤を投与後120分以内にはLVP、LVEDP、LVW、LVdp/dtmaxに有意な変化はなかった。
LVP:CMGを0.15、0.3、0.6mg/kgの用量での静脈投与後には、左心室圧力に有意な変化はなかった。
LVEDP:CMGを0.15、0.3、0.6mg/kg投与後、LVEDPは用量依存的に低下し、LVEDPは、最大それぞれ1.1±0.4、1.5±0.8、2.1±0.5mmHg(p<0.01)ずつ低下し、この効果は2h以上持続した。
LVW:CMGを0.15、0.3、0.6mg/kg投与後、左心室機能に有意な変化はなかった。
±LVdp/dtmax:CMGを0.15mg/kg投与後、120分以内に±LVdp/dtmaxに有意な変化はなかった。LVdp/dtmaxは、CMGをそれぞれ0.3、0.6mg/kg投与後5〜10分後に最大12.0±5.0、22.6±11.8%(p<0.01)上昇したが、− LVdp/dtmaxには有意な変化はなかった。
アストラガロサイドIVの投与後、LVSP、LVW、−LVdp/dtmax には有意な変化はなく、+LVdp/dtmaxが著しく増加したが、LVEDPが著しく低下した。同じ用量(0.3mg/kg)のCMGとアストラガロサイドIVに有意な差はなかった。
生理食塩水を静脈内投与した麻酔し開胸した犬において、投与後120分以内にCO、CIとTPRに有意な変化はなかった。
CO、CI:CMGを0.15、0.3、0.6mg/kg静脈内に投与後、120分以内にCO、CIに有意な変化はなかった。
TPR:CMGを0.15、0.3、0.6mg/kg静脈内に投与後、120分以内に全抹消血抵抗に有意な変化はなかった。
麻酔し開胸した犬において、生理食塩水投与後120分以内にCF、CRに有意な変化はなかった。
CMGを0.15、0.3、0.6mg/kg静脈内投与後でも120分以内にCF、CRに有意な変化はなかった。
アストラガロサイドIVの静脈内投与後にも120分以内にCF、CRに有意な変化はなかった。
CMGを0.15mg/kgを一回投与した後は、LVEDP以外の各血液動態指標に有意な変化はなかった。0.3、0.6mg/kg投与群ではLVEDPが顕著に低下し、+LVdp/dtmaxが増加したが、他の血液動態指標には有意な変化はなかった。
コントロール薬剤のアストラガロサイドIVはLVEDPを顕著に低下させ、+LVdp/dtを上昇させたが、同じ用量のCMGに比べて麻酔し開胸した犬の各指標に与える影響に有意差はなかった。
Claims (18)
- 以下のステップを含むことを特徴とするシクロアストラゲノール−6−O−β−D−グルコシドの製造方法:
a.アストラガロサイドIV又は常法により調製したオウギエキスを原料として使用し、溶媒を添加して、原料液を調製するステップであって、
原料がアストラガロサイドIVである場合、溶液中のアストラガロサイドIVの濃度が0.01〜0.1%W/Vであり、原料がオウギエキスである場合、エキス:溶液の比が1:2〜1:1000W:Vであり、
前記溶媒が、水、低級アルコール、及び含水低級アルコールからなる群から選択される溶媒である、ステップ;
b.加水分解酵素を添加し、一定温度で加水分解し、加水分解液を得るステップであって、該加水分解酵素が、β−グリコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、並びにこれらの酵素のうちの1つとセルラーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ及びアミラーゼから選択される1又は2種以上の酵素との混合物から選択され;基質がアストラガロサイドIVである場合、基質と酵素の比が1:1〜1:50W:Wであり;
基質がオウギエキスである場合、酵素と基質の比が1:100〜10:1W:Wであるステップ;
c.前記加水分解液をマクロ多孔性吸着樹脂により分離するステップであって、原料がオウギエキスである場合、原料:樹脂の比が1:20〜4:1g:mlであり;原料がアストラガロサイドIVである場合、原料:樹脂の比が0.1:1〜20:1mg:mlであるステップ;及び
d.分離された前記産物を精製するステップ。 - ステップaにおいて、原料がオウギエキスである場合、エキス:溶液の比が1:15〜1:1000W:Vであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- ステップbにおいて、加水分解酵素がβ−グリコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、又はキシラナーゼであることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 加水分解酵素がキシラナーゼであることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- ステップbにおいて、原料がオウギエキスである場合、酵素と基質の比が1:50〜10:1W:Wであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- ステップcにおいて、原料がオウギエキスである場合、原料:樹脂の比が1:10〜3:1g:mlであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- ステップcにおいて、原料がアストラガロサイドIVの場合、原料:樹脂の比が2:1〜10:1mg:mlであることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 低級アルコールが、炭素数1〜3の一価アルコールであることを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 低級アルコールが、エタノール及びメタノールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 低級アルコールがエタノールであることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 原料溶液中のアルコール濃度が1〜30%V/Vであることを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 原料溶液中のアルコール濃度が、5〜20%V/Vであることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 加水分解が、40〜55℃の一定温度で、12〜72時間行われ、その溶液のpH値が4〜7であることを特徴とする請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 加水分解が、48〜72時間行われることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 以下のステップを含む工程により分離を行うことを特徴とする請求項1〜14のいずれかに記載の方法:
加水分解液をスチレン骨格を有するマクロ多孔性吸着樹脂に供し、まず1〜2カラム体積の水、次に1〜2カラム体積の0.5〜2%のアルカリ性溶液、その次に1〜3カラム体積の20〜40%エタノール溶液、最後に1〜3カラム体積の70〜95%のエタノールで溶出し、高濃度のエタノールで溶出した溶出液部分を回収し、その後減圧濃縮するステップ。 - 以下のステップを含む工程により精製を行うことを特徴とする請求項1〜15のいずれかに記載の方法:
分離された産物を濾過し、低級アルコール又は含水低級アルコールに再溶解し、濾過し、濾過液を濃縮して結晶が析出するまで放置し、濾過して結晶を得た後、それを低級アルコール又は含水低級アルコールで再結晶を行い、95%を超える純度のシクロアストラゲノール−6−O−β−D−グルコシドを得るステップ。 - 再結晶用の低級アルコールが、炭素数1〜5の一価アルコール及び多価アルコールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 再結晶用の低級アルコールが、メタノール及びエタノールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
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