JP5184642B2 - Ｄｎａ検出装置、及びｄｎａ検出デバイス、並びにｄｎａ検出方法 - Google Patents

Ｄｎａ検出装置、及びｄｎａ検出デバイス、並びにｄｎａ検出方法 Download PDF

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Description

本発明は、ＤＮＡ検出さらにはＤＮＡ塩基配列決定の装置およびデバイスならびに方法に関するものであり、検出には化学発光を用いることを特徴とする装置、デバイス、方法に関するものである。
ＤＮＡ塩基配列決定にはサンガー法を基本にしてゲル電気泳動と蛍光検出を用いた方法が広く用いられている。この方法ではまず、配列解析を行おうとするＤＮＡ断片のコピーを多数作製する。これらを鋳型としてＤＮＡの５’末端を始点として種々の長さの蛍光標識断片を相補鎖合成により作製する。このときに少量の蛍光標識ターミネータ（擬似塩基）を相補鎖合成の基質である４種の核酸に加えることにより、種々の長さを持ち３’末端の塩基種に応じて波長の異なる蛍光標識を持ったＤＮＡ断片群を作製する。これらをゲル電気泳動により長さの違いを１塩基の差で識別し、それぞれの断片が発する発光を検出する。発光波長色から測定中のＤＮＡ断片のＤＮＡ末端塩基種を知る。ＤＮＡは短い断片から順次蛍光検出部を通過するので、蛍光色を計測することで短いＤＮＡから順に末端塩基種を知ることができる。これにより、配列決定をする。このような蛍光式ＤＮＡシーケンサーは幅広く普及しており、また、ヒトゲノム解析にも大いに活躍した。この方法では、内径５０μｍ程度のガラス細管を、多数本用い、さらに末端検出等の方法を利用し、一台あたりの解析処理数を増加させる技術が開示されている（例えば、非特許文献１参照）。
また、パイロシーケンシングに代表される段階的化学反応による配列決定法（例えば、特許文献１及び２参照）が、取り扱いの簡便性から最近注目されている。概略は以下の通りである。ターゲットとするＤＮＡ鎖にプライマーをハイブリダイズさせ、４種の相補鎖合成核酸基質（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を１種類ずつ順番に反応液中に加えて相補鎖合成反応を行う。相補鎖合成反応が起きるとＤＮＡ相補鎖が伸長し、副産物としてピロリン酸（ＰＰｉ）が生成する。ＰＰｉは共存する酵素の働きでＡＴＰに変換され、ルシフェリンとルシフェラーゼの共存下で反応して発光を生じる。この光を検出することで加えた相補鎖合成基質がＤＮＡ鎖に取り込まれたことがわかり、相補鎖の配列情報、従って、ターゲットとなったＤＮＡ鎖の配列情報がわかる。
この方法は、多くの反応セルを具備したフローセルを用いることにより多数のＤＮＡ断片の同時配列解析すなわち高スループット化が可能であるが、当該方法を応用して解析処理数を格段に増加させた例が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。この応用例では、複数の微小反応セルを平面状に並べた反応プレートを持ったフローセルが用いられている。報告例ではターゲットＤＮＡ鎖を種類毎に直径約３５μｍのセファロース製ビーズに固定したものが多数用意されて解析されている。各セファロースビーズには約１０８個の同じ種類のＤＮＡが固定されている。これらＤＮＡにプライマーをハイブリダイズさせた後、各反応セルに最大１種類のＤＮＡが固定されるように１個ビーズを入れる（ＤＮＡの種類が１種類であればビーズは複数でも良い）。また、化学発光検出用酵素（ルシフェラーゼおよびＡＴＰスルフリラーゼ）を固定した直径２．８μｍのマイクロビーズを反応セルに、充填している。これらのビーズの充填は、ビーズ含有溶液をフローセルに導入して、遠心器により沈降させることにより実施している。
ここで、非特許文献２に記載の装置について、図２を用いてより具体的に説明する。図２は、従来例（非特許文献２）による多くの反応セルを具備したフローセルの断面図を示している。図２の１０１は化学発光反応用のプレートであり、その表面に反応セル１０２を複数形成してある。この反応セル１０２の内部に配列解析対象となるＤＮＡを固定化したビーズ１０３を１つの反応セルに１つ入るようにしている。非特許文献２ではこのビーズ１０３に直径３４μｍ程度のセファロースビーズを用いて、反応セル１０２の直径を４４μｍとすることによって、１つの反応セルにビーズが１つしか入らないようにしている。さらに、化学発光用酵素（非特許文献２の場合にはルシフェラーゼとＡＴＰスルフリラーゼ）をその表面に固定した直径２．８μｍのマイクロビーズ１０４をＤＮＡ固定ビーズ１０３と一緒に遠心装置を使って反応セル１０２に充填する。次に、化学発光を測定するために透明な窓の領域を持つ上板１０５をプレート１０１と一定の隙間（０．３ｍｍ程度）を設けて対向させて固定する。この隙間は試薬のための流路となり、４種の相補鎖合成に必要な核酸基質と化学発光に必要な基質（ルシフェリンやＡＰＳ（Adenosine 5’-phosphosulfate））を逐次流すことによって相補鎖合成反応とこれに付随する化学発光反応を起こし、反応セル１０２内からの発光をＣＣＤなどの撮像素子で計測する。
ＤＮＡ塩基配列解析では、フローセル上流より、伸長反応用の４種の相補鎖合成核酸基質（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を逐次導入し、相補鎖合成反応を行う。相補鎖合成反応が進行した場合にはＰＰｉが生じ、ＡＴＰに変換され、ルシフェラーゼ反応を行うが、その際に生じる化学発光を観測している。このような反応セルを多数用い、化学発光や蛍光を検出する装置は幾つか報告されている。例えば、ビーズにＤＮＡを固定する代わりに、光ファイバプレートの１端面にＤＮＡプローブを固定し、環状核酸鋳型（Circular nucleic acid templates）と結合させ、化学発光により配列決定や多型解析を行う例（例えば、特許文献２参照）や、また、上記光ファイバプレートをエッチングしてファイバの中心部を取り除いて反応セルを作製して、ピコタイタプレート（以下、「プレート」と略記する）を構成し、フローセルの一部に利用した例がある（例えば特許文献３参照）。さらに、このプレート内の個々の反応セル内で、生成する物質、具体的にはＰＰｉなどの、横方向への拡散によるコンタミネーションの減少を図るためのメンブレン等を付加したプレートが、例えば特許文献４に開示されている。
また、化学発光検出用酵素をゲルの中に固定化する方法は非特許文献４及び５に示されている。また、光の照射によってゲル化する光反応性ポリマー材料として非特許文献６に光反応性ポリビニルアルコールが開示されている。
さらに、化学発光検出用酵素として、ＡＴＰスルフリラーゼの代わりに、ＰＰＤＫ(Pyruvate Orthophosphatase Dikinase)を用いてパイロシーケンシングを行う例が非特許文献７に開示されている。
国際公開パンフレット第９８／２８４４０号公報 国際公開パンフレット第０１／０２００３９号公報 国際公開パンフレット第０３／００４６９０号公報 特表２００３−５１５１０７号公報
Anal. Chem., Vol. 72, 2000反応セル pp. 3423-3430 Margulies M, et al., "Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.", Nature, Vol.437, Sep.15; 2005, pp.376-80及びSupplementary Information s1〜s3 Electrophoresis, Vol. 24, 2003, pp. 3769-3777 Kunio Ohyama, Kaoru Omura, Yoshihiro Ito, Allergology International, Vol. 54, 2005, pp. 627-631 Yoshihiro Ito, Hirokazu Hasuda, Makoto Sakurgi, Saki Tsuzuki, Acta Biomaterialia,Vol. 3(6), 2007, pp. 1024-1032 Yohshihiro Ito, Masayuki Nogawa, Mineko Takeda, Toru Shibuya, Biomaterials, Vol. 26, 2005, pp. 211-216 G. Zhou, T. Kajiyama, M. Gotou, A. Kishimoto, S. Suzuki and H. Kambara, Anal. Chem. Vol. 78(13), 4482 (2006)
反応セルを多数備えた化学発光検出を用いたＤＮＡ検出装置では撮像素子にプレート上の反応セルから出る発光信号を集光して観測する。この場合、一つの装置で計測できるビーズ数を増やした方が低コストでスループット（一度に計測できる配列決定できる遺伝子数）を向上することができる。これを実現するために、光学系の倍率を適切に設定し、ビーズと画素を１対１に設定することができればスループットは向上させることができる。
しかし、反応セルからの化学発光の撮像素子への集光効率は倍率の２乗に逆比例して低下するため、大幅な感度低下を招く。最も効率よく光を計測するためには、レンズ系は等倍（＝１倍）にすることが最善である（ラグランジュの法則から、幾何光学系を用いて発光密度を向上することはできないことが知られている）。
また、読み出しノイズは画素数に比例するため、光学系の倍率を１対１にしたまま、１つのビーズを結像する画素数をできるだけ少なくした方が読み出しノイズを低減できる。
しかし、実際には、実用的な画素サイズが数ミクロン（３−１０ミクロンが実用的）と小さい。非特許文献２に開示されている反応セルの直径は４４μｍと大きいため、光学系の倍率を１倍とすると、反応セルと画素のピッチを一致させて、反応セルと画素を１対１に対応させて計測するには、画素を大きくするか、あるいは反応セルを小さくしなければならない。
画素数を一定にし、画素を大きくして上記１対１を実現することによってビーズの数を増やすと、スループットは向上できるが、撮像素子のチップ面積が大きくなり、製造コストが高くなるのに加えて、暗電流ノイズ（サーマルノイズ）も大きくなり性能が低下するので実用的でない。
そこで、反応セル及びＤＮＡを固定するビーズのサイズを小さくすることが望まれている。ただし、実用的な画素サイズは数ミクロンに適合した反応セルのサイズは直径６μｍ程度であり、用いるビーズの直径も高々５ミクロン程度となる。このようなビーズには十分量のＤＮＡを表面に保持することはできないので、検出感度が不十分であるという問題がある。また、より大きな反応セルを用いた場合にも、精度の高い信号を選るには信号強度の向上が必要である。
検出感度を向上させるためには反応セルにおける単位体積（ビーズを除く体積）あたりの酵素活性を向上させることが有効である。その理由は次のとおりである。すなわち、反応セル中のＤＮＡ固定ビーズの直径を１／ｐ（ｐ＞１）にしたとき、ＤＮＡ固定ビーズ上のＤＮＡ分子数は１／ｐ２に比例して小さくなるが、一方、酵素固定ビーズの充填される体積は１／ｐ３に比例して小さくなる。すなわち、酵素活性が相対的に低下してしまう。従来のＤＮＡ固定ビーズのサイズで酵素活性に余裕があれば問題ないが、実際には、従来のＤＮＡ固定量が少ない（１０６分子／ビーズ程度）場合でも酵素量に比例して活性が低下する状況にある。すなわち、ＤＮＡ固定ビーズを小さくするためには、大幅な単位体積あたりの酵素活性の向上が必要であることが分かる。
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、各反応セルにおける単位体積当たりの酵素活性を向上させ、化学発光の検出感度を十分に確保することを可能にするＤＮＡ検出デバイス、及びそれを備えたＤＮＡ検出装置、並びにＤＮＡ検出方法を提供するものである。
まず、検出感度に影響を与える因子について整理・考察すると、その因子には１）検出系の受光効率、２）検出素子の性能、３）ターゲットとなるビーズに固定されたＤＮＡの数、４）相補鎖合成反応で生じるＰＰｉを用いた発光酵素反応の効率向上、などがある。
つまり、これらの因子について改善すれば化学発光の検出感度を向上させることができるが、これら因子の内、１）および２）は結像光学系を１：１とし、高感度の冷却ＣＣＤあるいは電子増幅機能付きのＣＣＤを用いることで対応できる。また、３）ビーズ表面に固定されたＤＮＡの個数は表面積従ってビーズの直径でほぼ決まる。表面をポリマーブラシで覆ったり、表面を荒らして実行面積を上げるなどにより固定できるＤＮＡ量を何割か増やすことができる。
従って、より検出効率を向上させるには、４）相補鎖合成反応で生じるＰＰｉを用いた発光酵素反応の効率向上が重要となってきる。なお、ここで使用している酵素反応は実施例で詳しく述べるようにサイクル反応である。すなわち、相補鎖合成反応で生じたＰＰｉはＡＴＰに変換され、ルシフェラーゼ反応により光を出す。副産物としてＰＰｉが再度生成する。これらは再びＡＴＰに変わり発光反応に寄与するのであるが、単位体積あたりの酵素反応の効率（活性）が低いと共存する分解酵素により分解されてしまう。酵素濃度を上げてこの発光サイクルを何度も回したいところであるが、酵素溶液を反応セルに加えたのでは反応基質の入れ替えに伴う洗浄工程で酵素自体が失われてしまう。
一方、従来例のようにビーズに固定した酵素を充填するとビーズ表面にだけ酵素を保持するので３次元的に見ると酵素の密度をあまり上げられない難点がある。そこで、本発明では、酵素を溶液上として効率よく反応セルに入れると同時に、それらが洗浄工程で流失しないようにゲルマトリックスを用いて従来例の課題を克服する。すなわち、上記４）について改良することで１桁以上の感度アップを達成することができる。
より具体的には、装置のフローセル部分の構成において、プレート１０１上に反応セル１０２を形成し、その中にＤＮＡ固定ビーズ１０３を充填する。その上から、酵素と光反応性ポリマーを混合した試薬を滴下後、スピンコートして、図１の１０６のようにポリマー充填部分を形成する。その後、反応セル中の酵素活性の低下が余り起きない程度に一定時間乾燥させ、その後、紫外線を照射することによって光反応性ポリマー充填部分をゲル化させる。反応セル中でゲル化させることによって、表面付近のみが十分硬化していれば、酵素の流出を抑制することができた。これによって、マイクロビーズ表面に固定していた場合に比べて、数十倍の酵素活性を得ることができた（実施例１参照）。これを実現できるのは、ゲルを充填すべき領域が反応セルの内部だけであるため、ゲルの強度が十分でなくても形がくずれて、ゲルが流出してしまうということがないからである。反応セルのみにゲルを充填するために、光硬化する前に、スピンコーターを使って、反応セル以外の領域の光反応性ポリマーを取り除くことによって実現できる。
次に、酵素をマイクロビーズ表面に固定するのではなく、ゲルに酵素を固定することによって単位体積あたりの酵素活性がどの程度向上し得るかを説明する。マイクロビーズに酵素を固定した場合、最大でも８ｎｍ四方の領域に１分子しか固定できない。よって直径２．８μｍのマイクロビーズ上には４×１０５分子の酵素を固定することができる。
一方、反応セル中でビーズを充填できる体積は１５ｐＬである。最密充填（７４％）でビーズを詰めることが出来たと仮定すると、反応セル中には約１０００個のビーズを詰めることができる。それゆえ４×１０８個の酵素分子が反応セル内部に固定される。一方、本発明の構成では、酵素濃度が分子量６００００のルシフェラーゼが２０ｍｇ／ｍＬの濃度の光反応性ポリマー溶液を準備できるので、反応セル中の酵素分子数は３×１０９とすることができる。
よって、反応セル中の酵素数を約１桁向上できることが分かる。マイクロビーズ表面に酵素を固定される場合には固定化の向きによって活性が維持できない場合があるため、さらに活性に差が生じているものと考えられる。他の酵素の固定についても同様であることは言うまでもない。
以上をまとめると、上記課題を解決するために、本発明によるＤＮＡ検出装置は、複数の反応セルからの化学発光を検出してＤＮＡ検出又はＤＮＡ分析するＤＮＡ検出装置であって、表面に複数の反応セルを１次元または２次元に配列したプレートを有するフローセルと、複数の画素を有し、化学発光を検出する光検出手段と、を有する。そして、反応セルには、それぞれ最大１種類のＤＮＡを固定した１個または複数個のビーズ、及び少なくとも化学発光検出に必要な酵素を含むゲルが充填される。ここで、反応セルに充填されたゲルは、反応セルの開口部において光照射によってゲル化され固化している。また、ゲルに含まれる酵素がルシフェラーゼを含んでいる。さらに、反応セルに充填されたゲルは、光照射によってゲル化するポリマーにアジ基を含むものである。なお、反応セルは内部に凸構造を有し、ＤＮＡ固定ビーズは反応セルに１個のみ充填可能となっており、ゲルを充填できる領域が反応セルの内部に存在するようにしてもよい。
本発明によるＤＮＡ検出デバイスは、複数の反応セルからの化学発光を検出するために用いられるＤＮＡ検出デバイスであって、表面に前記複数の反応セルを１次元または２次元に配列したプレートを有するフローセルを備えている。そして、反応セルには、化学発光の検出に必要な酵素を含むゲルが充填され、ゲルが充填された状態で反応セルの内部でゲルの充填部分よりも、反応セルの開口部に近い部分に、ＤＮＡを固定したビーズを充填するための空隙（凹部）が残されている。なお、プレートに形成された反応セルは、開口部が底面部よりも広いテーパ形状をなすようにしてもよい。
本発明によるＤＮＡ検出方法は、複数の反応セルからの化学発光を検出してＤＮＡ検出又はＤＮＡ分析するＤＮＡ検出方法であって、プレート上に１次元または２次元に配列した複数の反応セルにＤＮＡが固定されたビーズを充填する工程と、反応セル中に化学発光検出に必要な酵素を含む光反応性ポリマーを充填する工程と、光反応性ポリマーに光を照射してゲル化する工程と、反応セル上に発光反応に関連した試薬を導入して化学発光を起こさせ、この化学発光を検出する工程と、を有する。さらに、プレート上で反応セル以外の部分に残る光反応性ポリマーを除去する工程を備え、余分な光反応性ポリマーを除去した後に、光の照射によるゲル化の工程を実行する。
別の態様のＤＮＡ検出方法は、複数の反応セルからの化学発光を検出してＤＮＡ検出又はＤＮＡ分析するＤＮＡ検出方法であって、プレート上に１次元または２次元に配列した複数の反応セルに酵素を含む光反応性ポリマーを充填する工程と、光反応性ポリマーに光を照射してゲル化する工程と、ゲルが充填された状態で反応セルの内部でゲルの充填部分よりも、反応セルの開口部に近い部分の空隙部分（凹部）に、ＤＮＡが固定されたビーズを充填する工程と、反応セル上に試薬を導入して化学発光を起こさせ、この化学発光を検出する工程と、を有する。
上述のＤＮＡ検出方法においては、光反応性ポリマーを反応セルに充填する工程と、光を照射して光反応性ポリマーをゲル化する工程を複数回行うようにしてもよい。
さらなる本発明の特徴は、以下本発明を実施するための形態および添付図面によって明らかになるものである。
本発明によれば、酵素を反応セル中に３次元的に高密度で保持して酵素反応を効率よく行うことができるので、相補鎖合成により生じたＰＰｉをＡＴＰに変換して発光反応を行う反応及び発光反応の副産物として再度生成したＰＰｉを再びＡＴＰに変えて発光反応を繰り返し行うことができる。
また、酵素反応のサイクルを効率よく回して全発光量を格段に向上させることができるので、検出感度を向上することができる。その結果、小さなビーズに固定された少ないＤＮＡを用いてもビーズからの化学発光の検出あるいはＤＮＡ塩基配列決定を可能にする。
さらに、装置も反応セルと検出素子を１：１とするために小さな安価な装置で大量のＤＮＡ試料を並列して解析できるという利点もある。
本発明の実施例１におけるフローセル（検出デバイス）の断面図である。 従来技術におけるフローセルの断面図である。 本発明における化学発光検出システムの概略構成を示す図である。 フローセルの構成図である。 実施例１でのフローセル作製方法を示す図である。 パイロシーケンシング時の発光像例を示す図である。 パイロシーケンシングの実施結果例を示すグラフである。 従来法と本発明（実施例１）の化学発光強度の比を示すグラフである。 本発明の実施例２によるフローセルの断面図を示す図である。 実施例３における、ゲルをコートしたビーズの作成方法を示す図である。 実施例３によるフローセルの断面図を示す図である。 実施例４によるフローセルの断面図を示す図である。
本発明は、単位体積あたりの酵素活性を向上させるために、反応セル中にゲルを使って酵素を閉じ込めている。この際、反応セルからのゲルの流出を防止するために、ゲルの表面を硬化させる。
このゲル硬化に関し、非特許文献４及び５は、光反応性ポリマーをもちいて抗体等の蛋白質を固定化する方法を開示している。この方法は、ビーズ表面に固定する場合と異なり、マイクロビーズ内部のようなビーズが固定できない領域が存在せず、中の単位体積あたりに固定できる酵素分子数を多くすることが可能である。
非特許文献４及び５では、流路の内壁にゲルによる膜を形成し、その膜の中に酵素を閉じ込めている。この場合、光反応性ポリマーと酵素を混合してから、十分な乾燥を実行し、必要な強度の紫外光を十分長時間照射する必要がある。しかし、この乾燥と紫外光の照射は時間がながければ長いほど閉じこめた酵素の活性が低下してしまうという問題がある。その反面、乾燥と紫外光照射が十分でないと、硬化が十分でなく、ゲル膜が流路の内壁から剥がれて流れてしまうという問題がある。非特許文献６に記載の光反応性ポリマーを用いた場合も上記問題はある程度緩和するが、十分ではない。
本発明では、後述のように、反応セルという凹部にポリマーを充填し、セルの開口部表面のみをゲル化するので、紫外光の照射はポリマー全体がゲル化（硬化）するまで行う必要がない。そもそも非特許文献４乃至６の方法においては、反応セル内にゲルを充填するという着想自体がない。これは反応セルにゲル状の物質を充填すると試薬との反応が進まないという考えに基づいたものであった。
ところが、本発明者らは、光反応性ポリマーの表面をゲル化してもそのゲルのポアサイズが試薬の分子サイズよりも十分大きく、ルシフェラーゼやＰＰＤＫ等の酵素よりも十分に小さければ反応には問題ないことを見出したのである。
以下、添付図面を参照して本発明の実施例について説明する。ただし、本実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
（１）パイロシーケンスの概要
まず、本実施例で対象とするパイロシーケンシングの概要を説明する。図１はフローセルの断面図を示し、図３は装置全体の構成図を示している。
図１に示されるように、ターゲットとなるＤＮＡはビーズ１０３に固定され反応セル１０２に保持される。反応セル１０２中にはゲルマトリックス１０６に保持された酵素が含まれている。反応セルの上部は開口されており、反応基質が溶液状態で供給されるこれら反応基質溶液中にはＤＮＡ相補鎖合成反応の基質であるｄＮＴＰ、ＡＴＰ生成反応の基質であるＡＭＰ、及び発光反応の基質であるルシフェリンなどが含まれている。
ＤＮＡ試料にはプライマー及び相補鎖合成酵素が付いている。核酸基質ｄＮＴＰは４種類あるがこれらを順番に加えていく。１つの基質を加えた後で、ｄＮＴＰを分解する分解酵素アピラーゼを含む洗浄液で反応流路１０９及び反応セル１０２を洗浄し、前の反応基質を除去してから次の反応基質を加える。
加えた反応基質がＤＮＡ鎖に双補的な場合には、相補鎖合成が起こり、プライマーを基点とした相補ＤＮＡ鎖が一つ伸びて、副産物としてＰＰｉがでる。ＰＰｉはＰＰＤＫの働きでＡＭＰと反応してＡＴＰを生成する。ＡＴＰはルシフェラーゼの働きでルシフェリンと反応して発光反応をすると同時にＰＰｉとＡＭＰを副産物として生成する。ＰＰｉは再びＡＴＰ生成反応に使用される。
反応セル１０２内には分解酵素アピラーゼが微量共存している。アピラーゼが残存するｄＮＴＰを分解させる場合、ＡＴＰも分解する。これにより、不純物に起因したＡＴＰを分解したりして背景発光を押さえることができるが、実際のＤＮＡ相補鎖合成で生じたＡＴＰも分解してしまう。このため発光サイクル反応の回転は無限に続くわけではない。分解反応が起こる前に平均として多くの発光反応サイクルを回すことが必要となる。そのためには発光関連の酵素（ＰＰＤＫおよびルシフェラーゼ）を高密度で反応セルに保持することが重要である。これを実現するために、本発明ではゲルマトリックスを用いる。
また、ゲル溶液が充填された反応セル外にＤＮＡ固定ビーズが流れ出ないように、ビーズの比重はゲルよりも重いものを使用するとよい。具体的にはジルコニアビーズであるが、もちろん他の材料を使用しても良い。
（２）化学発光検出装置の構成
図３は、本発明による化学発光検出装置の概略構成を示す図である。化学発光検出装置は、プレート１０１上の反応セル１０２にＤＮＡ固定ビーズを充填し、その後に、反応セルのビーズ以外の領域を満たすように酵素を含む光反応性ポリマーを充填する。続いて、紫外光（波長３００ｎｍを含む）を照射することによってゲル化して酵素を固定する。これによって、マイクロビーズ上に酵素を固定しそれを反応セルに充填する従来例（非特許文献２）よりも、高密度に反応セル中に酵素を固定化することができ、ビーズ上のＤＮＡ分子数が少なくても塩基伸長に伴う化学発光を計測し、配列決定が実現できる。
図３において、化学発光検出装置は、プレート１０１上の反応セル１０２での化学発光を計測するシステムである。当該化学発光検出装置は、プレート１０１と対向する上板１０５と組み合わせて構成されるフローセル３０１と、フローセル内部に試薬を流し、反応セル内部に核酸によって試薬分子が導入されることによって起きる化学発光を画像データとして取得するための撮像用カメラ３０２と、カメラ内部の冷却ＣＣＤ素子などの撮像素子３０３上に反応セル１０２からの発光像を結像する光学系と、を備えている。
光学系としては、１倍の倍率で正立像を得ることができるタンデムレンズ系（２本のレンズの先端同士を合わせてつなぎ、２本とも無限遠に撮影距離を合わせて固定する）３０４を用いることができる。これにより、１倍の倍率を容易に実現し、発光を最も効率よく、撮像素子に集光することができる。
また、化学発光検出装置は、反応セル１０２に試薬を送液するシステムを具備する。すなわち、順次フローセルに試薬を分注するために４種の核酸基質（ｄＡＴＰ、ｄＧＴ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの４種類など）を各々収める試薬槽３０６〜３０９と、伸長反応測定後にフローセル内を洗浄するための洗浄試薬を収める洗浄試薬槽３１０と、洗浄後にセル内の洗浄試薬成分の残留を洗い流すためのコンディショニング試薬を収めるコンディショニング試薬槽３１１と、それらを選択的にフローセル側に注入するための注入部（選択バルブ３１２及び試薬をハンドリングするためのポンプ３１３）と、廃液ボトル３１４等を備える。
さらに、化学発光検出装置には、フローセル内部の試薬溶液の温度をパイロシーケンスに最適な温度に設定するために、ペルチェ素子３２０と、サーミスタとサーミスタで計測した温度を用いてペルチェ素子を制御するための温度コントローラが設けられている。また、撮像（ＣＣＤ）素子３０３の暗電流ノイズを低減するために、撮像素子３０３は−５７℃まで冷却されている。この冷却温度は化学発光の強度に応じて十分なＳＮ比が得られるように決定される。一方、ペルチェ素子３２０で制御するプレートの温度は、化学発光に最適な温度、ここでは例えば３７℃に設定する。この温度も使用する酵素によって異なるが、ポリメラーゼであるＫＦとルシフェラーゼの最適温度に設定している。
（３）フローセル（化学発光検出デバイス）の構造
次に、図４を用いて、化学発光の検出デバイスであるフローセル３０１の構造を説明する。フローセル３０１は、ＤＮＡ固定ビーズを保持するための複数の反応セル（凹部）１０２を表面に有するプレート１０１と、試薬流入口４０３と、試薬排出口４０４と、必要に応じて設けられる試料投入口を有する上板１０５と、流路を形成するスペーサ４０６とを備えている。
図１は、図４におけるフローセル３０１のＣＣ’での断面図を示している。図１で示されるように、試薬は上板１０５とプレート１０１の間に形成された流路１０９内を流れ、このとき反応セル１０２中に必要な試薬が供給される。供給された塩基によって伸長反応が起きたときに化学発光反応が起き、これを撮像素子にて検出する。このとき、解析対象となるＤＮＡを固定化したビーズ１０３は反応セル１０２に挿入され、かつ、反応セル１０２中に化学発光用酵素（ルシフェラーゼおよびＡＴＰスルフリラーゼまたはＰＰＤＫ）を含むゲル１０６が充填される。上記核酸基質などの試薬分子の拡散はゲル１０６を構成するポリマーの空隙を通して起こる。
（４）酵素入りゲルを含むフローセル作製方法（具体例）
ＤＮＡ固定化ビーズを、適量（本例では０．５ｍｇ（ビーズ約１６０００個））量り取り、ビーズ上のＤＮＡをポリメラーゼ（ＤＮＡ polymerase I exo-klenow）と確実に結合させるために、表１に記載のビーズインキュベーション試薬５０μＬの中に投入し、室温にてローテータで３分間反応させる。
この試薬の中のアピラーゼおよび、ＰＰａｓｅを、ビーズ表面やポリメラーゼ試薬中に、パイロシーケンス時に背景発光の原因となるＡＴＰやＰＰｉを分解するために混在させる。
次に、プレート１０１上に表２に記載の１×Ｃバッファ５０１を図５（ａ）のように滴下し、反応セル１０２内部の気泡を完全に脱気する。ここで、上記のＤＮＡ固定ビーズを図５（ａ）中の１×Ｃバッファ５０１に投入し、ジルコニアビーズの比重が６程度と大きいことを利用して反応セル内に沈降させる。反応セル１０２にうまく入らなかったＤＮＡ固定ビーズはフローセルを傾けることによってビーズを前後に移動させて、反応セル内にビーズを完全に挿入する。このときほぼ１００％の確率で反応セルにビーズが１つしか入らないことを確認した。
続いて、反応セル以外の余分な１×Ｃバッファを出来る限り取り除き、表３に記載の酵素を含むゲル用試薬５μＬと光反応性ポリマーである光反応性ポリビニルアルコール（化学式１）（東洋合成工業株式会社製ＢＩＯＳＵＲＦＩＮＥ(R)−ＡＷＰ）６％溶液１５μＬを混和し、図５（ｂ）のように滴下する。図中５０２が酵素入り光反応性ポリマー溶液である。
さらに、反応セル内部以外の光反応性ポリマーを除去するために、スピンコーターにてプレート１０１を５００ｒｐｍで５秒間、５０００ｒｐｍ程度３０秒間でスピンコートした。その結果、図５（ｃ）のように、反応セル１０２以外の平坦部分の光反応性ポリマー溶液をプレート外部へ飛散させることができる。これによって、紫外光照射による硬化前に必要な部分（反応セル内）にのみ酵素を含む光反応性ポリマーを充填することができる。
その後２分間乾燥させ、３６Ｗの紫外光を１．２分間照射し、反応セルの開口部の露出した光反応性ポリマーをゲル化して固化させる。これにより、反応セル１０２中に酵素を含むゲル１０６が充填された形を実現することができる。なお、直ちに、表２の１×Ｃバッファ５０１を滴下して過剰な乾燥による酵素の失活を抑制してもよい。
次に、上板１０５を取り付けてフローセルを形成し、流路１０９中の１×Ｃバッファを表４に記載のゲルインキュベーション試薬に置換して、３０分間インキュベートする。これは紫外光照射によって失活したポリメラーゼをビーズ上ＤＮＡに導入するためと、ゲル中に混入したＡＴＰやＰＰｉを分解するために行った。インキュベーションが終了したフローセルを図３に示した化学発光検出装置の所定の位置に取り付け、パイロシーケンスを実行する。
ここで、光反応性ポリマーは光反応性ポリビニルアルコール（化学式１）（東洋合成（株）製ＢＩＯＳＵＲＦＩＮＥ(R)−ＡＷＰ）を用いたが、他のポリマーを用いても良い。たとえば、特許文献６に記載の光反応性ＰＥＧ（化学式２）を用いてもよい。
これら２つの光反応性ポリマーはアジ基（Ｎ３）を含み、３００ｎｍ程度の紫外光の照射によって反応性の高いニトレンが生成される。このニトレンはＣＨ結合やアルケンをターゲットとして、ＣＨ挿入や付加環化によって反応し、ポリマー同士で反応し、ゲルを形成するだけなく、ポリマーと酵素やポリマーと樹脂製のプレート（反応セル内壁）とも反応し、酵素の流出やゲル全体の流出を抑制する。
しかし、これらの光反応性ポリマーも１０〜３０分程度の乾燥のプロセスがなければ、十分なゲル化を得られない。本構造は、フローセルに形成された凹み部分に光反応性ゲルが充填され、反応セル中で表面付近の光反応性ポリマーが十分ゲル化すれば、反応セル中に閉じ込められた酵素が流出することがないことを利用して、乾燥時間を３０秒〜２分と極端に短く設定している。これによって乾燥によってルシフェラーゼ等の酵素の失活を最小限に留めている。実際、１０分の乾燥ではルシフェラーゼ１〜２桁程度の活性の低下が見られた。
その他の光反応性ポリマーとしてポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（化学式３）と架橋剤としてビスアジド架橋剤を用いることもできるし、光重合ポリアクリルアミドゲルを用いることも可能である。
なお、上述のように、光反応ポリマーに紫外光を照射すると、アジ基による架橋反応によってポリマー同士が結合し、ゲル化する。また同時にルシフェラーゼやＰＰＤＫなどの酵素もアジ基と反応することによってポリマー分子と結合する。このとき、一部の酵素分子の中にはポリマーと結合しない酵素分子も存在する。しかし、ゲルのポアサイズが酵素分子と同程度若しくは小さくなるようにアジ基の割合と反応条件を決めることによって、酵素が外部に漏れないようにしている。一方、ＤＮＡの伸長反応を起こすために、ｄＮＴＰ拡散によってｄＮＴＰがビーズ表面付近に供給される。このときｄＮＴＰの分子サイズは酵素分子のサイズよりも十分小さいので、ゲルのポアサイズよりも十分に小さい。一般に、ポアサイズよりも小さい分子のゲル中での拡散速度は溶液中とほとんど変化がないことが知られている。実際、本実施例においても、従来技術と同様に微小セルの外部からゲルの膜を通してｄＮＴＰを供給してもＤＮＡの伸長反応が数秒から十数秒以内に完了し、十分な拡散速度でｄＮＴＰがゲル中を拡散していることが示唆される。
（５）微小反応セルの形状
微小反応セル２０１の形状は、例えば円柱状が好ましい。例えば、シリコンウエハーを用いてマスクとウエットエッチングにより製作したプレート、スライドガラス等のガラスを用いて粒子によるブラスタ加工で製作したプレート、及びポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン等を用いて金型の射出成型により製作したプレート等が使用可能である。ただし、これらは微小反応層の材料や製作法について制限するものではない。本実施例ではポリオレフィン製のプレートに反応セルを３９μｍ間隔で１１００００個射出成形によって形成した。
（６）発光像の例
図６に上記の化学発光検出装置で得られたＤＮＡ伸長（２塩基伸長）に伴う発光像を示す。発光スポットの一つがビーズ一つに対応し、ビーズ一つ一つからの発光を十分なコントラストで計測することが可能であることが分かる。
図７は、実際にパイロシーケンシングした例を示す図である。図７において、横軸はフローセルに流した塩基の種類を示し、ＡＣＧＴの順に順次試薬を導入したことを示している。図７の縦軸は最初の発光強度で規格化した発光強度である。配列決定に用いたＤＮＡの配列は、ＣＣＴＧＧＡＴＴＡＡＴＧＧＣＡＡＣＴＡＡＴ（配列表参照）である。なお、グラフの欄外も配列を記してある。
図７から分かるように、配列に一致する塩基がフローセルに導入されたときに連続する塩基に比例した強度で発光するこが確かめられ、ビーズに固定したＤＮＡのパイロシーケンシングが可能であることが確認できる。
図８は、従来方法との発光強度の比較を示す図である。図８の左側の棒グラフは非特許文献２に記載のマイクロビーズにルシフェラーゼとＡＴＰスルフリラーゼを最大量固定して一塩基伸長に伴う発光強度を測定したものである。真ん中の棒グラフは本発明の方法に従って、ルシフェラーゼとＡＴＰスルフリラーゼを固定して同様に発光強度を計測したものである。酵素固定の方法の改善によって図からわかるように３０倍以上の発光強度の向上が確認された。さらに、図８の右側の棒グラフに記したように、ＡＴＰスルフリラーゼの代わりにＰＰＤＫを用いることによって、さらに２倍の感度向上が図れることが分かる。なお、ＤＮＡ固定ビーズはどちらも同じジルコニアビーズを用い、ビーズ上には１０７分子のＤＮＡが固定された状態で測定したものである。
なお、ここで開示した方法を用いて、ビーズを小さくすることも可能であることも確認できる。以下にその詳細を示す。
ＤＮＡ固定ビーズは４．５μｍの磁気ビーズを用いている。ＤＮＡ分子数は１ビーズあたり、５×１０５分子である。フローセル上には直径６．５μｍの反応セルを１３μｍ間隔で１０４８５７６個配置し、画素数が１０２４×１０２４の電子像倍型ＣＣＤ素子の画素と１対１対応を実現する。光反応性ポリマーとしては、光反応性ポリビニルアルコール（化学式１）（東洋合成工業株式会社製ＢＩＯＳＵＲＦＩＮＥ(R)−ＡＷＰ）６％溶液１０μＬと表３に記載の酵素を含むゲル用試薬１０μＬを混和し、スピンコーターを使って塗布した。酵素を固定した光反応性ポリマーを塗布する条件は、５００ｒｐｍで５秒間、２５００ｒｐｍ程度で３０秒間である。これを用いて、上記と同様にフローセルを作製し、化学発光検出装置に設置して測定を行う。このときの試薬条件も上記と同様である。その結果、上記の２２μｍビーズを使った場合よりは、化学発光強度は４０分の１程度に低下したが、同様にＤＮＡの配列決定を実行することができた。
本実施例は、反応セル内へゲルを充填し、その後ＤＮＡ固定ビーズを挿入できるようにした例である。図９にフローセルの断面図を示す。
図９に示されるように、ポリオレフィンの射出成形にて反応セルが２次元に配列させている。このとき反応セル１０２の水平断面形状は円形であるが、入り口の直径が４５μｍと大きく底が５μｍと小さい円錐台の形状をなしている。ここで加工精度の問題から底部の直径を５μｍとしたが、これは０としてもよい。その場合には、反応セルの形は円錐台でなく円錐形状となる。反応セルの深さは６０μｍである。
この状態で光反応性ポリビニルアルコール（化学式１）（東洋合成工業株式会社製ＢＩＯＳＵＲＦＩＮＥ(R)−ＡＷＰ）６％溶液１５μＬと上記表３に記載の酵素を含むゲル用試薬５μＬを混和し、５００ｒｐｍで５秒間、５０００ｒｐｍで３０秒間スピンコートする。
その結果、図９に示すような形状に光反応性ポリマー溶液が塗布できた。その後２分間乾燥させ、３６Ｗの紫外光を１．２分間照射した。これによって、酵素を含むゲル層９０１が形成される。この状態で多数の酵素固定ゲル層９０１を形成したプレートを製造することができる。このプレートの凹部９０２の深さは、ＤＮＡ固定ビーズの直径と同程度（ビーズ直径の１倍から１．７倍程度）にすることによって各反応セル１０２に１つのＤＮＡ固定ビーズを充填することができる。
このゲル層を形成したプレートを用いてフローセルを構成し、実施例１と同様の装置でパイロシーケンスを実行することができる。本実施例でも光反応性ゲルに（化学式２）や（化学式３）に示したような他の物質を用いても良い。
本実施例による反応セル１０２に挿入されたビーズ１０３のゲルとの接触面積は上述の実施例１の場合と比べて少ないため、反応効率は劣るが、ゲルを充填した状態でユーザにフローセルを提供できるので、ユーザの実験準備における手間が減り、ユーザにとって使い勝手が良いものとなる。
本実施例は、ＤＮＡ固定ビーズをゲルで包みこむような形に形成し、このビーズを反応セル内に充填することによって、化学発光計測を行う例である。
深さ１ｍｍ程度の浅い樹脂性の容器１００１に光反応性ポリビニルアルコール（化学式１）（東洋合成工業株式会社製ＢＩＯＳＵＲＦＩＮＥ(R)−ＡＷＰ）６％溶液１００μＬと上記表３に記載の酵素を含むゲル用試薬１００μＬを混和した溶液（１００２）を満たす。ここにＤＮＡを固定したジルコニア製ビーズ１０２を投入し、図１０に示すように溶液からジルコニアビーズの一部が出るようにして、５００ｒｐｍで振動を加えながら１分間紫外光（３６Ｗ）を矢印で示したように斜めから照射することによって、ＤＮＡ固定ビーズ表面のみに厚さ５μｍ程度のゲル膜を形成する。
その後、この表面に酵素を含むゲルをコートしたビーズ１１０１をポリオレフィンで反応セルを２次元に配置したプレートに挿入する。挿入した状態を図１１に示す。ここではゲルをコートしたビーズの直径と同程度の深さの反応セルが形成されている。
このビーズとプレートを用いて実施例１と同様の装置でパイロシーケンスを実行することができる。なお、本実施例でも光反応性ゲルに化学式２や化学式３に示したような他の物質を用いても良い。
本実施例は、酵素を含むゲルを充填できる領域を増やした反応セルを用いることによって更なる感度向上を図った化学発光検出デバイスあるいは装置の例である。
樹脂製の反応セルの底の部分に直径５μｍ高さ１０μｍ程度の突起を設ける。反応セルの直径は、例えば３０μｍ、最も深い部分での深さは４０μｍ、中心付近の最も浅い部分は３０μｍとする。このような形状の反応セルを形成することによって、深い部分の深さを深くしても、直径２２μｍのＤＮＡ固定ビーズは１つしか充填されないようにすることができる。
このように、液体である光反応性ポリマーは充填することが可能でも球形のビーズが充填されないような１２０１のような領域を作ることによって、１つの反応セルに充填できるゲルの体積を増やすことができる。すなわち、反応セルあたりの化学発光に必要な酵素活性を向上させることができる。よって、反応セル外にピロリン酸（ＰＰｉ）が排出されるのを防止、或いは、排出されるピロリン酸の量を減少させることができる（ピロリン酸のロスを少なくすることができる）。
１０１ 反応セルを形成するプレート
１０２ 反応セル
１０３ ＤＮＡ固定ビーズ
１０４ 酵素を固定したマイクロビーズ
１０５ 検出窓を構成する上板
１０６ 化学発光用酵素を含むゲル
１０９ フローセルの流路
３０１ フローセル
３０２ カメラ
３０３ 撮像素子
３０４ 結像レンズ

Claims (15)

  1. 複数の反応セルからの化学発光を検出してＤＮＡ検出又はＤＮＡ分析するＤＮＡ検出装置であって、
    表面に前記複数の反応セルを１次元または２次元に配列したプレートを有するフローセルと、
    複数の画素を有し、化学発光を検出する光検出手段と、を有し、
    前記反応セルには、それぞれ最大１種類のＤＮＡを固定した１個または複数個のビーズ、及び少なくとも化学発光検出に必要な酵素を含むゲルが充填され、ここで、前記ゲルは、前記反応セルの開口部において光照射によってゲル化され固化していることを特徴とするＤＮＡ検出装置。
  2. 前記ゲルに含まれる酵素がルシフェラーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ検出装置。
  3. 前記反応セルに充填されたゲルは、光照射によってゲル化するポリマーにアジ基を含むことを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ検出装置。
  4. 前記反応セルは内部に凸構造を有し、ＤＮＡ固定ビーズは前記反応セルに１個のみ充填可能となっており、前記ゲルを充填できる領域が前記反応セルの内部に存在することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ検出装置。
  5. 複数の反応セルからの化学発光を検出するために用いられるＤＮＡ検出デバイスであって、
    表面に前記複数の反応セルを１次元または２次元に配列したプレートを有するフローセルを備え、
    前記反応セルには、前記化学発光の検出に必要な酵素を含むゲルが充填され、ここで、前記ゲルは、前記反応セルの開口部において光照射によってゲル化され固化しており、
    前記ゲルが充填された状態で前記反応セルの内部で前記ゲルの充填部分よりも、前記反応セルの開口部に近い部分に、ＤＮＡを固定したビーズを充填するための空隙（凹部）が残されていることを特徴とするＤＮＡ検出デバイス。
  6. 前記空隙の深さが前記ビーズの直径と同程度であることを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡ検出デバイス。
  7. 前記ゲルに含まれる酵素がルシフェラーゼを含むことを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡ検出デバイス。
  8. 前記反応セルに充填されたゲルは、光照射によってゲル化するポリマーにアジ基を含むことを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡ検出デバイス。
  9. 前記プレートに形成された前記反応セルは、開口部が底面部よりも広いテーパ形状をなしていることを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡ検出デバイス。
  10. 前記反応セルは内部に凸構造を有し、ＤＮＡ固定ビーズは前記反応セルに１個のみ充填可能となっており、前記ゲルを充填できる領域が前記反応セルの内部に形成されていることを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡ検出デバイス。
  11. 複数の反応セルからの化学発光を検出してＤＮＡ検出又はＤＮＡ分析するＤＮＡ検出方法であって、
    プレート上に１次元または２次元に配列した複数の反応セルにＤＮＡが固定されたビーズを充填する工程と、
    前記反応セル中に化学発光検出に必要な酵素を含む光反応性ポリマーを充填する工程と、
    前記光反応性ポリマーに光を照射してゲル化する工程と、
    前記反応セル上に発光反応に関連した試薬を導入して化学発光を起こさせ、この化学発光を検出する工程と、
    を有することを特徴とするＤＮＡ検出方法。
  12. さらに、前記プレート上で前記反応セル以外の部分に残る前記光反応性ポリマーを除去する工程を備え、
    余分な前記光反応性ポリマーを除去した後に、前記光の照射によるゲル化の工程を実行することを特徴とする請求項１１に記載のＤＮＡ検出方法。
  13. 前記光反応性ポリマーを前記反応セルに充填する工程と、前記光を照射して前記光反応性ポリマーをゲル化する工程を複数回行うことを特徴とする請求項１２に記載のＤＮＡ検出方法。
  14. 複数の反応セルからの化学発光を検出してＤＮＡ検出又はＤＮＡ分析するＤＮＡ検出方法であって、
    プレート上に１次元または２次元に配列した複数の反応セルに酵素を含む光反応性ポリマーを充填する工程と、
    前記光反応性ポリマーに光を照射してゲル化する工程と、
    ゲルが充填された状態で前記反応セルの内部でゲルの充填部分よりも、前記反応セルの開口部に近い部分の空隙部分（凹部）に、ＤＮＡが固定されたビーズを充填する工程と、
    前記反応セル上に試薬を導入して化学発光を起こさせ、この化学発光を検出する工程と、
    を有することを特徴とするＤＮＡ検出方法。
  15. 前記光反応性ポリマーを反応セルに充填する工程と、前記光を照射して前記光反応性ポリマーをゲル化する工程を複数回行うことを特徴とする請求項１４に記載のＤＮＡ検出方法。
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