JP4963015B2 - Nucleotide derivatives and uses thereof - Google Patents
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Description
本発明は、ヌクレオチド配列中の塩基種を決定するためのヌクレオチド誘導体及びその利用に関する。 The present invention relates to a nucleotide derivative and its use for determining a base species in a nucleotide sequence.
近年、薬剤の有効性やガンなどの各種疾患の予防や予後、広くは体質などの各個体における治療上の診断及び方針並びに疾患を予防するための生活習慣方針の指標としてＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）が用いられるようになってきている。 In recent years, SNP (Single Nucleide Polymorphism: as an index of therapeutic diagnosis and policy in various individuals such as the effectiveness of drugs and cancer, as well as the constitution and treatment policy and lifestyle policy for preventing disease in recent years: Single nucleotide polymorphism) has been used.
ＳＮＰタイピング法としては、ハイブリダイゼーション効率、酵素認識効率等が知られているが、なかでもＤＮＡマイクロアレイ等を利用したヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーション効率による方法について報告されている（非特許文献１）。例えば、ハイブリダイゼーションを用いたＳＮＰタイピング法は、プローブと標識したヌクレオチドとハイブリダイゼーション効率、すなわち、ハイブリダイゼーションにおける融解温度を指標とする方法が一般的であるが、このためには、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを標的とするヌクレオチド配列毎に厳密に設定する必要がある。さらに、こうした緻密な条件設定にもかかわらず、ミスハイブリダイゼーションによる測定誤差が避けられないものとなっている。また、こうした融解温度を指標とするのは、ヌクレオチド配列における塩基を間接的に特定するものに過ぎないにも関わらず、多大な労力を要するものとなっていた。 As the SNP typing method, hybridization efficiency, enzyme recognition efficiency, and the like are known. Among them, a method based on hybridization efficiency between nucleotide sequences using a DNA microarray or the like has been reported (Non-patent Document 1). For example, the SNP typing method using hybridization is generally a method in which a probe and a labeled nucleotide and hybridization efficiency, that is, a melting temperature in hybridization is used as an index. For this purpose, a hybridization string is used. It is necessary to set strictly for each nucleotide sequence targeting the genie. Furthermore, despite such precise condition settings, measurement errors due to mishybridization are inevitable. In addition, using such a melting temperature as an index is merely an indirect specification of a base in a nucleotide sequence, but requires a lot of labor.
本発明者らは、既にＳＮＰタイピングを省力化するために、標的ヌクレオチド配列中の特定塩基種と相対する時とそれ以外の塩基種と相対する時とにおいて蛍光シグナルが変化するヌクレオチド誘導体を見出し、この特定塩基との相対時における蛍光シグナルを当該特定塩基で識別できることを見出した。そして、このヌクレオチド誘導体をキャプチャープローブとして用いることにより、塩基種を直接的に特定する手法を開発している（特許文献１）。すなわち、この手法によれば、こうしたヌクレオチド誘導体をキャプチャープローブの特定部位に配置し、標識していない標的ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを行って蛍光を検出し、こうした蛍光シグナルが特定塩基と相対したときの蛍光シグナルかどうかを判定することにより、標的ヌクレオチド配列の特定部位の塩基種を特定することができる。すなわち、塩基種をハイブリダイゼーションによる蛍光シグナルの変化から直接的に特定することができる。
しかしながら、こうしたヌクレオチド誘導体を用いた蛍光の最大吸収波長が紫外領域に近いほど、シグナルの識別性が低くなる傾向がある。この結果、シグナル検出の精度や再現性が低下する傾向があった。 However, the closer the maximum absorption wavelength of fluorescence using such a nucleotide derivative is to the ultraviolet region, the lower the signal discrimination. As a result, the accuracy and reproducibility of signal detection tended to decrease.
そこで、本発明は、ハイブリダイゼーションによるヌクレオチド配列の分析に際して、識別性の高い蛍光発光特性を備えるヌクレオチド誘導体及びその利用を提供する。また、本発明は、容易かつ高精度に塩基種を特定できるヌクレオチド誘導体及びその利用を他の一つの目的とする。なお、ヌクレオチド誘導体の利用には、ヌクレオシド誘導体、プローブ、プローブ固定化体、ハイブリダイゼーション方法などが包含される。 Therefore, the present invention provides a nucleotide derivative having highly discriminating fluorescence emission characteristics and use thereof when analyzing a nucleotide sequence by hybridization. Another object of the present invention is to provide a nucleotide derivative that can easily and accurately specify a base species and its use. Use of nucleotide derivatives includes nucleoside derivatives, probes, probe-immobilized products, hybridization methods, and the like.
本発明者らは、少なくとも上記した一つの課題を解決するために以下の手段を創出した。 The present inventors have created the following means in order to solve at least one of the problems described above.
本発明の一つの形態によれば、ヌクレオチド誘導体であって、前記ヌクレオチド誘導体中の塩基にリンカーを介して２種類の蛍光物質を備え、前記ヌクレオチド誘導体を備えるポリヌクレオチド誘導体が相手鎖とハイブリダイズして特定塩基と相対したとき、前記２種類の蛍光物質がＦＲＥＴによる蛍光を発光可能である、誘導体が提供される。この発明において、ヌクレオチドとは、プリン塩基又はピリミジン塩基がβ−Ｎ−グリコシド結合により結合したヌクレオシドのリン酸エステルを意味している。また、ヌクレオチド誘導体とは、ヌクレオチドにリンカーを介して２種類の蛍光物質を備えたものをいう。 According to one aspect of the present invention, a nucleotide derivative is provided with two types of fluorescent substances via a linker at a base in the nucleotide derivative, and the polynucleotide derivative comprising the nucleotide derivative hybridizes with a partner strand. Thus, a derivative is provided in which the two types of fluorescent substances can emit fluorescence by FRET when opposed to a specific base. In the present invention, the nucleotide means a nucleoside phosphate ester in which purine bases or pyrimidine bases are linked by β-N-glycoside bonds. Moreover, a nucleotide derivative means what provided two types of fluorescent substances in the nucleotide through the linker.
この形態においては、前記ヌクレオチド誘導体としては、以下の一般式（１）で表されるヌクレオチド誘導体が挙げられる。
こうしたヌクレオチド誘導体としては、以下の一般式（２）で表されるヌクレオチド誘導体；
以下の一般式（３）で表されるヌクレオチド誘導体；
以下の一般式（４）で表されるヌクレオチド誘導体；
以下の一般式（５）で表されるヌクレオチド誘導体；
また、本発明の別の形態によれば、ヌクレオシド誘導体であって、前記ヌクレオシド誘導体中の塩基にリンカーを介して２種類の蛍光物質を備えるか、あるいは、前記リンカーを介して１種類の蛍光物質と蛍光物質を導入可能な官能基又は保護された該官能基を備える、誘導体も提供される。 According to another aspect of the present invention, there is provided a nucleoside derivative, wherein the base in the nucleoside derivative is provided with two kinds of fluorescent substances via a linker, or one kind of fluorescent substance via the linker And a functional group capable of introducing a fluorescent material or a protected functional group is also provided.
この形態においては、前記ヌクレオシド誘導体としては、以下の一般式（６）で表されるヌクレオシド誘導体が挙げられる。
こうしたヌクレオシド誘導体としては、以下の一般式（７）；
以下の一般式（８）で表されるヌクレオシド誘導体；
以下の一般式（９）で表されるヌクレオシド誘導体；
以下の一般式（１０）で表されるヌクレオシド誘導体；
また、本発明の他の形態によれば、上記ヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体の１種又は２種以上をホスホジエステル結合を介して備える、ポリヌクレオチド誘導体が提供される。 Moreover, according to the other form of this invention, the polynucleotide derivative provided with 1 type, or 2 or more types of the phosphate monoester body of the said nucleotide derivative through a phosphodiester bond is provided.
本発明の他の形態によれば、上記いずれかのヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体の１種又は２種以上をホスホジエステル結合を介して備える、プローブが提供される。このプローブにおいては、前記ヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体は、標的ポリヌクレオチドの検出しようとするｌ個又は２個以上の塩基種に対応して備えられている。 According to another aspect of the present invention, there is provided a probe comprising one or more phosphate monoesters of any of the above nucleotide derivatives via a phosphodiester bond. In this probe, the phosphate monoester of the nucleotide derivative is provided corresponding to one or two or more base species to be detected by the target polynucleotide.
また、本発明の他の形態によれば、上記プローブの１種又は２種以上が固相に固定化されたプローブ固定化体が提供される。この固定化体は、前記固相がプレート状であることが好ましい態様であり、さらに、前記プローブの１種又は２種以上は、それぞれ別個の領域を有して配列されていることが好ましい。また、一塩基多型を検出するためのプローブセットが固定化されていることが好ましい態様である。 According to another aspect of the present invention, there is provided a probe-immobilized body in which one or more of the probes are immobilized on a solid phase. In this immobilized body, the solid phase is preferably in the form of a plate, and one or more of the probes are preferably arranged with separate regions. Moreover, it is a preferable aspect that the probe set for detecting a single nucleotide polymorphism is immobilized.
また、本発明の他の形態によれば、ハイブリダイゼーション方法であって、上記プローブと標的ポリヌクレオチド配列とをハイブリダイゼーションさせる工程と、前記ハイブリダイゼーションのハイブリダイズ産物の蛍光を測定する工程と、ハイブリダイズ産物の蛍光測定結果と使用したプローブが備えるヌクレオチド誘導体の特定塩基を識別可能な蛍光発光特性とに基づいて標的ポリヌクレオチド中の１個又は２個以上の塩基種を同定する評価工程と、を備えることを特徴としている。このハイブリダイゼーション工程は、上記プローブを固相に固定化したプローブ固定化体を用いることが好ましい態様である。また、前記プローブとして、一塩基多型を検出するためのプローブセットを用いることも好ましい態様である。 According to another aspect of the present invention, there is provided a hybridization method comprising: a step of hybridizing the probe with a target polynucleotide sequence; a step of measuring fluorescence of a hybridization product of the hybridization; An evaluation step for identifying one or more base species in the target polynucleotide based on the fluorescence measurement result of the soy product and the fluorescence emission characteristic capable of identifying the specific base of the nucleotide derivative provided in the probe used; It is characterized by providing. In this hybridization step, a probe-immobilized body in which the probe is immobilized on a solid phase is preferably used. Moreover, it is also a preferable aspect to use a probe set for detecting a single nucleotide polymorphism as the probe.
本発明のヌクレオチド誘導体は、ピリミジン塩基又はプリン塩基に、リンカーを介して２種類の蛍光物質を備える新規なヌクレオチド誘導体である。そして、このヌクレオチド誘導体を備えるポリヌクレオチド誘導体が相手鎖とハイブリダイズして特定塩基と相対したとき、前記２種類の蛍光物質による蛍光を発光可能である。 The nucleotide derivative of the present invention is a novel nucleotide derivative comprising two kinds of fluorescent substances on a pyrimidine base or purine base via a linker. And when the polynucleotide derivative provided with this nucleotide derivative hybridizes with the partner strand and faces a specific base, it can emit fluorescence by the two kinds of fluorescent substances.
このヌクレオチド誘導体によれば、このヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体を少なくとも一つのユニットとして有する一本鎖のヌクレオチド配列がハイブリダイズする相手鎖の相対する塩基の種類によって蛍光発光特性が相違する結果、特定の塩基を識別可能な蛍光発光特性を発揮する。これにより、相対する塩基種を特定することができる。こうした蛍光発光の特性の違いから、特定塩基と相対したときの特徴的な蛍光発光特性を当該ヌクレオチド誘導体に関連付けることができる。これにより、このヌクレオチド誘導体を備えるポリヌクレオチドと相手鎖とのハイブリダイゼーションにおいて両者間の相補性の検出が可能になるとともに、相手鎖の未知の塩基種を特定することができるようになる。したがって、本発明のヌクレオチド誘導体は、塩基識別性を有するヌクレオチド誘導体として用いることができる。 According to this nucleotide derivative, the fluorescence emission characteristics differ depending on the type of the opposite base of the partner strand to which the single-stranded nucleotide sequence having the phosphate monoester of this nucleotide derivative as at least one unit hybridizes. It exhibits fluorescence emission characteristics that can identify specific bases. Thereby, the opposing base species can be specified. Due to the difference in the characteristics of the fluorescence emission, the characteristic fluorescence emission characteristic when facing a specific base can be associated with the nucleotide derivative. This makes it possible to detect complementarity between the polynucleotide comprising the nucleotide derivative and the partner strand and to identify an unknown base species of the partner strand. Therefore, the nucleotide derivative of the present invention can be used as a nucleotide derivative having base discrimination.
また、この塩基識別性ヌクレオチドを用いた場合、蛍光物質を２種類備えているため、それぞれの蛍光を検出することができる。また、蛍光物質の種類を選択することにより、一方の蛍光物質から他方の蛍光物質へのＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を生じさせることができる。これにより、蛍光波長を長波長側にシフトさせることができる。本発明の塩基識別性ヌクレオチドは、こうしたＦＲＥＴを塩基識別性ヌクレオチドが特定の塩基と相対したときに生じさせることができる。これらのことから、本発明のヌクレオチド誘導体は、特定塩基について高い識別性を備えることができ、検出感度、検出精度及び再現性に優れた塩基の同定が可能となっている。 In addition, when this base-identifying nucleotide is used, since two types of fluorescent substances are provided, each fluorescence can be detected. Further, by selecting the type of the fluorescent material, FRET (fluorescence resonance energy transfer) from one fluorescent material to the other fluorescent material can be caused. Thereby, a fluorescence wavelength can be shifted to the long wavelength side. The base discriminating nucleotide of the present invention can generate such FRET when the base discriminating nucleotide is opposed to a specific base. From these facts, the nucleotide derivative of the present invention can have a high discriminability with respect to a specific base, and can identify a base excellent in detection sensitivity, detection accuracy and reproducibility.
ＦＲＥＴを生じさせるためには、ヌクレオチド誘導体における蛍光物質の一方（Ｙ１）は、インターカレーターとしてハイブリダイズした二本鎖に結合するものを用いることが好ましい。こうした化合物を用いることで、相対する塩基を識別可能な蛍光シグナルを発することができる。こうした化合物としては、アントラセン、ピレンが挙げられる。一方、他方の蛍光物質（Ｙ２）としては、蛍光物質Ｙ１よりも励起波長が大きく、蛍光物質Ｙ２の蛍光によって励起されるような蛍光物質を選択することが好ましい。こうした蛍光物質Ｙ２としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体などが挙げられる。 In order to generate FRET, it is preferable to use one (Y 1 ) of the fluorescent substance in the nucleotide derivative that binds to the double strand hybridized as an intercalator. By using such a compound, it is possible to emit a fluorescent signal capable of distinguishing opposite bases. Such compounds include anthracene and pyrene. On the other hand, as the other fluorescent material (Y 2 ), it is preferable to select a fluorescent material having an excitation wavelength larger than that of the fluorescent material Y 1 and excited by the fluorescence of the fluorescent material Y 2 . As such a fluorescent substance Y 2, fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives.
Ｙ１とＹ２との好ましい組み合わせとしては、Ｙ１がピレンであり、Ｙ２が６−ＦＡＭが挙げられる。 As a preferable combination of Y 1 and Y 2 , Y 1 is pyrene and Y 2 is 6-FAM.
本発明の他の形態である、ヌクレオシド誘導体、ポリヌクレオチド誘導体、プローブ、ハイブリダイゼーション方法及びプローブ固定化体は、いずれも、本発明のヌクレオチド誘導体に関しており、これらについて順次説明する。 The nucleoside derivative, the polynucleotide derivative, the probe, the hybridization method, and the probe-immobilized form, which are other forms of the present invention, all relate to the nucleotide derivative of the present invention, and these will be sequentially described.
（ヌクレオチド誘導体）
本発明のヌクレオチド誘導体は、プリン塩基又はピリミジン塩基を備えているが、具体的には、一般式（１）に表されている。また、本発明のヌクレオチド誘導体において、リン酸エステル基のｍは１以上３以下の整数を表している。したがって、本発明のヌクレオチド誘導体は、モノリン酸、ジリン酸又はトリリン酸がエステル結合した化合物を包含している。また、リボースの２’位のＲ１は、水素原子又は水酸基であり、Ｒ１が水素原子のときには、デオキシリボヌクレオチド誘導体であり、同位が水酸基であるときには、リボヌクレオチド誘導体である。
(Nucleotide derivative)
The nucleotide derivative of the present invention has a purine base or a pyrimidine base, and is specifically represented by the general formula (1). In the nucleotide derivative of the present invention, m of the phosphate ester group represents an integer of 1 or more and 3 or less. Accordingly, the nucleotide derivatives of the present invention include compounds in which monophosphate, diphosphate or triphosphate is ester-linked. In addition, R 1 at the 2 ′ position of ribose is a hydrogen atom or a hydroxyl group. When R 1 is a hydrogen atom, it is a deoxyribonucleotide derivative, and when the isotope is a hydroxyl group, it is a ribonucleotide derivative.
本発明のヌクレオチド誘導体における蛍光物質は、特に限定しない。塩基特異的に蛍光を発することのできる組み合わせの少なくとも２種類の蛍光物質であればよい。蛍光物質としては、一般式(１)に示される化合物および以下に具体的に例示するもののほか、公知の蛍光物質を組み合わせて用いることができる。また、こうした蛍光物質を塩基に連結するリンカーの構造も特に限定しないが、一般式(１)に例示されるリンカーが挙げられる。 The fluorescent substance in the nucleotide derivative of the present invention is not particularly limited. Any combination of at least two kinds of fluorescent substances capable of emitting fluorescence in a base-specific manner may be used. As the fluorescent substance, in addition to the compound represented by the general formula (1) and those specifically exemplified below, known fluorescent substances can be used in combination. In addition, the structure of the linker for linking such a fluorescent substance to the base is not particularly limited, and examples include a linker exemplified by the general formula (1).
一般式（１）における蛍光物質Ｙ１としてのピレン化合物は、ピレン骨格を有し、ピレン骨格に結合する水素原子は置換されていてもよいものである。すなわち、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して水素原子又は置換基を表している。置換基としては、例えば、ハロゲン原子、含酸素基、含窒素基、含硫黄基及びこれらの原子や置換基を有していてもよい炭化水素基若しくは複素環基である。より具体的には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、水酸基、アルコキシ基、エステル基、水酸基、アシルオキシ基、アミノ基、置換アミノ基、ニトロ基、アミド基、シアノ基、カルバメート基、ウレイド基、チオール基、チオエーテル基、チオエステル基が挙げられる。また、これらの原子や置換基を有していてもよいアルキル基、フェニル基及びピロールなどの五員複素環基、ピリジンなどの六員複素環基などが挙げられる。なお、これの置換基におけるアルキル基は、好ましくは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどの炭素数１〜４個程度の直鎖又は分枝状のアルキル基である。また、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の隣接するもの同士が結合して置換されていてもよいフェニル基などの芳香族等の環を形成してもよい。 The pyrene compound as the fluorescent substance Y 1 in the general formula (1) has a pyrene skeleton, and a hydrogen atom bonded to the pyrene skeleton may be substituted. That is, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and R 10 each independently represent a hydrogen atom or a substituent. Examples of the substituent include a halogen atom, an oxygen-containing group, a nitrogen-containing group, a sulfur-containing group, and a hydrocarbon group or a heterocyclic group which may have these atoms and substituents. More specifically, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, hydroxyl group, alkoxy group, ester group, hydroxyl group, acyloxy group, amino group, substituted amino group, nitro group, amide group, cyano group, carbamate group, Examples thereof include a ureido group, a thiol group, a thioether group, and a thioester group. Moreover, the alkyl group which may have these atoms and a substituent, 5-membered heterocyclic groups, such as a phenyl group and a pyrrole, 6-membered heterocyclic groups, such as a pyridine, etc. are mentioned. The alkyl group in the substituent is preferably a straight chain or branched chain having about 1 to 4 carbon atoms such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl and the like. In the form of an alkyl group. Also, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and R 10 may be bonded to each other and substituted with an aromatic group such as a phenyl group. The ring may be formed.
ピレン化合物は、本発明のヌクレオチド誘導体を備える１本鎖のポリヌクレオチド誘導体が相手鎖とハイブリダイズしたときに、相対する塩基種を特定できる程度の塩基識別能を発揮できる限り、どの部位でＸ２に連結されていてもよいが、一般式（１）に表されるように結合することができる。 As long as a single-stranded polynucleotide derivative comprising the nucleotide derivative of the present invention is hybridized with the partner strand, the pyrene compound can be X 2 at any site as long as it can exhibit a base distinguishing ability that can identify the opposite base species. May be linked to each other, but can be bonded as represented by the general formula (1).
また、一般式（１）における蛍光物質Ｙ１としてのアントラセン化合物は、アントラセン骨格を有し、アントラセン骨格に結合する水素原子は置換されていてもよいものである。すなわち、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８及びＲ１９は、それぞれ独立して水素原子又は置換基を表している。置換基としては、例えば、ハロゲン原子、含酸素基、含窒素基、含硫黄基及びこれらの原子や置換基を有していてもよい炭化水素基若しくは複素環基であり、ピレン化合物についての置換基の各種態様を適用できる。また、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８及びＲ１９の隣接するもの同士が結合して置換されていてもよいフェニル基などの芳香族等の環を形成してもよい。 In addition, the anthracene compound as the fluorescent substance Y 1 in the general formula (1) has an anthracene skeleton, and a hydrogen atom bonded to the anthracene skeleton may be substituted. That is, R 11 , R 12 , R 13 , R 14 , R 15 , R 16 , R 17 , R 18 and R 19 each independently represent a hydrogen atom or a substituent. Examples of the substituent include a halogen atom, an oxygen-containing group, a nitrogen-containing group, a sulfur-containing group, and a hydrocarbon group or a heterocyclic group that may have these atoms and substituents. Various aspects of the group can be applied. Also, R 11 , R 12 , R 13 , R 14 , R 15 , R 16 , R 17 , R 18 and the adjacent ones of R 19 may be bonded to each other and substituted with an aromatic group such as a phenyl group The ring may be formed.
アントラセン化合物は、本発明のヌクレオチド誘導体を備える１本鎖のポリヌクレオチド誘導体が相手鎖とハイブリダイズしたときに、相対する塩基種を特定できる程度の塩基識別能を有している限り、どの部位でＸ２に連結されていてもよいが、一般式（１）に表されるように結合することができる。 As long as the anthracene compound has a base discriminating ability that can identify the opposite base species when a single-stranded polynucleotide derivative comprising the nucleotide derivative of the present invention is hybridized with the partner strand, at any site it may be linked to X 2, but may be coupled as represented by the general formula (1).
また、一般式（１）における蛍光物質Ｙ２としては、フルオレセインおよびその誘導体が挙げられる。例えば、以下の一般式（１１）〜（１８）式に挙げる化合物を用いることができる。これらはいずれもフルオレセイン誘導体である。 As the fluorescent material Y 2 in the general formula (1) include fluorescein and its derivatives. For example, the compounds listed in the following general formulas (11) to (18) can be used. These are all fluorescein derivatives.
これらのＹ１及びＹ２は、プリン塩基又はピリミジン塩基とはリンカーを介して結合している。ここで、リンカーとは、一般式（１）において塩基ＢとＹ１とＹ２とのそれぞれの間に構造の全てを含むものとする。リンカーの一部を構成するＸ１、Ｘ２及びＸ３の種類は特に限定しないが、例えば、それぞれ独立に以下の式（１９）において表される以下の群から選択されるいずれかとすることができる。なかでも、アミド基やカルボニル基を含む基が好ましい。
ｎ１、ｎ２及びｎ３並びにＸ１、Ｘ２及びＸ３が備えるアルキレン基におけるｎ４及びｎ５はそれぞれ０以上５以下の整数を表している。プリン塩基又はピリミジン塩基におけるリンカーの結合部位は、ピリミジン塩基の場合には、第４位又は第５位とすることができ、プリン塩基の場合には、第７位又は第８位とすることができる。 n 4 and n 5 in the alkylene group included in n 1 , n 2 and n 3 and X 1 , X 2 and X 3 each represent an integer of 0 or more and 5 or less. In the case of a pyrimidine base, the binding site of the linker in the purine base or pyrimidine base can be the 4th or 5th position, and in the case of a purine base, it can be the 7th or 8th position. it can.
また、Ｙ３は、メチレン基、エチレン基、ビニレン基又はエチニレン基を表している。 Y 3 represents a methylene group, an ethylene group, a vinylene group or an ethynylene group.
一般式（１）において塩基Ｂがピリミジン塩基のウラシルであるヌクレオチド誘導体は一般式（２）に表され、シトシンであるヌクレオチド誘導体は一般式（３）に表され、塩基Ｂがプリン塩基のアデニンであるヌクレオチド誘導体は一般式（４）に表され、グアニンであるヌクレオチド誘導体は一般式（５）に表される。ウラシル誘導体及びシトシン誘導体は、ピリミジン塩基の第５位にリンカーを介してＹ１が結合した構造を有している。なお、塩基の構造上、このウラシル誘導体は、デオキシリボヌクレオチド誘導体であるチミン誘導体ということもできる。また、アデニン誘導体は、プリン塩基の第７位にリンカーを介してＹ１が結合した構造を有し、グアニン誘導体は、プリン塩基の第８位にリンカーを介してＹ１が結合した構造を有している。 In general formula (1), a nucleotide derivative in which base B is a pyrimidine base uracil is represented by general formula (2), a nucleotide derivative in which cytosine is represented by general formula (3), and base B is an adenine of purine base. A certain nucleotide derivative is represented by the general formula (4), and a nucleotide derivative that is guanine is represented by the general formula (5). The uracil derivative and cytosine derivative have a structure in which Y 1 is bonded to the 5th position of the pyrimidine base via a linker. In terms of the base structure, this uracil derivative can also be referred to as a thymine derivative that is a deoxyribonucleotide derivative. Also, adenine derivatives have a seventh position Y 1 via a linker is bound to the structure of the purine base, guanine derivatives have a structure in which Y 1 is bonded via a linker to the 8-position of the purine bases is doing.
こうしたヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体は、塩基識別性ヌクレオチド誘導体（以下、本発明のヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体を塩基識別性ヌクレオチド誘導体ともいう。）としてプローブなどに用いることができる。例えば、Ｙ１としてピレン化合物を有し、Ｙ２として５−ＦＡＭを導入したウラシル誘導体のリン酸モノエステル体がホスホジエステル結合を介して備えるポリヌクレオチド誘導体が相手鎖とハイブリダイズした際、ウラシル誘導体のウラシル基が相対する塩基がアデニンであるときのハイブリダイズ産物の発光強度２．１、相対する塩基がアデニン以外の塩基、すなわち、チミン、グアニン及びシトシンの場合のハイブリダイズ産物よりも大きい。具体的には、相対する塩基がシトシンのときには０．９、グアニンのときには０．９及びチミンのときには０．９の発光強度を得ることができる。したがって、ウラシル誘導体は、アデニン識別可能な蛍光発光特性を有しているといえ、ウラシル誘導体は、相対する塩基種がアデニンであるか否かを判定するための塩基識別ヌクレオチド誘導体として用いることができる。なお、こうした塩基識別能力は、他の塩基を備えるヌクレオチド誘導体にも同様に適用できる。インターカレーターであり蛍光色素であるピレンを備える各種ヌクレオチド誘導体における塩基識別性（国際公開パンフレットＷＯ ２００４／０５８７９３号）によってもサポートされている。こうしたことから、シトシン誘導体は、相対する塩基種がグアニンであるか否かを判定するための塩基識別ヌクレオチド誘導体として、アデニン誘導体は、相対する塩基種がシトシンであるか否かを判定するための塩基識別ヌクレオチド誘導体として、グアニン誘導体は、相対する塩基種がチミン又はウラシル若しくはシトシンであるか否かを判定するための塩基識別ヌクレオチド誘導体として使用することができる。 Such a phosphate monoester derivative of a nucleotide derivative can be used for a probe or the like as a base-discriminating nucleotide derivative (hereinafter, the phosphate monoester derivative of the nucleotide derivative of the present invention is also referred to as a base-discriminating nucleotide derivative). For example, when a polynucleotide derivative comprising a phosphoric monoester of a uracil derivative having a pyrene compound as Y 1 and introducing 5-FAM as Y 2 through a phosphodiester bond is hybridized with a partner chain, the uracil derivative The luminescence intensity of the hybridized product when the base to which the uracil group is opposite is adenine is 2.1, which is larger than the hybrid product in the case where the base to be opposed is a base other than adenine, that is, thymine, guanine and cytosine. Specifically, a light emission intensity of 0.9 can be obtained when the opposite base is cytosine, 0.9 when guanine is used, and 0.9 when thymine is used. Therefore, it can be said that the uracil derivative has a fluorescent property capable of discriminating adenine, and the uracil derivative can be used as a base discriminating nucleotide derivative for determining whether or not the opposite base species is adenine. . Such base discrimination ability can be similarly applied to nucleotide derivatives having other bases. It is also supported by base discriminability (international pamphlet WO 2004/058793) in various nucleotide derivatives comprising an intercalator and a fluorescent dye, pyrene. Therefore, the cytosine derivative is used as a base identification nucleotide derivative for determining whether or not the opposite base species is guanine, and the adenine derivative is used for determining whether or not the opposite base species is cytosine. As a base-identifying nucleotide derivative, a guanine derivative can be used as a base-identifying nucleotide derivative for determining whether or not the opposite base species is thymine, uracil or cytosine.
また、このウラシル誘導体を用いたハイブリダイズ産物の励起スペクトルによれば、ウラシル誘導体は、相対する塩基がアデニンのときに３５０ｎｍ近傍において励起される。そして、ウラシル誘導体が相対する塩基がアデニンである相手鎖のハイブリダイズ産物の蛍光波長は５１６ｎｍ近傍であり、従来ピレン単独により得られている蛍光波長である４００ｎｍ近傍よりも約１１０ｎｍ程度長波長側にシフトされている。なお、この蛍光は、ピレン化合物でなくフルオレセイン誘導体の蛍光であるともに、約４００ｎｍにあるピレン化合物の蛍光は観察されていない。こうした長波長側へのシフトにより、蛍光シグナルを識別しやすくなり、検出感度や検出精度及び再現性が向上される。 Moreover, according to the excitation spectrum of the hybridized product using this uracil derivative, the uracil derivative is excited in the vicinity of 350 nm when the opposite base is adenine. And the fluorescence wavelength of the hybridization product of the partner strand whose base opposite to the uracil derivative is adenine is around 516 nm, and is about 110 nm longer than the neighborhood of 400 nm which is the fluorescence wavelength obtained by conventional pyrene alone. It has been shifted. This fluorescence is not a pyrene compound but a fluorescein derivative, and no fluorescence of the pyrene compound at about 400 nm is observed. Such a shift toward the long wavelength side makes it easy to identify the fluorescent signal, and detection sensitivity, detection accuracy, and reproducibility are improved.
本発明のヌクレオチド誘導体は、これの前駆体とするヌクレオシド誘導体から常法により得ることができる。すなわち、ヌクレオシド誘導体にＰＯＣｌ３及びリン酸トリメチルを添加することにより、ヌクレオチド誘導体リン酸モノエステル体（ｍ＝１）が得られる。さらに、ピロリン酸トリブチルアンモニウム塩を添加することにより、リン酸トリエステル体が得られる。 The nucleotide derivative of the present invention can be obtained by a conventional method from a nucleoside derivative used as a precursor thereof. That is, by adding POCl 3 and trimethyl phosphate to a nucleoside derivative, a nucleotide derivative phosphate monoester (m = 1) is obtained. Furthermore, a phosphoric acid triester is obtained by adding tributylammonium pyrophosphate.
（ヌクレオシド誘導体）
本発明のヌクレオシド誘導体は、ヌクレオシド誘導体中の塩基にリンカーを介して２種類の蛍光物質を備えるか、あるいは、前記リンカーを介して１種類の蛍光物質と蛍光物質を導入可能な官能基又は保護された該官能基とを備えている。蛍光物質についてはヌクレオチド誘導体及びリンカーについてはヌクレオチド誘導体について説明したとおりである。
(Nucleoside derivatives)
The nucleoside derivative of the present invention comprises two kinds of fluorescent substances via a linker at the base in the nucleoside derivative, or a functional group capable of introducing one kind of fluorescent substance and the fluorescent substance via the linker or a protected group. And the functional group. Regarding the fluorescent substance, the nucleotide derivative and the linker are as described for the nucleotide derivative.
本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば、一般式（６）に表される。なお、一般式（６）〜（１０）におけるＢ、Ｙ１、Ｙ２及びＹ３、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４及びｎ５、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０並びにＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８及びＲ１９については、一般式（１）についてのこれらの基の態様を適用するものである。また、Ｒ２０は、水素原子又は置換基とすることができる。Ｒ２０としては、例えば、オリゴヌクレオチド合成のためのシアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルフォスフォロアミダイト基などが挙げられる。また、Ｒ２１についても水素原子又は置換基とすることができる。置換基としては、オリゴヌクレオチド合成のためのジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）などが挙げられる。一般式（６）において塩基Ｂがピリミジン塩基のウラシルであるヌクレオシド誘導体は一般式（７）に表され、シトシンであるヌクレオシド誘導体は一般式（８）に表され、塩基Ｂがプリン塩基のアデニンであるヌクレオシド誘導体は一般式（９）に表され、グアニンであるヌクレオシド誘導体は一般式（１０）に表される。 The nucleoside derivative of the present invention is represented by, for example, general formula (6). In the general formulas (6) to (10), B, Y 1 , Y 2 and Y 3 , X 1 , X 2 and X 3 , n 1 , n 2 , n 3 , n 4 and n 5 , R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and R 10 and R 11 , R 12 , R 13 , R 14 , R 15 , R 16 , R 17 , R 18 And R 19 apply the embodiment of these groups with respect to the general formula (1). R 20 can be a hydrogen atom or a substituent. Examples of R 20 include a cyanoethyl-N, N′-diisopropyl phosphoramidite group for oligonucleotide synthesis. R 21 can also be a hydrogen atom or a substituent. Examples of the substituent include a dimethoxytrityl group (DMTr) for oligonucleotide synthesis. In the general formula (6), the nucleoside derivative in which the base B is pyrimidine base uracil is represented by the general formula (7), the nucleoside derivative in cytosine is represented by general formula (8), and the base B is a purine base adenine. A certain nucleoside derivative is represented by the general formula (9), and a nucleoside derivative that is guanine is represented by the general formula (10).
この態様のヌクレオシド誘導体は、常法により合成することができる。例えば、塩基のリンカー導入部位に脱離基としてのヨウ素原子を導入したものを用意する。一方、例えば、実施例に示すように、ピレン化合物と末端アミノ基を保護したリジン誘導体とからピレニル基と保護されたアミノ基を有し、リジンのカルボン酸部位に酸アミド結合を介してアセチニル基を導入したものを用意する。これらを常法により塩基のヨウ素原子とアセチニル基とのカップリング反応を行う。さらに保護されたアミノ基に蛍光物質を導入することにより、本発明のヌクレオシド誘導体が得られる。 The nucleoside derivative of this embodiment can be synthesized by a conventional method. For example, one in which an iodine atom as a leaving group is introduced into a base linker introduction site is prepared. On the other hand, for example, as shown in the Examples, a pyrene compound and a lysine derivative with a terminal amino group protected have a pyrenyl group and a protected amino group, and an acetylinyl group is bonded to the carboxylic acid site of lysine via an acid amide bond. Prepare what you have introduced. These are subjected to a coupling reaction between the iodine atom of the base and the acetinyl group by a conventional method. Furthermore, the nucleoside derivative of the present invention can be obtained by introducing a fluorescent substance into the protected amino group.
また、本発明のヌクレオシド誘導体において、１種類の蛍光物質と蛍光物質を導入可能な官能基又は保護された該官能基とを備える態様、例えば、一般式(６)においては、Ｙ１及びＹ２のいずれか一方が蛍光物質であり他方がアミノ酸保護基を表す態様は、オリゴヌクレオチド合成後に、ポスト修飾でＹ１又はＹ２を導入するのに有用である。ここでいう蛍光物質とは、上記したＹ１及びＹ２として記載した全ての化合物を包含する。また、蛍光物質を導入可能な官能基とは、特に限定しないで、アミノ基を始めとする公知の官能基を用いることができる。例えば、アミノ基の保護基とは、オリゴヌクレオチド合成中においてアミノ基を保護できるものであればよく、ＴＦＡ（トリフルオロアセチル基）やＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル基）が挙げられる。こうした態様のヌクレオシド誘導体も、例えば実施例に示すように常法により合成できる。 In addition, in the nucleoside derivative of the present invention, an embodiment having one type of fluorescent substance and a functional group capable of introducing the fluorescent substance or the protected functional group, for example, in the general formula (6), Y 1 and Y 2 The embodiment in which either one is a fluorescent substance and the other represents an amino acid protecting group is useful for introducing Y 1 or Y 2 by post-modification after oligonucleotide synthesis. The fluorescent substance here includes all the compounds described as Y 1 and Y 2 described above. The functional group into which the fluorescent substance can be introduced is not particularly limited, and a known functional group such as an amino group can be used. For example, the amino group protecting group may be any group capable of protecting the amino group during oligonucleotide synthesis, and examples thereof include TFA (trifluoroacetyl group) and Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl group). Such a nucleoside derivative can also be synthesized by a conventional method as shown in the Examples.
（ポリヌクレオチド誘導体）
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、上記ヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体の１種又は２種以上をホスホジエステル結合を介して備えている。こうしたポリヌクレオチド誘導体は、一般式（２０）で表されるユニットの１種又は２種以上を備えることとなる。本発明のポリヌクレオチド誘導体を構成する全てのユニットが上記ユニットを備えていてもよいし、一部が上記ユニットであってもよい。本発明のヌクレオチド誘導体は、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよいし、ＤＮＡとＲＮＡとのキメラであってもよい。また、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。また、必要に応じてヌクレアーゼ耐性を付与するような修飾がなされていてもよいし、本発明のヌクレオチド誘導体以外のヌクレオチド誘導体を含んでいてもよい。
The polynucleotide derivative of the present invention comprises one or more phosphate monoesters of the above nucleotide derivative via a phosphodiester bond. Such a polynucleotide derivative includes one or more units represented by the general formula (20). All the units constituting the polynucleotide derivative of the present invention may be provided with the above unit, or a part thereof may be the above unit. The nucleotide derivative of the present invention may be DNA, RNA, or a chimera of DNA and RNA. Moreover, a single strand may be sufficient and a double strand may be sufficient. Moreover, the modification which provides nuclease tolerance may be made | formed as needed, and nucleotide derivatives other than the nucleotide derivative of this invention may be included.
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、その重合鎖中のある位置に上記ヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体（塩基識別性ヌクレオチド誘導体）を備え、標的ヌクレオチド中の相対するヌクレオチド（塩基）が当該塩基であるときに、当該塩基を識別できる蛍光発光を発する。例えば、こうした本発明のポリヌクレオチド誘導体は、標的ヌクレオチドのある部位が塩基識別性ヌクレオチドによって識別可能な特定塩基のときには強く発光し、当該特定塩基以外のときには発光しないかあるいは弱く発光する。このために、本発明のポリヌクレオチド誘導体は、ハイブリダイズする相手鎖の特定位置の塩基種を識別できる。本発明のポリヌクレオチド誘導体は、特定塩基と相対したときには、ＦＲＥＴによって識別性の高い長波長側の蛍光波長を発する。このために、より確実に特定位置の塩基を識別することができる。したがって、本発明のポリヌクレオチド誘導体は、以下の用途に利用できる。 The polynucleotide derivative of the present invention comprises a phosphate monoester (base-identifying nucleotide derivative) of the above nucleotide derivative at a certain position in the polymer chain, and the opposite nucleotide (base) in the target nucleotide is the base. Sometimes it emits fluorescence that can identify the base. For example, such a polynucleotide derivative of the present invention emits strong light when a certain site of the target nucleotide is a specific base that can be identified by a base-identifying nucleotide, and emits light weakly or not when it is other than the specific base. For this reason, the polynucleotide derivative of the present invention can identify the base species at a specific position of the partner strand to be hybridized. When the polynucleotide derivative of the present invention is opposed to a specific base, it emits a fluorescence wavelength on the long wavelength side with high discrimination by FRET. For this reason, the base of a specific position can be identified more reliably. Therefore, the polynucleotide derivative of the present invention can be used for the following uses.
（１）標的核酸と相補的なポリヌクレオチド誘導体は、プローブとして用いることにより、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を決定できる。同様の方法でＳＮＰの検出に利用できる。特に、こうしたポリヌクレオチド誘導体をビーズや基板等の固相に固定化した固定化体とすることにより、特定核酸配列を有するか否かを確認できる。特に、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を決定できる。
（２）アンチセンスポリヌクレオチドに代えて使用する場合には、通常のポリヌクレオチドとは異なるために、核酸分解酵素（例えば制限酵素）や核酸結合タンパク質（例えば転写因子）等の標的核酸への結合を阻害できる。このことから、これらの作用を利用した実験用試薬として利用できる。
（３）それ自体蛍光を発するため、核酸の蛍光ラベルに使用できる。
（４）ＤＮＡ複製において、複製されるＤＮＡと相補的なプローブとして使用することによりＤＮＡ複製のリアルタイム検出ができる。同様に、ＲＮＡへの転写において、転写されるＲＮＡと相補的なプローブとして使用することによりＲＮＡ転写のリアルタイム検出ができる。
（５）相補的配列とハイブリダイズすることにより蛍光波長のシフトが起こるようなポリヌクレオチド誘導体である場合は、蛍光波長のシフトにより当該ポリヌクレオチド誘導体の酸化還元電位が変化する。このため、電極上に本発明のポリヌクレオチド誘導体を固定しておき、被験ポリヌクレオチドをこの電極に作用させて酸化還元電位を測定する方法で、核酸配列応答性のバイオセンサーとして利用できる。
（６）本発明のポリヌクレオチドは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に供される蛍光性プローブとして利用できる。
(1) By using a polynucleotide derivative complementary to a target nucleic acid as a probe, the type of nucleotide at a specific position of the target nucleic acid can be determined. It can be used for detecting SNPs in a similar manner. In particular, it is possible to confirm whether or not the polynucleotide derivative has a specific nucleic acid sequence by using an immobilized body in which such a polynucleotide derivative is immobilized on a solid phase such as a bead or a substrate. In particular, the type of nucleotide at a specific position of the target nucleic acid can be determined.
(2) When used in place of an antisense polynucleotide, since it differs from a normal polynucleotide, it binds to a target nucleic acid such as a nucleolytic enzyme (for example, a restriction enzyme) or a nucleic acid binding protein (for example, a transcription factor). Can be inhibited. Therefore, it can be used as an experimental reagent utilizing these actions.
(3) Since it emits fluorescence itself, it can be used as a fluorescent label for nucleic acids.
(4) In DNA replication, real-time detection of DNA replication can be performed by using it as a probe complementary to the DNA to be replicated. Similarly, in transcription to RNA, real-time detection of RNA transcription can be performed by using it as a probe complementary to RNA to be transcribed.
(5) In the case of a polynucleotide derivative that causes a fluorescence wavelength shift by hybridization with a complementary sequence, the redox potential of the polynucleotide derivative changes due to the fluorescence wavelength shift. For this reason, the polynucleotide derivative of the present invention is immobilized on an electrode, and a test polynucleotide is allowed to act on this electrode to measure the oxidation-reduction potential, which can be used as a nucleic acid sequence-responsive biosensor.
(6) The polynucleotide of the present invention can be used as a fluorescent probe to be subjected to fluorescence in situ hybridization (FISH).
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、例えば核酸自動合成機を用いたホスホロアミダイト法による化学合成方法において、特定ヌクレオシドに代えて本発明のヌクレオシド誘導体を用いることにより合成できる。また、本発明のポリヌクレオチド誘導体は、通常のヌクレオシドとアミノ酸保護基をＹ１又はＹ２に有するヌクレオシド誘導体を用いてポリヌクレオチド誘導体を合成した後、ポスト修飾により保護されたアミノ基に対して蛍光物質等を導入して合成することもできる。 The polynucleotide derivative of the present invention can be synthesized, for example, by using the nucleoside derivative of the present invention in place of the specific nucleoside in a chemical synthesis method using a phosphoramidite method using an automatic nucleic acid synthesizer. In addition, the polynucleotide derivative of the present invention synthesizes a polynucleotide derivative using a normal nucleoside and a nucleoside derivative having an amino acid protecting group in Y 1 or Y 2 and then fluoresces an amino group protected by post-modification. It can also be synthesized by introducing substances.
（プローブ及びプローブセット）
本発明のプローブは、１種又は２種以上の塩基識別性ヌクレオチド誘導体をホスホジエスエル結合を介して備えるポリヌクレオチド誘導体である。本プローブについては、上記した本発明のポリヌクレオチド誘導体としての各種の態様を適用することができる。また、本プローブにおいて、塩基識別性ヌクレオチド誘導体は、標的ポリヌクレオチドの検出しようとするｌ個又は２個以上の塩基種に対応して備えられている。これにより、試料中に含まれる標的ポリヌクレオチドの特定位置の塩基種を判定できる。プローブにおけるヌクレオチド数は例えば４〜１００個程度、好ましくは１０〜３０個程度とすることができる。プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラのいずれであってもよく、１本鎖又は２本鎖である。さらに、試料が細胞抽出液等のヌクレアーゼを含むものである場合には、ヌクレアーゼにより切断され難いように、ホスホロチオエートＤＮＡ又はＲＮＡ、Ｈ−ホスホネートＤＮＡ又はＲＮＡ等の修飾核酸であってもよい。
(Probe and probe set)
The probe of the present invention is a polynucleotide derivative comprising one or more base-identifying nucleotide derivatives via a phosphodiesel bond. Various aspects of the above-described polynucleotide derivative of the present invention can be applied to the probe. Further, in this probe, the base discriminating nucleotide derivative is provided corresponding to one or two or more base species to be detected by the target polynucleotide. Thereby, the base type of the specific position of the target polynucleotide contained in the sample can be determined. The number of nucleotides in the probe can be, for example, about 4 to 100, preferably about 10 to 30. The probe may be any of DNA, RNA, and DNA / RNA chimera, and is single-stranded or double-stranded. Furthermore, when the sample contains a nuclease such as a cell extract, it may be a modified nucleic acid such as phosphorothioate DNA or RNA, H-phosphonate DNA or RNA so that it is not easily cleaved by the nuclease.
プローブにおける塩基識別性ヌクレオチド誘導体の導入個数や位置などの態様は、決定しようとする塩基種の数や変異のタイプ等によって適宜設定される。プローブの各種形態については、後段にて説明する。 Aspects such as the number and position of base-discriminating nucleotide derivatives introduced into the probe are appropriately set depending on the number of base species to be determined, the type of mutation, and the like. Various forms of the probe will be described later.
本発明のプローブセットは、例えば、１個又は２個以上の塩基配列の判別等を目的として、２種類以上の本発明のプローブを組み合わせたプローブセットである。本発明のプローブは、標的ポリヌクレオチド中の一つのＳＮＰを特定するためにも、特定部位において２種類以上の塩基識別性ヌクレオチドをそれぞれ備えるプローブを要することが多い。こうしたプローブセットは、例えば、ガン、生活習慣病などの疾患関連遺伝子、体質関連遺伝子、薬剤耐性関連遺伝子等に関するＳＮＰタイピングのためのセットとすることができる。 The probe set of the present invention is a probe set in which two or more kinds of probes of the present invention are combined, for example, for the purpose of discriminating one or two or more base sequences. In order to specify one SNP in the target polynucleotide, the probe of the present invention often requires probes each having two or more kinds of base-identifying nucleotides at a specific site. Such a probe set can be a set for SNP typing related to, for example, disease-related genes such as cancer and lifestyle-related diseases, constitution-related genes, drug resistance-related genes and the like.
（ハイブリダイゼーション方法）
本発明のハイブリダイゼーション方法は、本発明のプローブと標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程と、前記ハイブリダイゼーションのハイブリダイズ産物の蛍光を測定する工程と、ハイブリダイズ産物の蛍光測定結果と使用したプローブが備えるヌクレオチド誘導体の塩基を識別可能な蛍光発光特性とに基づいて標的ポリヌクレオチド中の１個又は２個以上の塩基種を同定する評価工程とを、を備えることを特徴としている。
(Hybridization method)
The hybridization method of the present invention comprises a hybridization step of hybridizing the probe of the present invention and a target polynucleotide, a step of measuring the fluorescence of the hybridized product of the hybridization, and a result of measuring the fluorescence of the hybridized product. And an evaluation step for identifying one or more base species in the target polynucleotide based on the fluorescence emission characteristic capable of identifying the base of the nucleotide derivative provided in the probe.
標的ポリヌクレオチドとは、本発明のプローブで分析しようとする標的ヌクレオチド又は配列を有するものであればよく、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、また、１本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。また、こうした標的ポリヌクレオチドを含む試料は、通例、細胞抽出液、血液のような体液、ＰＣＲ産物等を用いることができる。 The target polynucleotide only needs to have the target nucleotide or sequence to be analyzed by the probe of the present invention, and may be DNA or RNA, or may be a single-stranded oligonucleotide. Good. In addition, as a sample containing such a target polynucleotide, a cell extract, a body fluid such as blood, a PCR product, or the like can be generally used.
ハイブリダイゼーション工程は、プローブが固定化されていない液相内において行うこともできるし、プローブを固定化した状態で行うこともできる。ハイブリダイゼーション工程は、従来とおり、通常のＤＮＡアレイ等を用いたハイブリダイゼーションと同様に行うことができるが、本発明のハイブリダイゼーション工程における標的ポリヌクレオチドは、標識されていなくてもよい。本方法によれば、プローブ自体が識別性を有しているため、試料ポリヌクレオチドの標識化が不要となっている。したがって、標識誤差による再現性の低下や精度の低下を排除できる。 The hybridization step can be performed in a liquid phase where the probe is not immobilized, or can be performed in a state where the probe is immobilized. The hybridization step can be performed in the same manner as in the conventional hybridization using a normal DNA array or the like, but the target polynucleotide in the hybridization step of the present invention may not be labeled. According to this method, since the probe itself is discriminating, labeling of the sample polynucleotide is unnecessary. Accordingly, it is possible to eliminate a decrease in reproducibility and a decrease in accuracy due to a labeling error.
本方法では、ハイブリダイゼーション工程後のハイブリダイゼーション後の洗浄工程をすることなく蛍光検出を行うことができる。標的ポリヌクレオチドを標識するものではないことと、プローブ自体が相対する塩基を識別可能な蛍光発光特性を有し、相対する塩基が特定塩基以外の場合には、蛍光が発生しないか相対的に低い蛍光しか発生しないからである。したがって、例えば、プローブを基板など固相に固定化して用いる場合など、ハイブリダイズしなかった試料中の核酸がそのまま存在してもよく、こうしたポリヌクレオチドを洗浄により除去する必要もない。したがって、洗浄工程に起因する測定誤差も排除される。したがって、本方法は、プローブが固相に固定化されたプローブ固定化体、特に基板に固定化されたものに好ましく適用される。 In this method, fluorescence detection can be performed without performing a washing step after hybridization after the hybridization step. It does not label the target polynucleotide and has a fluorescence emission characteristic that allows the probe itself to discriminate the opposite base, and when the opposite base is other than a specific base, fluorescence does not occur or is relatively low This is because only fluorescence is generated. Therefore, for example, when the probe is used after being immobilized on a solid phase such as a substrate, the nucleic acid in the sample that has not hybridized may exist as it is, and it is not necessary to remove such a polynucleotide by washing. Accordingly, measurement errors due to the cleaning process are also eliminated. Therefore, this method is preferably applied to a probe-immobilized body in which a probe is immobilized on a solid phase, particularly one that is immobilized on a substrate.
さらに、本ハイブリダイゼーション工程によれば、相対する塩基を識別可能な特異的な蛍光発光特性を示し、本来ハイブリダイゼーションすべきでないヌクレオチドとプローブとのハイブリダイズ産物が誤って生成されてもそうした蛍光発光を発しない。すなわち、ミスハイブリダイゼーションによる塩基識別性への影響は排除されている。したがって、本発明方法のハイブリダイゼーション工程によれば、ミスハイブリダイゼーションによるノイズを排除することができる。 Furthermore, according to the present hybridization step, specific fluorescence emission characteristics that can distinguish the opposite bases are shown, and even if a hybridization product of a nucleotide and a probe that should not be originally hybridized is erroneously generated, such fluorescence emission is caused. Does not emit. That is, the influence on base discrimination due to mishybridization is eliminated. Therefore, according to the hybridization step of the method of the present invention, noise due to mishybridization can be eliminated.
蛍光測定工程における蛍光検出は、常法に従い、照射波長２５０〜６００ｎｍ程度で測定すればよい。ハイブリダイズ前のポリヌクレオチド誘導体の蛍光スペクトル測定と、ハイブリダイズ産物の蛍光スペクトル測定とを行うことが好ましい。こうしたハイブリダイズ前後のスペクトルを比較して、塩基識別性ヌクレオチドを含むプローブの本来の識別能力が発揮されたか否かを確認しておくことにより、ハイブリダイゼーション反応が適性であったかどうかを判定できる。 The fluorescence detection in the fluorescence measurement step may be measured at an irradiation wavelength of about 250 to 600 nm according to a conventional method. It is preferable to perform fluorescence spectrum measurement of the polynucleotide derivative before hybridization and fluorescence spectrum measurement of the hybridized product. By comparing the spectra before and after such hybridization and confirming whether or not the original discriminating ability of the probe containing the base discriminating nucleotide has been exhibited, it can be determined whether or not the hybridization reaction was appropriate.
また、評価工程では、ハイブリダイズ産物の蛍光測定結果と、用いたプローブにおいて予め取得されている蛍光発光特性とに基づいて標的ポリヌクレオチド中の１個又は２個以上の塩基種を同定する。例えば、標的ポリヌクレオチド中の一つの塩基を特定するために、この塩基に相対する部位に、可能性のある４種の塩基にそれぞれ対応する本発明のヌクレオチド誘導体を備える４種のプローブを用いた場合、この４種のプローブのうちどのプローブが塩基特異的な固有の蛍光発光特性を発現しているかを判定する。そうした固有の蛍光発光特性を発現しているプローブの認識する塩基種が、未知の塩基種である。 In the evaluation step, one or more base species in the target polynucleotide are identified based on the fluorescence measurement result of the hybridized product and the fluorescence emission characteristics acquired in advance in the used probe. For example, in order to specify one base in the target polynucleotide, four types of probes each having a nucleotide derivative of the present invention corresponding to each of four possible bases were used at positions corresponding to this base. In this case, it is determined which of the four types of probes expresses the specific fluorescence emission characteristic specific to the base. A base species recognized by a probe expressing such a unique fluorescence emission characteristic is an unknown base species.
なお、一つの塩基を２種以上の塩基識別性ヌクレオチド誘導体が識別する場合や、一つの塩基識別性ヌクレオチド誘導体が２種類の塩基を識別する場合がある。このような場合には、こうした塩基識別性ヌクレオチド誘導体による蛍光発光特性を組み合わせて判定する。 There are cases where two or more base-identifying nucleotide derivatives identify one base, or one base-identifying nucleotide derivative identifies two types of bases. In such a case, determination is made by combining the fluorescence emission characteristics of such base-identifying nucleotide derivatives.
本発明のハイブリダイゼーション方法によれば、プローブとして、相手鎖とハイブリダイズしたとき、相対する塩基に特異的な蛍光発光特性を発現する塩基識別性ヌクレオチド誘導体を備えるプローブを用いるため、特定部位の塩基種を直接的に判定できる。したがって、ＳＮＰ検出のほか、未知の塩基配列も決定できるとともに、既知領域との相同性や変異部位も容易に検出できる。 According to the hybridization method of the present invention, since a probe having a base-discriminating nucleotide derivative that expresses fluorescence emission characteristics specific to the opposite base when hybridized with a partner strand is used as a probe, Species can be determined directly. Therefore, in addition to SNP detection, an unknown base sequence can be determined, and homology with a known region and a mutation site can be easily detected.
（ＳＮＰ検出方法）
本発明のＳＮＰ検出方法は、上記したハイブリダイゼーション方法を用いて実施する。すなわち、前記既知配列中の特定塩基種を判定する態様である。ＳＮＰ検出方法においては、プローブを、標的ヌクレオチド配列中のＳＮＰ塩基以外の塩基配列と相補的とするとともに、ＳＮＰ塩基に相対する部位に塩基識別性ヌクレオチド誘導体を備えるようにする。具体的には、ＳＮＰ塩基部位の塩基種を判定するために、ウラシル誘導体、シトシン誘導体、アデニン誘導体及びグアニン誘導体の１種又は２種以上を備えるようにする。どのヌクレオチド誘導体を用いるかは、ＳＮＰのタイプによるが、Ｇ／Ａ多型である場合には、Ｇ／Ｇホモ、Ｇ／Ａへテロ、Ａ／Ａホモを検出するために、少なくともグアニン認識ヌクレオチド誘導体（本発明のＡ誘導体）とアデニン識別ヌクレオチド誘導体（本発明のＵ誘導体）とをそれぞれ特定部位に備えるプローブを用いる。
(SNP detection method)
The SNP detection method of the present invention is carried out using the hybridization method described above. That is, this is an embodiment for determining a specific base species in the known sequence. In the SNP detection method, the probe is made complementary to a base sequence other than the SNP base in the target nucleotide sequence, and a base-discriminating nucleotide derivative is provided at a site opposite to the SNP base. Specifically, in order to determine the base type of the SNP base site, one or more of uracil derivatives, cytosine derivatives, adenine derivatives, and guanine derivatives are provided. Which nucleotide derivative is used depends on the type of SNP, but in the case of G / A polymorphism, at least guanine-recognizing nucleotide is used to detect G / G homo, G / A hetero, and A / A homo. Probes each having a derivative (A derivative of the present invention) and an adenine-identifying nucleotide derivative (U derivative of the present invention) at specific sites are used.
（未知配列の決定方法）
また、本発明のハイブリダイゼーション方法は、未知の塩基配列の決定方法に用いることができる。配列決定のためのプローブは、決定しようとする未知配列領域（ｎ＝１〜１００個程度）の第１位〜第ｎ位についてそれぞれ本発明の各延期に対する塩基識別ヌクレオチド誘導体を有する、４ｎ個のプローブのセットとすることが好ましい。また、既知配列との相同性やそのうちの変異部位の検出方法にも用いることができる。このためのプローブは、例えば、相同性を検出しようとする第１位〜第ｎ位までの個々のヌクレオチド位置に各塩基に対する塩基識別性ヌクレオチドを備える、４ｎ個のプローブのセットとすることが好ましい。標的ヌクレオチド配列が既知配列と完全に相同である場合には、既知配列の塩基を識別する塩基識別性ヌクレオチド誘導体を備えるプローブの全てがその蛍光発光特性により他のヌクレオチド誘導体を有するプローブから区別されることになる。一方、既知配列中に変異を有する場合には、既知配列の塩基でない塩基を識別するヌクレオチド誘導体を含むプローブによるハイブリダイズ産物の蛍光が他のプローブと区別されることになる。
(Method of determining unknown sequence)
Moreover, the hybridization method of the present invention can be used for a method for determining an unknown base sequence. Probes for sequencing have 4 n nucleotide-identifying nucleotide derivatives for each postponement of the present invention at positions 1 to n in the unknown sequence region (n = 1 to about 100) to be determined. It is preferable to use a set of probes. It can also be used in methods for detecting homology with known sequences and mutation sites. The probe for this purpose may be, for example, a set of 4 n probes comprising base-discriminating nucleotides for each base at individual nucleotide positions from the first position to the n-th position where homology is to be detected. preferable. If the target nucleotide sequence is completely homologous to a known sequence, all probes with base-discriminating nucleotide derivatives that distinguish the bases of the known sequence are distinguished from probes having other nucleotide derivatives by their fluorescence properties It will be. On the other hand, when there is a mutation in the known sequence, the fluorescence of the hybridized product by the probe containing a nucleotide derivative that identifies a base that is not a base of the known sequence is distinguished from other probes.
（プローブ固定化体）
本発明のプローブ固定化体は、本発明のプローブの１種又は２種以上が固相に固定化された固定化体である。こうしたプローブ固定化体は、本発明のハイブリダイゼーション方法等に好ましく用いることができる。
(Probe immobilized body)
The probe-immobilized body of the present invention is an immobilized body in which one or more of the probes of the present invention are immobilized on a solid phase. Such a probe-immobilized body can be preferably used in the hybridization method of the present invention.
プローブが固定化される固相は、特に限定されない、ビーズなどの粒状体、基板などのプレート状体とすることができる。プローブが塩基識別性ヌクレオチド誘導体を有しており、洗浄工程の省略等が可能であることから、本発明を適用するにあたって固相を基板にすることにメリットがある。また、固相の材料は特に限定されないで、樹脂などの有機材料、ガラスや金属などの無機材料、有機−無機複合材料などとすることができる。固相は多孔質性であっても非多孔質性であってもよい。また、固相の表面には、プローブのハイブリダイゼーション反応の領域を区画する凹凸やプローブの固定を強固するための凹凸等を備えていてもよい。 The solid phase on which the probe is immobilized is not particularly limited, and may be a granular body such as a bead or a plate-shaped body such as a substrate. Since the probe has a base-discriminating nucleotide derivative and the washing step can be omitted, there is an advantage in using a solid phase as a substrate in applying the present invention. The solid phase material is not particularly limited, and may be an organic material such as a resin, an inorganic material such as glass or metal, or an organic-inorganic composite material. The solid phase may be porous or non-porous. Further, the surface of the solid phase may be provided with unevenness for partitioning the probe hybridization region, unevenness for strengthening the probe fixation, and the like.
固相に対するプローブの固定化形態は、固相の種類に応じて適宜設定される。基板にプローブを固定化する場合、本ポリヌクレオチド誘導体の１種又は２種以上は、それぞれ別個の領域を有して配列されていることが好ましい。すなわち、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイのような形態が挙げられる。 The immobilization form of the probe to the solid phase is appropriately set according to the type of the solid phase. When immobilizing a probe on a substrate, it is preferable that one or more of the present polynucleotide derivatives are arranged with separate regions. That is, a form such as a so-called DNA chip or DNA microarray can be mentioned.
プローブの固定化形態には、共有結合、非共有結合による固定化を包含しているが、プローブがハイブリダイズ可能に固定化されている限り固定化の形態や固定化の手法は限定されない。例えば、共有結合による固定化には、プローブを基板上で合成するオンチップ合成法と合成したプローブを固相表面の所定部位に供給して共有結合させる方法がある。また、固相表面へのプローブの供給には、インクジェット方式を採用することが好ましい。インクジェット、特に、ピエゾ素子を利用したインクジェット方式によれば、微量かつ供給量を高精度に制御して供給することができるため、本発明のように、蛍光発光特性の相違に基づいて塩基種を特定する場合には、特に有効である。すなわち、本発明のプローブによる塩基種の判定のためには、プローブの固定領域（スポット）毎におけるプローブ量のバラツキが検出精度に影響するからである。 Probe immobilization forms include covalent bond and non-covalent immobilization, but the immobilization form and immobilization technique are not limited as long as the probe is immobilized in a hybridizable manner. For example, for immobilization by covalent bond, there are an on-chip synthesis method in which a probe is synthesized on a substrate and a method in which the synthesized probe is supplied to a predetermined site on a solid surface and covalently bound. Moreover, it is preferable to employ an ink jet method for supplying the probe to the solid surface. According to the inkjet method, in particular, an inkjet method using a piezo element, it is possible to supply a trace amount with a highly accurate supply amount. Therefore, as in the present invention, the base species is selected based on the difference in fluorescence emission characteristics. This is particularly effective when specifying. That is, in order to determine the base type using the probe of the present invention, the variation in the amount of probe in each probe fixed region (spot) affects the detection accuracy.
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these Examples.
（実施例１：ヌクレオチド誘導体(ＡＰｙU )の合成）
以下、図２を参照しながら、ヌクレオチド誘導体(ＡＰｙU )の合成法を説明する。なお、化合物の番号は、図２に示す化合物の番号に対応している。
Example 1: Nucleotide derivatives ( APy U )
Hereinafter, a method for synthesizing a nucleotide derivative ( APy U) will be described with reference to FIG. The compound numbers correspond to the compound numbers shown in FIG.
（化合物２の合成）
窒素雰囲気下、ピレンカルボン酸（２００ｍｇ，０．８１２ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド６．０ｍｌに溶解しＰｙＢＯＰ（５４９．３ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、化合物（１）（４４７．８ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（３１７．８ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）を加え、１８時間撹拌した。反応溶媒を減圧留去した後、水を加えクロロホルムで抽出して目的の化合物２を粗精製物として得て、これを用いて化合物３を合成した。
(Synthesis of Compound 2)
Under a nitrogen atmosphere, pyrenecarboxylic acid (200 mg, 0.812 mmol) was dissolved in 6.0 ml of anhydrous N, N′-dimethylformamide, and PyBOP (549.3 mg, 1.05 mmol) was added. After stirring at room temperature for 1 hour and confirming the disappearance of the raw materials by thin layer chromatography (TLC), Compound (1) (447.8 mg, 1.05 mmol) and diisopropylethylamine (317.8 mg, 1.05 mmol) were added, Stir for 18 hours. After the reaction solvent was distilled off under reduced pressure, water was added and the mixture was extracted with chloroform to obtain the target compound 2 as a crude purified product, which was used to synthesize compound 3.
（化合物３の合成）
窒素雰囲気下、先の反応で得られた化合物２の粗精製物を無水Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド６．０ｍｌに溶解しＰｙＢＯＰ（５４９．３ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、プロパルギルアミン（５７．８ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（３１７．８ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）を加え、１８時間撹拌した。反応溶媒を減圧留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒クロロホルム／メタノール＝２０／１）により精製して目的の化合物３（１５２．４ｍｇ，０．３００ｍｍｏｌ，２段階収率３７％）を得た。なお、ＮＭＲによるデータは以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）ｄ１．５５−１．７１（ｍ，４Ｈ），１．８５−１．９７（ｍ，２Ｈ），２．６４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），３．３２−３．３５（ｍ，２Ｈ），４．０２−４．１５（ｍ，２Ｈ），４．７１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），８．０４−８．２８（ｍ，８Ｈ），８．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）．
(Synthesis of Compound 3)
Under a nitrogen atmosphere, the crude product of compound 2 obtained in the previous reaction was dissolved in 6.0 ml of anhydrous N, N′-dimethylformamide, and PyBOP (549.3 mg, 1.05 mmol) was added. After stirring at room temperature for 1 hour and confirming the disappearance of the raw materials by thin layer chromatography (TLC), propargylamine (57.8 mg, 1.05 mmol) and diisopropylethylamine (317.8 mg, 1.05 mmol) were added, and 18 hours. Stir. After the reaction solvent was distilled off under reduced pressure, the residue was purified by silica gel column chromatography (silica gel, elution solvent chloroform / methanol = 20/1) to obtain the target compound 3 (152.4 mg, 0.300 mmol, two-step yield 37). %). The NMR data were as follows.
1 H NMR (CD3OD, 400 MHz) d1.55-1.71 (m, 4H), 1.85-1.97 (m, 2H), 2.64 (t, 1H, J = 2.8 Hz), 3 .32-3.35 (m, 2H), 4.02-4.15 (m, 2H), 4.71 (t, 1H, J = 2.8 Hz), 8.04-8.28 (m, 8H), 8.49 (d, 1H, J = 9.2 Hz).
（化合物５の合成）
窒素雰囲気下、化合物４（１０１．２ｍｇ，０．１５４ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド２．５ｍｌに溶解し化合物（３）（１０１．６ｍｇ，０．２００ｍｍｏｌ）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（１７．８ｍｇ，０．０１５４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（８５．７μｌ，０．６１６ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（５．９ｍｇ，０．０３０８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で５時間撹拌して薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒クロロホルム／メタノール＝１０／１）により精製して目的の化合物（５）を無色固体（１２３．０ｍｇ，０．１１９ｍｍｏｌ，収率７７％）として得た。ＮＭＲによるデータは以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）ｄ１．４９−１．６８（ｍ，４Ｈ），１．８１−１．９６（ｍ，２Ｈ），２．２６（ｄｄｄ，Ｊ＝６．４，６．８，１３．６Ｈｚ），２．３６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，６．４，１３．６Ｈｚ），３．２０−３．３２（ｍ，４Ｈ），３．７０（ｓ，６Ｈ），４．００−４．０２（ｍ，３Ｈ），４．４５（ｍ，１Ｈ），４．７１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，９．２Ｈｚ），６．１３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），６．８０−６．８５（ｍ，４Ｈ），７．１６−７．４３（ｍ，９Ｈ），７．９５−８．１９（ｍ，９Ｈ），８．４５ （ｄ， １Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）
(Synthesis of Compound 5)
Under a nitrogen atmosphere, Compound 4 (101.2 mg, 0.154 mmol) was dissolved in 2.5 ml of anhydrous N, N′-dimethylformamide to dissolve Compound (3) (101.6 mg, 0.200 mmol), tetrakistriphenylphosphine palladium ( 0) (17.8 mg, 0.0154 mmol), triethylamine (85.7 μl, 0.616 mmol), and copper (I) iodide (5.9 mg, 0.0308 mmol) were added. After stirring at room temperature for 5 hours and confirming the disappearance of the raw materials by thin layer chromatography (TLC), the reaction solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (silica gel, elution solvent chloroform / methanol = 10/1) to obtain the target compound (5) as a colorless solid (123.0 mg, 0.119 mmol, yield 77%). The data by NMR were as follows.
1 H NMR (CD3OD, 400 MHz) d1.49-1.68 (m, 4H), 1.81-1.96 (m, 2H), 2.26 (ddd, J = 6.4, 6.8, 13.6 Hz), 2.36 (ddd, 1H, J = 3.2, 6.4, 13.6 Hz), 3.20-3.32 (m, 4H), 3.70 (s, 6H), 4.00-4.02 (m, 3H), 4.45 (m, 1H), 4.71 (dd, 1H, J = 6.0, 9.2 Hz), 6.13 (t, 1H, J = 6.4 Hz), 6.80-6.85 (m, 4H), 7.16-7.43 (m, 9H), 7.95-8.19 (m, 9H), 8.45 (d , 1H, J = 9.6 Hz)
（化合物６の合成）
窒素雰囲気下、前記で得た化合物（５）（１１６．２ｍｇ，０．０９４ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン１．０ｍｌに溶解し、１Ｈテトラゾール無水アセトニトリル溶液（０．４５Ｍ，３１４．０μｌ，０．１４１ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（４５μｌ，０．１４１ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去した。残渣を無水アセトニトリル１．０ｍｌに溶解し、コスモナイスフィルターｓ（溶媒系、ナカライテスク）でろ過した。ろ液を濃縮し、目的の化合物（６）（ＡＰｙＵ）を粗精製物として得た。ＤＮＡ 合成には化合物６の粗精製物をそのまま用いた。
(Synthesis of Compound 6)
Under a nitrogen atmosphere, the compound (5) obtained above (116.2 mg, 0.094 mmol) was dissolved in 1.0 ml of anhydrous dichloromethane, and 1H tetrazole anhydrous acetonitrile solution (0.45 M, 314.0 μl, 0.141 mmol), 2-Cyanoethyl-N, N, N ′, N′-tetraisopropyl phosphorodiamidite (45 μl, 0.141 mmol) was added. This solution was stirred at room temperature for 2 hours, and after confirming the disappearance of the raw materials by thin layer chromatography (TLC), the reaction solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in 1.0 ml of anhydrous acetonitrile and filtered through Cosmonis filter s (solvent system, Nacalai Tesque). The filtrate was concentrated to obtain the target compound (6) ( APy U) as a crude product. The crude product of compound 6 was used as it was for DNA synthesis.
（実施例２：ヌクレオチド誘導体（ＡＰｙＵ）を用いたオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成）
実施例１で製造したヌクレオチド誘導体（ＡＰｙＵ）を用いて、本発明のヌクレオチド誘導体を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、アプライドバイオシステムズ社のＤＮＡ自動合成機（３４００ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー）で通常のホスホロアミダイト法に従って合成した。合成した配列は以下の通りであった。
（ＯＤＮ（ＡＰｙＵ）：５’−ＣＧＣＡＡＴＡＰｙＵＴＡＡＣＧＣ−３’）（配列番号１）
(Example 2: Synthesis of oligodeoxyribonucleotide using nucleotide derivative ( APy U))
Using the nucleotide derivative ( APy U) produced in Example 1, an oligodeoxyribonucleotide containing the nucleotide derivative of the present invention was synthesized. Oligodeoxyribonucleotides were synthesized by an automated DNA synthesizer (3400 DNA / RNA synthesizer) manufactured by Applied Biosystems according to the usual phosphoramidite method. The synthesized sequence was as follows.
(ODN ( APy U): 5′-CGCAAT APy UTAACGC-3 ′) (SEQ ID NO: 1)
合成後、固層担体からオリゴヌクレオチドをアンモニア水を用いて切り出し、エッペンドルフチューブに移し替え、５５℃で８ 時間加熱して脱保護を行った。得られたオリゴヌクレオチドの水溶液を高速液体クロマトグラフィー（ＰＵ−２８０８ｐｌｕｓ，ＪＡＳＣＯ）で精製した。精製後、凍結乾燥機で溶媒を減圧留去することで目的の配列（ＯＤＮ（ＡＰｙＵ）を有するオリゴヌクレオチド鎖（配列番号１）を得た。なお、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる同定データは以下のとおりであった。
（［Ｍ−Ｈ］−：ｃａｌｃｄ．：４３１３．０９，ｆｏｕｎｄ：４３１３．７８．）
After synthesis, the oligonucleotide was excised from the solid layer carrier using aqueous ammonia, transferred to an Eppendorf tube, and deprotected by heating at 55 ° C. for 8 hours. The obtained aqueous solution of oligonucleotide was purified by high performance liquid chromatography (PU-2808plus, JASCO). After purification, the solvent was distilled off under reduced pressure with a freeze dryer to obtain an oligonucleotide chain (SEQ ID NO: 1) having the target sequence (ODN ( APy U). The identification data by MALDI-TOF MS is as follows. It was as follows.
([M-H]-: calcd .: 4331.09, found: 4313.78.)
（実施例３：ＦＡＭＰｙＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成）
ポストＤＮＡ修飾によりＯＤＮ（ＡＰｙＵ）からＯＤＮ（ＦＡＭＰｙＵ）を合成する方法を図３に示す。
(Example 3 : Synthesis of FAMPy U-containing oligodeoxyribonucleotide)
FIG. 3 shows a method for synthesizing ODN ( FAMPy U) from ODN ( APy U) by post-DNA modification.
（ポストＤＮＡ修飾による蛍光分子（フルオレセイン）の導入）
１ＭＮａＨＣＯ３水溶液７５μｌに、ＯＤＮ（ＡＰｙＵ）の水溶液（２７０μＭ）１５μｌ、フルオレセインＤＭＦ溶液（１ｍｇ／２５μｌ）１５μｌ、水３０μｌを加え、３７℃で１８時間反応させた。反応液にギ酸アンモニウム緩衝液（ＡＦ緩衝液）４８μｌを加えて中和し、高速液体クロマトグラフィーで目的とするオリゴヌクレオチドを分取した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより目的とするオリゴヌクレオチドＯＤＮ（ＦＡＭＰｙＵ）（配列番号６）が得られたことを確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（［Ｍ−Ｈ］−：ｃａｌｃｄ．：，ｆｏｕｎｄ：．）
(Introduction of fluorescent molecules (fluorescein) by post-DNA modification)
To 75 μl of 1M NaHCO 3 aqueous solution, 15 μl of an aqueous solution (270 μM) of ODN (APy U), 15 μl of fluorescein DMF solution (1 mg / 25 μl) and 30 μl of water were added and reacted at 37 ° C. for 18 hours. The reaction solution was neutralized by adding 48 μl of ammonium formate buffer (AF buffer), and the target oligonucleotide was collected by high performance liquid chromatography. It was confirmed by MALDI-TOF MS that the desired oligonucleotide ODN ( FAMPy U) (SEQ ID NO: 6) was obtained.
MALDI-TOF MS ([MH]-: calcd.:, Found :.)
（実施例４：ＡＰｙＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドの蛍光分析）
実施例２により得られたＡＰｙＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドを２５０ｎＭ となるように、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液を調製した。この溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて約２５℃で測定したところ、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４０７ｎｍであり、４０７ｎｍにおける蛍光強度は、０．５であった。
(Example 4: Fluorescence analysis of AP de U-containing oligodeoxyribonucleotide)
A solution was prepared by dissolving the APy U-containing oligodeoxyribonucleotide obtained in Example 2 in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 M sodium chloride so as to have a concentration of 250 nM. When the fluorescence spectrum of this solution was measured at about 25 ° C. using a fluorescence spectrophotometer, the excitation wavelength was 350 nm, the fluorescence wavelength was 407 nm, and the fluorescence intensity at 407 nm was 0.5.
上記溶液に、ＡＰｙＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド（配列番号１）とＡＰｙＵ 以外の部分が相補的であり、ＡＰｙＵ部位においてそれぞれＡ、Ｔ、Ｃ及びＧを備えるように別途合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド（配列番号２〜５）をそれぞれ２５０ｎＭとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。なお、これらの配列を表１に示す。
これらの溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて測定した。これらの蛍光スペクトルの測定結果を図４に示す。 The fluorescence spectra of these solutions were measured using a fluorescence spectrophotometer. The measurement results of these fluorescence spectra are shown in FIG.
図４に示すように、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）を加えた場合には、４０７ｎｍにおける蛍光強度は２．５であった。オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ’）を加えた場合には、４０７ｎｍにおける蛍光強度は０．５であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ’）を加えた場合には、４０７ｎｍにおける蛍光強度は０．７であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ’）を加えた場合には、４０７ｎｍにおける蛍光強度は１．３であった。 As shown in FIG. 4, when oligodeoxyribonucleotide (A ′) was added, the fluorescence intensity at 407 nm was 2.5. When oligodeoxyribonucleotide (T ′) is added, the fluorescence intensity at 407 nm is 0.5, and when oligodeoxyribonucleotide (G ′) is added, the fluorescence intensity at 407 nm is 0.7, When oligodeoxyribonucleotide (C ′) was added, the fluorescence intensity at 407 nm was 1.3.
このように液相においては従来のＢＤＦ（ＰｙＵ）と同程度の励起波長、蛍光波長および塩基識別能を示した。 Thus, in the liquid phase, the same excitation wavelength, fluorescence wavelength and base discrimination ability as conventional BDF ( Py U) were shown.
（実施例５：ＦＡＭＰｙＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドの蛍光分析）
実施例３により得られたＦＡＭＰｙＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドを２５０ｎＭとなるように、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液を調製した。この溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて約２５℃で測定したところ、励起波長３５０ｎｍで蛍光波長は従来より約１１０ｎｍ長い５１６ｎｍであり、５１６ｎｍにおける蛍光強度は、０．５であった。
(Example 5: Fluorescence analysis of FAMPy U-containing oligodeoxyribonucleotide)
A solution was prepared by dissolving the FAMPy U-containing oligodeoxyribonucleotide obtained in Example 3 in a 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.0) containing 0.1 M sodium chloride so as to have a concentration of 250 nM. When the fluorescence spectrum of this solution was measured at about 25 ° C. using a fluorescence spectrophotometer, the excitation wavelength was 350 nm, the fluorescence wavelength was about 516 nm longer than the conventional one, and the fluorescence intensity at 516 nm was 0.5.
上記溶液に、ＦＡＭＰｙＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドとＦＡＭＰｙＵ以外の部分が相補的であり、ＦＡＭＰｙＵ部位においてそれぞれＡ、Ｔ、Ｃ及びＧを備えるように別途合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド（配列番号７〜１０）をそれぞれ２５０ｎＭとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。これらの溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて測定した。この蛍光スペクトルの測定結果を図５に示す。 In the above solution, oligodeoxyribonucleotides (SEQ ID NOs: 7 to 10) separately synthesized so that the portions other than FAMPy U-containing oligodeoxyribonucleotide and FAMPy U are complementary and each has A, T, C, and G at the FAMPy U site. ) Were added so that each became 250 nM, and it mixed with the vortex mixer. The fluorescence spectra of these solutions were measured using a fluorescence spectrophotometer. The measurement result of this fluorescence spectrum is shown in FIG.
図５に示すように、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）を加えた場合には、５１６ｎｍにおける蛍光強度は２．１であった。オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ’）を加えた場合には、５１６ｎｍにおける蛍光強度は０．９であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ’）を加えた場合には、５１６ｎｍにおける蛍光強度は０．９であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ’）を加えた場合には、５１６ｎｍにおける蛍光強度は０．９であった。 As shown in FIG. 5, when oligodeoxyribonucleotide (A ′) was added, the fluorescence intensity at 516 nm was 2.1. When oligodeoxyribonucleotide (T ′) is added, the fluorescence intensity at 516 nm is 0.9, and when oligodeoxyribonucleotide (G ′) is added, the fluorescence intensity at 516 nm is 0.9, When oligodeoxyribonucleotide (C ′) was added, the fluorescence intensity at 516 nm was 0.9.
このように液相においては従来のＢＤＦ（ＡＰｙＵ、ＦＡＭＰｙＵ）と同程度の励起波長、塩基識別能を示しつつ、蛍光波長は従来より約１１０ｎｍ長くなることが分かった。 Thus, in the liquid phase, it was found that the fluorescence wavelength was about 110 nm longer than the conventional one while showing the same excitation wavelength and base discrimination ability as the conventional BDF ( APy U, FAMPy U).
（実施例６）
実施例２により得られたＡＰｙＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド（配列番号１）および実施例３により得られたＦＡＭＰｙＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド（配列番号６）をキャプチャープローブに用いてＤＮＡマイクロアレイを作製し、その蛍光測定を行った。なお、サンプルＤＮＡはＡＰｙＵまたはＦＡＭＰｙＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドとＡＰｙＵまたはＦＡＭＰｙＵ以外の部分が相補的であって、ＡＰｙＵ部位又はＦＡＭＰｙＵ部位においてそれぞれＡ、Ｔ、Ｃ及びＧを備えるように別途合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド（配列番号２〜５及び７〜１０）を使用した。
(Example 6)
A DNA microarray was prepared using the APy U-containing oligodeoxyribonucleotide (SEQ ID NO: 1) obtained in Example 2 and the FAMPy U-containing oligodeoxyribonucleotide (SEQ ID NO: 6) obtained in Example 3 as capture probes. Fluorescence measurement was performed. The sample DNA is such that APy U or FAMPy U-containing oligodeoxyribonucleotide and a portion other than APy U or FAMPy U are complementary, and have A, T, C, and G at the APy U site or FAMPy U site, respectively. Separately synthesized oligodeoxyribonucleotides (SEQ ID NOs: 2-5 and 7-10) were used.
１．ＢＤＦ 含有オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドの調製
これらのオリゴデオキシリボヌクレオチドをアプライドバイオシステム社の３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用い、通常のホスホロアミダイド法に従って合成した。なお、配列番号１および６の５’末端はアミノ基修飾した。固相担体からの切り出しおよび脱保護は２５％アンモニア中でインキュベーションすることによって行い、その後、高速液体クロマトグラフィーによって精製した。
1. Preparation of BDF-containing oligodeoxyribonucleotides and oligodeoxyribonucleotides These oligodeoxyribonucleotides were synthesized according to a normal phosphoramidide method using a 392 DNA / RNA synthesizer manufactured by Applied Biosystems. The 5 ′ ends of SEQ ID NOs: 1 and 6 were modified with an amino group. Cleavage from the solid support and deprotection was performed by incubation in 25% ammonia followed by purification by high performance liquid chromatography.
２．固定用基板の調製
１０％ＮａＯＨ−６０％エタノール水溶液に２時間浸漬し、純水で１０回洗浄した７６×２６×１ｍｍサイズのガラス製スライド（松波硝子工業社製）を１０％ポリ−Ｌ−リジン水溶液に１時間浸漬した。純水で１０回の洗浄後、８００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、水分を除去して室温で乾燥して、固定用基板を調製した。
2. Preparation of Fixing Substrate A 76 × 26 × 1 mm size glass slide (manufactured by Matsunami Glass Industrial Co., Ltd.) immersed in 10% NaOH-60% ethanol aqueous solution for 2 hours and washed 10 times with pure water was added to 10% Poly-L- It was immersed in an aqueous lysine solution for 1 hour. After washing 10 times with pure water, centrifugation was performed at 800 rpm for 5 minutes to remove moisture and dry at room temperature to prepare a fixing substrate.
３．ＤＮＡマイクロアレイの調製
上記１で調製した配列番号１および６の各々を、最終濃度が５０ｐｍｏｌ／μｌとなるように調整し、上記２で調製した基板に２００ｐｌをそれぞれスポット（１０ｎｍｏｌ）した。その後、８０℃で１時間乾燥処理し、各スポットに水を添加し、基板上にＤＮＡ断片を固定した。この基板を１％ＢＳＡブロッキング溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌ、１０％ＳＤＳ１．２５ｍｌ）で４５分間（４２℃）振盪した。その後、９５℃純水で１分間、９５％エタノールで１分間それぞれ浸漬させ、遠心（８００ｒｐｍ、１分間）し、目的とするＤＮＡマイクロアレイを調製した。
3. Preparation of DNA Microarray Each of SEQ ID NOs: 1 and 6 prepared in 1 above was adjusted to a final concentration of 50 pmol / μl, and 200 pl was spotted (10 nmol) on the substrate prepared in 2 above. Then, it dried at 80 degreeC for 1 hour, water was added to each spot, and the DNA fragment was fixed on the board | substrate. The substrate was shaken for 45 minutes (42 ° C.) with 1% BSA blocking solution (50 mg / ml) 5 ml, 10% SDS 1.25 ml). Thereafter, the sample was immersed in 95 ° C. pure water for 1 minute and 95% ethanol for 1 minute, and centrifuged (800 rpm, 1 minute) to prepare a target DNA microarray.
４．サンプルＤＮＡの調製
オリゴデオキシリボヌクレオチドからなるサンプルＤＮＡ（５ｎｍｏｌ／２５μｌ）をサンプルチューブに加え、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液（２５μｌ）を添加した。９５℃ヒートブロックで２分間加熱した後、室温で５分間放置し、遠心してサンプル液を調製した（最終濃度：１００ｎＭ）。
4). Preparation of sample DNA Sample DNA (5 nmol / 25 μl) composed of oligodeoxyribonucleotide was added to a sample tube, and a solution (25 μl) dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 M sodium chloride was added. . After heating for 2 minutes in a 95 ° C. heat block, it was left at room temperature for 5 minutes and centrifuged to prepare a sample solution (final concentration: 100 nM).
５．ハイブリダイゼーション
上記３で調製したＤＮＡマイクロアレイ上に上記２で調製したサンプル液を２５μｌずつ１点にスポットし、カバーガラスで密閉してハイブリダイゼーション反応を行った（４２℃、１６時間）。
5. Hybridization On the DNA microarray prepared in 3 above, 25 μl of the sample solution prepared in 2 above was spotted at one point and sealed with a cover glass to carry out a hybridization reaction (42 ° C., 16 hours).
６．測定
反応終了後、バイオチップリーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ 社製）を使用して、各実験の最適測定条件で各ＤＮＡスポットの画像ファイルを取込み、蛍光強度を数値化した。結果を表２に示す。
表２に示すように、ＦＡＭＰｙＵ含有キャプチャープローブは、高い蛍光強度も示しており、蛍光波長が長波長側にシフトしたことも含めて優れた塩基識別能を有していることがわかった。 As shown in Table 2, the FAMPy U-containing capture probe also showed high fluorescence intensity and was found to have excellent base discrimination ability including that the fluorescence wavelength was shifted to the long wavelength side.
配列番号１〜１０：合成オリゴヌクレオチド SEQ ID NOs: 1-10: synthetic oligonucleotides
Claims (11)
前記ヌクレオチド誘導体中の塩基にリンカーを介して２種類の蛍光物質を備え、
前記ヌクレオチド誘導体を備えるポリヌクレオチド誘導体が相手鎖とハイブリダイズして特定塩基と相対したとき、前記２種類の蛍光物質がＦＲＥＴによる蛍光を発光可能であり、以下の一般式（Ａ）で表されるヌクレオチド誘導体。
The base in the nucleotide derivative is provided with two kinds of fluorescent substances via a linker,
When the polynucleotide derivative comprising the nucleotide derivative is relative and the specific base with mating chains hybridize, the are two types of fluorescent material capable of emitting der fluorescence by FRET, represented by the following general formula (A) Nucleotide derivatives.
前記ヌクレオシド誘導体中の塩基にリンカーを介して２種類の蛍光物質を備え、以下の一般式（Ｂ）で表されるヌクレオチド誘導体。
The nucleoside base in derivative via a linker example Bei two types of fluorescent materials, a nucleotide derivative represented by the following general formula (B).
請求項４又は５に記載のプローブと標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせる工程と、
前記ハイブリダイゼーションのハイブリダイズ産物の蛍光を測定する工程と、
ハイブリダイズ産物の蛍光測定結果と使用したプローブが備えるヌクレオチド誘導体の特定塩基を識別可能な蛍光発光特性とに基づいて前記標的ポリヌクレオチド中の１個又は２個以上の塩基種を同定する評価工程とを、
を備える、方法。 A hybridization method comprising:
Hybridizing the probe according to claim 4 or 5 and a target polynucleotide;
Measuring the fluorescence of the hybridized product of the hybridization;
An evaluation step for identifying one or more base species in the target polynucleotide based on a fluorescence measurement result of the hybridized product and a fluorescence emission characteristic capable of identifying a specific base of the nucleotide derivative provided in the probe used; The
A method comprising:
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