JP5277439B2 - 核酸内包高分子ミセル複合体 - Google Patents

Description

本発明は、核酸を内包する高分子ミセル複合体に関する。詳しくは、細胞内での還元環境に応答して核酸を細胞内へ導入することができる非ウイルス型遺伝子ベクターとしての上記複合体に関する。

ヒトゲノムの解読が完了した現在、遺伝情報と病気との相関が解明されつつある。そのような中で、遺伝子を薬として用い、遺伝子レベルで治療を行う遺伝子治療は、これまで治療が困難であった種々の疾患に対する治療法として大きな期待が寄せられている。遺伝子治療の達成のためには、遺伝子を安定に標的部位へ輸送するベクターの開発が不可欠である。ベクターに求められている特性は、１）血中での安定性、２）細網内皮系による取り込みや腎***の回避、３）標的細胞への選択的取り込み、４）細胞質内へのスムーズな移行、５）低毒性などが挙げられる。つまり、標的細胞に取り込まれるまでは安定に遺伝子を内包するが、細胞（細胞質）に取り込まれた後はスムーズに遺伝子を放出するという、相反する２つの特性を兼ね備えている必要がある。感染能に優れたウイルスは、そのような特性を備えた遺伝子ベクターとしての性質を満たすものであるが、副作用の恐れという問題が伴うため、非ウイルス型の遺伝子ベクターに注目が集まっている。
非ウイルス型遺伝子ベクターとしては、これまでに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とポリカチオン（カチオン性のポリペプチド）から構成されるブロックコポリマーと、ポリアニオンであるＤＮＡとの間の静電的相互作用により形成されたミセル状のポイリオンコンプレンクス（ＰＩＣ）が報告されている（Ｓ．Ｋａｔａｙｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，８，７０２−７０７（１９９７）；Ｓ．Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７，２８１０−２８１１（２００５）を参照）。
このＰＩＣは、ＤＮＡが、ブロックコポリマー中のポリカチオン部分との相互作用により凝縮してコア部分を形成し、ブロックコポリマー中の親水性及び生体適合性に優れたＰＥＧ部分がコア部分の周囲にシェル部分を形成したような構造となっている。そのため、例えば血中でもＤＮＡを安定に内包することができる。しかも、粒径がウイルスと同程度（約１００ｎｍ）であるため、生体内の異物認識機構を回避することができる。さらに、ブロックコポリマー中のポリカチオンの側鎖に含まれるエチレンジアンミンユニット（−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ_２）が、２段階のｐＫａを有しているため、ＤＮＡとのコンプレックスが形成されながら、細胞内ではプロトンスポンジ効果によりエンドソームエスケープが促進されるという効果も有する。上記ＰＩＣは、このような特性により遺伝子発現効率の向上が図られたものである。

本発明が解決しようとする課題は、標的細胞に対してさらに高い遺伝子発現効率が得られるポリイオンコンプレックスを提供することにある。さらには、上記ポリイオンコンプレックスを用いた、細胞内への核酸送達デバイス及び核酸送達用キットを提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、ポリエチレングリコールとポリカチオンとをジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）させたブロックコポリマーを用いれば、得られるポリイオンコンプレックスは上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ポリエチレングリコール及びポリカチオンがジスルフィド基を介して結合したブロックコポリマーと、核酸とを含むことを特徴とする、ポリイオンコンプレックス。
本発明のポリイオンコンプレックスにおいて、前記ポリカチオンとしては、例えば、側鎖にカチオン性基を有するポリペプチドが挙げられる。また、前記ブロックコポリマーとしては、例えば、下記一般式（１）で示されるポリマーが挙げられる。

〔式中、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、
Ｒ^３は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、
Ｌ^１は、ＮＨ、ＣＯ、下記一般式（４）：
−（ＣＨ_２）_ｐ１−ＮＨ− （４）
（式中、ｐ１は１〜５の整数を表す。）
で示される基、又は下記一般式（５）：
−Ｌ^２ａ−（ＣＨ_２）_ｑ１−Ｌ^３ａ− （５）
（式中、Ｌ^２ａは、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ又はＣＯＯを表し、Ｌ^３ａは、ＮＨ又はＣＯを表す。ｑ１は１〜５の整数を表す。）
で示される基を表し、
ｍ１は３０〜１５０の整数を表し、ｍ２は１〜５の整数を表し、ｎは１００〜４００の整数を表す。〕
ここで、一般式（１）で示されるポリマー中の−Ｒ^３としては、例えば、下記一般式（２）：
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｒ−Ｘ^１ （２）
（式中、Ｘ^１は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、ｒは０〜５の整数を表す。）
で示される基、又は下記一般式（３）：
−〔ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｓ〕_ｔ−Ｘ^２ （３）
（式中、Ｘ^２は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。ｓ及びｔは、それぞれ独立し、かつ〔ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｓ〕ユニット間で独立して、ｓは１〜５の整数を表し、ｔは２〜５の整数を表す。）
で示される基が挙げられる。より具体的には、−Ｒ^３としては、例えば、−ＮＨ−ＮＨ_２又は−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ_２が挙げられる。
また、本発明のポリイオンコンプレックスとしては、例えば、前記ブロックコポリマー中のポリカチオン部分と前記核酸とが静電的相互作用により結合したものが挙げられ、さらに、前記核酸と前記ブロックコポリマー中のポリカチオン部分とがコア部分を形成し、前記ブロックコポリマー中のポリエチレングリコールを含む部分が前記コア部分の周囲にシェル部分を形成したものも挙げられる。
（２）上記（１）に記載のポリイオンコンプレックスを含むことを特徴とする、細胞内への核酸送達デバイス。
（３）ポリエチレングリコール及びポリカチオンがジスルフィド基を介して結合したブロックコポリマーを含む、細胞内への核酸送達用キット。
本発明のキットにおいて、上記ブロックコポリマーとしては、例えば、一般式（１）（前記と同様）で示されるポリマーが挙げられる。
（４）ポリエチレングリコール及びポリカチオンがジスルフィド基を介して結合したブロックコポリマー。
本発明のブロックコポリマーとしては、例えば、一般式（１）（前記と同様）で示されるものが挙げられる。
また、本発明の他の一態様としては、ポリエチレングリコール及びポリカチオンがジスルフィド基を介して結合したブロックコポリマーと、アニオン性物質とを含むことを特徴とするポリイオンコンプレックスを挙げることができる。この態様において、上記ブロックコポリマーとしては、例えば、一般式（１）（前記と同様）で示されるポリマーが挙げられる。

図１は、本発明のポリイオンコンプレックスの構造を示す平面概略図である。
図２は、ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２の合成過程におけるＧＰＣチャートを経時的に示す図である。
図３は、ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図４は、ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＢＬＡの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図５は、ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））のＧＰＣチャートを示す図である。
図６は、ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図７は、ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣのアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
図８は、各ＰＩＣのエチジウムブロマイドアッセイの結果を示すグラフである。
図９は、各ＰＩＣの粒径の測定結果を示すグラフである。
図１０は、各ＰＩＣのゼータ電位の測定結果を示すグラフである。
図１１は、各ＰＩＣを用いたトランスフェクションにおける遺伝子発現効率の評価結果を示すグラフである。

符号の説明

１ ブロックコポリマー（ＰＥＧ−ＳＳ−ポリカチオン）
２ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
３ ポリカチオン
４ 核酸
５ ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）

以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００６−０５４３３２号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての先行技術文献、並びに公開公報、特許公報及びその他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
１．本発明の概要
本発明者は、前述した従来のポリイオンコンプレックスにおける遺伝子発現効率を改善するためには、シェル部分を構成するブロックコポリマー中のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を、標的細胞内において分離させる必要があると考えた。これは、以下の知見に基づくものである。すなわち、ポリカチオン（ＰＥＧ部分無しのポリマー）と核酸とを用いて形成したポリイオンコンプレックスは、ＰＥＧ−ポリカチオンを用いて形成したポリイオンコンプレックスに比べて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞内に導入した場合、遺伝子発現効率が非常に高くなるというものである。
そこで本発明者は、細胞内でＰＥＧ部分が容易に分離するポリイオンコンプレックスとして、細胞外と細胞内での何らかの環境変化に応答してＰＥＧ部分が分離するポリイオンコンプレックスが最適ではないかと考えた。そして、細胞外と細胞内とではグルタチオンの濃度差による酸化還元環境の違いがあることに着目し（細胞外（約１０μＭ）：酸化的環境、細胞内（約１０ｍＭ）：還元的環境）、さらに、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）が還元的環境下において容易に開裂するという知見を利用して、ＰＥＧ部分を分離させる手段について検討した。
その結果、本発明者は、使用するブロックコポリマーとして、ＰＥＧとポリカチオンとをジスルフィド基を介して結合させたコポリマーを合成し、このブロックコポリマーと核酸とを用いて、コア−シェル型の構造を有するミセル状のポリイオンコンプレックスを調製した（図１を参照）。
得られたポリイオンコンプレックスは、血中等の細胞外では従来のものと同様にＰＥＧの効果によって構造安定性が保持され、細胞内に取り込まれた後は、還元的環境への変化に応答してジスルフィド結合が開裂しＰＥＧ部分が容易に分離した。ＰＥＧ部分の分離後は、内包された核酸と細胞内のポリアニオンとの置換が促進されて、ポリイオンコンプレックスが解離した。これにより、核酸が細胞質内へスムーズに放出され、遺伝子発現効率が飛躍的に向上した。
以上のように、ジスルフィド結合を有するブロックコポリマーと、核酸とから構成されたポリイオンコンプレックスは、細胞外から細胞内への環境変化に応答して効率的に核酸導入できるインテリジェント遺伝子ベクターとして極めて有用である。
２．ポリイオンコンプレックス
本発明のポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）は、ジスルフィド結合を有する特定のブロックコポリマーと、核酸とを含むことを特徴とする、ミセル状の核酸内包高分子複合体である。
（１）ブロックコポリマー
本発明のＰＩＣの構成成分である特定のブロックコポリマーは、ＰＥＧ及びポリカチオンを構成成分として含み、これらがジスルフィド基を介して結合したブロックコポリマーである。
上記ＰＥＧ及びポリカチオンとしては、その構造（例えば重合度）は限定されず、任意の構造のものを選択できるが、なかでもポリカチオンとしては、カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドであることが好ましい。なお、ここで言うカチオン性基とは、水素イオンが配位して既にカチオンとなっている基に限らず、水素イオンが配位すればカチオンとなる基も含む意味である。このようなカチオン性基としては、公知のものが全て含まれる。カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドとは、塩基性側鎖を有する公知のアミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン等）がペプチド結合してなるもののほか、各種アミノ酸がペプチド結合し、その側鎖がカチオン性基を有するように置換されたものも含む。
上記特定のブロックコポリマーとしては、具体的には、例えば、下記一般式（１）で示されるブロックコポリマーが好ましく挙げられる。

一般式（１）中、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表す。
上記炭素数１〜１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、デシル基及びウンデシル基等が挙げられる。
また上記アルキル基の置換基としては、例えば、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、炭素数２〜７のアシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基、及びトリアルキルシロキシ基（各アルキルシロキシ基は、それぞれ独立に、炭素数１〜６である）等が挙げられる。
上記置換基がアセタール化ホルミル基である場合、酸性の温和な条件下で加水分解することにより、他の置換基であるホルミル基（アルデヒド基；−ＣＨＯ）に転化することができる。また、上記置換基（特にＲ^１における置換基）がホルミル基、又はカルボキシル基若しくはアミノ基の場合は、例えば、これらの基を介して、抗体若しくはその断片又はその他の機能性若しくは標的指向性を有するタンパク質等を結合させることができる。
一般式（１）中、カチオン性基を含む部分となるＲ^３は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表す。−Ｒ^３基としては、例えば、下記一般式（２）又は下記一般式（３）で示される基が挙げられ、中でも下記一般式（３）で示される基が好ましい。
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｒ−Ｘ^１ （２）
〔式（２）中、Ｘ^１は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、ｒは０〜５の整数を表す。〕
−〔ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｓ〕_ｔ−Ｘ^２ （３）
〔式（３）中、Ｘ^２は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。ｓ及びｔは、それぞれ独立し、かつ〔ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｓ〕ユニット間で独立して、ｓは１〜５（好ましくは２）の整数を表し、ｔは２〜５（好ましくは２）の整数を表す。〕
一般式（２）及び（３）中、末端の−Ｘ^１基及び−Ｘ^２基（アミン化合物残基）としては、例えば、−ＮＨ_２、−ＮＨ−ＣＨ_３、−Ｎ（ＣＨ_３）_２、及び下記式（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）に示される基等が好ましく挙げられ、中でも−ＮＨ_２が特に好ましい。なお、下記式（ｖｉ）中、Ｙとしては、例えば、水素原子、アルキル基（炭素数１〜６）、及びアミノアルキル基（炭素数１〜６）等が挙げられる。

一般式（１）中、−Ｒ^３基としては、具体的には「−ＮＨ−ＮＨ_２」又は「−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ_２」が特に好ましく、中でもエチレンジアンミンユニットを含む後者がより好ましい。なお、上記「−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ_２」は、ｐＫａが６．０及び９．５という２段階を示し、コンプレックスを形成するｐＨ７．４では、ｇａｕｃｈｅ型のシングルプロトン化状態であるので（下記反応式１参照）、核酸と静電相互作用をすることができる。一方、エンドソーム内（ｐＨ５．５）では、上記「−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ_２」は、さらにプロトン化され、ａｎｔｉ型に変化するので（下記反応式１参照）、バッファー効果によるエンドソームエスケープを促進させる効果を有する。

一般式（１）中、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）とともにリンカー部分となるＬ^１は、ＮＨ、ＣＯ、下記一般式（４）：
−（ＣＨ_２）_ｐ１−ＮＨ− （４）
〔式（４）中、ｐ１は１〜５（好ましくは２〜３）の整数を表す。〕
で示される基、又は下記一般式（５）：
−Ｌ^２ａ−（ＣＨ_２）_ｑ１−Ｌ^３ａ− （５）
〔式（５）中、Ｌ^２ａは、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ又はＣＯＯを表し、Ｌ^３ａは、ＮＨ又はＣＯを表す。ｑ１は１〜５（好ましくは２〜３）の整数を表す。〕
で示される基を表す。
一般式（１）中、ｍ１及びｎは、各ブロック部分の繰り返し単位の数（重合度）を表す。具体的には、ｍ１は、３０〜１５０（好ましくは６０〜１００）の整数を表し、ｎは、１００〜４００（好ましくは２００〜３００）の整数を表す。また、ｍ２は、１〜５（好ましくは１〜２）の整数を表す。
以上より、一般式（１）で示されるポリマーは、以下の２つのブロック部分を必須構成要素とするポリマーであると言える。
・核酸と静電結合する側鎖を持つブロック部分（側鎖にカチオン性基を有する重合度ｍ１のブロック部分：ポリカチオン部分）
・親水性であり生体適合性に優れたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖からなるブロック部分（重合度ｎのブロック部分：ＰＥＧ部分）
一般式（１）で示されるブロックコポリマーの分子量（Ｍｗ）は、限定はされないが、２３，０００〜４５，０００であることが好ましく、より好ましくは２８，０００〜３４，０００である。また、個々のブロック部分については、ＰＥＧ部分の分子量（Ｍｗ）は、８，０００〜１５，０００であることが好ましく、より好ましくは１０，０００〜１２，０００であり、ポリカチオン部分の分子量（Ｍｗ）は、１５，０００〜３０，０００であることが好ましく、より好ましくは１８，０００〜２２，０００である。
一般式（１）で示されるポリマーの製造方法は、限定はされないが、例えば、Ｒ^１とＰＥＧ鎖のブロック部分とを含むセグメント（ＰＥＧセグメント）を予め合成しておき、このＰＥＧセグメントの片末端（Ｒ^１と反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖をカチオン性基を含むように置換又は変換する方法、あるいは、上記ＰＥＧセグメントと、カチオン性基を含む側鎖を有するブロック部分とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。
上記ＰＥＧセグメントは、例えば、ＷＯ９６／３２４３４号公報、ＷＯ９６／３３２３３号公報、ＷＯ９７／０６２０２号公報に記載のブロックコポリマーのＰＥＧセグメント部分の製法を用いて調製することができる。ＰＥＧセグメントのうち−Ｒ^１基と反対側の末端は、一般式（１）において「Ｓ−Ｓ−Ｌ^１」となる部分であり、−Ｓ−Ｓ−ＮＨ_２、−Ｓ−Ｓ−ＣＯＯＨ、下記一般式（６）：
−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_ｐ２−ＮＨ_２ （６）
〔式（６）中、ｐ２は１〜５（好ましくは２〜３）の整数を表す。〕
で示される基、又は一般式（７）：
−Ｓ−Ｓ−Ｌ^２ｂ−（ＣＨ_２）_ｑ２−Ｌ^３ｂ （７）
〔式（７）中、Ｌ^２ｂは、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ又はＣＯＯを表し、Ｌ^３ｂは、ＮＨ_２又はＣＯＯＨを表す。ｑ２は１〜５（好ましくは２〜３）の整数を表す。〕
で示される基であることが好ましい。
一般式（１）で示されるポリマーの具体的な製造方法としては、例えば、末端にジスルフィド基を介してアミノ基を有するＰＥＧセグメント誘導体を用いて、そのアミノ末端に、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート（ＢＬＡ）及びＮε−Ｚ−Ｌ−リシン等の保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させてブロックコポリマーを合成し、その後、各ブロック部分の側鎖が前述したカチオン性基を有する側鎖となるように、ジエチレントリアミン（ＤＥＴ）等で置換又は変換する方法が挙げられる。
（２）核酸
本発明のＰＩＣにおいて、コア部分の構成成分となる核酸としては、限定はされず、遺伝子治療等に用い得る各種ＤＮＡ及びＲＮＡ、又はＰＮＡ（ペプチド核酸）が挙げられるが、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴＤＮＡ、及びｓｉＲＮＡ等が好ましく挙げられる。
核酸分子はポリアニオンとなるため、上述したブロックコポリマーのポリカチオン部分の側鎖と静電的相互作用により結合することができる。
なお本発明においては、必要に応じ、上記核酸と共に、生理活性タンパク質や各種ペプチドなど、細胞内で機能発現する様々な物質をコア部分に含有させることもできる。
また、本発明のＰＩＣの他の一態様においては、コア部分の構成成分として、高分子量又は低分子量の「アニオン性物質」を用いることができ、例えば、ペプチドホルモン、タンパク質、酵素及び核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡ）等の高分子物質、あるいは分子内に荷電性官能基を有する低分子物質（水溶性化合物）等が挙げられる。なお、当該アニオン性物質としては、複数の異なる帯電状態の官能基（アニオン性基及びカチオン性基）を有する分子について、ｐＨを変化させることにより分子全体としての帯電状態をアニオン性に変化させることができるものも含む。これらアニオン性物質は、１種のみ用いてもよいし２種以上を併用してもよく、限定はされない。
（３）ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）
本発明のＰＩＣは、核酸と、上述したブロックコポリマー中の一部（ポリカチオン部分）とが相互作用してコア部分を形成し、当該ブロックコポリマー中の他の部分（ＰＥＧ部分を含む部分）がコア部分の周囲にシェル部分を形成したような状態の、コア−シェル型のミセル状複合体ということができる（図１参照）。
本発明のＰＩＣは、例えば、核酸とブロックコポリマーとを任意のバッファー（例えばＴｒｉｓバッファー等）中で混合することにより容易に調製することができる。
ブロックコポリマーと核酸との混合比は、限定はされないが、例えば、ブロックコポリマー中のカチオン性基（例えばアミノ基）の総数（Ｎ）と、核酸中のリン酸基の総数（Ｐ）との比（Ｎ／Ｐ比）が、１．５〜６０であることが好ましく、より好ましくは１．５〜３２、さらに好ましくは２〜８である。特に、ブロックコポリマーが前記一般式（１）のコポリマーである場合は、Ｎ／Ｐ比は、限定はされないが、１．５〜３２であることが好ましく、より好ましくは１．５〜８であり、さらに好ましくは２〜８、特に好ましくは４〜６である（この場合のＮは、ポリカチオン部分の側鎖に含まれる１級アミンと２級アミンの合計数である。）。Ｎ／Ｐ比が上記範囲のときは、遊離のポリマーが存在せず、ｉｎ ｖｉｖｏでの高い発現効率が得られる等の点で好ましい。なお、上記カチオン性基（Ｎ）は、内包する核酸中のリン酸基と静電的に相互作用してイオン結合を形成することができる基を意味する。
本発明のＰＩＣの大きさは、限定はされないが、例えば、動的光散乱測定法（ＤＬＳ）による粒径が３０〜１５０ｎｍであることが好ましく、より好ましくは５０〜１００ｎｍである。
３．核酸送達デバイス
本発明においては、上述したポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を含む核酸送達デバイスが提供される。本発明の核酸送達デバイスは、細胞内外の酸化還元環境の変化を利用し、ＰＩＣのコア部分に内包した所望の核酸を、標的細胞内に効率的に導入する手段として使用できる。
具体的には、所望の核酸を内包したＰＩＣを含む溶液を被験動物に投与して、体内の標的細胞に取り込ませる。その後、細胞内に取り込まれたＰＩＣがエンドソームから細胞質に移行すると、細胞質内の還元的環境に応答して、ブロックコポリマー中のジスルフィド結合が開裂し、ＰＥＧ部分が分離する。その結果、ＰＩＣに内包された核酸と細胞内に存在するポリアニオンとの置換が促進され、ＰＩＣが解離することにより、所望の核酸を細胞質内に放出することができる。
本発明の核酸送達デバイスは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ等の各種動物に適用することができ、限定はされない。被験動物への投与方法は、通常、点滴静注などの非経口用法が採用され、投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は、被験動物の種類及び状態に合わせて適宜設定することができる。
本発明の核酸送達デバイスは、各種疾患の原因となる細胞に所望の核酸を導入する治療（遺伝子治療）に用いることができる。よって本発明は、前述したＰＩＣを含む医薬組成物、及び、前述したＰＩＣを用いる各種疾患の治療方法（特に遺伝子治療方法）を提供することもできる。なお、投与の方法及び条件は前記と同様である。
上記医薬組成物については、薬剤製造上一般に用いられる賦形材、充填材、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。また、医薬組成物の形態は、通常、静脈内注射剤（点滴を含む）が採用され、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供される。
上記医薬組成物及び治療方法は、例えば癌に対して有効に適用される。
４．核酸送達用キット
本発明の核酸送達用キットは、前記特定のブロックコポリマーを含むことを特徴とする。当該キットは、癌細胞等の各種標的細胞に対する遺伝子治療などに好ましく用いることができる。
本発明のキットにおいて、ブロックコポリマーの保存状態は、限定はされず、その安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
本発明のキットは、前記特定のブロックコポリマー以外に他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、例えば、各種バッファー、細胞内に導入する各種核酸（プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、溶解用バッファー、各種タンパク質及び使用説明書（使用マニュアル）等を挙げることができる。
本発明のキットは、標的細胞内に導入する所望の核酸をコア部分としたポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を調製するために使用され、調製したＰＩＣは、標的細胞への核酸送達デバイスとして有効に用いることができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）の調製＞
（１）ブロックコポリマーの合成
下記スキーム１に示す反応を経て、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とポリカチオンとがジスルフィド結合したブロックコポリマー（ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ）））を得た。スキーム１に示す各反応ステップ、すなわちＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２の合成、ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＢＬＡの合成、及びＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））の合成について、以下に具体的に説明する。

（１−１）ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２の合成
予め、ＰＥＧ（重合度（ｎ）＝２２７）の片末端にチオール基を導入したＰＥＧセグメント「ＰＥＧ−ＳＨ（Ｍｎ＝１０，２２７）」を、日本油脂（株）より購入した。
このＰＥＧ−ＳＨ １ｇと２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ ０．７７ｇ（１００倍量）をＭｅＯＨ １００ｍＬに溶解させ、室温で１３日間攪拌（４，６，８，１３日後にＧＰＣ測定）して反応させた。得られた反応物を、ＭｅＯＨに対して透析後、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製し、「ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２」を得た。なお、攪拌開始後、４，６，８，１３日後、透析後、イオン交換精製後に、一部サンプリングしてＧＰＣ測定を行った。
図２に、各ＧＰＣチャートをまとめて示す。経時的にみると、ＰＥＧの二量体が一旦増加した後、減少していることから、反応初期はＰＥＧ同士でＳ−Ｓ結合して二量体を形成した後、徐々に２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｔｉｏｌと置き換わっていったものと考えられる。攪拌開始から８日後には、上記二量体はほとんど認められなくなったため、実質的に８日で反応は終了したものと考えられる。また、反応後のメタノール透析とイオン交換でＳ−Ｓ結合の交換が起こる恐れがあったが、今回のＧＰＣ結果ではそれがほとんどないことが確かめられた。
ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２の収率は５７％（０．５７ｇ）であった。
図３に示す^１Ｈ ＮＭＲスペクトルより、アミノエタンチオールの導入率は９３％となり、定量的な導入が確認された。
（１−２）ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＢＬＡの合成
ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２ ３００ｍｇをＣＨ_２Ｃｌ_２ ４．５ｍＬに溶解させ、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＤＭＦ（１０：１）１１．５ｍＬに溶解したβ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ−Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ（ＢＬＡ−ＮＣＡ）８５９ｍｇを添加した後、３５℃で２日間攪拌した。ＩＲにより、ＢＬＡ−ＮＣＡに由来するピークの消失から反応が終了したことを確認した後、ヘキサン／酢酸エチル（６：４）２００ｍＬに再沈し、吸引ろ過し、減圧乾燥により精製して、「ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＢＬＡ」を得た。
図４に示す^１Ｈ ＮＭＲスペクトルにより、ポリＢＬＡ（ＰＢＬＡ）に由来するピークが認められることから、ＢＬＡ−ＮＣＡの重合が進行したことが確認された。ＰＥＧの主鎖のピークｂを基準にして、ＰＢＬＡ部分の側鎖のベンゼン環のピークｆの積分値を比較することにより、ＰＢＬＡ部分の重合度（ｍ）は１００と算出された。ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＢＬＡの収量は９１０ｍｇであった。
（１−３）ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））の合成
得られたＰＥＧ−ＳＳ−ＰＢＬＡのＰＢＬＡ部分の側鎖にｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ（ＤＥＴ）を導入して（アミノリシス反応）ポリカチオンとした。なお、Ｓ−Ｓ結合はアルカリに弱く、アミノリシス反応においては過剰のアミンが存在するため、Ｓ−Ｓ結合の交換を防ぐことに留意しつつＤＥＴを導入する必要がある。
具体的には、ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＢＬＡ ４０ｍｇにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２ｍＬを加えて攪拌し、５０倍量のＤＥＴ ０．７３ｍＬを添加して、さらに３分間室温で攪拌した。攪拌後５％ ＡｃＯＨａｑ １５ｍＬに滴下し、最後に０．０１Ｎ ＨＣｌに対して透析後、凍結乾燥により回収した。
図５に示すＧＰＣチャートから単峰性のピークが確認されたことにより、Ｓ−Ｓ結合の切断や交換は起きなかったと考えられる。
図６に示す^１Ｈ ＮＭＲスペクトルから、ＤＥＴ由来のピークが認められ、さらにピークｃを基準としたピークｆとの積分比よりＤＥＴの定量的導入も確認された。
このようにして、ＰＥＧと、ポリカチオン（アスパラギン骨格にエチレンジアンミンユニットが結合したアミノ酸のポリマー）とがＳ−Ｓ結合した目的のブロックコポリマー「ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））」が得られた。なお、前記のとおり、ＰＥＧ部分の重合度（ｎ）は２２７、ポリカチオン部分の重合度（ｍ）は１００であった。
（２）使用する核酸
細胞内送達用の核酸としては、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ発現プラスミド（プロメガ社製，製品名：ｐＧＬ３；以下「ｐＤＮＡ」と言う）を使用した。
（３）ＰＩＣの調製
１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）中で、ｐＤＮＡとＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））とを混合することにより、ｐＤＮＡをコア部分として内包するＰＩＣを調製した。具体的には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファーに溶解させたｐＤＮＡ（濃度：５０μｇ／ｍＬ）１００μＬに対して、同様のバッファー５０μＬに溶解させたＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を添加することにより、ＰＩＣを含む溶液を得た。
なお、ＰＩＣとしては、ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））の溶解量を適宜調整して、Ｎ／Ｐ比（下記式を参照）が、「０，１，１．５，２，２．５，３，４，８，１６，３２」であるものを、それぞれ個別に調製した。
Ｎ／Ｐ比＝
〔ポリカチオン部分の側鎖のアミノ基の総数（１級アミンと２級アミンの合計）〕
／〔ｐＤＮＡのリン酸基の総数〕
（４）ＰＩＣ形成の確認
上記（３）で得られた溶液中にＰＩＣが形成されているかどうかを、アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイドアッセイを利用して評価した。
上記（３）で得られた溶液にローディングバッファーを加え、アガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図７に示す。Ｎ／Ｐ＝１まではフリーのｐＤＮＡのバンドが、Ｎ／Ｐ＝１．５からはフリーのｐＤＮＡのバンドが消失したことから、ＰＩＣが形成されたと考えられる。
また、上記（３）で得られた溶液にエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を添加した後、蛍光を測定した結果を図８に示す。比較のため、上記（３）において、ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））の代わりに、Ｓ−Ｓ結合の無いブロックコポリマー「ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））」又はＰＥＧの無いポリマー（ホモポリマー）「Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））」（下記一般式参照）を使用して得られた溶液に関する結果も併せて示した。Ｎ／Ｐ＝２あたりから蛍光の減少がほぼ一定値に達したことから、そのあたりでＰＩＣの形成が完了したと考えられる。ＰＩＣ形成の条件では、ＤＥＴの１級アミンの部分だけプロトン化していると考えられるので、Ｎ／Ｐ＝２はブロックコポリマーのポリカチオンの電荷とｐＤＮＡのアニオンの電荷がちょうど釣り合う点であると言える。

（５）粒径の測定
ＰＩＣの粒径を動的光散乱測定法（ＤＬＳ）により測定した。その結果を図９に示す。ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣの粒径は、Ｎ／Ｐ比に関わらず約８０ｎｍであった（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣも同様）。これに対し、Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣの粒径は、Ｎ／Ｐ＝２前後において急激に大きくなったことから、電荷の中和により凝集することが示された。この結果より、ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣは、最外殻に位置するＰＥＧの立体反発効果により凝集が抑制されたと言える。
（６）ゼータ電位の測定
ＰＩＣのゼータ電位を測定した。但し、ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣについては、測定後、還元剤のジチオスレイトール（ＤＴＴ）２５ｍＭを添加して、再度ゼータ電位を測定した。その結果を図１０に示す。ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））やＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ）を用いたＰＩＣ（ＰＥＧ有り）は、Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣ（ＰＥＧ無し）に比べて、高いＮ／Ｐ比でも０に近いゼータ電位を示したことから、ＰＥＧによる電荷の遮蔽効果が示された。しかしながら、ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣに上記ＤＴＴを添加した後は、Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣのゼータ電位に近づいたことから、還元環境下ではＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））のＳ−Ｓ結合が開裂しＰＥＧが分離することが示された。これらの結果より、ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣは、還元環境に応答してＰＥＧが分離する（ひいては内包した核酸を放出する）インテリジェントキャリアであると言える。

＜遺伝子発現効率の評価＞
２４ウェルプレート上にＨｅＬａ細胞（４０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播き、２４時間インキュベーションした。次いで、実施例１で得られた「ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣ」を、ｐＤＮＡが１ウェル当たり１μｇとなる量で添加し、さらに２４時間インキュベーションして、ＨｅＬａ細胞内へのｐＤＮＡのトランスフェクションを行った。その後、ｐＤＮＡの遺伝子発現効率をルシフェラーゼアッセイにより評価した（Ｎ＝４，ｍｅａｎ±ＳＥ）。遺伝子発現量はＲｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）／ｍｇタンパク量の単位で得られる。なお、ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣの代わりに、「ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ）を用いたＰＩＣ」又は「Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣ」を添加した場合についても同様の評価を行った。
上記アッセイの結果を図１１に示す。「ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣ」は、Ｎ／Ｐ＝８以上では、「ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ）を用いたＰＩＣ」（Ｓ−Ｓ結合無し）より１〜２桁高い値となり、「Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣ」とほぼ同程度の遺伝子発現効率を示し、さらにＮ／Ｐ＝４では、「Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣ」との比較でも１桁高い値となり優れた遺伝子発現効率を示した。以上のように、「ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））を用いたＰＩＣ」は、細胞内の還元環境下で開裂し得るＳ−Ｓ結合の効果により、比較的低いＮ／Ｐ比であっても、Ｓ−Ｓ結合がないものより格段に高い遺伝子発現効率を示したことから、極めて有用な環境応答性の遺伝子ベクターであると言える。

本発明によれば、標的細胞に対して極めて高い遺伝子発現効率を発揮し得るポリイオンコンプレックスを提供することができる。本発明のポリイオンコンプレックスは、標的細胞に取り込まれる前（血中など）は、核酸を内包した状態で非常に優れた構造安定性を示し、細胞（細胞質）に取り込まれた後は、その構造安定性を崩して内包していた核酸をスムーズに放出する、インテリジェント遺伝子ベクターとして極めて有用である。
また本発明によれば、上記ポリイオンコンプレックスを用いた、細胞内への核酸送達デバイス及び核酸送達用キットを提供することもできる。

Claims (11)

1. ポリエチレングリコール及びポリカチオンがジスルフィド基を介して結合した下記一般式(1)で示されるブロックコポリマーと、核酸とを含むことを特徴とする、ポリイオンコンプレックス。
   

   

   〔式中、R¹及びR²は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、
   R³は、下記一般式(3)：
   -〔NH-(CH₂)_s〕_t -X² (3)
   （式中、X²は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。s及びtは、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH₂)_s〕ユニット間で独立して、sは1〜5の整数を表し、tは2〜5の整数を表す。）
   で示される基を表し、
   L¹は、NH、CO、下記一般式(4)：
   -(CH₂)_p1-NH- (4)
   （式中、p1は1〜5の整数を表す。）
   で示される基、又は下記一般式(5)：
   -L^2a-(CH₂)_q1-L^3a- (5)
   （式中、L^2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L^3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜5の整数を表す。）
   で示される基を表し、
   m1は30〜150の整数を表し、m2は1〜5の整数を表し、nは100〜400の整数を表す。〕
2. 前記ポリカチオンが、側鎖にカチオン性基を有するポリペプチドである、請求項１記載のポリイオンコンプレックス。
3. 前記ポリマー中のR³基が、-NH-(CH₂)₂-NH-(CH₂)₂-NH₂である、請求項１又は２記載のポリイオンコンプレックス。
4. 前記ブロックコポリマー中のポリカチオン部分と前記核酸とが静電的相互作用により結合したものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックス。
5. 前記核酸と前記ブロックコポリマー中のポリカチオン部分とがコア部分を形成し、前記ブロックコポリマー中のポリエチレングリコールを含む部分が前記コア部分の周囲にシェル部分を形成したものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックス。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックスを含むことを特徴とする、細胞内への核酸送達デバイス。
7. ポリエチレングリコール及びポリカチオンがジスルフィド基を介して結合した下記一般式(1)で示されるブロックコポリマーを含む、細胞内への核酸送達用キット。
   

   

   〔式中、R¹及びR²は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、
   R³は、下記一般式(3)：
   -〔NH-(CH₂)_s〕_t -X² (3)
   （式中、X²は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。s及びtは、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH₂)_s〕ユニット間で独立して、sは1〜5の整数を表し、tは2〜5の整数を表す。）
   で示される基を表し、
   L¹は、NH、CO、下記一般式(4)：
   -(CH₂)_p1-NH- (4)
   （式中、p1は1〜5の整数を表す。）
   で示される基、又は下記一般式(5)：
   -L^2a-(CH₂)_q1-L^3a- (5)
   （式中、L^2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L^3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜5の整数を表す。）
   で示される基を表し、
   m1は30〜150の整数を表し、m2は1〜5の整数を表し、nは100〜400の整数を表す。〕
8. 前記ポリマー中のR³基が、-NH-(CH₂)₂-NH-(CH₂)₂-NH₂である、請求項７記載のキット。
9. ポリエチレングリコール及びポリカチオンがジスルフィド基を介して結合した下記一般式(1)で示されるブロックコポリマー。
   

   

   〔式中、R¹及びR²は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、
   R³は、下記一般式(3)：
   -〔NH-(CH₂)_s〕_t -X² (3)
   （式中、X²は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。s及びtは、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH₂)_s〕ユニット間で独立して、sは1〜5の整数を表し、tは2〜5の整数を表す。）
   で示される基を表し、
   L¹は、NH、CO、下記一般式(4)：
   -(CH₂)_p1-NH- (4)
   （式中、p1は1〜5の整数を表す。）
   で示される基、又は下記一般式(5)：
   -L^2a-(CH₂)_q1-L^3a- (5)
   （式中、L^2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L^3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜5の整数を表す。）
   で示される基を表し、
   m1は30〜150の整数を表し、m2は1〜5の整数を表し、nは100〜400の整数を表す。〕
10. 前記ポリマー中のR³基が、-NH-(CH₂)₂-NH-(CH₂)₂-NH₂である、請求項９記載のブロックコポリマー。
11. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックスを含む溶液を非ヒト被験動物に投与し、該動物の体内の各種細胞のエンドソームに該ポリイオンコンプレックスを取り込ませることを含む、非ヒト被験動物の体内の標的細胞に核酸を送達する方法。

Images