JP5172638B2

JP5172638B2 - Method for evaluating the orientation of membrane proteins in lipid membranes

Info

Publication number: JP5172638B2
Application number: JP2008319944A
Authority: JP
Inventors: 奈保子河西; 陽一篠崎; 弘二住友; 慶一鳥光
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 2008-12-16
Filing date: 2008-12-16
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2028-12-16
Also published as: JP2010145125A

Description

本発明は、膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法に関する。 The present invention relates to a method for evaluating the orientation of membrane proteins in lipid membranes.

ポストゲノム時代が到来し、生体から精製したタンパク質を様々な用途に利用する研究開発が頻繁になされるようになってきた。その中でも膜タンパク質は、新しい創薬のターゲットとして注目されている。膜タンパク質である受容体タンパク質は、生体膜中に存在し、生体内の情報伝達に重要な役割を果たす。それゆえ、その機能の障害は疾病に大きく関与し、近年、既存の薬のうち約５０％、研究開発中の薬のうち約７０％が膜タンパク質をターゲットとしたものであるといわれている。そこで、精製した膜タンパク質を取り扱って様々な検討が行われているが、精製した膜タンパク質を、機能を保持した状態で取り扱う際には、多くの場合、該膜タンパク質を人工脂質二分子膜に再構成することが行われている。 With the advent of the post-genomic era, research and development using proteins purified from living organisms for various purposes has been frequently made. Among them, membrane proteins are attracting attention as targets for new drug discovery. A receptor protein that is a membrane protein exists in a biological membrane and plays an important role in information transmission in the living body. Therefore, the impairment of the function is greatly related to the disease, and in recent years, about 50% of existing drugs and about 70% of drugs under research and development are said to target membrane proteins. Therefore, various studies have been conducted on handling purified membrane proteins. When handling purified membrane proteins in a state that retains their functions, in many cases the membrane proteins are converted into artificial lipid bilayer membranes. Reconfiguration has been done.

また、再構成した膜タンパク質を用いることで、ナノメディシンという新しい分野の研究も生まれている。これはドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に代表されるナノメートル領域でかつ活性を制御した分子を創薬に用いる研究であり、米国では実際に治療に用いられている例もある。
具体的には、脂質二分子膜（以下、単に「脂質膜」ということもある。）により形成したナノメートルサイズのベシクルの表面に細胞接着性のタンパク質または抗体を埋め込み、内部に薬剤を充填しておく。これにより、タンパク質の分子識別能による局所限局性送達が実現されるため、投薬により、肺、目、皮膚の治療のみならず、癌や神経変性疾患、心血管疾患の治療も期待される。さらに、ナノ構造化したスキャフォールドによる再生医工学も注目されている（例えば、非特許文献１）。 Research on a new field of nanomedicine has also been born by using reconstituted membrane proteins. This is research that uses molecules with controlled activity in the nanometer range typified by drug delivery systems (DDS) for drug discovery, and there are examples that are actually used for treatment in the United States.
Specifically, a cell-adhesive protein or antibody is embedded on the surface of a nanometer-sized vesicle formed by a lipid bilayer membrane (hereinafter sometimes simply referred to as “lipid membrane”), and a drug is filled inside. Keep it. As a result, local localized delivery based on the molecular discrimination ability of the protein is realized, so that not only treatment of lungs, eyes and skin but also treatment of cancer, neurodegenerative diseases and cardiovascular diseases can be expected by administration. Furthermore, regenerative medical engineering using a nanostructured scaffold has also attracted attention (for example, Non-Patent Document 1).

一方、生体の機能を利用してチップ化を行うことも広く行われている。タンパク質もしくは抗体を基板上に固定して、その応答を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）等の方法で観察するプロテインチップは、短時間の診断や創薬に役立てられるようになってきた。この方法では、チップ化したタンパク質のリガンド結合能を検討するために、多数の活性を有する状態のタンパク質を基板上に保持している。
また、ベシクルを使ってタンパク質をアレイ化したチップに関しては、膜タンパク質をベシクルに再構成させ、自己配列法により基板の微小領域に結合させるという技術が開発されている（非特許文献２）。
さらに、パターニングしたシリコン基板を用いてベシクルをアレイ状に配列させる技術（特許文献２）や、金のナノメートルサイズのドット上にベシクルを配列させる技術も示されている（非特許文献３）。両者とも、膜タンパク質を含むベシクルを用いることで、膜タンパク質チップを容易に作製することが可能である。 On the other hand, chip formation using the function of a living body is also widely performed. A protein chip in which a protein or antibody is immobilized on a substrate and its response is observed by a method such as a surface plasmon resonance method (SPR method) has come to be useful for short-time diagnosis and drug discovery. In this method, in order to examine the ligand binding ability of the chipped protein, a protein having a large number of activities is held on the substrate.
In addition, regarding a chip in which proteins are arrayed using vesicles, a technique has been developed in which membrane proteins are reconstituted into vesicles and bound to microregions of a substrate by a self-alignment method (Non-patent Document 2).
Furthermore, a technique for arranging vesicles in an array using a patterned silicon substrate (Patent Document 2) and a technique for arranging vesicles on gold nanometer-sized dots are also shown (Non-Patent Document 3). In both cases, a membrane protein chip can be easily produced by using a vesicle containing a membrane protein.

その他、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）等のプローブ顕微鏡による膜タンパク質の構造観察は、膜タンパク質の機能を知る上で重要である。特に二次元結晶化された膜タンパク質については多くの報告がなされており（非特許文献４）、最近では精製後の膜タンパク質を脂質膜へ再構成し、その構造を観察することも行われている（非特許文献５）。プローブ顕微鏡を用いる観察では、単一の膜タンパク質を観察することも可能となり、生体内における膜タンパク質の役割や、他の分子との相互作用等について、より深い知見を得ることも可能である。 In addition, observation of the structure of the membrane protein with a probe microscope such as an atomic force microscope (AFM) is important for knowing the function of the membrane protein. In particular, many reports have been made on two-dimensionally crystallized membrane proteins (Non-Patent Document 4). Recently, membrane proteins after purification have been reconstituted into lipid membranes and their structures have been observed. (Non-Patent Document 5). In observation using a probe microscope, it is possible to observe a single membrane protein, and it is also possible to obtain deeper knowledge about the role of the membrane protein in vivo, interaction with other molecules, and the like.

膜タンパク質等の生体分子を観察やデバイスに用いる場合、生体分子やその一部が基板に強固に固定されている場合や、生体分子同士が凝集している場合には、それらの生体分子が生体内とは同じ生理活性を保持し難い。膜タンパク質１０は、図１に示すように、生体膜２０に埋め込まれる疎水部１１と、生体膜２０には入り込まない親水部１２（細胞内ドメイン１２ａ、細胞外ドメイン１２ｂ）とを有しており、生体内では、その疎水部１１が生体膜２０に埋め込まれた状態で存在している。そのため、機能を発現させるためには、生体内を模倣した状態、つまり脂質二分子膜中に再構成した状態で扱う必要があり、その状態で、アレイ化して診断等の目的でチップ化したり、プローブ顕微鏡で構造観察を行う目的で基板上に展開したりする必要がある。つまり、特に膜タンパク質の薬学、工学応用において、膜タンパク質を脂質膜へ再構成することは非常に重要である。 When biomolecules such as membrane proteins are used for observation or devices, when biomolecules or a part of them are firmly fixed to the substrate, or when biomolecules are aggregated, these biomolecules are It is difficult to maintain the same physiological activity as the body. As shown in FIG. 1, the membrane protein 10 has a hydrophobic portion 11 embedded in the biological membrane 20 and a hydrophilic portion 12 (intracellular domain 12a, extracellular domain 12b) that does not enter the biological membrane 20. In the living body, the hydrophobic part 11 exists in a state of being embedded in the biological membrane 20. Therefore, in order to express the function, it is necessary to handle it in a state imitating the living body, that is, in a state reconstituted in a lipid bilayer membrane, and in that state, it is arrayed and made into a chip for the purpose of diagnosis, It is necessary to develop on a substrate for the purpose of observing the structure with a probe microscope. In other words, it is very important to reconstitute membrane proteins into lipid membranes, especially in pharmaceutical and engineering applications of membrane proteins.

膜タンパク質を再構成したリポソーム（プロテオリポソーム）の製造方法としては、透析法やビーズ法等が挙げられる。脂質、膜タンパク質、界面活性剤を混合した混合液から、透析法、ビーズ法によって界面活性剤を除去することで、膜タンパク質が脂質二分子膜からなるリポソームの中に再構成されて安定化し、プロテオリポソームが形成される。基板上に展開する場合は、前述のようにして得たプロテオリポソームをベシクルフュージョン法により展開する。 Examples of the method for producing liposomes (proteoliposomes) reconstituted with membrane proteins include dialysis and bead methods. By removing the surfactant from the mixture of lipid, membrane protein, and surfactant by dialysis and bead methods, the membrane protein is reconstituted into liposomes consisting of lipid bilayers and stabilized. Proteoliposomes are formed. When developing on a substrate, the proteoliposome obtained as described above is developed by the vesicle fusion method.

従来、膜タンパク質の脂質膜への再構成は、主に（１）プロテオリポソームを用いたＤＤＳ（非特許文献６）、（２）Ｘ線構造解析のための膜タンパク質の二次元結晶化（非特許文献７）、（３）電気生理法によるチャネル活性計測（非特許文献８）、（４）膜タンパク質中の特定のペプチドと脂質膜との相互作用の検討（非特許文献９）を目的として行われていた。
しかしながら、（１）〜（４）いずれの場合においても、脂質膜中で再構成した膜タンパク質がどの方向を向いているか（細胞内ドメインと細胞外ドメインが脂質膜のどちら側にあるか）が考慮されていない。 Conventionally, reconstitution of a membrane protein into a lipid membrane has been mainly performed by (1) DDS using proteoliposome (Non-patent Document 6), (2) two-dimensional crystallization of membrane protein for X-ray structural analysis Patent Document 7), (3) Channel activity measurement by electrophysiology (Non-Patent Document 8), (4) Examination of interaction between specific peptide in membrane protein and lipid membrane (Non-Patent Document 9) It was done.
However, in any of the cases (1) to (4), the direction of the membrane protein reconstituted in the lipid membrane is directed (whether the intracellular domain or the extracellular domain is on the side of the lipid membrane). Not considered.

膜タンパク質は、細胞内ドメインと細胞外ドメインとで役割が全く異なるため、脂質膜における膜タンパク質の配向が異なると、その機能が全く異なってしまう。したがって、膜タンパク質の機能をデバイスへ応用する場合等においては、該膜タンパク質を脂質膜に再構成してその機能を発現させることはもちろん、その配向を評価することも不可欠である。そこで、基板上に展開した脂質膜中の膜タンパク質の配向を、抗体を利用したＡＦＭによる観察により評価する方法が示されている（非特許文献１０）。
米国特許出願公開第２００６／００９４０５３号明細書特開２００５−９８７１８号公報 Systemic Leukocyte-Directed siRNA Delivery Revealing Cyclin D1 as an Anti-Inflammatory Target, Peer D., et al., Science, 2008, 319: 627-630. Self-assembled Microarrays of Atto liter Molecular vessels, Dimitriios Stamou et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 5580-5583. Self-assembly of vesicle nanoarrays on Si:A potential route to high-density functional protein arrays, C. S. Ramanujan, Appl. Phys. Lett., 90, 033901 (2007). Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope, Andreas Engel and Daniel J. Muller, Nature Structural Biology, 2000, 7, 9, 715-718. Examination of Reconstitution Condition for AFM Observation of an Ionotropic Glutamate Receptor, N. Kasai, et al., Biophys. J., Meeting Abstract, 2008, 94: 1944. A remote controlled valve in liposomes for triggered liposomal release. Kocer A., Journal of Liposome Research, 2007; 17(3-4): 219-25. Membrane-protein stability in a phospholipid-based crystallization medium, Lunde CS, et al., J. Struct. Biol., Vol. 154, pp.223-231, 2006. Single channel recording of reconstituted AMPA receptors reveal low and high conductance states, Vitaly Vodyanoy, et al., Neuroscience Letters, Vol. 150, pp.80-84, 1993. Liposome reconstitution of a minimal protein-mediated membrane fusion machine. Top D. et al., EMBO J., 2005 Sep 7, 24(17): 2980-2988. Visualization of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor by atomic force microscopy., Suhara, W., Kobayashi, M., Sagara, H., Hamada, K., Goto, T., Fujimoto, I., Torimitsu, K. and Mikoshiba, K., 2006, Neuroscience Letters, 391, 102-107. Since membrane proteins have completely different roles in the intracellular domain and the extracellular domain, their functions are completely different if the orientation of the membrane protein in the lipid membrane is different. Therefore, when the function of a membrane protein is applied to a device, it is indispensable not only to reconstitute the membrane protein into a lipid membrane to express its function but also to evaluate its orientation. Therefore, a method for evaluating the orientation of membrane proteins in a lipid membrane developed on a substrate by observation with an AFM using an antibody has been shown (Non-patent Document 10).
US Patent Application Publication No. 2006/0094053 JP 2005-98718 A Systemic Leukocyte-Directed siRNA Delivery Revealing Cyclin D1 as an Anti-Inflammatory Target, Peer D., et al., Science, 2008, 319: 627-630. Self-assembled Microarrays of Atto liter Molecular vessels, Dimitriios Stamou et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 5580-5583. Self-assembly of vesicle nanoarrays on Si: A potential route to high-density functional protein arrays, CS Ramanujan, Appl.Phys. Lett., 90, 033901 (2007). Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope, Andreas Engel and Daniel J. Muller, Nature Structural Biology, 2000, 7, 9, 715-718. Examination of Reconstitution Condition for AFM Observation of an Ionotropic Glutamate Receptor, N. Kasai, et al., Biophys. J., Meeting Abstract, 2008, 94: 1944. A remote controlled valve in liposomes for triggered liposomal release.Kocer A., Journal of Liposome Research, 2007; 17 (3-4): 219-25. Membrane-protein stability in a phospholipid-based crystallization medium, Lunde CS, et al., J. Struct. Biol., Vol. 154, pp.223-231, 2006. Single channel recording of reconstituted AMPA receptors reveal low and high conductance states, Vitaly Vodyanoy, et al., Neuroscience Letters, Vol. 150, pp.80-84, 1993. Liposome reconstitution of a minimal protein-mediated membrane fusion machine.Top D. et al., EMBO J., 2005 Sep 7, 24 (17): 2980-2988. Visualization of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor by atomic force microscopy., Suhara, W., Kobayashi, M., Sagara, H., Hamada, K., Goto, T., Fujimoto, I., Torimitsu, K and Mikoshiba, K., 2006, Neuroscience Letters, 391, 102-107.

しかしながら、非特許文献１０では、プロテオリポソームの状態で膜タンパク質の配向を評価することは検討されていなかった。プロテオリポソームの状態で膜タンパク質の配向を評価することができれば、配向の揃ったプロテオリポソームを効率良く選択することができ、それによりデバイス構築の生産性が向上すると考えられる。
そこで本発明では、プロテオリポソームの脂質二分子膜に再構成された膜タンパク質の配向を評価する、膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法を提供することを目的とする。 However, in Non-Patent Document 10, it has not been studied to evaluate the orientation of membrane proteins in the state of proteoliposomes. If the orientation of membrane proteins can be evaluated in the state of proteoliposomes, it is considered that proteoliposomes with uniform orientation can be efficiently selected, thereby improving the productivity of device construction.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for evaluating the orientation of membrane proteins in lipid membranes, which evaluates the orientation of membrane proteins reconstituted in lipid bilayers of proteoliposomes.

本発明の膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法は、プロテオリポソームの脂質二分子膜内に再構成された膜タンパク質の配向を評価する方法であって、前記膜タンパク質の細胞内ドメインを標識する第１の蛍光波長を有する蛍光標識抗体と、細胞外ドメインを標識する第２の蛍光波長を有する蛍光標識抗体により、前記プロテオリポソームの前記脂質二分子膜の外側に位置する細胞内ドメインおよび細胞外ドメインを標識する標識工程と、該標識工程の後に、前記第１の蛍光波長の強度と、前記第２の蛍光波長の強度と、サイズ分布とをフローサイトメトリー法によって同時に計測し、前記第１の蛍光波長を有する蛍光標識抗体で標識されたプロテオリポソームと、前記第２の蛍光波長を有する蛍光標識抗体で標識されたプロテオリポソームを識別して前記膜タンパク質の配向を評価する評価工程と、を有する方法である。
The method for evaluating the orientation of a membrane protein in a lipid membrane according to the present invention is a method for evaluating the orientation of a membrane protein reconstituted in a lipid bilayer of a proteoliposome, wherein the intracellular domain of the membrane protein is labeled. and fluorescence-labeled antibody having a fluorescent wavelength of 1, the fluorescent labeled antibody having a second fluorescence wavelength to label the extracellular domain, BiHoso Oyo intracellular domain located outside of the lipid bilayer of the proteoliposomes A labeling step for labeling the extracellular domain, and after the labeling step, the intensity of the first fluorescence wavelength, the intensity of the second fluorescence wavelength, and the size distribution are simultaneously measured by flow cytometry, Proteoliposomes labeled with a fluorescently labeled antibody having a first fluorescence wavelength, and proteoliposomes labeled with a fluorescently labeled antibody having the second fluorescence wavelength An evaluation step of identifying and evaluating the alignment of the membrane protein is a method having.

本発明の評価方法によれば、プロテオリポソームの脂質二分子膜内に再構成された膜タンパク質の配向を評価することができる。 According to the evaluation method of the present invention, the orientation of the membrane protein reconstituted in the lipid bilayer of the proteoliposome can be evaluated.

本発明の膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法（以下、「配向評価方法」という。）は、プロテオリポソームの脂質二分子膜内に再構成された膜タンパク質の配向を評価する方法である。本発明の配向評価方法は、前記膜タンパク質の細胞内ドメインまたは細胞外ドメインのいずれかを標識する標識物質により、前記プロテオリポソームの前記脂質二分子膜の外側に位置する細胞内ドメインおよび／または細胞外ドメインを標識する標識工程と、該標識工程の後に前記標識物質による標識が施されたプロテオリポソームを分析して膜タンパク質の配向を評価する評価工程と、を有する。以下、本発明の実施形態の一例を示して詳細に説明する。 The method for evaluating the orientation of a membrane protein in a lipid membrane according to the present invention (hereinafter referred to as “orientation assessment method”) is a method for evaluating the orientation of a membrane protein reconstituted in a lipid bilayer of a proteoliposome. In the orientation evaluation method of the present invention, the intracellular domain and / or the cell located outside the lipid bilayer of the proteoliposome is labeled with a labeling substance that labels either the intracellular domain or the extracellular domain of the membrane protein. A labeling step for labeling the outer domain, and an evaluation step for analyzing the orientation of the membrane protein by analyzing the proteoliposome labeled with the labeling substance after the labeling step. Hereinafter, an exemplary embodiment of the present invention will be described in detail.

［第１実施形態］
本実施形態の配向評価方法は、プロテオリポソームに再構成された膜タンパク質の細胞内ドメインまたは細胞外ドメインのいずれかを標識する標識物質として蛍光標識抗体を用いる。本実施形態では、評価工程においてプロテオリポソームの蛍光強度を測定することにより、プロテオリポソーム中の膜タンパク質の配向を評価する。
本実施形態で用いるプロテオリポソーム１は、図２（Ａ）に示すように、脂質二分子膜３０に膜タンパク質１０が再構成されている。プロテオリポソーム１における膜タンパク質１０は、疎水部１１が脂質二分子膜３０中に埋め込まれ、親水部１２である細胞内ドメイン１２ａと細胞外ドメイン１２ｂのどちらか一方が外側を向くようにして再構成されている。 [First Embodiment]
In the orientation evaluation method of the present embodiment, a fluorescently labeled antibody is used as a labeling substance for labeling either the intracellular domain or the extracellular domain of the membrane protein reconstituted into proteoliposomes. In the present embodiment, the orientation of the membrane protein in the proteoliposome is evaluated by measuring the fluorescence intensity of the proteoliposome in the evaluation step.
In the proteoliposome 1 used in this embodiment, the membrane protein 10 is reconstituted in the lipid bilayer membrane 30 as shown in FIG. The membrane protein 10 in the proteoliposome 1 is reconstituted so that the hydrophobic portion 11 is embedded in the lipid bilayer membrane 30 and either the intracellular domain 12a or the extracellular domain 12b, which is the hydrophilic portion 12, faces outward. Has been.

プロテオリポソーム１の製造方法は、従来公知の方法を用いることができ、透析法、ビーズ法等を用いることができる。具体的には、脂質、膜タンパク質、界面活性剤を混合した混合液から、透析法、ビーズ法等により前記界面活性剤を取り除くことにより得ることができる。混合液の媒体としては、例えば、水、食塩水、緩衝溶液等の水性媒体が挙げられる。これらの方法により、混合液中の界面活性剤が徐々に取り除かれていき、混合液中で安定化されていた脂質により脂質二分子膜からなるリポソームが形成され、同時に混合液中で安定化されていた膜タンパク質が徐々に該脂質二分子膜中へと移動し、再構成されて安定化することで、プロテオリポソーム１が得られる。 As a method for producing the proteoliposome 1, a conventionally known method can be used, and a dialysis method, a bead method, or the like can be used. Specifically, it can be obtained by removing the surfactant by a dialysis method, a bead method or the like from a mixed solution in which lipid, membrane protein, and surfactant are mixed. Examples of the medium for the mixed liquid include aqueous media such as water, saline, and buffer solution. By these methods, the surfactant in the mixed solution is gradually removed, and liposomes composed of lipid bilayers are formed by the lipids stabilized in the mixed solution, and at the same time stabilized in the mixed solution. Proteoliposome 1 is obtained by the membrane protein that has been moved gradually into the lipid bilayer membrane, reconstituted and stabilized.

膜タンパク質１０としては、生体中で生体膜中に配されているものであればよく、例えば、イオンチャンネル型受容体やＧタンパク質共役型受容体等が挙げられる。膜タンパク質１０は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
脂質二分子膜３０を形成する脂質は、プロテオリポソームの形成に用いられる公知の脂質を用いることができ、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質等が挙げられる。これらの脂質は１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
界面活性剤は、プロテオリポソームの形成に用いられるものであればよく、公知の非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤を用いることができる。これら界面活性剤は１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。 The membrane protein 10 only needs to be arranged in the biological membrane in the living body, and examples thereof include an ion channel receptor and a G protein coupled receptor. Only one type of membrane protein 10 may be used, or two or more types may be used in combination.
As the lipid forming the lipid bilayer membrane 30, a known lipid used for forming a proteoliposome can be used. For example, phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylserine (PS), phosphatidylinositol ( PI), phosphatidylinositol phosphate (PIP), phosphatidic acid (PA), phosphatidylglycerol (PG), sphingolipid and the like. These lipids may use only 1 type and may use 2 or more types together.
The surfactant is not particularly limited as long as it is used for forming proteoliposomes, and known nonionic surfactants, anionic surfactants, cationic surfactants, and amphoteric surfactants can be used. . These surfactants may be used alone or in combination of two or more.

（標識工程）
標識工程では、プロテオリポソーム１において脂質二分子膜３０に再構成された膜タンパク質１０の細胞内ドメイン１２ａまたは細胞外ドメイン１２ｂのいずれかを蛍光標識抗体４２で標識する。この例では、細胞外ドメイン１２ｂを標識する場合について説明する。 (Labeling process)
In the labeling step, either the intracellular domain 12 a or the extracellular domain 12 b of the membrane protein 10 reconstituted into the lipid bilayer 30 in the proteoliposome 1 is labeled with the fluorescently labeled antibody 42. In this example, the case where the extracellular domain 12b is labeled will be described.

まず、プロテオリポソーム１を含む溶液に細胞外ドメイン１２ｂを特異的に認識する一次抗体４１を加え、該一次抗体４１をプロテオリポソーム１の脂質二分子膜３０の外側に位置する細胞外ドメイン１２ｂに結合させる（図２（Ｂ））。このとき、プロテオリポソーム１の脂質二分子膜３０の内側にある細胞外ドメイン１２ｂには一次抗体４１が結合できないため、細胞外ドメイン１２ｂが外側を向いて配向している膜タンパク質１０のみに一次抗体４１が結合する。 First, a primary antibody 41 that specifically recognizes the extracellular domain 12b is added to a solution containing the proteoliposome 1, and the primary antibody 41 is bound to the extracellular domain 12b located outside the lipid bilayer 30 of the proteoliposome 1. (FIG. 2B). At this time, since the primary antibody 41 cannot bind to the extracellular domain 12b inside the lipid bilayer membrane 30 of the proteoliposome 1, the primary antibody only to the membrane protein 10 in which the extracellular domain 12b is oriented outward. 41 joins.

次に、一次抗体４１を特異的に認識する二次抗体４２ａが蛍光物質４２ｂで標識された蛍光標識抗体４２を加え、該蛍光標識抗体４２を膜タンパク質１０の細胞外ドメイン１２ｂに結合した一次抗体４１に結合させる（図２（Ｃ））。これにより、プロテオリポソーム１の脂質二分子膜３０の外側にある細胞外ドメイン１２ｂのみに蛍光標識抗体４２を結合させ、該細胞外ドメイン１２ｂのみを標識することができる。
また、細胞内ドメイン１２ａの標識は、細胞内ドメイン１２ａを特異的に認識する一次抗体４１、および該一次抗体４１を特異的に認識する蛍光標識抗体４２の組み合わせを用いて、前述と同様の方法で行うことができる。 Next, a secondary antibody 42a that specifically recognizes the primary antibody 41 is added with a fluorescent-labeled antibody 42 labeled with a fluorescent substance 42b, and the primary antibody in which the fluorescent-labeled antibody 42 is bound to the extracellular domain 12b of the membrane protein 10 41 (FIG. 2C). Thereby, the fluorescent labeled antibody 42 can be bound only to the extracellular domain 12b outside the lipid bilayer 30 of the proteoliposome 1 and only the extracellular domain 12b can be labeled.
The intracellular domain 12a can be labeled using a combination of a primary antibody 41 that specifically recognizes the intracellular domain 12a and a fluorescently labeled antibody 42 that specifically recognizes the primary antibody 41, and the same method as described above. Can be done.

一次抗体４１としては、用いる膜タンパク質１０の細胞内ドメイン１２ａまたは細胞外ドメイン１２ｂのいずれか一方を特異的に認識する抗体を用いることができ、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。一次抗体４１は、公知の方法により作製したものを用いてもよく、また市販品を用いてもよい。
一次抗体４１の具体例としては、例えば、膜タンパク質１０としてイオンチャネル型グルタミン酸受容体を用い、その細胞内ドメイン１２ａを標識する場合、該受容体のＣ末端を認識する抗体等が挙げられる。また、細胞外ドメイン１２ｂを標識する場合は、該受容体のＮ末端を認識する抗体等が挙げられる。 As the primary antibody 41, an antibody that specifically recognizes either the intracellular domain 12a or the extracellular domain 12b of the membrane protein 10 to be used can be used, which may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Also good. As the primary antibody 41, one produced by a known method may be used, or a commercially available product may be used.
Specific examples of the primary antibody 41 include, for example, an antibody that recognizes the C-terminus of the receptor when an ion channel glutamate receptor is used as the membrane protein 10 and the intracellular domain 12a is labeled. When labeling the extracellular domain 12b, an antibody that recognizes the N-terminus of the receptor can be used.

一次抗体４１の添加量は、脂質二分子膜３０の外側に位置する膜タンパク質１０の細胞内ドメイン１２ａ（細胞外ドメイン１２ｂ）を充分に標識できる量であればよく、プロテオリポソーム１に再構成する膜タンパク質１０の分子数に対して、１０倍〜１０００倍であることが好ましく、１０倍〜１００倍であることがより好ましい。一次抗体４１の前記添加量が１０倍以上であれば、脂質二分子膜３０の外側に位置する標識対象の細胞内ドメイン１２ａ（細胞外ドメイン１２ｂ）を充分に標識することが容易である。また、一次抗体４１の前記添加量が１０００倍以下であれば、未反応の一次抗体４１の量が少なくなるため、プロテオリポソーム１における膜タンパク質１０の配向を評価することが容易になる。 The added amount of the primary antibody 41 may be an amount that can sufficiently label the intracellular domain 12a (extracellular domain 12b) of the membrane protein 10 located outside the lipid bilayer membrane 30, and is reconstituted into the proteoliposome 1. The number of molecules of membrane protein 10 is preferably 10 times to 1000 times, and more preferably 10 times to 100 times. If the added amount of the primary antibody 41 is 10 times or more, it is easy to sufficiently label the intracellular domain 12a (extracellular domain 12b) to be labeled located outside the lipid bilayer membrane 30. Further, when the added amount of the primary antibody 41 is 1000 times or less, the amount of the unreacted primary antibody 41 is decreased, and therefore it becomes easy to evaluate the orientation of the membrane protein 10 in the proteoliposome 1.

蛍光標識抗体４２は、一次抗体４１を特異的に認識する二次抗体４２ａが蛍光物質４２ｂにより標識された抗体である。
二次抗体４２ａとしては、一次抗体４１を特異的に認識する抗体であれば特に限定されず、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。二次抗体４２ａは、公知の方法により作製したものを用いてもよく、また市販品を用いてもよい。二次抗体４２ａの具体例としては、例えば、一次抗体４１がラビットＩｇＧの場合、抗ラビットＩｇＧ抗体等が挙げられる。
蛍光物質４２ｂとしては、抗体の蛍光標識に通常用いられる蛍光物質を用いることができ、例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＴｅｘａｓＲｅｄ等が挙げられる。 The fluorescently labeled antibody 42 is an antibody in which a secondary antibody 42a that specifically recognizes the primary antibody 41 is labeled with a fluorescent substance 42b.
The secondary antibody 42a is not particularly limited as long as it is an antibody that specifically recognizes the primary antibody 41, and may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. As the secondary antibody 42a, one produced by a known method may be used, or a commercially available product may be used. Specific examples of the secondary antibody 42a include, for example, an anti-rabbit IgG antibody when the primary antibody 41 is a rabbit IgG.
As the fluorescent substance 42b, a fluorescent substance usually used for fluorescent labeling of antibodies can be used, and examples thereof include Alexa Fluor 488, Texas Red and the like.

蛍光標識抗体４２の添加量は、膜タンパク質１０に結合した一次抗体４１に充分に結合できる量であればよく、添加した一次抗体４１の分子数に対して、１０倍〜１００倍であることが好ましい。蛍光標識抗体４２の前記添加量が１０倍以上であれば、脂質二分子膜３０の外側に位置する標識対象の細胞内ドメイン１２ａ（細胞外ドメイン１２ｂ）を充分に標識することが容易になる。また、蛍光標識抗体４２の前記添加量が１００倍以下であれば、未反応の蛍光標識抗体４２の量が少なくなるため、プロテオリポソーム１における膜タンパク質１０の配向を評価することが容易になる。 The addition amount of the fluorescently labeled antibody 42 may be an amount that can sufficiently bind to the primary antibody 41 bound to the membrane protein 10, and is 10 to 100 times the number of molecules of the added primary antibody 41. preferable. If the addition amount of the fluorescently labeled antibody 42 is 10 times or more, it becomes easy to sufficiently label the intracellular domain 12a (extracellular domain 12b) to be labeled located outside the lipid bilayer membrane 30. In addition, when the amount of the fluorescently labeled antibody 42 added is 100 times or less, the amount of the unreacted fluorescently labeled antibody 42 is reduced, so that the orientation of the membrane protein 10 in the proteoliposome 1 can be easily evaluated.

（評価工程）
評価工程では、標識工程後のプロテオリポソーム１の蛍光強度を測定することにより、膜タンパク質１０の配向を評価する。
本実施形態における蛍光強度の測定は、フローサイトメトリー法を用いることが好ましい。フローサイトメトリー法は、サブマイクロメートルサイズのひとつひとつのプロテオリポソーム１について、蛍光強度とサイズとを同時に計測することができる。そのため、フローサイトメトリー法を用いる場合、未反応の蛍光標識抗体４２については、プロテオリポソーム１に比べて大きさが小さいことから、蛍光標識抗体４２により標識されたプロテオリポソーム１とは異なる集団に帰属するものとして判断できる。また、蛍光標識抗体４２により標識されていない未反応のプロテオリポソーム１は蛍光強度が低いことから、蛍光標識抗体４２により標識されたプロテオリポソーム１とは異なる集団に帰属するものとして判断できる。これらのことから、フローサイトメトリー法は、未反応の蛍光標識抗体４２を分離除去する必要がなく、工程が簡便になる点で優れている。 (Evaluation process)
In the evaluation step, the orientation of the membrane protein 10 is evaluated by measuring the fluorescence intensity of the proteoliposome 1 after the labeling step.
The measurement of the fluorescence intensity in this embodiment preferably uses a flow cytometry method. The flow cytometry method can simultaneously measure the fluorescence intensity and size of each proteoliposome 1 of submicrometer size. Therefore, when the flow cytometry method is used, since the unreacted fluorescently labeled antibody 42 is smaller in size than the proteoliposome 1, it belongs to a different group from the proteoliposome 1 labeled with the fluorescently labeled antibody 42. It can be judged as something to do. In addition, since the unreacted proteoliposome 1 not labeled with the fluorescently labeled antibody 42 has low fluorescence intensity, it can be determined that it belongs to a different group from the proteoliposome 1 labeled with the fluorescently labeled antibody 42. From these facts, the flow cytometry method is excellent in that it is not necessary to separate and remove the unreacted fluorescently labeled antibody 42 and the process becomes simple.

また、標識対象の細胞内ドメイン１２ａまたは細胞外ドメイン１２ｂが脂質二分子膜３０の外側を向いて配向している膜タンパク質１０の量が多いほど、それらに結合する蛍光標識抗体４２の量が多くなり、そのプロテオリポソーム１の蛍光強度が増大する。 In addition, as the amount of the membrane protein 10 in which the intracellular domain 12a or the extracellular domain 12b to be labeled is oriented toward the outside of the lipid bilayer membrane 30 is increased, the amount of the fluorescently labeled antibody 42 bound thereto is increased. As a result, the fluorescence intensity of the proteoliposome 1 increases.

従って、細胞内ドメイン１２ａを標識したプロテオリポソーム１と、細胞外ドメイン１２ｂを標識したプロテオリポソーム１とをそれぞれ計測し、それらの数および蛍光強度の比較から、細胞内ドメイン１２ａが脂質二分子膜３０の外側を向いて配向している膜タンパク質１０と、細胞外ドメイン１２ｂが脂質二分子膜３０の外側を向いて配向している膜タンパク質１０の比を見積もることで、膜タンパク質１０の配向を評価することができる。 Accordingly, the proteoliposome 1 labeled with the intracellular domain 12a and the proteoliposome 1 labeled with the extracellular domain 12b are respectively measured, and from the comparison of the number and fluorescence intensity, the intracellular domain 12a is converted into the lipid bilayer membrane 30. The orientation of the membrane protein 10 is evaluated by estimating the ratio of the membrane protein 10 oriented to the outside of the membrane and the membrane protein 10 in which the extracellular domain 12b is oriented to the outside of the lipid bilayer membrane 30 can do.

また、蛍光標識抗体４２を用いる場合には、蛍光波長の異なる蛍光物質４２ｂで標識された２種以上の蛍光標識抗体４２を用いてもよい。この場合、同じ膜タンパク質１０における別々の部位、または別々の膜タンパク質１０を特異的に認識する２種以上の一次抗体４１を用い、そのそれぞれの一次抗体４１を特異的に認識する二次抗体４２を用いる。
例えば、同じ膜タンパク質１０の細胞内ドメイン１２ａと細胞外ドメイン１２ｂのそれぞれに異なる動物種由来の２種の一次抗体４１を結合させ、そのそれぞれの一次抗体４１に特異的に結合する蛍光波長が異なる２種の蛍光標識抗体４２を結合させ、それら異なる波長の蛍光シグナルを同時に計測することで、蛍光強度を比較して膜タンパク質１０の配向を評価することができる。 In addition, when the fluorescently labeled antibody 42 is used, two or more fluorescently labeled antibodies 42 labeled with fluorescent substances 42b having different fluorescence wavelengths may be used. In this case, different sites in the same membrane protein 10 or two or more kinds of primary antibodies 41 that specifically recognize different membrane proteins 10 are used, and secondary antibodies 42 that specifically recognize the respective primary antibodies 41. Is used.
For example, two primary antibodies 41 derived from different animal species are bound to each of the intracellular domain 12a and the extracellular domain 12b of the same membrane protein 10, and the fluorescence wavelengths that specifically bind to the respective primary antibodies 41 are different. By binding two types of fluorescently labeled antibodies 42 and simultaneously measuring fluorescence signals of different wavelengths, the orientation of the membrane protein 10 can be evaluated by comparing the fluorescence intensities.

尚、標識工程後に、未反応の蛍光標識抗体４２を除去する工程を行い、その後に蛍光強度の測定を行う場合には、フローサイトメトリー法を用いない測定方法であってもよく、公知の蛍光分光器を用いて測定を行う方法であってもよい。 When the step of removing unreacted fluorescently labeled antibody 42 is performed after the labeling step and then the fluorescence intensity is measured, a measurement method that does not use flow cytometry may be used. It may be a method of performing measurement using a spectroscope.

［第２実施形態］
本実施形態の配向評価方法は、プロテオリポソームに再構成された膜タンパク質の細胞内ドメインまたは細胞外ドメインのいずれかを標識する標識物質として金微粒子標識抗体を用いる。本実施形態では、評価工程において、ダイナミック光散乱法（ＤＬＳ）によりプロテオリポソームの大きさを測定することにより、プロテオリポソーム中の膜タンパク質の配向を評価する。
用いるプロテオリポソーム１（図３（Ａ））は、第１実施形態と同じものを用いることができる。 [Second Embodiment]
In the orientation evaluation method of the present embodiment, a gold microparticle-labeled antibody is used as a labeling substance for labeling either the intracellular domain or the extracellular domain of a membrane protein reconstituted into proteoliposomes. In the present embodiment, in the evaluation step, the orientation of the membrane protein in the proteoliposome is evaluated by measuring the size of the proteoliposome by dynamic light scattering (DLS).
The proteoliposome 1 used (FIG. 3A) can be the same as in the first embodiment.

（標識工程）
標識工程では、プロテオリポソーム１において脂質二分子膜３０に再構成された膜タンパク質１０の細胞内ドメイン１２ａまたは細胞外ドメイン１２ｂのいずれかを金微粒子標識抗体５２で標識する。この例では、細胞外ドメイン１２ｂを標識する場合について説明する。
まず、プロテオリポソーム１を含む溶液に細胞外ドメイン１２ｂを特異的に認識する一次抗体５１を加え、該一次抗体５１をプロテオリポソーム１の脂質二分子膜３０の外側に位置する細胞外ドメイン１２ｂに結合させる（図３（Ｂ））。このとき、プロテオリポソーム１の脂質二分子膜３０の内側にある細胞外ドメイン１２ｂには一次抗体５１が結合できないため、細胞外ドメイン１２ｂが外側を向いて配向している膜タンパク質１０のみに一次抗体５１が結合する。 (Labeling process)
In the labeling step, either the intracellular domain 12 a or the extracellular domain 12 b of the membrane protein 10 reconstituted in the lipid bilayer 30 in the proteoliposome 1 is labeled with the gold microparticle labeled antibody 52. In this example, the case where the extracellular domain 12b is labeled will be described.
First, a primary antibody 51 that specifically recognizes the extracellular domain 12b is added to a solution containing the proteoliposome 1, and the primary antibody 51 is bound to the extracellular domain 12b located outside the lipid bilayer 30 of the proteoliposome 1. (FIG. 3B). At this time, since the primary antibody 51 cannot bind to the extracellular domain 12b inside the lipid bilayer membrane 30 of the proteoliposome 1, the primary antibody only to the membrane protein 10 in which the extracellular domain 12b is oriented outward. 51 joins.

次に、一次抗体５１を特異的に認識する二次抗体５２ａが金微粒子５２ｂで標識された金微粒子標識抗体５２を加え、該金微粒子標識抗体５２を膜タンパク質１０の細胞外ドメイン１２ｂに結合した一次抗体５１に結合させる（図３（Ｃ））。これにより、プロテオリポソーム１の脂質二分子膜３０の外側にある細胞外ドメイン１２ｂのみに金微粒子標識抗体５２を結合させ、該細胞外ドメイン１２ｂのみを標識することができる。
また、細胞内ドメイン１２ａの標識は、細胞内ドメイン１２ａを特異的に認識する一次抗体５１、および該一次抗体５１を特異的に認識する金微粒子標識抗体５２の組み合わせを用いて、前述と同様の方法で行うことができる。 Next, a secondary antibody 52a that specifically recognizes the primary antibody 51 is added with a gold fine particle labeled antibody 52 labeled with a gold fine particle 52b, and the gold fine particle labeled antibody 52 is bound to the extracellular domain 12b of the membrane protein 10. It binds to the primary antibody 51 (FIG. 3C). Thereby, the gold fine particle labeled antibody 52 can be bound only to the extracellular domain 12b outside the lipid bilayer 30 of the proteoliposome 1 and only the extracellular domain 12b can be labeled.
Further, the labeling of the intracellular domain 12a is performed in the same manner as described above using a combination of the primary antibody 51 that specifically recognizes the intracellular domain 12a and the gold fine particle labeled antibody 52 that specifically recognizes the primary antibody 51. Can be done by the method.

一次抗体５１としては、第１実施形態の一次抗体４１で挙げたものと同じ抗体を用いることができる。
一次抗体５１の添加量は、脂質二分子膜３０の外側に位置する膜タンパク質１０の細胞内ドメイン１２ａ（細胞外ドメイン１２ｂ）を充分に標識できる量であればよく、プロテオリポソーム１に再構成した膜タンパク質１０の分子数に対して、１０倍〜１０００倍であることが好ましく、１０倍〜１００倍であることがより好ましい。一次抗体５１の前記添加量が１０倍以上であれば、脂質二分子膜３０の外側に位置する標識対象の細胞内ドメイン１２ａ（細胞外ドメイン１２ｂ）を充分に標識することが容易である。また、一次抗体５１の前記添加量が１０００倍以下であれば、未反応の一次抗体５１の量が少なくなるため、プロテオリポソーム１における膜タンパク質１０の配向を評価することが容易になる。 As the primary antibody 51, the same antibody as the primary antibody 41 of the first embodiment can be used.
The addition amount of the primary antibody 51 may be an amount that can sufficiently label the intracellular domain 12a (extracellular domain 12b) of the membrane protein 10 located outside the lipid bilayer membrane 30, and is reconstituted into the proteoliposome 1. The number of molecules of membrane protein 10 is preferably 10 times to 1000 times, and more preferably 10 times to 100 times. If the added amount of the primary antibody 51 is 10 times or more, it is easy to sufficiently label the intracellular domain 12a (extracellular domain 12b) to be labeled located outside the lipid bilayer membrane 30. Further, when the added amount of the primary antibody 51 is 1000 times or less, the amount of the unreacted primary antibody 51 is decreased, and thus it becomes easy to evaluate the orientation of the membrane protein 10 in the proteoliposome 1.

金微粒子標識抗体５２は、一次抗体５１を特異的に認識する二次抗体５２ａが金微粒子５２ｂにより標識された抗体である。
二次抗体５２ａは、第１実施形態の二次抗体４１ａで挙げた抗体と同じものを用いることができる。 The gold fine particle labeled antibody 52 is an antibody in which a secondary antibody 52a that specifically recognizes the primary antibody 51 is labeled with a gold fine particle 52b.
As the secondary antibody 52a, the same antibodies as those mentioned for the secondary antibody 41a of the first embodiment can be used.

また、金微粒子５２ｂの粒径は、１０〜１００ｎｍであることが好ましい。金微粒子５２ｂの粒径が１０ｎｍ以上であれば、ＤＬＳ測定によって膜タンパク質１０の配向を評価することが容易になる。金微粒子５２ｂの粒径が１００ｎｍ以下であれば、一次抗体５１と二次抗体５２ｂとの結合能が充分に得られやすい。 The particle size of the gold fine particles 52b is preferably 10 to 100 nm. If the particle diameter of the gold fine particles 52b is 10 nm or more, it becomes easy to evaluate the orientation of the membrane protein 10 by DLS measurement. If the particle size of the gold fine particles 52b is 100 nm or less, the binding ability between the primary antibody 51 and the secondary antibody 52b can be sufficiently obtained.

金微粒子標識抗体５２の添加量は、膜タンパク質１０に結合した一次抗体５１に充分に結合できる量であればよく、添加した一次抗体５１の分子数に対して、１０倍〜１００倍であることが好ましい。金微粒子標識抗体５２の前記添加量が１０倍以上であれば、脂質二分子膜３０の外側に位置する標識対象の細胞内ドメイン１２ａ（細胞外ドメイン１２ｂ）を充分に標識することが容易である。また、金微粒子標識抗体５２の前記添加量が１００倍以下であれば、未反応の金微粒子標識抗体５２の量が少なくなるため、該プロテオリポソーム１における膜タンパク質１０の配向を評価することが容易になる。 The addition amount of the gold fine particle labeled antibody 52 may be an amount that can sufficiently bind to the primary antibody 51 bound to the membrane protein 10 and is 10 to 100 times the number of molecules of the added primary antibody 51. Is preferred. If the added amount of the gold fine particle labeled antibody 52 is 10 times or more, it is easy to sufficiently label the intracellular domain 12a (extracellular domain 12b) to be labeled located outside the lipid bilayer membrane 30. . Further, if the added amount of the gold fine particle labeled antibody 52 is 100 times or less, the amount of the unreacted gold fine particle labeled antibody 52 is reduced, and therefore the orientation of the membrane protein 10 in the proteoliposome 1 can be easily evaluated. become.

（評価工程）
評価工程では、ＤＬＳにより標識工程後のプロテオリポソーム１の大きさを測定することにより、膜タンパク質１０の配向を評価する。ＤＬＳを用いれば、ナノメートルレベルでプロテオリポソームのサイズをひとつひとつ計測することができる。
金微粒子標識抗体５２が結合すると、プロテオリポソーム１の大きさと重さが、一次抗体５１および金微粒子標識抗体５２の分だけ大きくなる。本実施形態では、標識工程において、脂質二分子膜３０の外側に位置する、標識対象の細胞内ドメイン１２ａや細胞外ドメイン１２ｂに特異的に金微粒子標識抗体５２を結合させることができることから、大きさ、重さが変化したプロテオリポソーム１は、標識対象の細胞内ドメイン１２ａまたは細胞外ドメイン１２ｂが、脂質二分子膜３０の外側を向いた配向で再構成されているといえる。 (Evaluation process)
In the evaluation step, the orientation of the membrane protein 10 is evaluated by measuring the size of the proteoliposome 1 after the labeling step by DLS. If DLS is used, the size of the proteoliposome can be measured one by one at the nanometer level.
When the gold fine particle labeled antibody 52 is bound, the size and weight of the proteoliposome 1 are increased by the amount of the primary antibody 51 and the gold fine particle labeled antibody 52. In the present embodiment, in the labeling step, the gold microparticle-labeled antibody 52 can be specifically bound to the intracellular domain 12a or the extracellular domain 12b to be labeled, which is located outside the lipid bilayer membrane 30. It can be said that the proteoliposome 1 having a changed weight is reconstituted with the orientation of the intracellular domain 12a or the extracellular domain 12b to be labeled facing the outside of the lipid bilayer membrane 30.

本実施形態のＤＬＳ測定においては、金微粒子標識抗体５２で標識されていない未反応のプロテオリポソーム１も検出されるため、特に標識されたプロテオリポソーム１と未反応のプロテオリポソーム１の大きさが近く、それらを別々に測定し難い場合には、未反応のプロテオリポソーム１をサンプルから除去する必要がある。未反応のプロテオリポソーム１の除去は、例えば、遠心分離を用い、金微粒子標識抗体５２で標識されたプロテオリポソーム１のみを沈殿させ、未反応のプロテオリポソーム１と分離することにより行うことができる。 In the DLS measurement of this embodiment, unreacted proteoliposome 1 that is not labeled with the gold microparticle-labeled antibody 52 is also detected, so that the size of the labeled proteoliposome 1 and the unreacted proteoliposome 1 are particularly close. When it is difficult to measure them separately, it is necessary to remove the unreacted proteoliposome 1 from the sample. The unreacted proteoliposome 1 can be removed by, for example, centrifuging and precipitating only the proteoliposome 1 labeled with the gold fine particle labeled antibody 52 and separating it from the unreacted proteoliposome 1.

未反応の金微粒子標識抗体５２や、標識が解離して遊離した金微粒子５２ｂは、フィルタによって除去することができる。エクストルーダは、フィルタの孔径よりも大きいプロテオリポソーム１のサイズをフィルタ孔径に揃えるために用いるものを使用することができる。エクストルーダにおけるフィルタ径を、金微粒子標識抗体５２が結合したプロテオリポソーム１を通過させず、未反応の金微粒子標識抗体５２および遊離した金微粒子５２ｂを通過させるように調整することで、それらを分離することができる。ただし、これら未反応の金微粒子標識抗体５２や遊離した金微粒子５２ｂが、プロテオリポソーム１と比較して充分小さい場合には、それらは除去しなくてもよい。
未反応のプロテオリポソーム１や、未反応の金微粒子標識抗体５２、遊離した標識抗体５２を除去することにより、金微粒子標識抗体５２により標識されたプロテオリポソーム１をＤＬＳで測定し、その濃度を計測することが容易になる。 The unreacted gold fine particle labeled antibody 52 and the gold fine particles 52b released by dissociation of the label can be removed by a filter. The extruder can be used to align the size of the proteoliposome 1 larger than the pore size of the filter with the filter pore size. The filter diameter in the extruder is adjusted by passing the unreacted gold fine particle labeled antibody 52 and the released gold fine particle 52b without passing the proteoliposome 1 to which the gold fine particle labeled antibody 52 is bound, thereby separating them. be able to. However, when these unreacted gold fine particle labeled antibodies 52 and the released gold fine particles 52b are sufficiently smaller than the proteoliposome 1, they may not be removed.
By removing unreacted proteoliposome 1, unreacted gold microparticle-labeled antibody 52, and free labeled antibody 52, proteoliposome 1 labeled with gold microparticle-labeled antibody 52 is measured by DLS and the concentration is measured. Easy to do.

ＤＬＳ測定では、サンプル中の標的物質の絶対濃度を計測することができない。そのため、大きさや濃度が既知のポリスチレンやラテックス製のビーズを、基準としてサンプル中に混合しておくことで、金微粒子標識抗体５２が結合したプロテオリポソーム１、未反応のプロテオリポソーム１の濃度を相対的に見積もることができる。これにより、細胞内ドメイン認識抗体と細胞外ドメイン認識抗体のそれぞれを用いて別々に測定し、基準となるビーズに対する濃度比を求めることで、脂質二分子膜の外側に位置する細胞内ドメイン１２ａと細胞外ドメイン１２ｂの比を見積もることができる。
サンプルから未反応のプロテオリポソーム１を除去する場合は、金微粒子標識抗体５２が結合したプロテオリポソーム１と、未反応のプロテオリポソーム１の濃度を別々に測定すればよい。 In the DLS measurement, the absolute concentration of the target substance in the sample cannot be measured. Therefore, the polystyrene and latex beads of known sizes and concentrations are mixed in the sample as a reference, so that the concentrations of the proteoliposome 1 bound to the gold microparticle labeled antibody 52 and the unreacted proteoliposome 1 can be compared. Can be estimated automatically. Thus, the intracellular domain 12a positioned outside the lipid bilayer is obtained by separately measuring each of the intracellular domain recognition antibody and the extracellular domain recognition antibody, and determining the concentration ratio with respect to the reference beads. The ratio of the extracellular domain 12b can be estimated.
When removing the unreacted proteoliposome 1 from the sample, the concentration of the proteoliposome 1 bound with the gold fine particle labeled antibody 52 and the unreacted proteoliposome 1 may be measured separately.

以上のようなＤＬＳ測定により、一次抗体５１および金微粒子標識抗体５２の分だけ大きくなったプロテオリポソーム１の数と、未反応のプロテオリポソーム１の数とを比較することで、プロテオリポソーム１における標識対象の細胞内ドメイン１２ａや細胞外ドメイン１２ｂが脂質二分子膜３０の外側に向いて配向した膜タンパク質の割合を見積もり、膜タンパク質１０の配向を評価することができる。 By comparing the number of proteoliposomes 1 increased by the amount of the primary antibody 51 and the gold fine particle labeled antibody 52 with the number of unreacted proteoliposomes 1 by the DLS measurement as described above, the labeling in the proteoliposome 1 is performed. The ratio of the membrane protein in which the target intracellular domain 12a and extracellular domain 12b are oriented toward the outside of the lipid bilayer membrane 30 can be estimated, and the orientation of the membrane protein 10 can be evaluated.

本実施形態では、同じ膜タンパク質１０における細胞内ドメイン１２ａと細胞外ドメイン１２ｂをそれぞれ特異的に標識できる、２種類の一次抗体５１と金微粒子標識抗体５２の組み合わせを用い、未反応のプロテオリポソーム１を除去する方法で、細胞内ドメイン１２ａまたは細胞外ドメイン１２ｂが脂質二分子膜３０の外側に配向した膜タンパク質１０の濃度をそれぞれ測定し、それらを比較することで膜タンパク質１０の配向を評価することが好ましい。これにより、脂質二分子膜３０の外側に位置する細胞内ドメイン１２ａと細胞外ドメイン１２ｂの量をそれぞれ測定することができるため、膜タンパク質１０の配向の評価がより正確に行える。 In this embodiment, an unreacted proteoliposome 1 is used using a combination of two types of primary antibodies 51 and gold microparticle-labeled antibodies 52 that can specifically label the intracellular domain 12a and the extracellular domain 12b in the same membrane protein 10, respectively. The concentration of the membrane protein 10 in which the intracellular domain 12a or the extracellular domain 12b is oriented outside the lipid bilayer membrane 30 is measured, and the orientation of the membrane protein 10 is evaluated by comparing them. It is preferable. Thereby, since the quantity of the intracellular domain 12a located outside the lipid bilayer membrane 30 and the extracellular domain 12b can be measured, respectively, evaluation of the orientation of the membrane protein 10 can be performed more accurately.

［第３実施形態］
また、ＤＬＳ測定により膜タンパク質の配向を評価する際には、標識物質として金微粒子を用いることもできる。この場合、標識対象の細胞内ドメインまたは細胞外ドメインに特異的に金微粒子を標識する方法としては、例えば、ビオチン−アビジン結合を用いる方法が挙げられる。
具体的には、プロテオリポソームを形成する前に、膜タンパク質のＮ端またはＣ端にビオチンを結合させておき、プロテオリポソームを形成する。その後、標識工程においてアビジンを被覆した金微粒子を用いることで、標識対象の細胞内ドメイン１２ａまたは細胞外ドメイン１２ｂに特異的に標識することができる。
評価工程におけるＤＬＳ測定は、第２実施形態と同様にして行うことができる。 [Third Embodiment]
Further, when the orientation of the membrane protein is evaluated by DLS measurement, gold fine particles can be used as the labeling substance. In this case, examples of the method for specifically labeling the gold fine particles on the intracellular domain or extracellular domain to be labeled include a method using a biotin-avidin bond.
Specifically, before forming the proteoliposome, biotin is bound to the N-terminal or C-terminal of the membrane protein to form the proteoliposome. Thereafter, by using gold fine particles coated with avidin in the labeling step, the intracellular domain 12a or the extracellular domain 12b to be labeled can be specifically labeled.
The DLS measurement in the evaluation process can be performed in the same manner as in the second embodiment.

［その他の実施形態］
また、本発明の配向評価方法では、蛍光標識抗体、金微粒子標識抗体、金微粒子のうちの異なる２種以上を併用してもよい。例えば、膜タンパク質の細胞内ドメインと細胞外ドメインの両方を、異なる標識物質で同時に標識して配向を評価したり、異なる膜タンパク質の細胞内ドメインや細胞外ドメインを異なる標識物質で同時に標識してそれらの配向を評価したりすることができる。 [Other Embodiments]
In the orientation evaluation method of the present invention, two or more different types of fluorescently labeled antibodies, gold fine particle labeled antibodies, and gold fine particles may be used in combination. For example, both the intracellular and extracellular domains of membrane proteins can be simultaneously labeled with different labeling substances to assess their orientation, or the intracellular and extracellular domains of different membrane proteins can be simultaneously labeled with different labeling substances. Their orientation can be evaluated.

以上説明した本発明の配向評価方法によれば、プロテオリポソームの脂質二分子膜内に再構成された膜タンパク質の配向を簡便に評価することができる。配向を把握することで、そのプロテオリポソームを基板上に展開した後、膜タンパク質の構造を検討するとき、またはデバイス応用するときに、膜タンパク質の機能を把握する上で高い信頼性が得られる。 According to the orientation evaluation method of the present invention described above, the orientation of the membrane protein reconstituted in the lipid bilayer membrane of the proteoliposome can be easily evaluated. By grasping the orientation, high reliability can be obtained in grasping the function of the membrane protein when the proteoliposome is developed on the substrate and then the structure of the membrane protein is examined or when the device is applied.

例えば、基板に展開した膜タンパク質の単一分子の構造を観察や機能の検討と本発明の配向評価方法を組み合わせることで、より正確に膜タンパク質の科学的知識を得ることができる。単一の膜タンパク質の構造や機能の検討に応用する場合は、ＡＦＭや他のタイプの走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）や全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）等が観察に適している。
また、膜タンパク質をナノバイオデバイスに用いる場合、配向が既知の膜タンパク質をデバイスに応用すれば該膜タンパク質の向きを把握することができるため、薬物への応答を効果的かつ効率的に検討することが可能となる。これにより、特定の膜タンパク質受容体に対するドラッグターゲットの能力が飛躍的に向上すると考えられる。また、創薬のドラッグスクリーニングのほか、神経疾患等の診断の分野でも広く用いられる可能性が高い。
以上のように、本発明の配向評価方法は非常に有用な方法であり、医学、薬学、診断等の分野に広く応用することが可能である。 For example, the scientific knowledge of the membrane protein can be obtained more accurately by observing the structure of a single molecule of the membrane protein developed on the substrate, examining the function, and combining the orientation evaluation method of the present invention. For application to the examination of the structure and function of a single membrane protein, AFM, other types of scanning probe microscopes (SPM), total reflection illumination fluorescence microscopes (TIRF), etc. are suitable for observation.
In addition, when membrane proteins are used in nanobiodevices, the orientation of the membrane protein can be grasped by applying a membrane protein with a known orientation to the device, so the response to the drug should be studied effectively and efficiently. Is possible. This is thought to dramatically improve the ability of the drug target for a specific membrane protein receptor. In addition to drug drug screening, it is highly likely to be widely used in the field of diagnosis of neurological diseases and the like.
As described above, the orientation evaluation method of the present invention is a very useful method and can be widely applied in the fields of medicine, pharmacy, diagnosis and the like.

以下、実施例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
［実施例１］
本発明の配向評価方法により、ダイナミック光散乱法（ＤＬＳ）による測定により膜タンパク質の配向評価を行なった例を示す。
プロテオリポソームは透析法により作製した。膜タンパク質としては、精製したイオンチャネル型グルタミン酸受容体を用いた。該イオンチャネル型グルタミン酸受容体（１００ｎＭ）と、ｎ−オクチル−Ｄ−グルコピラノシド（シグマ製）（４０ｍＭ）と、ホスファチジルコリン（卵黄由来）およびホスファチジルセリン（ブタ脳由来）の３：１の混合物（２ｍＭ）とを、緩衝液（３０ｍＭＨＥＰＥＳＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＧＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、ＮａＮ_３（０．０２％））に加え、１０分間超音波により混合して混合液を得て、その後、室温で１０分間静置した。得られた混合液（５μｌ）に対し、セルロース膜（ポア１２，０００〜１４，０００ｍｗ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ製））を用いて、７２時間、４℃で透析を行った。透析溶液は３０ｍＭＨＥＰＥＳＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＧＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、ＮａＮ_３（０．０２％）の５ｍｌであった。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the present invention is not limited by the following description.
[Example 1]
The example which evaluated the orientation of the membrane protein by the measurement by the dynamic light scattering method (DLS) by the orientation evaluation method of this invention is shown.
Proteoliposomes were prepared by dialysis. A purified ion channel glutamate receptor was used as the membrane protein. A 3: 1 mixture (2 mM) of the ion channel glutamate receptor (100 nM), n-octyl-D-glucopyranoside (Sigma) (40 mM), phosphatidylcholine (yolk yolk) and phosphatidylserine (pig brain) And a buffer solution (30 mM HEPES HCl (pH 7.4), 5 mM EDGA, 1 mM EGTA, NaN ₃ (0.02%)) and mixed by ultrasonication for 10 minutes to obtain a mixed solution. And left for 10 minutes. The obtained mixed liquid (5 μl) was dialyzed at 4 ° C. for 72 hours using a cellulose membrane (pores 12,000 to 14,000 mw (manufactured by Spectrum)). The dialysis solution was 5 ml of 30 mM HEPES HCl (pH 7.4), 5 mM EDGA, 1 mM EGTA, NaN ₃ (0.02%).

透析７２時間後に、作製したプロテオリポソームについて抗体反応を行った。まず、細胞外ドメイン１２ｂを認識する一次抗体として、マウス由来の抗グルタミン酸受容体（Ｎ端）抗体（ケミコン社）を、プロテオリポソーム溶液量の１０分の１量添加し、３０分間室温にて静置した。金ナノ粒子標識マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ製）を、同様に１０分の１量添加し、４５分間室温にて静置した。その後、フィルタ（エクストルーダ、ポアサイズ３０ｎｍ、Ａｖａｎｔｉ社製）を用いて、試料内に残った未結合の金ナノ粒子標識抗マウスＩｇＧ抗体を除去し、金ナノ粒子が結合しているプロテオリポソームのみの溶液にした。その後、この試料に直径３００ｎｍ、濃度が既知の標準ラテックスビーズ溶液（テクノケミカル社）を添加し、ＤＬＳにより測定を行った。
一方、細胞内ドメイン１２ａを認識するマウス由来の抗グルタミン酸受容体（Ｃ端）抗体（ケミコン社）を用いた場合についても、上記と同様にしてＤＬＳ計測を行った。得られた結果を図４（Ａ）、（Ｂ）に示す。図４（Ａ）は、Ｎ端を標識する金微粒子標識抗体を用いた結果、（Ｂ）はＣ端を標識する金微粒子標識抗体を用いた結果である。また、ピークｅ、ｇは標識されたプロテオリポソームのサイズに起因するピークであり、ピークｆ、ｈは標準ラテックスビーズのサイズに起因するピークである。 After 72 hours of dialysis, an antibody reaction was performed on the prepared proteoliposomes. First, as a primary antibody recognizing the extracellular domain 12b, a mouse-derived anti-glutamate receptor (N-terminal) antibody (Chemicon) was added in an amount one-tenth of the amount of proteoliposome solution and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. I put it. A gold nanoparticle labeled mouse IgG antibody (manufactured by Sigma) was similarly added in an amount of 1/10 and allowed to stand at room temperature for 45 minutes. Thereafter, using a filter (extruder, pore size 30 nm, manufactured by Avanti), unbound gold nanoparticle-labeled anti-mouse IgG antibody remaining in the sample is removed, and a solution containing only proteoliposomes to which gold nanoparticles are bound. I made it. Thereafter, a standard latex bead solution (Technochemical Co., Ltd.) having a diameter of 300 nm and a known concentration was added to this sample, and measurement was performed by DLS.
On the other hand, when a mouse-derived anti-glutamate receptor (C-terminal) antibody (Chemicon) that recognizes intracellular domain 12a was used, DLS measurement was performed in the same manner as described above. The obtained results are shown in FIGS. 4 (A) and 4 (B). FIG. 4A shows the result of using a gold microparticle-labeled antibody that labels the N-terminus, and FIG. 4B shows the result of using a gold microparticle-labeled antibody that labels the C-terminus. Peaks e and g are peaks caused by the size of labeled proteoliposomes, and peaks f and h are peaks caused by the size of standard latex beads.

図４（Ａ）、（Ｂ）に示すように、それぞれ添加した標準ラテックスビーズのサイズ、量は同じ（ピークｆとピークｈ）であり、標準ラテックスビーズのピークに対するプロテオリポソームのピークｅ、ｇの比を求めることで、それらのピークサイズの比を求めることができた。本結果では、ｅ／ｆ＝５．０となり、この結果から、Ｎ端（細胞外ドメイン）を外側に向けてプロテオリポソーム中に再構成されている膜タンパク質が、Ｃ端（細胞内ドメイン）を外に向けて再構成されている膜タンパク質の約５倍あることが分かった。 As shown in FIGS. 4A and 4B, the sizes and amounts of the standard latex beads added are the same (peak f and peak h), and the proteoliposome peaks e and g with respect to the peak of the standard latex beads. By determining the ratio, the ratio of their peak sizes could be determined. In this result, e / f = 5.0, and from this result, the membrane protein reconstituted in the proteoliposome with the N-terminal (extracellular domain) facing outward is the C-terminal (intracellular domain). It was found that there are about five times as many membrane proteins that are reconstituted outward.

［参考例１］
本発明の配向評価方法により、フローサイトメーターを用いてプロテオリポソームを計測し、膜タンパク質の配向評価を行なう例を示す。
プロテオリポソームは透析法により作製する。膜タンパク質としては、精製したイオンチャネル型グルタミン酸受容体を用いる。該イオンチャネル型グルタミン酸受容体（１００ｎＭ）と、ｎ−オクチル−Ｄ−グルコピラノシド（シグマ製）（４０ｍＭ）と、ホスファチジルコリン（卵黄由来）およびホスファチジルセリン（ブタ脳由来）の３：１の混合物（２ｍＭ）とを、緩衝液（３０ｍＭＨＥＰＥＳＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＧＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、ＮａＮ_３（０．０２％））に加え、１０分間超音波により混合して混合液を得て、その後、室温で１０分間静置する。得られた混合液（５μｌ）に対し、セルロース膜（ポア１２，０００〜１４，０００ｍｗ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ製））を用いて、７２時間、４℃で透析を行う。透析溶液は３０ｍＭＨＥＰＥＳＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＧＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、ＮａＮ_３（０．０２％）の５ｍｌである。 [Reference Example 1]
An example of measuring the orientation of membrane proteins by measuring proteoliposomes using a flow cytometer by the orientation evaluation method of the present invention is shown.
Proteoliposomes are prepared by dialysis. A purified ion channel glutamate receptor is used as the membrane protein. 3: 1 mixture (2 mM) of the ion channel glutamate receptor (100 nM), n-octyl-D-glucopyranoside (manufactured by Sigma) (40 mM), phosphatidylcholine (derived from egg yolk) and phosphatidylserine (derived from pig brain) And a buffer solution (30 mM HEPES HCl (pH 7.4), 5 mM EDGA, 1 mM EGTA, NaN ₃ (0.02%)) and mixed by ultrasonication for 10 minutes to obtain a mixed solution. Let stand for 10 minutes. The obtained mixed solution (5 μl) is dialyzed at 4 ° C. for 72 hours using a cellulose membrane (pores 12,000 to 14,000 mw (manufactured by Spectrum)). The dialysis solution is 5 ml of 30 mM HEPES HCl (pH 7.4), 5 mM EDGA, 1 mM EGTA, NaN ₃ (0.02%).

透析７２時間後に、作製したプロテオリポソームについて抗体反応を行う。まず、細胞外ドメイン１２ｂを認識する一次抗体としてマウス由来の抗グルタミン酸受容体（Ｎ端）抗体（ケミコン社製）を、プロテオリポソーム溶液量の１０分の１量添加し、３０分間室温にて静置する。続いて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体を、同様に１０分の１量添加し、４５分間室温にて静置する。その溶液をフローサイトメーター（ＢｅｃｋｍａｎｎＣｏｕｌｔｅｒ社製、ＥＰＩＣＳＸＬ）を用いて計測する。
また、同様に透析により作製するプロテオリポソーム溶液について、異なる抗体を用いて抗体反応を行う。細胞内ドメイン１２ａを認識するマウス由来の抗グルタミン酸受容体（Ｃ端）抗体（ケミコン社）を、プロテオリポソーム溶液量の１０分の１量添加し、３０分間室温にて静置した後、さらにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体を、同様に１０分の１量添加し、４５分間室温にて静置する。その溶液を前記フローサイトメーターを用いて計測する。 After 72 hours of dialysis, an antibody reaction is performed on the produced proteoliposome. First, a mouse-derived anti-glutamate receptor (N-terminal) antibody (manufactured by Chemicon) is added as a primary antibody that recognizes the extracellular domain 12b, one-tenth of the amount of the proteoliposome solution, and left at room temperature for 30 minutes Put. Subsequently, Alexa Fluor 488-labeled anti-mouse IgG antibody is similarly added in an amount of 1/10 and allowed to stand at room temperature for 45 minutes. The solution is measured using a flow cytometer (EPICS XL, manufactured by Beckmann Coulter).
Similarly, for a proteoliposome solution prepared by dialysis, an antibody reaction is carried out using different antibodies. An anti-glutamate receptor (C-terminal) antibody derived from a mouse that recognizes intracellular domain 12a (Chemicon) was added to one-tenth of the proteoliposome solution, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and then Alexa. Fluor 488-labeled anti-mouse IgG antibody is similarly added in an amount of 1/10, and left at room temperature for 45 minutes. The solution is measured using the flow cytometer.

以上のようにしてフローサイトメーターにより計測することにより、例えば、図５（Ａ）、（Ｂ）に例示したような結果が得られた場合には、以下に示すように膜タンパク質の配向を評価することができる。なお、図５（Ａ）は、Ｎ端（細胞外ドメイン）を標識する蛍光標識抗体を用いた場合を示し、図５（Ｂ）はＣ端（細胞内ドメイン）を標識する蛍光標識抗体を用いた場合を示す。また、図５の横軸は蛍光強度、縦軸はＦＳＣ（ｆｏｗａｒｄｓｃａｔｔｅｒ、側方散乱強度、プロテオリポソームの大きさ）を示している。図５中のａ、ｂ、ｃ、ｄはそれぞれ、蛍光標識されたリポソーム（ａ）、蛍光標識されていないリポソーム（ｂ）、蛍光標識抗体（ｃ）、蛍光標識されていない抗体もしくは壊れたリポソーム（ｄ）を示しており、点は該当するサンプルの数を示している。また、図５（Ａ）、（Ｂ）それぞれにおいて、蛍光強度におけるヒストグラムを示している。 By measuring with a flow cytometer as described above, for example, when the results illustrated in FIGS. 5A and 5B are obtained, the orientation of the membrane protein is evaluated as shown below. can do. 5A shows the case where a fluorescently labeled antibody that labels the N-terminal (extracellular domain) is used, and FIG. 5B uses a fluorescently labeled antibody that labels the C-terminal (intracellular domain). Indicates the case where In addition, the horizontal axis in FIG. 5 indicates fluorescence intensity, and the vertical axis indicates FSC (forward scatter, side scattering intensity, proteoliposome size). In FIG. 5, a, b, c, and d are respectively a fluorescently labeled liposome (a), a non-fluorescent labeled liposome (b), a fluorescently labeled antibody (c), an unlabeled antibody, or a broken liposome. (D) is shown, and the dots indicate the number of corresponding samples. 5A and 5B show histograms of fluorescence intensity.

このような結果が得られた場合、Ｎ端（細胞外ドメイン）を標識する蛍光標識抗体を用いたとき（図５（Ａ））は、Ｃ端（細胞内ドメイン）を標識する蛍光標識抗体を用いたとき（図５（Ｂ））に比べて、ｃ、ｄの範囲に含まれるサンプルの数がほぼ同じであるが、ａの範囲に含まれるサンプルの数が多く、ｂが少ないことがわかる。これにより、Ｎ端（細胞外ドメイン）が標識された膜タンパク質が多く、Ｃ端（細胞内ドメイン）が標識された膜タンパク質が少なく、すなわちプロテオリポソームの外側にＮ端を向けて再構成されているイオンチャネル型グルタミン酸受容体が多いと評価することができる。このことは、図５（Ａ）、（Ｂ）におけるヒストグラムからも評価することができる。 When such a result is obtained, when a fluorescently labeled antibody that labels the N-terminal (extracellular domain) is used (FIG. 5A), a fluorescently labeled antibody that labels the C-terminal (intracellular domain) is used. Compared to when used (FIG. 5B), the number of samples included in the range of c and d is almost the same, but the number of samples included in the range of a is large and b is small. . As a result, there are many membrane proteins labeled at the N-terminus (extracellular domain) and few membrane proteins labeled at the C-terminus (intracellular domain), that is, reconstitution with the N-terminus directed outside the proteoliposome. It can be evaluated that there are many ion channel type glutamate receptors. This can also be evaluated from the histograms in FIGS. 5 (A) and 5 (B).

また、本発明の配向評価方法により、配向が既知の膜タンパク質が再構成した脂質二分子膜を得ることは、単一分子レベルで膜タンパク質の構造や機能を調べる上で重要な技術であり、科学的に非常に重要である。それだけでなく、非常に高感度でかつ極微小なバイオセンサチップの実現等に応用でき、今後発展が著しいと期待されるナノテクノロジーとバイオテクノロジーの融合分野において、極めて有効であり、広い分野で利用される可能性は極めて大きい。 In addition, obtaining a lipid bilayer membrane in which a membrane protein having a known orientation is reconstructed by the orientation evaluation method of the present invention is an important technique for examining the structure and function of a membrane protein at a single molecule level. Scientifically very important. Not only that, it can be applied to the realization of extremely sensitive and ultra-small biosensor chips, etc., and it is extremely effective in the fusion field of nanotechnology and biotechnology, which is expected to develop significantly in the future. The possibility of being done is extremely high.

生体膜に存在する膜タンパク質を示した概念図である。It is the conceptual diagram which showed the membrane protein which exists in a biological membrane. 本発明の膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法の実施形態の一例の工程図である。It is process drawing of an example of embodiment of the lipid membrane orientation evaluation method of the membrane protein of this invention. 本発明の膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法の実施形態の他の例の工程図である。It is process drawing of the other example of embodiment of the orientation evaluation method in the lipid membrane of the membrane protein of this invention. 実施例１におけるＤＬＳによる分析結果を示した図である。It is the figure which showed the analysis result by DLS in Example 1. FIG. 参考例１におけるフローサイトメーターによる分析結果の一例を示した図である。It is the figure which showed an example of the analysis result by the flow cytometer in the reference example 1. FIG.

符号の説明Explanation of symbols

１プロテオリポソーム１０膜タンパク質１１疎水部１２親水部１２ａ細胞内ドメイン１２ｂ細胞外ドメイン３０脂質二分子膜４２蛍光標識抗体５２金微粒子標識抗体 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Proteoliposome 10 Membrane protein 11 Hydrophobic part 12 Hydrophilic part 12a Intracellular domain 12b Extracellular domain 30 Lipid bilayer membrane 42 Fluorescent label antibody 52 Gold fine particle label antibody

Claims

プロテオリポソームの脂質二分子膜内に再構成された膜タンパク質の配向を評価する方法であって、
前記膜タンパク質の細胞内ドメインを標識する第１の蛍光波長を有する蛍光標識抗体と、細胞外ドメインを標識する第２の蛍光波長を有する蛍光標識抗体により、前記プロテオリポソームの前記脂質二分子膜の外側に位置する細胞内ドメインおよび細胞外ドメインを標識する標識工程と、
該標識工程の後に、前記第１の蛍光波長の強度と、前記第２の蛍光波長の強度と、サイズ分布とをフローサイトメトリー法によって同時に計測し、前記第１の蛍光波長を有する蛍光標識抗体で標識されたプロテオリポソームと、前記第２の蛍光波長を有する蛍光標識抗体で標識されたプロテオリポソームを識別して前記膜タンパク質の配向を評価する評価工程と、を有する膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法。 A method for evaluating the orientation of a membrane protein reconstituted in a lipid bilayer of a proteoliposome,
And fluorescence-labeled antibody having a first fluorescence wavelength to label intracellular domain of the membrane protein, a fluorescent-labeled antibody having a second fluorescence wavelength to label the extracellular domain, of the lipid bilayer of the proteoliposomes a labeling step of labeling the intracellular domain Oyo BiHoso extracellular domain located outside,
After the labeling step, the intensity of the first fluorescence wavelength, the intensity of the second fluorescence wavelength, and the size distribution are simultaneously measured by a flow cytometry method, and the fluorescence labeled antibody having the first fluorescence wavelength And an evaluation step of evaluating the orientation of the membrane protein by distinguishing the proteoliposome labeled with a proteoliposome labeled with a fluorescently labeled antibody having the second fluorescence wavelength, and the intra-lipid orientation of the membrane protein Evaluation method.