JP5239472B2 - 蛍光イメージング装置 - Google Patents

Description

本発明は、小動物などの生体試料を対象とする光バイオイメージング技術に関する。

生体中の分子種がどのように分布しているかを画像化する手法は医学、生物学の重要な研究方法である。これまで細胞レベルでは顕微鏡を使い、蛍光色素を付着した分子プローブ（以下、蛍光プローブと記す。）や、化学発光を用いる分子プローブを用いて、分子種を画像化する方法が広く行われて来た。今後は細胞レベルからより大きな臓器やさらに動物の個体に対して、注目している分子種が分布している様子を生きたまま観察する装置が要求されている。例えばマウスなど個体におけるガン細胞に蛍光プローブが結合するようにして、注目するガン細胞の増殖の様子を画像化し、毎日とか毎週とかの経時変化として観測する技術である。従来の細胞レベル用の測定装置で動物個体内部のガン細胞の増殖を見るためには、動物を殺して所定の部分を染色したり、蛍光体を付けたりして観察することになるが、それでは１つの個体に対する長期間にわたる細胞の経時的な増殖を見ることができない。この理由で小動物個体の内部情報の分子種を、個体が生きたままの状態で観察できる装置の開発が望まれている。

近赤外光は生体内部における光の透過率が比較的良いため、生体試料を観察する装置では、蛍光を励起するための励起光として６００ｎｍ〜９００ｎｍ程度の波長の光が用いられている。
そのような生体試料を観察する従来の蛍光イメージング装置は、通常、生体試料の上方（一方向）からの観察画像しか撮像できず、多方向からの観察画像を取得することはできなかった。蛍光プローブを用いて小動物の撮像を行なう場合、特定の方向からの撮像したときは蛍光が検出されないが他の方向から撮像すると蛍光が検出されることがある。これは、一方向からの観察だけでは癌を見落とす可能性があることを意味する。そのため、オペレータは小動物を体軸を中心として少しずつ回転した像を撮像することで近似的に多方向からの観察を行なう必要があった。しかし、生体試料を回転させて何度も撮像を行なうと、生体試料は均一な形状ではないため、回転させる度に回転角がばらついて再現性のある測定を行なうことが困難であった。

多方向からの観察画像を得る方法として、回転反射鏡を用いて時分割で多数の角度の画像を順次取得する方法が提案されている（特許文献１参照。）。この手法によれば、試料自身の平行移動はあるものの、試料を回転させたり二次元検出器を回転させたりすることなく、途中の反射鏡の回転と試料の位置の変化によって多方向の観察を行なうことができ、再現性の高い多方向からの観察画像を取得して試料からの蛍光の見落としを改善することができる。
米国特許出願公開２００５０２０１６１４

ところで、従来の蛍光イメージング装置では、蛍光を励起する励起光を照射するための光源を１つだけ備えており、しかもその光源の照射方向と観察方向との相対的な位置関係は常に一定で、観察方向とほぼ同じ方向から光を照射するようになっていることがほとんどである。光源の照射方向と観察方向が同じ場合、生体試料の表面で発生する自家蛍光が強く検出されてバックグランドとして画像に写る。蛍光を発するプローブの位置が生体試料の励起光が照射されている側に浅く近い場合には強い強度の蛍光を検出することができるが、プローブが生体試料の深い位置にある場合は生体内部で減衰してしまうためにその検出強度が弱くなり、自家蛍光によるバックグランドに埋まってしまう可能性もある。

したがって、プローブが生体試料の深い位置にある場合には観察方向とは異なる方向から励起光を照射したほうがよい場合がある。また、励起光の照射方向を変化させて撮像することによってプローブ位置の深さ方向の情報を得ることもできるという利点もある。このように、生体蛍光イメージング技術を用いた測定では、観測したい部位の深さや自家蛍光強度との兼ね合いなどの条件に応じて観察方向と励起光の照射方向を変化させて撮像することが有効である。

そこで本発明は、生体試料の測定したい部位の位置に応じた条件で撮像を行なうことができる蛍光イメージング装置を提供することを目的とするものである。

本発明は、生体試料が載置される試料台と、二次元検出器及び二次元検出器に試料台上の生体試料の複数の異なる方向からの観察画像の光を導くための撮像光学系を含む撮像部と、二次元検出器からみた方向が互いに異なる２以上の方向から、試料台上の生体試料を励起して蛍光を発生させる励起光を選択的に照射できる光源装置と、励起光を遮蔽して生体試料からの蛍光を二次元検出器に導く蛍光フィルタと、撮像部による撮像の観察方向及び光源装置の励起光の照射方向を含む撮像条件を設定するための撮像条件設定部と、撮像条件設定部で設定された撮像条件での観察画像を撮像部で撮像するように、光源装置及び撮像部を制御する撮像制御部と、撮像部により撮像された画像を記憶する画像記憶部と、画像記憶部に記憶されている複数の画像のうち少なくとも一部を表示する画像表示部と、を備えた蛍光イメージング装置である。
複数の方向から励起光を照射できる光源装置と、複数の方向からの観察画像を撮像できる撮像部と、励起光の照射方向と観察方向を撮像条件として設定できる条件設定部を備えているので、任意の撮像条件での撮像が可能である。

複数の励起光の照射方向と複数の観察方向を備えている蛍光イメージング装置では、同一の生体試料について照射方向数×観察方向数の撮像画像を取得することができる。しかし、蛍光イメージング装置による蛍光観察は１つの画像を取得するだけでも長時間を要するため、全種類の画像を取得するには膨大な時間を要する。本発明のように、撮像する画像の条件として観察方向と励起光の照射方向を設定できれば、必ずしも全ての撮像を行なう必要がなくなり、不要な画像の撮像時間を短縮することができる。この機能は、特に、生体試料の観察すべき部位の位置が予めわかっている場合に有効である。すなわち、観察したい部位の位置に適した条件の撮像のみを行なうことができるため、観察画像の取得にかかる時間を短縮することができる。なお、生体試料の観察すべき部位の位置が未知である場合には、全撮像条件で撮像を行なうように設定すればよい。

また、本発明の蛍光イメージング装置においては、画像記憶部に記憶されている画像から画像表示部に並列表示させる画像を設定するための表示画像設定部と、をさらに備え、画像表示部は、画像記憶部に記憶されている画像のうち画像条件設定部で設定された画像を並列表示する機能を備えていることが好ましい。
画像条件設定部で並列表示する画像を設定し、設定した画像を画像表示部に並列表示させる機能は、生体試料の観察すべき部位の位置が未知である場合に特に有効である。前述のように、生体試料の観察すべき部位の位置が未知である場合には照射方向と観察方向の全ての組合わせでの撮像を行なう必要があるが、撮像された画像は照射方向数や観察方向数によっては膨大な量となり、それら全ての画像を表示すると見にくくなる。そこで、撮像した画像のうち必要な情報を得るための比較に用いる画像のみを選択して並列表示するようにすれば、比較対象画像が見やすくなる。

本発明の蛍光イメージング装置における撮像光学系が試料台上の生体試料の周囲の互いに異なる複数の位置に設けられ、各方向からの観察画像の光を同時に二次元検出器に導く複数の反射鏡と、それら複数の反射鏡によって導かれた画像の光を二次元検出器上に結像させる結像レンズを備えている。そのため、二次元検出器によって試料台上の生体試料を複数の角度からの観察画像を同時に得ることができる。その場合、撮像条件設定部では光源装置の励起光の照射方向のみを設定する。

上記の場合、撮像光学系には、反射鏡により二次元検出器上に導かれる各画像の光の光路長差に基づく画像の焦点を補正する補助結像レンズが設けられていることが好ましい。

本発明の蛍光イメージング装置は、光源装置は生体試料の外形像を撮像するための照明用光源を備え、生体試料の外形像の撮像時は、生体試料に対して照明用光源から照明光が照射され、蛍光フィルタが生体試料からの画像の光の光路から外れた状態で撮像部による撮像が行なわれることが好ましい。そうすれば、生体試料の外形像を撮像画像を取得でき、取得した外形画像と蛍光画像とを対応させることによって蛍光が生体試料のどの場所から発せられているかを容易に確認できるようになる。

本発明の蛍光イメージング装置においては、複数の方向から励起光を照射できる光源装置と、複数の方向からの観察画像を撮像できる撮像部と、励起光の照射方向と観察方向を撮像条件として設定できる条件設定部を備え、照射方向と観察方向の任意の組合わせによる画像を取得して表示できるようにしたので、生体試料の観察したい部位の位置が予めわかっている場合に、不要な条件での撮像を省略してその位置に応じた撮像条件でのみ撮像を行なうことができ、撮像にかかる時間を短縮できる。また、生体試料の観察したい部位の位置が未知な場合には、照射方向と観察方向の全ての組合わせでの撮像を行なうことができ、その画像のうちから任意の画像を選択的に画像表示部に表示することができるので、測定部位に関する多くの情報を得ることができる。

また、画像表示部に任意の画像を選択的に並列表示させることができれば、オペレータが所望の情報を得るために比較する複数の画像が並列に表示されるため、それらの画像を視覚的に確認しやすくなる。

以下に本発明の蛍光イメージング装置の一実施例を説明する。図１は一実施例の蛍光イメージング装置の構成を概略的に示すブロック図である。
この蛍光イメージング装置で観察する生体試料４は観察する部位が蛍光剤によって標識されたものである。生体試料４の多方向からの観察画像を撮像するための撮像部２は、二次元検出器（図示は省略）とその二次元検出器に生体試料４の多方向からの画像の光を導くための光学系（図示は省略）を備えている。撮像部２は制御部８によってその撮像動作が制御されている。

蛍光剤で標識された部位を励起して蛍光を発生させる励起光を生体試料４に照射する光源装置６が設けられている。光源装置６は互いに異なる複数の方向から選択的に励起光を照射することができる。光源装置６は制御部８によって光照射動作が制御されている。

演算処理部９と画像記憶部１０が撮像部２に接続されている。演算処理部９は撮像部２により撮像された画像又は画像記憶部１０に記憶されている画像に対して所定の処理を施し、画像記憶部１０又は画像表示部１２に送る。画像記憶部１０は撮像部２で撮像された画像や演算処理部９で所定の処理が施された後の画像を記憶することができる。演算処理部９は制御部８によってその処理動作が制御されている。

制御部８は撮像部２、光源装置６及び演算処理部９を制御しているが、その制御は撮像条件設定部１４と表示画像設定部１６で設定された情報に基づいて行なわれる。
撮像条件設定部１４ではオペレータによって撮像する観察方向や励起光の照射方向が設定される。表示画像設定部１６ではオペレータによって画像表示部１２に表示する画像が設定される。画像表示部１２は撮像部２で撮像された画像を一覧的に表示するだけでなく、表示画像設定部１６で設定された画像を並列表示する機能を備えている。

次に、同実施例の蛍光イメージング装置の撮像部２及び光源装置６の構成の具体例を図２を用いて説明する。
生体試料４は透明な試料台３上に載置されている。撮像部２として、試料台３の真上に配置された二次元検出器１８、反射鏡Ｍ１〜Ｍ４、主結像レンズ２０、補助結像レンズＬ０〜Ｌ４及び蛍光フィルタ２２が設けられている。

反射鏡Ｍ１〜Ｍ４は試料台３の主平面内方向と垂直な面内に配置されている。反射鏡Ｍ１〜Ｍ４は二次元検出器１８による真上からの直接的な観察方向を０°として、反時計回りに７２°毎にずれた方向からの観察画像の光を二次元検出器１８に導くように配置されている。すなわち、反射鏡Ｍ１は７２°方向、反射鏡Ｍ２は１４４°方向、反射鏡Ｍ３は２１６°方向、反射鏡Ｍ４は２８８°方向からの観察画像の光を二次元検出器１８に導くように配置されている。

主結像レンズ２０は反射鏡Ｍ１〜Ｍ４からの光を二次元検出器１８上に結像させるものであり、二次元検出器１８の受光面側に設けられている。
補助結像レンズＬ０〜Ｌ４は各反射鏡Ｍ１〜Ｍ４からの光の光路長差を補正するためのものであり、各光路上に配置されている。
蛍光フィルタ２２は励起光を遮蔽して蛍光成分を透過させるものであり、生体試料４からの蛍光を観察する際に主結像レンズ２０の入射側に設けられる。

光源装置６は５つの光源Ｓ１〜Ｓ５を備えている。光源装置６の光源Ｓ１〜Ｓ５は、生体試料４の体軸と垂直な面内に設けられ、かつ生体試料４の体軸延長線上を中心とする同一円周上の互いに異なる位置に均等に配置されている。光源Ｓ１〜Ｓ５は生体試料４に対して真上からの方向を０°方向として反時計周りに３６°（Ｓ１），１０８°（Ｓ２），１８０°（Ｓ３），２５２°（Ｓ４），３２４°（Ｓ５）の方向から光を照射するように配置されている。これらの光源Ｓ１〜Ｓ５はそれぞれ独立して点灯及び消灯を行なうことができる。なお、図では、光源装置６は光源Ｓ１〜Ｓ５を保持する円周のみが図示されている。また、同図では光源Ｓ１〜Ｓ５はそれぞれ１つの光源として図示されているが、これらの光源Ｓ１〜Ｓ５は蛍光剤によって標識された生体試料４の特定の部位を励起して蛍光を発生させる励起光を発する励起光源と、生体試料４の全体画像を撮像するための照明用光源とを備えている。

この例の蛍光イメージング装置では、二次元検出器１８による直接的な観察画像の光と各反射鏡Ｍ１〜Ｍ４によって導かれる観察画像の光が主結像レンズ２０によって二次元検出器１８上で結像し、図３や図４（Ａ）に示されているような５方向からの観察画像を同時に取得することができる。図４（Ａ）は蛍光観察画像を別に撮像された外形画像の上に重ね合わせたものである。このようにして撮像された蛍光観察画像は演算処理部９によって、例えば図４（Ｂ）に示されているように、オペレータが確認しやすいように観察方向ごとに切り取られて左右反転、画像サイズ調整、表示順番調整などの処理が施されて画像表示部１２に表示される。

図２の構成では、二次元検出器１８上に５方向からの観察画像が結像されて同時に撮像されるため、撮像条件設定部１４で設定する撮像条件は励起光の照射方向（Ｓ１〜Ｓ５）のみである。この場合の撮像条件の設定方法として、表１に示されたシーケンス一覧表からシーケンス番号を選択して設定する方法を挙げることができる。表１において、「○」は光源の点灯を意味し、「×」は光源の消灯を意味する。

表１の例は、光源装置６の光源Ｓ１〜Ｓ５を全て点灯させて撮像する工程（シーケンス１）と各光源Ｓ１〜Ｓ５を１つずつ点灯させて撮像する工程（シーケンス２〜シーケンス６）を設けた場合を示している。撮像条件設定部１４にはこのようなシーケンスの一覧が設定されており、オペレータが生体試料４の観察したい部位の位置に応じたシーケンスを選択することによって撮像条件設定部１４が選択されたシーケンスに応じた信号を制御部８に送信し、制御部８は選択されたシーケンスに応じた条件で撮像が行なわれるように撮像部２及び光源装置６を制御する。
この実施例では、１つのシーケンス（励起光の照射方向）について５方向からの観察画像を同時に撮像することができるため、例えば１〜６の全てのシーケンスを実行すると６×５＝３０種類の観察画像を取得することができる。表２は全てのシーケンスを実行して得られる観察画像への画像番号の割り当ての一例を示すものである。

表２の例では、各シーケンス１〜６で取得した５種類の画像にそれぞれ観察方向の順に１〜５までの番号を割り振っている。ここで割り振られている画像は、１つのシーケンスにおいて１枚の画像として撮像された５種類の画像から観察方向ごとに切り取られ、左右反転やサイズ調整など、オペレータが確認しやすいように調整された画像である。このように一覧化することにより、オペレータは確認したい画像のみを取り出して表示することができる。

図５はオペレータによって選択された画像が画像表示部１２に並列に表示された例を示すものである。画像表示部１２に並列に表示される画像は、オペレータによって表示画像条件設定部１６に例えば表３のように入力された表示画像条件に対応したものである。この例では、オペレータが５つの画像条件を入力した場合を示している。なお、４つ以下又は６つ以上の画像条件を指定した場合にはその条件に対応した画像が画像表示部１２に表示される。また、図６に示されているように、画像表示部１２に並列に表示させる画像の組を複数設定できるようになっていてもよい。

この実施例の蛍光イメージング装置では、図２や図３に示したように、１つのシーケンスで同時に５つの画像を取得できるが、それらの画像は同じ励起光の照射方向で異なる観察方向から撮像した画像である。しかし、このように任意に選択した画像を並列に表示することができれば、例えば観察方向が同じで励起光の照射方向が異なる画像を並列に表示して比較することも可能である。

なお、表１では、光源装置６の光源Ｓ１〜Ｓ５を全部点灯させるシーケンス（シーケンス１）といずれか１つの光源のみを点灯させるシーケンス（シーケンス２〜シーケンス６）とを設けているが、表４に示されているように、２以上の光源を同時に点灯させるシーケンスをさらに設けてもよい。

次に、図１、図７及び図８を参照しながらこの実施例の蛍光イメージング装置の動作について説明する。図７は蛍光イメージング装置の撮像動作の一例を示すフローチャート図であり、図８は撮像した画像の表示動作の一例を示すフローチャート図である。
まず、オペレータが観察したい部位の位置に応じた撮像条件を撮像条件設定部１４で設定する（ステップＳ１）。撮像条件の設定方法の詳細については後述する。

生体試料４に照明光（励起光ではない）を照射した状態で、図３に示されているような、生体試料４の全観察方向からの全体像を撮像する（ステップＳ２）。このとき、図２に示されているような、蛍光成分のみを二次元検出器１８に導くための蛍光フィルタ２２は各観察方向からの光の光路から外しておく。撮像した生体試料４の全体像の画像は画像記憶部１０に記憶される（ステップＳ３）。なお、複数方向からの観察画像を１枚の画像として撮像した場合には、演算処理部９において撮像した画像を観察方向ごとに分割し、サイズ調整や左右反転等の補正を施してから画像記憶部１０に記憶させるようにしてもよい。

次に、撮像条件設定部１４で設定した撮像条件に基づいて生体試料４の蛍光観察画像を撮像する。この撮像では、撮像条件設定部１４で設定された励起光の照射方向及び観察方向で撮像できる状態となるように光源装置６の光源の点灯や撮像部２の光学系を調整し（ステップＳ４）、撮像する（ステッＳ５）。撮像した蛍光観察画像は画像記憶部１０に記憶される（ステップＳ６）。なお、複数方向からの観察画像を１枚の画像として撮像した場合には、演算処理部９において撮像した画像を観察方向ごとに分割し、サイズ調整や左右反転等の補正を施してから画像記憶部１０に記憶させるようにしてもよい。
撮像条件設定部１４で複数の撮像条件が設定されている場合には、全ての撮像条件での撮像が終了するまで励起光の照射方向及び観察方向の調整（ステップＳ４）、撮像（ステップＳ５）及び撮像画像の記憶（ステップＳ６）を繰り返し行なう（ステップＳ７）。

全ての撮像条件での撮像が終了した後、オペレータは撮像した画像を画像表示部１２に表示させるかどうかを選択する（ステップＳ１１）。画像を画像表示部１２に表示させる場合には、オペレータは特定の画像を並列表示させるかどうかをさらに選択することができる（ステップＳ１２）。特定の画像を画像表示部１２に並列表示させる場合は、オペレータが表示画像設定部１６で並列表示する画像を選択して設定し（ステップＳ１３）、設定された画像が画像表示部１２に並列表示される（ステップＳ１４）。特定の画像を並列表示しない場合には、撮像した全画像が一覧的に表示される（ステップＳ１５）。並列表示する画像の設定方法については後述する。

なお、上記の動作では、生体試料４の全体像を撮像した（ステップＳ２）後で蛍光画像の撮像（ステップＳ４〜ステップＳ６）を行なっているが、実際には、生体試料４の全体像の撮像を蛍光画像の撮像の後で行なってもよい。

撮像条件の設定方法について図９を参照しながら説明する。図９は撮像条件の設定方法の一例を示すフローチャート図である。
撮像条件の設定において、オペレータは、励起光の照射方向を選択し（ステップＳ２１）、その照射方向から励起光を照射したときに撮像したい観察方向を選択する（ステップＳ２２）。従来技術のように、撮像部２が回転式反射鏡を備えているなど複数方向からの観察画像を順次撮像するものである場合には、観察方向を選択することが可能であるが、撮像部２が図２に示したような複数方向からの観察画像を同時に撮像するものである場合には観察方向を指定しない。このようにして設定された励起光の照射方向と観察方向との組合わせは撮像条件として記憶される（ステップＳ２３）。さらなる撮像条件を設定する場合（ステップＳ２４）は、再度、励起光の照射方向を選択し（ステップＳ２１）、その照射方向で撮像したい観察方向を選択（ステップＳ２２）することによって新たな撮像条件として記憶される（ステップＳ２３）。なお、設定された撮像条件は撮像条件設定部１４内に記憶されるようになっていてもよいし、制御部８内に記憶されるようになっていてもよい。

次に、画像表示部１２に並列表示する画像の設定方法の一例を説明する。図１０は画像表示部１２に並列表示する画像の設定方法の一例を示すフローチャート図である。
まず、画像表示部１２に並列に表示する画像の数をオペレータが設定する（ステップＳ３１）。オペレータによって並列表示する画像数が設定されることにより、表示画像の配置位置が割り当てられ、配置位置を指定することができるようになる。オペレータは、画像記憶部１０に記憶されている画像の中から並列表示したい画像を選択し（ステップＳ３２）、その画像を画像表示部１２において割り当てられた配置位置のうちどの位置に配置するかを選択する（ステップＳ３３）。選択された画像とその画像の配置位置は表示画像設定部１６内や制御部８内に記憶され（ステップＳ３４）、全ての配置位置に表示する画像が選択されるまで以上の動作を繰り返す（ステップＳ３５）。

なお、画像選択時は、画像表示部１２内に画像記憶部１０に記憶されている画像が撮像条件とともに一覧表示されているか、又は撮像条件から検索して選択できるようになっていることが好ましい。選択した画像について演算処理部９による画像加工処理の有無をオペレータが選択できるようになっていてもよい。

図２の蛍光イメージング装置を用いて実際に蛍光観察を行なったときの観察結果を以下に示す。この観察では生体試料４の代わりとして図１１に示すファントム２４を用いた。ファントム２４は生体試料と同様に光が散乱吸収伝播するよう散乱物質および吸収物質を混入した樹脂でできており、直径２８ｍｍの円筒形状に硬化させたものである。このファントム２４内の異なる２箇所に励起光が照射されることによって蛍光を発する蛍光剤ａ，ｂが設置されている。蛍光剤ａは表面から２ｍｍ位置にあり、蛍光剤ｂの深さは表面から４ｍｍの位置にある。

この蛍光観察において、光源装置６の各光源Ｓ１〜Ｓ５を順に１つずつ点灯させたときの５方向からの観察画像を同時に撮像したものが図１２〜図１６である。図１２は光源装置６の光源Ｓ１（３６°）のみ、図１３は光源Ｓ２（１０８°）のみ、図１４は光源Ｓ３（１８０°）のみ、図１５は光源Ｓ４（２５２°）のみ、図１６は光源Ｓ５（３２４°）のみをそれぞれ点灯させて撮像したときの観察画像である。

図１２〜図１６を比較することからもわかるように、蛍光剤が試料の浅い部分に存在する場合にはその蛍光剤に近い方向から観察するほうが強い蛍光を検出することができるが、蛍光剤が励起光の照射方向から遠い位置にある場合には、蛍光剤に近い方向から観察したとしても強い蛍光を検出することはできない。また、蛍光剤の位置が試料中心に近づくにつれて、蛍光の検出強度の励起光照射方向に対する依存性は減少する。すなわち、蛍光検出強度の観察方向に対する依存性だけでなく、蛍光検出強度の励起光照射方向に対する依存性をオペレータが確認しやすいように撮像された画像が表示されれば、蛍光剤のより詳細な位置情報を得ることができる。

図１７は図１２〜図１６で撮像した計２５種類の画像から同じ観察方向で励起光の照射方向が異なる画像を切り取って並列に配置したものである。（Ａ）はファントム２４の蛍光剤ａからの蛍光強度が高く検出される観察方向０°からの観察画像を励起光の照射方向ごとに並べたものであり、（Ｂ）は蛍光剤ｂからの蛍光強度が高く検出される観察方向２８８°からの観察画像を励起光の照射方向ごとに並べたものである。これら画像データを比較すれば、（Ｂ）において、観察方向２８８°に近い励起光照射方向２５２°及び３２４°で蛍光剤ｂからの蛍光が強く検出されているが、他の照射方向では蛍光がほとんど検出されていない。それに対し、（Ａ）において、観察方向０°では励起光の照射方向３６°,３２４°で蛍光が強く検出されるとともに、照射方向１０８°，２５２°の画像においても弱いながら蛍光剤ａからの蛍光が検出されている。このことは、蛍光剤ａは蛍光剤ｂよりも深い位置にあるのではないかとの知見を与えるものとなる。

また、図１８は図１２〜図１６の画像のうちから観察方向と励起光の照射方向の相対的な位置関係が３６°（±３６°）となっている画像を抜き出して並べたものである。すなわちこれらの画像は、観察方向と励起光の照射方向の相対的な位置関係が常に同じである従来の反射鏡回転型の蛍光イメージング装置を用いて得られた複数の観察方向からの画像を模擬的に示したものである。

図１８の５つの画像を見れば、ファントム２４には蛍光剤が２箇所あることが推測され、単方向照射・単方向観察で生じるような見落としは生じないことがわかる。この方法では、観察方向に常に近い方向から励起光を照射して撮像するため、どの観察方向から撮像した画像でも可能な限り強い蛍光を検出することができる。したがって、場所が未知なる蛍光を確実に検出する視点に立てばこの反射鏡回転式でもよい。しかし、どの観察方向からも可能な限り強く蛍光を検出したいのであれば、図２に示したような多方向同時観察の装置を用いて全方向から同時に励起光を照射して撮像すれば同じ結果を得ることができる。さらには、生体を対象とした蛍光観察は基本的に微弱光観察であるため、ＣＣＤカメラのような蓄積型の二次元検出器を用いて１つの画像取得に時間をかけて行なっているため、反射鏡回転式の蛍光イメージング装置では全ての画像を取得するのに多大な時間を要し、多方向からの観察画像を同時に取得できる装置のほうが全画像の取得にかかる時間が短くてすむ。

また、例えば蛍光剤ｂからの蛍光が蛍光剤ａよりも強く検出される場合、蛍光剤ｂはａよりも高濃度であることを示しているのか、蛍光剤ａよりも浅い位置にあることを示しているのかについて確認するための情報を得ることができない。この反射鏡回転式では、常に照射方向と観察方向との相対的な位置関係が固定されているため、同一観察方向で異なる方向から励起光を照射したときの画像を取得することはできないためである。

また、蛍光剤が生体試料の中央付近に存在する場合、検出される蛍光強度の照射方向への依存性及び観察方向への依存性が極端に低下する上、その強度は生体内部の吸収を受けて極めて弱くなる。この場合、照射方向が観察と同じ側から照射すると、生体試料の表面で発生する自家蛍光強度も強く観察されるため、自家蛍光のバックグランドに埋まってしまう可能性が高くなる。これに対して、多方向照射・多方向観察では照射方向から生体試料を挟んで反対側で観察することができるため、比較的自家蛍光の影響を受けにくい測定ができる。

以上、本発明の蛍光イメージング装置の実施例について説明したが、当該蛍光イメージング装置の機能について以下にまとめておく。

撮像条件を任意に設定可能であることにより、次のことが可能である。
（１）事前の測定等によって測定部位（蛍光剤）の位置が予めわかっており、その測定部位の経時的変化を連続的に測定するといった場合には、最も強く蛍光を検出することができる条件、すなわち、測定部位に近い方向からの観察方向及び照射方向を設定して撮像を行なう。
（２）場所が未知である測定部位を見落とすことなく確実に検出するために、全方向から励起光を照射した状態で全方向からの観察画像を撮像する。
（３）場所が未知である測定部位の深さ方向の情報を取得するために、照射方向と観察方向の全ての組合わせについて撮像する。

さらに、画像表示部１２に並列表示する画像を設定可能であることにより、以下のような目的に応じた並列表示が可能である。
（１）場所が未知な測定部位（蛍光）を確認するために、励起光の照射方向と観察方向が近い画像を並列表示する。
（２）着目した蛍光に関する深さ情報を得るために、同一観察方向で異なる照射方向の観察画像を並列表示する。
（３）生体試料の深い位置にある蛍光を確認するために、自家蛍光によるバックグランドが少ない条件、すなわち、励起光照射方向と反対側からの観察画像を並列表示する。

ところで、蛍光イメージング装置を用いた蛍光測定では、蛍光励起光源の選択波長や観察波長帯の光学フィルタ（蛍光フィルタ）を選択することが一般的である。以上において説明した実施例では、撮像条件及び表示画像条件として観察方向と励起光照射方向の２つの要素の組合わせを設定するようになっているが、励起光の波長や蛍光フィルタの透過波長帯域も撮像条件及び表示画像条件の選択要素として追加してもよい。

蛍光イメージング装置の一実施例を概略的に示すブロック図である。 同実施例の構成を具体的に示す構成図である。 １回の撮像動作で撮像される生体試料の画像の一例を示す画像である。 蛍光観察画像の一例であり、（Ａ）は１回の撮像動作で同時に撮像された５方向からの蛍光観察画像であり、（Ｂ）はその蛍光観察画像の好ましい配置例である。 画像表示部の画面表示の一例を示す図である。 画像表示部の画面表示の他の例を示す図である。 蛍光イメージング装置の撮像動作の一例を説明するためのフローチャート図である。 蛍光イメージング装置の画面表示動作の一例を説明するためのフローチャート図である。 撮像条件の設定方法の一例を説明するためのフローチャート図である。 表示画像の設定方法の一例を説明するためのフローチャート図である。 蛍光画像の測定実験で用いたファントムを示す図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）は正面図、（Ｃ）は側面図である。 励起光を３６°の方向から照射した状態でファントムを５方向から同時に撮像した画像である。 励起光を１０８°の方向から照射した状態でファントムを５方向から同時に撮像した画像である。 励起光を１８０°の方向から照射した状態でファントムを５方向から同時に撮像した画像である。 励起光を２５２°の方向から照射した状態でファントムを５方向から同時に撮像した画像である。 励起光を３２４°の方向から照射した状態でファントムを５方向から同時に撮像した画像である。 図１２〜図１６の画像から同じ観察方向の画像を励起光照射方向順に並べた画像であり、（Ａ）は観察方向が０°、（Ｂ）は観察方向が２８８°の画像である。 図１２〜図１６の画像から観察方向と励起光照射方向との相対的な角度差が３６°である画像のみを並べた画像である。

符号の説明

２ 撮像部
３ 試料台
４ 生体試料
６ 光源装置
８ 制御部
９ 演算処理部
１０ 画像記憶部
１２ 画像表示部
１４ 撮像条件設定部
１６ 表示画像設定部
１８ 二次元検出器
２０ 主結像レンズ
２２ 蛍光フィルタ
Ｌ０〜Ｌ４ 補助結像レンズ
Ｍ１〜Ｍ４ 反射鏡
Ｓ１〜Ｓ５ 光源
２４ ファントム

Claims (4)

1. 生体試料が載置される試料台と、
   二次元検出器及び前記二次元検出器に前記試料台上の生体試料の複数の異なる方向からの観察画像の光を導くための撮像光学系を含む撮像部と、
   前記二次元検出器からみた方向が互いに異なる２以上の方向から、前記試料台上の生体試料を励起して蛍光を発生させる励起光を選択的に照射できる光源装置と、
   前記励起光を遮蔽して生体試料からの蛍光を前記二次元検出器に導く蛍光フィルタと、
   前記撮像部による撮像の観察方向及び前記光源装置の励起光の照射方向からなる撮像条件を設定するための撮像条件設定部と、
   前記撮像条件設定部で設定された撮像条件での観察画像を前記撮像部で撮像するように、前記光源装置及び撮像部を制御する撮像制御部と、
   前記撮像部で撮像した画像を記憶する画像記憶部と、
   前記画像記憶部に記憶されている複数の画像のうち少なくとも一部を表示する画像表示部と、を備え、
   前記撮像光学系は、前記試料台上の生体試料の周囲の互いに異なる複数の位置に設けられ、各方向からの観察画像の光を同時に前記二次元検出器に導く複数の反射鏡と、前記複数の反射鏡によって導かれた画像の光を前記二次元検出器上に結像させる結像レンズを備えており、
   前記撮像条件設定部で前記光源装置の励起光の照射方向のみを設定する蛍光イメージング装置。
2. 前記画像表示部に並列表示させる画像を前記画像記憶部に記憶されている画像の中から設定するための表示画像設定部と、をさらに備え、
   前記画像表示部は、前記画像記憶部に記憶されている画像のうち前記表示画像設定部で設定された画像を並列表示する機能を備えている請求項１に記載の蛍光イメージング装置。
3. 前記撮像光学系には、前記反射鏡により前記二次元検出器上に導かれる各画像の光の光路長差に基づく画像の大きさを補正する補助結像レンズが設けられている請求項１に記載の蛍光イメージング装置。
4. 前記光源装置は生体試料の外形像を撮像するための照明用光源を備え、
   生体試料の外形像の撮像時は、生体試料に対して前記照明用光源から照明光が照射され、前記蛍光フィルタが生体試料からの画像の光の光路から外れた状態で前記撮像部による撮像が行なわれる請求項１から３のいずれか一項に記載の蛍光イメージング装置。