JP4375224B2 - 光学的測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、粒子を含む液体試料を光学的に測定する光学的測定装置に関する。本発明の光学的測定装置は、例えば、液中粒子の有無の確認、さらには液中粒子の濃度、粒形、粒径の測定に適用することができる。

近年、液体中の粒子を計測することは、例えば蛋白質などの生体高分子に関する情報を計測する手段のひとつとして注目されている。
生体高分子を粒子としてみたときの生体高分子の移動しやすさ、すなわち拡散しやすさは、生体高分子の大きさ、形状、結合状態等に依存して変化するので、拡散しやすさを評価することにより、生体高分子に関する種々の情報、例えば粒子の有無、粒径や、粒形、結合状態等を知ることができる。

液体中の粒子の拡散しやすさを計測する手法としては例えば顕微蛍光相関分光法がある（特許文献１参照）。
顕微蛍光分光法によれば、計測対象となる粒子（生体高分子）を蛍光分子で標識処理し、顕微鏡視野下でこれを励起照明し、蛍光を発する計測対象粒子のブラウン運動に伴う蛍光強度変化を計測（蛍光粒子の数をカウントする）して、計測対象粒子の拡散係数を求めるものである。

出願人は、先行特許出願において、標識化を行うことなく粒子（溶解したもの又は分散したもの）の拡散しやすさを計測するための光学的測定装置として、液体中の粒子に誘電泳動を生じさせて移動することにより、粒子集中領域を形成し、その後、誘電泳動を停止して粒子集中領域から粒子を拡散させたときの屈折率変化から、粒子の拡散に関する評価を行う装置を提案している（特願２００４−２０４０２４号）。この光学的測定装置では、２本の平行に並ぶ電極を通じて被測定液に電圧を印加して誘電泳動を引き起こすことにより、溶液の局所的な屈折率変化を発生させている。

また、出願人は他の先行特許出願において、基本回折光パターンを生じさせる回折格子兼電極に、交流電圧を印加して粒子に誘電泳動を起こさせることにより、粒子集中領域を形成して局所的な屈折率変化を発生させ、基本回折光パターンとは異なる変形回折光パターンを発生させ、変形回折光パターンに基づいて液体中の粒子の有無など、粒子に関する情報を計測することを提案している（特願２００４−２４１９０７号）。
特表平１１−５０２６０８号公報

上述した特許文献１に開示された公知の顕微蛍光相関分光法による粒子の光学的測定では、試料を標識化する必要があり、そのための煩わしい前処理作業を行わなければならない。
また、顕微蛍光相関分光法により測定すれば、粒子に標識化処理を施してしまうので、粒子を完全な自然状態で測定することはできない。
これに対し、出願人が先行特許出願において提案している測定方法、すなわち回折格子兼電極に所定の交流電圧を印加して粒子に誘電泳動を起こすことにより粒子集中領域を形成し、粒子集中領域による変形回折光パターンに基づいて液体中の粒子の光学的測定を行う方法では、標識化処理の必要がないので、前処理の煩わしさがなく、また、粒子を完全な自然状態で測定することができる。

しかしながら、誘電泳動作用により液中の粒子を移動させる方法は、使用する液体が非電解質の場合は有効であるが、電解質液である場合には、電極間に実質的に十分な高電圧を印加することができないため、誘電泳動による粒子の移動が生じにくく、粒子集中領域を形成することが困難である。生体高分子のような粒子の場合には、電解質液中に存在させておくことが多いので、液体の種類とは無関係に測定可能な測定法が望まれる。

そこで本発明は、粒子に標識化処理を施すことなく、粒子を完全な自然状態で測定することができるとともに、電解質液中の粒子であっても光学的測定を行うことができる光学的測定装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するためになされた本発明の光学的測定装置は、第一液体を貯留する容器と、容器内の第一液体中に等間隔隔てて第二液体を並列に導入する並列導入口群と、並列導入口群から導入された第二液体と第一液体とが交互に並ぶことにより形成される格子状領域に向けて入射光を照射する光源と、格子状領域から出射される回折光を検出する検出器とを備え、回折光に基づいて第一液体または第二液体のいずれかに含まれる粒子に関する情報を測定するようにしている。

本発明によれば、容器内に第１液体を貯留し、並列導入口群から第２液体を導入する。導入直後は、第１液体中に第２液体が等間隔の層をなすように流れ、第１液体と第２液体とが交互に並ぶようになり、第１液体と第２液体との屈折率差によって、この領域に一時的に双方の液体による格子状領域が形成され、回折格子として機能する。この格子状領域は、その後、液中に含まれる粒子の拡散によりぼやけるようになる。
したがって、形成された回折格子（格子状領域）による回折光の時間変化をモニタすることにより、液中粒子の有無、さらには液中粒子の拡散現象をモニタすることができ、ひいては液中粒子の拡散しやすさを評価することができる。すなわち、回折光の時間変化から液中粒子の有無、拡散しやすさに影響を与える粒径、粒形、結合状態などの情報を得ることができる。

ここで、第１液体または第２液体のいずれか一方に測定対象となる粒子を含むようにすれば、拡散による変化を回折光として検出することができる。具体的には、例えば蛋白質粒子を測定する場合、第１液体は水、あるいはＴＥバッファのような電解質液を希釈液として用い、第２液体には測定対象である蛋白質粒子を含ませた試料液体を用いる。
あるいは、第１液体と第２液体とを逆にしてもよいが、定量的な測定を行う場合は、容器内に貯留されている第１液体中ではなく、並列導入口群から導入する第２液体に粒子を含むようにする方が、粒子の動きを検出しやすいので、より好ましい。
また、液はエタノールなどの有機溶媒でもよい。

また、いずれか一方に粒子が含まれる希釈液と試料液体の組み合わせに代えて、第１液体と第２液体との双方に粒子を含む液体を供給してもよい。この場合も、粒径や粒種が異なれば、屈折率差として現れて格子状領域が形成されるので、同様の測定を行うことができる。

本発明によれば、粒子に標識化処理を施すことなく、粒子を完全な自然状態で測定することができる。また、誘電泳動を利用しないため電圧を印加する必要がないことから、たとえ電解質液中の粒子であっても、液中粒子による回折格子（格子状領域）を形成することができるので光学的測定を行うことができる。

（その他の課題を解決するための手段および効果）
上記発明において、導入口群は、容器側壁を貫通するノズル群としてもよい。ノズル先端から第２液体を導入することにより、第二液体を局所的に導入することができ、導入直後に第１液体と第２液体とはっきり分けることができる。

この場合に、ノズル群は、第二液体を吐出する吐出ノズルと、第二液体が吐出しないダミーノズルとが交互に配置されるようにするのが、さらに好ましい。容器内には、第一液体と第二液体とに起因する回折格子の他に、ノズル群１５の先端部分が等間隔で並ぶことに起因する回折格子が存在し、これらは同じ格子定数であるため、ダミーノズルにより、前者の格子定数を異ならせることにより、回折光を分離することができる。

また、上記発明において、導入口群は、容器壁に形成されるスリット群からなるようにしてもよい。スリット状に第２液体を導入することにより、帯状の回折格子を形成することができ、入射光の回折効率を向上して回折光強度を増大することができる。

また、上記発明において、容器には、第一液体を供給する供給流路と、容器内の液体を排出する排出流路とを形成し、供給流路と排出流路の少なくともいずれか一方にバルブを形成し、容器内の液体を交換することができるように構成してもよい。
これによれば、１回の測定を行った後、第１液体と第２液体とが混ざった容器内液体を直ちに排出するとともに、同時に次の測定のための第１液体を導入することができ、繰り返し測定を能率よく行うことができる。

以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明する。なお、本発明は、以下に説明するような実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の態様が含まれることはいうまでもない。

（実施形態１）
図１は、本発明の一実施形態である光学的測定装置の概略構成図であり、図１（ａ）はその平面図、図１（ｂ）はその正面図である。
この実施形態の光学的測定装置１０は、粒子を含まない希釈液（第１液体）を保持する容器１１と、容器内の液体に向けて入射光を照射する光源１２と、容器内の液体による回折光や透過光、あるいは反射光を測定する光検出器１３とにより構成される。

容器１１は、光源１２からの光を透過するガラスで形成され、直方体形状であり、液体を貯留するための内部空間を有している。内部空間を挟んで長手方向の一端側の容器側壁１１ａには希釈液を供給する供給流路１４ａ、他端側の容器側壁１１ｂには内部空間の液体を排出する排出流路１４ｂが形成されている。供給流路１４ａにはバルブ１６が設けられており、バルブ１６の上流側は図示しない希釈液のタンクに接続されており、バルブ１６を開閉制御することにより、容器１１内に新しい希釈液が導入されるとともに、それまで容器１１内に貯留していた液体は、排出流路１４ｂから排出されるようにしてある。
なお、バルブ１６に代えて、排出流路１４ｂ側にバルブを設けてもよい。また、供給流路１４ａと排出流路１４ｂとの双方にバルブを設けてもよい。

容器１１の長手方向の側壁１１ｃには、等間隔隔てて一列に並ぶように形成された複数の孔が形成され、これらの孔を貫通するようにノズル群１５が取り付けられている。ノズル先端どうしの間の距離は、０．５μｍ〜４０μｍ程度になるようにするのが好ましいが、ノズルから吐出された液体が回折格子として機能する間隔であればよい。
ノズル群１５のそれぞれのノズルは、粒子を含む試料液体を供給する供給流路１７に接続されている。供給流路１７にはバルブ１８が取り付けてあり、バルブ１８の開閉制御によりノズル群１５の先端から適量の試料液体が吐出するようにしてある。

光源１２は、容器の底面１１ｄから容器内の液体に照射されるようにしてある。光源１２は、測定対象となる液体試料に応じて種類を選択すればよいが、例えば、Ｈｅ−Ｎｅレーザ光源（波長６３３ｎｍ）や、その他のレーザ光源を用いるのが好ましい。
レンズ光学系１９は、光源光を収束して、容器内における回折格子が形成される格子状領域に照射されるように調整してある。

検出器１３は、透過回折光を検出するときは容器の上面１１ｅ側に配置する。入射角は、容器底面１１ｄと液体試料との界面で全反射が生じない条件であればよく、例えば、入射角０度で入射させてもよい。検出器１３には、回折角を測定するための角度調整機構が設けられており、回折光の強度とともに回折角が検出できるようにしてある。この検出器１３には、フォトダイオードやＣＣＤが用いられる。なお、角度調整機構を設ける代わりに、複数の素子を並べたアレイセンサを用いて、回折角が計測できるようにしてもよい。
反射回折光を検出するときは、検出器１３を容器の底面１１ｄ側に配置する。

次に、上記装置による計測動作について説明する。バルブ１６を開いて、新しい希釈液(第１液体）を容器１１内に供給し、バルブ１６を閉じ、容器内の希釈液の流れがなくなって安定するの待つ。光源１２から入射光を照射し、以後、検出器１３により、透過光または反射光の経時変化を検出する。検出器１３は、予め予備試験により、回折光が検出できる角度に調整しておく。

続いて、バルブ１８を短時間開いてノズル群１５先端から粒子を含む試料液体（第２液体）を吐出する。
吐出直後の容器１１内には、希釈液体と試料液体とが交互に並んだ格子が形成され、回折格子領域が生じている。このとき、検出器１３は、回折光を検出することになる。
その後、液中の粒子が拡散することにより、希釈液体と試料液体とが混ざり合うにつれて、格子状態が崩れていく。これに伴い、検出器１３により測定される回折光強度が減衰する。この減衰曲線をモニタする。以上により１回の測定サイクルが終了する。続いて、バルブ１６を開いて、次回測定のための希釈液を供給するとともに、容器１１内の液体を排出する。
以上の動作により得た減衰曲線に基づいて、粒子の拡散しやすさ、拡散係数、さらにはこれをもとに、粒径、粒形、結合状態に関する情報を評価する。

上述した実施形態では、入射光は底面１１ｄから入射するようにしているが、図２に示すように、入射光をノズル群１５が取り付けられた側壁１１ｃと対向する側壁１１ｆ側から入射し、同じく側壁１１ｆ側から反射回折光を測定するようにしてもよい。

なお、側壁１１ｆ側から入射光を導入する場合に、試料液体と希釈液とに起因する回折格子（液体回折格子と呼ぶ）の他に、ノズル群１５の先端部分が等間隔で並ぶことに起因する回折格子（ノズル回折格子と呼ぶ）が存在し、これらは同じ格子定数となるので、双方の回折格子により得られる回折光が混在することになる。これを防ぐために、図３に示すように、奇数番目または偶数番目のノズルは栓１５ａによりされたダミーノズル１５ｂとして用いることにより、ノズル群１５のうち、実際に試料液体を吐出する吐出ノズル１５ｃをひとつ飛ばしにしにして、２つの回折格子の格子定数を異ならせるようにして測定することにより、液体回折格子に起因する回折光を、ノズル回折格子に起因する回折光と分離してもよい。

（実施形態２）
図４は、本発明の他の一実施形態である光学的測定装置の概略構成図であり、図４（ａ）はその平面断面図（上部容器２４で切出した断面図）、図３（ｂ）はその正面断面図である。なお、図１と同じものは同符号を付すことにより説明を省略する。

この実施形態では、試料液体の吐出を行う手段にノズルに代えて、スリット２２を用いている。すなわち、容器２１は、供給流路１４ａが接続される側壁２１ａ、排出流路１４ｂが接続される側壁２１ｂ、容器２１の長手方向側壁２１ｃ、容器２１の底面２１ｄ、スリット２２が形成される上面２１ｅ、容器２１の長手方向側壁２１ｆ、の六面による直方体形状をなしている。このうち上面２１ｅの上には、スリット２２を覆う扁平な上部空間２３を形成する上部容器２４が形成されている。そして上部空間２３は試料液体を導入する供給流路２５が接続してあり、バルブ２６の開閉制御により試料液体が上部空間２３を経てスリット２２から容器２１内に吐出するようにしてある。この実施形態では、光源１２は、底面２１ｄからではなく、側壁２１ｃ側（あるいは側壁２１ｆ側でもよい）に配置する。検出器１３は、透過回折光を検出する場合は側壁２１ｆ側、反射回折光を検出する場合は側壁２１ｃ側に取り付ける。測定動作は実施形態１と同様であるので説明を省略する。

本発明は、電解質液などの液体中に含まれる粒子に関する情報を測定する光学的測定装置に利用することができる。

本発明の一実施形態である光学的測定装置の概略構成を示す概略断面図であり、図１（ａ）はその平面断面図、図１（ｂ）はその正面断面図。 図１の実施形態において光学系の配置を変更した変形実施形態を示す図。 図２の実施形態においてダミーノズルを用いた変形実施形態を示す図。 本発明の他の一実施形態である光学的測定装置の概略構成を示す概略断面図であり、図３（ａ）はその上部空間部分の平面断面図、図３（ｂ）はその正面断面図。

符号の説明

１１：容器
１２：光源
１３：検出器
１４ａ：供給流路
１４ｂ：排出流路
１５：ノズル群
１５ａ：栓
１５ｂ：ダミーノズル
１５ｃ：吐出ノズル
１６、１７：バルブ
２１：容器
２２：スリット群
２３：上部空間
２４：上部容器

Claims (5)

1. 第一液体を貯留する容器と、容器内の第一液体中に等間隔隔てて第二液体を並列に導入する並列導入口群と、並列導入口群から導入された第二液体と第一液体とが交互に並ぶことにより形成される格子状領域に向けて入射光を照射する光源と、格子状領域から出射される回折光を検出する検出器とを備え、回折光に基づいて第一液体または第二液体の少なくともいずれかに含まれる粒子に関する情報を測定することを特徴とする光学的測定装置。
2. 並列導入口群は、容器壁を貫通するように取り付けられるノズル群からなることを特徴とする請求項１に記載の光学的測定装置。
3. ノズル群は、第二液体を吐出する吐出ノズルと、第二液体が吐出しないダミーノズルとが交互に配置されることを特徴とする請求項２に記載の光学的測定装置。
4. 並列導入口群は、容器壁に形成されるスリット群からなることを特徴とする請求項１に記載の光学的測定装置。
5. 容器には、第一液体を供給する供給流路と、容器内の液体を排出する排出流路とが形成され、供給流路と排出流路の少なくとも一方にバルブが形成され、容器内の液体を排出流路から排出するとともに供給流路から第１液体を供給することにより、容器内の液体を交換することができるように構成されることを特徴とする請求項１に記載の光学的測定装置。