JP5176234B2 - Target nucleic acid detection method - Google Patents
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Description
この発明は、検査対象の核酸と、標的核酸に基づいて設計された添加物を水溶媒に溶解させ、水溶液中に形成される分子集合体の形状を、顕微鏡を用いて観察することにより、標的核酸を検出する方法に関する。 In this invention, the nucleic acid to be examined and the additive designed based on the target nucleic acid are dissolved in an aqueous solvent, and the shape of the molecular assembly formed in the aqueous solution is observed using a microscope, thereby The present invention relates to a method for detecting a nucleic acid.
核酸は、生命の基本となる生体分子で、生体のさまざまな現象に関わる非常に重要な物質の一つであり、核酸を検出する技術の開発には大きな需要がある。
このような技術として、例えば、電気泳動法は、従来核酸を検出する方法として広く用いられてきた。この手法は、一般にゲルの調製やエチジウムブロマイドによる染色などが必要であり、結果が得られるまでに要する時間が長く、分析手順が煩雑である。また、染色試薬として使うエチジウムブロマイドは人体への発ガン性をもつ化合物であり、使用に危険がともなう。さらに、二重らせん構造をもたないＲＮＡや一本鎖の核酸を分析するこは一般的に困難であるとされる。
また、近年では固体表面上に数多くの核酸を固定化したＤＮＡチップが開発されている（非特許文献１など）。ＤＮＡチップにおいては、核酸への化学修飾工程が必須であり、分析手順が煩雑である。また、バックグラウンドノイズや基板への非特異的吸着により、再現性よく蛍光シグナルを得ることが問題となることが多い。ＤＮＡチップはそれ自体が高価である上に、蛍光標識試薬及びその専用検出器も非常に高価であるという問題点もある。
さらに簡便な方法として、金コロイドとＤＮＡの複合体の凝集を用いる核酸検出法が報告されている（非特許文献２など）。しかし、このような複合体による凝集では、標的核酸が複数の微粒子を架橋することで凝集が起こるため、標的核酸の複数の領域と結合する複数のＤＮＡ固定化金コロイドを合成しておく必要があり、プローブへの化学修飾と金コロイドを結合させるための化学合成工程が必要である。したがって汎用性がないのが現状である。
本発明者らは、既に開発した、二価又は三価の炭化水素鎖の分子端にヌクレオチドを有するハイドルゲル化剤（特許文献１）を、本発明に利用した。
Nucleic acids are biomolecules that form the basis of life, and are one of the very important substances involved in various phenomena in living organisms, and there is a great demand for the development of technologies for detecting nucleic acids.
As such a technique, for example, electrophoresis has been widely used as a conventional method for detecting nucleic acids. This technique generally requires gel preparation, ethidium bromide staining, etc., requires a long time to obtain a result, and the analysis procedure is complicated. In addition, ethidium bromide used as a staining reagent is a compound that has carcinogenicity to the human body and is dangerous to use. Furthermore, it is generally considered difficult to analyze RNA or single-stranded nucleic acid having no double helix structure.
In recent years, DNA chips in which a large number of nucleic acids are immobilized on a solid surface have been developed (Non-Patent Document 1, etc.). In a DNA chip, a chemical modification step for nucleic acid is essential, and the analysis procedure is complicated. In addition, obtaining a fluorescent signal with high reproducibility often becomes a problem due to background noise or nonspecific adsorption to the substrate. The DNA chip itself is expensive, and the fluorescent labeling reagent and its dedicated detector are also very expensive.
As a simpler method, a nucleic acid detection method using aggregation of a complex of gold colloid and DNA has been reported (Non-patent Document 2, etc.). However, in the aggregation by such a complex, aggregation occurs when the target nucleic acid crosslinks a plurality of fine particles, so it is necessary to synthesize a plurality of DNA-immobilized gold colloids that bind to a plurality of regions of the target nucleic acid. There is a need for a chemical synthesis process for bonding the gold colloid with the chemical modification to the probe. Therefore, there is no versatility at present.
The present inventors have used in the present invention a Hydol gelling agent (Patent Document 1) that has already been developed and has a nucleotide at the molecular end of a divalent or trivalent hydrocarbon chain.
本発明は、標的核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を溶解させた水溶液を、そのまま又は乾燥させて顕微鏡で観察することにより、標的核酸を検出する方法を提供する。 The present invention provides a method for detecting a target nucleic acid by observing an aqueous solution in which the target nucleic acid (DNA or RNA) is dissolved as it is or after drying it with a microscope.
検査対象の核酸を溶解させた水溶液に、標的核酸の塩基配列に基づいて設計した一組のプローブと、二価又は三価の炭化水素鎖の分子端にヌクレオチドを有するヌクレオチド脂質（特許文献１）を混合すると、その水溶液中に標的核酸が存在する場合には、これらが相補的核酸塩基対を形成することにより自己集合してファイバーを形成する。本発明者らは、形成されたファイバーを顕微鏡で観察することにより、標的核酸の存在を検出することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。 A nucleotide lipid having a pair of probes designed based on the base sequence of a target nucleic acid and a nucleotide at the molecular end of a divalent or trivalent hydrocarbon chain in an aqueous solution in which the nucleic acid to be tested is dissolved (Patent Document 1) When target nucleic acids are present in the aqueous solution, they form self-assembled fibers by forming complementary nucleobase pairs to form fibers. The present inventors have found that the presence of the target nucleic acid can be detected by observing the formed fiber with a microscope, and have completed the present invention.
即ち、本発明は、（ａ）検査対象の核酸、２種類のプローブ及び下記一般式
Ｒ−Ｘｎ
（式中、ｎは２又は３を表し、Ｘはそれぞれ同じであっても異なってもよいヌクレオチドを表し、Ｒは炭化水素鎖（ｎが２の場合には二価であり、ｎが３の場合には三価である。）を表し、該ヌクレオチドのリン酸部分で該炭化水素と結合する。）で表されるヌクレオチド脂質を水溶媒に溶解させる段階、及び
（ｂ）この水溶液中に生成する集合体の形状を顕微鏡で観察する段階から成る標的核酸を検出する方法であって、
一方のプローブが、該標的核酸の３’側の少なくとも５塩基から成る核酸１に相補的な核酸の５’末端に、ヌクレオチドＸのうちの一つのヌクレオチドＸ１と塩基対を形成しうるヌクレオチドＹ１が１０〜１５０個結合した核酸が結合してなる核酸であり、他方のプローブが、該標的核酸において、該核酸１よりも５’側に位置する、少なくとも５塩基から成る核酸２に相補的な核酸の３’末端に、ヌクレオチドＸのうちの他のヌクレオチドＸ２と塩基対を形成しうるヌクレオチドＹ２が１０〜１５０個結合した核酸が結合して成る核酸である、標的核酸の検出方法である。
That is, the present invention relates to (a) a nucleic acid to be examined, two types of probes, and the following general formula R—X n
(Wherein n represents 2 or 3, X represents a nucleotide which may be the same or different, and R represents a hydrocarbon chain (when n is 2, it is divalent and n is 3) And is bound to the hydrocarbon at the phosphate moiety of the nucleotide), and (b) is formed in this aqueous solution. A method for detecting a target nucleic acid comprising a step of observing the shape of an assembly under a microscope,
Nucleotide Y capable of forming a base pair with one nucleotide X 1 of nucleotide X at the 5 ′ end of a nucleic acid complementary to nucleic acid 1 consisting of at least 5 bases 3 ′ on the 3 ′ side of the target nucleic acid 1 is a nucleic acid formed by binding 10 to 150 nucleic acids, and the other probe is complementary to a nucleic acid 2 consisting of at least 5 bases located 5 ′ from the nucleic acid 1 in the target nucleic acid. A method for detecting a target nucleic acid, which is a nucleic acid formed by binding a nucleic acid in which 10 to 150 nucleotides Y 2 capable of forming a base pair with another nucleotide X 2 of nucleotides X are bound to the 3 ′ end of a simple nucleic acid It is.
この（ａ）段階が、
（ａ’）前記２種類のプローブと前記ヌクレオチド脂質を水溶媒に溶解させ、一旦８０℃以上に加温して常温に冷却する段階、及び
（ｂ’）この水溶液に前記検査対象の核酸を加えて混合する段階、
から成ることが好ましい。
This stage (a)
(A ′) dissolving the two kinds of probes and the nucleotide lipid in an aqueous solvent, once heating to 80 ° C. or higher and cooling to room temperature; and (b ′) adding the nucleic acid to be tested to the aqueous solution. Mixing stage,
Preferably it consists of.
また、本発明は、前記標的核酸がＤＮＡであり、前記ヌクレオチド脂質が、下記一般式
Ｒ−Ｘ２
（式中、Ｘは同じデオキシリボヌクレオチドを表し、Ｒは上記で定義したとおりである。）で表され、前記一方のプローブが、該標的核酸の３’末端の５〜１５０塩基から成る核酸１に相補的な核酸の５’末端に、デオキシリボヌクレオチドＸと塩基対を形成しうるデオキシリボヌクレオチドＹが１０〜１５０個結合した核酸が結合してなる核酸であり、前記他方のプローブが、該標的核酸の５’末端の５〜１５０塩基から成る核酸２に相補的な核酸の３’末端に、デオキシリボヌクレオチドＹが１０〜１５０個結合した核酸が結合して成る核酸である、上記の方法である。
In the present invention, the target nucleic acid is DNA, and the nucleotide lipid is represented by the following general formula RX- 2.
(Wherein X represents the same deoxyribonucleotide and R is as defined above), and the one probe is a nucleic acid 1 consisting of 5 to 150 bases at the 3 ′ end of the target nucleic acid. A nucleic acid formed by binding 10 to 150 deoxyribonucleotides Y capable of forming a base pair with deoxyribonucleotide X is bound to the 5 ′ end of a complementary nucleic acid, and the other probe is the target nucleic acid. In the above method, the nucleic acid is formed by binding a nucleic acid having 10 to 150 deoxyribonucleotides Y bonded to the 3 ′ end of a nucleic acid complementary to the nucleic acid 2 having 5 to 150 bases at the 5 ′ end.
本発明の標的核酸の検出方法は、ゲルの調製や染色などの工程が不要で、検出までの分析手順が容易である。また、危険物質の使用が必要なく、プローブに化学修飾や蛍光試薬をインターカレートする必要がない。また、本発明の標的核酸の検出方法は、一重鎖核酸を検出できる。 The target nucleic acid detection method of the present invention does not require steps such as gel preparation or staining, and the analysis procedure up to detection is easy. In addition, there is no need to use dangerous substances, and it is not necessary to intercalate the probe with chemical modifications or fluorescent reagents. Moreover, the method for detecting a target nucleic acid of the present invention can detect a single-stranded nucleic acid.
本発明は、２種類のプローブとヌクレオチド脂質を用いて、標的核酸を検出する方法である。まず、この２種類のプローブとヌクレオチド脂質を、標的核酸に対応させて説明する。図１にその模式図を示す。
標的核酸は原則的に任意の配列のＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡであり、本発明の方法を適用するためには、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも２０塩基の長さが必要である。
The present invention is a method for detecting a target nucleic acid using two types of probes and nucleotide lipids. First, these two types of probes and nucleotide lipids will be described in correspondence with target nucleic acids. FIG. 1 shows a schematic diagram thereof.
The target nucleic acid is in principle DNA or RNA of any sequence, preferably DNA, and a length of at least 10 bases, preferably at least 20 bases, is necessary for applying the method of the present invention.
２種類のプローブは、それぞれ標的核酸とハイブリダイズするように設計された核酸、好ましくはＤＮＡである。
一方のプローブ（「プローブＡ」という。）は、図１に示すように、標的核酸の一部分である核酸（「核酸１」という。）に相補的な核酸を有する。標的核酸において、この核酸１は、後述のもう一方のプローブ（「プローブＢ」という。）とハイブリダイズする標的核酸の一部分である核酸（「核酸２」という。）よりも標的核酸の３’側に位置する。この核酸１は、標的核酸の３’末端に位置してもよいし、核酸１と標的核酸の３’末端との間に１００塩基以下の任意の塩基が存在してもよい。この核酸１のサイズは、少なくとも５塩基、好ましくは５〜１５０塩基、より好ましくは１０〜１００塩基である。
プローブＡは、図１に示すように、核酸１に相補的な核酸の５’末端に、又は５’末端との間に１００塩基以下の任意の塩基を介して、ヌクレオチドＹ１が１０〜１５０個、好ましくは１０〜１００個結合した核酸が結合してなる。このヌクレオチドＹ１は、後述のヌクレオチド脂質のヌクレオチドＸのうちの一つのヌクレオチドＸ１と塩基対を形成しうる塩基である。即ち、Ｘ１が、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）（又はウラシル（Ｕ））である場合、Ｙ１は、ぞれぞれ、チミン（Ｔ）（又はウラシル（Ｕ））、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）である。
The two types of probes are nucleic acids, preferably DNA, each designed to hybridize with a target nucleic acid.
One probe (referred to as “probe A”) has a nucleic acid complementary to a nucleic acid (referred to as “nucleic acid 1”) that is a part of the target nucleic acid, as shown in FIG. In the target nucleic acid, this nucleic acid 1 is 3 ′ of the target nucleic acid relative to a nucleic acid (referred to as “nucleic acid 2”) that is a part of the target nucleic acid that hybridizes with the other probe (referred to as “probe B”) described later. Located in. The nucleic acid 1 may be located at the 3 ′ end of the target nucleic acid, or any base of 100 bases or less may exist between the nucleic acid 1 and the 3 ′ end of the target nucleic acid. The size of the nucleic acid 1 is at least 5 bases, preferably 5 to 150 bases, more preferably 10 to 100 bases.
As shown in FIG. 1, the probe A has a nucleotide Y 1 of 10 to 150 via an arbitrary base of 100 bases or less at the 5 ′ end of a nucleic acid complementary to the nucleic acid 1 or between the 5 ′ end. Individual, preferably 10 to 100 nucleic acids bound together. The nucleotide Y 1 is a base capable of forming a single nucleotide X 1 base pair of the nucleotides X nucleotides lipid described below. That is, when X 1 is adenine (A), cytosine (C), guanine (G), thymine (T) (or uracil (U)), Y 1 is thymine (T) ( Or uracil (U)), guanine (G), cytosine (C), and adenine (A).
もう一方のプローブＢは、図１に示すように、標的核酸の一部分である核酸（「核酸２」という。）に相補的な核酸を有する。標的核酸において、この核酸２は、上記プローブＢよりも標的核酸の５’側に存在し、核酸１と核酸２との間には０〜１００塩基が存在してもよい。この核酸２は、標的核酸の５’末端に位置してもよいし、核酸２と標的核酸の５’末端との間に１００塩基以下の任意の塩基が存在してもよい。この核酸２のサイズは、少なくとも５塩基、好ましくは５〜１５０塩基、より好ましくは１０〜１００塩基である。
プローブＢは、図１に示すように、核酸２に相補的な核酸の３’末端に、又は３’末端との間に１００塩基以下の任意の塩基を介して、ヌクレオチドＹ２が１０〜１５０個、好ましくは１０〜１００個結合した核酸が結合してなる。このヌクレオチドＹ２は、後述のヌクレオチド脂質のヌクレオチドＸのうちの他の（即ち、Ｘ１以外の）ヌクレオチドＸ２と塩基対を形成しうる塩基である。なお、Ｘ１とＸ２とは同じであってもよい。Ｘ２が、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）（又はウラシル（Ｕ））である場合、Ｙ２は、ぞれぞれ、チミン（Ｔ）（又はウラシル（Ｕ））、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）である。
As shown in FIG. 1, the other probe B has a nucleic acid complementary to a nucleic acid (referred to as “nucleic acid 2”) that is a part of the target nucleic acid. In the target nucleic acid, the nucleic acid 2 is present on the 5 ′ side of the target nucleic acid from the probe B, and 0 to 100 bases may exist between the nucleic acid 1 and the nucleic acid 2. The nucleic acid 2 may be located at the 5 ′ end of the target nucleic acid, or any base of 100 bases or less may exist between the nucleic acid 2 and the 5 ′ end of the target nucleic acid. The size of the nucleic acid 2 is at least 5 bases, preferably 5 to 150 bases, more preferably 10 to 100 bases.
As shown in FIG. 1, the probe B has a nucleotide Y 2 of 10 to 150 at the 3 ′ end of a nucleic acid complementary to the nucleic acid 2 or through any base of 100 bases or less between the nucleic acid 2 and the 3 ′ end. Individual, preferably 10 to 100 nucleic acids bound together. The nucleotide Y 2 are bases capable of forming the other (i.e., other than X 1) nucleotide X 2 base pairs of the nucleotides X nucleotides lipid described below. X 1 and X 2 may be the same. When X 2 is adenine (A), cytosine (C), guanine (G), thymine (T) (or uracil (U)), Y 2 is thymine (T) (or uracil), respectively. (U)), guanine (G), cytosine (C), and adenine (A).
本発明で用いるヌクレオチド脂質は下記一般式で表される。
Ｒ−Ｘｎ
この式中、ｎは２又は３、好ましくは２を表す。
Ｘはヌクレオチドを表し、これらのヌクレオチドは、それぞれ同じであっても異なってもよいが、好ましくは同じである。このヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド、好ましくはデオキシリボヌクレオチドであり、その３’又は５’の位置に１又は２以上のリン酸を含んでもよい。このヌクレオチド脂質の作製が容易であるという観点から、デオキシチミジンの３’位にモノリン酸が結合したものが好ましい。
The nucleotide lipid used in the present invention is represented by the following general formula.
R-X n
In this formula, n represents 2 or 3, preferably 2.
X represents a nucleotide, and these nucleotides may be the same or different, but are preferably the same. The nucleotide is a ribonucleotide or deoxyribonucleotide, preferably deoxyribonucleotide, and may contain one or more phosphates at its 3 ′ or 5 ′ position. From the viewpoint of easy preparation of this nucleotide lipid, those having monophosphate bound to the 3 ′ position of deoxythymidine are preferred.
Ｒは炭化水素鎖を表し、ｎが２の場合にはこの炭化水素鎖は二価となり、ｎが３の場合には三価となる。この炭化水素に特に制限はなく、直鎖、分枝、環式のいずれであってもよい。また、結合手（ｎ＝２の場合には２個、ｎ＝３の場合には３個）はその炭化水素鎖の末端にあることが好ましい。
この炭化水素鎖の炭素数は１２〜２０が好ましく、１８〜２０がより好ましい。また、この炭化水素鎖としては末端に結合手を有するオリゴメチレン基、特に−（ＣＨ２）ｍ−（ｍは好ましくは１２〜２０、より好ましくは１８〜２０である。）が好ましい。
このヌクレオチドは、そのリン酸部分で該炭化水素鎖と結合する。
また、上記ヌクレオチドは必ずしも１種類である必要はなく、２種以上を用いてもよい。更に、炭化水素鎖も同様に２種以上を用いてもよい。
R represents a hydrocarbon chain. When n is 2, this hydrocarbon chain is divalent, and when n is 3, it is trivalent. There is no restriction | limiting in particular in this hydrocarbon, Any of linear, branched, and cyclic may be sufficient. Moreover, it is preferable that the bond (2 in the case of n = 2, 3 in the case of n = 3) is at the end of the hydrocarbon chain.
12-20 are preferable and, as for carbon number of this hydrocarbon chain, 18-20 are more preferable. In addition, the hydrocarbon chain is preferably an oligomethylene group having a bond at the end, particularly — (CH 2 ) m — (m is preferably 12 to 20, more preferably 18 to 20).
This nucleotide binds to the hydrocarbon chain at its phosphate moiety.
Moreover, the said nucleotide does not necessarily need to be 1 type, You may use 2 or more types. Further, two or more hydrocarbon chains may be used as well.
以下、本発明の標的核酸の検出方法を段階ごとに説明する。
（ａ）まず、検査対象の核酸、２種類のプローブ及びヌクレオチド脂質を水溶媒に溶解させる。
溶媒は、水であり、必要に応じて、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（通常濃度：０〜５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（通常濃度：０〜５ｍＭ）、ＮａＣｌ（通常濃度：０〜５０ｍＭ）、ＫＣｌ（通常濃度：０〜５０ｍＭ）等を含んでもよい。
溶媒中の、ヌクレオチド脂質の濃度は、１×１０−３Ｍ〜３×１０−２Ｍが好ましく、より好ましくは１．８×１０−３Ｍ〜１．８×１０−２Ｍである。
プローブの濃度は、同じ核酸塩基が連続する結合部分（ヌクレオチドＸのと塩基対を形成しうる塩基Ｙの１０〜１５０個から成る核酸部分）がヌクレオチド脂質（Ｒ−Ｘｎ）のＸｎに対して等量から２分の１になるような濃度が好ましい。従って、塩基配列により最適濃度は異なる。
検査対象の核酸の濃度は、プローブ濃度の等量から１０分の１程度の濃度が好ましい。核酸の濃度が不明な場合は、検査対象の核酸が含まれる溶液の紫外−可視領域の吸収スペクトル測定を行って、特定波長における吸光度（例えば、波長２６０ｎｍの吸光度）から濃度を求めておくことができる。
溶液の温度は、通常０℃以上で、用いる標的核酸の融解温度（核酸によるが、通常４０〜６０℃程度である。）以下の範囲である。
Hereinafter, the method for detecting a target nucleic acid of the present invention will be described step by step.
(A) First, a nucleic acid to be examined, two types of probes, and a nucleotide lipid are dissolved in an aqueous solvent.
The solvent is water, and if necessary, Tris-HCl (normal concentration: 0 to 50 mM), EDTA (normal concentration: 0 to 5 mM), NaCl (normal concentration: 0 to 50 mM), KCl (normal concentration: 0) ~ 50 mM) and the like.
The concentration of the nucleotide lipid in the solvent is preferably 1 × 10 −3 M to 3 × 10 −2 M, more preferably 1.8 × 10 −3 M to 1.8 × 10 −2 M.
The concentration of the probe is such that the binding portion (the nucleic acid portion consisting of 10 to 150 bases Y that can form a base pair with nucleotide X) is the same as the Xn of nucleotide lipid (R-Xn). A concentration that is half the amount is preferred. Therefore, the optimum concentration differs depending on the base sequence.
The concentration of the nucleic acid to be examined is preferably about 1/10 to the equivalent of the probe concentration. When the concentration of the nucleic acid is unknown, it is possible to measure the absorption spectrum in the ultraviolet-visible region of the solution containing the nucleic acid to be examined, and obtain the concentration from the absorbance at a specific wavelength (for example, absorbance at a wavelength of 260 nm). it can.
The temperature of the solution is usually 0 ° C. or higher, and is within the range of the melting temperature of the target nucleic acid to be used (depending on the nucleic acid, usually about 40 to 60 ° C.).
検査対象の核酸、２種類のプローブ及びヌクレオチド脂質を水溶媒に溶解させる場合に、これらを水溶媒に分散させる処理を行なうことが好ましい。即ち、ヌクレオチド脂質の水への分散を促し、プローブとヌクレオチド脂質とのハイブリダイゼーションを確実に解離させるためである。
このような分散処理として、水溶液を加熱することや、超音波照射を行うことなどが挙げられる。
水溶液を加熱する場合は、この水溶液を一旦８０℃以上（但し、水溶液の沸点以下）に加温する。加温状態におく時間は好ましくは約１０〜３０分である。
超音波照射を行う場合は、例えば、超音波洗浄機により超音波照射（振動周波数２５Ｈｚ〜５０Ｈｚ）する。超音波照射する時間は好ましくは３０〜６０分である。
このような処理の後で、常温に冷却しておくことが好ましい。常温への冷却は、通常室温に放置しておけばよい。
When the nucleic acid to be examined, two types of probes, and nucleotide lipids are dissolved in an aqueous solvent, it is preferable to perform a treatment of dispersing them in the aqueous solvent. That is, it is to promote dispersion of nucleotide lipids in water and to reliably dissociate hybridization between the probe and the nucleotide lipid.
Examples of such dispersion treatment include heating the aqueous solution and performing ultrasonic irradiation.
When the aqueous solution is heated, the aqueous solution is once heated to 80 ° C. or higher (however, the boiling point of the aqueous solution or lower). The time for keeping the heated state is preferably about 10 to 30 minutes.
When performing ultrasonic irradiation, for example, ultrasonic irradiation (vibration frequency: 25 Hz to 50 Hz) is performed by an ultrasonic cleaner. The ultrasonic irradiation time is preferably 30 to 60 minutes.
After such treatment, it is preferable to cool to room temperature. Cooling to room temperature is usually allowed to stand at room temperature.
検査対象の核酸（以下単に「核酸」ともいう。）、２種類のプローブ（以下単に「プローブ」という。）及びヌクレオチド脂質を混合する順番に特に制限はないが、例えば、以下のような手順が好ましい。
（１）プローブ、ヌクレオチド脂質、核酸を全て水溶媒に溶解し、分散処理を行い、常温に冷却する。
（２）水溶媒にヌクレオチド脂質を加えて分散処理を行い、常温に冷却し、これにプローブと核酸を加えて混合する。
（３）水溶媒にプローブとヌクレオチド脂質を加えて分散処理を行ない、常温に冷却し、これに核酸を加えて混合する。
The order of mixing the nucleic acid to be tested (hereinafter also simply referred to as “nucleic acid”), two types of probes (hereinafter simply referred to as “probes”) and nucleotide lipids is not particularly limited. preferable.
(1) The probe, nucleotide lipid, and nucleic acid are all dissolved in an aqueous solvent, dispersed, and cooled to room temperature.
(2) A nucleotide lipid is added to an aqueous solvent for dispersion treatment, cooled to room temperature, and a probe and a nucleic acid are added and mixed.
(3) The probe and nucleotide lipid are added to an aqueous solvent for dispersion treatment, cooled to room temperature, and nucleic acid is added and mixed.
また、既に検査対象の核酸が溶解した溶液を検査する場合には、以下のような手順が好ましい。
（４）この溶液に、プローブ及びヌクレオチド脂質を加え、分散処理を行い、常温に冷却する。
（５）別途、水溶媒にヌクレオチド脂質を加え分散処理を行い、常温に冷却した溶液を用意し、上記核酸が溶解した溶液に、このヌクレオチド脂質が溶解した溶液とプローブを加えて混合する。
Further, when testing a solution in which a nucleic acid to be tested is already dissolved, the following procedure is preferable.
(4) To this solution, a probe and a nucleotide lipid are added, dispersed, and cooled to room temperature.
(5) Separately, a nucleotide lipid is added to an aqueous solvent for dispersion treatment, a solution cooled to room temperature is prepared, and the solution in which the nucleotide lipid is dissolved and the probe are added to and mixed with the solution in which the nucleic acid is dissolved.
このような操作の結果、ヌクレオチド脂質とプローブが相補的核酸塩基対を形成し、プローブと標的核酸が相補的核酸塩基対を形成する。なお、プローブと標的核酸の結合は、これらと上記ヌクレオチド脂質との結合よりも強いため、ヌクレオチド脂質が、プローブと標的核酸との間の相補的核酸塩基対形成を阻害することはないと考えられる。 As a result of such an operation, the nucleotide lipid and the probe form a complementary nucleobase pair, and the probe and the target nucleic acid form a complementary nucleobase pair. In addition, since the binding between the probe and the target nucleic acid is stronger than the binding between these and the above nucleotide lipid, it is considered that the nucleotide lipid does not inhibit complementary nucleobase pairing between the probe and the target nucleic acid. .
（ｂ）次に、この溶液を顕微鏡で観察して、これらの集合体の形状を観察する。
検査対象の核酸が標的核酸である場合には、プローブ、ヌクレオチド脂質及び標的核酸は、相互作用により、前駆体同士が寄り集まり、一定方向へ伸長しファイバーを形成する。このファイバーは通常径が５．０〜１０ｎｍ、長さが０．１〜３．０μｍである。最終的に、この分子集合体は規則性をもった構造となるため、顕微鏡により観察することができる。
検査対象の核酸が標的核酸でない場合には、ファイバーは検出されず、プローブ、ヌクレオチド脂質及び核酸の各形態（通常はサイズが１０〜１００ｎｍ粒子）が観察される。
顕微鏡は、上記のファイバーを観察できれば特に制限はなく、例えば、走査型プローブ顕微鏡、原子間力顕微鏡、走査型トンネル顕微鏡、水平力顕微鏡、化学力顕微鏡、磁力顕微鏡、フォースモジュレーション顕微鏡、高周波磁力顕微鏡、磁気抵抗感度マッピング、電気力顕微鏡、走査型静電容量顕微鏡、走査型広がり抵抗顕微鏡、トンネル原子間力顕微鏡、伝導原子間力顕微鏡、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡、レーザー共焦点顕微鏡、光学顕微鏡等を使用できる。
調製直後に顕微鏡観察してもよいが、混合溶液が標的核酸の融解温度以下に達し、かつ混合溶液が白濁してから観察することが好ましい。ハイブリダイズが起こり、ファイバー又は粒子状集合体ができると溶液全体が白濁するためである。
(B) Next, this solution is observed with a microscope, and the shape of these aggregates is observed.
When the nucleic acid to be inspected is a target nucleic acid, the probe, nucleotide lipid, and target nucleic acid gather together due to the interaction, and extend in a certain direction to form a fiber. This fiber usually has a diameter of 5.0 to 10 nm and a length of 0.1 to 3.0 μm. Ultimately, this molecular assembly has a regular structure and can be observed with a microscope.
When the nucleic acid to be examined is not the target nucleic acid, the fiber is not detected, and the probe, nucleotide lipid, and nucleic acid forms (usually particles having a size of 10 to 100 nm) are observed.
The microscope is not particularly limited as long as the above-described fiber can be observed. Magnetoresistance sensitivity mapping, electric force microscope, scanning capacitance microscope, scanning spreading resistance microscope, tunnel atomic force microscope, conduction atomic force microscope, scanning electron microscope, transmission electron microscope, laser confocal microscope, optics A microscope or the like can be used.
Although observation with a microscope may be performed immediately after preparation, it is preferable to observe after the mixed solution has reached the melting temperature of the target nucleic acid or less and the mixed solution has become cloudy. This is because when the hybridization occurs and fibers or particulate aggregates are formed, the entire solution becomes cloudy.
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
なお、薄層クロマトグラフィーのＲｆ値としては、クロロホルム／メタノール（容積比４／１）混合溶媒を展開溶媒としたときの値をＲｆ値とした。
製造例１
本製造例では、二価のヌクレオチド脂質を合成した。
ジクロロメタンに１，１８−オクタデカンジカルボン酸２．３ｇ（９．４ミリモル）、塩化チオニル３．３ｍｌ（２８ミリモル）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１滴を加え、還流下で２時間加熱した。反応後、減圧下で溶媒を完全に留去して得られた酸クロライドを、テトラヒドロフランに溶解した。次に、テトラヒドロフランに水素化リチウムアルミニウム０．５ｇ（１３ミリモル）を加え、−５０℃に保った。この溶液中に、先ほどの酸クロライド溶液をゆっくりと滴下した後、室温に戻し、還流下で３時間加熱した。その後２４時間室温で撹拌し、酢酸エチル、続いて飽和硫酸ナトリウム水溶液を気泡が発生しなくなるまで加えた。次に反応溶液を減圧下で溶媒を留去し、得られた固体をクロロホルムに懸濁して濾過し、ろ液を減圧下で留去した。得られた固体をヘキサン／酢酸エチル＝２／１の溶媒から再結晶し、白色の固体として１，２０−エイコサンジオール１．５ｇ（収率＝７４％）を得た。
The following examples illustrate the invention but are not intended to limit the invention.
In addition, as Rf value of thin layer chromatography, the value when chloroform / methanol (volume ratio 4/1) mixed solvent was used as a developing solvent was defined as Rf value.
Production Example 1
In this production example, a divalent nucleotide lipid was synthesized.
To the dichloromethane were added 2.3 g (9.4 mmol) of 1,18-octadecanedicarboxylic acid, 3.3 ml (28 mmol) of thionyl chloride, and 1 drop of N, N-dimethylformamide, and the mixture was heated under reflux for 2 hours. After the reaction, the acid chloride obtained by completely distilling off the solvent under reduced pressure was dissolved in tetrahydrofuran. Next, 0.5 g (13 mmol) of lithium aluminum hydride was added to tetrahydrofuran and kept at −50 ° C. The acid chloride solution was dropped slowly into the solution, then returned to room temperature and heated under reflux for 3 hours. Thereafter, the mixture was stirred for 24 hours at room temperature, and ethyl acetate and then a saturated aqueous sodium sulfate solution were added until no bubbles were generated. Next, the solvent was distilled off from the reaction solution under reduced pressure, the resulting solid was suspended in chloroform and filtered, and the filtrate was distilled off under reduced pressure. The obtained solid was recrystallized from a solvent of hexane / ethyl acetate = 2/1 to obtain 1.5 g of 1,20-eicosanediol (yield = 74%) as a white solid.
この１，２０−エイコサンジオール０．１４ｇ（０．７ミリモル）と１Ｈ−テトラゾール０．２ｇ（３ミリモル）をテトラヒドロフランに溶解し、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシチミジン３’−Ｏ−[Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト]１．０ｇ（１．４ミリモル）を加えた。室温で２４時間かき混ぜた後、反応溶液中に７０％ｔ−ブチルヒドロペルオキシド水溶液０．４ｍｌを加え、１時間撹拌した。その後、２８％アンモニア水溶液８ｍｌを加え、２４時間撹拌後、溶媒を減圧下で留去し、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：クロロホルム／メタノール＝４／１）で精製した。カラム溶出液を減圧下溶媒留去し、得られた固体をクロロホルムに溶解し、トリフルオロ酢酸０．５ｍｌを加えて析出した固体をクロロホルムにより洗浄した後、クロロホルム／メタノール＝１／１溶液から再沈殿させることにより１，２０−（エイコサンジオキシ）ビス（３’−ホスファチジル−２’−デオキシチミジン）（ヌクレオチド脂質）０．２ｇ（収率３５％）を白色粉末として得た。
得られた化合物の物理的性質及び精密質量分析結果を次に示す。
融点：２３３℃（分解） 薄層クロマトグラフィーのＲｆ値＝０．６０（クロロホルム／メタノール＝１／１） 精密質量分析値（［Ｍ−Ｈ］−、Ｃ４０Ｈ６７Ｎ４Ｏ１６Ｐ２として）計算値：９２１．４０２７、実測値：９２１．４０２２
0.14 g (0.7 mmol) of 1,20-eicosanediol and 0.2 g (3 mmol) of 1H-tetrazole were dissolved in tetrahydrofuran, and 5'-O-dimethoxytrityl-2'-deoxythymidine 3'- 1.0 g (1.4 mmol) of O- [O- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl phosphoramidite] was added. After stirring at room temperature for 24 hours, 0.4 ml of a 70% aqueous solution of t-butyl hydroperoxide was added to the reaction solution and stirred for 1 hour. Thereafter, 8 ml of a 28% aqueous ammonia solution was added, and after stirring for 24 hours, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the resulting solid was purified by silica gel column chromatography (eluent: chloroform / methanol = 4/1). The column eluate was evaporated under reduced pressure, the resulting solid was dissolved in chloroform, 0.5 ml of trifluoroacetic acid was added and the precipitated solid was washed with chloroform, and then re-started from the chloroform / methanol = 1/1 solution. By precipitation, 0.2 g (yield 35%) of 1,20- (eicosanedioxy) bis (3′-phosphatidyl-2′-deoxythymidine) (nucleotide lipid) was obtained as a white powder.
The physical properties and accurate mass analysis results of the obtained compound are shown below.
Melting point: 233 ° C. (decomposition) Rf value of thin layer chromatography = 0.60 (chloroform / methanol = 1/1) Precise mass spectrometric value ([M−H] −, C 40 H 67 N 4 O 16 P 2 ) Calculated value: 921.4027, measured value: 921.4022
実施例１
図２に示すように、標的配列Ｔ（配列番号３）（ダイズレクチン遺伝子の塩基配列の一部、融解温度：５２℃（塩濃度５０ｍＭの条件下））を用意し、その１〜１１番目の塩基配列に相補的なＤＮＡの３’末端に、２０個のアデニンから成るＤＮＡを結合させたプローブＢ（ＰＢ）（配列番号２）と、その１２〜２１番目の塩基配列に相補的なＤＮＡの５’末端に、２０個のアデニンから成るＤＮＡを結合させたプローブＡ（ＰＡ）（配列番号１）を合成して用意した。また、比較のため、上記標的配列とは全く関係のない配列ＮＴ（配列番号４）（ダイズレクチン遺伝子の塩基配列の一部、融解温度：４３℃（塩濃度５０ｍＭの条件下））を用意した。
ＰＡ（１．６ｍｇ）及びＰＢ（１．５ｍｇ）を、それぞれ１５７ｍｍ３及び１３８ｍｍ３のバッファー水溶液で溶解した。一方、製造例１で得たヌクレオチド脂質４．６ｍｇ（５μｍｏｌ）をサンプル容器に計り取り、ＰＡ及びＰＢの水溶液を１３８ｍｍ３ずつ加え、９０℃以上に保った水浴中で３０分間放置し、溶解させた。得られた水溶液を室温下で放置したところ、数日後に水溶液は粘性の高いゲル状態となった。
このゲル状の水溶液を１ｍｍ３取り、そこへバッファー水溶液（アプライドバイオシステムズ社、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １ｍＭ、ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ、ｐＨ＝８．０）１ｍｍ３を加え、２４時間以上放置した。得られた溶液をサンプルａという。
同様に、このゲル状の水溶液を１ｍｍ３取り、標的核酸Ｔ（１×１０−４ｍｏｌ／ｄｍ３）を含むバッファー水溶液を１ｍｍ３加え、２４時間以上放置した。得られた溶液をサンプルｂという。
同様に、このゲル状の水溶液を１ｍｍ３取り、ＮＴ（１×１０−４ｍｏｌ／ｄｍ３）を含むバッファー水溶液を１ｍｍ３加え、２４時間以上放置した。得られた溶液をサンプルｃという。
Example 1
As shown in FIG. 2, a target sequence T (SEQ ID NO: 3) (part of the base sequence of soybean lectin gene, melting temperature: 52 ° C. (under the condition of a salt concentration of 50 mM)) is prepared. Probe B (PB) (SEQ ID NO: 2) in which DNA consisting of 20 adenines is bound to the 3 ′ end of DNA complementary to the base sequence, and DNA complementary to the 12th to 21st base sequences A probe A (PA) (SEQ ID NO: 1) was prepared by combining DNA consisting of 20 adenines at the 5 ′ end. For comparison, a sequence NT (SEQ ID NO: 4) (part of the base sequence of soybean lectin gene, melting temperature: 43 ° C. (under a salt concentration of 50 mM)) that was not related to the target sequence was prepared. .
PA (1.6 mg) and PB (1.5 mg) were dissolved in 157 mm 3 and 138 mm 3 buffer aqueous solutions, respectively. On the other hand, 4.6 mg (5 μmol) of the nucleotide lipid obtained in Production Example 1 was weighed into a sample container, added with 138 mm 3 each of an aqueous solution of PA and PB, and allowed to stand for 30 minutes in a water bath maintained at 90 ° C. or higher for dissolution. It was. When the obtained aqueous solution was allowed to stand at room temperature, the aqueous solution became a highly viscous gel after several days.
The 1 mm 3 up the gel-like solution, there to buffer solution (Applied Biosystems, Tris-HCl 1mM, EDTA 0.1mM , pH = 8.0) to 1 mm 3, and the mixture was left for 24 hours or more. The resulting solution is referred to as sample a.
Similarly, the gel-like aqueous solution 1 mm 3 up, the buffer solution 1 mm 3 was added containing the target nucleic acid T (1 × 10 -4 mol / dm 3), were allowed to stand for 24 hours or more. The resulting solution is referred to as sample b.
Similarly, the 1 mm 3 up the gel-like solution, a buffer solution 1 mm 3 was added containing NT (1 × 10 -4 mol / dm 3), were allowed to stand for 24 hours or more. The resulting solution is referred to as sample c.
サンプルａを１ｍｍ３取り、高配向熱分解グラファイト上に滴下した。これを数分間放置し、さらに１０ｍｍ３のミリＱ水（イオン交換水）を滴下し、すぐに濾紙で余分な水分を吸収し除去した。この操作を２回繰り返し、１０分以上室温で乾燥させたものをサンプルとし、原子間力顕微鏡（セイコーエスアイアイ・ナノテクノロジー社製、ＮａｎｏＮａｖｉシステム）によって観察した。サンプルｂ、サンプルｃについても同様に原子間力顕微鏡によって観察した。これらの原子間力顕微鏡写真を図３に示す。
サンプルａについては、高さ約１０ｎｍの円状又は楕円状の構造体が凝集したものが観察された。
サンプルｂについては、高さ約７ｎｍ、長さ数百ｎｍ〜数μｍのらせん状のファイバー構造が観察された。このらせんのピッチは５０〜６０ｎｍであった。
サンプルｃについては、楕円状又は円状の構造体が凝集したものが観察された。
すなわち、標的核酸を含む水溶液を加えたサンプルｂのみが、らせん状ファイバー構造を形成していることが観察された。
Sample 1 ( 3 mm) was taken and dropped onto highly oriented pyrolytic graphite. This was allowed to stand for several minutes, and 10 mm 3 of milli-Q water (ion exchange water) was further added dropwise, and the excess water was immediately absorbed and removed by filter paper. This operation was repeated twice, and a sample dried at room temperature for 10 minutes or more was used as a sample and observed with an atomic force microscope (manufactured by Seiko SII Nanotechnology Inc., NanoNavi system). Sample b and sample c were similarly observed with an atomic force microscope. These atomic force micrographs are shown in FIG.
Regarding sample a, an aggregate of circular or elliptical structures having a height of about 10 nm was observed.
For sample b, a helical fiber structure having a height of about 7 nm and a length of several hundred nm to several μm was observed. The pitch of this helix was 50-60 nm.
Regarding sample c, an aggregate of elliptical or circular structures was observed.
That is, it was observed that only the sample b to which the aqueous solution containing the target nucleic acid was added formed a helical fiber structure.
電気泳動やＤＮＡチップにより核酸を検出する場合、試薬や装置が高価であること、再現性の確認のため繰り返し実験と統計処理が必要であることなどから、現状では非常にコストがかかるため、実際にはまだ現場では使用されていない。本発明の核酸の検出方法は、従来法に比べ分析工程が簡便であり、走査型プローブ顕微鏡などの顕微鏡により構造を観察することで標的核酸を検出するため、危険物質の使用や核酸への化学修飾が必要ない。また、プローブと相互作用し分子集合体を形成させるヌクレオチド脂質（Ｒ−Ｘｎ）は、加熱、あるいは有機溶媒へ溶解させたり、カラム処理をすることによりプローブと解離させ、回収し、再利用することも可能である。従って、従来法と比較しコストを抑えることもできる。このため、様々な分野の遺伝子検出に用いることができる汎用性の高い方法である。例えば、病気に関わる遺伝子の検出においては医療分野、また遺伝子組み換え作物等に含まれる遺伝子の検出においては農業や食品分野への応用が期待できる。また、原子間力顕微鏡や電子顕微鏡などの原子分解能をもつ装置を使えば、極少量の標的核酸を検出できるため、現在核酸を分析する前によく行われているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）による核酸増幅過程を省略することも期待できる。 When nucleic acid is detected by electrophoresis or DNA chip, it is very expensive at present, because reagents and equipment are expensive, and repeated experiments and statistical processing are necessary to confirm reproducibility. Is not yet used in the field. The nucleic acid detection method of the present invention has a simpler analysis process than conventional methods, and detects the target nucleic acid by observing the structure with a microscope such as a scanning probe microscope. No modification is required. In addition, nucleotide lipids (R-Xn) that interact with the probe to form a molecular assembly must be dissociated from the probe by heating, dissolved in an organic solvent, or subjected to column treatment, recovered, and reused. Is also possible. Therefore, the cost can be reduced as compared with the conventional method. For this reason, it is a highly versatile method that can be used for gene detection in various fields. For example, the detection of genes related to diseases can be expected to be applied to the medical field, and the detection of genes contained in genetically modified crops can be expected to be applied to agriculture and food. In addition, if a device with atomic resolution such as an atomic force microscope or an electron microscope is used, a very small amount of target nucleic acid can be detected. It can also be expected to omit the nucleic acid amplification process.
Claims (4)
Ｒ−Ｘｎ
（式中、ｎは２又は３を表し、Ｘはそれぞれ同じであっても異なってもよいヌクレオチドを表し、Ｒは炭化水素鎖（ｎが２の場合には二価であり、ｎが３の場合には三価である。）を表し、該ヌクレオチドのリン酸部分で該炭化水素と結合する。）で表されるヌクレオチド脂質を水溶媒に溶解させる段階、及び
（ｂ）この水溶液中に生成する集合体の形状を顕微鏡で観察する段階から成る標的核酸を検出する方法であって、
一方のプローブが、該標的核酸の３’側の少なくとも５塩基から成る核酸１に相補的な核酸の５’末端に、ヌクレオチドＸのうちの一つのヌクレオチドＸ１と塩基対を形成しうるヌクレオチドＹ１が１０〜１５０個結合した核酸が結合してなる核酸であり、他方のプローブが、該標的核酸において、該核酸１よりも５’側に位置する、少なくとも５塩基から成る核酸２に相補的な核酸の３’末端に、ヌクレオチドＸのうちの他のヌクレオチドＸ２と塩基対を形成しうるヌクレオチドＹ２が１０〜１５０個結合した核酸が結合して成る核酸である、標的核酸の検出方法。 (A) Nucleic acid to be tested, two types of probes, and the following general formula R—X n
(Wherein n represents 2 or 3, X represents a nucleotide which may be the same or different, and R represents a hydrocarbon chain (when n is 2, it is divalent and n is 3) And is bound to the hydrocarbon at the phosphate moiety of the nucleotide), and (b) is formed in this aqueous solution. A method for detecting a target nucleic acid comprising a step of observing the shape of an assembly under a microscope,
Nucleotide Y capable of forming a base pair with one nucleotide X 1 of nucleotide X at the 5 ′ end of a nucleic acid complementary to nucleic acid 1 consisting of at least 5 bases 3 ′ on the 3 ′ side of the target nucleic acid 1 is a nucleic acid formed by binding 10 to 150 nucleic acids, and the other probe is complementary to a nucleic acid 2 consisting of at least 5 bases located 5 ′ from the nucleic acid 1 in the target nucleic acid. A method for detecting a target nucleic acid, which is a nucleic acid formed by binding a nucleic acid in which 10 to 150 nucleotides Y 2 capable of forming a base pair with another nucleotide X 2 of nucleotides X are bound to the 3 ′ end of a simple nucleic acid .
（ａ’）前記２種類のプローブと前記ヌクレオチド脂質を水溶媒に溶解させ、一旦８０℃以上に加温して常温に冷却する段階、及び
（ｂ’）この水溶液に前記検査対象の核酸を加えて混合する段階、
から成る請求項１に記載の方法。 The step (a)
(A ′) dissolving the two kinds of probes and the nucleotide lipid in an aqueous solvent, once heating to 80 ° C. or higher and cooling to room temperature; and (b ′) adding the nucleic acid to be tested to the aqueous solution. Mixing stage,
The method of claim 1 comprising:
Ｒ−Ｘ２
（式中、Ｘは同じデオキシリボヌクレオチドを表し、Ｒは上記で定義したとおりである。）で表され、前記一方のプローブが、該標的核酸の３’末端の５〜１５０塩基から成る核酸１に相補的な核酸の５’末端に、デオキシリボヌクレオチドＸと塩基対を形成しうるデオキシリボヌクレオチドＹが１０〜１５０個結合した核酸が結合してなる核酸であり、前記他方のプローブが、該標的核酸の５’末端の５〜１５０塩基から成る核酸２に相補的な核酸の３’末端に、デオキシリボヌクレオチドＹが１０〜１５０個結合した核酸が結合して成る核酸である、請求項１又は２に記載の方法。 The target nucleic acid is DNA, and the nucleotide lipid is represented by the following general formula R-X 2
(Wherein X represents the same deoxyribonucleotide and R is as defined above), and the one probe is a nucleic acid 1 consisting of 5 to 150 bases at the 3 ′ end of the target nucleic acid. A nucleic acid formed by binding 10 to 150 deoxyribonucleotides Y capable of forming a base pair with deoxyribonucleotide X is bound to the 5 ′ end of a complementary nucleic acid, and the other probe is the target nucleic acid. The nucleic acid obtained by binding a nucleic acid having 10 to 150 deoxyribonucleotides Y bound to the 3 'end of a nucleic acid complementary to nucleic acid 2 having 5 to 150 bases at the 5' end. the method of.
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