JP5236597B2 - フラビウイルス感染症の予防のための核酸ワクチン - Google Patents
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Description
本発明は、フラビウイルスによって引き起こされる疾患の治療および予防の双方において用いられる新規ワクチン、診断薬および方法に関する。特に、ワクチンは、日本脳炎ウイルス(JEV)、西ナイルウイルス(WNV)、または関連フラビウイルスのようなフラビウイルスの構造蛋白質の遺伝子を含む組み換え型核酸である。これらのワクチンは、インビボで投与した場合にウイルス蛋白質抗原を生合成するための転写単位として作用する。診断薬は、フラビウイルス感染症を検出するために用いることができる組み換え型核酸から作製した抗原を含む組成物である。
フラビウイルスは、フラビウイルス科に分類されるフラビウイルス属のメンバーである。フラビウイルスは、ヒトおよび他の哺乳類に対して主として病原性である。ヒトおよび動物に疾患を引き起こすフラビウイルスには、アルフュイ(Alfuy)、アポイ(Apoi)、アロア(Aroa)、バガザ(Bagaza)、バンジ(Banzi)、バツ洞(BatuCave)、ブブイ(Bouboui)、ブカラサコウモリ(Bukalasa bat)、ブスクアラ(Bussuquara)、カシパコア(Cacipacore)、カーリー島(CareyIsland)、カウボーンリッジ(Cowbone Ridge)、ダカールコウモリ(Dakar bat)、デング(Dengue)(血清型1、2、3および4)、エッジヒル(EdgeHill)、エンテベコウモリ(Entebbe bat)、ガジェッツガリー(Gadgets Gully)、イグアペ(Iguape)、イルヘウス(Ilheus)、イスラエル七面鳥髄膜脳炎(Israelturkey meningoencephalitis)、日本脳炎(Japanese encephalitis)、ジュグラ(Jugra)、ジュチアパ(Jutiapa)、カダム(Kadam)、Karshi(カーシ)、ケドーゴー(Kedougou)、ココベラ(Kokobera)、コウタンゴ(Koutango)、クンジン(Kunjin)、キャサヌール森林病(KyasanurForest disease)、ランガト(Langat)、メアバン(Meaban)、モドック(Modoc)、モンタナ筋炎白質脳炎(Montana myotisleukoencephalitis)、マリーバレー脳炎(Murray Valley encephalitis)、ナランジャル(Naranjal)、ネギシ(Negishi)、ウンタヤ(Ntaya)、オムスク出血熱(Omskhemorrhagic fever)、プノンペンコウモリ(Phnom Penh bat)、ポチスクム(Potiskum)、ポワッサン(Powassan)、リオブラボー(RioBravo)、ロシオ(Rocio)、ロイヤルファーム(Royal Farm)、ロシア春夏脳炎(Russian spring summerencephalitis)、サボヤ(Saboya)、サルビエジャ(Sal Vieja)、サンパーリタ(San Perlita)、サウマレツリーフ(SaumarezReef)、セピク(Sepik)、ソクルク(Skuluk)、スポンドウェニ(Spondweni)、セントルイス脳炎(St. Louisencephalitis)、ストラトフォード(Stratford)、ダニ媒介脳炎-中欧サブタイプ(Tick-borne encephalitis -Central European subtype)、ダニ媒介脳炎-極東サブタイプ(Tick-borne encephalitis - far easternsubtype)、テンブス(Tembusu)、THCAr、チュレニイ(Tyuleniy)、ウガンダS(Uganda S)、ウスツ(Usutu)、西ナイル(WestNile)、ヤウンデ(Yaounde)、黄熱病(Yellow fever)、ヨコセ(Yokose)、ジキ(Ziki)、細胞融合物質およびKunoら(J.Virol. 72:73〜83(1998))に記載される他の関連フラビウイルスが含まれる。
本発明は、免疫原性フラビウイルス抗原の転写単位(TU)を含む核酸分子を提供する。TUは、細胞内に取り込まれた後、宿主細胞に抗原を合成するように指示する。本発明の重要な局面において、フラビウイルスは、黄熱病ウイルス(YFV)、デング血清型1型ウイルス(DEN-1)、デング血清型2型ウイルス(DEN-2)、デング血清型3型ウイルス(DEN-3)、デング血清型4型ウイルス(DEN-4)、セントルイス脳炎ウイルス(SLEV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、西ナイルウイルス(WNV)、ポワッサンウイルスまたは他の如何なるフラビウイルスとなりうる。本発明の重要な態様において、抗原はフラビウイルスprM/M蛋白質、E蛋白質、またはその双方となりうる。本発明の重要な態様において、抗原はキメラフラビウイルス蛋白質となりうる。特に、TUがprM/MとE蛋白質の双方を含む場合、宿主細胞は、prM/MとE抗原とを含むサブウイルス粒子を分泌する。本発明のさらに重要な局面において、核酸はDNA分子である。さらに重要な態様において、核酸TUは、それがprM/MおよびE抗原の発現を機能的に制御するように適当に配置された制御配列を含み、この制御配列は、サイトメガロウイルス前初期プロモーターとなりうる。さらなる態様において、TUのヌクレオチド配列は、TUによって産生されたmRNAの5'末端非翻訳領域における大きいヘアピン構造を模倣することによって、および/またはTUによって産生されたmRNAの翻訳開始部位にコザックコンセンサス配列を含めることによって、真核細胞での翻訳を最適にするように操作される。さらなる態様において、転写単位にはまたポリ-Aターミネーターも含まれる。
本発明の好ましい実施形態によれば、以下の核酸などが提供される:
(項目1)
第一のフラビウイルスの構造蛋白質のシグナル配列、および第二のフラビウイルスの免疫原性フラビウイルス抗原をコードする転写単位を含み、ここで転写単位は抗原の合成を指示する、単離された核酸。
(項目2)
シグナル配列が日本脳炎ウイルスのシグナル配列である、項目1記載の核酸。
(項目3)
免疫原性フラビウイルス抗原が、黄熱病ウイルス、デング血清型1型ウイルス、デング血清型2型ウイルス、デング血清型3型ウイルス、デング血清型4型ウイルス、日本脳炎ウイルス、ポワッサンウイルス、および西ナイルウイルスからなる群より選択されるフラビウイルスの抗原である、項目1記載の核酸。
(項目4)
転写単位が、日本脳炎ウイルスのシグナル配列、ならびに西ナイルウイルスのM蛋白質およびE蛋白質とをコードする、項目1記載の核酸。
(項目5)
転写単位が、日本脳炎ウイルスのシグナル配列、ならびに黄熱病ウイルスのM蛋白質およびE蛋白質をコードする、項目1記載の核酸。
(項目6)
転写単位が、日本脳炎ウイルスのシグナル配列、ならびにセントルイス脳炎ウイルスのM蛋白質およびE蛋白質をコードする、項目1記載の核酸。
(項目7)
転写単位が、日本脳炎ウイルスのシグナル配列、ならびにポワッサンウイルスのM蛋白質およびE蛋白質をコードする、項目1記載の核酸。
(項目8)
抗原が、フラビウイルスのM蛋白質、フラビウイルスのE蛋白質、フラビウイルスのM蛋白質およびE蛋白質の双方、フラビウイルスのM蛋白質の一部、フラビウイルスのE蛋白質の一部、ならびにフラビウイルスのM蛋白質の一部およびフラビウイルスのE蛋白質の一部の双方、またはその任意の組み合わせからなる群より選択される、項目1記載の核酸。
(項目9)
抗原が、フラビウイルスのM蛋白質およびE蛋白質の双方である、項目8記載の核酸。
(項目10)
核酸がDNAである、項目1記載の核酸。
(項目11)
配列番号:15、配列番号:19、配列番号:21、および配列番号:23からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、項目10記載の核酸。
(項目12)
転写単位が、抗原の合成を機能的に制御するように適切に配置された制御配列を含む、項目1記載の核酸。
(項目13)
制御配列がサイトメガロウイルス前初期プロモーターである、項目12記載の核酸。
(項目14)
TUによってコードされる抗原を含むポリペプチドの翻訳開始部位に存在するコザックコンセンサス配列を含む、項目1記載の核酸。
(項目15)
転写単位が、ポリ-Aターミネーターを含む、項目1記載の核酸。
(項目16)
項目1記載の核酸を含む細胞。
(項目17)
項目1記載の核酸および薬学的に許容される担体を含む組成物。
(項目18)
項目17記載の組成物の有効量を被験者に投与する段階を含む、フラビウイルスによる感染症に対して被験者を免疫する方法。
(項目19)
フラビウイルス抗原が、黄熱病ウイルス、デング血清型1型ウイルス、デング血清型2型ウイルス、デング血清型3型ウイルス、デング血清型4型ウイルス、日本脳炎ウイルス、ポワッサンウイルス、および西ナイルウイルスからなる群より選択されるフラビウイルスの抗原である、項目18記載の方法。
(項目20)
抗原がフラビウイルスのM蛋白質、フラビウイルスのE蛋白質、フラビウイルスのM蛋白質およびE蛋白質の双方、フラビウイルスのM蛋白質の一部、フラビウイルスのE蛋白質の一部、ならびにフラビウイルスのM蛋白質の一部およびフラビウイルスのE蛋白質の一部の双方、またはその任意の組み合わせからなる群より選択される、項目18記載の方法。
(項目21)
抗原がフラビウイルスのM蛋白質およびE蛋白質の双方であって、被験者の体内の細胞が、その中に核酸を組み入れた後、M蛋白質およびE蛋白質を含むサブウイルス粒子を分泌する、項目20記載の方法。
(項目22)
転写単位が、日本脳炎ウイルスのシグナル配列、ならびに西ナイルウイルスのM蛋白質およびE蛋白質をコードする、項目18記載の方法。
(項目23)
転写単位が、日本脳炎ウイルスのシグナル配列、ならびに黄熱病ウイルスのM蛋白質およびE蛋白質をコードする、項目18記載の方法。
(項目24)
転写単位が、日本脳炎ウイルスのシグナル配列、ならびにセントルイス脳炎ウイルスのM蛋白質およびE蛋白質をコードする、項目18記載の方法。
(項目25)
転写単位が、日本脳炎ウイルスのシグナル配列、ならびにポワッサンウイルスのM蛋白質およびE蛋白質をコードする、項目18記載の方法。
(項目26)
被験者に組成物の1回量を投与する段階を含む、項目18記載の方法。
(項目27)
組成物が非経口経路によって投与される、項目18記載の方法。
(項目28)
抗原がセントルイス脳炎ウイルス抗原である、項目1記載の核酸。
(項目29)
抗原がセントルイス脳炎ウイルス抗原である、項目18記載の方法。
(項目30)
抗原が日本脳炎ウイルス抗原である、項目1記載の核酸。
(項目31)
抗原が日本脳炎ウイルス抗原である、項目18記載の方法。
(項目32)
抗原が黄熱病ウイルス抗原である、項目1記載の核酸。
(項目33)
抗原が黄熱病ウイルス抗原である、項目18記載の方法。
(項目34)
抗原がデングウイルス抗原である、項目1記載の核酸。
(項目35)
抗原がデングウイルス抗原である、項目18記載の方法。
(項目36)
抗原が西ナイルウイルス抗原である、項目1記載の核酸。
(項目37)
抗原が西ナイルウイルス抗原である、項目18記載の方法。
(項目38)
項目1記載の核酸から産生された抗原。
(項目39)
以下を含む、試料におけるフラビウイルス抗体を検出する方法:
(a)抗原/抗体複合体が形成されうる条件下で、項目38記載の抗原に試料を接触させる段階;および
(b)抗原/抗体複合体形成を検出して、それによって試料中のフラビウイルス抗体を検出する段階。
(項目40)
項目38記載の抗原による免疫化に反応して産生された抗体。
(項目41)
以下を含む、試料におけるフラビウイルス抗原を検出する方法:
(a)抗原/抗体複合体が形成しうる条件下で、項目40記載の抗体に試料を接触させる段階;および
(b)抗原/抗体複合体形成を検出して、それによって試料中のフラビウイルス抗原を検出する段階。
(項目42)
以下を含む、被験者におけるフラビウイルス感染を診断する方法:
(a)抗原/抗体複合体が形成されうる条件下で、項目38記載の抗原に被験者からの試料を接触させる段階;および
(b)抗原/抗体複合体形成を検出して、それによって被験者におけるフラビウイルス感染を診断する段階。
(項目43)
以下を含む、被験者におけるフラビウイルス感染を診断する方法:
(a)抗原/抗体複合体が形成されうる条件下で、項目40記載の抗体に被験者からの試料を接触させる段階;および
(b)抗原/抗体複合体形成を検出して、それによって被験者におけるフラビウイルス感染症を診断する段階。
本発明は、prM/MおよびE蛋白質抗原のようなフラビウイルス抗原性蛋白質をコードする核酸転写単位を含む。核酸は、特に細胞が被験者の細胞である場合、核酸が適当な細胞に取り込まれると、prM/MおよびE蛋白質抗原を発現するように機能する。本発明はまた、その活性物質が核酸転写単位(TU)であるワクチンを含む。本発明はさらに、TUを含む細胞を含む。本発明はさらに、核酸TU分子を含むワクチンの有効量を被験者に投与することによって、フラビウイルス感染症に対して被験者を免疫する方法を含む。
本発明の核酸TU分子の調製および発現に関連して分子生物学および組み換え型DNA技術を利用する一般的方法は、例えば、「Current Protocols inMolecular Biology」、Ausubelら、John Wiley and Sons、New York 1987(四半期ごとに更新)、および「MolecularCloning:A Laboratory Manual」、第二版、Sambrook、Fritsch and Maniatis、Cold SpringHarbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY、1989に記載される。
ゲノムRNAを、QIAamp(商標)ウイルスRNAキット(Qiagen、Santa Clarita、CA)を用いて、マウス脳から増殖させたJEV株SA14ウイルスシード150μlから抽出した。シリカ膜上に吸着させたRNAをヌクレアーゼ不含水80μl中で溶出して、JEVprMおよびE遺伝子コード配列を増幅するための鋳型として用いた。プライマー配列は、Nitayaphanら(Virology 177:541〜552(1990))の研究から得られた。ゲノムヌクレオチド領域389〜2478位を含む単一のcDNA断片を、逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって増幅した。制限部位KpnIおよびXbaI、コンセンサスコザックリボソーム結合配列、ならびに翻訳開始部位を、アンプリマー(amplimer)14DV389(ヌクレオチド配列、配列番号:1;アミノ酸配列、配列番号:2)によってcDNAの5'末端で作成(engineer)した。インフレーム翻訳終了コドンの後にNotI制限部位を、アンプリマーc14DV2453(配列番号:3)によってcDNAの3'末端に導入した(図2)。TitanRT-PCRキット(Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN)を用いて1試験管RT-PCRを行った。ウイルスRNA 10μlを14DV389(50μM)およびc14DV2453(50μM)各1μl、ならびにヌクレアーゼ不含水18μlと混合して、混合物を85℃で5分間加熱した後、4℃に冷却した。反応ミックス[5×緩衝液20μl、dNTP混合物2μl(各10mM)、ジチオスレイトール(0.1 mM)5μl、RNasin(商標)(40 U/μl、ベーリンガーマンハイム社)0.5μl、ポリメラーゼ混合物2μl、およびヌクレアーゼ不含水45.5μl]75μlを加えて、RT-PCRを以下のように行った:1サイクル(50℃で30分、94℃で3分、50℃で30秒、68℃で2.5分)、9サイクル(94℃で30秒、50℃で30秒、68℃で2.5分)、20サイクル(最初のサイクルは94℃で30秒、50℃で30秒、68℃で2.5分、その後1サイクルごとに5秒ずつ増加)、および68℃で15分間の最終伸長。RT-PCR産物は、QIAquick(商標)PCR精製キット(Qiagen)によって精製して、50μlの1mMトリス塩酸、pH 7.5によって溶出した。
様々な組み換え型発現プラスミドによるJEV特異的遺伝子産物の発現を、COS-1、COS-7、およびSV-T2(ATCC、ロックビル、メリーランド州;それぞれ、1650-CRL、1651-CRL、および163.1-CCL)の一過性にトランスフェクトした細胞株において、間接的免疫蛍光抗体アッセイ(IFA)によって評価した。SV-T2細胞株は、予備的な結果から、JEV抗原陽性であった細胞が形質転換したSV-T2細胞の1〜2%に過ぎないことが示されたことから、以降の試験から除外した。形質転換を行うために、細胞を150cm2培養フラスコにおいて75%コンフルエンスまで増殖させ、トリプシン処理を行って、4℃の燐酸緩衝生理食塩液に最終細胞数5×106個/mlとなるように再懸濁させた。150V、960μF、および100Ω抵抗に設定したBioRadジーンパルス(商標)(Bio-Rad)を用いて、プラスミドDNA 10μgを細胞浮遊液300μlに電気穿孔した。電気穿孔の5分後、細胞を新鮮な培地25mlによって希釈して、75 cm2フラスコに播種した。形質転換の48時間後、培地を細胞から除去して、細胞にトリプシン処理を行い、3%正常ヤギ血清を含むPBS5 mlに再懸濁させた。少量10μlをスライドガラス上にスポットし、風乾させ、アセトン中で−20℃で20分間固定した。IFAは、フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウス免疫グロブリンG(SigmaChemical Co.)およびJEV HIAFを用いて、アセトン固定プラスミド形質転換細胞について行った。
COS-1細胞を、先の実施例に記載した電気穿孔によってpCDJE2-7 DNA 10μgによって形質転換した。非選択的な培養培地において24時間インキュベートした後、細胞をネオマイシン(0.5mg/ml、シグマケミカル社)によって処置した。2〜3週間で目に見えるようになるネオマイシン抵抗性コロニーを、ネオマイシン含有培地において限界希釈法によってクローニングした。ベクターがコードするJEV遺伝子産物の発現は、JEVHIAFを用いたIFAによって最初にスクリーニングした。JEV-IFA陽性クローン(JE-4B)1個、および陰性クローン(JE-5A)1個をさらなる分析のために選択して、200μg/mlネオマイシンを含む培地において維持した。
a.サブウイルス粒子の調製。 JE-4B COS-1細胞は、200μg/mlネオマイシンを含む培地において増殖および維持した。培養培地は通常通り採取して4℃で保存して、週2回新鮮な培地に交換して、細胞を7日〜10日ごとに1:5に分割して継代した。培養培地をSorvallF16/250ローターにおいて4℃、10,000 rpmで30分間遠心することによって透明にし、Sorvall TH641ローターにおいて5%ショ糖クッション(w/w、10mMトリス塩酸、pH 7.5、100 mM NaCl(TN緩衝液)によって調製)の中を4℃、39,000 rpmでさらに4時間遠心した。サブウイルス粒子を含む沈降物をTN緩衝液に再懸濁させて、4℃で保存した。または、7%もしくは10%PEG-8000(w/v)を透明にした培養培地に加えた。混合物を4℃で少なくとも2時間攪拌して、沈殿した粒子を10,000rpmで30分間遠心することによって回収した。沈殿物をTN緩衝液に再懸濁させて、4℃で保存した。サブウイルス粒子を、5%〜25%連続ショ糖勾配のTN溶液において4℃、38,000rpmで90分間の速度ゾーン遠心によって、沈降した調整物およびPEG沈殿した調製物の双方から精製した。1 ml分画を勾配の上部から回収して、抗原捕獲ELISA(下記参照)によって調べ、陽性分画を25%〜50%ショ糖勾配のTN溶液にローディングした。これを、4℃、35,000rpmでの平衡密度遠心において一晩遠心した。平衡勾配からの0.9 ml分画を底から回収した。それらを抗原捕獲ELISAによって調べ、pH 6.6でのヘムアグルチニン(HA)活性に関して評価した。各分画の100μlのアリコートの重量を正確に測定して、その密度を測定した。ELISA陽性分画をプールして、4℃、39,000rpmで3〜4時間遠心して沈降させ、沈降物をTN緩衝液に再懸濁させた。沈降させた試料に関して抗原捕獲ELISAおよびHA力価を測定した。JEV感染COS-1細胞上清にも同様に、先に詳細に記述したように類似の精製プロトコールを行い、勾配分析のための陽性対照として用いた。JEビリオンも同様に、感染後5日〜6日の感染C6/36細胞から、グリセロール/酒石酸塩平衡勾配における沈降によって精製した。
3週齢の雌性ICR非近交系マウス1群5匹に、左四頭筋および右四頭筋にpCDJE2-7プラスミド100μgのdH2O溶液100μlを筋肉内注射するか、またはヒトに投与する用量の5分の1であるJE-VAX用量(製造は、大阪大学微生物病研究会、および販売は、ConnaughtLaboratories、Swiftwater、PA)を皮下投与した。無関係な蛋白質をコードして発現するプラスミドpCDNA3/CAT(インビトロジェン社)を陰性ワクチン接種対照として用いた。pCDJE2-7ワクチン接種マウス1群を除き、動物は全て、さらなる用量のプラスミドまたはJE-VAXによって3週間後に追加免疫した。接種後3週、6週、9週、23週、40週、および60週間目にマウスの眼窩後洞から採血した。JEV抗体力価は、精製JEVに対する酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)によって、またはプラーク減少中和試験(PRNT)(Roehrigら、Virol,171:49〜60(1989);およびHuntおよびCalisher、Amer. J. Trop. Hyg. 28:740〜749(1979))によって決定した。
類似のレベルのJEV蛋白質が、pCDJE2-7、pCBJE1-14、またはpCIBJES14によって形質転換したCOS-1細胞によって発現された。これらの核酸構築物によるJEV抗体誘導を、ワクチン接種時に二つの異なる齢で、JE-VAX市販ワクチンと比較した。1群10匹の3日齢(性別混合)または3週齢(雌性)ICR非近交系マウスに、プラスミドDNA50μgもしくは100μgを筋肉内にワクチン接種するか、またはヒトに投与する用量の10分の1または5分の1であるJE VAX用量を皮下にワクチン接種した。血清標本を免疫後3週間および7週間で採取して、精製JEVを抗原として用いたELISAによって1600倍希釈で試験した。結果を表4に示す。
実施例6からの3日齢ワクチン接種群に、ワクチン接種後7週目にマウス適合JEV株SA14 50,000 pfu/100μlを腹腔内注射によってチャレンジして、3週間観察した。様々な核酸TU含有ワクチン構築物を接種した群では100%の保護が21日間得られた(表5)。対照的に、JE-VAXワクチン接種マウスの60%、ならびにpCDNA3/CATワクチン接種陰性対照の70%が、ウイルスチャレンジから21日まで生き残ることができなかった。これらの結果は、本発明の核酸TUは、ワクチン接種マウスに対して予想外に有効な保護を与えることを示している。これは、ヒト用の初期幼少期ワクチンとして本発明の核酸ワクチンを用いる可能性を示唆している。対照的に、現在用いられている不活化ヒトワクチンJE-VAXは、若い動物において有効ではないように思われる。
3週齢の雌性ICRマウスに、pCDJE2-7プラスミドDNAを100μg/100μlの1用量もしくは2日間あけて2用量、またはヒトに投与する用量の5分の1であるJEVAX 2用量をワクチン接種した。陰性対照群には、pCDNA-3/CATプラスミド100μg/100μlの2用量を投与した。母体抗体による受動的保護は、第一のワクチン接種後9週目または第二のワクチン接種後6週目に、実験の雌性マウスを非免疫雄性マウスと交配させることによって得られた仔において評価した。生後3日〜15日の間の仔を、マウス適合SA14ウイルス5,000pfu/100μlの腹腔内投与によってチャレンジして、3週間毎日観察した(表6)。生存率は、母体の中和抗体力価と相関した。PRNT 1:80の母親によって哺乳された仔の100%がウイルス感染から生き残ったのに対し、対照母親からの仔はいずれも生き残らなかった(表6)。PRNT力価がそれぞれ、1:20および1:40である母親によって哺乳されたより週齢の大きい仔では、45%および75%の部分的保護を認めた。生存率はまた、仔が免疫母親によって哺乳された期間にも相関した。まさに示しているように、13日〜15日齢の仔は高い生存率を示した。しかし、3〜4日齢の仔は、母親のPRNT力価が1:20、または1:40である場合にはウイルスチャレンジから生き残れなかった。このように、母親の抗体は、子孫に部分的ないし完全な保護免疫を提供する。さらに、ELISAによって、チャレンジ後の仔の97%(29/30)の血清中にJEV抗体が検出された。
ゲノムRNAを、QIAamp(商標)ウイルスRNAキット(Qiagen、Santa Clarita、CA)を用いて、1999年にニューヨークでの大流行から単離した株であるNY99-6480株に感染させたVero細胞培養培地150μlから抽出した。抽出したRNAを溶出させて、ヌクレアーゼ不含水80μlに浮遊させて、WNV prMおよびE遺伝子コード配列を増幅するための鋳型として用いた。プライマー配列は、Lanciottiら(Science286:2333〜2337(1999))の研究から得た。ゲノムヌクレオチド領域を含むcDNA断片を逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって増幅した。制限部位BsmBIおよびKasIを、アンプリマーWN466(ヌクレオチド配列、配列番号:12)を用いてcDNAの5'末端に作成(engineer)した。NotI制限部位が後に続くインフレーム翻訳終了コドンを、アンプリマーcWN2444(配列番号:13)を用いてcDNAの3'末端に導入した。RT-PCR産物は、QIAquick(商標)PCR精製キット(Qiagen)によって精製した。
pCBWNプラスミドによってコードされたWNV特異的遺伝子産物を、COS-1細胞において発現させた。Changら(J. Virol. 74:4244〜4252(2000))に従って細胞を電気穿孔して、pCBWNプラスミドによって形質転換した。電気穿孔した細胞を75cm2培養フラスコ、または滅菌カバーガラス1枚/ウェルを含む12ウェル組織培養皿に播種した。フラスコおよび12ウェルプレートは全て、37℃、5%CO2インキュベータで維持した。電気穿孔の40時間後、接着細胞を含むカバーガラスをウェルから取り出して、PBSによって簡単に洗浄して、室温でアセトンによって2分間固定し、空気乾燥させた。
3週齢の雌性ICRマウス1群10匹を試験に用いた。マウスにpCBWNまたは緑色蛍光蛋白質発現プラスミド(pEGFP)DNA(Clonetech、SanFrancisco、CA)の1回量を筋肉内注射した。pCBWNプラスミドDNAは、EndoFreeプラスミドギガキット(Qiagen)によってXL-1blue細胞から精製して、pH 7.5のPBSに濃度1.0μg/μlとなるように再懸濁させた。pEGFP 100μgを投与したマウスを非ワクチン接種対照として用いた。マウスに100μlの容量中100μg、10μg、1.0μg、または0.1μgの用量でpCBWNプラスミドを注射した。pCBWN10μg、1.0μg、または0.1μgを投与した群にEMC-830方形波電気穿孔装置(Genetronics、San Diego、CA)を用いて、エレクトロトランスファー媒介インビボ遺伝子輸送プロトコールによってワクチン接種した。エレクトロトランスファープロトコールは、Mirら(Proc.Natl. Acad. Sci. USA 96:4262〜4267(1999))の方法に基づいた。DNA注射の直後、脚のそれぞれの側に4.5mm〜5.5 mm離して配置した2本のステンレス鋼プレート電極によって、経皮電気パルスを適用した。脚の皮膚との電気的接触は、PBSによって脚を完全に湿らせることによって確実にした。パルス間の間隔200msecで、持続25 msecの40ボルト/mmのパルス4回2組を適用した。電極の極性は、エレクトロトランスファーの効率を増強するために、パルスの組の間で逆転させた。
pCDJE2-7組み換え型プラスミドの構築と類似の戦略を用いて、YFVおよびSLEV組み換え型プラスミドを調製した。ゲノムRNAを、QIAamp(商標)ウイルスRNAキット(Qiagen、SantaClarita、CA)を用いて、YFV株TRI-788379またはSLE株78V-6507ウイルスシード150μlから抽出した。ウイルスRNAは、YFVまたはSLEVprMおよびE遺伝子コード領域を増幅するための鋳型として用いた。プライマーYFDV389(ヌクレオチド配列、配列番号:4;アミノ酸配列、配列番号:5)、cYFDV2452(配列番号:6)、SLEDV410(ヌクレオチド配列、配列番号:7;アミノ酸配列、配列番号:8)、およびcSLEDV2449(配列番号:9)を用いて、JEVおよびWNV組み換え型プラスミドの調製のために、上記のように対応する組み換え型核酸を作製した。KpnIおよびNotI酵素によって消化したRT-PCR増幅cDNAを、真核細胞発現プラスミドベクターpCDNA3(Invitrogen)のKpnI-NotI部位に挿入した。cDNAの双方の鎖をシークエンシングして、YFV株TRI-788379またはSLEV株78V-6507からの配列に対する同一性を確認した。YFVまたはSLEVのprMおよびEコード領域のヌクレオチド配列をそれぞれ含む、組み換え型プラスミドpCDYF2およびpCDSLE4-3は、EndoFree(商標)プラスミドマキシキット(Qiagen)を用いて精製し、インビトロ形質転換またはマウス免疫に用いた。
QIAamp(商標)ウイルスRNAキット(Qiagen、Santa Clarita、CA)を用いて、セントルイス脳炎ウイルスのMSI-7株に感染させた、Vero細胞培養培地150μlからゲノムRNAを抽出した。抽出したRNAを溶出して、ヌクレアーゼ不含水80μlに懸濁させ、セントルイス脳炎ウイルスprMおよびE遺伝子コード配列を増幅するための鋳型として用いた。プライマー配列は、Trentら(Virology156:293〜304(1987))の研究から得た。ゲノムヌクレオチド領域を含むcDNA断片は、逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって増幅した。制限部位AfeIを、アンプリマーSLE463(配列番号:30)を用いることによってcDNAの5'末端に作成(engineer)した。NotI制限部位が後に続くインフレーム翻訳終了コドンを、アンプリマーcSLE2447(配列番号:31)を用いてcDNAの3'末端に導入した。RT-PCR産物は、QIAquick(商標)PCR精製キット(Qiagen)によって精製した。
QIAamp(商標)ウイルスRNAキット(Qiagen、Santa Clarita、CA)を用いて、黄熱病ウイルスの17D-213株に感染させたVero細胞培養培地150μlからゲノムRNAを抽出した。抽出したRNAを溶出して、ヌクレアーゼ不含水80μlに懸濁させ、黄熱病ウイルスprMおよびE遺伝子コード配列を増幅するための鋳型として用いた。プライマー配列は、dosSantosら(Virus Research 35:35〜41(1995))の研究から得た。ゲノムヌクレオチド領域を含むcDNA断片を、逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって増幅した。制限部位AfeIは、アンプリマーYF482(配列番号:28)を用いてcDNAの5'末端に作成(engineer)した。後にNotI制限部位が続くインフレーム翻訳終了コドンを、アンプリマーcYF2433(配列番号:29)を用いてcDNAの3'末端に導入した。RT-PCR産物はQIAquick(商標)PCR精製キット(Qiagen)によって精製した。
QIAamp(商標)ウイルスRNAキット(Qiagen、Santa Clarita、CA)を用いて、ポワッサンウイルスのLB株に感染させたVero細胞培養培地150μlから、ゲノムRNAを抽出した。抽出したRNAを溶出して、ヌクレアーゼ不含水80μlに懸濁させ、ポワッサンウイルスprMおよびE遺伝子コード配列を増幅するための鋳型として用いた。プライマー配列は、Mandlら(Virology194:173〜184(1993))の研究から得た。ゲノムヌクレオチド領域を含むcDNA断片を、逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって増幅した。制限部位AfeIは、アンプリマーPOW454(配列番号:25)を用いてcDNAの5'末端に作成(engineer)した。NotI制限部位が後に続くインフレーム翻訳終了コドンを、アンプリマーcPOW2417(配列番号:26)を用いてcDNAの3'末端に導入した。RT-PCR産物はQIAquick(商標)PCR精製キット(Qiagen)によって精製した。
他のフラビウイルスに関して行ったような技法(実施例1、9、および12〜15を参照のこと)に従って、デング血清型2型抗原の核酸TUを含むベクターを調製する。実施例に従って、ベクターを構築するために用いられるアンプリマーは、正常なデングウイルスシグナル配列を操作するために選択してもよく、または改変された日本脳炎ウイルスシグナル配列のような、他のフラビウイルスからのシグナル配列を操作するために選択してもよい。
実施例16において調製した、prMからEまでの遺伝子領域をコードするデング血清型2型核酸TUワクチンを、注射用水または緩衝生理食塩液のような適した薬学的担体に懸濁させ、離乳期のマウス群に筋肉内注射する。対照群には、デング血清型2型特異的遺伝子を欠損する同等のプラスミド調製物を注射する。デング血清型2型特異的抗体および/またはデング血清型2型特異的免疫系細胞障害細胞の産生を、その後一定の間隔で、例えば毎週の間隔で評価する。核酸TUワクチンを投与した約2ヶ月〜4ヶ月後、マウスにデング血清型2型ウイルスをチャレンジする。ウイルス血症のレベルは、2日ごとなどのその後の適当な間隔で評価する。母体の抗体による受動的保護は、実施例8に示すように評価する。
シグナルペプチドは、挿入された蛋白質の転移および方向、したがってprMおよびE蛋白質の位相学(topology)を左右しうる。真核細胞のシグナルペプチドの最も一般的な特徴は、h-領域と呼ばれる疎水性アミノ酸の枝8個〜12個からなる(vonHeijne、「Signal sequences. The limits of variation」、J. Mol. Biol. 184:99〜105(1985))。n-領域として知られる開始メチオニンとh-領域との間の領域は、通常、アミノ酸1個〜5個を有し、通常、陽性荷電アミノ酸を有する。h-領域と切断部位との間はc-領域であり、これは3個〜7個の極性アミノ酸、しかしほとんどが非荷電のアミノ酸残基からなる。ウイルスポリ蛋白質合成の際、CおよびprM蛋白質の接合部での、潜在型から切断可能なコンフォメーションへのシグナラーゼ切断部位の調節は、ウイルスプロテアーゼ複合体NS2B/NS3によってC蛋白質が予め除去されていることに依存する(Lobigs、「Flaviviruspremembrane protein cleavage and spike heterodimer secretion require thefunction of the viral proteinase NS3」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6218〜6222(1993))。このように、prMおよびE蛋白質を発現プラスミドのみによって発現させる場合、ウイルスシグナル配列の有効性を検討することが重要である。
多数のフラビウイルスに対して免疫するように設計された、多価および/または複合ワクチンも同様に作製することができる。多価ワクチンの調製において、YF、異なる血清型のDEN、JE、WN、SLE、およびTBE(RSSEおよびCEE)ウイルス、またはフラビウイルスの他の任意の組み合わせのような、関係する病原体に関連した要素を含む一価ワクチン成分を調製する。他の実施例および本明細書において記述したDNA構築物の設計および作製は、記述通りに実施する。適当なワクチンの組み合わせは、多数の病原体に対して保護する多価または複合ワクチンを提供するように作製されうる。本発明者らのグループの予備的なデータは、pCBJE1-14およびpCBWNDNAの複合ワクチンの筋肉内注射によって、マウスにおいてJEウイルス、およびWNウイルス特異的Nt抗体が誘導されることを証明した(表8)。それぞれの一価の成分は、たとえ同一の転写および翻訳調節物質を用いて構築しても、好ましくは、そのワクチン能を確実にするために類似のモデル系において試験すべきである。その後、複合ワクチンカクテルを処方することができる。これらのワクチンカクテルは、特定の地理的地域に対して特異的に作製することができる。例えば、熱帯および亜熱帯アジアのためのワクチンカクテルは、DENの四つの血清型、WN、およびJEウイルスワクチンを含むべきである。アフリカおよび南アメリカのための同様に有用なワクチンカクテルはそれぞれ、DENの四つの血清型、WN、およびYFウイルスワクチン、ならびにDENの四つの血清型、Rocio、およびYFウイルスワクチンを含むべきである。
a.実施例の要約。 デング2型ウイルス(DEN-2)の前膜(prM)およびエンベロープ(E)蛋白質をコードする一連のプラスミドを構築した。これらのプラスミドには、配列番号:43によって記述される蛋白質をコードする真正のDEN-2prM-E構築物(pCBD2-14-6)(配列番号:42)、配列番号:45によって記述される蛋白質をコードする90%DEN-2E-10%日本脳炎(JE)ウイルスEキメラ構築物(pCB9D2-1J-4-3)(配列番号:44)、および配列番号:47によって記述される蛋白質をコードする80%DEN-2E-20%JE Eキメラ構築物(pCB8D2-2J-2-9-1)(配列番号:46)が含まれた。モノクローナル抗体(MAb)反応性は、三つ全てのプラスミドが、ドメイン1、2、および3の抗体のパネルと反応するE蛋白質エピトープを発現することを示した。しかし、pCB8D2-2J-2-9-1構築物(配列番号:46)のみが高レベルのprM(成熟prM)およびEを、プラスミド形質転換COS-1細胞の培地に分泌した。pCBD2-14-6プラスミド(配列番号:42)によって形質転換されたCOS-1細胞、およびpCB9D2-4-3プラスミド(配列番号:44)によって形質転換されたCOS-1細胞によって発現されたprMおよびE蛋白質の主要な部分は、膜に結合したままであった。DEN-2のE蛋白質をコードする配列の20%を対応するJEE蛋白質配列をコードする配列に置換しても、MAb反応性に影響を及ぼさなかった。
i.細胞培養およびウイルス株。 COS-1細胞(ATCC、Manassas、VA;1650-CRL)を、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS、HycloneLaboratories Inc.、Logan、UT)、1 mMピルビン酸ナトリウム、1 mM非必須アミノ酸、30 ml/L 7.5%NaHCO3、100単位/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル最小基本培地(DMEM、GIBCO、GrandIsland、NY)において5%CO2、37℃で増殖させた。VeroおよびC6/36細胞を、COS-1細胞に関して用いた条件と同じ条件で増殖させた。DEN-2ウイルス、株16681を、cDNAクローニング、IgGELISA、およびプラーク減少中和試験(PRNT)のために用いた。ウイルスは、C6/36細胞培養において増殖させた。免疫学的または生化学的研究のために用いられるウイルスは、7%ポリエチレングリコール(PEG-8000;FisherScientific、Fair Lawn、NJ)による沈殿の後、30%グリセロール-45%酒石酸カリウム勾配中で超遠心することによって精製した(Obijeskiら、「Segmentedgenome and nucleocapsid of La Crosse virus」、J. Virol. 20:664〜675(1976))。
i.DEN-2ウイルス組み換え型抗原の一過性の発現。 DEN-2ウイルスのprMおよびE遺伝子の発現、またはDEN-2およびJEウイルス配列の組み合わせ(80%DEN-20%JEまたは90%DEN-10%JE)からのキメラE遺伝子の発現は、三つの組み換え型DEN-2DNAプラスミドのそれぞれを、COS-1細胞に個別に形質転換することによって得た。基本のプラスミド設計は、プラスミド形質転換細胞が発現され、真正のウイルス蛋白質が細胞培養液に分泌される、JEウイルスおよびWNウイルスの組み換え型プラスミドによるこれまでの研究結果に基づいた(Changら、(「Asingle intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protectiveimmunity and prevents Japanese encephalitis in mice」、J. Virol. 74:4244〜4252(2000);Davisら、「WestNile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from viruschallenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that canbe used in enzyme-linked immunosorbent assays」、J. Virol. 75:4040〜4047(2001))。DEN-2組み換え型蛋白質の一過性の発現は当初、細胞培養上清の抗原捕獲ELISA、およびアセトン固定形質転換COS-1細胞のIFAによって評価した(Changら、(「Asingle intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protectiveimmunity and prevents Japanese encephalitis in mice」、J. Virol. 74:4244〜4252(2000))。最適な抗原発現点は、電気穿孔の48時間後であると決定された。
JEおよびWNワクチンに関して初期に用いた同じ段階を最初に用いて、真正DEN-2 prMおよびE遺伝子領域からなる組み換え型DEN-2プラスミド、pCBD2-14-6(配列番号:42)を構築した。MAbのパネルを用いて、IFAにより、このプラスミドによって形質転換したCOS-1細胞によって発現された、DEN-2蛋白質の抗原性マッピングを行ったところ、prMおよびE蛋白質が適合性の蛍光強度を示し、ウイルス感染細胞と類似のMAb反応性を有することが示された(表10)。しかし、真正DEN-2prMおよびE領域をコードするプラスミドによって形質転換したこれらのCOS-1細胞は、検出可能なDEN-2抗原を培養液に分泌することができなかった(抗原捕獲ELISAによって測定した場合)。さらに、真正のDEN-2prMおよびE領域をコードするプラスミドを用いてワクチン接種を行っても、筋肉内に免疫したマウスにおいて抗DEN-2ウイルス中和抗体を刺激することができなかった(表13)。興味深いことに、pCBD2-14-6による細胞の形質転換によって、穴の開いた球状の蛍光染色が得られ、これはDEN-2のE蛋白質のC-末端が、蛋白質の膜保持シグナルに関与する可能性があることを示唆している。このIFA染色パターンは、JEまたはWN構築物形質転換細胞のいずれにおいても認められなかった(Changら、(「Asingle intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protectiveimmunity and prevents Japanese encephalitis in mice」、J. Virol. 74:4244〜4252(2000);Davisら、「WestNile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from viruschallenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that canbe used in enzyme-linked immunosorbent assays」、J. Virol. 75:4040〜4047(2001))。したがって、本出願の教示に従ってなされた知見に照らして、DEN-2のC-末端の10%または20%を、それぞれJEウイルスE蛋白質の対応する領域に置換して、DNA配列の適当な操作を行った二つのさらなるプラスミド、pCB9D2-1J-4-3(配列番号:44)およびpCB8D2-2J-2-9-1(配列番号:46)を作製した。ワクチン接種マウスにおける検出可能な抗DEN-2ELISA抗体を刺激するための、異なる構築物の相対的な有効性を表13に示す。
移入された二つの細胞株における、様々な組み換え型プラスミドによるJE prMおよびE蛋白質の一過性の発現。
* 様々な細胞株をpCDNA3/CAT(陰性対照)、pCDJE2-7、pCBJE1-14、pC1BJES14、pCEJE、pREJE、またはpRCJEによって形質転換した。細胞を48時間後にトリプシン処理して、JEウイルス特異的HIAFによる間接的免疫蛍光抗体アッセイ(IFA)によって調べた。データは、IFA陽性細胞の強度(尺度1+〜4+)および割合として表記する。pCDNA3/CAT形質転換細胞を陰性対照として用いた。
JEウイルス反応抗体によるCOS-1細胞のpCDJE2-7によって安定に形質転換したクローン(JE-4B)によって発現された蛋白質の特徴付け
pCDJE2-7またはJE-VEXワクチンによって免疫したマウスにおける免疫応答の持続
マウスに100μg/用量のプラスミドDNA、またはJE-VAXワクチンのヒト用量の1/5を1回もしくは2回接種した。2回目の免疫を行う前に、試験のために血清を採取した。
*個々の血清力価。
様々なJEVワクチンによるワクチン接種後のマウスにおける、年齢依存的%血清陽性率
様々なJEVワクチンによる3日齢でのワクチン接種後、8週齢マウスにおけるJEVチャレンジからの保護
JEV核酸ワクチン接種雌性マウスからの母体抗体が、致死的JEV脳炎から仔を保護することができるか否かに関する評価
マウスにプラスミドDNA 100μg用量を1回もしくは2回筋肉内に接種するか、またはJE-VAXワクチンのヒト用量の1/5量を2回皮下接種した。非免疫雄性マウスと交配させる前に、PRNT試験のためにワクチン接種後9週目に血清を採取した。
1:生存数/各同腹子の総数
2:JEV ELISA抗体陽性動物数(力価≧400倍)/生存数;血清は、チャレンジ後12週目に試験のために採取した。
フラビウイルスDNAワクチン構築物におけるシグナルペプチドの特徴とワクチン能
a シグナルP HMMプログラムを適用して、シグナルペプチド(SP)、アンカーペプチド(AP)、およびシグナラーゼ切断部位(C部位)の確率を計算した。一文字アミノ酸コードを使用し、荷電アミノ酸は、下線と太字の文字で強調した。SPとprMの間のシグナラーゼ切断部位を「/」で示す。DNAワクチンは、筋肉内(im)、皮内(id)、または遺伝子ガン(gg)法によって接種した。
WNおよびJEウイルスの複合DNAワクチンの異なる用量によって免疫したマウスにおける中和抗体(Nt)反応
3週齢の雌性ICR非近交系マウス1群10匹に、表記の複合プラスミドの用量を1回筋肉内注射した。免疫後12週目に採取した血清標本を、プラーク減少中和試験(PRNT)によってアッセイした。JEおよびWNウイルスに対するエンドポイント力価はそれぞれ、JEウイルス(SA-14株)および西ナイルウイルス(NY-6480株)を用いて、90%プラーク減少に基づいて計算した。
DEN-2ウイルスprM E発現プラスミドを構築するために用いられるオリゴヌクレオチド、およびキメラDEN-2およびJE Eの接合領域を示す。
a オリゴヌクレオチドにおいてコードされる制限酵素部位は、太字、斜体、および下線で強調した。
間接蛍光抗体アッセイ法(IFA)によって決定した、組み換え型DEN-2プラスミドによって発現されたDEN-2 E糖蛋白質エピトープの特徴付け
a IFA基質は、DEN-2 16681に感染した、非感染対照、およびDEN-2組み換え型プラスミドによって形質転換したアセトン固定COS-1細胞であった。
b モノクローナル抗体は、DEN-2 16681ウイルスに対する反応性に基づいて規定の最適な希釈で用いた。いくつかのMAbに関しては、括弧内に示すエンドポイント力価を報告し、他のMAbに関しては、1+〜4+の尺度に基づいて定性的な値のみを報告し、3〜4+を陽性と見なし、2+は不明確、そして1+は陰性と見なす。
c TBEウイルスのE-糖蛋白質に基づく抗原性ドメイン(Mandlら、「Antigenic structure of theflavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-borneencephalitis virus as a model」、J. Virol. 63:564〜571(1989);Reyら、「The envelopeglycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 Åresolution」、Nature 375:291〜298(1995))。
d 50%中和エンドポイントが報告された4G2および9D12-6を除き、90%プラーク減少エンドポイントを用いた、腹水の100倍希釈でのプラーク減少中和活性(Henchalら、「Epitopicanalysis of antigenic determinants on the surface of dengue-2 virions usingmonoclonal antibodies」、Am. J. Trop. Med. Hyg. 34:162〜169(1985);Roehrigら、「Monoclonalantibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus, Jamaica」、Virology246:317〜328(1998))。
抗原捕獲ELISAによる、分泌型および膜結合型DEN-2組み換え型蛋白質の検出
a プラスミド形質転換細胞からの培養上清を、10%ポリエチレングリコールによって沈殿させ、最初の容積の100分の1に再懸濁させた。
b PEG沈殿培養上清を4%エタノールによって抽出してPEGを除去し、ペレットを抽出した容量の1/5に再懸濁させた。
c 疎水性膜分画は、材料と方法に記載のように調製した。
ICRマウスにおける三つのDEN-2組み換え型プラスミドの免疫原性
a PRNT、プラーク減少中和試験、90%中和エンドポイント。
b マウスを0週目および3週目にプラスミドDNA 100μgによって筋肉内に免疫した。
c ELISAスクリーニングは、100倍および400倍希釈した血清を用いた。
d ND、行っていない。
e プール、1、2、4、5、7、8。
f プール、2、3、6〜10。
g プール、1〜3、6〜10。
三つのDEN-2組み換え型プラスミドの特徴の要約。
a 間接蛍光抗体アッセイ(IFA)染色の特徴、+または-、および拡散または球状パターン。
b 組み換え型プラスミドによって免疫したマウスからの血清の、抗DEN-2 ELISA力価。血清は、ワクチン接種後9週目に採取した(0週目および3週目)。プールした血清試料のエンドポイントELISA力価を含む、力価が100倍以上のマウスの数/マウスの総数を示す。
c プラーク減少中和力価(PRNT、90%減少)が10倍以上であるマウスの数/マウスの総数。血清はワクチン接種後9週目に採取した。
d 中和抗体を有するマウス7匹中、マウス3匹は、PRNT力価が1000倍以上であり、3匹は、100倍以上1000倍未満、そして1匹は力価40倍であった。
Claims (16)
- 転写単位を含む宿主細胞から分泌されたサブウイルス粒子であって、該転写単位は、第一のフラビウイルスの構造蛋白質のシグナル配列および免疫原性フラビウイルス抗原をコードし、該抗原は、M蛋白質およびE蛋白質を含み、そして該抗原は1より多くのフラビウイルスからのアミノ酸配列を含むキメラ抗原であり、そしてここで該転写単位は該抗原の合成を指示し、該第一のフラビウイルスが日本脳炎ウイルスである、サブウイルス粒子。
- 前記キメラ抗原が前記第一のフラビウイルスおよび第二のフラビウイルスからのアミノ酸配列を含む、請求項1記載のサブウイルス粒子。
- 前記第二のフラビウイルスが、黄熱病ウイルス、デング血清型1型ウイルス、デング血清型2型ウイルス、デング血清型3型ウイルス、デング血清型4型ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ポワッサンウイルスおよび西ナイルウイルスからなる群より選択される、請求項2記載のサブウイルス粒子。
- 前記免疫原性フラビウイルス抗原がキメラE蛋白質を含む、請求項2または請求項3記載のサブウイルス粒子。
- 前記免疫原性フラビウイルス抗原が、前記第二のフラビウイルス由来のM蛋白質と、日本脳炎ウイルスおよび前記第二のフラビウイルス由来のアミノ酸配列を含むキメラE蛋白質とを含む、請求項4記載のサブウイルス粒子。
- 前記キメラE蛋白質が、日本脳炎ウイルス由来のカルボキシ末端部分を含み、ここで該カルボキシ末端部分は、該キメラE蛋白質の5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%または75%である、請求項5記載のサブウイルス粒子。
- 前記カルボキシ末端部分は前記キメラE蛋白質の10%である、請求項6記載のサブウイルス粒子。
- 前記カルボキシ末端部分は前記キメラE蛋白質の20%である、請求項6記載のサブウイルス粒子。
- 前記第二のフラビウイルスはデングウイルスである、請求項2〜8のいずれかに記載のサブウイルス粒子。
- 前記第二のフラビウイルスはセントルイス脳炎ウイルスである、請求項2〜8のいずれかに記載のサブウイルス粒子。
- 前記転写単位は、前記抗原の合成を機能的に制御するように適当に配置された制御配列を含む、請求項1〜10のいずれか記載のサブウイルス粒子。
- 前記転写単位によってコードされる前記抗原を含むポリペプチドについての翻訳開始部位に配置されたコザックコンセンサス配列を含む、請求項1〜11のいずれか記載のサブウイルス粒子。
- 前記転写単位はポリ−Aターミネーターを含む、請求項1〜12のいずれか記載のサブウイルス粒子。
- 請求項1〜13のいずれか記載のサブウイルス粒子および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
- フラビウイルスによる感染症に対して被験者を免疫する医薬の製造における、請求項14記載の組成物の使用。
- フラビウイルスによる感染症に対して被験者を免疫するための組成物であって、請求項1〜13のいずれか記載のサブウイルス粒子および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
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