JP5175442B2

JP5175442B2 - ヤーコン由来の抗ガン剤

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Publication number: JP5175442B2
Application number: JP2006057997A
Authority: JP
Inventors: 啓敏田村; ティビギンキタインアルマンド; 一幸尾路; 雅博石川; 和行高島
Original assignee: Nihon Kaisui Co Ltd
Current assignee: Nihon Kaisui Co Ltd
Priority date: 2006-03-03
Filing date: 2006-03-03
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2026-03-03
Also published as: JP2007230973A

Description

本発明は、ヤーコン由来の特定の活性成分を配合した抗ガン剤に関する。さらに詳しくは、本発明はヤーコン抽出画分に含まれる形態で有効な発ガン活性作用を抑制すべき疾患を治療または予防するための抗ガン剤に関するものである。

ガンは日本人の年間の死亡原因の1／4を占めるまたガンの発生要因の約80％が、我々の身近な環境的要因（化学物質）によるものであることが、疫学的研究からも明らかにされており、ヒトの発ガン因子のうち、約25％が食物であると言われている（非特許文献１）。日常摂取する食品が、一方ではガンの発生に、他方ではその抑制に大きく関わっていることは注目すべき事実であり、疫学的研究により示唆される野菜の発ガン抑制効果を発ガン予防の見地から、化学的に解明することは極めて意義深いことである（非特許文献２）。

化学物質による発ガンの発生の機構は発ガン二段階説によって理解されており、初発段階（イニシエーション）と促進段階（プロモーション）の二つの異なったプロセスが関与するというものである。イニシエーション過程とは、正常細胞が潜在的腫瘍細胞へと変化する過程であり、プロモーション過程とは、その潜在的腫瘍細胞が目に見える腫瘍細胞へと変化する過程である（非特許文献３、４）。化学発ガンを防止する手段として、このイニシエーション過程またはプロモーション過程のどちらか一方、またはその両方を化学物質によって抑制する方法があげられる（非特許文献５）。しかし、人間は成人になるとイニシエートされた細胞をすでに体内に保有していると考えられており、プロモーション過程を抑制する方が、化学発ガンを予防するうえでより効率的であると言える（非特許文献６)。

これまでに単離された、天然に存在する抗ガン活性成分として、アオジソからオレアノール酸、ゴボウからモッコラクトンとアルクチン酸、ショウガからジンジャロール、茶からカテキン、ウコンからクルクミン、紫蘇抽からα−リノレン酸、ブロッコリーからスルフォラファン、ロ−ズマリーからロズマノールなどが知られる（非特許文献７、８）。また、膨大な数の疫学的調査や動物実験により、カンキツ類の果実にはガン予防効果があることが明らかにされている（非特許文献９）。
ヤーコン（Polymnia sonchifolia）は、南米アンデス地方を原産とするキク科の多年草であり、エクアドルからペルーにかけて分布している。日本では現在、各地で栽培されているが、やや冷涼な地方が適地と考えられ、本州では埼玉県などで栽培されている。また、アンデスポテトとも呼ばれ、地下部に貯蔵器官のサツマイモに似た塊根を形成する。

ヤーコンの利用法として、葉や茎はお茶にして利用される。葉や茎には、カリウム・カルシウム等のミネラルやテルペン・タンニン・フラボノイド配糖体・イヌリン、ビタミンA、B₁、B₂、Cなど、生命維持に欠かすことのできない物質が豊富に含まれている。また、血糖の上昇を抑えるインスリンと同様の働きをする物質が含まれていることも分かってきた。ヤーコンの葉の注目すべきもう一つの機能性は、脂肪の代謝改善作用であり、ヤーコンのお茶を飲むことで中性脂肪、コレステロール値を下げ、結果的に体重増加の抑制につながるということが研究により証明されている。
また、塊根部は、前インカ時代から食用に供されていたようであり、甘味があり歯ごたえもよく、生でも食べられる。最も注目される特徴は、フラクトオリゴ糖を塊根に含むことであり、フラクトオリゴ糖の機能性としては、虫歯菌の抑制、ビフィズス菌の活性化、整腸作用、血中脂肪や血糖値の改善等があげられる。さらに、塊根部は、食物繊維や抗酸化作用のあるポリフェノールも豊富に含んでおり、機能性根菜として注目されている（非特許文献１０〜１４）。また、ヤーコンの塊根部からカフェー酸の誘導体も単離されている（非特許文献１５）。このように、ヤーコンについて、これまで様々な機能性が研究されてきている。しかし、抗発ガン性に関しては、未だ明らかにされていない。

日本施設園芸協会編「野菜と健康の科学」養賢堂，p131（1994） SCIENCE FORUM，p308−330（1984）「発がん」化学同人，p64（1984）、「蛋白質核酸酵素」共立出版，p999−1009，Vol．24，No．8（1979）「化学と生物」29（9），p598-603（1991） Cancer Res．，45，p1-8（1985） Abstract of Papers，The international Congress of New DrugDevelopment Seoul，Korea，p130（1991）「フードケミカル」食品化学新聞社，p23−32，No．12（1994）「化学と生物」Vol．39，No．12，p795−802（2001）「農業と園芸」64，1033（1989）「化学と生物」27，813（1989）「農業と園芸」66，413（1991）「奇跡の健康野菜ヤーコン」廣済堂出版「食材図典」p235（1997） J．Agric．Food Chem．2003，51，p793

ヤーコンには、前記したように、様々な生理活性があることが確かめられてきたがその生理活性の中に抗発ガン活性は含まれておらず、ヤーコンが抗ガン活性作用を呈するということはこれまで知られていなかった。

本発明は、安全性に問題がなく、安価で比較的容易に入手可能な材料、好ましくは未利用材料であるヤーコンの芋皮および／または葉茎部から、優れた抗ガン活性作用を有する組成物を提供すること、好ましくは発ガン活性作用を抑制すべき疾患を治療または予防するための組成物、より具体的には食品添加物、食品素材、飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料からなる群から選ばれる形態のものを提供することを課題とする。

本発明は以下の（１）〜（４）の抗ガン剤を要旨とする。
（１）ヤーコン由来の9-アセトキシ-10(2,3-ジメチル-オキシランカルボニルオキシ)-4メチル-12-メチレン-13-オキソ-3,14-ジオキサ-ロリシクロ[9.3.0.0^2,4]テトラデ-7-セン-8-カルボン酸メチルエステルを有効成分とする抗ガン剤。
（２）ヤーコンがヤーコンの芋皮および／または葉茎部である上記（１）の抗ガン剤。
（３）抗ガン剤が、発ガン活性作用を阻害すべき疾患を治療または予防するための剤である上記（１）または（２）の抗ガン剤。
（４）上記発ガン活性作用を阻害すべき疾患が、腫瘍もしくは癌における発ガン活性作用が原因となる疾患である（３）の抗ガン剤。

本発明は、安全性に問題がなく、安価で比較的容易に入手可能な材料（未利用材料であるヤーコンの芋皮および／または葉茎部）から、副作用が少ない、優れた抗ガン活性作用を有する組成物を提供すること、好ましくは発ガン活性作用を抑制すべき疾患を治療または予防するための組成物、より具体的には食品添加物、食品素材、飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料からなる群から選ばれる形態のものを提供することができる。

ヤーコンは、葉、茎、葉茎部（葉柄）などのヤーコン地上部と芋が使用できるが、芋皮や葉茎部は未利用部分であり、該未利用部分を用いることはヤーコンの高度有効利用の観点から望ましい。使用にあたっては、芋皮や葉茎部のヤーコン未利用部分を乾燥したものを細切りあるいは粉末にして直接用いる。ヤーコン中の成分では熱による変性を受けやすい成分と安定な成分があり、乾燥条件や抽出条件によって抽出される成分が異なってくる。前処理工程で十分乾燥することと、できるだけ熱変性の起こらない低温で行うことが望ましい。

本発明の上記組成物は、安全性に問題がなく、安価で比較的容易に入手可能な材料（未利用材料であるヤーコンの芋皮および／または葉茎部）から、工場規模での実生産に適した簡便な処理方法により得られ、その生体への適用は飲食物、医薬品、肥料、飼料や皮膚外用剤に使用することで、優れた発ガン活性抑制効果を得ることが期待できる。
本発明の上記組成物は、発ガン活性抑制作用を有する天然物由来の活性成分を有するものであり、該活性成分に基づく発ガン活性抑制を応用することにより、たとえば安全なガンの治療法へと導くのであり、発ガン活性抑制の作用は、腫瘍もしくはガンにおける発ガン活性作用が原因となる疾患に対して予防および安全に治療する効果を有する機能性組成物である。
すなわち、本発明の上記組成物は、発ガン活性を抑制すべき疾患を治療または予防するための組成物である。発ガン活性を抑制すべき疾患とは、発ガン活性が病態の発生に重要な働きをしている疾患であれば、どのようなものでも対象となる。したがって、発ガン活性を抑制すべき疾患は、腫瘍もしくはガンにおける発ガン活性作用が原因となる疾患である。本発明においては、発ガン活性を抑制すべき疾患として、種々の腫瘍またはガンを標的とすることが好ましい。

本発明の上記組成物は、ヤーコン由来の成分を抗ガン活性作用の有効成分とすることを特徴とする。前記ヤーコン由来の成分に含まれる抗ガン活性作用を呈する物質は、好ましくはヤーコンの芋皮および／または葉茎部のヘキサン抽出物に含まれる物質である。

ヤーコンにおける最適抽出溶媒と最適部位の比較検討においては、乾燥済みのヤーコンの葉、芋、皮、また生の状態のヤーコンの芋、皮を粉砕後、それぞれヘキサン、アセトン、70％MeOH水溶液の溶媒で抽出し、抗ガン活性試験に供した。その結果、葉の部分は、いずれの抽出溶媒においても強い活性がみられた。乾燥済みの皮の部分にも強い活性がみられたが、細胞毒性試験の結果より、葉の部分よりも毒性が強いと考えられた。他の部位においてはヘキサン抽出物が最も強い活性を示した。これらの結果より、最適抽出溶媒はヘキサン、最適部位は葉であると考えられた。
また、塊根部のみに注目すると、全体的に芋の部分よりも皮の部分の方が、活性が強かったことから、抗ガン活性成分を有しているのは、皮の部分であると言える。
また、ヤーコンの葉について抗ガン活性成分を単離した。単離した成分は、組成式C₂₃H₂₈O₁₀、分子量464の9-アセトキシ-10(2,3-ジメチル-オキシランカルボニルオキシ)-4メチル-12-メチレン-13-オキソ-3,14-ジオキサ-ロリシクロ[9.3.0.0^2,4]テトラデ-7-セン-8-カルボン酸メチルエステル（9-Acetoxy-10-（2，3−dimethyl-oxiranecarbonyloxy）-4-methyl-12-methylene-13-oxo-3,14-dioxa-tricyclo[9.3.0.0^2,4]tetradec-7-ene-8-carboxylic acid methyl ester）であった。この成分は、強い抗菌活性を示す（Biosci・Biotecbnol．Biochem．，67（10），p2154−2159（2003）、Phytochemistry，Vol．39 No．4，p845-848（1995）、Phytochemistry，Vol．38，No．2，p433−435（1995）、Phytochemistry, Vol. 43, No. 5, p1019-1021（1996））ことがすでに分かっているが、抗ガン活性については未だ明らかにされていない。
また、この単離された活性成分について、すでに抗ガン活性成分として単離されているクルクミンと比較したところ、クルクミンがTPAに対して、100倍の濃度でRaji細胞の変形を完全に抑制したのに対し、ヤーコンの活性成分においては、さらに10倍薄い濃度で強い活性がみられた。このことから、ヤーコンから単離された成分は、強い抗ガン活性を示すと思われる。
また、細胞毒性試験の結果を見ると、クルクミンがRaji細胞の変形を完全に抑制した100倍の濃度で生育率が19％であったのに対し、活性成分においては、変形を完全に抑制した濃度で平均30％弱の生育率であった。このことから、細胞に対する毒性もクルクミンと比較すると低いと言える。

単離された活性成分あるいはヤーコンヘキサン抽出物は、発ガン活性作用を抑制するための食品添加物、食品素材、飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料からなる群から選ばれる形態のものである。その組成物の機能性を生かして健康飲食品、患者用栄養飲食品を謳った食品、同様に、家畜、家禽、魚などの飼育動物のための飼料の開発が可能となった。
すなわち、上記飲食品が、抗ガン活性作用を有する、機能性食品、栄養補助食品または健康飲食品である。上記飼料が、抗ガン活性作用を有する、家畜、家禽、ペット類の飼料である。具体的には、上述したヤーコンヘキサン抽出物を含む食品素材を、食品形態、飲料形態または飼料形態のいずれの形態で使用することができる。
本発明の抗ガン活性作用を有する組成物が有する上述した機能性を生かして用いる場合は、その含量は、特に制限されないが、目的とする機能の度合い、使用態様、使用量等により適宜調整することができ、例えば０．００１〜１００質量％である。抗ガン活性作用を有する組成物は、人体やその他飲食物、医薬品、飼料や皮膚外用剤に使用することができる。また、経口等により内服することも、皮膚等に塗布することもできる。常法にしたがって経口、非経口の製品に配合することができ、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、皮膚外用剤、医薬品および飼料等の様々な分野で利用することができる。例えば、飲食物に配合した場合には、発ガン活性作用を抑制すべき疾患を治療または予防するための飲食物を提供することができる。予防等の効果からは、健康食品、栄養食品等として用いられることも期待できる。その他、家畜、および／または魚類の飼料、餌料に利用することができる。人体やその他飲食物、医薬品、肥料、飼料や皮膚外用剤に使用することにより、発ガン活性作用を抑制すべき疾患を治療または予防する効果を得ることができる。
さらに、未利用のヤーコン部位（ヤーコンの芋皮および／または葉茎部）から容易に得ることができ、コスト面からみても、資源の有効活用という面からみても好ましい。

本発明の組成物を食品に利用する場合、そのままの形態、オイルなどに希釈した形態、乳液状形態食、または食品業界で一般的に使用される担体を添加した形態などのものを調製してもよい。
乳液状形態のものは、例えば、油相部に組成物を添加し、更にグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセロール、デキストリン、ナタネ油、大豆油、コーン油などの液状の脂肪を加え、水相部にＬ−アスコルビン酸或いはそのエステルまたは塩、例えばローカストビーンガム、アラビアガムまたはゼラチンなどのガム質、例えばヘスペリジン、ルチン、ケルセチン、カテキン、チアニジンなどのフラボノイド類またはポリフェノール類或いはその混合物などを添加し、乳化することによって調製できる。

飲料の形態は、非アルコール飲料またはアルコール飲料である。非アルコール飲料としては、例えば、炭酸系飲料、果汁飲料、ネクター飲料などの非炭酸系飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、茶、コーヒー、ココアなど、また、アルコール飲料の形態ではスピリッツ、リキュール、チューハイ、果実酒類、麦酒、発泡酒、薬用酒などの一般食品の形態を挙げることができる。

飲食物としては、具体的には以下のものを例示することができる。洋菓子類（プリン、ゼリー、グミキャンディー、キャンディー、ドロップ、キャラメル、チューインガム、チョコレート、ペストリー、バタークリーム、カスタードグリーム、シュークリーム、ホットケーキ、パン、ポテトチップス、フライドポテト、ポップコーン、ビスケット、クラッカー、パイ、スポンジケーキ、カステラ、ワッフル、ケーキ、ドーナツ、ビスケット、クッキー、せんべい、おかき、おこし、まんじゅう、あめなど）、乾燥麺製品（マカロニ、パスタ）、卵製品（マヨネーズ、生クリーム）、飲料（機能性飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料、濃厚乳性飲料、果汁飲料、無果汁飲料、果肉飲料、透明炭酸飲料、果汁入り炭酸飲料、果実着色炭酸飲料）、嗜好品（緑茶、紅茶、インスタントコーヒー、ココア、缶入りコーヒードリンク）、乳製品（アイスクリーム、ヨーグルト、コーヒー用ミルク、バター、バターソース、チーズ、発酵乳、加工乳）、ペースト類（マーマレード、ジャム、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、果実のシロップ漬け）、畜肉製品（ハム、ソーセージ、ベーコン、ドライソーセージ、ビーフジャーキー、ラード）、魚介類製品（魚肉ハム、魚肉ソーセージ、蒲鉾、ちくわ、ハンペン、魚の干物、鰹節、鯖節、煮干し、うに、いかの塩辛、スルメ、魚のみりん干し、貝の干物、鮭などの燻製品）、佃煮類（小魚、貝類、山菜、茸、昆布）、カレー類（即席カレー、レトルトカレー、缶詰カレー）、調味料剤（みそ、粉末みそ、醤油、粉末醤油、もろみ、魚醤、ソース、ケチャップ、オイスターソース、固形ブイヨン、焼き肉のたれ、カレールー、シチューの素、スープの素、だしの素、ペースト、インスタントスープ、ふりかけ、ドレッシング、サラダ油）、揚げ製品（油揚げ、油揚げ菓子、即席ラーメン）、豆乳、マーガリン、ショートニングなどを挙げることができる。

上記飲食物は、組成物を常法に従って、一般食品の原料と配合することにより、加工製造することができる。

上記飲食物への組成物の配合量は食品の形態により異なり特に限定されるものではないが、通常は０．００１〜２０％が好ましい。

上記飲食物は、機能性食品、栄養補助食品或いは健康食品類としても用いることができる。その形態は、特に限定されるものではなく、例えば、食品の製造例としては、アミノ酸バランスのとれた栄養価の高い乳蛋白質、大豆蛋白質、卵アルブミンなどの蛋白質、これらの分解物、卵白のオリゴペプチド、大豆加水分解物などの他、アミノ酸単体の混合物などを、常法に従って使用することができる。また、ソフトカプセル、タブレットなどの形態で利用することもできる。

栄養補助食品或いは機能性食品の例としては、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料などが配合された流動食、半消化態栄養食、成分栄養食、ドリンク剤、カプセル剤、経腸栄養剤などの加工形態を挙げることができる。上記各種食品には、例えば、スポーツドリンク、栄養ドリンクなどの飲食物は、栄養バランス、風味を良くするために、更にアミノ酸、ビタミン類、ミネラル類などの栄養的添加物や甘味料、香辛料、香料、色素などを配合することもできる。

本発明の組成物を安定化させるために抗酸化剤、例えば、トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸、ＢＨＡ、ローズマリー抽出物などを常法に従って併用することができる。

本発明の組成物は、家畜、家禽、ペット類の飼料用に応用することができる。例えば、ドライドッグフード、ドライキャットフード、ウェットドッグフード、ウェットキャットフード、セミモイストドックフード、養鶏用飼料、牛、豚などの家畜用飼料に配合することができる。飼料自体は、常法に従って調製することができる。
これらの治療剤および予防剤は、ヒト以外の動物、例えば、牛、馬、豚、羊などの家畜用哺乳類、鶏、ウズラ、ダチョウなどの家禽類、は虫類、鳥類或いは小型哺乳類などのペット類、養殖魚類などにも用いることができる。

抗ガン活性作用を利用する薬剤について説明する。
抗ガン活性成分を有効成分とする、前記諸症状の予防剤または治療剤は、これらのみで用いるほか、一般的賦形剤、安定剤、保存剤、結合剤、崩壊剤等の適当な添加剤を配合し、液剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤、錠剤等の適宜な剤型を選んで製剤し、経口的あるいは経腸的に投与することができる。

本発明の抗ガン活性作用を利用する薬剤を臨床に適用するに際しては、有効成分として9-アセトキシ-10(2,3-ジメチル-オキシランカルボニルオキシ)-4メチル-12-メチレン-13-オキソ-3,14-ジオキサ-ロリシクロ[9.3.0.0^2,4］テトラデ-7-セン-8-カルボン酸メチルエステルおよびその誘導体を、固体、半個体又は液体の医薬用担体又は希釈剤、例えば、賦形剤、安定剤等の添加剤とともに含む製剤とすることが好ましい。該医薬製剤において、前記有効成分の担体成分に対する割合は、１〜90重量％の間で変動させうる。剤形及び投与形態としては、顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、丸剤もしくは液剤等の剤形にして、又は原末のまま経口投与してもよい。

経口、経腸投与に適した医薬用の有機又は無機の、固体、半個体又は液体の担体、溶解剤もしくは希釈剤を、本発明の血糖上昇抑制剤を調製するために用いることができる。水、ゼラチン、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、タルク、動植物油脂、ベンジルアルコール、ガム、ポリアルキレングリコール、石油樹脂、やし油、ラノリン、又は医薬に用いられる他のキャリアー (担体) は全て、本発明の抗ガン活性作用を利用する薬剤の担体として用いることができる。また、安定剤、湿潤剤、乳化剤や、浸透圧を変えたり、配合剤の適切なpＨを維持するための塩類を補助薬剤として適宜用いることもできる。

更に、本発明の抗ガン活性作用を利用する薬剤は、ガンなどの治療において、本発明の抗ガン活性作用を利用する薬剤とともに適切に投与することができる他の医薬として有効な成分、例えば他の適当な抗ガン活性作用を利用する薬剤を含有していてもよい。顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤又はカプセル剤の場合には、本発明の抗ガン活性作用を利用する薬剤は9-アセトキシ-10(2,3-ジメチル-オキシランカルボニルオキシ)-4メチル-12-メチレン-13-オキソ-3,14-ジオキサ-ロリシクロ[9.3.0.0^2,4］テトラデ-7-セン-8-カルボン酸メチルエステルおよびその誘導体を５〜80重量％含有しているのが好ましく、液剤の場合には、対応する量 (割合) は、１〜30重量％であるのが好ましい。

臨床投与量は、経口投与の場合、成人に対し9-アセトキシ-10(2,3-ジメチル-オキシランカルボニルオキシ)-4メチル-12-メチレン-13-オキソ-3,14-ジオキサ-ロリシクロ[9.3.0.0^2,4］テトラデ-7-セン-8-カルボン酸メチルエステルおよびその誘導体として、１日量0.3〜50ｇを内服するのが好ましいが、年令、症状により適宜増減することも可能である。前記１日量の本発明の血糖上昇抑制剤は、１日に１回、又は適当な間隔をおいて１日２もしくは３回に分けて、あるいは食前、食後あるいは食事とともに投与することが好ましい。

本発明の詳細を実施例で説明する。本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。

（ヤーコンの部位による抗ガン活性の違い）
本試験では、ヤーコンの未だ明らかにされていない抗ガン活性について、より詳細に調べるため、様々な部位について活性成分を抽出し、抗ガン活性試験に供することで、最適抽出溶媒と最適部位を決定した。

［はじめに］
化学発ガンには、初発段階（イニシエーション）と促進段階（プロモーション）の二つの異なったプロセスが関与するというものである。プロモーション作用抑制の簡便な検出方法として、EBV（Epstein−Barr virus）を用いた実験系が確立されている。
EBV早期抗原検出法として、Raji細胞を用いたEBV活性化抑制試験法が用いられている。Raji細胞とは、EBVのゲノムを有するが、EBV粒子を産生しない細胞で、早期抗原を発現しておらずイニシエーションされた状態にある（「生化学実験」第17章，p255）。
本試験では、近藤らが開発したEBV早期抗原検出改良法（日農化1995年度大会要旨，166（1995））を用いて、ヤーコンの抗ガン活性を測定した。この方法は、Raji細胞にプロモーターとしてTPA（12-0-tetradecanoylphorbol 13-acetate）とn-酪酸ナトリウムを加えることにより、EBVが活性化され、球状の細胞が肥大、扁平化や周辺部の樹枝状化を伴う形態変化を示す現象を利用したものである。この検出系に被験物質を共存させ、形態変化抑制率を測定することで、被験物質の抗ガン活性を測定することができる。

［実験方法］
試料の調製
今回用いた試料は、ヤーコンの葉(FD乾燥、30g)、ヤーコンの芋の部分(乾燥、27g)、ヤーコンの皮の部分(乾燥、17g)、ヤーコンの芋の部分(生、555.0g)、ヤーコンの皮の部分(生、158.7g)の5種類である。

最適抽出溶媒と最適部位の決定
調製した試料をミキサーで粉砕したものを3つに分けて、それぞれヘキサン、アセトン、70％MeOH水溶液に浸漬し抽出液を得た後、濃縮乾固した。

抗発ガンプロモーター活性試験用試料の調製
濃縮乾固した試料から一部をとり、これをTPA（4μg/ml）の濃度に対して1000倍、200倍になるように、dimethyl sulfoxide（以下DMSO）で希釈後、試料としてアッセイに使用した。

Raji細胞培養液の調製
ダルべッコ変法イーグル培地26.96g、カナマイシン200mg、HEPES9.54gを殺菌水360mlに溶解して、無菌下0.22μmのフィルターでろ過滅菌した。これを5倍濃縮培養液として使用した。この5倍濃縮培養液40mlに殺菌水160ml、アンホテリシンB 0.2ml、7％重曹水6ml、牛胎児血清20mlを加え、これを10％FCS培地とし、Raji細胞の培養に使用した。

抗ガン活性試験及び細胞毒性試験
生細胞数1.0×10⁵個/mlに調製したRaji細胞懸濁液を1mlずつ分注し、各濃度に調製した試料10μl、0.1Mn-酪酸ナトリウム10μlを添加し、さらにTPA（4μg/ml）10μlを添加して5％CO₂インキュベーターにて37℃で48時間培養した。その後、形態変化を観察し、生細胞数を数えた。また、コントロールとして、0.1Mn-酪酸ナトリウムとTPAのみを添加したものを指標として細胞の形態変化を観察した。また、n−酪酸ナトリウムのみを添加したものを同様に培養し48時間後の生細胞数をコントロールとして算出し、コントロールの生細胞数に対する供試試料における培養細胞の生育度合を、生細胞数の比で算出した。

判定方法
5％CO₂下、37℃の条件下で培養し、48時間後の細胞の変形を倒立顕微鏡で観察し、試料無添加のコントロールと比較し、1視野における抑制の強さを下記に示す方法にて5段階で判定した。
＋＋＋完全に抑制（1視野に0−1個）
＋＋強く抑制（1視野に2−3個）
＋適度に抑制（1視野に5−6値）
−＋少し抑制（コントロールと比べて差がある）
− 全く抑制しない（コントロールと比べて差がない）
また、細胞毒性試験では、培養48時間後に生育率（％）と生育度合（％）を調べた。
生育率＝（生細胞数／生細胞数＋死細胞数）×100（％）
生育度合＝（生細胞数／コントロールの生細胞数）×100（％）

［結果及び考察］
抗ガン活性試験及び細胞毒性試験
各抽出物の抗ガン活性を示した（表１）。ヤーコンのヘキサン抽出物（(1)、(4)、(7)、(10)、(13)）、アセトン抽出物（(2)、(5)、(8)、(11)、(14)）、70％MeOH抽出物（(3)、(6)、(9)、(12)、(15)）を、TPAの濃度に対して1000倍、及び200倍の濃度にDMSOにて希釈し、試料として活性試験に供した。葉の部分は、いずれの抽出溶媒においても強い活性がみられた。乾燥済みの皮の部分にも強い活性がみられたが、細胞毒性試験の結果より毒性が強いと考えられた。また、乾燥済みの芋を試料とした場合、生育率は約70％で、いずれの抽出溶媒においても活性がみられなかったが、他の部位においてはヘキサンが最も活性が強かった。これらの結果より、最適抽出溶媒はヘキサン、最適部位は葉であると考えられた。

（ヤーコンの抗ガン活性成分の単離）
実施例１の結果から、ヤーコンの葉（乾燥済み）には抗ガン活性成分が含まれていたことが分かった。また、抽出溶媒はヘキサンが最適であることも分かった。そこで本実施例では、ヤーコンの葉に含まれている抗ガン活性成分を明らかにするために、ヤーコンの葉から抗ガン活性成分を、カラムクロマトグラフィーと薄層クロマトグラフィーにより単離することにした。

［方法および結果］
試料の調製
ヤーコンの葉（FD乾燥済み）1.726kgをヘキサンで浸漬し、その後プレス機にてヘキサン可溶物質を抽出し、約15リットルの抽出液を得た。さらに濃縮乾固し、31.8gの乾固物を得た。

カラムクロマトグラフィー
上記で調製した乾固物31.8gをヘキサン40mlに溶解し、シリカゲルカラム（250g、35cm×4.5cm）にのせた。ヘキサン-ジエチルエーテル系の溶出溶媒を順次流してFr.1〜Fr.8に分画し、それぞれの画分から一部をとり、TPAの濃度に対して200倍、50倍、及び20倍になるようにDMSOで希釈し試料とした後、これらを抗ガン活性試験に供した。（表２）
Fr．7−(1)、Fr．7−(2)、Fr．8では200倍、50倍ともに非常に強い活性がみられた。さらにFr．8においては、20倍でも非常に強い活性がみられた。これより、Fr．8に最も強い抗ガン活性成分が含まれていることが分かった。

薄層クロマトグラフィー
上記で調製したFr.8から102.4mgをとり、これをアセトンに溶解し、ヘキサン-ジエチルエーテル系（1：4〜9）を展開溶媒として分取用シリカゲルプレート（20cm×20cm、0.5mm）で薄層クロマトグラフィーを行い、Fr.1-1′〜 Fr.1-8′に分画した。それぞれの画分から一部をとり、TPAの濃度に対して100倍、20倍、及び10倍になるようにDMSOにて希釈し、試料として活性試験に供した。
Fr.1-1′については再びヘキサン-ジエチルエーテル系溶媒で薄層クロマトグラフィーを行い、Fr.1-1″〜Fr.1-4″に分画した。
各画分の抗ガン活性を示した（表３）。特に、Fr．1-1′については100倍、20倍ともに活性が強く、生育率を見てもそれほど毒性がないと思われる。また、この画分を精製し抗ガン活性試験を供したところ、更に10倍でも強い活性を確認した。

（ヤーコンの抗ガン活性成分の構造解析）
実施例２からヤーコンから単離された成分は、強い抗ガン活性を示すことが分かった。そこで本実施例では、この抗ガン活性成分はどのような構造をしているのかを知るために、NMR分析を中心としてMSなど機器分析を行い、その構造解析を行った。また、NMR解析では、1H−1H COSY、COLOC、HMBC等の測定を行った。

［実験方法］
機器分析
上記で調製したFr．1−2”についてNMR解析及びMS分析を行った。

機器分析条件
〈NMR〉
装置：日本電子JNM-A400型核磁気共鳴装置
溶媒：Chloroform−d₁，contains１％（v／v）TMS 99.8 atom ％D（Fr．1−1′）
Acetone−d₆（Fr．1−2″）
標準物質：TMS（Tetramethylsilane）
周波数：400MHz
〈MS〉
装置：日本電子JMS−SX102AQQ Hydrid Mass Spectrometer
試料気化部温度：50℃→300℃（16℃／min．）
イオン化法：EI
イオン化電圧：70eV
標準物質：PFK（Perfluorokerosene）

［結果及び考察］
機器分析
Fr．1−2″についての¹³C−NMRスペクトルから炭素数23個、¹H−NMRスペクトルからメチル基が数個、酸素を含むＯ−CH結合や、オレフィンのCHなどの存在が示唆された。
また、本物質の高分解能質量分析の結果、分子量464で、C₂₃H₂₈O₁₀の元素組成であることが分かった。
次に、CHSHFスペクトルを用いて、すべての炭素上の水素との結合様式を明らかにした。次に、¹H−¹H COSYスペクトルから隣接した¹H核相互の結合関係を明らかにした。
更に、COLOC、HMBC等により、遠距離の¹H核と¹³C核の相関関係を明らかにしていった。本活性物質の平面構造は（図１）であることが明確になった。
最後に、立体構造を決定するため、NOESY測定を行った結果、立体構造を決定した。
単離した成分は、9-アセトキシ-10(2,3-ジメチル-オキシランカルボニルオキシ)-4メチル-12-メチレン-13-オキソ-3,14-ジオキサ-ロリシクロ[9.3.0.0^2,4］テトラデ-7-セン-8-カルボン酸メチルエステル（9-Acetoxy-10-(2,3-dimethyl-oxiranecarbonyloxy)-4-methyl-12-methylene-13-oxo-3,14-dioxa-tricyclo[9.3.0.0^2,4]tetradec-7-ene-8-carboxylic acid methyl ester]（図２）であった。

本発明によって、安全性に問題がなく、安価で比較的容易に入手可能な材料（未利用材料であるヤーコンの芋皮および／または葉茎部）から、副作用が少ない、優れた抗ガン活性作用を有する組成物を提供すること、好ましくは発ガン活性作用を抑制すべき疾患を治療または予防するための組成物、より具体的には食品添加物、食品素材、飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料からなる群から選ばれる形態のものを提供することが可能となる。

単離した活性成分の平面構造。〈活性成分〉9-アセトキシ-10(2,3-ジメチル-オキシランカルボニルオキシ)-4メチル-12-メチレン-13-オキソ-3,14-ジオキサ-ロリシクロ[9.3.0.0^2,4]テトラデ-7-セン-8-カルボン酸メチルエステル（9-Acetoxy-10-(2,3-dimethyl-oxiranecarbonyloxy)-4-methyl-12-methylene-13-oxo-3,14-dioxa-tricyclo[9.3.0.0^2,4]tetradec-7-ene-8-carboxylicacid methyl ester）単離した活性成分の立体構造。

Claims

ヤーコン由来の9-アセトキシ-10(2,3-ジメチル-オキシランカルボニルオキシ)-4メチル-12-メチレン-13-オキソ-3,14-ジオキサ-ロリシクロ[9.3.0.0^2,4]テトラデ-7-セン-8-カルボン酸メチルエステルを有効成分とする抗ガン剤。
ヤーコンがヤーコンの芋皮および／または葉茎部である請求項１の抗ガン剤。
抗ガン剤が、発ガン活性作用を阻害すべき疾患を治療または予防するための剤である請求項１または２の抗ガン剤。
上記発ガン活性作用を阻害すべき疾患が、腫瘍もしくは癌における発ガン活性作用が原因となる疾患である請求項３の抗ガン剤。