JP5216318B2 - 蛍光検出装置 - Google Patents
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Description
これにより,プリズムの励起光入射面にマッチング液が付着し,エバネッセント場が形成されなくなる恐れもある。
このように上記の従来技術においては,操作性が良好で,且つ常に安定したエバネッセント場を形成できるような装置構造については十分考慮されていなかった。
θp>sin-1(naq/np) (式1)
ここで,上記の(式1)の全反射条件について図3を用いて説明する。図3に示すようにθpはプリズム301からマッチング液302への入射角,naqはサンプル溶液304の屈折率,npはプリズム301の屈折率である。本実施例では,プリズム301の素材S-BAL14より,np=1.57,サンプル溶液304は水溶液naq=1.33ゆえ,(式1)より全反射する入射角条件はθp>57.9度となり,これを満たすように入射角度を調整した。これを満たさない値で入射すると,励起光は全反射せずにサンプル溶液304を透過するので,水のラマン散乱などによる背景光の影響で測定感度が低下し,結果として蛍光単分子の測定精度は著しく低下する。
本実施例では,サンプル支持部材105に厚さ2mm大きさ35 mm×5 mmのポリカーボネート板2枚を使用し,それぞれの両端にネジを通すキリ穴を空け,サンプル基板106を挟んでサンプルステージ109のネジ穴を使用して締めつけることで,サンプル基板106を強固に固定した。この他,サンプル支持部材105として,板バネのようなものを用いることが可能である。また、上記では、サンプル基板を上下に挟み込む構造であるが、支持部材に凹部等を設け左右から高さ方向を併せるように挟み込んで保持するような構成とすることも可能である。
その後にダイクロイックミラー124〜126で波長ごとに異なる方向へ透過または反射させ,結像レンズ127〜130でイメージセンサ131〜134の光電面上に結像させる。イメージセンサ131〜134で得られた画像は,演算,記憶および制御機能を備えたコンピュータとしての機能を有する制御部135に記録される。
以下,図6のフローチャートに沿って測定の工程を示す。
図7は図1のプリズム周辺の励起光路を含む断面図である。ウェルに油浸型対物レンズ703で用いるイマージョンオイルを充填し,サンプル基板704とプリズム701のマッチング液702を兼用する。
Δl=Δlm+Δlp (式7)
ここで,ΔlmとΔlpを求めるために,波長λ1とλ2の励起光のプリズム1701,マッチング液1702,サンプル基板1703での屈折率をそれぞれ,np(λ1),np(λ2) , nm(λ1),nm(λ2) ,ns(λ1),ns(λ2)として,マッチング液1702,サンプル基板1703の厚みをそれぞれΔm,Δsと定義する(図17(A))。このとき波長λ1とλ2の励起光のプリズム1701からマッチング液1702への透過光角θm1とθm2は,スネルの法則より
θm1=sin-1((np(λ1)/nm(λ1))sin(θp)) (式8)
θm2=sin-1((np(λ2)/nm(λ2))sin(θp)) (式9)
で与えられる。これより,Δlmは,
Δlm=Δm×|tan(θm1)- tan(θm2)| (式10)
となる。同様にΔlsを(式8)〜(式10)をまとめた形で表すと,
Δls=Δs×|tan(sin-1((nm(λ1)/ns(λ1))sin(θm1)))
- tan(sin-1((nm(λ2)/ns(λ2))sin(θm2)))| (式11)
となるので,(式10)と(式11)の値を(式7)に代入すれば,エバネセント照射位置のズレΔlを求めることができる。
β>sin-1(naq/nm) (式2)
ここで,naqはサンプル溶液803の屈折率,npはマッチング液804の屈折率である。本実施例の構成では,プリズム801斜面およびウェル底面に対して励起光は垂直に入射するので,同じ光路に複数種の光源が混ざっていても,前記界面での波長に依存した光路のズレは生じない。本実施例では,垂直入射であることを確認する機構として,集光レンズ808の光源側に励起光の直径とほぼ同じ径をもつ開口絞り809を配置した。垂直入射であれば,プリズム801表面での反射光は,実質的に入射と同一光路で光源方向に戻るので,開口絞り809に映る戻り光を確認することができる。前記方法で合わせれば,対物レンズ807の視野付近にエバネッセント照射領域を収めることができるので,光源1603,1604やミラー1615の角度を微動調整するだけで,エバネッセント領域を視野内に合わせることができる。尚,開口絞り809を集光レンズ808の光源側に配置したが,プリズム側やミラー1601の光源側に配置してもかまわない。また,前記入射の垂直性はエバネッセント照射領域の位置あわせの手間を軽減するための指標であり,入射角が垂直からずれたために,本実施例固有の効果がなくなる訳ではない。
図9(A)は,屈折率npのプリズム901から屈折率nmのマッチング液902への入射光角度θiと透過光角度θtを表している。
フレネルの公式より,入射面に電場ベクトルが平行なp-偏光と垂直なs-偏光の反射率は,
i)θi≠0のとき
(p-偏光反射率)=(sin(θi-θt)/ sin(θi+θt))2 (式3)
(s-偏光反射率)=(tan(θi-θt)/ tan(θi+θt))2 (式4)
ii)θi=0のとき
(p/s-偏光反射率)=((n1-n2)/(n1+n2)) 2 (式5)
となる。ここで,透過光角度θtは,スネルの法則から
npsinθi= nmsinθt (式6)
で求まるので,以上(式3)〜(式6)より,実施例1同様,マッチング液902にグリセロール(屈折率nm=1.47),プリズム901素材をS-BSL14(屈折率np=1.57)としたときの反射率は,図9(B)のようになる。結果,プリズム901からマッチング液902へ垂直入射したとき(θi=0)に,反射光が最も少なくなり,徐々に上昇する。
102…プリズム支持部材
103…プリズム駆動部
104,302,702,804,902,1103,1202,1302,1402,1606,1702…マッチング液
105,705,805,1410,1608…サンプル支持部材
106,303, 502,704,802,1401,1501,1607,1703…サンプル基板
107,1406…流入路
108,1407…流出路
109,401〜403,706,806,1408,1618…サンプルステージ
110,1409…サンプル駆動部
111,112,507,508,1603,1604…励起光源
113,114,1611,1614…フィルター
115,116,117,118,1601,1615…ミラー
119,120,807,1609…集光レンズ
121,703,1405,1617…対物レンズ
122,123…発光フィルター
124〜126,1602…ダイクロイックミラー
127〜130…結像レンズ
131〜134…イメージセンサ
135…制御部
136…流入容器
137…廃液容器
138…対物レンズ駆動部
139,140,1610,1613…シャッター
141,142,1612,1616…λ/4板
304,803,1704…サンプル溶液
501…DNA一本鎖とプライマの複合体
503…チミン
504…アデニン
505…シトシン
506…グアニン
707…小型バルブ
708,1205…マッチング液容器
709…ノズル
1002,1003…突起部
1004…接着部
1102…液漏れ防止溝
1105…液漏れ防止段
1203…注入口
1204…排出口
1206…バルブ
1207…マッチング液廃容器
1303,1306,1307…温調部
1304…温度制御部
1305…温度センサ
1403,1502…マッチング液保持部材。
Claims (13)
- 表面に蛍光標識された生体分子が固定される基板と,
該基板を保持するサンプル保持部と,
前記基板からエバネッセント場を生じさせるように,前記基板に光を照射する少なくとも1つの光源と,
前記光源から照射される前記光の光路上に配置されたプリズムと,
前記生体分子から放射された光を通過させるための, 前記基板の前記プリズムを介して前記光が入射する面と反対の面側に配置されたレンズと,
前記レンズを通過した光を所定の波長毎に分光する分光部と,
前記分光部により分光された光を検出するセンサと,
前記センサによって検出された光を処理する制御部と,を有し,
前記プリズムは前記基板を浸漬させるマッチング液の液層を形成するように前記マッチング液を滞留させるマッチング液滞留手段を備え,
前記マッチング液に対物レンズ用イマージョンオイルを用い,前記レンズの先端が前記マッチング液滞留手段中の前記マッチング液に浸される,ことを特徴とする蛍光検出装置。 - 表面に蛍光標識された生体分子が固定される基板と,
該基板を挟持するサンプル保持部と,
該サンプル保持部を駆動するサンプル駆動部と,
前記基板からエバネッセント場を生じさせるように,前記基板の裏面方向から光を照射する少なくとも1つの光源と,
前記光源から照射される前記光の光路上に配置されたプリズムと,
前記プリズムを駆動させるプリズム駆動部と,
前記生体分子から放射された光を通過させるための,前記基板の前記プリズムを介して前記光が入射する面と反対の面側に配置されたレンズと,
前記レンズを通過した光を分光する分光部と,
前記分光部による分光された光を検出するセンサと,
前記センサによって検出された光を処理する制御部と,を有し,
前記プリズムは前記基板を浸漬させるマッチング液層を形成するようにマッチング液を滞留させる壁面を備え,
前記マッチング液に対物レンズ用イマージョンオイルを用い,前記レンズの先端が前記マッチング液滞留手段中の前記マッチング液に浸され,
前記制御部は,前記基板を前記マッチング液層に接触させるときに,前記サンプル保持部を前記マッチング液層表面に対して傾斜させることを特徴とする蛍光検出装置。 - 請求項1に記載の蛍光検出装置において,
前記制御部は,前記基板を前記マッチング液層に接触させるときに,前記サンプル保持部を前記マッチング液層表面に対して傾斜させることを特徴とする蛍光検出装置。 - 請求項2に記載の蛍光検出装置において,
前記制御部は,前記プリズム駆動部を制御して前記基板と前記プリズムとの距離を調整することを特徴とする蛍光検出装置。 - 請求項4に記載の蛍光検出装置において,
前記プリズム駆動部は,粗動機構と微動機構を有することを特徴とする蛍光検出装置。 - 請求項1また2に記載の蛍光検出装置において,
前記プリズムの前記基板と対向する面は,前記光源から照射される前記光が入射する前記基板の面と平行であり,
両者の前記マッチン液面と成す角βは,naq ,npをそれぞれ前記生体分子を含有するサンプル溶液,マッチング液804の屈折率として,
β>sin-1(naq/nm)
を満たし,
前記光源から照射される前記光は,前記プリズム面に対して実質的に垂直に入射することを特徴とする蛍光検出装置。 - 請求項1または2に記載の蛍光検出装置において,
前記分光部は,ダイクロイックミラーと,複数のイメージセンサを備えることを特徴とする蛍光検出装置。 - 請求項1または2の蛍光検出装置において,
前記基板に少なくとも一種類の生体分子を含む溶液をフローさせる手段を有することを特徴とする蛍光検出装置。 - 請求項1または2に記載の蛍光検出装置において,
前記プリズムにおける前記マッチング液層が形成される面の底面に突起部を有し,
前記プリズムに前記基板を押し付けたときに,両者の対向面を平行にすることを特徴とする蛍光検出装置。 - 請求項1または2に記載の蛍光検出装置において,
前記壁面に前記マッチング液を受け止める溝を有することを特徴とする蛍光検出装置 - 請求項1または2に記載の蛍光検出装置において,
前記プリズムに前記マッチング液を注入する注入手段及び前記マッチング液を排出する排出手段を有することを特徴とする蛍光検出装置。 - 請求項1または2に記載の蛍光検出装置において,
前記プリズムに注入された前記マッチング液の温度を調整する温度調整機構を備え,前記制御部によって該温度調整機構を制御することを特徴とする蛍光検出装置。 - 表面に蛍光標識された生体分子が固定される基板と,
該基板を挟持するサンプル保持部と,
前記基板からエバネッセント場を生じさせ、かつ前記基板の裏面方向に対して同一光路となるように波長の異なる光を夫々出射する複数の光源と,
前記複数の光源から夫々出射される前記光の光路上に配置されたプリズムと,
前記生体分子から放射された光を通過させるための, 前記基板の前記プリズムを介して前記光が入射する面と反対の面側に配置されたレンズと,
前記レンズを通過した光を所定の波長毎に分光する分光部と,
前記分光部により分光された光を検出するセンサと,
前記センサによって検出された光を処理する制御部とを有し,
前記プリズムは前記基板を浸漬させるマッチング液の液層を形成するように前記マッチング液を滞留させる手段を備え、
前記プリズムは前記基板を浸漬させるマッチング液の液層を形成するように前記マッチング液を滞留させるマッチング液滞留手段を備え,
前記マッチング液に対物レンズ用イマージョンオイルを用い,前記レンズの先端が前記マッチング液滞留手段中の前記マッチング液に浸され,
前記プリズムの前記基板と対向する面は,前記光源から照射される前記光が入射する前記基板の面と概略平行であり,
前記プリズムの表面に対する前記光源から照射される前記光の入射角度は0度から54度であることを特徴とする蛍光検出装置。
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