JP5240970B2 - Cholesterol oxidase stable in the presence of surfactants - Google Patents
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Description
本発明は、界面活性剤存在下で安定性を有する新規なコレステロールオキシダーゼおよび新規なコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子に関する。 The present invention relates to a novel cholesterol oxidase having stability in the presence of a surfactant and a gene encoding the novel cholesterol oxidase.
コレステロールオキシダーゼは、３β−ヒドロキシステロイドと酸素の間の反応を触媒し、相当する３−オキソステロイドと過酸化水素を生成する酸化酵素である。現在までに、体液中のコレステロール濃度の測定（例えば、特許文献１参照）、コレステロール誘導体の製造（例えば、特許文献２参照）、殺虫剤（例えば、特許文献３参照）、洗剤（例えば、特許文献４参照）等に利用することを目的として研究開発されている。 Cholesterol oxidase is an oxidase that catalyzes the reaction between 3β-hydroxysteroid and oxygen to produce the corresponding 3-oxosteroid and hydrogen peroxide. To date, measurement of cholesterol concentration in body fluid (for example, see Patent Document 1), production of cholesterol derivatives (for example, see Patent Document 2), insecticide (for example, see Patent Document 3), detergent (for example, Patent Document) 4)) for the purpose of use.
該酵素はストレプトマイセス（例えば、特許文献５参照）、ブレビバクテリウム（例えば、特許文献６参照）、ロドコッカス（例えば、特許文献７参照）、シュードモナス（例えば、特許文献８参照）等多種の微生物により生産されることが知られている。 The enzyme includes various microorganisms such as Streptomyces (see, for example, Patent Document 5), Brevibacterium (for example, see Patent Document 6), Rhodococcus (for example, see Patent Document 7), Pseudomonas (for example, see Patent Document 8). It is known to be produced by
バークホルデリア セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）菌株ＳＴ−２００｛旧分類ではPseudomonas sp. 菌株ＳＴ−２００であり、１９９８年２月４日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６１である。｝より単離されたコレステロールオキシダーゼ（例えば、特許文献９参照）は、今までに知られたコレステロールオキシダーゼと比較して、コレステロールを基質とした際の生成物が異なること、反応機構が異なること、高い有機溶剤耐性、温度安定性を持つなどの特徴がある。バークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼは遺伝子がクローニングされ、様々な宿主において組換え体コレステロールオキシダーゼの高生産が、分泌、細胞内を問わず可能である(例えば、特許文献１０参照)。 Burkholderia cepacia strain ST-200 (formerly Pseudomonas sp. Strain ST-200, dated February 4, 1998, NIBH) Deposited at 1-3-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan. The accession number is FERM BP-6661. }, The cholesterol oxidase isolated from (for example, see Patent Document 9) is different from the cholesterol oxidase known so far in that the product when cholesterol is used as a substrate, the reaction mechanism is different, It has features such as high organic solvent resistance and temperature stability. Cholesterol oxidase derived from Burkholderia cepacia strain ST-200 has a cloned gene, and high production of recombinant cholesterol oxidase is possible in various hosts, whether secreted or intracellular (see, for example, Patent Document 10). .
臨床診断薬に使用する酵素に求められる特性は、多くの場合、対象物に対する高い反応性、特異性、製品としての保存安定性に影響する熱安定性などであるが、コレステロール測定においては、対象物を高い特異性で測定するために、高濃度で界面活性剤を処方することが多く、そのため使用する酵素には上記の特性のほかに界面活性剤共存下での保存安定性が強く求められている。バークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼは、先に述べた優れた性質を持つものの、界面活性剤共存下での保存安定性に劣ることが、コレステロール測定試薬への応用を妨げていた。 The properties required for enzymes used in clinical diagnostics are, in many cases, high reactivity to the target, specificity, and thermal stability that affects storage stability as a product. In order to measure substances with high specificity, surfactants are often formulated at a high concentration. Therefore, in addition to the above properties, the enzyme used is strongly required to have storage stability in the presence of surfactants. ing. Although the cholesterol oxidase derived from Burkholderia cepacia strain ST-200 has the above-mentioned excellent properties, its inferior storage stability in the presence of a surfactant has hindered its application to a cholesterol measuring reagent. .
コレステロール測定系で使用される界面活性剤は、陰イオン系界面活性剤としては、１−ペンタンスルホン酸塩、１−ヘキサンスルホン酸塩、１−ヘプタンスルホン酸塩、１−オクタンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、コール酸塩（コール酸ナトリウム）、コール酸、デヒドロコール酸塩、デオキシコール酸、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、N,N-ビス(3-D-グルコンアミドプロピル)コールアミド、N,N-ビス-3-D-グルコンアミドプロピルコールアミド、ドデシルベンゼンスルホン酸塩、ラウロイルサルコシンなどが用いられている（例えば、特許文献１１〜１７参照）。また、陽イオン系界面活性剤としては、n-ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルピリジニウムクロリド等が用いられている（例えば、特許文献１７参照）。
Surfactants used in the cholesterol measurement system include anionic surfactants such as 1-pentanesulfonate, 1-hexanesulfonate, 1-heptanesulfonate, 1-octanesulfonate, Oxyethylene alkyl ether sulfate, sodium dodecylbenzenesulfonate, cholate (sodium cholate), cholic acid, dehydrocholate, deoxycholic acid, sodium deoxycholate, sodium taurodeoxycholate, N, N-bis (3-D-Gluconamidopropyl) coleamide, N, N-bis-3-D-gluconamidopropylcoleamide, dodecylbenzenesulfonate, lauroyl sarcosine and the like are used (for example,
非イオン系界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル、アルキルポリオキシエチレンエーテル、n-ドデシル-β-D-マルトシド、シュークロースモノラウレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレングリコールp-t-オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、グリセリン脂肪酸エステル、n-オクチル-β-D-グルコシド、ポリオキシエチレングリコールモノドデシルエーテル、n-オクチル-β-D-チオグルコシド、セチルエーテル(C16)、ラウリルエーテル（C12）、オレイルエーテル、ベヘニルエーテル（C20）、ポリオキシエチレンモノラウレート等が用いられている（例えば、特許文献１２〜２５参照）。 Nonionic surfactants include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether, polyoxyethylene-polyoxypropylene condensate, acyl polyoxyethylene sorbitan ester, alkyl polyoxyethylene ether, n-dodecyl-β -D-maltoside, sucrose monolaurate, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene alkylene phenyl ether, polyoxyethylene alkylene tribenzyl phenyl ether, polyoxyethylene glycol pt-octyl phenyl ether, polyoxyethylene higher alcohol ether, Polyoxyethylene fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitol Fatty acid ester, polyoxyethylene alkylamine, glycerin fatty acid ester, n-octyl-β-D-glucoside, polyoxyethylene glycol monododecyl ether, n-octyl-β-D-thioglucoside, cetyl ether (C16), lauryl Ether (C12), oleyl ether, behenyl ether (C20), polyoxyethylene monolaurate and the like are used (for example, see Patent Documents 12 to 25).
また、両性界面活性剤としては、ベタイン誘導体、アルキルベタイン誘導体、イミダゾリウムベタイン誘導体、スルホベタイン誘導体、アミノカルボン酸誘導体、イミダゾリン誘導体、アミンオキサノイド誘導体、胆汁酸誘導体等が用いられている（例えば、特許文献１４，１７〜１９参照）。
本発明は、このような従来のバークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼの有する欠点を克服し、界面活性剤処方下で高い安定性を有するコレステロールオキシダーゼおよびそれをコードする遺伝子を提供することにある。 The present invention overcomes the drawbacks of cholesterol oxidase derived from such a conventional Burkholderia cepacia strain ST-200, and provides cholesterol oxidase having high stability under a surfactant formulation and a gene encoding the same. There is.
本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、バークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼ遺伝子（特開２００２−６５２７１号公報記載）の改変を行った結果、界面活性剤処方下で高い安定性を有する新規なコレステロールオキシダーゼが得られること等を見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have modified the cholesterol oxidase gene derived from Burkholderia cepacia strain ST-200 (described in JP-A-2002-65271), and as a result, The inventors have found that a novel cholesterol oxidase having high stability under the active agent formulation can be obtained, and have completed the present invention.
即ち、本発明は、
１）下記の理化学的性質を有し、界面活性剤に対する安定性が改善されたことを特徴とする新規なコレステロールオキシダーゼであり、
（ａ）作用及び基質特異性：コレステロールに作用して、コレスト‐５‐エン‐３‐オンに変換する；コレスト‐５‐エン‐３‐オンに作用してこれを６β‐パーヒドロキシコレスト‐４‐エン‐３‐オンに変換する。３β−ステロール類に作用し、３α−ヒドロキシステロイドには作用しない。
（ｂ）分子量：約６０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
２）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質であり、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
３）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質であり、
（ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
４）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子であり、
（ａ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ中の連続する１５塩基以上、またはこれらに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示し、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
５）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長、配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ中の連続する１５塩基以上、またはこれらに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示し、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
That is, the present invention
1) A novel cholesterol oxidase having the following physicochemical properties and improved stability to a surfactant:
(A) Action and substrate specificity: acts on cholesterol to convert to choles-5-en-3-one; acts on choles-5-en-3-one to convert it to 6β-perhydroxycholest- Convert to 4-en-3-one. It acts on 3β-sterols and does not act on 3α-hydroxysteroids.
(B) Molecular weight: about 60,000 (SDS-PAGE)
2) A protein having the following cholesterol oxidase activity (a), (b) or (c):
(A) A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A protein having a novel cholesterol oxidase activity, comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(C) A protein having a novel cholesterol oxidase activity, comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
3) A protein having the following cholesterol oxidase activity (a), (b) or (c):
(A) A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
(B) A protein having a novel cholesterol oxidase activity, comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
(C) A protein having a novel cholesterol oxidase activity, comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
4) A gene comprising the following DNA (a), (b) or (c):
(A) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
(B) the full length of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, 15 or more consecutive bases in the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, or a DNA comprising a base sequence complementary thereto A DNA encoding a protein that hybridizes under stringent conditions and has a novel cholesterol oxidase activity.
(C) a DNA encoding a protein having a novel cholesterol oxidase activity that exhibits 80% or more homology with a full-length DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a portion of 15 or more bases thereof;
5) A gene comprising the following DNA (a), (b) or (c).
(A) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6.
(B) the full length of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, 15 or more consecutive bases in the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, or a DNA consisting of a base sequence complementary thereto A DNA encoding a protein that hybridizes under stringent conditions and has a novel cholesterol oxidase activity.
(C) a DNA encoding a protein having a novel cholesterol oxidase activity that exhibits 80% or more homology with a full-length DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or a portion of 15 or more bases thereof;
本発明によれば、臨床診断用酵素として試薬中に処方する上で、より界面活性剤に対する安定性の高いコレステロールオキシダーゼおよびそれをコードする遺伝子が提供され、産業上有用である。 According to the present invention, a cholesterol oxidase having higher stability to a surfactant and a gene encoding the same are provided and are industrially useful when formulated in a reagent as an enzyme for clinical diagnosis.
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の新規なコレステロールオキシダーゼ（以下、「本発明オキシダーゼ」という）とは、下記の理化学的性質を有し、界面活性剤存在下での保存安定性が改善されたコレステロールオキシダーゼである。
（ａ）作用及び基質特異性：コレステロールに作用して、コレスト‐５‐エン‐３‐オンに変換する；コレスト‐５‐エン‐３‐オンに作用してこれを６β‐パーヒドロキシコレスト‐４‐エン‐３‐オンに変換する。３β−ステロール類に作用し、３α−ヒドロキシステロイドには作用しない。
（ｂ）分子量：約６０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
常法により、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品社製）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により求める。
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The novel cholesterol oxidase of the present invention (hereinafter referred to as “the oxidase of the present invention”) is a cholesterol oxidase having the following physicochemical properties and improved storage stability in the presence of a surfactant.
(A) Action and substrate specificity: acts on cholesterol to convert to choles-5-en-3-one; acts on choles-5-en-3-one to convert it to 6β-perhydroxycholest- Convert to 4-en-3-one. It acts on 3β-sterols and does not act on 3α-hydroxysteroids.
(B) Molecular weight: about 60,000 (SDS-PAGE)
It is determined by the SDS-PAGE method using Multigel 10/20 (Daiichi Chemical Co., Ltd.) by a conventional method.
このように、本発明オキシダーゼは、その理化学的性質において、公知の何れのコレステロールオキシダーゼとも異なっており、新規なコレステロールオキシダーゼである。従って、保存安定性の優れた臨床診断用酵素としてキット試薬中に処方することができる。 Thus, the oxidase of the present invention is a novel cholesterol oxidase that is different from any known cholesterol oxidase in its physicochemical properties. Therefore, it can be formulated in a kit reagent as an enzyme for clinical diagnosis having excellent storage stability.
本発明オキシダーゼとしては、天然界よりスクリーニングして得られる種々の生物由来のオキシダーゼや従来公知のコレステロールオキシダーゼを改変して得られるオキシダーゼなどを挙げることができるが、例えば、一例として、以下の（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）又は（ｈ）などの本発明オキシダーゼ等が挙げられる。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼ。
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入されたアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼ。
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼ。
（ｆ）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼ。
（ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入されたアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼ。
（ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼ。
ここで「１個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入された」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入されたことを意味する。また「８０％以上の相同性を示す」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であれば特に制限がなく、例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
Examples of the oxidase of the present invention include oxidases derived from various organisms obtained by screening from the natural world and oxidases obtained by modifying conventionally known cholesterol oxidase. For example, the following (c) ), (D), (e), (f), (g) or (h) of the present oxidase.
(C) Cholesterol oxidase comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(D) A cholesterol oxidase comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added and / or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(E) A cholesterol oxidase comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(F) Cholesterol oxidase comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
(G) A cholesterol oxidase comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added and / or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
(H) A cholesterol oxidase comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
Here, “one or more amino acids are deleted, substituted, added and / or inserted” means, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5 in any number. It means that an amino acid has been deleted, substituted, added and / or inserted. “Showing 80% or more homology” is not particularly limited as long as the homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is 80% or more, for example, 80% or more, preferably 90% or more. Most preferably, it is 95% or more.
本発明の新規なコレステロールオキシダーゼをコードするコレステロールオキシダーゼ遺伝子（以下、「本発明遺伝子」という）としては、例えば、上記（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）又は（ｈ）などの本発明オキシダーゼをコードする遺伝子や、さらに、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡを含む本発明オキシダーゼをコードする遺伝子等が挙げられる。
（ａ）配列番号４で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ中の連続する１５塩基以上、またはこれらに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列の全長又は１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示す塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号６で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｅ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長、配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ中の連続する１５塩基以上、またはこれらに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｆ）配列番号６で表される塩基配列の全長又は１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示す塩基配列を含むＤＮＡ。
ここで「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、６５℃でハイブリダイゼーションを行なった後、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Current Protocols in Molecular Biology （WILEY Interscience，1989）等に記載されている方法に準じて行なうことができる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。本発明における、「全長又は塩基配列の１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示す塩基配列を含むＤＮＡ」の相同性は、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
As the cholesterol oxidase gene encoding the novel cholesterol oxidase of the present invention (hereinafter referred to as “the gene of the present invention”), for example, the above (c), (d), (e), (f), (g) or ( h) and other genes encoding the oxidase of the present invention, as well as the oxidase of the present invention containing the following DNA (a), (b), (c), (d), (e) or (f) Genes and the like.
(A) DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
(B) the full length of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, 15 or more consecutive bases in the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, or a DNA comprising a base sequence complementary thereto DNA containing a base sequence that hybridizes under stringent conditions.
(C) DNA comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and having a base sequence showing 80% or more homology with a portion of 15 bases or more.
(D) DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 6.
(E) the full length of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, 15 or more consecutive bases in the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, or a DNA consisting of a base sequence complementary thereto DNA containing a base sequence that hybridizes under stringent conditions.
(F) DNA comprising a full-length base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or a base sequence showing 80% or more homology with a portion of 15 bases or more.
Here, “hybridizes under stringent conditions” means DNA obtained by using a DNA as a probe and using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like. Specifically, it can be identified by performing hybridization at 65 ° C. using a filter immobilizing colony or plaque-derived DNA or a fragment of the DNA, and then washing the filter at 65 ° C. Mention may be made of DNA. Hybridization can be performed according to the method described in Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience, 1989). Examples of DNA that hybridizes under stringent conditions include DNA having a certain degree of homology with the base sequence of DNA used as a probe. In the present invention, the homology of “DNA containing a base sequence showing 80% or more homology with the full length or 15 or more base portions of the base sequence” is, for example, 80% or more, preferably 90% or more, and most preferably 95 % Or more.
次に本発明オキシダーゼ及び本発明遺伝子の取得方法について説明する。
本発明オキシダーゼは、微生物や動物、植物起源の酵素を探索して、自然界より得ることができる。さらに、遺伝子工学的技術や変異処理などの方法を用い、本発明酵素と異なる理化学的性質を有するコレステロールオキシダーゼ（以下、「性質を異にするオキシダーゼ」という）を改変することにより、本発明オキシダーゼを得ることもできる。本発明でいう性質を異にするオキシダーゼとしては、先に述べた既知のオキシダーゼなどが挙げられるが、新たに探索して得られたコレステロールオキシダーゼや遺伝子工学的技術により改変して得られたコレステロールオキシダーゼなどでもよい。例えば、既知のオキシダーゼとしては、好ましくは、バークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼ（特許第３２４１７１２号、特開２００２−６５２７１号公報記載）などが挙げられる。上記コレステロールオキシダーゼは、本来はシグナル配列を持つ分泌たんぱく質であるが、シグナル配列を残したまま用いてもかまわないし、シグナル配列を除去して細胞内に生産してもかまわない。
Next, the method for obtaining the oxidase of the present invention and the gene of the present invention will be described.
The oxidase of the present invention can be obtained from nature by searching for enzymes of microbial, animal or plant origin. Furthermore, the present oxidase is modified by modifying cholesterol oxidase having a physicochemical property different from that of the enzyme of the present invention (hereinafter referred to as “oxidase having different properties”) using a method such as genetic engineering or mutation treatment. It can also be obtained. Examples of the oxidase having different properties in the present invention include the known oxidase described above, cholesterol oxidase obtained by newly searching, and cholesterol oxidase obtained by modification by genetic engineering techniques. Etc. For example, a known oxidase preferably includes cholesterol oxidase derived from Burkholderia cepacia strain ST-200 (Patent No. 32241712, JP-A No. 2002-65271). The cholesterol oxidase is originally a secreted protein having a signal sequence. However, the cholesterol oxidase may be used while leaving the signal sequence, or may be produced in the cell after removing the signal sequence.
性質を異にするオキシダーゼの理化学的性質を改変する方法としては、該オキシダーゼを生産する微生物などに、例えば、紫外線、Ｘ線、放射線などを照射したり、もしくはエチルメタンサルフォネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸などの変異誘発剤を接触させることにより、改変された本発明オキシダーゼを生産する微生物を得、得られた微生物から本発明オキシダーゼを得る方法などが挙げられる。 Examples of a method for modifying the physicochemical properties of oxidases having different properties include irradiating microorganisms that produce the oxidase with ultraviolet rays, X-rays, radiation, etc., or ethyl methanesulfonate, N-methyl -N'-nitro-N-nitrosoguanidine, a method for obtaining a microorganism producing the oxidase of the present invention by contacting with a mutagen such as nitrous acid, and obtaining the oxidase of the present invention from the obtained microorganism Can be mentioned.
しかし、一般的には、遺伝子工学的な技術を用い、性質を異にするオキシダーゼなどをコードする遺伝子を改変することにより、本発明オキシダーゼを得ることができる。本発明に用いられる性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子としては、改変により本発明オキシダーゼを得ることのできる遺伝子であれば、如何なるコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子でも用いることができる。 However, in general, the oxidase of the present invention can be obtained by modifying a gene encoding an oxidase or the like having different properties using genetic engineering techniques. As a gene encoding an oxidase having different properties used in the present invention, any gene encoding a cholesterol oxidase can be used as long as it can be obtained by modification.
本発明に用いる、性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、性質を異にするオキシダーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（WILEY Interscience，1989）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製する。ついで、上記性質を異にするオキシダーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーからスクリーニングする方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。このようにして得られた性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、バークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼ遺伝子（特開２００２−６５２７１号公報記載）などが挙げられる。これらの遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましく、例えば、単離したバークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来の性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＣｏｘ４ＤＮＡ（特開２００２−６５２７１号公報記載）から、例えば、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）を用いることにより、抽出、精製して得られる。なお、本発明において用いることの出来るベクターＤＮＡとしては、上記プラスミドベクターＤＮＡに限定されることなくそれ以外の、例えば、プラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等を用いることが出来る。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ+ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が好ましい。 In order to obtain a gene encoding an oxidase having different properties used in the present invention, a generally used gene cloning method is used. For example, chromosomal DNA or mRNA is extracted from microbial cells having various oxidase producing ability and various cells by a conventional method, for example, a method described in Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience, 1989). Furthermore, cDNA can be synthesized using mRNA as a template. A library of chromosomal DNA or cDNA thus obtained is prepared. Next, a suitable probe DNA is synthesized based on the amino acid sequence of an oxidase having a different property as described above, and a method is used for screening from a chromosomal DNA or cDNA library. Primer DNA is prepared, DNA containing the gene fragment of interest is amplified by an appropriate polymerase chain reaction (PCR method) such as 5'RACE method or 3'RACE method, and these are ligated to obtain the full-length gene of interest. The containing DNA can be obtained. A preferable example of a gene encoding an oxidase having different properties thus obtained includes a cholesterol oxidase gene derived from Burkholderia cepacia strain ST-200 (described in JP-A-2002-65271). It is preferable for handling that these genes are linked to various vectors as usual, for example, a set comprising a gene encoding an oxidase having different properties derived from isolated Burkholderia cepacia strain ST-200. It can be obtained by extraction and purification from recombinant plasmid pCox4DNA (described in JP-A-2002-65271) using, for example, QIAGEN (manufactured by Qiagen). In addition, as vector DNA which can be used in this invention, it is not limited to the said plasmid vector DNA, For example, plasmid vector DNA, bacteriophage vector DNA, etc. other than that can be used. Specifically, for example, pBluescript II SK + (manufactured by STRATAGENE) is preferable.
次に、上記の方法で得られた性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子を改変することにより、本発明オキシダーゼを得ることができる。すなわち、本発明においては、性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子が改変されることにより、その遺伝子により翻訳される性質を異にするオキシダーゼのアミノ酸配列が改変される。その結果、本発明オキシダーゼを含む、改変前の性質を異にするオキシダーゼと種々の性質の異なるコレステロールオキシダーゼが得られる。 Next, the oxidase of the present invention can be obtained by modifying a gene encoding an oxidase having different properties obtained by the above method. That is, in the present invention, by modifying a gene encoding an oxidase having a different property, the amino acid sequence of an oxidase having a different property translated by the gene is modified. As a result, an oxidase having a different property before modification and a cholesterol oxidase having various properties, including the oxidase of the present invention, can be obtained.
改変に用いる性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子は特に限定されないが、本発明の一実施態様として、バークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来の性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子（特開２００２−６５２７１号公報記載、配列番号３）などを挙げることができる。さらに、この遺伝子を宿主生物で発現させるのに適したようにアミノ酸残基を付加、欠失、置換しないように、又は付加、欠失、置換するように塩基配列を改変したものもあげることが出来る。 A gene encoding an oxidase having a different property to be used for modification is not particularly limited. As one embodiment of the present invention, a gene encoding an oxidase having a different property derived from Burkholderia cepacia strain ST-200 (Japanese Patent Application Laid-Open (JP-A)). No. 2002-65271, SEQ ID NO: 3) and the like. Furthermore, the gene sequence may be modified so that amino acid residues are not added, deleted, or substituted, or added, deleted, or substituted as appropriate for expression of this gene in the host organism. I can do it.
上記遺伝子を改変する方法としては、既知の如何なる方法でも用いることができるが、例えば、前記の組換え体プラスミドｐＣｏｘ４ＤＮＡ（特２００２−６５２７１号公報記載）に、ハイドロキシルアミン、亜硝酸などの化学変異剤を接触させる方法、またはＰＣＲ法を用いてランダムに変換する等の点変異方法、市販のキットを使用する部位特異的な置換または欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特異的変異誘導法、この組換え体プラスミドＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択されたオリゴヌクレオチドを除去又は付加し、連結する方法、すなわちオリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。次いで、上記処理後の組換え体ＤＮＡを脱塩カラム、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）等を用いて精製し、種々の組換え体ＤＮＡを得る。この際、ｐＣｏｘ４ＤＮＡのコレステロールオキシダーゼのアミノ末端側のシグナル配列をコードする塩基配列を除去し、代わりに開始メチオニンをコードするATGを付加した組換え体ＤＮＡや、アミノ末端側をコードした塩基配列を大腸菌などの宿主生物で発現させるのに適した配列に置換した組換え体ＤＮＡを用いてもよい。 As a method for modifying the gene, any known method can be used. For example, the recombinant plasmid pCox4DNA (described in Japanese Patent Publication No. 2002-65271) can be used for chemical mutation agents such as hydroxylamine and nitrous acid. Mutation method, which is a well-known technique for generating site-specific substitution or deletion mutation using a commercially available kit. And a method of selectively cleaving the recombinant plasmid DNA, then removing or adding the selected oligonucleotide, and ligating, that is, an oligonucleotide mutagenesis method and the like. Next, the recombinant DNA after the above treatment is purified using a desalting column, QIAGEN (manufactured by Qiagen) or the like to obtain various recombinant DNAs. At this time, the base sequence encoding the signal sequence on the amino terminal side of cholesterol oxidase of pCox4DNA was removed, and the recombinant DNA added with ATG encoding the start methionine, or the base sequence encoding the amino terminal side was replaced with E. coli. Recombinant DNA substituted with a sequence suitable for expression in a host organism such as
このようにして得られた種々の組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９、ＤＨ５α（共に東洋紡社製）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（フナコシ（株）製）等を形質転換又は形質導入し、種々の改変されたコレステロールオキシダーゼ遺伝子断片を保有する組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体を得ることが出来る。そして、例えば、形質転換体の場合、得られた形質転換体（その中に種々の変異コレステロールオキシダーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミドＤＮＡを含有している）より、目的の本発明の界面活性剤存在下での安定性を有する形質転換体（本発明オキシダーゼ生産株）を選抜する。 Using various recombinant DNAs thus obtained, for example, E. coli K12, preferably E. coli JM109, DH5α (both manufactured by Toyobo Co., Ltd.), XL1-Blue (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.), etc. are transformed or Transformants or transductants containing recombinant DNA carrying various modified cholesterol oxidase gene fragments can be obtained by transduction. For example, in the case of a transformant, the desired surfactant of the present invention is present from the obtained transformant (containing recombinant plasmid DNA containing various mutant cholesterol oxidase genes therein). A transformant (inventive oxidase producing strain) having the following stability is selected.
次に、本発明オキシダーゼ生産株を選抜するためには、例えば、次のような方法を用いることができる。先ず、得られた上記形質転換体のコロニーを滅菌したＬＢ液体培地を入れ、アンピシリンを添加した滅菌済み９６穴プレートに植え継ぎ培養する。十分に生育した後、リゾチームなどの溶菌剤を添加し、３７℃で１時間ほど静置し、溶菌させる。溶菌したら、適切な界面活性剤を含んだ０．２％牛血清アルブミンを含んだ０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を５０μＬ各セルに入れた９６穴プレートの対応したセルに、溶菌した培養液を５０μＬ加え懸濁し、３７℃、５時間処理する。その後、基質であるコレステロール、トリトンX−１００、コール酸ナトリウム、ペルオキシダーゼ、フェノール、４−アミノアンチピリンを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を１００μＬ加え懸濁し、赤紫色の発色の度合いを観察する。改変前の性質を異にするオキシダーゼ生産株についても同様の工程で発色試験を行い、その比較により目的とする形質転換体を選抜する。 Next, in order to select the oxidase-producing strain of the present invention, for example, the following method can be used. First, LB liquid medium in which the obtained colonies of the transformants are sterilized is put, and the cells are transplanted and cultured in a sterilized 96-well plate to which ampicillin has been added. After sufficient growth, a lysing agent such as lysozyme is added, and the mixture is allowed to stand at 37 ° C. for about 1 hour for lysis. Once lysed, the cells were lysed in the corresponding cells of a 96-well plate containing 50 μL of 0.1 M MES buffer (pH 7.0) containing 0.2% bovine serum albumin containing an appropriate surfactant in each cell. 50 μL of the culture solution is added, suspended, and treated at 37 ° C. for 5 hours. Thereafter, 100 μL of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing the substrates cholesterol, Triton X-100, sodium cholate, peroxidase, phenol, and 4-aminoantipyrine was added and suspended, and reddish purple coloration was observed. Observe the degree. For oxidase-producing strains having different properties before modification, a color development test is performed in the same process, and a target transformant is selected by comparison.
使用する界面活性剤は、先に述べたコレステロール測定系に用いられる界面活性剤であればどのようなものでもかまわないが、望ましくは陰イオン系界面活性剤としては、１−ペンタンスルホン酸塩、１−ヘキサンスルホン酸塩、１−ヘプタンスルホン酸塩、１−オクタンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（商品名、エマール２０Ｃ、エマールＮＣ−３５（以上花王製））、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、コール酸塩（コール酸ナトリウム）、コール酸、デヒドロコール酸塩、デオキシコール酸、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、N,N-ビス(3-D-グルコンアミドプロピル)コールアミド、N,N-ビス-3-D-グルコンアミドプロピルコールアミド、ドデシルベンゼンスルホン酸塩、ラウロイルサルコシン等、また陽イオン系界面活性剤としては、n-ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルピリジニウムクロリド等、また非イオン系界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（商品名、エマルゲン２２０、エマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０８、エマルゲン４０８など（以上花王製））、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（商品名、エマルゲン９０３、エマルゲン９０９、エマルゲン９１３など（以上花王製））、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物（商品名、プルロニックＦ８８（旭電化製））、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル（商品名、Ｔｗｅｅｎ２１、Ｔｗｅｅｎ８１、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０，Ｔｗｅｅｎ８０，Ｔｗｅｅｎ８５、Ｅｍａｓｏｌ４１３０など）、アルキルポリオキシエチレンエーテル（商品名、ＡｔｌａｓＧ２１２７、Ｂｒｉｊ３６Ｔ、Ｂｒｉｊ５６など）、n-ドデシル-β-D-マルトシド、シュークロースモノラウレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名、エマルゲン１２０など）、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル（商品名、エマルゲンＡ６０など）、ポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテル（商品名、エマルゲンＢ６６など）、ポリオキシエチレングリコールp-t-オクチルフェニルエーテル（商品名、ＴｒｉｏｔｏｎＸ１００）、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル（商品名、エマルゲン７０５、エマルゲン７０９など）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、グリセリン脂肪酸エステル、n-オクチル-β-D-グルコシド、ポリオキシエチレングリコールモノドデシルエーテル、n-オクチル-β-D-チオグルコシド、セチルエーテル(C16)、ラウリルエーテル（C12）、オレイルエーテル、ベヘニルエーテル（C20）、ポリオキシエチレンモノラウレート等、また両性界面活性剤としては、ベタイン誘導体、アルキルベタイン誘導体、イミダゾリウムベタイン誘導体、スルホベタイン誘導体、アミノカルボン酸誘導体、イミダゾリン誘導体、アミンオキサノイド誘導体、胆汁酸誘導体等であることが望ましく、特に非イオン系界面活性剤であることがより一層望ましい。 The surfactant to be used may be any surfactant as long as it is used in the cholesterol measurement system described above. Desirably, as the anionic surfactant, 1-pentanesulfonate, 1-hexane sulfonate, 1-heptane sulfonate, 1-octane sulfonate, polyoxyethylene alkyl ether sulfate (trade name, EMAL 20C, EMAL NC-35 (manufactured by Kao)), dodecylbenzene sulfonic acid Sodium, cholate (sodium cholate), cholic acid, dehydrocholate, deoxycholic acid, sodium deoxycholate, sodium taurodeoxycholate, N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) coleamide , N, N-bis-3-D-gluconamidopropylcholamide, dodecylbenzenesulfonate, Uroyl sarcosine and the like, and cationic surfactants such as n-dodecyltrimethylammonium chloride and hexadecylpyridinium chloride, and nonionic surfactants include polyoxyethylene alkyl ether (trade name, Emulgen 220, Emulgen 104P, Emulgen 108, Emulgen 408, etc. (above Kao), polyoxyethylene alkyl phenyl ether (trade name, Emulgen 903, Emulgen 909, Emulgen 913, etc. (above Kao)), polyoxyethylene-polyoxypropylene condensation Product (trade name, Pluronic F88 (Asahi Denka)), acyl polyoxyethylene sorbitan ester (trade name, Tween 21, Tween 81, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 8) , Tween 85, Emasol 4130, etc.), alkyl polyoxyethylene ether (trade name, Atlas G2127, Brij 36T, Brij 56, etc.), n-dodecyl-β-D-maltoside, sucrose monolaurate, polyoxyethylene lauryl ether (trade name, Emulgen) 120), polyoxyethylene alkylene phenyl ether (trade name, Emulgen A60, etc.), polyoxyethylene alkylene tribenzyl phenyl ether (trade name, Emulgen B66, etc.), polyoxyethylene glycol pt-octyl phenyl ether (trade name, Triton X100) ), Polyoxyethylene higher alcohol ether (trade name, Emulgen 705, Emulgen 709, etc.), polyoxyethylene fatty acid ester), polyoxy Siethylene sorbitan fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester, polyoxyethylene alkylamine, glycerin fatty acid ester, n-octyl-β-D-glucoside, polyoxyethylene glycol monododecyl ether, n-octyl-β -D-thioglucoside, cetyl ether (C16), lauryl ether (C12), oleyl ether, behenyl ether (C20), polyoxyethylene monolaurate and the like, and amphoteric surfactants include betaine derivatives, alkyl betaine derivatives, Desirable are imidazolium betaine derivatives, sulfobetaine derivatives, aminocarboxylic acid derivatives, imidazoline derivatives, amine oxanoid derivatives, bile acid derivatives, and the like, and even more desirable nonionic surfactants. Arbitrariness.
この様にして本発明オキシダーゼ生産能を有する形質転換体を得ることができる。例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するバークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼ（特許第３２４１７１２号公報）について、上記改変方法を用いて得られた、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む本発明オキシダーゼなどを挙げることができる。さらに必要により、この本発明オキシダーゼ生産能を有する形質転換体を用い、本発明遺伝子を、上記した改変方法により、さらに改変を繰り返し行なうことにより、さらに界面活性剤に対する安定性の高い改変された本発明オキシダーゼ及びその生産能を有する形質転換体を得ることもできる。すなわち本発明においては、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入されたアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼなども本発明オキシダーゼに含まれる。例えば、具体的には、後述の実施例に示す本発明オキシダーゼ（Ｒ７）などを挙げることができる。Ｒ７は、配列番号２で表されるアミノ酸配列から３アミノ酸残基が置換されており、９０％以上の相同性を有している。また、このようにして得られた本発明オキシダーゼを生産する形質転換体の一例としては、界面活性剤共存下での残存活性率が８０％になった配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む本発明オキシダーゼ（Ｒ１）生産大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＮＣＰ１）を挙げることができる。 In this way, a transformant having the ability to produce the oxidase of the present invention can be obtained. For example, for cholesterol oxidase derived from Burkholderia cepacia strain ST-200 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (Japanese Patent No. 32241712), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 obtained using the above-described modification method is Examples of the oxidase according to the present invention include: If necessary, this transformant having the ability to produce the oxidase of the present invention is used, and the gene of the present invention is further modified by the above-described modification method, thereby further modifying the highly stable surfactant against the surfactant. Inventive oxidase and a transformant having the production ability thereof can also be obtained. That is, in the present invention, a cholesterol oxidase containing an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added and / or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the amino acid represented by SEQ ID NO: 2 Cholesterol oxidase containing an amino acid sequence showing 80% or more homology with the sequence is also included in the oxidase of the present invention. For example, the oxidase (R7) of the present invention shown in Examples described later can be specifically mentioned. R7 has 3 amino acid residues substituted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and has 90% or more homology. In addition, as an example of a transformant that produces the oxidase of the present invention obtained in this way, a book containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 having a residual activity rate of 80% in the presence of a surfactant. Inventive oxidase (R1) producing E. coli JM109 (pNCP1) can be mentioned.
また本発明遺伝子の一例として、上記した本発明オキシダーゼ（Ｒ１）遺伝子（配列番号６）を挙げることができる。配列番号５をコードする配列番号６を含む遺伝子を含むプラスミドｐＮＣＰ１は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−１０３４３として寄託されている。さらに本発明遺伝子として、配列番号２又は５で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入されたアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼおよび配列番号２又は５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼなどの本発明オキシダーゼをコードする遺伝子や、さらに、配列番号４又は６で表される塩基配列の全長又は１５塩基以上の部分、又はその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡや配列番号４又は６で表される塩基配列の全長又は１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示す塩基配列を含むＤＮＡを含む本発明オキシダーゼをコードする遺伝子等が挙げられる。「１５残基以上の部分」の具体的な例としては、配列番号６の部分配列である４〜１８６塩基の塩基配列などが挙げられる。また配列番号４の１３０〜３１２塩基の塩基配列を配列番号６の４〜１８６塩基の塩基配列と交換したものも配列番号２のアミノ酸配列をコードしており、８０％以上の相同性を示す塩基配列を含むＤＮＡの例としてあげる事が出来る。 As an example of the gene of the present invention, the above-described oxidase (R1) gene of the present invention (SEQ ID NO: 6) can be mentioned. Plasmid pNCP1 containing the gene containing SEQ ID NO: 6 encoding SEQ ID NO: 5 has been deposited as FERM BP-10343 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST). Furthermore, as a gene of the present invention, a cholesterol oxidase containing an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added and / or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 5, and SEQ ID NO: 2 or 5 A gene encoding the oxidase of the present invention, such as cholesterol oxidase, which contains an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented, or the full length of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 6, or 15 bases or more Or a DNA containing a base sequence that hybridizes with a nucleic acid containing a complementary strand thereof under stringent conditions, the full length of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 6, or a part having 15 bases or more and 80% or more Examples include a gene encoding the oxidase of the present invention including DNA containing a base sequence exhibiting homology. Specific examples of the “part having 15 residues or more” include a base sequence of 4 to 186 bases, which is a partial sequence of SEQ ID NO: 6. A nucleotide sequence of 130 to 312 bases of SEQ ID NO: 4 replaced with a base sequence of 4 to 186 bases of SEQ ID NO: 6 also encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and shows a base of 80% or more homology An example of DNA containing a sequence can be given.
次に、本発明オキシダーゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物より該コレステロールオキシダーゼを採取することにより本発明オキシダーゼを製造する。本発明オキシダーゼ生産能を有する微生物であれば、いかなる微生物も本発明オキシダーゼの製造に用いることができる。例えば、上記のようにして得られた本発明オキシダーゼ生産能を有する形質転換体又は形質導入体などが挙げられる。例えば、本発明オキシダーゼ生産能を有する、好ましくはエッシェリシア属に属する形質転換株を用いて本発明オキシダーゼを生産することができる。上記微生物を培養するには、固体培養法で培養してもよいが、液体培養法を採用して培養するのがより好ましい。また、上記微生物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆もしくは小麦麹の浸出液などの１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄もしくは硫酸マンガンなどの無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミンなどを適宜添加したものが用いられる。なお、培地の初発ｐＨは、６〜９に調製するのが適当である。また培養は、２０〜４２℃、好ましくは２５℃前後で１０〜４０時間、通気攪拌深部培養、振とう培養、静置培養などにより実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物より本発明オキシダーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いることが出来る。培養液から、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体から本発明オキシダーゼを採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることも出来るが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法などにより、菌体から本発明オキシダーゼを採取するのが好ましい。 Next, the oxidase of the present invention is produced by culturing a microorganism capable of producing the oxidase of the present invention in a medium and collecting the cholesterol oxidase from the culture. Any microorganism can be used for producing the oxidase of the present invention as long as it has the ability to produce the oxidase of the present invention. For example, the transformant or transductant having the ability to produce the oxidase of the present invention obtained as described above can be used. For example, the oxidase of the present invention can be produced using a transformant having the ability to produce the oxidase of the present invention, preferably belonging to the genus Escherichia. In order to culture the microorganism, it may be cultured by a solid culture method, but it is more preferable to employ a liquid culture method. Examples of the culture medium for culturing the microorganism include one or more nitrogen sources such as yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, soybean or wheat straw leachate, potassium dihydrogen phosphate, hydrogen phosphate. One or more inorganic salts such as dipotassium, magnesium sulfate, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate are added, and if necessary, saccharide raw materials, vitamins and the like are appropriately added. The initial pH of the medium is suitably adjusted to 6-9. Cultivation is preferably carried out at 20 to 42 ° C., preferably around 25 ° C. for 10 to 40 hours, by aeration / agitation deep culture, shaking culture, stationary culture, or the like. In order to collect the oxidase of the present invention from the culture after completion of the culture, usual enzyme collecting means can be used. The cells are separated from the culture solution by, for example, operations such as filtration and centrifugation, and washed. The oxidase of the present invention is preferably collected from the cells. In this case, the microbial cells can be used as they are, but the microbial cell wall using a cell wall lytic enzyme such as lysozyme, a method of destroying the microbial cells using various disrupting means such as an ultrasonic crusher, French press, dynomill, etc. The oxidase of the present invention is preferably collected from the microbial cells by a method for dissolving the microbial cells, a method for extracting the enzyme from the microbial cells using a surfactant such as Triton X-100, and the like.
このようにして得られた粗酵素液から本発明オキシダーゼを単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈殿法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行うのが好ましい。このようにして、本発明オキシダーゼを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一のバンドを示すまでに単離することができる。また、上記精製方法を適宜組合わせて、用途に応じた精製度合いの異なる酵素標品を調整することもできる。 In order to isolate the oxidase of the present invention from the crude enzyme solution thus obtained, a conventional method for enzyme purification can be used. For example, an ammonium sulfate salting-out method, an organic solvent precipitation method, an ion exchange chromatography method, a gel filtration chromatography method, an adsorption chromatography method, an electrophoresis method, or the like is preferably used in an appropriate combination. In this way, the oxidase of the present invention can be isolated until it shows an almost single band by SDS-PAGE. In addition, enzyme preparations with different degrees of purification can be prepared by appropriately combining the purification methods described above.
本発明オキシダーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。以下、本発明酵素の活性測定には、ことわりのない限り、コレステロールを基質として用いる。なお、酵素力価は、コレステロールを基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：コレステロール溶液
５．０ｍｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００に５００ｍｇのコレステロール（和光純薬製）を添加し、ヒーター上で攪拌溶解する。これに９０ｍｌのイオン交換水を添加後、煮沸後、氷上で冷却し、４．０ｇのコール酸ナトリウム（ナカライテスク製）を添加し、溶解した後、１００ｍｌに定容する。
（２）試薬２：６．０％フェノール溶液
フェノール６．０ｇをイオン交換水に溶解して１００ｍｌにする。
（３）試薬３：０．１５％ペルオキシダーゼ溶液
１５０ｍｇを１００ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解する。
（４）試薬４：４−アミノアンチピリン溶液
１．７６ｇの４−アミノアンチピリン（和光純薬製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
Ｂ．測定法
４．０ｍｌの試薬１と５１ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）とを混合した後、２．０ｍｌの試薬２、２．０ｍｌの試薬３、１．０ｍｌの試薬４を順に加え、混合する。これを３．０ｍｌずつ試験管に分注し、氷冷保存する。測定時は、３．０ｍｌを３７℃で５分加温し、５０μｌの酵素液を加え混和し、分光光度計（Ｕ−３０１０、日立社製）により、５００ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値（ΔODtest）は、５００ｎｍにおける２分後から４分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液（ΔODblank）は、酵素液の代わりに５０μｌの０．２％牛血清アルブミンを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加える以外は前記と同様にしたものである。下記の計算式に従い、算出した値を酵素活性値（Ｕ／ｍｌ）とした。
Examples of the method for measuring the enzyme activity of the oxidase of the present invention include a method for measuring the amount of hydrogen peroxide produced by the reaction of the enzyme and a method for measuring the amount of oxygen consumed by the enzyme reaction. Hereinafter, as an example, a method for measuring the amount of hydrogen peroxide will be described. Hereinafter, cholesterol is used as a substrate for measuring the activity of the enzyme of the present invention unless otherwise specified. The enzyme titer was defined as 1 U for the amount of enzyme that produces 1 μmol of hydrogen peroxide per minute when measured using cholesterol as a substrate.
A. Preparation of Reagent (1) Reagent 1: Cholesterol Solution Add 500 mg of cholesterol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) to 5.0 ml of Triton X-100, and stir and dissolve on a heater. 90 ml of ion-exchanged water is added thereto, boiled, cooled on ice, 4.0 g of sodium cholate (manufactured by Nacalai Tesque) is added and dissolved, and the volume is made up to 100 ml.
(2) Reagent 2: 6.0% phenol solution Dissolve 6.0 g of phenol in ion exchange water to make 100 ml.
(3) Reagent 3: 0.15% peroxidase solution 150 mg is dissolved in 100 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0).
(4) Reagent 4: 4-aminoantipyrine solution 1.76 g of 4-aminoantipyrine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is dissolved in ion-exchanged water and made up to a volume of 100 ml.
B. Measurement Method After 4.0 ml of Reagent 1 and 51 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) were mixed, 2.0 ml of Reagent 2, 2.0 ml of
１３．７８：上記の測定条件下でのミリモル分子吸光係数（cm2/micromole）
１／２：酵素反応で生成したＨ２Ｏ２の２分子から形成するQuinoneimine色素は１分子であることによる係数。
１．０：光路長(cm)
13.78: millimolar extinction coefficient (cm 2 / micromole) under the above measurement conditions
1/2: Coefficient due to the fact that the quinoneimine dye formed from two molecules of H 2 O 2 produced by an enzyme reaction is one molecule.
1.0: Optical path length (cm)
本発明で得られるコレステロールオキシダーゼ遺伝子を用い、低基質（コレステロール）濃度でも高い活性を示し、幅広いｐＨで作用しさらに熱安定性に優れているコレステロールオキシダーゼを安価に提供できる。該コレステロールオキシダーゼは界面活性剤に対する安定性が改善されており、体液や食品中でのコレステロールの測定に特に適するものである。また、有機溶媒重層下において強く活性化されることから、コレステロール類の酵素変換を効率的に行える特徴を有している。その他、本酵素を経口的に摂取させることにより殺虫剤としても使用でき、コレステロール類で汚染した衣類等の洗剤として使用することもできる。 Using the cholesterol oxidase gene obtained in the present invention, cholesterol oxidase exhibiting high activity even at a low substrate (cholesterol) concentration, acting at a wide pH range and having excellent thermal stability can be provided at low cost. The cholesterol oxidase has improved stability to surfactants and is particularly suitable for the measurement of cholesterol in body fluids and foods. Further, since it is strongly activated under the organic solvent overlay, it has the feature that it can efficiently convert cholesterols into an enzyme. In addition, it can be used as an insecticide by ingesting the enzyme orally, and can also be used as a detergent for clothes contaminated with cholesterols.
以下に、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
（Ａ）組換え体プラスミドの調製
性質を異にするオキシダーゼ遺伝子（配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子）を有する組換え体プラスミドＤＮＡ、およびこの遺伝子の大腸菌における発現量を増加させるために本遺伝子のうちアミノ末端をコードする領域の塩基配列を大腸菌のコドンユセージに合うように改変したオキシダーゼ遺伝子を有する組換え体プラスミドＤＮＡをそれぞれ調製した。以後に述べる本発明オキシダーゼを作製するに当たっては、何れの組換え体プラスミドＤＮＡを用いてもよいが、改変したオキシダーゼ遺伝子を有する組換え体プラスミドＤＮＡを用いることが、本発明オキシダーゼを大量に製造する上で有効である。
（１）組換え体プラスミドｐＣｏｘ４ＤＮＡの調製
上述のオキシダーゼ遺伝子（配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子）の組換え体プラスミドを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（ｐＣｏｘ４）（ＦＥＲＭ Ｐ−１８００２）を、ＬＢ培地（１％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、０．２５％ＮａＣｌ）２０ｍｌに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し培養物を得た。この培養物を７０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体よりＱＩＡＧＥＮ ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドｐＣｏｘ４ＤＮＡを抽出して精製し、組換え体プラスミドｐＣｏｘ４ＤＮＡを１００μｇ得た。
（２）アミノ末端側塩基配列を改変した組換え体プラスミドｐＮＣＯＰＤＮＡの調製
配列番号６の部分配列である配列番号７〜１４に記載の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドをシグマジェノシス社の受託合成サービスにより入手した。配列番号７〜１４のそれぞれをT4 Polynucleotide kinase（宝酒造社製）を用いてリン酸化する。一方、配列番号１を持つｐＣｏｘ４ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５、１６をプライマーとしてEx Taq polymerase（宝酒造社製）を用いてＰＣＲ反応を行い、Ｃ末端側をコードする遺伝子断片を調製した。さらに、本断片をNdeI（第一化学薬品社製）、NspI（第一化学薬品社製）で処理した。さらにｐＫＦ１９ｋＤＮＡをNdeIで処理した後、ＢＡＰ処理（宝酒造社製試薬を使用）により脱リン酸化を行なった。こうして得られたリン酸化オリゴヌクレオチドのうち、８本のリン酸化オリゴヌクレオチド、ｐＣｏｘ４ＤＮＡ由来遺伝子断片、ｐＫＦ１９ｋ断片を適量混合し、Ligation Kit ver.2（宝酒造社製）を利用しライゲーションし、得られたプラスミドをｐＮＣＯＰと命名した。続いて、（１）に記載の方法によりｐＮＣＯＰ ＤＮＡを１００μｇ調製した。
(A) Preparation of recombinant plasmid In order to increase recombinant plasmid DNA having an oxidase gene (gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1) having different properties, and the expression level of this gene in E. coli A recombinant plasmid DNA having an oxidase gene in which the base sequence of the amino-terminal coding region of this gene was modified to match the E. coli codon usage was prepared. In preparing the oxidase of the present invention described below, any recombinant plasmid DNA may be used, but using a recombinant plasmid DNA having a modified oxidase gene produces a large amount of the oxidase of the present invention. Effective above.
(1) Preparation of recombinant plasmid pCox4DNA E. coli DH5α (pCox4) (FERM P-18002) having a recombinant plasmid of the above oxidase gene (gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) ) Was inoculated into 20 ml of LB medium (1% bacto-tryptone, 0.5% yeast extract, 0.25% NaCl) and cultured with shaking at 37 ° C. for 20 hours to obtain a culture. The culture was collected by centrifugation at 7000 rpm for 5 minutes to obtain bacterial cells. The recombinant plasmid pCox4 DNA was extracted and purified from the cells using QIAGEN tip-100 (Qiagen), and 100 μg of the recombinant plasmid pCox4 DNA was obtained.
(2) Preparation of Recombinant Plasmid pNCOPDNA with Modified Amino Terminal Side Base Sequence Oligonucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 7 to 14, which is a partial sequence of SEQ ID NO: 6, was obtained by a contracted synthesis service of Sigma Genosys obtained. Each of SEQ ID NOs: 7 to 14 is phosphorylated using T4 Polynucleotide kinase (Takara Shuzo). On the other hand, a PCR reaction was carried out using Ex Taq polymerase (Takara Shuzo) using pCox4DNA having SEQ ID NO: 1 as a template and SEQ ID NOs: 15 and 16 as primers to prepare a gene fragment encoding the C-terminal side. Further, this fragment was treated with NdeI (Daiichi Chemical Co., Ltd.) and NspI (Daiichi Chemical Co., Ltd.). Further, pKF19kDNA was treated with NdeI, and then dephosphorylated by BAP treatment (using a reagent manufactured by Takara Shuzo). Among the phosphorylated oligonucleotides thus obtained, 8 phosphorylated oligonucleotides, pCox4 DNA-derived gene fragment, and pKF19k fragment were mixed in appropriate amounts, and ligated using Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo). The plasmid was named pNCOP. Subsequently, 100 μg of pNCOP DNA was prepared by the method described in (1).
（Ｂ）本発明オキシダーゼ及び本発明オキシダーゼ生産能を有する形質転換株の作製
（１）改変操作（変異の導入）
上記組換え体プラスミド、ｐＮＣＯＰＤＮＡを鋳型としてプライマーとして配列番号１７、２５を用いてＰＣＲ法を実施した。この際、反応系に１０％のＤＭＳＯを添加することで増幅のミスを誘発させ、変異を導入した。このようにして得たＤＮＡ断片を制限酵素NdeIで処理した後、プラスミドpKF19kを同じくNdeIで処理した後、ＢＡＰ処理（宝酒造社製試薬を使用）により脱リン酸化を行なったものと混合し、Ligation Kit ver.2（宝酒造社製）を利用しライゲーションし、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，３２６〜３３１，１９７９）に従って大腸菌ＪＭ１０９(東洋紡社製)を形質転換し、約２５００株の改変を受けたプラスミドを保有する形質転換株を得た。
（２）本発明オキシダーゼ生産株の選抜
まず、得られた上記形質転換体の全てを１ｍＭ ＩＰＴＧ、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含んだ滅菌済みＬＢ培地を１００μｌずつ各セルに含んだ９６穴プレートに植ぐ。各プレートのうち１セルは、ｐＮＣＯＰを保持したＪＭ１０９を植え、ネガティブコントロールとする。２５℃で２４時間培養した。こうして得られた培養液を−８０℃のフリーザーにプレートごと１時間入れて溶菌させる。その後、１００μｌの１０％エマルゲン９１３を含んだ０．２％牛血清アルブミン入り１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）とプレート上で混合し、３７℃、５時間静置する。その後、各処理液５０μｌをとって下記の組成の反応試薬５０μｌと混ぜ合わせ反応させ、ネガティブコントロールと比較して発色の増加しているものを選択する。
１５ｍｌ コレステロール溶液
５．０ｍのＴｒｉｔｏｎＸ−１００に５００ｍｇのコレステロール（和光純薬製）を添加し、ヒーター上で攪拌溶解する。これに９０ｍｌのイオン交換水を添加後、煮沸後、氷上で冷却し、４．０4ｇのコール酸ナトリウム（ナカライテスク製）を添加し、溶解した後、１００ｍｌに定容する。
１７．５ｍｌ ０．１Ｍリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０
３．５ｍｌ １．７６％４−アミノアンチピリン溶液
７ｍｌ ６％フェノール水溶液
７ｍｌ ０．１５％ペルオキシダーゼ溶液
１５０ｍｇを１００ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解する。
ここで選択された発色した１０株について２ｍｌのＬＢ培地（５０μｇカナマイシン添加）で液体培養し、プラスミドに含まれる改変されたコレステロールオキシダーゼを生産させた。培養後、得られた培養物を超音波破砕し、８０００ｒｐｍで５分間遠心して得たその粗酵素抽出液０．５ｍｌを０．５ｍｌの１０％エマルゲン９１３を含有する０．２％牛血清アルブミン入り１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）と混ぜ、３７℃で一晩反応させた。この反応液と未処理の粗酵素液の２倍希釈液の活性を測定し、活性残存率（反応液の活性／未処理の粗酵素抽出液の活性）を算出した。同様にして培養、抽出、熱処理をし、活性測定をした改変前の性質を異にするオキシダーゼと活性残存率の比較を行い、活性残存率が４０％から８０％に向上した改変されたコレステロールオキシダーゼとその生産大腸菌３株を得た。そのうちの１種（Ｒ１）遺伝子をコードするプラスミドｐＮＣＰ１を独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−１０３４３として寄託した。
（３）改変の起こった部位の同定
改変されたコレステロールオキシダーゼ遺伝子を保持するプラスミドを回収し、ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ解析システム（ベックマンコールター社製）を用いて塩基配列を決定し、それを元に改変されたアミノ酸残基の同定を行った。
これにより、本発明オキシダーゼ（Ｒ１）は、配列番号１に表されるアミノ酸配列において配列番号２に示すように、１７５番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されていることが分かった。これは、配列番号５においては１３３番目に相当する。同様に本発明オキシダーゼ（Ｒ７）では、配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１７３番目のプロリンがロイシンに、２２０番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換されていることが分かった。また、これらは配列番号５においてはそれぞれ１３１番目、１７８番目に相当する部位の変異である。
（４）変異点の分離と組み合わせ
これらの変異点をそれぞれ単独で導入してみた。即ち、ｐＮＣＯＰ ＤＮＡに配列番号１７，１８（配列番号５の１３３番目をアスパラギン酸がアスパラギンに置換するようにデザインされている）の配列をプライマーとしてＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲ反応を行った後、アガロースゲル電気泳動にてプラスミドの全長に相当するＤＮＡ断片の増幅を確認し、制限酵素ＤｐｎＩ（メチル化したＤＮＡに作用する；第一化学薬品製）で処理した後、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、カナマイシンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。生育してきたコロニーをカナマイシン入りの液体培地で培養し、コレステロールオキシダーゼ遺伝子を保持するプラスミドを回収し、塩基配列を確認し目的どおりの変異が導入されていることを確認する。配列番号５の１３１番目（プロリンをロイシンに置換）、１７８番目（アスパラギン酸をグルタミン酸に置換）についても１３１番目については配列番号１９，２０を、１７８番目については配列番号２１，２２を代わりに用いて同様の方法で、部位特異的変異コレステロールオキシダーゼ遺伝子を得た。さらに、ここで得られた部位特異的変異コレステロールオキシダーゼ遺伝子を保持するプラスミドを鋳型に２重変異体コレステロールオキシダーゼ遺伝子を得た。この際、１３１番目と１３３番目の変異点は近接しているため、配列番号２３，２４を用いて行った。さらに３重変異体コレステロールオキシダーゼ遺伝子を保持するプラスミドを得た。
（５）変異点と界面活性剤耐性
上記で得た変異点の異なる変異型コレステロールオキシダーゼ遺伝子をもつプラスミドを保持した大腸菌ＪＭ１０９をそれぞれ１．０ｍＭ ＩＰＴＧ添加ＬＢ−カナマイシン培地１０ｍｌで３０℃、２４時間攪拌培養し、得られた培養液を８０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して集菌し、２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌ懸濁した。その後、超音波により菌体を破砕し、１０，０００ｒｐｍ、１０分の遠心により上清を回収した。これらの粗酵素抽出液２００μｌを２００μｌの２％エマルゲン９１３入り０．２％牛血清アルブミン含有１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）と混合し、３０℃、７日間静置し、界面活性剤未処方で３０℃、７日間静置したものと酵素活性の残存率を比較した（表１）。
(B) Preparation of the oxidase of the present invention and a transformant having the ability to produce the oxidase of the present invention (1) Modification operation (introduction of mutation)
PCR was carried out using SEQ ID NOS: 17 and 25 as primers using the above recombinant plasmid, pNCOPDNA as a template. At this time, amplification errors were induced by adding 10% DMSO to the reaction system, and mutations were introduced. After treating the DNA fragment thus obtained with the restriction enzyme NdeI, the plasmid pKF19k was similarly treated with NdeI, and then mixed with BAP treatment (using a reagent manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and mixed with Ligation. Ligation using Kit ver.2 (Takara Shuzo) M.M. Escherichia coli JM109 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed according to the method of Morrison (Method in Enzymology, 68, 326 to 331, 1979) to obtain a transformant having about 2500 modified plasmids.
(2) Selection of the oxidase producing strain of the present invention First, all the obtained transformants are planted in a 96-well plate containing 100 μl of sterilized LB medium containing 1 mM IPTG and 50 μg / ml kanamycin in each cell. . One cell of each plate is planted with JM109 retaining pNCOP and serves as a negative control. The cells were cultured at 25 ° C. for 24 hours. The culture broth thus obtained is lysed by placing it in a freezer at −80 ° C. for 1 hour together with the plate. Thereafter, 100 μl of 100% MES-NaOH buffer solution (pH 7.0) containing 0.2% bovine serum albumin containing 10% emulgen 913 is mixed on the plate, and left to stand at 37 ° C. for 5 hours. Thereafter, 50 μl of each treatment solution is taken and mixed with 50 μl of a reaction reagent having the following composition and reacted, and the one with an increased color compared with the negative control is selected.
500 mg cholesterol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to 15 ml cholesterol solution 5.0 m Triton X-100, and stirred and dissolved on a heater. 90 ml of ion-exchanged water is added to this, boiled, cooled on ice, 4.04 g of sodium cholate (manufactured by Nacalai Tesque) is added and dissolved, and the volume is adjusted to 100 ml.
17.5 ml 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.0
3.5 ml 1.76% 4-
The 10 colored strains selected here were liquid-cultured in 2 ml of LB medium (added with 50 μg kanamycin) to produce modified cholesterol oxidase contained in the plasmid. After culturing, the resulting culture was sonicated and 0.5 ml of the crude enzyme extract obtained by centrifuging at 8000 rpm for 5 minutes contains 0.5 ml of 0.2% bovine serum albumin containing 10% emulgen 913. It was mixed with 100 mM MES-NaOH buffer (pH 7.0) and reacted at 37 ° C. overnight. The activity of a 2-fold diluted solution of this reaction solution and untreated crude enzyme solution was measured, and the activity remaining rate (activity of reaction solution / activity of untreated crude enzyme extract) was calculated. A modified cholesterol oxidase whose activity remaining rate was improved from 40% to 80% by comparing the activity remaining rate with an oxidase having different properties before the modification after culturing, extraction and heat treatment in the same manner. And 3 production strains of Escherichia coli were obtained. A plasmid pNCP1 encoding one of the genes (R1) was deposited as FERM BP-10343 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center.
(3) Identification of the site where the modification occurred The plasmid carrying the modified cholesterol oxidase gene was recovered, the nucleotide sequence was determined using the CEQ2000XL DNA analysis system (manufactured by Beckman Coulter, Inc.), and the modification was performed based on it. Amino acid residues were identified.
Thereby, as for this invention oxidase (R1), as shown to sequence number 2 in the amino acid sequence represented by sequence number 1, it turned out that the 175th aspartic acid was substituted by asparagine. This corresponds to the 133rd position in SEQ ID NO: 5. Similarly, in the oxidase (R7) of the present invention, it was found that in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the 173rd proline was replaced with leucine and the 220th aspartic acid was replaced with glutamic acid. These are mutations corresponding to the 131st and 178th positions in SEQ ID NO: 5, respectively.
(4) Isolation and combination of mutation points These mutation points were introduced individually. That is, PCR was performed using KOD plus polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) using pNCOP DNA as a primer with the sequence of SEQ ID NOs: 17 and 18 (designed so that aspartic acid was substituted with aspartic acid at position 133 of SEQ ID NO: 5). After the reaction, amplification of a DNA fragment corresponding to the full length of the plasmid was confirmed by agarose gel electrophoresis, and after treatment with restriction enzyme DpnI (acting on methylated DNA; manufactured by Daiichi Chemical), E. coli JM109 was transformed and selected on LB agar medium supplemented with kanamycin. The grown colonies are cultured in a liquid medium containing kanamycin, the plasmid holding the cholesterol oxidase gene is recovered, the base sequence is confirmed, and the intended mutation is confirmed. As for the 131st position of SEQ ID NO: 5 (proline is replaced with leucine) and the 178th position (aspartic acid is replaced with glutamic acid), SEQ ID NOS: 19 and 20 are used for the 131st position and SEQ ID NOS: 21 and 22 are used for the 178th position instead In the same manner, a site-specific mutant cholesterol oxidase gene was obtained. Further, a double mutant cholesterol oxidase gene was obtained using the plasmid carrying the site-specific mutant cholesterol oxidase gene obtained here as a template. At this time, since the 131st and 133rd mutation points are close to each other, the experiment was performed using SEQ ID NOS: 23 and 24. Furthermore, a plasmid carrying the triple mutant cholesterol oxidase gene was obtained.
(5) Mutation point and surfactant resistance The Escherichia coli JM109 retaining the plasmids having the mutant cholesterol oxidase genes with different mutation points obtained above was stirred at 30 ° C. for 24 hours in 10 ml of LB-kanamycin medium supplemented with 1.0 mM IPTG. After culturing, the resulting culture was collected by centrifugation at 8000 rpm for 5 minutes, and suspended in 1 ml of 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). Thereafter, the cells were disrupted by ultrasonic waves, and the supernatant was collected by centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes. 200 μl of these crude enzyme extracts were mixed with 200 μl of 100 mM MES-NaOH buffer solution (pH 7.0) containing 0.2% bovine serum albumin containing 2% Emulgen 913, and allowed to stand at 30 ° C. for 7 days. The residual rate of enzyme activity was compared with that which was left untreated for 30 days at 30 ° C. (Table 1).
D133N変異は、133位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換したもの。
D178E変異は、178位のアスパラギン酸をグルタミン酸に置換したもの。
さらに、エマルゲン９１３に対する安定化効果の認められた変異型コレステロールオキシダーゼについて他の界面活性剤（エマルゲン１２０、エマール２０Ｃ、エマール２０ＣＭ）に対する保存安定性を検討した。条件は前試験に準じ、それぞれ粗酵素抽出液２００μｌを２００μｌの２％界面活性剤入り０．２％牛血清アルブミン含有１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）と混合し、３０℃、３日間静置により行った（表２）。
The D133N mutation is a substitution of aspartic acid at position 133 with asparagine.
The D178E mutation is a substitution of aspartic acid at position 178 with glutamic acid.
Furthermore, the storage stability with respect to other surfactants (Emulgen 120, Emar 20C, Emar 20CM) was examined for the mutant cholesterol oxidase in which the stabilizing effect on Emulgen 913 was recognized. The conditions were the same as in the previous test, and 200 μl of the crude enzyme extract was mixed with 200 μl of a 100 mM MES-NaOH buffer solution (pH 7.0) containing 0.2% bovine serum albumin containing 2% surfactant at 30 ° C. for 3 days. This was carried out by standing (Table 2).
（Ｃ）本発明オキシダーゼの生産及びその理化学的性質
上記のようにして得られた本発明オキシダーゼ（Ｒ１）を生産する形質転換体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＮＣＰ１）を１ｍＭ ＩＰＴＧ入りＬＢ−カナマイシン培地１０Ｌに植菌し、ジャーファーメンターを用いて、通気量１Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度６００ｒｐｍの条件で、３０℃、２４時間攪拌培養した。得られた培養液１０Ｌを７０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して集菌し、２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌに懸濁した。その後、超音波により菌体を破砕し、１０，０００ｒｐｍ、１０分の遠心により上清を回収し、粗酵素液とした。この粗酵素液を６０℃、３０分熱処理を行い、２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍希釈後、１０，０００ｒｐｍ、１０分の遠心により上清を回収する。これを限外膜ＡＩＰ−２０１３（旭化成製）で５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）に透析し、５００ｍｌに濃縮する。その後、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）で平衡化した２００ｍｌのＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−５０に懸濁し、ろ液と２００ｍｌの５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）で洗いこんだものを活性画分として回収する。回収した本発明オキシダーゼ（Ｒ１）の比活性は４．０Ｕ／Ａ２８０であった。
(C) Production of oxidase of the present invention and its physicochemical properties Transformant producing Ester coli JM109 (pNCP1) producing oxidase (R1) of the present invention obtained as described above was added to LB- containing 1 mM IPTG. Inoculated into 10 L of kanamycin medium and stirred and cultured at 30 ° C. for 24 hours using a jar fermenter under conditions of an aeration rate of 1 L / min and a stirring speed of 600 rpm. 10 L of the obtained culture broth was collected by centrifugation at 7000 rpm for 10 minutes, and suspended in 1 L of 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). Thereafter, the cells were disrupted by ultrasonic waves, and the supernatant was collected by centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes to obtain a crude enzyme solution. This crude enzyme solution is heat-treated at 60 ° C. for 30 minutes, diluted 10-fold with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and the supernatant is recovered by centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes. This is dialyzed against 5 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl (pH 8.8) with an ultra-membrane AIP-2013 (manufactured by Asahi Kasei) and concentrated to 500 ml. Thereafter, the suspension is suspended in 200 ml of QAE-Sephadex A-50 equilibrated with 5 mM EDTA and 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), and washed with the filtrate and 200 ml of 5 mM EDTA and 20 mM Tris-HCl (pH 8.8). The waste is recovered as the active fraction. The specific activity of the recovered oxidase (R1) of the present invention was 4.0 U / A280.
得られた本発明オキシダーゼ（Ｒ１）の理化学的性質は、下記の通りであった。
（１）作用
前述した酵素活性の測定方法により、基質としてコレステロールに対する反応を確認した。
（２）示適ｐＨ
緩衝液として、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５〜６．０）、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．２２）、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５８〜９．５）、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．４３〜１１．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行った結果、その相対活性は、図１に示す通りであった。図１より、本発明オキシダーゼの示適ｐＨは６．５〜８．０であることが判かった。
（３）作用適温の範囲
前述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った結果、図２に示す通りであった。図２より、本発明オキシダーゼの作用適温の範囲は、５５〜６５℃であった。
（４）安定ｐＨ範囲
緩衝液として、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５〜６．０）、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．２２）、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５８〜９．５）、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．４３〜１１．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、２５℃で２０時間処理した後、本発明オキシダーゼの残存活性を測定した結果、図３に示す通りであった。図３より、安定ｐＨ範囲は、ｐＨ３．５〜８．５であった。
（５）熱安定性
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、各温度で１５分間処理した場合の熱安定性の結果は、図４に示す通りであり、本発明オキシダーゼは、７０℃付近まで安定であった。
（６）分子量
常法により、マルチゲル１０／２０（第一科学薬品社製）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量を求めた。約６０，０００であった。
（７）界面活性剤耐性
もとのバークホルデリア セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ（ＷＴ））と界面活性剤に対する安定性を比較した。それぞれ２％の界面活性剤を含む０．２％牛血清アルブミン入り１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）と２Ｕ／ｍｌのコレステロールオキシダーゼを等量混合し、３７℃で２４時間保存したものである（表３）。
The physicochemical properties of the obtained oxidase (R1) of the present invention were as follows.
(1) Action The reaction to cholesterol as a substrate was confirmed by the enzyme activity measurement method described above.
(2) Indication pH
As buffer solutions, 100 mM acetate buffer (pH 5.5 to 6.0), 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0 to 8.22), 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.58 to 9.5), 100 mM As a result of performing an enzyme reaction at a temperature of 37 ° C. at each pH using NaHCO 3 -NaOH buffer (pH 9.43 to 11.0), the relative activity was as shown in FIG. From FIG. 1, it was found that the optimum pH of the oxidase of the present invention is 6.5 to 8.0.
(3) Range of temperature suitable for action As a result of measuring the activity of the present enzyme at various temperatures using a reaction solution having the same composition as the reaction solution in the above-described activity measurement method, it was as shown in FIG. From FIG. 2, the range of the appropriate temperature of action of the oxidase of the present invention was 55 to 65 ° C.
(4) Stable pH Range As a buffer solution, 100 mM acetate buffer solution (pH 3.5 to 6.0), 100 mM potassium phosphate buffer solution (pH 6.0 to 8.22), 100 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.58 to 9.5), the residual activity of the oxidase of the present invention was measured after treatment at 25 ° C. for 20 hours at each pH using a 100 mM NaHCO 3 -NaOH buffer (pH 9.43 to 11.0). As shown in FIG. From FIG. 3, the stable pH range was pH 3.5 to 8.5.
(5) Thermal stability The results of thermal stability when treated with 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) at each temperature for 15 minutes are as shown in FIG. It was stable up to around 70 ° C.
(6) Molecular weight The molecular weight was determined by an SDS-PAGE
(7) Resistance to Surfactant The original burkholderia cepacia ( Burkholderia cepacia ) strain ST-200-derived cholesterol oxidase (CHO (WT)) and the stability against the surfactant were compared. 100% MES-NaOH buffer solution (pH 7.0) containing 0.2% bovine serum albumin each containing 2% surfactant and 2U / ml cholesterol oxidase were mixed in equal amounts and stored at 37 ° C for 24 hours. Yes (Table 3).
Claims (2)
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。 A protein having the following cholesterol oxidase activity (a) or (b):
(A) A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
（ａ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。 A gene comprising the following DNA (a) or (b):
(A) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
(B) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6.
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