JP5221825B1 - 肺扁平上皮癌の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)被検体から採取した血液検体中のデスモグレイン3の含有量を測定する工程、および、
(2)前記測定により得られたデスモグレイン3の含有量と、健常者から採取した血液検体中のデスモグレイン3の含有量を比較し、被検体から採取した血液検体中のデスモグレイン3の含有量の方が多いことをもって、被検体における肺扁平上皮癌の存在を推定する工程。
(1)固相化抗体としての、配列番号:4のアミノ酸配列で表されるHCDR1、配列番号:5のアミノ酸配列で表されるHCDR2、配列番号:6のアミノ酸配列で表されるHCDR3、配列番号:7のアミノ酸配列で表されるLCDR1、配列番号:8のアミノ酸配列で表されるLCDR2、および配列番号:9のアミノ酸配列で表されるLCDR3を有するDF366m抗体、および、
(2)検出抗体としての、検出抗体として、配列番号:17のアミノ酸配列で表されるHCDR1、配列番号:18のアミノ酸配列で表されるHCDR2、配列番号:19のアミノ酸配列で表されるHCDR3、配列番号:20のアミノ酸配列で表されるLCDR1、配列番号:21のアミノ酸配列で表されるLCDR2、および配列番号:22のアミノ酸配列で表されるLCDR3を有するDF151抗体またはMAB1720抗体(R&D systems社)。
(3)SCCおよびCYFRAからなる群から選ばれる少なくとも1つの肺癌マーカーを、サンドイッチ型免疫学的測定法を用いて検出するための試薬。
本発明は、被検体から採取した血液検体中のデスモグレイン3を用いて測定することにより、肺扁平上皮癌を検出する。血液中のデスモグレイン3濃度は、肺扁平上皮癌患者で特異的に上昇するため、肺扁平上皮癌の有効な診断マーカーであり、肺扁平上皮癌の診断または診断の支援に用いることができる。また、本発明によれば、血液中の濃度を測定すればよいため、被験者の負担の大きい組織生検をする必要が無く、また、その後の解析作業も容易であるため、肺扁平上皮癌を簡便かつ迅速に検出することができる。
(1)被検体から採取した血液検体中のデスモグレイン3の含有量を測定する工程、
(2)前記測定により得られたデスモグレイン3の含有量と、健常者から採取した血液検体中のデスモグレイン3の含有量を比較し、被検体から採取した血液検体中のデスモグレイン3の方の含有量が多いことをもって、被検体における肺扁平上皮癌の存在を推定する工程。
本発明は、被験者から採取した血液検体中のデスモグレイン3の含有量に基づく前記判定と、同一被検体の検体から得られた、既存の肺癌マーカーの発現量に基づく判定を組み合わせた、肺扁平上皮癌の検出方法を含む。
本発明では、被検試料に含まれるデスモグレイン3タンパク質を、抗デスモグレイン3抗体を用いたサンドイッチ型免疫学的測定法により測定することが好ましい。サンドイッチ型免疫学的測定法としては、サンドイッチELISAまたは表面プラズモン励起増強蛍光分光法(Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy、以下「SPFS」という)がより好ましい。
抗デスモグレイン3抗体を固定するために用いられる支持体(担体)としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂 、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズ、プレートなどの形状で用いられる。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどが使用できる。プレートの場合、マルチウェルプレート(96穴マルチウェルプレート等)、バイオセンサーチップなどが使用できる。抗デスモグレイン3抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により行うことができる。これらの支持体はすべて市販のものが好適に使用できる。
試料中のデスモグレイン3の支持体に対する非特異的な結合を防ぐため、固相のブロッキングを行うことが好ましい。ブロッキングは、例えば、緩衝液で希釈した仔牛血清アルブミン(BSA)、ゼラチン、アルブミンなどを用いて行うことができる。ブロッキングは、通常、4℃〜37℃で、1時間〜24時間程度インキュベートすることで行うことができる。
被験試料を支持体に固相化された抗体に接触させることで、デスモグレイン3と固相化抗体を結合させる。被験試料は、必要により、緩衝液、血液、タンパク含有溶液等で適宜希釈して用いる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液を用いることができる。また、血液としては、例えばウシ血清等、タンパク含有溶液としては、例えばBSA含有緩衝液等が好適に用いられる。接触は通常、4℃〜37℃で、1時間〜24時間程度インキュベートすることで行うことができる。
固相化抗体と結合したデスモグレイン3と検出抗体との結合は、検出抗体をデスモグレイン3に接触させることで行う。デスモグレイン3と検出抗体の結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液等を用いることができる。接触は通常、4℃〜37℃で、1時間〜24時間程度インキュベートすることで行うことができる。
標識物質の検出は、それぞれの標識物質に適した当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、放射性物質により標識された検出抗体を検出する場合には、液体シンチレーシヨンやRIA法により検出することができる。蛍光色素により標識された検出抗体を検出する場合には、ルミノメーター、SPSF測定器等により検出することができる。酵素で標識された検出抗体を検出する場合は、標識された酵素に対応した基質を加えた後に、酵素による基質の化学的変化、例えば、発色、蛍光、化学発光等を測定することにより検出することができる。
サンドイッチ型免疫学的測定法のなかでも、本発明ではサンドイッチELISAが好適に用いられる。サンドイッチELISAは、前記サンドイッチ型免疫学的測定法において、標識物質に酵素を用いる方法である。
本発明のサンドイッチELISAの測定方法として、担体(支持体)としてマルチプレートを用いた以下の方法が好適に挙げられる。
本発明のサンドイッチ型免疫学的測定方法として、SPFSが好適に用いられる。SPFSは、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰(ATR)が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉されたアナライト(分析対象物)を標識する蛍光体を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなSPFSは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中にアナライトがごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。
SPFS用測定部材は、一般的に、サンドイッチ型免疫複合体を形成してSPFSによる蛍光測定を行うための場(測定領域)が形成されているセンサーチップと、サンドイッチ型免疫複合体の形成などに用いられる各種の溶液(アナライトを含む試料、標識リガンド溶液、その他の反応試薬等)を測定領域上に保持することのできる、流路またはウェルを構築するための部材とを積層化した構成をとる。
本発明に係る免疫学的測定法は、一般的なSPFS用測定装置を使用して実施することができる。SPFS用測定装置は、基本的に、SFPFS用測定部材が着脱可能となっており、使用する蛍光体に応じた適切な波長の励起光(好適にはレーザー光)を照射するための光源、励起光をセンサーチップの金属薄膜の裏面に所定の角度で入射させるためのプリズム(透明支持体が平面基板状のセンサーチップを使用する場合)、金属薄膜で反射した光を受光しその強度を測定する受光器、蛍光体から発せられる蛍光を集光するためのレンズおよびその蛍光の強度を測定するための検出器、励起光および蛍光から所定の波長を有する光のみを透過させそれ以外の光をカットするための各種のフィルタなどを備える。より具体的な態様は、たとえば特開2010−145272号公報など、各種の文献を参照することができる。
本発明に係るSPFSの測定法は、血液検体中のデスモグレイン3を対象として、下記工程1および2を行うことを含む:
(工程1)固相化された抗デスモグレイン3抗体、デスモグレイン3、および蛍光標識化された抗デスモグレイン3抗体を含むサンドイッチ型免疫複合体を形成する工程、および
(工程2)形成されたサンドイッチ型免疫複合体に含まれる蛍光体から発せられる蛍光強度をSPFS(表面プラズモン励起増強蛍光分光法)により測定する工程。
(工程1a)前記固相化された抗デスモグレイン3抗体と試料中のデスモグレイン3とを反応させて複合体を形成する工程、および
(工程1b)形成された免疫複合体と前記蛍光標識化された抗デスモグレイン3抗体とを反応させて前記サンドイッチ型免疫複合体を形成する工程。
〔免疫学的測定法に用いる抗体〕
本発明に係る免疫学的測定法では、抗ヒトデスモグレイン3抗体を用いる。本発明に係る測定に用いる抗ヒトデスモグレイン3抗体は、本発明の効果を達成できる抗ヒトデスモグレイン3抗体であれば特に限定はされないが、例えば、特許文献3に記載の方法で得られた抗体を挙げることができ、具体的には、例えば、DF120、DF122、DF148、DF151、DF153、DF168、DF331、DF364、DF366、DF151c、DF364c、DF366c、DF366m、YB-DF366c等を挙げることができる。これらの抗ヒトデスモグレイン3抗体のうちのいくつかはアミノ酸配列は特許文献3に開示されている。また、上記以外の市販の抗ヒトデスモグレイン3抗体を用いることもできる。市販の抗体としては、例えば、R&D Systems社のMAB1720、(株)医学生物学研究所のD219-3等が好適に挙げられる。
本発明に係るサンドイッチ型免疫学的測定法では、固相化抗体(以下「捕捉抗体」ともいう。)および検出抗体を用いる。固相化抗体は、支持体(担体)に固定され、検体中のデスモグレイン3を特異的に捕捉するものである。検出抗体は、検出に用いる物質(以下「標識物質」という。)で修飾された抗体であり、前記固相化抗体で捕捉されたデスモグレイン3に結合することでデスモグレイン3を標識物質により標識するものである。この標識物質の存在および存在量を測定することにより、検体中のデスモグレイン3の存在および存在量を測定することができる。本発明では、以下の特定の抗ヒトデスモグレイン3抗体を固相化抗体および検出抗体として用いることで、より高感度で血中デスモグレイン3を検出することができる。
本発明に係るサンドイッチ型免疫学的測定方法では、後述するDF366m抗体、DF151抗体およびMAB1720抗体からなる群から選ばれる2つの抗体を使用することが好ましい。
DF366m抗体は、配列番号:4のアミノ酸配列で表されるHCDR1、配列番号:5のアミノ酸配列で表されるHCDR2、配列番号:6のアミノ酸配列で表されるHCDR3、配列番号:7のアミノ酸配列で表されるLCDR1、配列番号:8のアミノ酸配列で表されるLCDR2、および配列番号:9のアミノ酸配列で表されるLCDR3を有するモノクローナル抗体であって、配列番号:2のアミノ酸配列で表されるH鎖および配列番号:3で表されるL鎖を含む完全抗体(以下「DF366m[I]抗体」という。)、ならびに、当該完全抗体のアミノ酸の一部を有する抗体(以下「DF366[P]抗体」という。)が包含される。なお、DF366m抗体の上記各CDRは、DF366抗体のそれぞれ対応するCDRと同一である(特許文献3参照)。
DF366m[P]抗体は、DF366m[I]抗体のアミノ酸の一部を有する抗体であり、以下の一群の抗体を含む。
CDR1として配列番号:4に記載のアミノ酸配列(DF366m抗体のHCDR1の配列)、CDR2として配列番号:5に記載のアミノ酸配列(DF366m抗体のHCDR2の配列)、および、CDR3として配列番号:6に記載のアミノ酸配列(DF366m抗体のHCDR3の配列)を有するH鎖、ならびに、
CDR1として配列番号:7に記載のアミノ酸配列(DF366m抗体のLCDR1の配列)、CDR2として配列番号:8に記載のアミノ酸配列(DF366m抗体のLCDR2の配列)、CDR3として配列番号:9に記載のアミノ酸配列(DF366m抗体のLCDR3の配列)を有するL鎖
を含む抗体。
VHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列(DF366m抗体のVHの配列)を有するH鎖、および、VLとして配列番号:11に記載のアミノ酸配列(DF366m抗体のVLの配列)を有するL鎖を含む抗体。
前記(2)に記載のV領域、ならびにCH1として配列番号:12のアミノ酸配列(DF366m抗体のCH1の配列)を有するH鎖、および、CLとして配列番号:13のアミノ酸配列(DF366m抗体のCLの配列)を有するL鎖を含む抗体。
DF151抗体は、配列番号:17のアミノ酸配列で表されるHCDR1、配列番号:18のアミノ酸配列で表されるHCDR2、配列番号:19のアミノ酸配列で表されるHCDR3、配列番号:20のアミノ酸配列で表されるLCDR1、配列番号:21のアミノ酸配列で表されるLCDR2、および配列番号:22のアミノ酸配列で表されるLCDR3を有するモノクローナル抗体であって、配列番号:15のアミノ酸配列で表されるH鎖および配列番号:16で表されるL鎖を含む完全抗体(以下「DF151[I]抗体」という。)、ならびに、当該完全抗体のアミノ酸の一部を有する抗体(以下「DF151[P]抗体」という。)が包含される。
DF151[P]抗体は、DF151[I]抗体のアミノ酸の一部を有する抗体であり、以下の一群の抗体を含む。
CDR1として配列番号:17に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のHCDR1の配列)、CDR2として配列番号:18に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のHCDR2の配列)、および、CDR3として配列番号:19に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のHCDR3の配列)を有するH鎖、ならびに、
CDR1として配列番号:20に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のLCDR1の配列)、CDR2として配列番号:21に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のLCDR2の配列)、CDR3として配列番号:22に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のLCDR3の配列)を有するL鎖を含む抗体。
VHとして配列番号:23に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のVHの配列)を有するH鎖、および、VLとして配列番号:24に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のVLの配列)を有するL鎖を含む抗体。
前記(2)に記載のV領域、ならびにCH1として配列番号:25のアミノ酸配列(DF151抗体のCH1の配列)を有するH鎖、および、CLとして配列番号:3のアミノ酸配列(DF151抗体のCLの配列)を有するL鎖を含む抗体。
MAB1720抗体は、Clone#216519により産生されるマウス抗ヒトデスモグレイン3モノクローナル抗体(サブクラス:IgG2b)であり、R&D systems社より購入することが可能である。
本発明で使用される抗体は、抗体の全長分子(完全抗体)に限られず、本発明の効果を損ねない範囲において、かつ、前記に規定した各CDRのアミノ酸配列を有することを条件として、低分子化抗体、多量体、あるいはキメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。低分子化抗体としては、例えば、Fab、Fab’、F(ab')2、Fv、scFv(single chain Fv)、Diabody、sc(Fv)2(single chain (Fv)2)などを挙げることができる。また、これら抗体の多量体(例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー)も、本発明の抗体に含まれる。さらに、公知の手法によってキメラ抗体またはヒト化抗体を作製することもできる。
本発明に用いる抗体のアミノ酸配列は、本発明の効果を損ねない範囲において、アミノ酸の置換、欠失、付加および/または挿入がされていてもよい。すなわち、本発明に用いる抗体を構成するアミノ酸のうち、一もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、前記本発明に用いる抗体と、本発明の達成するべき効果において機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内(例えば、5アミノ酸以内)である。前記アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換であることが好ましい。
本発明に用いる前記各抗体は、公知の方法により、作製することができる。例えば、目的とする抗体のアミノ酸をコードする配列を有する核酸を発現プラスミドに導入し、これを適切な発現細胞に導入し、該発現細胞を適切な培地中で培養することにより、目的の抗体を得ることができる(例えば特許文献3参照)。
本発明の方法の対象となる検体は、被検体より採取した血液検体である。血液は、全血、必要に応じて抗凝固処理した全血、抗凝固処理をした全血を遠心分離して血球成分を除去して得られる血漿、または全血を凝固させて沈殿物(血餅)を除去して得られる血清等であってよい。また、血液検体は、前記血液に加え、必要に応じてこれらを遠心分離、希釈、試薬との混合等の処理をした血液由来試料を含む。これらのなかでも、血清または血漿が好ましい。
本発明は、検体中のデスモグレイン3を検出することによって肺扁平上皮癌を検出する肺扁平上皮癌診断用キットを含む。該肺扁平上皮癌診断用キットは、サンドイッチ型免疫学的測定法に用いる下記試薬を含有する:
(1)固相化抗体としてのDF366m抗体、および、
(2)検出抗体としての、DF151抗体およびMAB1720抗体(R&D systems社)からなる群から選ばれる1つの抗体。
上記サンドイッチ型免疫学的測定法のうち、血液検体の測定では、ELISA法とSPFS法が汎用される。
<標準抗原を用いた適切な抗体の選択試験>
抗体は以下のものを用いた。(1)〜(3)の抗体は、いずれも特許文献3に記載の方法で作成した、ハイブリドーマまたはプラスミドを導入した発現細胞の培養上清より調製した。
(2)DF151(DF151[I]抗体)
(3)D219-3((株)医学生物学研究所)
(4)MAB1720(R&D systems社、カタログ番号MAB1720)
<ビオチン標識抗体の調製>
モノクローナル抗体のビオチン化は、以下のように行った。
ヒトデスモグレイン3として、配列番号:1で表されるヒトDSG3細胞外領域(Met1-Leu616)とマウスIgG2a定常領域を結合させた可溶型ヒトDSG3/マウスIgG2aFc融合タンパク質を作製して使用した。融合タンパクの作製は、特許文献3の実施例3に記載の方法と同様に行った。得られた抗原タンパクをPBS(-)で希釈し、0〜25ng/mLの抗原溶液を作製した。
各固相抗体を、100mM 炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH9.6)中に5μg/mLに希釈し、この溶液をポリスチレン製ELISAプレート(Maxi-soup plate (商品名)、NUNC社)に各50μL/ウェルずつ添加し、4℃で12時間インキュベートすることで、各抗体を固相化した。
結果を表1に示す。表中の数値は、S/N比が2を超える最小の抗原溶液濃度(以下「検出限界濃度」という。)を示し、数値の単位はpg/mLである。S/N比は各抗原溶液濃度(1.6、8、40、200、1,000、5,000、25,000pg/mL)における発光強度を、抗原を含まないブランク抗原溶液(0pg/mL)における発光強度で除したものである。
<血液添加デスモグレイン3標準品の検出>
表2に示す抗体の組合せのうち、検出限界濃度が1,000pg/mL以下であった組合せについて、デスモグレイン3標準品をヒト血清に添加した検体の測定をおこなった。
結果を表3に示す。表中の数値は検出限界濃度であり、数値の単位はpg/mLである。本発明の抗体の組合せを用いれば、血液中のデスモグレイン3量であっても高感度で測定できることが明らかとなった。
<患者血液(血清および血漿)検体中のデスモグレイン3のサンドイッチELISAによる検出>
癌患者の血液検体中のデスモグレイン3の検出を以下の通り行った。
血液バンクより入手したヒト血液検体(血清または血漿)(健常者、膵癌患者、肺腺癌患者および肺扁平上皮癌患者、各10例)を、ウシプール血清(コージンバイオ社)で10倍に希釈し、被験溶液とした。
DF366mを100mM炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH9.6)で5μg/mLに希釈し、この溶液をポリスチレン製ELISAプレート(Maxi-soup plate (商品名)、NUNC社)に各50μL/ウェルずつ添加し、4℃で終夜インキュベートすることで固相化した。
結果を図1に示す。肺扁平上皮癌患者の1検体において、健常者と比較して有意に高いデスモグレイン3の存在を検出することができた。健常者、膵癌患者および肺腺癌患者の検体中では、デスモグレイン3の高い上昇は認められなかった。したがって、肺扁平上皮癌と他の癌を区別することができ、血中デスモグレイン3量は、肺扁平上皮癌の特異的診断マーカーとして用いることができることが示唆された。
<肺扁平上皮癌患者血液(血清)検体中のデスモグレイン3の検出>
さらに、血液バンクより、肺扁平上皮癌患者30名の血液検体を入手し、追加実験を行った。被験溶液として原液を用いた他は実施例2と同様に行った。得られた結果は、実施例2で測定した健常者10例および肺扁平上皮癌患者10例の結果と合わせて評価した。
<他の肺癌マーカーとの比較>
実施例3の肺扁平上皮癌患者血液検体40例について、他の肺癌マーカーとの特性の比較検討を行った。デスモグレイン3のデータは実施例3の結果を用いた。他の肺癌マーカーとしてSCCおよびCYFRA21-1(以下「CYFRA」という。)を選択し検討を行った。
SCCの測定は、はSCC測定キットCanAg SCC EIA(商品名、FUJIREBIO Diagnostics,Inc)を用いて、添付指示書にしたがって実施し、カットオフ値は、1.5ng/mLに設定した。CYFRAの測定は、CYFRA測定キットCYFRA21-1 EIA(商品名、FUJIREBIO Diagnostics,Inc)を用いて、添付指示書にしたがって実施し、カットオフ値は3.5ng/mLに設定した。
図3〜図5に結果を示す。本来、血中濃度としてマイナスの値は通常想定できないが、定量限界に近い濃度領域ではノイズ値がシグナル値を超える場合も多々あるために、マイナス値が算出されており、図3〜図5においては、算出値をそのまま記載している。
<緩衝液中のデスモグレイン3標準品のSPFSによる検出(1)>
緩衝液中のデスモグレイン3をSPFSにより測定した。固相化抗体として、実施例1に記載のDF366mを、検出抗体として実施例1に記載のDF151を用いた。
厚さ1mmのガラス製の透明支持体「S−LAL 10」((株)オハラ、屈折率(nd):1.72)をプラズマ洗浄した後、該支持体の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは1〜3nm以下、金薄膜の厚さは42〜47nmであった。
DF151抗体溶液(2.5μg/mL)と、AlexaFluor647標識キット(Invitrogen社)とを用いて、当該キットの所定の手順に従い、AlexaFluor647標識化DF151を作製した。その後、分子量カットフィルタ(日本ミリポア(株))を用いて未反応物を除去し、AlexaFluor647標識化DF151抗体を精製し、下記アッセイの実施まで4℃で保存した。
前記工程(1)で作製した測定部材の流路に、デスモグレイン3を100pg/mL(=0.1ng/mL)含むPBS溶液0.1mLを送液し、25分間循環させた。
結果を図6に示す。縦軸は「シグナル」−「ノイズ」(S-N)の値(単位:a.u.)、横軸はデスモグレイン3の濃度(単位:pg/mL)である。このプロットに基づき、上記測定系によるデスモグレイン3の検出限界濃度は5pg/mLであると判定でき、サンドイッチELISAによる測定と比べて、約40倍の検出感度が得られることが明らかとなった。すなわち、SPFS法によれば、ELISA法で必要な検体量の1/40の検体量で同等の評価が行えるという効果が得られることになる。
[実施例7]
<血液添加デスモグレイン3標準品のSPFSによる検出>
検体として、実施例2の検体溶液を用いたほかは、実施例6と同様に実施した。
実施例6と同様の結果が得られ、血中のデスモグレイン3の検出限界濃度は5pg/mLと判定された。すなわち、本発明に係る検体の組合せを用いれば、血液検体中のデスモグレイン3をSPFSにより高感度で検出できることが明らかとなり、他の測定方法、例えばELISA法と比較して遥かに少ない検体量で検出することができ、また、肺扁平上皮癌の判定のカットオフ値をELISA法に比べてさらに下げられることが示された。
Claims (11)
- 以下の工程を含む判定により、肺扁平上皮癌を検出する方法:
(1)被検体から採取した血液検体中のデスモグレイン3の含有量を測定する工程、および、
(2)前記測定により得られたデスモグレイン3の含有量と、健常者から採取した血液検体中のデスモグレイン3の含有量を比較し、被検体から採取した血液検体中のデスモグレイン3の含有量の方が多いことをもって、被検体における肺扁平上皮癌の存在を推定する工程。 - さらに、同一被検体の検体から得られた、既存の肺癌マーカーである、SCCおよびCYFRAからなる群から選ばれる少なくとも1つの発現量に基づく判定を組み合わせた、請求項1に記載の方法。
- 前記測定がサンドイッチ型免疫学的測定法である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記サンドイッチ型免疫学的測定法において、
固相化抗体として、配列番号:4のアミノ酸配列で表されるHCDR1、配列番号:5のアミノ酸配列で表されるHCDR2、配列番号:6のアミノ酸配列で表されるHCDR3、配列番号:7のアミノ酸配列で表されるLCDR1、配列番号:8のアミノ酸配列で表されるLCDR2、および配列番号:9のアミノ酸配列で表されるLCDR3を有するDF366m抗体を使用し、
検出抗体として、配列番号:17のアミノ酸配列で表されるHCDR1、配列番号:18のアミノ酸配列で表されるHCDR2、配列番号:19のアミノ酸配列で表されるHCDR3、配列番号:20のアミノ酸配列で表されるLCDR1、配列番号:21のアミノ酸配列で表されるLCDR2、および配列番号:22のアミノ酸配列で表されるLCDR3を有するDF151抗体、またはMAB1720抗体(R&D systems社)を使用する、請求項3に記載の方法。 - 前記サンドイッチ型免疫学的測定法において、担体に固相化されたDF366m抗体に検体を接触させ、その後、DF151抗体またはMAB1720抗体(R&D systems社)を接触させる、請求項3または4に記載の方法。
- 前記DF366m抗体が、配列番号:2のアミノ酸配列で表されるH鎖および配列番号:3で表されるL鎖を含む完全抗体、またはVHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有するH鎖およびVLとして配列番号:11に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体であり、前記DF151抗体が、配列番号:15のアミノ酸配列で表されるH鎖および配列番号:16で表されるL鎖を含む完全抗体、またはVHとして配列番号:23に記載のアミノ酸配列を有するH鎖およびVLとして配列番号:24に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体である、請求項4または5に記載の方法。
- 前記サンドイッチ型免疫学的測定法が、サンドイッチELISA法である、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンドイッチ型免疫学的測定法が、SPFS法である、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
- サンドイッチ型免疫学的測定法に用いる下記試薬を含有する、肺扁平上皮癌診断用キット:
(1)固相化抗体としての、配列番号:4のアミノ酸配列で表されるHCDR1、配列番号:5のアミノ酸配列で表されるHCDR2、配列番号:6のアミノ酸配列で表されるHCDR3、配列番号:7のアミノ酸配列で表されるLCDR1、配列番号:8のアミノ酸配列で表されるLCDR2、および配列番号:9のアミノ酸配列で表されるLCDR3を有するDF366m抗体、および、
(2)検出抗体としての、検出抗体として、配列番号:17のアミノ酸配列で表されるHCDR1、配列番号:18のアミノ酸配列で表されるHCDR2、配列番号:19のアミノ酸配列で表されるHCDR3、配列番号:20のアミノ酸配列で表されるLCDR1、配列番号:21のアミノ酸配列で表されるLCDR2、および配列番号:22のアミノ酸配列で表されるLCDR3を有するDF151抗体またはMAB1720抗体(R&D systems社)。 - 前記DF366m抗体が、配列番号:2のアミノ酸配列で表されるH鎖および配列番号:3で表されるL鎖を含む完全抗体、またはVHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有するH鎖およびVLとして配列番号:11に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体であり、前記DF151抗体が、配列番号:15のアミノ酸配列で表されるH鎖および配列番号:16で表されるL鎖を含む完全抗体、またはVHとして配列番号:23に記載のアミノ酸配列を有するH鎖およびVLとして配列番号:24に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体である、請求項9に記載の肺扁平上皮癌診断用キット。
- さらに、下記試薬を含有する、請求項9または10の肺扁平上皮癌診断用キット:
(3)SCCおよびCYFRAからなる群から選ばれる少なくとも1つの肺癌マーカーを、サンドイッチ型免疫学的測定法を用いて検出するための試薬。
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