JP5174971B2 - ペプチド翻訳合成におけるrapidディスプレイ法 - Google Patents
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Description
(ア)リンカー分子の3’末端はピューロマイシンではなく、アミノ酸がエステルを介してアデノシンに結合(アミノアシル化)した構造となっている。
(イ)アミノアシル化反応は、人工RNA触媒(リボザイム)により行う。
(ウ)再構成型の無細胞翻訳系を利用する。
(エ)リンカーとmRNAとの結合は、ライゲーションではなく、翻訳系内でのハイブリダイゼーションによる複合体形成で行う。
(オ)転写、翻訳およびリンカーとの複合体形成を単一の翻訳反応容器中で行うことができる。
(1)再構成型のin vitroタンパク質合成系において、mRNAと、その翻訳産物であるペプチドとが、リンカーを介して結合した連結体を作製するために使用されるリンカーであって、
リンカーの一方の端に、mRNAの3'末端側の塩基と対合する側鎖塩基を有する一本鎖構造領域を含み、
リンカーのもう一方の端に、ペプチド転移反応によって翻訳産物と結合可能な基を含むペプチドアクセプター領域を含み、
ペプチドアクセプター領域は、塩基配列ACCAからなるオリゴRNAにアミノ酸がエステル結合した構造からなり、
当該エステル結合が、人工RNA触媒を用いるアミノアシル化反応により形成された
ことを特徴とするリンカー。
(2)一本鎖構造領域とペプチドアクセプター領域の間がポリエチレングリコールで連結されている、前記(1)のリンカー。
(3)一本鎖構造領域が一本鎖DNAからなる、前記(1)または(2)のリンカー。
(4)アミノアシル化反応に使用される人工RNA触媒が、以下のいずれかのRNA配列
GGAUCGAAAGAUUUCCGCAGGCCCGAAAGGGUAUUGGCGUUAGGU (配列番号3)
GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU (配列番号4)
GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU (配列番号5)
GGAUCGAAAGAUUUCCGCACCCCCGAAAGGGGUAAGUGGCGUUAGGU (配列番号19)
からなる化学構造を有する、前記(1)〜(3)のいずれかのリンカー。
(5)mRNAと、その翻訳産物であるペプチドが、前記(1)〜(4)のいずれかのリンカーを介して結合した〔mRNA〕−〔リンカー〕−〔ペプチド〕連結体を作製する方法であって、
前記(1)〜(4)のいずれかのリンカーを調製する工程、
リンカーの一本鎖構造領域の塩基配列にハイブリダイズできる配列を、ペプチドをコードする配列の下流に有するmRNAを合成する工程、
再構成型のin vitroタンパク質合成反応液中で、リンカーとmRNAとを接触させるとともに、mRNAからペプチドの翻訳を行う工程
を含む、前記方法。
(6)mRNAと、その翻訳産物であるペプチドが、前記(1)〜(4)のいずれかのリンカーを介して結合した〔mRNA〕−〔リンカー〕−〔ペプチド〕連結体を作製する方法であって、
前記(1)〜(4)のいずれかのリンカーを調製する工程、
リンカーの一本鎖構造領域の塩基配列にハイブリダイズできる配列を、ペプチドをコードする配列の下流に有するmRNAの鋳型となるDNAを合成する工程、
再構成型のin vitroタンパク質合成反応液中にリンカーとDNAを供することにより、DNAからmRNAへの転写およびペプチドへの翻訳ならびにリンカーとmRNAとの複合体形成を行う工程
を含む、前記方法。
(7)再構成型のin vitroタンパク質合成反応液中に、非タンパク質性アミノ酸またはヒドロキシ酸でチャージされたtRNAを含むことにより、翻訳産物であるペプチドが特殊ペプチドとなる、(5)または(6)に記載の方法。
(8)前記(7)に記載の方法で作製された、〔mRNA〕−〔リンカー〕−〔特殊ペプチド〕連結体からなるライブラリー。
(9)mRNAと、その翻訳産物であるペプチドが、前記(1)〜(4)のいずれかのリンカーを介して結合した〔mRNA〕−〔リンカー〕−〔ペプチド〕連結体ライブラリーから、標的物質に結合するペプチドアプタマーを選択する方法であって、
前記(1)〜(4)のいずれかのリンカーを調製する工程、
リンカーの一本鎖構造領域の塩基配列にハイブリダイズできる配列を、ランダムペプチド配列をコードする配列の下流に有するmRNAライブラリーを作製する工程、
再構成型のin vitroタンパク質合成反応液中で、リンカーとmRNAライブラリーとを接触させるとともに、ペプチドの翻訳を行うことにより、〔mRNA〕−〔リンカー〕−〔ペプチド〕連結体のライブラリーを作製する工程
標的物質と、〔mRNA〕−〔リンカー〕−〔ペプチド〕連結体のライブラリーを接触させる工程
標的物質に結合したペプチドを提示する連結体を選択する工程
を含む、前記方法。
(10)標的物質がビオチン化修飾されている、(9)に記載の方法。
(11)再構成型のin vitroタンパク質合成反応液中に、非タンパク質性アミノ酸またはヒドロキシ酸でチャージされたtRNAを含むことにより、翻訳産物であるペプチドが特殊ペプチドとなる、(9)または(10)に記載の方法。
(12)上記(2)に記載のリンカーを作製する方法であって、
一本鎖構造領域と、配列ACCAからなるオリゴRNAとの間を、ポリエチレングリコールで連結したキメラオリゴヌクレオチドを合成し、
キメラオリゴヌクレオチドの3’末端のアデノシンに、人工RNA触媒を用いる反応により、アミノ酸をエステル結合させることにより、
一本鎖構造領域とペプチドアクセプター領域の間がポリエチレングリコールで連結されたリンカーを作製する、前記方法。
(13)人工RNA触媒が、以下のいずれかのRNA配列
GGAUCGAAAGAUUUCCGCAGGCCCGAAAGGGUAUUGGCGUUAGGU (配列番号3)
GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU (配列番号4)
GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU (配列番号5)
GGAUCGAAAGAUUUCCGCACCCCCGAAAGGGGUAAGUGGCGUUAGGU (配列番号19)
からなる化学構造を有する、(12)に記載の方法。
リンカーは、本発明のRAPIDディスプレイ法においても公知のmRNAディスプレイ法と同様に、一方の端でmRNAの3’末端側と、もう一方の端でペプチドのC末端側と結合することにより、mRNAとその翻訳産物であるペプチドを連結する。
5'-CTCCCGCCCCCCGTCC-3’(配列番号1)
5'-CCCGCCTCCCGCCCCCCGTCC-3’(配列番号2)
といった塩基配列を有する、13〜21ヌクレオチドからなる一本鎖DNAが挙げられる。
上述の通り、リンカーにペプチドアクセプターとしての構造を付与するためには、リンカー分子末端のオリゴRNA(ACCA配列)部分に、アミノ酸を結合させる必要がある。このアミノ酸の結合を、人工RNA触媒を用いて行うことが、本発明の特徴である。
H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662;
H. Murakami, D. Kourouklis, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 1077-1084;
H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) Nature Methods 3, 357-359;
N. Niwa, Y. Yamagishi, H. Murakami, H. Suga (2009) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 3892-3894; および
特開2008-125396またはWO2007/066627。
原型のフレキシザイム Fx
[GGAUCGAAAGAUUUCCGCAGGCCCGAAAGGGUAUUGGCGUUAGGU-3’, 45nt] (配列番号3)
エンハンスドフレキシザイム eFx
[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU-3’,45nt]) (配列番号4)
ジニトロベンジルフレキシザイム dFx
[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU-3’,46nt] (配列番号5)
アミノフレキシザイム aFx
[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCACCCCCGAAAGGGGUAAGUGGCGUUAGGU-3’,47nt]) (配列番号19)
フレキシザイム Fxは、脱離基としてシアノメチル基を、側鎖として芳香環をもつアミノ酸(例えば、フェニルアラニン、チロシンなどのシアノメチルエステル)、フレキシザイム eFx, dFx, aFxはフレキシザイム Fxで利用可能な脱離基とアミノ酸に加え、脱離基として4−クロロベンジルチオールを、側鎖としては芳香環以外の側鎖をもつアミノ酸を基質としたアミノアシル化を触媒することができる。詳細は、前述の文献を参照されたい。したがって、このような構造を持つアミノ酸とリンカーをフレキシザイムの存在下で反応させることにより、リンカー3’末端のアデノシン内のリボース環上の3’位の水酸基に、アミノ酸がエステル結合した分子を得ることができる。アミノ酸基質としては、任意の構造を持つものを結合させることができ、天然の翻訳で使用されるアミノ酸のみならず、D-アミノ酸あるいはβ(beta)-アミノ酸などの非タンパク質性アミノ酸(すなわち、天然に存在するタンパク質中に通常見出されるL-アミノ酸以外のもの)も利用できる。さらに、アミノ酸の代わりにヒドロキシカルボン酸をリンカー3’末端に結合させることもでき、ペプチドアクセプターとしてリボソームへの取り込みも可能である。
RAPIDディスプレイ法では、リンカーをcDNAあるいはmRNAと共に無細胞翻訳系(「in vitroタンパク質合成系」ともいう)に加えて一定時間反応させることで、mRNAからの翻訳およびリンカー分子との複合体形成、それに続くペプチドとリンカーとの連結を行うことができる。
(ア)DNAをmRNAに転写する反応
(イ)mRNAの3’末端側が、リンカー末端の一本鎖構造領域とハイブリダイゼーションにより複合体を形成する反応
(ウ)mRNAからペプチドに翻訳する反応
(エ)翻訳が完了したペプチドのC末端がリンカーのもう一方の末端のペプチドアクセプター領域にアミド結合する反応
(オ)〔ペプチド〕−〔リンカー〕−〔mRNA〕複合体が、リボソームから解離する反応。
T7プロモーターの場合、TAATACGACTCACTATA (配列番号6)
(2)開始コドン上流の適切な配列をコードする配列。
無細胞翻訳系で大腸菌由来のリボソームを使用する場合、SD配列遺伝子を含む。これは通常のタンパク質合成と同様である。例えば、GGGTTAACTTTAA GAAGGAGATATACAT (配列番号7): T7ファージのgene 10 proteinの上流配列を改変したもの。下線部はSD配列。
進化分子工学では、所望の機能や性質を持つタンパク質やペプチドを創製することを目的として、可能性のある遺伝子を大規模に準備し、その中から狙った表現型を有するクローンを選択する。
リンカーとしてDNAとRNA間をポリエチレングリコール(5ユニットのSpacer18)で連結したDNA/RNAキメラオリゴヌクレオチドを使用した。種々リンカーはBEX社(東京)より購入した。以下に示す配列の*Aおよび*CはRNA、SPC18はSpacer18(ヘキサエチレングリコール)に相当する。
〔リンカーのアミノアシル化〕
フレキシザイムが触媒する反応により、an21-ACCAリンカー分子の3’末端側にエステル結合を介してL-フェニルアラニンもしくはβ-L-アラニンを結合させた。反応産物は精製した反応産物溶液を酸性条件下でのアクリルアミド電気泳動分析により確認した。リンカー分子に由来するバンドがアミノアシル化されると移動度が少なくなる。そのため、未反応物由来のバンドと反応産物由来のバンドの強度を比較することでアミノアシル化効率を決定することができる。
〔cDNAの合成〕
ペプチド-mRNA複合体を形成するために用いるcDNAは、合成オリゴヌクレオチドをPCRにより連結することにより調製した。以下に配列を示す合成DNAはオペロン社(東京)より購入した。これらのオリゴDNAを連結することにより得られる各々のcDNAは、T7プロモーター配列、リボソーム結合配列、開始コドン、ペプチドアプタマー配列、スペーサーペプチド配列(CGSGSGS)、アンバーコドンおよびリンカーハイブリダイゼーション配列より構成される。
TNF-a_D-Trp.R66:
GCCGCTGCCGCTGCCGCAATGCTTCAGATACAGACAATGCAGACGTTGCATATGTATATCTCCTTC
EMP1SS.F63: GAAGGAGATATACATATGGCAGCAGGTGGTACCTATTCTTCTCATTTTGGTCCGCTGACCTGG
EMP1SS.R63: GCCGCTGCCGCTGCCGCATGCTGCACCACCTTGCGGCTTAGAAACCCAGGTCAGCGGACCAAA
T7g10M.F48: TAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG
CGS3an13.R39: TTTCCGCCCCCCGTCCTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA
CGS3an21.R44: CCCGCCTCCCGCCCCCCGTCCTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA
PCRによる連結は以下の手順にて行った。
〔mRNAの調製〕
mRNAは前述の方法で作成したcDNA(TNF-α-DW(an21))を元にT7 RNA ポリメラーゼによる転写反応によりRNAを合成し、得られた反応産物は常法に従いフェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、さらに2-プロパノール沈殿により精製を行った。精製後のmRNAの濃度を260 nmにおけるUVの吸収から求め、10 μMになるように希釈した。
〔転写・翻訳、リンカーのハイブリダイゼーション、ペプチドアクセプターとの連結〕
mRNAからの翻訳およびリンカー分子との複合体形成もしくはcDNAからの転写、翻訳およびリンカー分子との複合体形成は再構成型の無細胞翻訳系を用いて行った。
70Sリボソーム(1.2uM)、翻訳開始因子(IF1(0.7uM), IF2(0.4uM), IF3(1.5uM))、
伸長因子(EF-G(0.26uM), EF-Tu/EF-Ts複合体(10uM))、翻訳終止因子(RF2(0.25uM), RF3(0.17uM))メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ(MTF(0.6uM))、リボソーム再生因子(RRF(0.5uM))、アミノアシルtRNA合成酵素(AlaRS(0.73uM), ArgRS(0.03uM), AsnRS(0.38uM), CysRS(0.02uM), GlnRS(0.06uM), GluRS(0.23uM), GlyRS(0.09uM), HisRS(0.02uM), IleRS(0.4uM), LeuRS(0.04uM), MetRS(0.03uM), PheRS(0.68uM), ProRS(0.16uM), SerRS(0.04uM), ThrRS(0.09uM), TrpRS(0.03uM), ValRS(0.02uM), AspRS(0.13uM), LysRS(0.11uM), TyrRS(0.02uM))、クレアチンキナーゼ(ロシュ社製CK(4ug/mL)、ミオキナーゼ(ロシュ社製、MK(3ug/mL))、ピロフォスファターゼ(PPa(0.1uM))、
ヌクレオチド二リン酸キナーゼ(NDK(0.1uM))、T7 RNAポリメラーゼ(T7ファージ遺伝子由来の組み換え体、0.1uM)、大腸菌tRNA(ロシュ社製、1.5mg/mL)。リボソームは対数増殖期の大腸菌から精製したもの、リボソーム以外の各種タンパク質は、特に指示がある場合を除き、大腸菌の遺伝子をクローニングし、それを元に発現、精製した組み換えタンパク質である。
50mM HEPES-KOH (pH7.6), 2mM NTPs, 20mM リン酸クレアチン, 100mM 酢酸カリウム, 2mM スペルミジン, 1mM ジチオスレイトール, 6mM 酢酸マグネシウム, 0.1mM 10-ホルミル-5, 6, 7, 8-テトラヒドロ葉酸。
〔逆転写〕
ペプチド-mRNA複合体のmRNA部分の安定性を向上させるため、逆転写反応を行うことにより、RNA-DNAハイブリッド鎖を形成させた。具体的には以下の操作を行った。前述の翻訳反応産物に、12 mM Tris-HCl (pH 8.3), 5 μM 逆転写プライマー(CGS3an13.R21), 0.5 mM dNTPs, 18 mM Mg(OAc)2, 10 mM KOH(各々の濃度は終濃度)を添加した。これにM-MLV Reverse Transcriptase (RNaseH Minus, Point Mutant, Promega) 1 unitを添加し恒温水槽中で42 ℃で10分間反応させた。その後、終濃度が10 mMおよび18 mMになるようにEDTAと塩酸を添加した。
〔セレクション〕
このようにして作成したペプチド-mRNA複合体分子が、提示ペプチドとターゲットとなるタンパク質との相互作用により回収されるかどうかを以下に示す方法により確認した。
〔リアルタイムPCRによる定量〕
ターゲットタンパク質添加前、および磁性ビーズより回収後のDNAの量をリアルタイムPCR法により定量した。リアルタイムPCR測定装置はLightCycler(登録商標)1.5 (Roche Applied Science社)を使用し、前述のPCR(taq-)バッファーにTaqポリメラーゼ、SYBR(登録商標)Green I (100,000希釈、Invitrogen社)、および測定サンプル溶液を添加した反応液を測定に供した。
TNF-αを標的としたモデル実験
リンカーの機能を確認するために用いたターゲットとなるタンパク質およびペプチドアプタマーとして、TNF-αおよびTNF-αに結合するペプチドアプタマーであるTNF-α-DWを選択した。
前述までの実験に於いては、提示しているペプチドと、その配列をコードしているmRNAは単一の種類であるため、mRNAから翻訳合成されたペプチドに対して、別のリンカー分子がアクセプターとして結合している可能性や、2本鎖を形成しているリンカー分子とmRNA分子が操作の途中で別のリンカー分子やmRNAと交換している可能性を排除できない。そのため、回収されるペプチド-mRNA-リンカー複合分子の提示ペプチドとmRNAとの対応付けが正確に行われていることを確認するために以下に示す実験を行った。
〔ランダムペプチドライブラリー〕
本手法によりランダムペプチド配列をコードするmRNAライブラリー中に含まれる低コピー数のペプチドアプタマーをコードするmRNAもしくはcDNAを、複数回のセレクションを繰り返すことにより選別することが可能かどうかを検討した。
〔TNF-α-DWスパイクドライブラリーの調製〕
このランダムペプチドライブラリーに対して、TNF-α-DWをコードするmRNA(TNF-α-DW(an13): リンカーとの2本鎖形成部の長さが13塩基)をモル比で1,000,000 : 1となるように混合したスパイクドライブラリーを用意した。
〔ラウンド1〕
このスパイクドライブラリーmRNAおよびan21-Pheリンカーを用いて、前述の実施例1および2に示した手順に従い翻訳とペプチド?mRNA複合体の形成を行った(ラウンド1)。
〔ラウンド2、3および4〕
ラウンド2以降に於いては、前ラウンドのPCR産物から合成したmRNAを翻訳反応に用いた場合と、前ラウンドのPCR産物をcDNAとして転写・翻訳反応を同時に行った場合とを比較した。実験の手順は実施例1および2と同様に行った。その際のネガティブセレクションの操作を複数回行った。具体的にはラウンド毎に1回ずつネガティブセレクションの回数を増やしている。ラウンド2以降もPCRは増幅反応が飽和する前に増幅を終了した。
〔選択された配列の確認〕
ラウンド2の操作を複数回繰り返した結果、ラウンド4において結合率の大幅な増大を認めた。ラウンド毎の結合率の変化を図7に示した。PCR産物をpGEM-T easy Vector System I (Promega社)を用い常法に従いクローニングし、各々5クローンをDNAシーケンシングにより解析した。その結果、得られたクローンは全てTNF-α-DW(an21)と同一の配列であった。
配列番号2 合成オリゴヌクレオチド
配列番号3 フレキシザイムFx (Flexizyme Fx)
配列番号4 フレキシザイムeFX (Flexizyme eFx)
配列番号5 フレキシザイムdFx (Flexizyme dFx)
配列番号6 合成オリゴヌクレオチド
配列番号7 合成オリゴヌクレオチド
配列番号8 合成オリゴヌクレオチド TNF-a_D-Trp.R66
配列番号9 合成オリゴヌクレオチド EMP1SS.F63
配列番号10 合成オリゴヌクレオチド EMP1SS.R63
配列番号11 合成オリゴヌクレオチド T7g10M.F48
配列番号12 合成オリゴヌクレオチド CGS3an13.R39
配列番号13 合成オリゴヌクレオチド CGS3an21.R44
配列番号14 合成オリゴヌクレオチド CGSan13.R21
配列番号15 TNF-alpha-DW(an21)
配列番号16 TNF-alpha-DW(an13)
配列番号17 EMP1SS (an21)
配列番号18 TNF-alpha
配列番号19 フレキシザイムaFx (Flexizyme aFx)
(注)配列番号15〜17のDNAでは、メチオニンのコドンが非タンパク質性アミノ酸(ClAc-D-Trp)に割り当てられている(遺伝暗号のリプログラミング)。
Claims (11)
- 再構成型のin vitroタンパク質合成系において、mRNAと、その翻訳産物であるペプチドとが、リンカーを介して結合した連結体を作製するために使用されるリンカーであって、
リンカーの一方の端に、mRNAの3'末端側の塩基と対合する側鎖塩基を有する一本鎖構造領域を含み、
リンカーのもう一方の端に、ペプチド転移反応によって翻訳産物と結合可能な基を含むペプチドアクセプター領域を含み、
ペプチドアクセプター領域は、塩基配列ACCAからなるオリゴRNAにアミノ酸がエステル結合した構造からなり、
当該エステル結合が、人工RNA触媒を用いるアミノアシル化反応により形成された
ことを特徴とするリンカーであって、
アミノアシル化反応に使用される人工RNA触媒が、以下のいずれかのRNA配列
GGAUCGAAAGAUUUCCGCAGGCCCGAAAGGGUAUUGGCGUUAGGU (配列番号3)
GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU (配列番号4)
GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU (配列番号5)
GGAUCGAAAGAUUUCCGCACCCCCGAAAGGGGUAAGUGGCGUUAGGU (配列番号19)
からなる化学構造を有する、前記リンカー。 - 一本鎖構造領域とペプチドアクセプター領域の間がポリエチレングリコールで連結されている、請求項1に記載のリンカー。
- 一本鎖構造領域が一本鎖DNAからなる、請求項1または2に記載のリンカー。
- mRNAと、その翻訳産物であるペプチドが、請求項1〜3のいずれかに記載のリンカーを介して結合した〔mRNA〕−〔リンカー〕−〔ペプチド〕連結体を作製する方法であって、
請求項1〜3のいずれかに記載のリンカーを調製する工程、
リンカーの一本鎖構造領域の塩基配列にハイブリダイズできる配列を、ペプチドをコードする配列の下流に有するmRNAを合成する工程、
再構成型のin vitroタンパク質合成反応液中で、リンカーとmRNAとを接触させるとともに、mRNAからペプチドの翻訳を行う工程
を含む、前記方法。 - mRNAと、その翻訳産物であるペプチドが、請求項1〜3のいずれかに記載のリンカーを介して結合した〔mRNA〕−〔リンカー〕−〔ペプチド〕連結体を作製する方法であって、
請求項1〜3のいずれかに記載のリンカーを調製する工程、
リンカーの一本鎖構造領域の塩基配列にハイブリダイズできる配列を、ペプチドをコードする配列の下流に有するmRNAの鋳型となるDNAを合成する工程、
再構成型のin vitroタンパク質合成反応液中にリンカーとDNAを供することにより、DNAからmRNAへの転写およびペプチドへの翻訳ならびにリンカーとmRNAとの複合体形成を行う工程
を含む、前記方法。 - 再構成型のin vitroタンパク質合成反応液中に、非タンパク質性アミノ酸またはヒドロキシ酸でチャージされたtRNAを含むことにより、翻訳産物であるペプチドが特殊ペプチドとなる、請求項4または5に記載の方法。
- 請求項6に記載の方法で作製された、〔mRNA〕−〔リンカー〕−〔特殊ペプチド〕連結体からなるライブラリー。
- mRNAと、その翻訳産物であるペプチドが、請求項1〜3のいずれかに記載のリンカーを介して結合した〔mRNA〕−〔リンカー〕−〔ペプチド〕連結体ライブラリーから、標的物質に結合するペプチドアプタマーを選択する方法であって、
請求項1〜3のいずれかに記載のリンカーを調製する工程、
リンカーの一本鎖構造領域の塩基配列にハイブリダイズできる配列を、ランダムペプチド配列をコードする配列の下流に有するmRNAライブラリーを作製する工程、
再構成型のin vitroタンパク質合成反応液中で、リンカーとmRNAライブラリーとを接触させるとともに、ペプチドの翻訳を行うことにより、〔mRNA〕−〔リンカー〕−〔ペプチド〕連結体のライブラリーを作製する工程
標的物質と、〔mRNA〕−〔リンカー〕−〔ペプチド〕連結体のライブラリーを接触させる工程
標的物質に結合したペプチドを提示する連結体を選択する工程
を含む、前記方法。 - 標的物質がビオチン化修飾されている、請求項8に記載の方法。
- 再構成型のin vitroタンパク質合成反応液中に、非タンパク質性アミノ酸またはヒドロキシ酸でチャージされたtRNAを含むことにより、翻訳産物であるペプチドが特殊ペプチドとなる、請求項8または9に記載の方法。
- 請求項2に記載のリンカーを作製する方法であって、
一本鎖構造領域と、配列ACCAからなるオリゴRNAとの間を、ポリエチレングリコールで連結したキメラオリゴヌクレオチドを合成し、
キメラオリゴヌクレオチドの3’末端のアデノシンに、以下のいずれかのRNA配列からなる化学構造を有する、人工RNA触媒:
GGAUCGAAAGAUUUCCGCAGGCCCGAAAGGGUAUUGGCGUUAGGU (配列番号3)
GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU (配列番号4)
GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU (配列番号5)
GGAUCGAAAGAUUUCCGCACCCCCGAAAGGGGUAAGUGGCGUUAGGU (配列番号19)
を用いる反応により、アミノ酸をエステル結合させることにより、
一本鎖構造領域とペプチドアクセプター領域の間がポリエチレングリコールで連結されたリンカーを作製する、前記方法。
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