JP5251048B2 - 発光触媒活性を有するポリペプチド - Google Patents
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Description
ガウシアルシフェラーゼの遺伝子およびアミノ酸配列(195アミノ酸)については、すでに報告されている(例えば、特許文献1:WO99/49019)。また、ガウシアと同一種に含まれ、ガウシアルシフェラーゼと相同性を示すメトリデアルシフェラーゼ遺伝子およびアミノ酸配列(219アミノ酸)も、報告されている(例えば、非特許文献1:J. Biol. Chem. 279, 3212-3217 (2004))。
また、ガウシアルシフェラーゼ、またはガウシアルシフェラーゼの27〜97番目のアミノ酸配列もしくは98〜168番目のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの発光触媒活性が、ハロゲン化物イオンによって活性化されることを見いだした。
これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
(1) 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のポリペプチド:
(a)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列を含有するポリペプチド;
(b)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号:1または配列番号:3に対して80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;および
(d)配列番号:2または配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
ただし、配列番号:6で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質を除く、
(1a) 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のポリペプチド:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有するポリペプチド;
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号:1に対して80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
ただし、配列番号:6で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質を除く、
(1b) 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のポリペプチド:
(a)配列番号:3のアミノ酸配列を含有するポリペプチド;
(b)配列番号:3のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号:3に対して80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;および
(d)配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
ただし、配列番号:6で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質を除く、
(2) 以下の(a)〜(d)のいずれかである上記(1)記載のポリペプチド:
(a)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列を含有するポリペプチド;
(b)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号:1または配列番号:3に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;および
(d)配列番号:2または配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
(2a) 以下の(a)〜(d)のいずれかである上記(1a)記載のポリペプチド:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有するポリペプチド;
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号:1に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド、
(2b) 以下の(a)〜(d)のいずれかである上記(1b)記載のポリペプチド:
(a)配列番号:3のアミノ酸配列を含有するポリペプチド;
(b)配列番号:3のアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号:3に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;および
(d)配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド、
(3) 配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである、上記(1)記載のポリペプチド、
(3a) 配列番号:1のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである、上記(1a)記載のポリペプチド、
(3b) 配列番号:3のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである、上記(1b)記載のポリペプチド、
(4) 上記(1)〜(3)のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(5) 以下の(e)〜(i)のいずれかである上記(4)記載のポリヌクレオチド:
(e)配列番号:2または配列番号:4の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(f)配列番号:2または配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(g)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(h)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;および
(i)配列番号:1または配列番号:3に対して80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(5a) 以下の(e)〜(i)のいずれかである上記(4)記載のポリヌクレオチド:
(e)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(f)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(g)配列番号:1のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(h)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;および
(i)配列番号:1に対して80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(5b) 以下の(e)〜(i)のいずれかである上記(4)記載のポリヌクレオチド:
(e)配列番号:4の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(f)配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(g)配列番号:3のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(h)配列番号:3のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;および
(i)配列番号:3に対して80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(6) 以下の(e)〜(i)のいずれかである上記(4)記載のポリヌクレオチド:
(e)配列番号:2または配列番号:4の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(f)配列番号:2または配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(g)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(h)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;および
(i)配列番号:1または配列番号:3に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(6a) 以下の(e)〜(i)のいずれかである上記(4)記載のポリヌクレオチド:
(e)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(f)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(g)配列番号:1のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(h)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;および
(i)配列番号:1に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(6b) 以下の(e)〜(i)のいずれかである上記(4)記載のポリヌクレオチド:
(e)配列番号:4の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(f)配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(g)配列番号:3のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(h)配列番号:3のアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;および
(i)配列番号:3に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(7) 上記(4)〜(6b)のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
(8) 上記(7)記載の組換えベクターが導入された形質転換体、
(9) 上記(8)記載の形質転換体を培養し、上記(1)〜(3b)のいずれかに記載のポリペプチドを生成させる工程を含む、上記(1)〜(3b)のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法、
(10) 上記(1)〜(3b)のいずれかに記載のポリペプチドを含むキット、
(11) 上記(4)〜(6b)のいずれかに記載のポリヌクレオチド、上記(7)記載の組換えベクターまたは上記(8)記載の形質転換体を含むキット;
(12) さらにルシフェリンを含む、上記(10)または(11)記載のキット、
(13) ルシフェリンがセレンテラジン類である、上記(12)記載のキット、
(14) セレンテラジン類がセレンテラジンである、上記(13)記載のキット、
(15) 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のポリペプチド:
(a)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列を含有するポリペプチド;
(b)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号:1または配列番号:3に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;および
(d)配列番号:2または配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド、
と、ルシフェリンとを接触させることを含む、発光反応を行う方法、
(16) ハロゲン化物イオン存在下で発光反応を行う、上記(15)記載の方法、
(17) ハロゲン化物イオンが、フッ素イオン、臭素イオンまたはヨウ素イオンである、上記(16)記載の方法、
(18) ハロゲン化物イオンを用いて、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のポリペプチド:
(a)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列を含有するポリペプチド;
(b)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号:1または配列番号:3に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;および
(d)配列番号:2または配列番号:4の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;または
以下の(a)〜(d)のいずれかに記載の蛋白質:
(a)配列番号:6のアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質;
(b)配列番号:6のアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質;
(c)配列番号:6のアミノ酸配列と約90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質;および
(d)配列番号:5の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質、
の発光活性を活性化する方法、
(19) ハロゲン化物イオンが、フッ素イオン、臭素イオンまたはヨウ素イオンである、上記(18)記載の方法
などを提供する。
本発明の発光活性を活性化する方法によれば、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質などの発光効率を向上させることができる。
1.本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドIとは、配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性もしくは機能を有するポリペプチドを意味する。本明細書中、配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性もしくは機能を有するポリペプチドを「カルボキシ末端ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ」と称することがある。
本発明のポリペプチドIIとは、配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性もしくは機能を有するポリペプチドを意味する。本明細書中、配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性もしくは機能を有するポリペプチドを「アミノ末端ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ」と称することがある。
本発明のポリペプチドIと本発明のポリペプチドIIとをまとめて「本発明のポリペプチド」と称することがある。
本発明で用いられる蛋白質とは、配列番号:6のアミノ酸配列からなる蛋白質および配列番号:6のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性もしくは機能を有する蛋白質を意味する。本発明で用いられる蛋白質には、「ガウシアルシフェラーゼ」が含まれる。
本明細書において、セレンテラジン類とは、セレンテラジンおよびセレンテラジン誘導体を意味する。セレンテラジン誘導体としては、例えば、h-セレンテラジン、hcp-セレンテラジン、cp-セレンテラジン、f-セレンテラジン、fcp-セレンテラジン、n-セレンテラジン、Bis-セレンテラジン、MeO-セレンテラジン、e-セレンテラジン、cl-セレンテラジンch-セレンテラジンなどがあげられる。
本発明で用いられる蛋白質としては、より具体的には、例えば;(a)配列番号:6のアミノ酸配列を含有し、かつ配列番号:6のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性もしくは機能を有する蛋白質;(b)配列番号:6のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を含有し、かつ配列番号:6のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性もしくは機能を有する蛋白質;(a’)配列番号:6のアミノ酸配列からなる蛋白質;または(b’)配列番号:6のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号:6に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性もしくは機能を有する蛋白質などがあげられる。
本発明のポリペプチドIの具体例としては、例えば、配列番号:1のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号:13のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号:13のアミノ酸配列からなるポリペプチドなどがあげられる。
本発明のポリペプチドIIの具体例としては、例えば、配列番号:3のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号:17のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号:17のアミノ酸配列からなるポリペプチドなどがあげられる。
本発明で用いられる蛋白質の具体例としては、例えば、配列番号:6のアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号:8のアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号:6のアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号:8のアミノ酸配列からなる蛋白質などがあげられる。
配列番号:3のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号:17のアミノ酸配列からなるポリペプチドなどがあげられる。
配列番号:6のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、配列番号:6のアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号:8のアミノ酸配列からなる蛋白質などがあげられる。
配列番号:6のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性もしくは機能を有する蛋白質としては、例えば、配列番号:6のアミノ酸配列と約80%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ配列番号:6のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性もしくは機能を有する蛋白質もあげられる。より具体的には、例えば、(c)配列番号:6のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性もしくは機能を有する蛋白質としては、例えば、配列番号:6のアミノ酸配列と約80%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリン(例えば、セレンテラジン類)を基質とする発光触媒活性を有する蛋白質などがあげられる。
上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、BLAST(例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照)やFASTA(Pearson W. R., Methods in Enzymology 183, 63 (1990)、など参照)等の解析プログラムを用いて決定できる。BLASTまたはFASTAを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
また、本発明で用いられる蛋白質には、配列番号:5の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有し、かつ配列番号:6のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性もしくは機能を有する蛋白質、(d)配列番号:5の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有し、かつルシフェリン(例えば、セレンテラジン類)を基質とする発光触媒活性を有する蛋白質も含まれる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドについては、後記する。
本発明は、前述した本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよいが、好ましくはDNAである。DNAとしては、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、細胞・組織由来のcDNA、細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAなどがあげられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からtotalRNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(以下、RT-PCR法と略称する)によって増幅することもできる。
さらに、本発明のポリヌクレオチドには、(e)配列番号:5の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;(f)配列番号:5の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号:6のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性もしくは機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;(g)配列番号:6のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;(h)配列番号:6のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつ配列番号:6のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性もしくは機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;または(i)配列番号:6に対して80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ配列番号:6のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性もしくは機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどが含まれる。
また目的の変異(欠失、付加、置換および/または挿入)を導入した配列をそれぞれの5’端に持つ1組のプライマーを用いたPCR(例えば、Ho S. N. et al., Gene 77, 51 (1989)、など参照)によっても、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。
本発明のポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号:6のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、配列番号:8のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、配列番号:6のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、配列番号:8のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、などもあげられる。
さらに、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび形質転換体を提供する。
(1)組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチド(例えば、DNA)を連結(挿入)することにより得ることができる。より具体的には、精製されたポリヌクレオチド(DNA)を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等があげられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド(例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110, pTP5等)、酵母由来のプラスミド(例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などがあげられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージなどがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、昆虫ウイルス(例えば、バキュロウイルスなど)などがあげられる。
このようにして得られた、本発明のポリヌクレオチド(すなわち、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質をコードするポリヌクレオチド)を含有する組換えベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。宿主としては、本発明のポリヌクレオチド(DNA)を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)などがあげられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などがあげられる。シュードモナス属菌としては、例えば、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などがあげられる。リゾビウム属菌としては、例えば、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などがあげられる。酵母としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などがあげられる。動物細胞としては、例えば、COS細胞、CHO細胞などがあげられる。昆虫細胞としては、例えば、Sf9、Sf21などがあげられる。
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質を生成させる工程を含む、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質の製造方法を提供する。本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質は、前記形質転換体を本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質をコードするポリヌクレオチド(DNA)が発現可能な条件下で培養し、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質を生成・蓄積させ、分離・精製することによって製造することができる。
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、形質転換体によって本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質が生成され、形質転換体内または培養液中などに本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質が蓄積される。
上記培養物から、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質を分離・精製することによって、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
(レポーター蛋白質としての利用)
本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質をコードするポリヌクレオチド(すなわち、本発明のポリヌクレオチド)を、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列(例えば、エンハンサーなど)に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、ルシフェリン存在下、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質に由来する発光を検出することにより、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列の活性を測定することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、上述のようにして、レポーター遺伝子として利用することができる。
本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質は、ルシフェリン存在下、発光による検出マーカーとして利用することができる。本発明の検出マーカーは、例えば、イムノアッセイまたはハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質を化学修飾法など通常用いられる方法により目的蛋白質あるいは目的核酸と結合させて使用することができる。このような検出マーカーを用いた検出方法は、通常の方法によって行うことができる。また、本発明の検出マーカーは、例えば、目的蛋白質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入することによって、前記目的蛋白質の分布を測定するために利用することもできる。このような目的タンパク質などの分布の測定は、発光イメージング等の検出法などを利用して行うこともできる。なお、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることもできる。
本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質は、ルシフェリンが酸素分子で酸化されてオキシルシフェリンが励起状態で生成される反応を触媒する活性を有する。励起状態のオキシルシフェリンは可視光を発して基底状態となる。よって、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質などは、アミューズメント用品の材料の発光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、発光シャボン玉、発光アイス、発光飴、発光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組換えベクターおよび本発明の形質転換体から選択されるいずれかを含むキットも提供する。本発明のキットには、さらにルシフェリン(例えば、セレンテラジンもしくはその誘導体)を含んでいてもよい。本発明のキットは、通常用いられる材料および方法で製造することができる。本発明のキットは、例えば、サンプルチューブ、プレート、キット使用者に対する指示書、溶液、バッファー、試薬、標準化のために好適なサンプルまたは対照サンプルを含んでもよい。本発明のキットには、さらに、ハロゲン化物イオンを含む塩などを含んでいてもよい。
本発明は、ハロゲン化物イオンを用いて、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質の、ルシフェリン(例えば、セレンテラジン類)を基質とする発光活性(発光触媒活性)を活性化する方法も提供する。
(発光活性)
本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質は、ルシフェリン(例えば、セレンテラジン類)を酸素分子で酸化して励起状態のオキシルシフェリンを生成させる反応を触媒する活性を有する。励起状態のオキシルシフェリンは、基底状態となる際に可視光を発する。すなわち、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質は、ルシフェリン(例えば、セレンテラジン類)を基質とする発光反応を触媒し、発光を生じさせる活性を有する。この活性を、本明細書において、「発光活性」と称することがある。
(発光反応)
本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質を用いた、ルシフェリン(例えば、セレンテラジン類)を基質とする発光反応は、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質ルシフェリンとを接触させることにより行うことができる。反応条件としては、ガウシアルシフェラーゼを用いた発光反応に通常用いられる条件またはそれに準じた条件で行うことができる(例えば、WO99/49019、J. Biol. CHem. 279, 3212-3217 (2004)、およびそれらの引用文献など参照)。
具体的には、反応溶媒としては、例えば、Tris-HCl緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液、水、などが用いられる。
反応温度は、通常約10℃〜約40℃、好ましくは約20℃〜約40℃である。
反応溶液のpHは、通常約5〜約10、好ましくは約6〜約9、より好ましくは約7〜約8、特に好ましくは約7.5である。
ルシフェリンとしては、セレンテラジン類が好ましく、特にセレンテラジンが好ましい。
ルシフェリンは、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホオキシド等の極性溶媒や、メタンール、エタノール、ブタノール等のアルコール溶液として反応系に加えてもよい。
(発光活性の活性化)
本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質の、ルシフェリン(例えば、セレンテラジン類)を基質とする発光活性(発光触媒活性)は、ハロゲン化物イオンにより活性化される。
ハロゲン化物イオンとしては、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなどがあげられ、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンが好ましい。
ハロゲン化物イオンの濃度は、通常約10μM〜約100mM、好ましくは約100μM〜約50mM、特に好ましくは約1mM〜約20mMである。
反応系にハロゲン化物イオンを添加する方法としては、塩として添加する方法などがあげられる。用いられる塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩;カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩などがあげられる。より具体的には、NaF、NaCl、NaBr、NaI、KF、KCl、KBr、KI、CaF2、CaCl2、CaBr2、CaI2、MgF2、MgCl2、MgBr2、MgI2、などがあげられる。
[配列番号:1]カルボキシ末端ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ(本発明のポリペプチドI)のアミノ酸配列を表す。このアミノ酸配列は、配列番号:6のアミノ酸配列の27〜97番目のアミノ酸配列に相当する。
[配列番号:2]配列番号:1のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を表す。
[配列番号:3]アミノ末端ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ(本発明のポリペプチドII)のアミノ酸配列を表す。このアミノ酸配列は、配列番号:6のアミノ酸配列の98〜168番目のアミノ酸配列に相当する。
[配列番号:4]配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を表す。
[配列番号:5]ガウシアルシフェラーゼ遺伝子(hGL遺伝子)から分泌シグナル配列をコードする領域を除いたポリヌクレオチドの塩基配列を表す。
[配列番号:6]配列番号:5の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質、すなわちガウシアルシフェラーゼから分泌シグナル配列を除いた蛋白質のアミノ酸配列を表す。
[配列番号:7]実施例1で作製したガウシアルシフェラーゼ発現ベクターpCold-hGLに挿入された組換えガウシアルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を表す。
[配列番号:8]配列番号:7の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされる組換え蛋白質のアミノ酸配列を表す。
[配列番号:9]実施例1で用いられたプライマーの塩基配列を表す。
[配列番号:10]実施例1で用いられたプライマーの塩基配列を表す。
[配列番号:11]実施例2で用いられたプライマーの塩基配列を表す。
[配列番号:12]実施例2で用いられたプライマーの塩基配列を表す。
[配列番号:13]実施例2で作製したカルボキシ末端ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ組換え蛋白質(ポリペプチド)のアミノ酸配列を表す。
[配列番号:14]実施例2で作製したガウシアガウシアルシフェラーゼのカルボキシ末端のドメインが欠失した組換え蛋白質(ポリペプチド)の発現ベクターpCold-hGL-27/97に挿入された、カルボキシ末端ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ組換え蛋白質(ポリペプチド)をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を表す。
[配列番号:15]実施例2で用いられたプライマーの塩基配列を表す。
[配列番号:16]実施例2で用いられたプライマーの塩基配列を表す。
[配列番号:17]実施例2で作製したアミノ末端ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ組換え蛋白質(ポリペプチド)のアミノ酸配列を表す。
[配列番号:18]実施例2で作製したガウシアガウシアルシフェラーゼのアミノ末端のドメインが欠失した組換え蛋白質(ポリペプチド)の発現ベクターpCold-hGL-98/168に挿入された、アミノ末端ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ組換え蛋白質(ポリペプチド)をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を表す。
深海コペポーダであるガウシアプリンセス由来のガウシアルシフェラーゼを大腸菌内で発現させるために、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子(hGL遺伝子)から分泌シグナル配列をコードする領域を除いたポリヌクレオチド(配列番号:5)を発現ベクターpCold II(タカラバイオ社製)に挿入することにより発現ベクター,pCold-hGL,を構築した(図1)。配列番号:5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号:6に示す。pCold-hGLに挿入された、組換えガウシアルシフェラーゼをコードするDNAの塩基配列を配列番号:7に示す。配列番号:7で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号:8に示す。
ガウシアルシフェラーゼ発現ベクターpCold-hGLは、具体的には、以下の方法に従って構築した。ガウシアルシフェラーゼ遺伝子を有するpcDNA3-hGL(プロルミ社製)を鋳型として2種のPCRプライマー:
GL5-N/SacI(5' gcc-GAG-CTC-AAG-CCC-ACC-GAG-AAC-AAC-GAA 3')(配列番号:9;SacI制限酵素部位はアンダーライン)およびGL2-C/EcoRI(5' gcc-GAA-TTC-TTA-GTC-ACC-ACC-GGC-CCC-CTT 3' )(配列番号:10;EcoRI制限酵素部位はアンダーライン)を用いて、PCRキット(タカラバイオ社製)にてPCR(サイクル条件25サイクル;1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃)を実施して、所望のDNA領域を増幅した。得られた断片をPCR精製キット(キアゲン社製)で精製し、常法により制限酵素SacI/EcoRIにて消化した後、pColdII(タカラバイオ社製)の制限酵素SacI/EcoRI部位に連結することによって、発現ベクターpCold-hGLを構築した(図2)。
ガウシアルシフェラーゼ(hGL)のアミノ末端およびカルボキシ末端のドメインが欠失した蛋白質を発現させるために、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子(hGL遺伝子)の完全長を有するphGL(プロルミ社製)より、PCR法によりドメイン欠失hGL遺伝子を取得し、発現ベクター,pCold II(タカラバイオ社製)に挿入することにより発現ベクター, pCold-hGL-27/97及びpCold-hGL-98/168,を構築した(図1)。
具体的には、ガウシアルシフェラーゼからアミノ末端にある17残基の分泌シグナル配列を除いたポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号:6)の27番目から97番目を有する、ガウシアルシフェラーゼのカルボキシ末端のドメインが欠失した組換え蛋白質の発現ベクターは、phGLを鋳型として2種のPCRプライマー:GL13-N-27/EcoRI(5' ggc-GAA-TTC-CGC-GGG-AAG-TTG-CCC-GGC-AAG 3')(配列番号:11;EcoRI制限酵素部位はアンダーライン)およびGL8-C-71/XbaI(5' cgg-TCT-AGA-TTA-GTC-GAC-GAT-CGC-CTC-GCC 3'(配列番号:12;XbaI制限酵素部位はアンダーライン)を用いて、PCRキット(タカラバイオ社製)にてPCR(サイクル条件25サイクル;1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃)を実施して、所望のDNA領域を増幅した。得られた断片をPCR精製キット(キアゲン社製)で精製し、常法により制限酵素EcoRI/XbaIにて消化した後、pColdII(タカラバイオ社製)の制限酵素EcoRI/XbaI部位に連結することによって、カルボキシ末端のドメインが欠失した組換え蛋白質の発現ベクター, pCold-hGL-27/97を構築した(図3)。カルボキシ末端のドメインが欠失した組換え蛋白質(配列番号:13)は6個のヒスチジン配列を含む22アミノ酸残基からなる配列をアミノ末端側に付加した93アミノ酸よりなる。
ガウシアルシフェラーゼから分泌シグナル配列を除いたポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号:6)の98番目から168番目を有するアミノ末端のドメインが欠失した組換え蛋白質の発現ベクターの構築は、以下の方法に従って行った。phGLを鋳型として2種のPCRプライマー:GL15-N-97/EcoRI(5' ggc-GAA-TTC-ATT-CCT-GAG-ATT-CCC-GGG-TTC 3'(配列番号:15;EcoRI制限酵素部位はアンダーライン)およびGL7-C/XbaI(5' gcc-TCT-AGA-TTA-GTC-ACC-ACC-GGC-CCC-CTT 3'(配列番号:16;XbaI制限酵素部位はアンダーライン)を用いて、PCRキット(タカラバイオ社製)にてPCR(サイクル条件25サイクル;1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃)を実施して、所望のDNA領域を増幅した。得られた断片をPCR精製キット(キアゲン社製)で精製し、常法により制限酵素EcoRI/XbaIにて消化した後、pColdII(タカラバイオ社製)の制限酵素EcoRI/XbaI部位に連結することによって、アミノ末端のドメインが欠失した組換え蛋白質の発現ベクター, pCold-hGL-98/168を構築した(図4)。アミノ末端のドメインが欠失した組換え蛋白質(配列番号:17)は6個のヒスチジン配列を含む22アミノ酸残基からなる配列をアミノ末端側に付加した93アミノ酸よりなる。配列番号:17で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号:18に示す。
本発現ベクターは、低温で誘導可能であり、発現したガウシアルシフェラーゼのカルボキシ末端またはアミノ末端のドメインが欠失した組換え蛋白質は、アミノ末端にヒスチジンダグを有する。
本明細書中、ガウシアルシフェラーゼのカルボキシ末端またはアミノ末端のドメインが欠失した蛋白質を「ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ」と称することがある。ガウシアルシフェラーゼのカルボキシ末端のドメインが欠失した蛋白質を「カルボキシ末端ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ」と称することがある。ガウシアルシフェラーゼのアミノ末端のドメインが欠失した蛋白質を「アミノ末端ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ」と称することがある。配列番号:1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを「カルボキシ末端ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ」と称することがある。配列番号:3のアミノ酸配列を含むポリペプチドを「アミノ末端ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ」と称することがある。ガウシアルシフェラーゼのカルボキシ末端またはアミノ末端のドメインが欠失した蛋白質の組み換えタンパク質を「ドメイン欠失組換え蛋白質」と称することがある。
1)蛋白質の大腸菌での発現
発現ベクターpCold-hGL 、pCold-hGL-27/97及びpCold-hGL-98/168を常法により大腸菌BL21株に導入し、得られた形質転換株をアンピシリン(50μg/ml)を含有する10mlのLB液体培地(水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イーストエクストラクト5g、塩化ナトリウム5g)に植菌し、37℃で18時間培養を行った。次いで、その培養菌体液を新たなLB液体培地400mlに添加して、37℃で4.5時間培養した後、氷水上で冷却して、イソプロピル-β-D(−)-チオガラクトピラノシド(IPTG、和光純薬工業社製)を最終濃度0.2mMになるように培養液に添加し、15℃にて17時間培養を行った。培養菌体は遠心分離により回収(5,000rpm、5分)し、これを蛋白質抽出の出発材料とした。
2)培養菌体からの蛋白質の抽出
集菌した菌体を80mlの50mM Tris-HCl (pH7.6)で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理(ブランソン社製、Sonifier model cycle 250)を2分間、3回行った。その菌体破砕液を10,000rpm(12,000×g)で20分間遠心し、可溶性画分と不溶性沈殿画分を得た。可溶性画分は、これを直接蛋白質精製の出発材料とした。一方、不溶性沈殿画分は、50mlの 6M尿素を含む50mM Tris-HCl(pH7.6)に懸濁、溶解し、10,000 rpm (12,000×g) で 20 分間遠心を行った。得られた6M尿素の可溶化画分を不溶性沈殿画分からの蛋白質精製の出発材料とした。
3)ニッケルキレートカラムクロマトグラフ法による蛋白質の可溶性画分の精製
前記可溶解性画分(80 ml)を、50mM Tris-HCl(pH7.6)で平衡化したニッケルキレートカラム(アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ:直径2.5×6.5cm)に添加して吸着させた。カラムに吸着した蛋白質を0.1 Mイミダゾール(和光純薬工業社製)を含む50mM Tris-HCl(pH7.6)、次いで0.3 Mイミダゾールを含む50mM Tris-HCl(pH7.6)にて溶出した。0.3 Mイミダゾールを含む画分に、発光活性および12%SDS-ポリアクリルアミド電気泳動法で蛋白質の溶出を確認した。
4)ニッケルキレートカラムクロマトグラフ法による蛋白質の不溶性画分の精製
前記不溶解性画分(50 ml)を、6M尿素を含む50mM Tris-HCl(pH7.6)で平衡化したニッケルキレートカラム(アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ:直径2.5×6.5cm)に添加して吸着させた。カラムに吸着した蛋白質を0.1 Mイミダゾール(和光純薬工業社製)を含む6M Urea (pH8.0)、次いで0.3 Mイミダゾールを含む6M尿素(pH8.0)にて溶出した。0.3 Mイミダゾールを含む6M尿素(pH8.0)画分に、発光活性および12%SDS-ポリアクリルアミド電気泳動法で蛋白質の溶出を確認した。
16%SDS-ポリアクリルアミド電気泳動法による蛋白質の純度は95%以上であった。(図5)。
蛋白質濃度をブラッドフォードの色素結合法(Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976))により、市販のキット(バイオラド社製)および標準物質としてウシ血清アルブミン(ピアス社製)を用いて測定した。SDS-PAGE分析は、還元条件下で12%分離ゲル(テフコ社製)を用いてレムリ法(Nature 227, 680-658 (1970))に従って行った。
ガウシアルシフェラーゼ蛋白質については、2Lの培養液の可溶性画分から15.0mg、不溶性画分から217.7mgの精製蛋白質を得た。
カルボキシ末端ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼの組換え蛋白質については、800mlの培養液の可溶性画分から2.0mg、不溶性画分から15.4mgの精製蛋白質を得た。アミノ末端ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼの組換え蛋白質は、800mlの培養液の可溶性画分から9.2mg、不溶性画分から36.8mgの精製蛋白質を得た。表2に精製蛋白質の比活性(蛋白質当りの活性)を示す。その結果、ガウシアルシフェラーゼのアミノ末端及びカルボキシ末端のドメインのみ、すなわちすなわち71アミノ酸配列のみで活性を示すことが明らかとなった。
SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による分析によると(図5)、アミノ末端ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼの推定分子量は6.5KDaである。より正確な分子量を、マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF-MS)をオートFLEX(ブルーカー・ダルトニクス)上で、マトリックスとしてシナピン酸(インビトロジェン社製)を用いて、Anal. Biochem. 316, 216-222 (2003)に記載の方法に従って測定した。データはポジティブリフレクターモードで得た。時間−質量変換をアポミオグロビン(ウマ、m/z = 16952.6)を標準に用いた外部較正により行った。分子量の計算値をプログラムExPASy PeptideMass(http://www.expasy.ch/cgi-bin/peptide-mass.pl)を用いて得た。
精製したガウシアルシフェラーゼ組換え蛋白質またはドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ組換え蛋白質においてヒスチジンヘキサマーを有することを確認するために、MALDI-TOF-MSを用いて質量分析を行った。
ガウシアルシフェラーゼ組換え蛋白質では、[M+H]+に対するm/z 20019.1の質量値が観察された。この値はヒスチジンヘキサマーを有するガウシアルシフェラーゼ組換え蛋白質(配列番号:8)に対する計算平均質量19977.1によく一致していた。カルボキシ末端のドメインが欠失したガウシアルシフェラーゼ組換え蛋白質では、[M+H]+に対するm/z 10742.8の質量値が観察された。この値はヒスチジンヘキサマーを有するカルボキシ末端欠失ガウシアルシフェラーゼ組換え蛋白質(配列番号:13)に対する計算平均質量10696.5によく一致していた。アミノ末端のドメインが欠失したガウシアルシフェラーゼ組換え蛋白質では、[M+H]+に対するm/z 10354.5の質量値が観察された。この値はヒスチジンヘキサマーを有するアミノ末端欠失ガウシアルシフェラーゼ組換え蛋白質(配列番号:17)に対する計算平均質量10309.9によく一致していた。
ガウシアルシフェラーゼまたはドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ(1μl)を10mM EDTAを含む50mM Tris-HCl (pH7.6) 100μlに懸濁し、エタノールに溶解した基質セレンテラジン(1μg/μl)を混合して発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200(アトー社製)で60秒間発光活性の測定を行った。発光活性は最大値(Imax)で示した。
上記の発光活性測定法を用いて、精製したガウシアルシフェラーゼ(hGL)またはドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ(hGL-27/97、hGL-98/168)の至適pHを検討した。具体的には、精製したガウシアルシフェラーゼまたはドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼを酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0, pH 5.5)、リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5, pH 8.0)、グリシン-水酸化ナトリウム緩衝液 (pH 9.0, pH 9.5, pH 10.0, pH 10.5) 100μlに懸濁し、エタノールに溶解した基質セレンテラジン(1μg/μl)を混合して発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200(アトー社製)で60秒間発光活性の測定を行った。各緩衝液の発光強度は相対活性(%)で示した(図6)。使用した蛋白質量は、hGLが1.0μg、hGL-27/97が0.45μg、hGL-98/168が0.3μgであった。この結果より、アミノ末端およびカルボキシ末端のドメインが欠失したガウシアルシフェラーゼは、ガウシアルシフェラーゼと同じ至適pHを有することを示している。
精製したガウシアルシフェラーゼまたはドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼの発光スペクトルを確認した。具体的には、10mM EDTAを含む30mM Tris-HCl (pH7.6)中で、ジャスコ(東京)FP-560 蛍光発光測定器(バンドパス 20nm;応答 0.5nm, Medium;スキャン速度 2000nm/分)、22〜25℃にて、石英キュベット(10mm光路)を用いて測定した。使用したガウシアルシフェラーゼ(hGL)の蛋白質濃度は140μg/mlであった。ドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼのhGL-27/97およびhGL-98/168の蛋白質量は、それぞれ80μg/ml、210μg/mlであった。発光強度を相対強度(%)で示した(図7)。
この結果より、アミノ末端およびカルボキシ末端のドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼは、ガウシアルシフェラーゼの発光スペクトルと同じであることが明らかとなった。これは、発光反応における励起分子種は同一であることを示している。
100mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.5) 200μlにエタノールに溶解した基質セレンテラジン(1μg/μl)と塩化銅溶液または塩化カルシウム溶液を懸濁した。この懸濁液、精製したガウシアルシフェラーゼ(hGL)またはドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ(hGL-27/97、hGL-98/168)(2μl)を混合して発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200(アトー社製)で10秒間発光活性の測定を行った。使用した蛋白質量は、hGLが0.4μg、hGL-27/97が0.08μg、hGL-98/168が0.1μgであった。塩化銅溶液または塩化カルシウム溶液の最終濃度は、0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM、1000μMとした。発光活性は最大値(Imax)を相対活性(%)で示した(図8)。この結果より、アミノ末端またはカルボキシ末端のドメインが欠失したガウシアルシフェラーゼは、ガウシアルシフェラーゼと同様に銅イオンによる阻害および塩素イオンによる活性化を受けることが明らかとなった。
100mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.5) 200μlに、エタノールに溶解した基質セレンテラジン(1μg/μl)とハロゲン化物イオン溶液(最終濃度5mM)を懸濁した。この懸濁液に、精製したガウシアルシフェラーゼ(hGL)またはドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ(hGL-27/97、hGL-98/168)(2μl)を混合して発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200(アトー社製)で10秒間発光活性の測定を行った。使用した蛋白質量は、hGLが0.32μg、hGL-27/97が0.08μg、hGL-98/168が0.04μgであった。発光活性は最大値(Imax)を相対活性(%)で示した(表3)。この結果より、アミノ末端またはカルボキシ末端のドメインが欠失したガウシアルシフェラーゼおよびガウシアルシフェラーゼにおいて、いずれも同様に塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンにより活性化(最大約17倍)されることが明らかとなった。
10mM EDTAを含む50mM Tris-HCl (pH7.6) 100μlにエタノールに溶解した基質セレンテラジンの誘導体(1μg/μl)を懸濁した。この懸濁液に、精製したガウシアルシフェラーゼ(hGL)またはドメイン欠失ガウシアルシフェラーゼ(hGL-27/97、hGL-98/168)(2μl)を混合して発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200(アトー社製)で10秒間発光活性の測定を行った。使用した蛋白質量は、hGLが0.32μg、hGL-27/97が0.08μg、hGL-98/168が0.10μgであった。発光活性は最大値(Imax)を相対活性(%)で示した(表4)。アミノ末端のドメインが欠失したガウシアルシフェラーゼ、カルボキシ末端のドメインが欠失したガウシアルシフェラーゼおよびガウシアルシフェラーゼは、いずれもセレンテラジンがもっとも良い基質であった。この結果より、アミノ末端のドメインが欠失したガウシアルシフェラーゼ、カルボキシ末端のドメインが欠失したガウシアルシフェラーゼおよびガウシアルシフェラーゼは、いずれも同様の基質特異性を示すことが明らかとなった。
本発明のポリヌクレオチドは、上述した本発明のポリペプチドをコードしているので、レポーター遺伝子として利用することができる。
また、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の形質転換体などは、本発明のポリペプチドの製造に利用することができる。
本発明の発光活性を活性化する方法によれば、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質の発光効率を向上させることができる。よって、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質を用いた検出マーカーなどの検出感度を向上させることができる。また、本発明のポリペプチドまたは本発明で用いられる蛋白質を用いたアミューズメント用品などの発光強度を向上させることができる。
Claims (15)
- 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のポリペプチド:
(a)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列において1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号:1または配列番号:3に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;および
(d)配列番号:13または配列番号:17のアミノ酸配列からなるポリペプチド。 - 以下の(a)〜(d)のいずれかである請求項1記載のポリペプチド:
(a)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列において1〜3個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号:1または配列番号:3に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;および
(d)配列番号:13または配列番号:17のアミノ酸配列からなるポリペプチド。 - 配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項1記載のポリペプチド。
- 配列番号:13または配列番号:17のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項1記載のポリペプチド。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 以下の(e)〜(i)のいずれかである請求項5記載のポリヌクレオチド:
(e)配列番号:2または配列番号:4の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(f)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(g)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列において1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(h)配列番号:1または配列番号:3に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;および
(i)配列番号:14または配列番号:18の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 以下の(e)〜(i)のいずれかである請求項5記載のポリヌクレオチド:
(e)配列番号:2または配列番号:4の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(f)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(g)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列において1〜3個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(h)配列番号:1または配列番号:3に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;および
(i)配列番号:14または配列番号:18の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 請求項5〜7のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターが導入された形質転換体を培養し、請求項1〜4のいずれかに記載のポリペプチドを生成させる工程を含む、請求項1〜4のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のポリペプチドを含むキット。
- 請求項5〜7のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むキット。
- さらにセレンテラジンを含む、請求項9または10記載のキット。
- 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のポリペプチド:
(a)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列において1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号:1または配列番号:3に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;および
(d)配列番号:13または配列番号:17のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、セレンテラジンとを接触させることを含む、発光反応を行う方法。 - ハロゲン化物イオン存在下で発光反応を行う、請求項12記載の方法。
- ハロゲン化物イオンが、フッ素イオン、臭素イオンまたはヨウ素イオンである、請求項13記載の方法。
- 臭素イオンまたはヨウ素イオンを用いて、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のポリペプチド:
(a)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列を含有するポリペプチド;
(b)配列番号:1または配列番号:3のアミノ酸配列において1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつセレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号:1または配列番号:3に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつセレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有するポリペプチド;および
(d)配列番号:13または配列番号:17のアミノ酸配列からなるポリペプチド;または
以下の(a)〜(d)のいずれかに記載の蛋白質:
(a)配列番号:6のアミノ酸配列を含有し、かつセレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質;
(b)配列番号:6のアミノ酸配列において1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を含有し、かつセレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質;
(c)配列番号:6のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつセレンテラジンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質;および
(d)配列番号:8のアミノ酸配列からなる蛋白質、
のセレンテラジンを基質とする発光活性を活性化する方法。
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