JP5199267B2 - ジンクフィンガータンパク質と原核生物の転写因子とを含む人工転写因子の製造、及びその利用 - Google Patents
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Description
ジンクフィンガードメインは、真核生物で最もよく見られるDNA結合タンパク質のDNA結合モチーフであって、酵母から高等植物及び人間に至る様々な種で見られる。ジンクフィンガードメインは、それ自体で遺伝子発現を抑制する転写リプレッサーとして作用することが知られている。従って、このようなジンクフィンガードメインにエフェクタードメイン(活性化又は抑制)を融合した場合、その融合タンパク質は、新しい転写因子であって、ジンクフィンガーが認識する標的遺伝子の発現を活性化又は抑制することができる。
一般に、原核生物の転写因子は、転写の活性化及び抑制の2つの機能を同時に有する。転写の活性化及び抑制の機能は、転写因子が結合するゲノム配列上の位置によって異なる。一般に、転写開始点から−80〜−30に転写因子が結合した場合は遺伝子発現を活性化し、−30より下流に結合した場合は遺伝子発現を抑制することが知られている。
様々なリンカーを使用して前記DNA結合ドメイン同士を連結し、又は前記DNA結合ドメインとエフェクタードメインとを連結することもできる。本発明は、自然界に存在するジンクフィンガータンパク質でジンクフィンガードメインを連結するリンカーを使用することができる。前記自然界に存在する典型的なリンカーとしては、Thr−Gly−(Glu−Gln)−(Lys−Arg)−Pro−(Tyr−Phe)がある。本発明においては、ジンクフィンガードメイン同士、並びにジンクフィンガードメインとエフェクタードメインとを連結するために、Thr−Gly−Glu−Lys−Pro−Tyrを利用することができる。
本発明においては、人工転写因子の遺伝子発現調節能力を確認するために、2つのレポータープラスミド、すなわち遺伝子発現の活性化を確認するためのレポータープラスミドpEGFP−Aと、遺伝子発現の抑制を確認するためのレポータープラスミドpEGFP−Rとが作成される。各レポータープラスミドは、大腸菌内因性(endogenous)転写因子の活性により、本発明の転写因子の能力が影響を受けるか否かを確認するために、大腸菌内因性転写因子であるlacIにより調節されるtacプロモータを利用して改変した。tacプロモータの改変は、各レポータープラスミドのtacプロモータの隣接領域に、本発明の試験転写因子が標的として結合できる配列5’−GCG GCG GGG−3’を挿入することにより完成した。すなわち、前述のように、原核生物の転写因子は、転写開始点からの結合位置によって能力(活性化又は抑制)が異なるので、転写開始点から適切な位置に試験転写因子の結合配列を挿入することにより、レポータープラスミドのプロモータを完成した。
本発明の転写因子の機能を確認するために、レポータープラスミド上の5’−GCG GCG GGG−3’配列を標的として認識することのできる試験ジンクフィンガードメインは、次のジンクフィンガードメインを利用して作成した。ジンクフィンガーとしては、5’−GCG−3’を認識するZFP1及び5’−GGG−3’を認識するZFP2を利用した。エフェクタードメインとしては、CRP W(配列番号1)、並びにCRP誘導体であるCRP Del 137(残基137−190、配列番号3)及びCRP Del 180(残基1−180、配列番号5)を利用した。融合した各エフェクタードメインによって3種類の試験転写因子を作成して、エフェクタードメインとしてCRP Wを利用した場合はZFP−CRP Wと命名し、エフェクタードメインとしてCRP Del 180を利用した場合はZFP−CRP Del 180と命名し、エフェクタードメインとしてCRP Del 137を利用した場合はZFP−CRP Del 137と命名した。前記転写因子は、N−末端からエフェクタードメイン−ZFP2−ZFP1−ZFP1、C−末端からなる(図2参照)。
遺伝子発現の活性化及び抑制を確認するための各レポータープラスミドとしては、pACYC184(New England Biolabs, Inc.、USA、図16)を改変して使用した。レポータープラスミドは、レポーター遺伝子としての向上した緑色蛍光特性を有するGFP誘導体(EGFP)遺伝子、tacプロモータ遺伝子、及び試験転写調節因子の標的認識配列をPCRで増幅し、pACYC184に挿入することにより作成した。遺伝子発現活性化を確認するためのレポータープラスミドであるpEGFP−Aは、転写開始点から−67〜−50領域に試験転写因子の標的配列である5’−GCG GCG GGG−3’を2コピー挿入することにより作成した(図3参照)。また、試験転写因子の遺伝子発現抑制能力を確認するためのレポータープラスミドとしてのpEGFP−Rのプロモータは、転写開始点から+24〜+41領域に試験転写因子の標的配列である5’−GCG GCG GGG−3’を2コピー挿入することにより作成した(図4参照)。pEGFP−Aレポータープラスミドの核酸配列は配列番号7であり、pEGFP−Rレポータープラスミドの核酸配列は配列番号8である。
本発明の転写因子の機能が、大腸菌(E.coli MG1655 K−12 Blattner laboratory)内因性転写因子であるlacIリプレッサーの影響を受けず、遺伝子の発現を人為的に活性化又は抑制できるか否かを確認するために、下記のような実験を行った。
ジェンバンク(GenBank)データベース検索結果から選別されたヒトゲノムの26種類のジンクフィンガードメインを合成し、pUC19(New England Biolabs. Inc.、USA、図17参照)にクローニングした。本発明者らは、転写因子発現プラスミドにエフェクタードメインとしてCRP誘導体であるCRP Del 137とCRP Del 180をそれぞれクローニングして融合したエフェクタードメインによって、2種類の異なる転写因子ライブラリーを作成した。転写因子ライブラリーの作成は前記試験転写因子の作成と同様の方法で行われた。すなわち、エフェクタードメインがクローニングされた発現プラスミドをAgeIとEcoRIで切断する。異なるジンクフィンガードメインがクローニングされたpUC19を同量で混ぜた後、XmaIとEcoRIで切断した。前記AgeIとEcoRIで切断された、エフェクタードメインがクローニングされた発現プラスミドと、前記XmaIとEcoRIで切断されたジンクフィンガードメインとを連結して、エフェクタードメインと1つのジンクフィンガードメインとからなるライブラリーを作成した。その後、上記と同様の方法で、エフェクタードメインと1つのジンクフィンガードメインがクローニングされた発現プラスミドをAgeIとEcoRIで切断し、XmaIとEcoRIで切断されたジンクフィンガードメインと連結して、第2のジンクフィンガードメインを連結した。最後に、上記と同様の方法で、3つのジンクフィンガードメインとエフェクタードメインとからなる転写因子ライブラリーを作成した。
Z1は配列番号13の核酸配列によりコードされている;
Z2は配列番号15の核酸配列によりコードされている;
Z3は配列番号17の核酸配列によりコードされている;
Z4は配列番号19の核酸配列によりコードされている;
Z5は配列番号21の核酸配列によりコードされている;
Z6は配列番号23の核酸配列によりコードされている;
Z7は配列番号25の核酸配列によりコードされている;
Z8は配列番号27の核酸配列によりコードされている;
Z9は配列番号29の核酸配列によりコードされている;
Z10は配列番号31の核酸配列によりコードされている;
Z11は配列番号33の核酸配列によりコードされている;
Z12は配列番号35の核酸配列によりコードされている;
Z13は配列番号37の核酸配列によりコードされている;
Z14は配列番号39の核酸配列によりコードされている;
Z15は配列番号41の核酸配列によりコードされている;
Z16は配列番号43の核酸配列によりコードされている;
Z17は配列番号45の核酸配列によりコードされている;
Z18は配列番号47の核酸配列によりコードされている;
Z19は配列番号49の核酸配列によりコードされている;
Z20は配列番号51の核酸配列によりコードされている;
Z21は配列番号53の核酸配列によりコードされている;
Z22は配列番号55の核酸配列によりコードされている;
Z23は配列番号57の核酸配列によりコードされている;
Z24は配列番号59の核酸配列によりコードされている;
Z25は配列番号61の核酸配列によりコードされている;
Z26は配列番号63の核酸配列によりコードされている。
前記実験例2で作成された転写因子ライブラリーを大腸菌に導入し、特定の条件下で所望の表現型を示す大腸菌を誘導して選別した。所望の表現型を示す大腸菌から転写因子を単離して確認した後、これを大腸菌に再導入して同一の表現型が誘導されるか否かを確認することにより、転写因子による特定の表現型の誘導を確認した。
高い温度での異種タンパク質(heterologous protein)の大量発現は、その溶解度を増加させる。従って、大腸菌において熱衝撃応答(heat shock response)に関する理解は、産業用微生物の開発において重要な課題である。1つの態様においては、転写因子ライブラリーを大腸菌に導入し、エフェクタードメインとしてCRP Del 180を利用して作成した人工転写因子が導入された大腸菌を、55℃で2時間熱衝撃を加え、LBプレートにプレーティングし、37℃で培養した。培養後に成長したコロニーから熱抵抗性を有する大腸菌を選別した。
T1=CRP 1〜180a.a+Z23+Z11+Z19
T2=CRP 1〜180a.a+Z13+Z2+Z23
T3=CRP 1〜180a.a+Z9+Z4+Z11
3−2.向上した成長速度を有する形質転換大腸菌の誘導
宿主細胞の速い成長速度は生産性を向上させるので産業的に非常に有用である。従って、本発明においては、エフェクタードメインとしてCRP Del 180を利用し、前記実験例2で作成された転写因子ライブラリーを導入して、最適な成長温度である37℃で向上した成長速度を有する大腸菌を誘導、選別した。
前述のように、本発明の人工転写因子のDNA結合ドメインであるジンクフィンガータンパク質は、真核細胞だけでなく、原核細胞においても活性を示すことを確認することができ、また本発明の人工転写因子のエフェクタードメインとして利用したCRPの場合、シゲラのCRPと同じ配列を有し、様々な原核細胞にそのようなファミリータンパク質が存在するので、大腸菌だけでなく、様々な原核細胞で遺伝子の発現を調節することにより、様々な表現型を誘導できると期待される。
低い温度での標的タンパク質の過剰発現はタンパク質の溶解度及び安定性を向上させるので、低温抵抗性を有してよく成長する大腸菌は産業用微生物として大きな価値がある。従って、低温衝撃に対する抵抗性を有する形質転換大腸菌を誘導するために、下記のような実験を行った。本実験においては、エフェクタードメインとしてCRP Del 180を利用し、前記実験例2で作成された転写因子ライブラリーを導入して、低温でも成長が可能な大腸菌を誘導、選別した。
CT1=CRP 1〜180a.a+Z19+Z6+Z22
CT2=CRP 1〜180a.a+Z15+Z4+Z2
3−4.浸透圧抵抗性(高塩濃度に対する抵抗性)を有する形質転換大腸菌の誘導
発酵時に過度な熱の発生を伴う浸透圧の増加は、微生物における標的タンパク質の発現時にその生産性を阻害する。従って、浸透圧抵抗性を有してよく成長する大腸菌は産業用微生物として非常に有用である。本実験においては、浸透圧抵抗性を有する大腸菌を選別するために、高塩濃度の0.6M Naclが添加された最小A培地(10.5g/lのK2HPO4、4.5g/lのKH2PO4、1g/lの(NH4)2SO4、0.5g/lのクエン酸ナトリウム2H2O、10ml/lの20%のグルコース、1ml/lの1M MgSO47H2O)を利用した。エフェクタードメインとしてCRP Del 180を利用し、前記実施例2の転写因子ライブラリーを大腸菌XL1−Blue(Sambrook and Rusell、2001)に導入し、プレーティングし、37℃で培養し、成長したコロニーから浸透圧抵抗性を有する大腸菌を選別した。選別された大腸菌から転写因子を単離し、DNA配列分析により転写因子を確認し、これを再導入し、浸透圧抵抗性が誘導されるか否かを確認することにより、転写因子の活性を確認した。
OT1=CRP 1〜180a.a+Z24+Z2+Z2
OT2=CRP 1〜180a.a+Z8+Z4+Z19
OT3=CRP 1〜180a.a+Z5+Z23+Z17
OT4=CRP 1〜180a.a+Z9+Z24+Z23
Claims (19)
- 1つ〜3つのジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、大腸菌のCRP(カタボライト制御タンパク質)とを含む人工転写因子ポリペプチドであって、
前記CRPが、配列番号1の核酸配列によりコードされている野生型CRP(CRP W)、配列番号3の核酸配列によりコードされているCRP Del 137、及び配列番号5の核酸配列によりコードされているCRP Del 180、から成る群から選択され;
前記ジンクフィンガードメインが下記のジンクフィンガードメインからなる群:
Z1:配列番号13の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z2:配列番号15の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z3:配列番号17の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z4:配列番号19の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z5:配列番号21の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z6:配列番号23の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z7:配列番号25の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z8:配列番号27の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z9:配列番号29の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z10:配列番号31の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z11:配列番号33の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z12:配列番号35の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z13:配列番号37の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z14:配列番号39の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z15:配列番号41の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z16:配列番号43の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z17:配列番号45の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z18:配列番号47の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z19:配列番号49の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z20:配列番号51の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z21:配列番号53の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z22:配列番号55の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z23:配列番号57の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z24:配列番号59の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z25:配列番号61の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
Z26:配列番号63の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメイン、
から選択されたものであり、
遺伝子発現を人為的に活性化又は抑制する人工転写因子ポリペプチド。 - 遺伝子発現を活性化するために、転写開始点から−67〜−50領域に結合している、請求項1に記載の人工転写因子ポリペプチド。
- 遺伝子発現を抑制するために、転写開始点から+24〜+41領域に結合している、請求項1に記載の人工転写因子ポリペプチド。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の人工転写因子ポリペプチドが導入されて形質転換された大腸菌。
- 前記大腸菌が、熱抵抗性、低温抵抗性、浸透圧抵抗性又は向上した成長速度を有するものである、請求項4に記載の形質転換された大腸菌。
- Z13、Z2、及びZ23のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号5の核酸配列によりコードされているCRP Del 180とを含み、
Z13が配列番号37の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;
Z2が配列番号15の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;そして
Z23が配列番号57の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインである、
熱抵抗性を誘導する人工転写因子ポリペプチド。 - Z23、Z11、及びZ19のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号5の核酸配列によりコードされているCRP Del 180とを含み、
Z23が配列番号57の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;
Z11が配列番号33の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;そして
Z19が配列番号49の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインである、
熱抵抗性を誘導する人工転写因子ポリペプチド。 - Z9、Z4、及びZ11のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号5の核酸配列によりコードされているCRP Del 180とを含み、
Z9が配列番号29の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;
Z4が配列番号19の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;そして
Z11が配列番号33の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインである、
熱抵抗性を誘導する人工転写因子ポリペプチド。 - 請求項6〜8のいずれか1項に記載の人工転写因子ポリペプチドが導入されて熱抵抗性を誘導する形質転換大腸菌。
- Z26及びZ7のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号5の核酸配列によりコードされているCRP Del 180とを含み、
Z26が配列番号63の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;そして
Z7が配列番号25の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインである、
向上した成長速度を誘導する人工転写因子ポリペプチド。 - 請求項10に記載の人工転写因子ポリペプチドが導入されて向上した成長速度を有する形質転換大腸菌。
- Z19、Z6、及びZ22のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号5の核酸配列によりコードされているCRP Del 180とを含み、
Z19が配列番号49の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;
Z6が配列番号23の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;そして
Z22が配列番号55の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインである、
低温抵抗性を誘導する人工転写因子ポリペプチド。 - Z15、Z4、及びZ2のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号5の核酸配列によりコードされているCRP Del 180とを含み、
Z15が配列番号41の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;
Z4が配列番号19の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;そして
Z2が配列番号15の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインである、
低温抵抗性を誘導する人工転写因子ポリペプチド。 - 請求項12又は13に記載の人工転写因子ポリペプチドが導入されて低温抵抗性を誘導する形質転換大腸菌。
- Z24、Z2、及びZ2のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号5の核酸配列によりコードされているCRP Del 180とを含み、
Z24が配列番号59の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;そして
Z2が配列番号15の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインである、
浸透圧抵抗性を誘導する人工転写因子ポリペプチド。 - Z8、Z4、及びZ19のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号5の核酸配列によりコードされているCRP Del 180とを含み、
Z8が配列番号27の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;
Z4が配列番号19の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;そして
Z19が配列番号49の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインである、
浸透圧抵抗性を誘導する人工転写因子ポリペプチド。 - Z5、Z23、及びZ17のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号5の核酸配列によりコードされているCRP Del 180とを含み、
Z5が配列番号21の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;
Z23が配列番号57の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;そして
Z17が配列番号45の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインである、
浸透圧抵抗性を誘導する人工転写因子ポリペプチド。 - Z9、Z24、及びZ23のジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとしての、配列番号5の核酸配列によりコードされているCRP Del 180とを含み、
Z9が配列番号29の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;
Z24が配列番号59の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインであり;そして
Z23が配列番号57の核酸配列によりコードされているジンクフィンガードメインである、
浸透圧抵抗性を誘導する人工転写因子ポリペプチド。 - 請求項15〜18のいずれか1項に記載の人工転写因子ポリペプチドが導入されて浸透圧抵抗性を有する形質転換大腸菌。
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