JP2003079386A - New fructosyl amino acid oxidase - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なフルクトシ
ルアミノ酸オキシダーゼ、該酵素をコードする遺伝子、
およびフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造方法に
関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel fructosyl amino acid oxidase, a gene encoding the enzyme,
And a method for producing fructosyl amino acid oxidase.
【０００２】[0002]
【従来の技術】フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、
酸素の存在下でイミノ２酢酸又はその誘導体（「アマド
リ化合物」とも言う）を酸化して、グリオキシル酸又は
α−ケトアルデヒド、α−アミノ酸及び過酸化水素を生
成する作用を触媒する酵素である。フルクトシルアミノ
酸オキシダーゼは、真菌や細菌から見出されており、こ
れらの酵素を用いた食品や生体内に生成されるアマドリ
化合物を測定する分析法が提案されている（特公平５−
３３９９７号公報、特公平６−６５３００号公報、特開
平２−１９５９００号公報、特開平３−１５５７８０号
公報、特開平４−４８７４号公報、特開平５−１９２１
９３号公報、特開平６−４６８６号公報）。2. Description of the Related Art Fructosyl amino acid oxidase is
It is an enzyme that catalyzes the action of oxidizing iminodiacetic acid or its derivative (also referred to as “Amadori compound”) in the presence of oxygen to produce glyoxylic acid or α-ketoaldehyde, α-amino acid, and hydrogen peroxide. Fructosyl amino acid oxidase has been found in fungi and bacteria, and an analysis method for measuring Amadori compounds produced in foods and living bodies using these enzymes has been proposed (Japanese Patent Publication No.
No. 33997, Japanese Patent Publication No. 6-65300, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-195900, Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-155780, Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-4874, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-1921.
93, JP-A-6-4686).
【０００３】最近、臨床診断分野において、糖尿病患者
の病態診断や症状管理の重要な血糖コントロールマーカ
ーとしてＨｂＡ１ｃ（ヘモグロビンが糖化を受けたも
の）が注目されている。このＨｂＡ１ｃを迅速にかつ簡
便に測定する方法として、フルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼを用いる酵素的測定方法、すなわち、ＨｂＡ１ｃ
をプロテアーゼなどで分解し、遊離したフルクトシルバ
リン（バリンのα−アミノ基が糖化されたイミノ２酢酸
の誘導体）を測定する方法が知られている。この測定方
法に用いられる酵素として、種々のフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼのうちでも、特に、基質の一つであるフ
ルクトシルバリンに高い活性を有し、かつ、ε−フルク
トシルリジン（リジンのε−アミノ基が糖化されたもの
でアマドリ化合物の一種）には活性を有しない酵素、た
とえばコリネバクテリウム属細菌由来のフルクトシルア
ミノ酸オキシダーゼなどが、測定の迅速性や精度の点で
優れている。しかし、上記フルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼは至適ｐＨが８以上という性質をもつため、Ｈｂ
Ａ１ｃの分解で生じたフルクトシルバリンを測定する時
には、測定系のｐＨを８以上に上げる必要があった。In the field of clinical diagnosis, HbA1c (one in which hemoglobin has been glycosylated) has recently attracted attention as an important blood glucose control marker for diagnosing pathological conditions and managing symptoms in diabetic patients. As a method for measuring this HbA1c rapidly and simply, an enzymatic measurement method using fructosyl amino acid oxidase, that is, HbA1c
There is known a method of decomposing lactic acid with protease or the like and measuring the released fructosyl valine (a derivative of iminodiacetic acid in which the α-amino group of valine is saccharified). Among various fructosyl amino acid oxidases, the enzyme used in this measuring method has a high activity particularly to fructosyl valine, which is one of the substrates, and has ε-fructosyl lysine (ε-of lysine). An enzyme in which the amino group is saccharified and which is not active as a type of Amadori compound), such as a fructosyl amino acid oxidase derived from a bacterium of the genus Corynebacterium, is excellent in terms of measurement speed and accuracy. However, since the above-mentioned fructosyl amino acid oxidase has a property that the optimum pH is 8 or higher, Hb
When measuring fructosyl valine generated by the decomposition of A1c, it was necessary to raise the pH of the measurement system to 8 or more.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規なフル
クトシルアミノ酸オキシダーゼ、該酵素をコードする遺
伝子、およびフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造
方法の提供を目的とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a novel fructosyl amino acid oxidase, a gene encoding the enzyme, and a method for producing fructosyl amino acid oxidase.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
解決のために鋭意研究を重ねた結果、アグロバクテリウ
ムを由来とするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの取
得に成功し、本発明を完成した。すなはち、本発明は、
以下の物および方法に関する。
１．以下の理化学的性質を有するフルクトシルアミノ酸
オキシダーゼ。
（ａ）作用及び基質特異性：酸素の存在下で、イミノ２
酢酸又はその誘導体を酸化して、グリオキシル酸又はα
−ケトアルデヒド、α−アミノ酸及び過酸化水素を生成
する反応を触媒する。ε−フルクトシルリジンには作用
しない。
（ｂ）至適ｐＨ：７．０〜８．５Means for Solving the Problems As a result of intensive studies for solving the above problems, the present inventors succeeded in obtaining a fructosyl amino acid oxidase derived from Agrobacterium and completed the present invention. . That is, the present invention is
The following items and methods are relevant. 1. A fructosyl amino acid oxidase having the following physicochemical properties. (A) Action and substrate specificity: imino 2 in the presence of oxygen
Oxidizing acetic acid or its derivatives to give glyoxylic acid or α
Catalyze reactions to produce ketoaldehydes, α-amino acids and hydrogen peroxide. It has no effect on ε-fructosyl lysine. (B) Optimum pH: 7.0-8.5
【０００６】２．以下の理化学的性質を有するフルクト
シルアミノ酸オキシダーゼ。
（ａ）作用及び基質特異性：酸素の存在下で、イミノ２
酢酸又はその誘導体を酸化して、グリオキシル酸又はα
−ケトアルデヒド、α−アミノ酸及び過酸化水素を生成
する反応を触媒する。ε−フルクトシルリジンには作用
しない。
（ｂ）至適ｐＨ：７．０〜８．５
（ｃ）フルクトシルグリシンに対するKm値が０．３１ｍ
Ｍである。
（ｄ）至適温度の範囲：２５℃〜４０℃
（ｅ）熱安定性：３５℃、１０分の熱処理で８０％以上
の活性が残存
（ｆ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ４．０〜８．５
（ｇ）分子量：約８５，０００（ゲル濾過法）、約４
２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）2. A fructosyl amino acid oxidase having the following physicochemical properties. (A) Action and substrate specificity: imino 2 in the presence of oxygen
Oxidizing acetic acid or its derivatives to give glyoxylic acid or α
Catalyze reactions to produce ketoaldehydes, α-amino acids and hydrogen peroxide. It has no effect on ε-fructosyl lysine. (B) Optimum pH: 7.0-8.5 (c) Km value for fructosylglycine is 0.31 m
It is M. (D) Optimum temperature range: 25 ° C to 40 ° C (e) Thermal stability: 35 ° C, 80% or more of the activity remains after heat treatment for 10 minutes (f) Stable pH range: pH 4.0 to 8. 5 (g) molecular weight: about 85,000 (gel filtration method), about 4
2,000 (SDS-PAGE)
【０００７】３．以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸
配列を含むフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列を含み、かつフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼ活性を有する蛋白質。3. A fructosyl amino acid oxidase containing the following amino acid sequence (a) or (b). (A) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. (B) A protein containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having fructosyl amino acid oxidase activity.
【０００８】４．以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の
ＤＮＡを含むフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝
子。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列を含み、かつフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトシルア
ミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ。4. A fructosyl amino acid oxidase gene containing the following DNA (a), (b) or (c). (A) DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 contains an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and A DNA encoding a protein having fructosyl amino acid oxidase activity. (C) A DNA which hybridizes with the DNA of (a) or (b) above under stringent conditions and which encodes a protein having fructosyl amino acid oxidase activity.
【０００９】５．上記４．記載のフルクトシルアミノ酸
オキシダーゼ遺伝子を含有する発現ベクター。
６．上記５．に記載の発現ベクターで、宿主細胞を形質
転換または宿主細胞に形質導入して得られた、形質転換
体または形質導入体。
７．上記６．に記載の形質転換体または形質導入体を培
地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼ活性を有するタンパク質を回収することを特徴とす
る、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造法。5. Above 4. An expression vector containing the described fructosyl amino acid oxidase gene. 6. The above 5. A transformant or transductant obtained by transforming or transducing a host cell with the expression vector according to 1. 7. Above 6. A method for producing fructosyl amino acid oxidase, which comprises culturing the transformant or transductant according to 1. in a medium, and recovering a protein having fructosyl amino acid oxidase activity from the culture.
【００１０】[0010]
【発明の実施の形態】１．フルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼ：本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
（以下「本発明オキシダーゼ」という）は、以下の
（ａ）〜（ｂ）に記載の理化学的性質を有する。
（ａ）作用及び基質特異性：酸素の存在下で、イミノ２
酢酸又はその誘導体を酸化して、グリオキシル酸又はα
−ケトアルデヒド、α−アミノ酸及び過酸化水素を生成
する反応を触媒する。ε−フルクトシルリジンには作用
しない。
（ｂ）至適ｐＨ：７．０〜８．５。また、最も好ましい
至適ｐＨはｐＨ７．８である。本発明オキシダーゼは、
詳細には、上記（ａ）〜（ｂ）に加えて、以下の（ｃ）
に記載の理化学的性質を有する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION 1. Fructosyl amino acid oxidase: The fructosyl amino acid oxidase of the present invention (hereinafter referred to as “the oxidase of the present invention”) has the physicochemical properties described in (a) and (b) below. (A) Action and substrate specificity: imino 2 in the presence of oxygen
Oxidizing acetic acid or its derivatives to give glyoxylic acid or α
Catalyze reactions to produce ketoaldehydes, α-amino acids and hydrogen peroxide. It has no effect on ε-fructosyl lysine. (B) Optimum pH: 7.0-8.5. The most preferable optimum pH is pH 7.8. The oxidase of the present invention is
Specifically, in addition to (a) and (b) above, the following (c)
It has the physicochemical properties described in.
【００１１】（ｃ）フルクトシルグリシンに対するKm値
が０．３１ｍＭである。(C) The Km value for fructosylglycine is 0.31 mM.
【００１２】本発明オキシダーゼは、より詳細には、上
記（ａ）〜（ｃ）に加えて、以下の（ｄ）〜（ｇ）に記
載の理化学的性質を有する。
（ｄ）至適温度の範囲：２５℃〜４０℃
（ｅ）熱安定性：３５℃、１０分の熱処理で８０％以上
の活性残存
（ｆ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ４．０〜８．５
（ｇ）分子量：約８５，０００（ゲル濾過法）、約４
２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
本発明オキシダーゼの酵素活性の測定方法としては、酵
素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や
酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主
な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過
酸化水素量を測定する方法について示す。以下、本発明
酵素の活性測定には、ことわりのない限り、フルクトシ
ルグリシンを基質として用いる。なお、酵素力価は、フ
ルクトシルグリシンを基質として測定したとき、１分間
に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定
義する。More specifically, the oxidase of the present invention has the physicochemical properties described in (d) to (g) below in addition to (a) to (c) above. (D) Optimum temperature range: 25 ° C. to 40 ° C. (e) Thermal stability: 35 ° C., 80% or more active residual after heat treatment for 10 minutes (f) Stable pH range: pH 4.0 to 8.5 (G) Molecular weight: about 85,000 (gel filtration method), about 4
2,000 (SDS-PAGE) As a method for measuring the enzyme activity of the oxidase of the present invention, a method of measuring the amount of hydrogen peroxide produced by the reaction of the enzyme, a method of measuring the amount of oxygen consumed by the enzyme reaction, etc. are mainly used. As a measuring method. The method for measuring the amount of hydrogen peroxide will be described below as an example. Hereinafter, fructosylglycine is used as a substrate for the activity measurement of the enzyme of the present invention unless otherwise specified. The enzyme titer is defined as 1 U, which is the amount of enzyme that produces 1 μmol of hydrogen peroxide per minute when measured with fructosylglycine as a substrate.
【００１３】Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：ＰＯＤ−４‐ＡＡ溶液
１．０ｋＵのパーオキシダーゼ（東洋紡社製、ＴＹＰＥ
III）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（東京化
成社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）に溶解し、１Ｌに定容する。
（２）試薬２：ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（同仁化学製）をイオン交換水に
溶解し、１００ｍｌに定容する。
（３）試薬３：基質溶液（１５０ｍＭ；終濃度 ５ｍ
Ｍ）
フルクトシルグリシン３５７ｍｇをイオン交換水に溶解
して１０ｍｌに定容する。フルクトシルバリンまたはε
−フルクトシルリジンを基質として用いるときはそれぞ
れ、４１７ｍｇ、４６２ｍｇをイオン交換水に溶解し
て、１０ｍｌに定容した溶液を用いる。A. Preparation of Reagents (1) Reagent 1: POD-4-AA solution 1.0 kU peroxidase (manufactured by Toyobo Co., TYPE
III), 100 mg of 4-aminoantipyrine (manufactured by Tokyo Kasei) and 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 8.
Dissolve in 0) and make up to 1 L. (2) Reagent 2: TOOS solution 500 mg of TOOS (manufactured by Dojindo Chemical Co., Ltd.) is dissolved in ion-exchanged water to a constant volume of 100 ml. (3) Reagent 3: substrate solution (150 mM; final concentration 5 m
M) Dissolve 357 mg of fructosyl glycine in ion-exchanged water and adjust the volume to 10 ml. Fructosyl valine or ε
-When fructosyl lysine is used as a substrate, 417 mg and 462 mg are dissolved in deionized water, and a solution having a fixed volume of 10 ml is used.
【００１４】Ｂ．測定法
２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１０
０μｌの酵素液を混和し、２５℃で５分間予備加温す
る。その後１００μｌの試薬３を加えて良く混ぜた後、
分光光度計（Ｕ−２０００Ａ、日立社製）により、５５
５ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値は、５５５ｎ
ｍにおける１分後から３分後の１分間あたりの吸光度変
化とする。なお対照液は、１００μｌの試薬３の代わり
に１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様
にしたものである。これをあらかじめ作製しておいた過
酸化水素の標準溶液を試薬３の代わりに、また酵素液の
代わりにイオン交換水を用い、その生成色素量との関係
を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、２５
℃、１分間当たりに生成される過酸化水素のマイクロモ
ルを計算し、この数値を酵素液中の活性単位とする。B. Assay 2.7 ml Reagent 1, 100 μl Reagent 2, and 10
Mix 0 μl of enzyme solution and preheat at 25 ° C. for 5 minutes. Then add 100 μl of Reagent 3 and mix well,
55 with a spectrophotometer (U-2000A, Hitachi)
Absorbance at 5 nm is measured. The measured value is 555n
It is the change in absorbance per minute from 1 minute to 3 minutes after m. The control solution was the same as that described above except that 100 μl of ion-exchanged water was added instead of 100 μl of the reagent 3. A standard solution of hydrogen peroxide prepared in advance is used in place of the reagent 3 and ion-exchanged water is used in place of the enzyme solution. Using this graph,
The micromoles of hydrogen peroxide produced per minute at ° C are calculated, and this value is taken as the activity unit in the enzyme solution.
【００１５】さらに別の態様では、本発明オキシダーゼ
は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質で
ある。なお、本発明オキシダーゼは、フルクトシルアミ
ノ酸オキシダーゼ活性を有する限り、配列番号２で表さ
れるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が
欠失、置換若しくは付加されてもよい。
２．フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの取得：本発明
オキシダーゼは、微生物や動物、植物起源の酵素を探索
して、自然界より取得することができる。本発明オキシ
ダーゼは、例えば、アグロバクテリウムなどの微生物の
培養物から通常の蛋白質精製法を用いて精製することが
できる。また、本発明オキシダーゼは、該酵素をコード
する遺伝子を適当な宿主-ベクター系で発現させること
により得られる。本発明オキシダーゼ遺伝子の取得法に
ついては後述する。In yet another embodiment, the oxidase of the present invention is a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. The oxidase of the present invention may have one or several amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as long as it has fructosyl amino acid oxidase activity. 2. Acquisition of fructosyl amino acid oxidase: The oxidase of the present invention can be acquired from nature by searching for enzymes of microbial, animal or plant origin. The oxidase of the present invention can be purified from a culture of a microorganism such as Agrobacterium using a conventional protein purification method. Further, the oxidase of the present invention can be obtained by expressing a gene encoding the enzyme in an appropriate host-vector system. The method for obtaining the oxidase gene of the present invention will be described later.
【００１６】さらに、本発明オキシダーゼを得る別法と
しては、変異処理の方法を用い、本発明酵素と異なる理
化学的性質を有するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
（以下、「性質を異にするオキシダーゼ」という）を改
変する方法がある。性質を異にするオキシダーゼとして
は、既知のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼなどが挙
げられるが、新たに探索して得られたフルクトシルアミ
ノ酸オキシダーゼや遺伝子工学的技術により改変して得
られたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼなどであって
もよい。既知のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとし
ては、例えば、コリネバクテリウム属細菌由来のフルク
トシルアミノ酸オキシダーゼ（特公平６−６５３００号
公報）が挙げられる。Further, as another method for obtaining the oxidase of the present invention, a method of mutation treatment is used, and a fructosyl amino acid oxidase having physicochemical properties different from that of the enzyme of the present invention (hereinafter referred to as "oxidase having different properties") is used. There is a way to modify. Examples of oxidases having different properties include known fructosyl amino acid oxidases, but fructosyl amino acid oxidases obtained by new search and fructosyl amino acid oxidases obtained by modification by genetic engineering techniques. May be Examples of known fructosyl amino acid oxidase include fructosyl amino acid oxidase derived from Corynebacterium bacterium (Japanese Patent Publication No. 6-65300).
【００１７】性質を異にするオキシダーゼの理化学的性
質を改変する方法としては、該オキシダーゼを生産する
微生物などに、例えば、紫外線、Ｘ線、放射線などを照
射したり、もしくはエチルメタンサルフォネート、Ｎ−
メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝
酸などの変異誘発剤を接触させることにより、改変され
た本発明オキシダーゼを生産する微生物を得、得られた
微生物から本発明オキシダーゼを得る方法などが挙げら
れる。As a method of modifying the physicochemical properties of oxidases having different properties, microorganisms that produce the oxidase are irradiated with, for example, ultraviolet rays, X-rays, radiation, or ethyl methanesulfonate, N-
Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, a method for obtaining the oxidase of the present invention from the obtained microorganism by contacting with a mutagenic agent such as nitrous acid, etc. Is mentioned.
【００１８】３．本発明のフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼ遺伝子：本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼ遺伝子（以下「本発明オキシダーゼ遺伝子」とい
う）は、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡを
含む。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列を含み、かつフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトシルア
ミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ。
配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
の一例としては、配列番号１で示される塩基配列が挙げ
られる。3. Fructosyl amino acid oxidase gene of the present invention: The fructosyl amino acid oxidase gene of the present invention (hereinafter referred to as "the oxidase gene of the present invention") contains the following DNA (a), (b) or (c). (A) DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 contains an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and A DNA encoding a protein having fructosyl amino acid oxidase activity. (C) A DNA which hybridizes with the DNA of (a) or (b) above under stringent conditions and which encodes a protein having fructosyl amino acid oxidase activity. DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
As an example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be mentioned.
【００１９】ストリンジェントな条件とは、特異的なハ
イブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグ
ナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリ
ダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さ
によって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼー
ションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変
えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハ
イブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合に
は、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げると
ともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を下げることにより
特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリ
ッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイ
ゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要に応
じて洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを
安定化させることが出来る。The stringent condition is a condition under which a signal of a specific hybrid is clearly distinguished from a signal of a non-specific hybrid, and the hybridization system to be used and the type, sequence and length of the probe. Depends on Such conditions can be determined by changing the temperature of hybridization, the temperature of washing and the salt concentration. For example, when even a non-specific hybrid signal is strongly detected, the specificity can be increased by raising the temperature of hybridization and washing and, if necessary, lowering the salt concentration of washing. Further, when no specific hybrid signal is detected, the hybrid can be stabilized by lowering the temperature of hybridization and washing and, if necessary, increasing the salt concentration of washing.
【００２０】本発明オキシダーゼ遺伝子は、データーベ
ース検索を利用して得ることができる。具体的には、ま
ず、ＦＡＳＴＡ，ＢＬＡＳＴ等のデーターベース検索に
より、既知のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの全配
列、もしくは部分配列を用いて、その配列と相同性を有
するタンパク（ホモログ）の配列情報を得る。既知のフ
ルクトシルアミノ酸オキシダーゼの配列としては、例え
ばコリネバクテリウム属細菌由来のフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼ（特開平１１−１５５５７９号公報）な
どを用いることができる。The oxidase gene of the present invention can be obtained by using a database search. Specifically, first, a sequence search of a known fructosyl amino acid oxidase is used to obtain sequence information of a protein (homolog) having homology with the sequence by a database search such as FASTA and BLAST. . As the known fructosyl amino acid oxidase sequence, for example, a fructosyl amino acid oxidase derived from a bacterium belonging to the genus Corynebacterium (JP-A-11-155579) can be used.
【００２１】次いで、得られたホモログについて、フル
クトシルアミノ酸オキシダーゼ活性の有無を確認する。
得られたホモログと既知のフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼとの配列の相同性が高ければ高いほど、同様の性
質を有している可能性が高いが、フルクトシルアミノ酸
オキシダーゼであるか決定するためには、ホモログの活
性を確認する必要がある。ホモログの活性を確認するた
めには、ソースとなる細胞、菌体等を培養し、フルクト
シルアミノ酸オキシダーゼ活性の有無を調べる方法や、
ホモログ遺伝子を適当なベクターにクローニングし、他
の宿主で発現させ、その活性を確認すればよい。また、
遺伝子工学的な技術を用い、性質を異にするオキシダー
ゼをコードする遺伝子を改変することにより、本発明オ
キシダーゼ遺伝子を得ることができる。上記遺伝子を改
変する方法としては、既知の如何なる方法でも用いるこ
とができる。例えば、単離したコリネバクテリウム・エ
スピー．２．４．１株由来の性質を異にするオキシダー
ゼをコードする遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＦＡ
５ＤＮＡ（特開平１１−１５５５７９号公報記載）に、
ハイドロキシルアミン、亜硝酸などの化学変異剤を接触
させる方法、またはＰＣＲ法を用いてランダムに変換す
る等の点変異方法、市販のキットを使用する部位特異的
な置換または欠失変異を生じさせるための周知技術であ
る部位特異的変異誘導法、この組換え体プラスミドＤＮ
Ａを選択的に開裂し、次いで選択されたオリゴヌクレオ
チドを除去又は付加し、連結する方法、すなわちオリゴ
ヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。次いで、上記
処理後の組換え体ＤＮＡを脱塩カラム、ＱＩＡＧＥＮ
（キアゲン社製）等を用いて精製し、種々の組換え体Ｄ
ＮＡを得る。本発明オキシダーゼをコードするＤＮＡを
含む組換え体ＤＮＡを選抜する事により、目的の遺伝子
が得られる。Next, the presence or absence of fructosyl amino acid oxidase activity in the obtained homolog is confirmed.
The higher the sequence homology between the obtained homolog and known fructosyl amino acid oxidase, the more likely it is that they have similar properties, but to determine if it is a fructosyl amino acid oxidase, It is necessary to confirm the activity of the homolog. In order to confirm the activity of the homologue, a method of culturing the source cells, cells, etc., and examining the presence or absence of fructosyl amino acid oxidase activity,
The homolog gene may be cloned into an appropriate vector, expressed in another host, and its activity confirmed. Also,
The oxidase gene of the present invention can be obtained by modifying a gene encoding an oxidase having different properties using a genetic engineering technique. As a method for modifying the above gene, any known method can be used. For example, isolated Corynebacterium sp. 2.4.1 Recombinant plasmid pFA containing a gene encoding an oxidase having different properties from the strain
5 DNA (described in JP-A No. 11-155579),
In order to generate a site-specific substitution or deletion mutation using a commercially available kit, a method in which a chemical mutagen such as hydroxylamine or nitrous acid is contacted, or a point mutation method such as random conversion using the PCR method Site-directed mutagenesis method, which is a well-known technique for this recombinant plasmid DN
A method of selectively cleaving A, then removing or adding the selected oligonucleotide, and ligating, that is, an oligonucleotide mutation induction method and the like can be mentioned. Then, the recombinant DNA after the above treatment is treated with a desalting column, QIAGEN.
(Manufactured by Qiagen) and purified by various recombinant D
Get NA. A target gene can be obtained by selecting a recombinant DNA containing a DNA encoding the oxidase of the present invention.
【００２２】４．発現ベクター：本発明の発現ベクター
は、本発明オキシダーゼ遺伝子を適当なベクターＤＮＡ
に連結することにより得ることができる。ベクターＤＮ
Ａは、形質転換する宿主中でフルクトシルアミノ酸オキ
シダーゼを生産させうるものであればどのようなもので
も用いることが出来る。例えば、プラスミドベクターＤ
ＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等を用いるこ
とが出来る。具体的には、例えば、ｐＵＣ１９（宝酒造
社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ+ （ＳＴＲ
ＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が好ましい。4. Expression vector: The expression vector of the present invention contains the oxidase gene of the present invention as a suitable vector DNA.
It can be obtained by connecting to. Vector DN
Any A can be used as A as long as it can produce fructosyl amino acid oxidase in the transforming host. For example, plasmid vector D
NA, bacteriophage vector DNA, etc. can be used. Specifically, for example, pUC19 (Takara Shuzo), pBluescriptII SK + (STR
(Manufactured by ATAGENE) and the like are preferable.
【００２３】本発明オキシダーゼ遺伝子を含有する発現
ベクターの一例として、プラスミド「ｐＵＣ-ＡｇａＥ
Ｈ」（工業技術院生命工学技術研究所に「ＦＥＲＭ Ｐ
−１８３７２」として寄託されている）が挙げられる。
プラスミドｐＵＣ-ＡｇａＥＨは、ベクターＤＮＡであ
るｐＵＣ１９のＥｃｏＲＶサイトに配列番号２記載のア
ミノ酸配列をコードする本発明オキシダーゼ遺伝子（配
列番号１）が挿入されている。As an example of the expression vector containing the oxidase gene of the present invention, the plasmid "pUC-AgaE" is used.
H "(institute of biotechnology, Institute of Industrial Science," FERM P
Deposited as "-18372").
In the plasmid pUC-AgaEH, the oxidase gene of the present invention (SEQ ID NO: 1) encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is inserted at the EcoRV site of vector DNA pUC19.
【００２４】５．形質転換体または形質導入体：上記の
発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換または形質導
入することにより、本発明オキシダーゼ生産能を有す
る、本発明の形質転換体または形質導入体が得られる。
宿主細胞としては、エッシェリシア属に属する大腸菌Ｋ
１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９、ＤＨ５α（共に東
洋紡社製）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（フナコシ（株）製）が
挙げられる。本発明の形質転換体の一例として、実施例
記載の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＵＣ-Ａ
ｇａＥＨ）を挙げることができる。5. Transformant or transductant: The transformant or transductant of the present invention having the oxidase-producing ability of the present invention can be obtained by transforming or transducing an appropriate host cell with the above expression vector.
As a host cell, Escherichia coli K belonging to the genus Escherichia
12, preferably Escherichia coli JM109, DH5α (both manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and XL1-Blue (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.). As an example of the transformant of the present invention, E. coli JM109 (pUC-A) described in Examples is used.
gaEH) can be mentioned.
【００２５】６．フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの
製造法：
上記５．に記載の形質転換体または形質導入体を培地に
培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
活性を有するタンパク質を回収することにより、本発明
オキシダーゼを製造することができる。具体的には以下
の方法が採用できる。6. Method for producing fructosyl amino acid oxidase: 5. The oxidase of the present invention can be produced by culturing the transformant or transductant described in 1 above in a medium and recovering the protein having fructosyl amino acid oxidase activity from the culture. Specifically, the following method can be adopted.
【００２６】まず、得られた形質転換体または形質導入
体（以下「微生物」と総称する）を培養する。この場
合、固体培養法で培養してもよいが、液体培養法を採用
して培養するのがより好ましい。また、上記微生物を培
養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、
肉エキス、コーンスティープリカー、大豆もしくは小麦
麹の浸出液などの１種以上の窒素源に、リン酸二水素カ
リウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩
化第２鉄、硫酸第２鉄もしくは硫酸マンガンなどの無機
塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、
ビタミンなどを適宜添加したものが用いられる。First, the obtained transformant or transductant (hereinafter collectively referred to as "microorganism") is cultured. In this case, the solid culture method may be used, but the liquid culture method is preferably used. Further, as the medium for culturing the above-mentioned microorganism, for example, yeast extract, peptone,
One or more nitrogen sources such as meat extract, corn steep liquor, soybean or wheat koji leaching solution, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate. Or more of inorganic salts such as
The thing which added vitamins etc. suitably is used.
【００２７】なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調製す
るのが適当である。また培養は、２５〜４２℃、好まし
くは３７℃前後で６〜２４時間、通気攪拌深部培養、振
とう培養、静置培養などにより実施するのが好ましい。
培養終了後、該培養物より本発明オキシダーゼを採取す
るには、通常の酵素採取手段を用いることが出来る。The initial pH of the medium is preferably adjusted to 7-9. Further, the culture is preferably carried out at 25 to 42 ° C., preferably around 37 ° C. for 6 to 24 hours by aeration and agitation deep culture, shaking culture, static culture and the like.
After culturing, the usual enzyme collecting means can be used for collecting the oxidase of the present invention from the culture.
【００２８】次いで、培養液から、例えば、濾過、遠心
分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体
から本発明オキシダーゼを採取することが好ましい。こ
の場合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波
破砕機、フレンチプレス、ダイノミル等の種々の破壊手
段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞
壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリト
ンＸ−１００等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽
出する方法などにより、菌体から本発明オキシダーゼを
採取するのが好ましい。Then, the cells are separated from the culture solution by an operation such as filtration or centrifugation, and washed. It is preferable to collect the oxidase of the present invention from the cells. In this case, although the cells can be used as they are, a method of destroying the cells using various disrupting means such as an ultrasonic crusher, a French press, and a dynomill, a cell wall lysing enzyme such as lysozyme is used. It is preferable to collect the oxidase of the present invention from the microbial cells by a method of dissolving the oxidase, a method of extracting the enzyme from the microbial cells using a surfactant such as Triton X-100, or the like.
【００２９】このようにして得られた粗酵素液から本発
明オキシダーゼを単離するには、通常の酵素精製に用い
られる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶
媒沈殿法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロ
マトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を
適宜組み合わせて行うのが好ましい。このようにして、
本発明オキシダーゼを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一
のバンドを示すまでに単離することができる。また、上
記精製方法を適宜組合わせて、用途に応じた精製度合い
の異なる酵素標品を調整することもできる。In order to isolate the oxidase of the present invention from the thus obtained crude enzyme solution, a method generally used for enzyme purification can be used. For example, it is preferable to perform an appropriate combination of ammonium sulfate salting-out method, organic solvent precipitation method, ion exchange chromatography method, gel filtration chromatography method, adsorption chromatography method, electrophoresis method and the like. In this way
The oxidase of the present invention can be isolated until it shows an almost single band by SDS-PAGE. In addition, enzyme preparations having different degrees of purification can be prepared according to applications by appropriately combining the above purification methods.
【００３０】[0030]
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明の技術的範囲は、それらの例に
より何ら限定されるものではない。
（１）データーベース検索
既に配列が明らかになっているコリネバクテリウム属細
菌由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特開平１
１−１５５５７９号公報）の全アミノ酸配列を用いて、
ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡデーターベースに対し相同
性検索を行ったところ、「AgaE homolog」という名称の
アグロバクテリウム由来の遺伝子を見出した。EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples. (1) Database search Fructosyl amino acid oxidase derived from Corynebacterium bacterium whose sequence has already been clarified
No. 1-155579),
A homology search was performed on the BLAST and FASTA databases, and a gene derived from Agrobacterium named "AgaE homolog" was found.
【００３１】アグロバクテリウム・トゥメファシエンス
Ｃ５８のｃｒｙｐｔｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＡｔＣ５
８上の６１７５ｂｐの領域は、Ｋｉｍ，Ｋ．−Ｓ. ら
（Ｓｏｇａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって塩基
配列が決定されている（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ１５１６
９８）。AgaE homolog遺伝子はこの領域に含まれるが、
該遺伝子がコードする酵素の機能や性質については、こ
れまで調べられていなかった。
（２）粗酵素液による、フルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼ活性の確認
アグロバクテリウム・トゥメファシエンスＣ５８（「AT
CC33970」として入手可能）をＬＢ培地（１％トリプト
ン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナ
トリウム、ｐＨ７．０）２０ｍＬに接種し、３０℃、１
２時間振とう培養した。この培養液を７０００ｒｐｍ、
１０分間遠心分離して集菌して菌体を得た。その後、超
音波により菌体を破砕し、４℃、１０，０００ｇ、１０
分の遠心により上清を回収し、粗酵素液とした。この粗
酵素液について、上記活性測定法にて、フルクトシルア
ミノ酸オキシダーゼ活性の有無を調べたところ、同活性
があることが確認された。
（３）サブクローニング
アグロバクテリウム・トゥメファシエンスＣ５８をＬＢ
培地２０ｍＬに接種し、３０℃、１２時間振とう培養し
た。この培養液を７０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し
て集菌し、この菌体からtotalＤＮＡを常法により調整
した。次にtotalＤＮＡをテンプレートにし、リン酸化
したプライマーＡｇａＰ１及びＡｇａＰ２を用いて以下
の条件で反応液を作った。Cryptic plasmid pAtC5 of Agrobacterium tumefaciens C58
The 6175 bp region on K. -S. Et al. (Sogang University) have determined the nucleotide sequence (GenBank AF1516).
98). The AgaE homolog gene is included in this region,
The function and properties of the enzyme encoded by the gene have not been investigated so far. (2) Confirmation of fructosyl amino acid oxidase activity by crude enzyme solution Agrobacterium tumefaciens C58 (“AT
CC33970 ") is inoculated into 20 mL of LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, pH 7.0) at 30 ° C, 1
It was shake-cultured for 2 hours. This culture solution is 7,000 rpm,
The cells were collected by centrifugation for 10 minutes to obtain bacterial cells. After that, the cells were crushed by ultrasonic waves, and the temperature was 4 ° C, 10,000 g, and 10 g.
The supernatant was recovered by centrifugation for minutes and used as a crude enzyme solution. The presence or absence of fructosyl amino acid oxidase activity in this crude enzyme solution was examined by the above-described activity measurement method, and it was confirmed that the crude enzyme solution had the same activity. (3) Subcloning Agrobacterium tumefaciens C58 to LB
20 mL of the medium was inoculated and cultured with shaking at 30 ° C. for 12 hours. The culture solution was centrifuged at 7,000 rpm for 10 minutes to collect the cells, and total DNA was prepared from the cells by a conventional method. Next, using total DNA as a template, phosphorylated primers AgaP1 and AgaP2 were used to prepare a reaction solution under the following conditions.
【００３２】
・total ＤＮＡ ２μｌ
・x10ＰＣＲバッファー １０μｌ
・２ｍＭ ｄＮＴＰ mix １０μｌ
・プライマーＡｇａＰ１（５０ｐｍｏｌ／μｌ） １μｌ
・プライマーＡｇａＰ２（５０ｐｍｏｌ／μｌ） １μｌ
・KOD DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ） １μｌ
・滅菌超純水 ７５μｌ （合計１００μｌ）
上記反応液を用いて、以下の条件でＰＣＲを行った
｛９４℃、３０秒；６０℃、３０秒；７２℃、９０秒｝
ｘ３０cycles-Total DNA 2 μl-x10 PCR buffer 10 μl-2 mM dNTP mix 10 μl-Primer AgaP1 (50 pmol / μl) 1 μl-Primer AgaP2 (50 pmol / μl) 1 μl-KOD DNA polymerase (2.5 U / μl) 1 μl-Sterile ultrapure Water 75 μl (total 100 μl) PCR was performed using the above reaction solution under the following conditions {94 ° C., 30 seconds; 60 ° C., 30 seconds; 72 ° C., 90 seconds}
x30cycles
【００３３】ＴＢＥバッファーを含む１．０％アガロー
スゲルを使用し、ＰＣＲ産物２０μｌを電気泳動した。
その結果、AgaE homolog 遺伝子と思われる単一のバン
ドを確認することができた。電気泳動で確認したバンド
を切り出し、GeneElute MinusEtBr Columns（シグマ・
アルドリッチ社製）にて指示通りに処理し、ＤＮＡ断片
を得た。次に得られたＤＮＡ断片を、あらかじめＥｃｏ
ＲＶ処理したのち、アルカリフォスファターゼ処理をし
たｐＵＣ１９（宝酒造社製）にサブクローニングした。20 μl of the PCR product was electrophoresed using a 1.0% agarose gel containing TBE buffer.
As a result, a single band considered to be the AgaE homolog gene could be confirmed. The band confirmed by electrophoresis is cut out, and GeneElute MinusEtBr Columns (Sigma ・
(Manufactured by Aldrich) and treated as instructed to obtain a DNA fragment. Next, the obtained DNA fragment was preliminarily Eco
After RV treatment, it was subcloned into pUC19 (Takara Shuzo) treated with alkaline phosphatase.
【００３４】以上により得られたプラスミドを用いて
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転
換株より、任意に１０株選択しプラスミド抽出を行っ
た。それぞれのプラスミドに対し制限酵素処理を行い、
適当なサイズのＤＮＡが挿入され、且つAgaE homolog
遺伝子がｐＵＣ１９上のｌｕｃプロモーターと同じ向き
に挿入されているプラスミドを選択し、「ｐＵＣ-Ａｇ
ａＥＨ」と命名した。Using the plasmid obtained as described above, E. E. coli JM109 was transformed. From this transformant, 10 strains were arbitrarily selected and plasmids were extracted. Perform restriction enzyme treatment on each plasmid,
AgaE homolog with proper size DNA inserted
The plasmid in which the gene was inserted in the same direction as the luc promoter on pUC19 was selected, and "pUC-Ag
aEH ”.
【００３５】（４）AgaE homolog 遺伝子の塩基配列の
確認
上記により得られたプラスミドについて、ＣＥＱ２００
０ＸＬ ＤＮＡ解析システム（ベックマン社製）を用い
て、指示通りに処理し、プラスミド挿入ＤＮＡ断片の塩
基配列を確認した。ＧｅｎＢａｎｋのＡＦ１５１６９８
ではAgaE homolog 遺伝子の長さは１１２２ｂｐとされ
ているが、３５４−３５５番目の間に２ｂｐの欠失（Ｃ
Ｇ）および、４１９−４２０番目の間に１ｂｐの欠失
（Ｇ）が認められ、正しくは、１１２５ｂｐであった。
今回確認した塩基配列を配列番号１に、またその塩基配
列より予想されるアミノ酸配列を配列番号２に記載し
た。なお、配列番号１の塩基配列を含むプラスミド「ｐ
ＵＣ-ＡｇａＥＨ」は、工業技術院生命工学技術研究所
にＦＥＲＭ Ｐ−１８３７２として寄託されている。(4) Confirmation of nucleotide sequence of AgaE homolog gene Regarding the plasmid obtained as described above, CEQ200
Using the 0XL DNA analysis system (manufactured by Beckman), treatment was performed as instructed, and the nucleotide sequence of the plasmid-inserted DNA fragment was confirmed. GenBank AF151698
However, the length of the AgaE homolog gene is 1122 bp, but the deletion of 2 bp between the 354-355th position (C
G) and a deletion of 1 bp (G) between the 419th and 419th positions, and it was 1125 bp correctly.
The nucleotide sequence confirmed this time is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence predicted from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2. The plasmid "p containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
UC-AgaEH "has been deposited as FERM P-18372 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology.
【００３６】（５）本発明オキシダーゼの生産及び精製
上記のようにして得られた本発明オキシダーゼを生産す
る形質転換体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐ
ＵＣ-ＡｇａＥＨ）をＬＢ−ａｍｐ培地１Ｌに植菌し、
３０℃、２４時間振とう培養した。得られた培養液１Ｌ
を７０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して集菌し、５０
ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＬに
懸濁した。その後、超音波により菌体を破砕し、４℃、
１０，０００ｇ、１０分の遠心により上清を回収し、粗
酵素液とした。(5) Production and Purification of the Oxidase of the Present Invention A transformant for producing the oxidase of the present invention obtained as described above, E. coli JM109 (p.
UC-AgaEH) was inoculated into 1 L of LB-amp medium,
It was shake-cultured at 30 ° C. for 24 hours. 1 L of the obtained culture solution
Were collected by centrifugation at 7,000 rpm for 10 minutes.
It was suspended in 50 mL of mM potassium phosphate buffer (pH 8.0). Then, sterilize the cells by ultrasonic waves,
The supernatant was recovered by centrifugation at 10,000 g for 10 minutes to obtain a crude enzyme solution.
【００３７】この粗酵素液に、５０％飽和となるように
硫酸アンモニウムを加え、十分に攪拌した後、１０，０
００ｒｐｍ、１０分の遠心により沈殿を回収した。沈殿
を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁
し、同緩衝液で一晩透析した。これを同緩衝液で平衡化
した１００ｍＬのＱ−セファロース（ファルマシア製）
カラムに吸着させ、同緩衝液５００ｍＬで洗浄した。そ
の後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）及
び０．８Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ８．０）それぞれ５００ｍＬを用い、グラ
ジェントにより溶出した。酵素活性画分を、予め０．２
Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ８．０）で平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌＡｃＡ３
４カラムにアプライして、タンパク質を溶出させた。そ
して、溶出後の活性画分を回収し、単一の精製酵素を得
た。Ammonium sulfate was added to the crude enzyme solution so as to be 50% saturated, and the mixture was sufficiently stirred and then 10,0.0
The precipitate was collected by centrifugation at 00 rpm for 10 minutes. The precipitate was suspended in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) and dialyzed against the same buffer overnight. 100 mL of Q-Sepharose (Pharmacia) equilibrated with the same buffer
It was adsorbed on the column and washed with 500 mL of the same buffer. After that, 500 mL of 50 mM potassium phosphate buffer solution (pH 8.0) and 500 mL of 0.8 mM sodium chloride-containing 50 mM potassium phosphate buffer solution (pH 8.0) were used to elute by gradient. The enzyme activity fraction was previously adjusted to 0.2
UltrogelAcA3 equilibrated with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing M sodium chloride.
The protein was eluted by applying to 4 columns. Then, the active fraction after elution was collected to obtain a single purified enzyme.
【００３８】（６）本発明オキシダーゼの理化学的性質
得られた本発明オキシダーゼの理化学的性質は、下記の
通りであった。
（ａ）作用及び基質特異性
前述した酵素活性の測定方法により、基質としてフルク
トシルグリシン、フルクトシルバリン、ε−フルクトシ
ルリジンを用いて、本発明オキシダーゼの活性を測定し
た。本発明オキシダーゼは、フルクトシルグリシン、フ
ルクトシルバリンに作用するが、ε−フルクトシルリジ
ンには作用しなかった。
（ｂ）至適ｐＨ
緩衝液として、２００ｍＭリン酸二ナトリウム−クエン
酸緩衝液（ｐＨ５．５〜６．０）、１００ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．５）、１００ｍＭ炭酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０〜１０．０）を用い、夫
々のｐＨにおいて、温度２５℃にて酵素反応を行った。
結果を図1に示す。本発明オキシダーゼは、ｐＨ７．８
において最も高い活性を示した。また、ｐＨ７．８での
活性に対して８０％以上の活性を示すｐH範囲は、ｐＨ
７．０〜８．５であった。以上から、本発明オキシダー
ゼの至適ｐＨはｐＨ７．０〜８．５であり、最も好まし
い至適ｐＨはｐＨ７．８であると判断した。
（ｃ）フルクトシルグリシンに対するＫｍ値
前記活性測定法において、基質フルクトシルグリシン濃
度を変化させて活性測定を行い、ラインウェーバー・バ
ークプロットから、ミカエリス定数（Ｋｍ）を求めた。
この結果、フルクトシルグリシンに対するＫｍ値は０．
３１ｍＭであることが判かった。
（ｄ）至適温度の範囲
後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反
応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行っ
た。結果を図３に示す。最も高い活性を示した温度であ
る、３５℃付近での活性に対して８０％以上の活性を示
す温度範囲は、２５〜４０℃であった。以上から、本発
明オキシダーゼの至適温度の範囲は、２５〜４０℃であ
ると判断した。
（ｅ）熱安定性
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用い
て、各温度で１０分間処理した時の熱安定性の結果は、
図４に示す通りであり、本発明オキシダーゼは、３５℃
付近まで安定であった。
（ｆ）安定ｐＨの範囲
緩衝液として、２００ｍＭリン酸二ナトリウム−クエン
酸緩衝液（ｐＨ３．０〜６．０）、１００ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．５）、１００ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．０）、１００ｍＭ炭
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０〜１０．５）を用い、
夫々のｐＨにおいて２５℃で１０分間処理した後、本発
明オキシダーゼの残存活性を測定した。結果を図２に示
す。最も高い残存活性を示したｐＨである、ｐＨ５．０
付近での活性に対して７０％以上の活性を示すｐＨ範囲
は、ｐＨ４．０〜８．５であった。(6) Physicochemical properties of the oxidase of the present invention The physicochemical properties of the oxidase of the present invention obtained were as follows. (A) Action and Substrate Specificity The activity of the oxidase of the present invention was measured by the above-mentioned enzyme activity measurement method using fructosylglycine, fructosyl valine and ε-fructosyl lysine as substrates. The oxidase of the present invention acted on fructosylglycine and fructosyl valine, but did not act on ε-fructosyl lysine. (B) Optimum pH As a buffer, 200 mM disodium phosphate-citrate buffer (pH 5.5 to 6.0), 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0 to 8.5), 100 mM sodium carbonate buffer Using the liquid (pH 9.0 to 10.0), the enzyme reaction was carried out at each pH at a temperature of 25 ° C.
The results are shown in Figure 1. The oxidase of the present invention has a pH of 7.8.
Showed the highest activity. The pH range showing 80% or more of the activity at pH 7.8 is
It was 7.0 to 8.5. From the above, it was determined that the optimum pH of the oxidase of the present invention was pH 7.0 to 8.5, and the most preferable optimum pH was pH 7.8. (C) Km value for fructosylglycine In the above-mentioned activity measuring method, the activity was measured by changing the substrate fructosylglycine concentration, and the Michaelis constant (Km) was determined from the Lineweaver-Burk plot.
As a result, the Km value for fructosylglycine was 0.
It was found to be 31 mM. (D) Optimum temperature range The activity of this enzyme was measured at various temperatures using a reaction solution having the same composition as the reaction solution in the activity measurement method described later. The results are shown in Fig. 3. The temperature range in which 80% or more of the activity around 35 ° C, which is the temperature at which the highest activity was exhibited, was 25-40 ° C. From the above, it was determined that the optimum temperature range of the oxidase of the present invention is 25 to 40 ° C. (E) Thermal stability The results of thermal stability when treated with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) at each temperature for 10 minutes are as follows.
As shown in FIG. 4, the oxidase of the present invention was
It was stable up to the vicinity. (F) As a stable pH range buffer, 200 mM disodium phosphate-citrate buffer (pH 3.0 to 6.0), 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0 to 8.5), 100 mM Tris- A hydrochloric acid buffer (pH 7.5 to 9.0) and a 100 mM sodium carbonate buffer (pH 9.0 to 10.5) were used,
After treatment at 25 ° C for 10 minutes at each pH, the residual activity of the oxidase of the present invention was measured. The results are shown in Figure 2. PH 5.0, which is the pH showing the highest residual activity
The pH range showing 70% or more of the activity in the vicinity was pH 4.0 to 8.5.
【００３９】以上から、本発明オキシダーゼの安定ｐＨ
範囲はｐＨ４．０〜８．５であると判断した。
（ｇ）分子量
常法により、セファデックスＧ−２００を用いるカラム
ゲル濾過法（０．１Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液中）及びマルチゲル１０／２０（第一
科学薬品社製）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子
量を求めた。本発明オキシダーゼの分子量は、それぞ
れ、約８５，０００（ゲル濾過法）、約４２，０００
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）であった。From the above, the stable pH of the oxidase of the present invention is
The range was determined to be pH 4.0-8.5. (G) Molecular weight According to a conventional method, a column gel filtration method using Sephadex G-200 (in 50 mM potassium phosphate buffer containing 0.1 M sodium chloride) and SDS-using Multigel 10/20 (manufactured by Daiichi Kagaku Yakuhin). The molecular weight was determined by the PAGE method. The molecular weights of the oxidase of the present invention are about 85,000 (gel filtration method) and about 42,000, respectively.
(SDS-PAGE).
【００４０】（７）既知のフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼとの比較
本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（本発明オ
キシダーゼ）と、既知のフルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼの理化学的性質との比較した結果を表1にまとめ
る。(7) Comparison with known fructosyl amino acid oxidase Table 1 shows the results of comparison between the fructosyl amino acid oxidase of the present invention (the oxidase of the present invention) and the physicochemical properties of the known fructosyl amino acid oxidase.
【００４１】[0041]
【表１】 [Table 1]
【００４２】既知のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
と比較すると、本発明オキシダーゼは、ε−フルクトシ
ルリジンに作用せず、かつフルクトシルグリシンに対す
るＫｍ値が小さいという特性を有する。Ｋｍ値が小さい
ことにより、試料中のフルクトシルグリシン（基質）が
低濃度である場合にも、高い酵素活性を得ることができ
る。本発明オキシダーゼは、従来よりも酵素の使用量が
低減できるので経済的である。また、コリネバクテリウ
ム属細菌由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと比
較すると、本発明オキシダーゼは至適ｐＨがｐＨ７．０
〜８．５であり、コリネバクテリウム属細菌由来の酵素
より低いｐＨ範囲で使用できる。また、通常の測定試薬
は中性範囲で使用するものが多いので、本発明オキシダ
ーゼはこの点でも有用である。Compared with the known fructosyl amino acid oxidase, the oxidase of the present invention has the characteristics that it does not act on ε-fructosyl lysine and has a small Km value for fructosyl glycine. Due to the small Km value, high enzyme activity can be obtained even when the fructosylglycine (substrate) in the sample has a low concentration. The oxidase of the present invention is economical because the amount of enzyme used can be reduced as compared with the conventional one. Further, as compared with the fructosyl amino acid oxidase derived from Corynebacterium, the oxidase of the present invention has an optimum pH of pH 7.0.
It is ~ 8.5, and can be used in a lower pH range than enzymes derived from Corynebacterium. Moreover, since most of the usual measuring reagents are used in the neutral range, the oxidase of the present invention is also useful in this respect.
【００４３】[0043]
【発明の効果】本発明により、新規なフルクトシルアミ
ノ酸オキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び形質転換体
が提供された。また、本発明によりフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼの製造方法が提供された。The present invention provides a novel fructosyl amino acid oxidase, a fructosyl amino acid oxidase gene, a recombinant vector containing the gene and a transformant. The present invention also provides a method for producing fructosyl amino acid oxidase.
【００４４】[0044]
【配列表】 sequence listing <110> KIKKOMAN CORPARATION <120> Novel fructosyl-amino acid oxidase <160> 4 <210> 1 <211> 1125 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens <400> １ atg acc gac aac acc atc tct tcg gcc gtc atc atc ggt gcc ggt atc ttc ggc gtt tct 60 acc ggc gtg cag ctt gcg cgg cgc ggc atc cag gtc act atc ctc aat gac ggc ccg ccc 120 gcc aac ggt gcc tcc ggc cgc tcg ctt tcc tgg tta aac tcg gcg cgc atg cgc tcg gaa 180 ccc tat cat cag ttg cgg atg gct ggc atc gac cgg tat cgt acg ctc gcg gcg gag aac 240 ccc gac gtg gaa tgg ctt cgc ttc gat ggt ggg ctg acc tgg gat tcg gat gac gag cgc 300 aac gag atc gac gca gcc tat cgc cac gag gtt tcg ctt gcc tat gac gcg cag cgg ctt 360 tcc gca ggc gac gtc gcc cgc gtc aca ccg ggc ata gac gca ggc gca atc acc ccg cag 420 ggt gcc atc ttc aat ccc ggc gaa ggc tgg gtc gat ctg cca aca ttg atc agg gtg ctt 480 ctg gaa gag ttt ttc gcg ctc ggg ggc gtt ctg gtg acg gac caa ggt gcc gcg cgg gtc 540 atg ctc gag ggt ggt cgt gct gtt ggt gcg gaa acc gca gaa ggt tat ctc cat cgg gcc 600 gat gct gtt gtg ctc gcg aca ggc ccg gcc gtg ccg aag atg gtt ggg gaa agc gga caa 660 atc atc ggt gac ggg aca ccg atc gct ctt ctc gtg caa acc aaa ccg ctc gcc cat ccc 720 ctg cgc gct gtc ctc aac aca ccg cgt gtc gct gtt cgc ccc gcg cca ggt ggc tcc ttc 780 tcg ctg gat gcc gac tgg gcg gcc gac gag ggt gtg aca gtg cgt gcg gac ggc acc tat 840 gag atc gat gac acc att gtt gcc gag ctt ctt gtg gag gct gcc aag gtg atg gaa ggc 900 aat ccg caa ctc gaa gtc gct tcg atc ggt gtt ggt ggg aag ccg atc ccg ggc gac gga 960 gag ccg gtg att gga gcc atc aag gcc att ccc ggc tat tac gtg gcc ttc agc cat agc 1020 ggc gca acg ctt ggc ctg atc gtg ggc gaa ttg ctc gct ttc gag att gtc acc ggg acc 1080 gag cat cag atg ctc gca acc ttc cga ccg gag cgt ttc tca agc taa 1128 <210> 2 <211> 375 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 2 Met Thr Asp Asn Thr Ile Ser Ser Ala Val Ile Ile Gly Ala Gly Ile 1 5 10 15 Phe Gly Val Ser Thr Gly Val Gln Leu Ala Arg Arg Gly Ile Gln Val 20 25 30 Thr Ile Leu Asn Asp Gly Pro Pro Ala Asn Gly Ala Ser Gly Arg Ser 35 40 45 Leu Ser Trp Leu Asn Ser Ala Arg Met Arg Ser Glu Pro Tyr His Gln 50 55 60 Leu Arg Met Ala Gly Ile Asp Arg Tyr Arg Thr Leu Ala Ala Glu Asn 65 70 75 80 Pro Asp Val Glu Trp Leu Arg Phe Asp Gly Gly Leu Thr Trp Asp Ser 85 90 95 Asp Asp Glu Arg Asn Glu Ile Asp Ala Ala Tyr Arg His Glu Val Ser 100 105 110 Leu Ala Tyr Asp Ala Gln Arg Leu Ser Ala Gly Asp Val Ala Arg Val 115 120 125 Thr Pro Gly Ile Asp Ala Gly Ala Ile Thr Pro Gln Gly Ala Ile Phe 130 135 140 Asn Pro Gly Glu Gly Trp Val Asp Leu Pro Thr Leu Ile Arg Val Leu 145 150 155 160 Leu Glu Glu Phe Phe Ala Leu Gly Gly Val Leu Val Thr Asp Gln Gly 165 170 175 Ala Ala Arg Val Met Leu Glu Gly Gly Arg Ala Val Gly Ala Glu Thr 180 185 190 Ala Glu Gly Tyr Leu His Arg Ala Asp Ala Val Val Leu Ala Thr Gly 195 200 205 Pro Ala Val Pro Lys Met Val Gly Glu Ser Gly Gln Ile Ile Gly Asp 210 215 220 Gly Thr Pro Ile Ala Leu Leu Val Gln Thr Lys Pro Leu Ala His Pro 225 230 235 240 Leu Arg Ala Val Leu Asn Thr Pro Arg Val Ala Val Arg Pro Ala Pro 245 250 255 Gly Gly Ser Phe Ser Leu Asp Ala Asp Trp Ala Ala Asp Glu Gly Val 260 265 270 Thr Val Arg Ala Asp Gly Thr Tyr Glu Ile Asp Asp Thr Ile Val Ala 275 280 285 Glu Leu Leu Val Glu Ala Ala Lys Val Met Glu Gly Asn Pro Gln Leu 290 295 300 Glu Val Ala Ser Ile Gly Val Gly Gly Lys Pro Ile Pro Gly Asp Gly 305 310 315 320 Glu Pro Val Ile Gly Ala Ile Lys Ala Ile Pro Gly Tyr Tyr Val Ala 325 330 335 Phe Ser His Ser Gly Ala Thr Leu Gly Leu Ile Val Gly Glu Leu Leu 340 345 350 Ala Phe Glu Ile Val Thr Gly Thr Glu His Gln Met Leu Ala Thr Phe 355 360 365 Arg Pro Glu Arg Phe Ser Ser 370 375 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <400> 3 cccatgaccg acaacaccat ctc 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <400> 4 cttcgaatga gtgtcttagc ttg 23[Sequence list] sequence listing <110> KIKKOMAN CORPARATION <120> Novel fructosyl-amino acid oxidase <160> 4 <210> 1 <211> 1125 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 1 atg acc gac aac acc atc tct tcg gcc gtc atc atc ggt gcc ggt atc ttc ggc gtt tct 60 acc ggc gtg cag ctt gcg cgg cgc ggc atc cag gtc act atc ctc aat gac ggc ccg ccc 120 gcc aac ggt gcc tcc ggc cgc tcg ctt tcc tgg tta aac tcg gcg cgc atg cgc tcg gaa 180 ccc tat cat cag ttg cgg atg gct ggc atc gac cgg tat cgt acg ctc gcg gcg gag aac 240 ccc gac gtg gaa tgg ctt cgc ttc gat ggt ggg ctg acc tgg gat tcg gat gac gag cgc 300 aac gag atc gac gca gcc tat cgc cac gag gtt tcg ctt gcc tat gac gcg cag cgg ctt 360 tcc gca ggc gac gtc gcc cgc gtc aca ccg ggc ata gac gca ggc gca atc acc ccg cag 420 ggt gcc atc ttc aat ccc ggc gaa ggc tgg gtc gat ctg cca aca ttg atc agg gtg ctt 480 ctg gaa gag ttt ttc gcg ctc ggg ggc gtt ctg gtg acg gac caa ggt gcc gcg cgg gtc 540 atg ctc gag ggt ggt cgt gct gtt ggt gcg gaa acc gca gaa ggt tat ctc cat cgg gcc 600 gat gct gtt gtg ctc gcg aca ggc ccg gcc gtg ccg aag atg gtt ggg gaa agc gga caa 660 atc atc ggt gac ggg aca ccg atc gct ctt ctc gtg caa acc aaa ccg ctc gcc cat ccc 720 ctg cgc gct gtc ctc aac aca ccg cgt gtc gct gtt cgc ccc gcg cca ggt ggc tcc ttc 780 tcg ctg gat gcc gac tgg gcg gcc gac gag ggt gtg aca gtg cgt gcg gac ggc acc tat 840 gag atc gat gac acc att gtt gcc gag ctt ctt gtg gag gct gcc aag gtg atg gaa ggc 900 aat ccg caa ctc gaa gtc gct tcg atc ggt gtt ggt ggg aag ccg atc ccg ggc gac gga 960 gag ccg gtg att gga gcc atc aag gcc att ccc ggc tat tac gtg gcc ttc agc cat agc 1020 ggc gca acg ctt ggc ctg atc gtg ggc gaa ttg ctc gct ttc gag att gtc acc ggg acc 1080 gag cat cag atg ctc gca acc ttc cga ccg gag cgt ttc tca agc taa 1128 <210> 2 <211> 375 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 2 Met Thr Asp Asn Thr Ile Ser Ser Ala Val Ile Ile Gly Ala Gly Ile 1 5 10 15 Phe Gly Val Ser Thr Gly Val Gln Leu Ala Arg Arg Gly Ile Gln Val 20 25 30 Thr Ile Leu Asn Asp Gly Pro Pro Ala Asn Gly Ala Ser Gly Arg Ser 35 40 45 Leu Ser Trp Leu Asn Ser Ala Arg Met Arg Ser Glu Pro Tyr His Gln 50 55 60 Leu Arg Met Ala Gly Ile Asp Arg Tyr Arg Thr Leu Arla Ala Glu Asn 65 70 75 80 Pro Asp Val Glu Trp Leu Arg Phe Asp Gly Gly Leu Thr Trp Asp Ser 85 90 95 Asp Asp Glu Arg Asn Glu Ile Asp Ala Ala Tyr Arg His Glu Val Ser 100 105 110 Leu Ala Tyr Asp Ala Gln Arg Leu Ser Ala Gly Asp Val Ala Arg Val 115 120 125 Thr Pro Gly Ile Asp Ala Gly Ala Ile Thr Pro Gln Gly Ala Ile Phe 130 135 140 Asn Pro Gly Glu Gly Trp Val Asp Leu Pro Thr Leu Ile Arg Val Leu 145 150 155 160 Leu Glu Glu Phe Phe Ala Leu Gly Gly Val Leu Val Thr Asp Gln Gly 165 170 175 Ala Ala Arg Val Met Leu Glu Gly Gly Arg Ala Val Gly Ala Glu Thr 180 185 190 Ala Glu Gly Tyr Leu His Arg Ala Asp Ala Val Val Leu Ala Thr Gly 195 200 205 Pro Ala Val Pro Lys Met Val Gly Glu Ser Gly Gln Ile Ile Gly Asp 210 215 220 Gly Thr Pro Ile Ala Leu Leu Val Gln Thr Lys Pro Leu Ala His Pro 225 230 235 240 Leu Arg Ala Val Leu Asn Thr Pro Arg Val Ala Val Arg Pro Ala Pro 245 250 255 Gly Gly Ser Phe Ser Leu Asp Ala Asp Trp Ala Ala Asp Glu Gly Val 260 265 270 Thr Val Arg Ala Asp Gly Thr Tyr Glu Ile Asp Asp Thr Ile Val Ala 275 280 285 Glu Leu Leu Val Glu Ala Ala Lys Val Met Glu Gly Asn Pro Gln Leu 290 295 300 Glu Val Ala Ser Ile Gly Val Gly Gly Lys Pro Ile Pro Gly Asp Gly 305 310 315 320 Glu Pro Val Ile Gly Ala Ile Lys Ala Ile Pro Gly Tyr Tyr Val Ala 325 330 335 Phe Ser His Ser Gly Ala Thr Leu Gly Leu Ile Val Gly Glu Leu Leu 340 345 350 Ala Phe Glu Ile Val Thr Gly Thr Glu His Gln Met Leu Ala Thr Phe 355 360 365 Arg Pro Glu Arg Phe Ser Ser 370 375 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <400> 3 cccatgaccg acaacaccat ctc 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <400> 4 cttcgaatga gtgtcttagc ttg 23
【図１】本発明オキシダーゼの至適ｐＨを示す図。FIG. 1 is a graph showing the optimum pH of the oxidase of the present invention.
【図２】本発明オキシダーゼの安定ｐＨ範囲を示す図。FIG. 2 is a diagram showing a stable pH range of the oxidase of the present invention.
【図３】本発明オキシダーゼの至適温度の範囲を示す
図。FIG. 3 is a view showing the optimum temperature range of the oxidase of the present invention.
【図４】本発明オキシダーゼの熱安定性を示す図。FIG. 4 shows the thermostability of the oxidase of the present invention.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA08 CA03 DA06 EA04 HA01 4B050 CC03 DD02 FF05E FF11E LL03 4B065 AA11Y AA26X AB01 BA02 CA28 CA46 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) C12N 9/06 C12N 5/00 AF term (reference) 4B024 AA11 BA08 CA03 DA06 EA04 HA01 4B050 CC03 DD02 FF05E FF11E LL03 4B065 AA11Y AA26X AB01 BA02 CA28 CA46
Claims (7)
アミノ酸オキシダーゼ。 （ａ）作用及び基質特異性：酸素の存在下で、イミノ２
酢酸又はその誘導体を酸化して、グリオキシル酸又はα
−ケトアルデヒド、α−アミノ酸及び過酸化水素を生成
する反応を触媒する。ε−フルクトシルリジンには作用
しない。 （ｂ）至適ｐＨ：７．０〜８．５1. A fructosyl amino acid oxidase having the following physicochemical properties. (A) Action and substrate specificity: imino 2 in the presence of oxygen
Oxidizing acetic acid or its derivatives to give glyoxylic acid or α
Catalyze reactions to produce ketoaldehydes, α-amino acids and hydrogen peroxide. It has no effect on ε-fructosyl lysine. (B) Optimum pH: 7.0-8.5
アミノ酸オキシダーゼ。 （ａ）作用及び基質特異性：酸素の存在下で、イミノ２
酢酸又はその誘導体を酸化して、グリオキシル酸又はα
−ケトアルデヒド、α−アミノ酸及び過酸化水素を生成
する反応を触媒する。ε−フルクトシルリジンには作用
しない。 （ｂ）至適ｐＨ：７．０〜８．５ （ｃ）フルクトシルグリシンに対するＫｍ値が０．３１
ｍＭである。 （ｄ）至適温度の範囲：２５℃〜４０℃ （ｅ）熱安定性：３５℃、１０分の熱処理で８０％以上
の活性が残存 （ｆ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ４．０〜８．５ （ｇ）分子量：約８５，０００（ゲル濾過法）、約４
２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）2. A fructosyl amino acid oxidase having the following physicochemical properties. (A) Action and substrate specificity: imino 2 in the presence of oxygen
Oxidizing acetic acid or its derivatives to give glyoxylic acid or α
Catalyze reactions to produce ketoaldehydes, α-amino acids and hydrogen peroxide. It has no effect on ε-fructosyl lysine. (B) Optimum pH: 7.0-8.5 (c) Km value for fructosylglycine is 0.31
It is mM. (D) Optimum temperature range: 25 ° C to 40 ° C (e) Thermal stability: 35 ° C, 80% or more of the activity remains after heat treatment for 10 minutes (f) Stable pH range: pH 4.0 to 8. 5 (g) molecular weight: about 85,000 (gel filtration method), about 4
2,000 (SDS-PAGE)
を含むフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。 （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列。 （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列を含み、かつフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼ活性を有する蛋白質。3. A fructosyl amino acid oxidase containing the following amino acid sequence (a) or (b): (A) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. (B) A protein containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having fructosyl amino acid oxidase activity.
Ａを含むフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子。 （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ。 （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列を含み、かつフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。 （ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトシルア
ミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ。4. A DN of (a), (b) or (c) below:
A fructosyl amino acid oxidase gene containing A. (A) A DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. (B) A DNA containing a protein having a fructosyl amino acid oxidase activity, which contains an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. (C) A DNA which hybridizes with the DNA of (a) or (b) above under stringent conditions and which encodes a protein having fructosyl amino acid oxidase activity.
シダーゼ遺伝子を含有する発現ベクター。5. An expression vector containing the fructosyl amino acid oxidase gene according to claim 4.
胞を形質転換または宿主細胞に形質導入して得られた、
形質転換体または形質導入体。6. A host cell obtained by transforming or transducing a host cell with the expression vector according to claim 5.
Transformant or transductant.
入体を培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸
オキシダーゼ活性を有するタンパク質を回収することを
特徴とする、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造
法。7. Production of fructosyl amino acid oxidase, which comprises culturing the transformant or transductant according to claim 6 in a medium and recovering a protein having fructosyl amino acid oxidase activity from the culture. Law.
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