JP5170084B2 - ３次元顕微鏡および３次元画像取得方法 - Google Patents

Description

本発明は、３次元顕微鏡および３次元画像取得方法に関する。

生物学、医学および薬学などの分野において利用される顕微鏡などの観察装置として、以下のものが開発されている。

共焦点顕微鏡は生物、医療、薬学等の分野で広く利用されている。共焦点顕微鏡においては、試料を染色しなければならず、生きたままの細胞を見るには不向きである。共焦点顕微鏡において、試料を染色しないでも画像が得られるが、生体試料のような弱散乱物体の場合は透過共焦点顕微鏡では像のコントラストが悪くなり、反射共焦点顕微鏡では正確な物体像を再現できない。

非線形顕微鏡は、試料を染色しないで観察するためのツールとして開発された。非線形顕微鏡においては、第二高調波(SHG)、 第三高調波(THG)、 コヒーレント・アンチストークス・ラマン散乱(CARS)などが利用されている。非線形顕微鏡は、光源にハイパワーのパルスレーザーを使用するので使い勝手が良くない。

位相差顕微鏡は、透明物体を高コントラストな像に変換するので、生体試料を観測するのに最も簡便に使える道具の一つである。しかし、位相差顕微鏡によっては、２次元画像しか得られない。

ホログラフィーによれば３次元画像が得られるが、分解能が不十分である。ホログラフィーを使用した顕微鏡技術は、たとえば非特許文献１に記載されている。

光学コヒーレント・トモグラフィー(OCT)は生体試料を観察するための優れたデバイスである。しかし、OCTにおいては、光源のスペクトル幅で奥行き分解能が決まり、分解能を上げるためには広帯域光源開発が必須である。

他方、工業用途として、たとえば、ガラス内部の欠陥の画像化に対するニーズがある。しかし、屈折率分布と吸収率分布を分離して３次元的に画像化する装置は開発されてない。
Etienne Cuche, Pierre Marquet and Christian Depeursinge, "Simultaneous amplitude-contrast and quantitative phase-contrast microscopy by numerical reconstruction of Fresnel off-axis holograms", Appl. Opt. 38, 6994-7001(1999)

したがって、生物学、医学および薬学などの分野において、高い３次元分解能を有し、試料を染色する必要がなく、使い勝手のよい顕微鏡に対するニーズがある。

また、工業用途として、屈折率分布と吸収率分布を分離して３次元的に画像化する顕微鏡に対するニーズがある。

本発明を例示する第１の態様に従えば、物体に対して光を複数の照射方向から順次照射する第１光学系と、前記物体から発生する回折光と参照光とを撮像部に導く第２光学系と、前記回折光と前記参照光との干渉像を撮像する撮像部と、前記撮像部によって取得された前記照射方向ごとの干渉像から前記物体の３次元画像を生成する処理装置と、を含み、前記処理装置は、前記照射方向ごとの干渉像から前記回折光の複素振幅を求め、該複素振幅から前記物体の吸収率分布及び屈折率分布の少なくとも一方の３次元画像を生成するように構成されたことを特徴とする３次元顕微鏡が提供される。

本発明を例示する第２の態様に従えば、物体に対して光を複数の照射方向の平面波で順次照射し、前記物体から発生する回折光と参照光との干渉像を照射方向ごとに取得し、照射方向ごとに取得された干渉像から前記回折光の複素振幅を求め、該複素振幅から前記物体の吸収率分布及び屈折率分布の少なくとも一方の３次元画像を生成することを特徴とする３次元画像生成方法が提供される。

本発明によれば、高い３次元分解能を有し、試料を染色する必要がなく、使い勝手のよい顕微鏡が得られる。

本発明の一実施形態による３次元顕微鏡の構成を示す図である。 ２次元撮像装置の構成を示す図である。 試料ホルダおよび２枚の第１対物を示す図である。 ホログラム・データから３次元画像を生成する方法を示す流れ図である。 ホログラム・データから３次元画像を生成する方法を示す流れ図である。 ホログラム・データから３次元画像を生成する方法を示す流れ図である。 ホログラム・データから３次元画像を生成する方法を説明するための図である。 ホログラム・データから３次元画像を生成する方法を説明するための図である。 透過側および反射側の２個の瞳関数からなる３次元入射瞳関数を示す図である。 水中の第１対物レンズについて、ＮＡ＝１．２である場合のＯＴＦを示す図である。

図１は本発明の一実施形態による３次元顕微鏡の構成を示す図である。

本実施形態による３次元顕微鏡においては、光源１０１からの光を、平面波として試料ホルダ１１９内の試料物体(以下、単に物体とも呼称する)に照射し、物体のフーリエ面上に配置された２次元撮像装置１６５上において物体光と参照光とを干渉させてホログラム・データ（干渉像）を生成する。光源１０１からの光を物体に照射する際に、傾きを変えることのできる走査ミラー（両面ミラー）１０３によって照射方向を変化させ、照射方向ごとにホログラム・データ（干渉像）を生成し取得する。２次元撮像装置１６５によって取得された、照射方向ごとのホログラム・データを処理装置２０１によって処理することにより物体の３次元画像を生成する。以下に詳細に説明する。

図１に示した光学系において、全ての連続する２つのレンズの組は無限遠系結像系になっている。

光源１０１としてホログラム用の安定でコヒーレント長の長い近赤外レーザー(波長８５０ｎｍ)を用いる。

光源１０１によって生成され、第１光学系によって物体に照射される光について説明する。光源１０１からの光の偏光方向は、紙面に垂直な偏光（Ｓ偏光）である。光源１０１からの光は、走査ミラー１０３およびミラー１０５によって反射され、ビームスプリッタ１０７および第２対物レンズ１０９を透過し、偏光ビームスプリッタ１１１によって反射される。その後、光源１０１からの光は、偏光素子１１３を透過し、ミラー１１５によって反射され、２枚の第１対物レンズの一方１１７を透過し、平面波として試料ホルダ１１９内の物体に照射される。偏光素子１１３は、ノイズを除去するために設置されている。

ここで、走査ミラー１０３は、光源１０１からの光が試料ホルダ１１９内の物体を２次元的に走査するように傾きを変えることができるように構成されている。光源１０１からの光の物体に対する最大入射角度は約６４°、第１対物レンズ１１７の物体側の開口数（ＮＡ）は水浸状態で１．２である。第２対物レンズ１０９の焦点距離は第１対物レンズ１１７の焦点距離の６０倍であるため、走査ミラー１０３の最大傾き角度は約１°である。

物体によって散乱されず物体をそのまま透過した０次光について説明する。０次光は、２枚の第１対物レンズの他方１２１を透過し、半波長板１２３を透過する。０次光は、半波長板１２３を透過することによってＰ偏光に変えられる。その後、０次光は、ミラー１２５によって反射され、偏光素子１２７、偏光ビームスプリッタ１１１および第２対物レンズ１０９を透過し、ビームスプリッタ１０７およびミラー１２９によって反射され、走査ミラー１０３に到達する。ここで、偏光素子１２７は、ノイズを除去するために設置されている。走査ミラー１０３の中心は、光軸上における試料物体の中心の共役位置に配置されている。０次光の方向は、走査ミラー（両面ミラー）１０３によって反射されることによって、傾いていない走査ミラー１０３によって反射された方向と同一の方向となる。すなわち、０次光の方向は、走査ミラー１０３の傾きに無関係に一定の方向となる。その後、０次光は、わずかな透過率を有する直径約２００μｍの微小ミラー１３７に到達する。ここで、微小ミラー１３７は、２枚の第１対物レンズ１１７および１２１の共通焦点面（物体の中心面）のフーリエ面に位置する。０次光の大部分は、微小ミラー１３７に反射され、コリメートレンズ１６３によってコリメートされた後、参照光として使われる。このように、０次光は、第２光学系によって２次元撮像装置１６５に到達する。微小ミラー１３７を透過した一部の０次光については後で説明する。

物体によって散乱された透過回折光について説明する。透過回折光は、０次光と同様の経路を通り、２枚の第１対物レンズ１１７および１２１の共通焦点面（物体の中心面）のフーリエ面に位置する微小ミラー１３７で一部（低周波成分）はカットされる。透過回折光の残りは、微小ミラー１３７によって反射されずに進行し、偏光ビームスプリッタ１４３および１４９を透過し、２枚の第１対物レンズ１１７および１１９の共通焦点面のフーリエ面または微小ミラー１３７の共役位置に配置された２次元撮像装置１６５に到達する。このように、透過回折光は、第２光学系によって２次元撮像装置１６５に到達する。

物体によって散乱された反射回折光について説明する。反射回折光は、第１の対物レンズ１１７を透過した後、ミラー１１５、偏光ビームスプリッタ１１１、ビームスプリッタ１０７、ミラー１２９および走査ミラー（両面ミラー）１０３によって反射される。その後、反射回折光の一部は、微小ミラー１３７でカットされるが、残りは、微小ミラー１３７によって反射されずに進行し、偏光ビームスプリッタ１４３、ミラー１５１および偏光ビームスプリッタ１４９で反射され、半波長板１５５を透過する。反射回折光の偏光は、半波長板１５５を透過することによって、Ｐ偏光に変えられる。その後、反射回折光は、ビームスプリッタ１５７を透過し、２次元撮像装置１６５に到達する。このように、反射回折光は、第２光学系によって２次元撮像装置１６５に到達する。

わずかな透過率を有する微小ミラー１３７を透過した一部の０次光は、微小１／４波長板１３９を透過する。一部の０次光は、微小１／４波長板１３９を透過することによって円偏光にされた後、偏光ビームスプリッタ１４３によって２成分に分離される。２成分は、それぞれ、透過回折光および反射回折光とともに２次元撮像装置１６５に到達する。

図２は、２次元撮像装置１６５の構成を示す図である。２次元撮像装置１６５は、透過回折光用撮像装置と反射回折光用撮像装置とを含む。２次元撮像装置１６５は、たとえば、ＣＣＤやＣＭＯＳを含むデジタルカメラである。透過回折光用撮像装置および反射回折光用撮像装置は、たとえば、１０２４ｘ１０２４個の画素をそれぞれ備える。透過回折光、反射回折光および参照光は、２次元撮像装置１６５の観察面においてＰ偏光であるので、透過回折光および反射回折光は、参照光と干渉し、透過回折光用撮像装置および反射回折光用撮像装置によってホログラム・データを取得することができる。

走査ミラー１０３によって、光源１０１からの光の試料物体への照射方向が変化しても、走査ミラー１０３の中心は、光軸上における試料物体の中心の共役位置に配置されているので、透過回折光および反射回折光は、２次元撮像装置１６５に対して垂直に入射する。光源１０１からの光の試料物体への照射方向が変化すると、透過回折光用撮像装置上における透過回折光の円形領域は、透過回折光用撮像装置上において移動し、反射回折光用撮像装置における反射回折光の円形領域は、反射回折光用撮像装置上において移動する。図２に示すように、０次光(参照光)は、透過回折光用撮像装置および反射回折光用撮像装置の観察面の中心位置で固定される。０次光(参照光)の方向は、走査ミラー１０３の傾きに無関係に一定の方向となり、常に微小ミラー１３７の中心で反射されるので、０次光(参照光)の２次元撮像装置１６５に対する入射角度は、光源１０１からの光の試料物体への照射方向が変化しても変化しない。走査ミラー１０３によって、光源１０１からの光の試料物体への照射方向を変化させて、照射方向ごとに、透過回折光用撮像装置および反射回折光用撮像装置によってホログラム・データを取得する。

図３は、試料ホルダ１１９、および２枚の第１対物レンズ１１７、１２１を示す図である。本実施形態において第１対物レンズ１１７、１２１は、フーリエレンズである。フーリエレンズにおいて、瞳の収差は適切に補正され、

の条件が満たされる。ここで、ｈは瞳面における主光線の高さ、Ｆは焦点距離、θは、物体面の中心から放射された主光線の、光軸に対する角度を表す。第１対物レンズ１１７、１２１の物体側の開口数(ＮＡ)は、水浸状態で１．２であり、検出面側の開口数(ＮＡ)は、空気中で０．００７５である。第２対物レンズ１０９の焦点距離は２００ｍｍであり、第１対物レンズ１１７、１２１の倍率が６０倍であれば、第１対物レンズ１１７、１２１の焦点距離は、水中で約４．４ｍｍである。試料における視野は、約５０μｍである。２次元撮像装置１６５は、第１対物レンズ１１７、１２１の瞳面に共役に配置される。第１対物レンズ１１７、１２１の瞳面と２次元撮像装置１６５の検出面との間の光学系が、倍率βの像形成光学系であるとすると、

となる。ここで、NA₀は、第１対物レンズ１１７および１２１の物体側の開口数、μは、２次元撮像装置１６５の１画素の幅、Ｎは、２次元撮像装置１６５の１辺に対応する画素数を示す。２次元撮像装置１６５の１辺の長さは、μNであり、２次元撮像装置１６５上の回折光による円形領域の直径の２倍である。

試料の観察可能体積は、試料の両側の２個の開口板１１９１および１１９３の円形開口部によって制限される。開口部の直径は、照射光の断面の３倍であり、試料の厚さの３倍である。照射光は、第１対物レンズ１１７の瞳面上の１点に収束した後に、平面波に変換され、試料に入射する。開口面上の照射光の断面は、入射角度に関係なく円形となる。このことは、フーリエレンズの特徴の一つである。第１対物レンズ１２１の瞳面上における散乱光の開口数は、絞りにより０次光の開口数の３倍に制限される。

２次元撮像装置１６５の検出面で回折光と参照光とが干渉した光強度(ホログラム・データ)を検出し、デジタルホログラム技術により光強度を回折光の振幅に変換する。その際、図１のように参照光の検出面の法線に対する入射角度をφとすると、

となるように角度を調整する。ここで、λは参照光の波長、μは２次元撮像装置１６５の１画素の幅である。つまり、検出面上の参照光の位相の１周期が４画素分になるようにする。図２に示す透過回折光用撮像装置および反射回折光用撮像装置の１辺に対応する空間周波数の差は

に設定してある。ここで、NA₀は、第１対物レンズ１１７および１２１の物体側の開口数である。上記空間周波数のフーリエ変換に対応する実空間における物体のサイズＤは

となる。ここで、Ｎは、透過回折光用撮像装置および反射回折光用撮像装置の１辺に対応する画素数である。開口板１１９１および１１９３の円形開口部の直径Ｒと物体の直径Ｄは

の関係を有する。

であるとすると、実空間において再現される物体のサイズＤ／４は、約４５μｍである。また、分解能λ/(2NA₀)は、３５４ｎｍである。

本実施形態においては、試料物体に対して、照射光の２次元走査を行うことによってホログラム・データを取得し、該ホログラム・データに基づいて試料物体の３次元画像を生成する。３次元画像に対する３次元マトリクスのサイズが256³であるとすると、最大解像度を得るには、128²×π/4の走査方向(照射方向)が必要である。ここで、係数π/4は、円形瞳を意味する。走査方向の数は、画像の質と走査時間とを考慮して減少させてもよい。

ホログラム・データから３次元画像を生成する方法について以下に説明する。

３次元物体の光散乱振幅(複素振幅)

で与えられる。ここで、係数εは十分に小さい実数を表す。また、

は屈折率分布による光散乱振幅であり、

は平均屈折率に対する比屈折率分布を表している。

は、吸収率分布を示している。吸収率分布による散乱光と屈折率分布による散乱光は位相がπ/2ずれる。物体によって散乱されず、物体をそのまま透過する０次光は式（１）における右辺第１項の１に対応している。

上記の散乱光振幅を物体のフーリエ面（２次元撮像装置１６５の検出面）で観測したホログラム・データは、

をフーリエ変換したものに対応する。ホログラム・データにおいて、０次光に対応する部分は、座標原点のデルタ関数となる。

可視化した３次元像は、散乱振幅

の絶対値の２乗に対応する。そこで、そのまま散乱振幅の絶対値の２乗をとると、

となり、ＤＣ(直流)成分に吸収率分布が加わったものが得られる。このＤＣ成分を抑えればコントラストの高い像となる。εの２乗の項は小さいため無視される。

つぎに、散乱振幅の０次光の位相をπ/2ずらして絶対値の２乗をとると、

となり、ＤＣ成分に屈折率分布が加わったものが得られる。このＤＣ成分を抑えればコントラストの高い像となる。εの２乗の項は小さいため無視される。

このように、式(２)および(３)に基づいて、吸収率分布の３次元画像および屈折率分布の３次元画像を分離して生成することができる。

図４乃至図６は、ホログラム・データから３次元画像を生成する方法を示す流れ図である。図４乃至図６に示した方法は、処理装置２０１によって実行される。処理装置２０１は、走査ミラー１０３に照射方向を設定し、２次元撮像装置１６５から照射方向ごとのホログラム・データを受け取る。

図７および図８は、ホログラム・データから３次元画像を生成する方法を説明するための図である。

図４のステップＳ０４１０において、ホログラム・データをフーリエ変換する。光源１０１からの、全ての照射方向の光によって生成された透過回折光および反射回折光のホログラム・データを、２次元撮像装置１６５によって取得した後、ＮｘＮ画素のホログラム・データを処理装置２０１によってフーリエ変換する。

演算の結果、図７（Ａ）の右上に示すように、物体波の複素振幅が一方の側に得られ、共役物体波の複素振幅が他方の側に現れる。なお、図７（Ａ）では、反射回折光の成分の図示を省略し、透過回折光の成分のみを示している。

の関係により、物体波と共役物体波は重なるが、サイズがN/4である、物体波と共役物体波の中央部分は重ならない。参照光の発光は、図１に示す減衰器１５９によって、最大強度の位置において透過光の約１００倍(振幅で１０倍)に調整されるので、直流光によって生成される中央の明るいスポットのみが現れる。減衰量を調整することができるように、参照光の光路に減衰量の異なる複数の減衰器を選択的に配置することができるようにしてもよい。中央の明るいスポット周囲に現れると考えられる物体波の自己相関は無視しうる。

図４のステップＳ０４２０において、図７（Ａ）の右下に示すように

の物体波の部分が切り取られ、再現される物体のサイズは、D/4に制限される。切り取られた２次元マトリクスに逆フーリエ変換が施され、瞳面における回折光の複素振幅が得られる。

図４のステップＳ０４３０において、図７（Ａ）の左下に示すように、直径N/8の円が切り取られる。そして、図７（Ｂ）に示すように、透過回折光の成分および反射回折光の成分のそれぞれが、波数空間にマップされた「部分球面」に投影される。第１対物レンズの入射瞳は無限遠に位置し、参照球面の半径は無限大であるため、回折光が到達する検出面を波数空間として扱うのが便利である（例えば、渋谷眞人・大木裕史著 ”光学ライブラリー１ 回折と結像の光学” 朝倉書店 P17〜P24を参照）。部分球面は、

要素の３次元マトリクス内に存在する。図７（Ｂ）に示すように、部分球面上の要素以外の全ての要素の複素振幅は、ゼロに設定される。このステップにおいて、複素振幅は部分球面上に、Ｚ方向（周波数空間における光軸方向）に投影される。部分球面の（ｘ，ｙ）要素がＺ方向における２個の３Ｄ画素からなる場合に、振幅は２個の３Ｄ画素に均等に分配される。このステップは、実空間においてアーティファクトを生じうるが、Ｚ方向に数個の要素を含むガウス関数によってコンボリューションをとった部分球面を使用することによって誤差は減少する。部分球面がデジタル化された後、複素振幅は、ガウス分布の重みをつけてデジタル部分球面に投影される。この場合に、Ｚ方向の実空間における画像の周辺の強度は弱くなる。

図８（Ａ）に示すように、照明光が試料に照射され、０次光（直接透過光）と透過回折光は透過回折光用撮像装置に到達し、０次光と反射回折光は反射回折光用撮像装置に到達する。これらの回折光（０次光も含む）は前述のとおり、参照光との干渉縞として撮像され、処理装置によって回折光の複素振幅が得られ、透過回折光および反射回折光の複素振幅はそれぞれ部分球面に光軸方向に投影される。そして、図８（Ｂ）に示すように、周波数空間内のそれぞれの部分球面は、０次光が周波数原点に一致するように配置される。このように構成することにより、系の光学伝達関数(ＯＦＴ)の物理的性質を描写することができる。物体の構造はフーリエ変換により、無数の３次元格子に分解されるが、それぞれの格子において、法線方向をベクトルの向き、空間周波数をベクトルの大きさとしてもつベクトルを格子ベクトルと呼称する。系が、それぞれの部分球面に対応するホログラムの測定の段階で誤差を有しなければ、周波数空間の原点の偏角はゼロである。０次光に対応する複素振幅は、透過成分の部分球面S_T上に存在する。反射成分の部分球面S_Ｒに対しては、０次光の複素振幅は、反射成分の部分球面S_Ｒから離れ、原点（透過成分の部分球面S_T上に存在する）に位置する。反射成分の部分球面S_Ｒは、２次元撮像装置１６５上において０次光が撮像素子に到達する位置に対応する位置に穴を有する。すなわち、反射成分に対して、２次元撮像装置１６５上に到達する０次光は、反射成分の部分球面S_Ｒから引かれ、反射成分の位相誤差補正に使用される。反射成分に対する部分球面および０次光は同一の球上に存在する。透過成分および反射成分に対する２個の３次元マトリクスは加えられ、互いに向かい合う２個の部分球面からなるマトリクスが得られる。同一の半径および曲率を有する２個の部分球面からなるマトリクスを、以下においてツイン球面と呼称する。

図４のステップＳ０４４０において、ツイン球面から物体の３次元画像を求める。全ての照明方向に対して、ツイン球面の複素振幅を計算した後、図８（Ｃ）に示すように、０次光に対応する位置が３次元マトリクスの原点に配置されるようにそれぞれのツイン球面を並行移動する。

測定中の温度変化や振動によって、透過回折光、反射回折光および参照光の３経路の間で相対的な光路長の差が変化しうる。複数回の測定の間で、それぞれのホログラムに対する位相差が発生しうる。すなわち、透過回折光、反射回折光および参照光の３経路の間の相対的な光路長の変化に対して、ツイン球面の透過成分および反射成分の相対的な位相差が存在する。上記位相差を最小とするために、ツイン球面を形成するように２個の部分球面を加える前に、透過(反射) 成分に対する部分球面は、透過(反射) 成分用の２次元撮像装置に到達する０次光の位相項で割られる。このように、０次光によってそれぞれのホログラムに対する位相補正が行われ、３次元マトリクスの原点における位相はゼロであることが保障される。

また、図１に示すように、試料ホルダ１１９および偏光ビームスプリッタ１１１を含むループ部分１１０において、透過回折光（０次光を含む）および反射回折光の相対光路長は、測定中に波長オーダーで変化し、それが位相誤差として残る可能性がある。そこで、ループ部分１１０を堅固な構造としてもよい。

ツイン球面から物体の３次元画像を求める方法は二つある。以下に、二つの方法について説明する。

図５は、第１の方法を示す流れ図である。

図５のステップＳ０５１０において、吸収率分布の３次元画像を求める場合には、照射方向ごとに、ツイン球面をフーリエ変換し絶対値の２乗を計算する。屈折率分布の３次元画像を求める場合には、照射方向ごとに、０次光のみにπ/2の位相シフトを加えた後、ツイン球面をフーリエ変換し絶対値の２乗を計算する。

図５のステップＳ０５２０において、全ての照射方向に対する絶対値の２乗を加算することによって、実空間において

のサイズの物体の３次元画像が得られる。第１の方法は、従来のケーラー照明光学系による像形成に対応している。

図６は、第２の方法を示す流れ図である。

図６のステップＳ０６１０において、全ての照射方向に対するツイン球面の３次元マトリクスをコヒーレントに加算することによって周波数領域における合計振幅が得られる。

図６のステップＳ０６２０において、吸収率分布の３次元画像を求める場合には、合計振幅をフーリエ変換し絶対値の２乗を取ることによって物体の３次元画像が得られる。屈折率分布の３次元画像を求める場合には、３次元マトリクスの原点にπ/2の位相シフトを加えた後、合計振幅をフーリエ変換し絶対値の２乗を取ることによって物体強度が再現される。

試料物体が低コントラスト物体であれば、第１の方法および第２の方法によって得られる像は同一の光学特性を有する。

本発明による３次元顕微鏡により、屈折率分布と吸収分布を有する物体の、屈折率分布の３次元画像および吸収分布の屈折率分布の３次元画像が分離して得られる。

第１の方法および第２の方法を、以下においてより詳細に説明する。

図９は、透過側および反射側の２個の瞳関数からなる３次元入射瞳関数を示す図である。瞳関数は、周波数空間にあると考える。

透過側に対する３次元瞳関数

および反射側に対する３次元瞳関数

を考える。ここで、

である。ここで、アスタリスクは複素共役を表す。簡単のために、透過(反射)側に対する瞳関数は、部分球面上で１であり、瞳球の外側で０であると仮定する。すなわち、

光源からの光の波数

が瞳関数

上を走査され、物体から発生した回折光が、瞳

の両側を通って伝達される。０次光の振幅は、２次元撮像装置１６５に到達する前に係数

により減衰器１５９によって減衰される。物体の振幅が

によって与えられると、光源からの光の所定の波数

に対して、ツイン球面上の複素振幅は、

となる。ここで、吸収物体の場合はそのままの０(x)を用い、位相物体の場合は０次光の位相をπ/２シフトさせた０(x)を用いる。このとき、全体の位相を適当に選べば、０(x)を実数にすることができる。

第１の方法に基づいて、再現される物体の画像の放射照度は、

となる。ここで、

である。式(５)においては、複素振幅のフーリエ変換の絶対値の２乗が、照射方向に関して積分されている。

３次元入射瞳関数

のフーリエ変換は、３次元コヒーレント点像分布関数(point spread function)

に等しい。点像分布関数は、以下の関係を有する。

瞳関数は、光軸に回転対称であるので、

となる。ここで、

であり、上記は、３次元相互強度(3-D mutual intensity)と呼称される。

低コントラスト物体

を考える。ここで、係数ε_ｏは十分に小さな実数、ｏ（ｘ）はＤＣ成分を除いた光散乱振幅を表す。ただし、

である。式(６)に

を挿入することによって、

となる。ここで、最後の項においてパーシバルの定理

および

を使用し、
ε₀
の２次項は無視する。さらに簡単な計算により、

となる。ここで、

であり、

は、

のフーリエ変換である。３次元光学伝達関数（ＯＴＦ）は、

と定義される。光学伝達関数は、入射瞳

と光源からの光に対する透過側の瞳

との間の相関関数に等しい。すなわち、

である。

図１０は、水中の第１対物レンズについて、ＮＡ＝１．２である場合のＯＴＦを示す図である。ＯＴＦは、

方向に回転対称であり、光軸の方向における空間周波数である。図１０には、

軸を含む断面が描かれている。従来の位相差顕微鏡技術と同様に、０次光の付近を伝播する散乱波は、微小ミラーによってさえぎられるので、光軸に沿った空間周波数は、透過成分および反射成分の両方に分解することはできないことに留意すべきである。深さ分解能は、反射成分から得られ、反射成分に対応するＯＦＴの部分は、失われた円錐形（missing cone）として知られる領域に位置する。透過成分および反射成分に対応するＯＦＴの二つの部分のギャップが存在し、該ギャップにおける空間周波数は分解できないが、より大きなＮＡの対物レンズを使用することによって減少させることができる。

物体の複素振幅が、低コントラスト屈折率分布を有する３次元位相物体に対して成立する実数値関数

であれば、式(８)は、

は、３次元点像分布関数である。低コントラスト物体

に変換することができる。このことは、物体の当初のコントラストは、
2ε₀
は、０次光の減衰によって

まで強められる。最終的に、物体の再現に対する簡単な式

が得られる。上記の方法によって再現された画像の放射照度は、強調されたコントラストを有する、物体強度の、３次元点像関数によるコンボリューションによって表される。

第２の方法において、画像の放射照度は、

によって与えられる。ここで、パーシバルの定理が使用される。式(１１)において、複素振幅を照射方向ごとに積分した後、積分値をフーリエ変換し、絶対値の２乗を求める。試料が低コントラスト物体であれば、

を式(１１)に代入すると

が得られる。ここで、

であり、
ε₀
の２次項は無視する。すなわち、式（１２）より、試料が低コントラスト物体である限り、第２の方法によって再現された物体の画像放射照度は、第１の方法によるものに比例する。第２の方法は、最終段階で１回のフーリエ変換を必要とするだけなので、複数回のフーリエ変換を必要とする第２の方法に比較して計算時間は少ない。

画像は、従来の光学系と同様の方法でＯＴＦによってデコンボリューションすることができる。第１の方法において、フーリエ変換する前に、それぞれのシフトされた部分球面をＯＴＦで割る。第２の方法において、絶対値の２乗を取る前に、ＯＴＦによって、周波数領域で合計振幅を割ることによってデコンボリューションを行う。両方の方法は、透過成分しかなければ誤差がなく、低周波数物体は、再現する際に、ほとんど誤差無しに解像することができる。

本発明の実施形態の特徴を以下に説明する。

本発明の一実施形態によれば、照射方向ごとの干渉像から物体の吸収率分布の３次元画像および屈折率分布の３次元画像を生成することを特徴とする。

本実施形態によれば、吸収率分布および屈折率分布を有する物体の、吸収率分布の３次元画像および屈折率分布の３次元画像を分離して生成することができる。

本発明の他の実施形態によれば、回折光として、透過回折光および反射回折光を使用することを特徴とする。

本実施形態によれば、回折光として、透過回折光および反射回折光を使用することにより、特に、物体の奥行き方向の高い分解能が得られる。

本発明の他の実施形態によれば、参照光として物体を透過した０次光を使用することを特徴とする。

本実施形態によれば、参照光として物体を透過した０次光を使用するので光学系の構成が簡単になる。

本発明の他の実施形態によれば、参照光として使用される０次光を経路上において減衰させることを特徴とする。

本実施形態によれば、参照光として使用される０次光を経路上において減衰させるので、回折光と比較して強度の大きい０次光によって撮像部が飽和するのが防止される。

本発明の他の実施形態によれば、０次光の一部が参照光と使用される０次光と分離されて、回折光と同じ経路を通るように構成され、干渉像から物体の３次元画像を生成する際に、前記回折光と同じ経路を通った０次光の位相を使用して前記回折光および前記参照光の間の位相誤差を補正することを特徴とする。

本実施形態によれば、個々の干渉の間の位相誤差を最小とすることができる。

本発明の他の実施形態によれば、光を反射する反射鏡を備え、前記反射鏡の傾きを変えることによって物体への前記光の照射方向を変化させ、前記反射鏡が前記物体の共役位置に配置され、０次光が、前記反射鏡に反射され、照射方向に関係なく、前記物体のフーリエ面の中心に集光されることを特徴とする。

本実施形態によれば、０次光が、反射鏡に反射され、照射方向に関係なく、一定の方向に進行して物体のフーリエ面の中心に集光されるので、０次光を参照光として使用するのに都合がよい。

本発明の他の実施形態によれば、物体のフーリエ面の中心に微小反射鏡が配置され、前記微小反射鏡によって参照光として使用される０次光を反射することによって、参照光として使用される０次光の経路を回折光の経路と分離することを特徴とする。

本実施形態によれば、簡単な構成によって参照光として使用される０次光の光路を回折光の光路と分離することができる。

Claims (16)

1. 物体に対して光を複数の照射方向から順次照射する第１光学系と、
   前記物体から発生する回折光と参照光とを撮像部に導く第２光学系と、
   前記回折光と前記参照光との干渉像を撮像する撮像部と、
   前記撮像部によって取得された前記照射方向ごとの干渉像から前記物体の３次元画像を生成する処理装置と、を含み、
   前記処理装置は、前記照射方向ごとの干渉像から前記回折光の複素振幅を求め、該複素振幅から前記物体の吸収率分布及び屈折率分布の少なくとも一方の３次元画像を生成するように構成されたことを特徴とする３次元顕微鏡。
2. 前記処理装置が前記照射方向ごとの干渉像から前記物体の吸収率分布の３次元画像および屈折率分布の３次元画像を生成するように構成されたことを特徴とする請求項１に記載の３次元顕微鏡。
3. 前記回折光として、透過回折光および反射回折光を使用するように構成されたことを特徴とする請求項１に記載の３次元顕微鏡。
4. 前記参照光として、前記物体を透過した０次光を使用するように構成されたことを特徴とする請求項１に記載の３次元顕微鏡。
5. 前記参照光として使用される０次光が前記撮像部において飽和しないように、前記第２光学系において減衰部を備えたことを特徴とする請求項４に記載の３次元顕微鏡。
6. 前記第２光学系が、０次光の一部が前記参照光として使用される０次光と分離されて、前記回折光と同じ経路を通って前記撮像部に到達するように構成され、
   前記処理装置が、前記回折光と同じ経路を通って前記撮像部に到達した０次光の位相を使用して前記回折光および前記参照光の間の位相誤差を補正するように構成されたことを特徴とする請求項４に記載の３次元顕微鏡。
7. 前記第２光学系が、前記光を反射する反射鏡を備え、前記反射鏡の傾きを変えることによって前記物体への前記光の照射方向を変化させるように構成されており、前記反射鏡が前記物体の共役位置に配置され、０次光が、前記反射鏡に反射され、照射方向に関係なく、前記物体のフーリエ面の中心に集光されるように構成されたことを特徴とする請求項４に記載の３次元顕微鏡。
8. 前記物体のフーリエ面の中心に微小反射鏡が配置され、前記微小反射鏡によって前記参照光として使用される０次光を反射することによって、前記参照光として使用される０次光の経路を前記回折光の経路と分離するように構成されたことを特徴とする請求項７に記載の３次元顕微鏡。
9. デジタルホログラフィを使用して物体の３次元画像を生成する３次元画像生成方法であって、
   物体に対して光を複数の照射方向から順次照射し、
   前記物体から発生する回折光と参照光との干渉像を照射方向ごとに取得し、
   照射方向ごとに取得された干渉像から前記回折光の複素振幅を求め、該複素振幅から前記物体の吸収率分布及び屈折率分布の少なくとも一方の３次元画像を生成することを特徴とする３次元画像生成方法。
10. 前記照射方向ごとの干渉像から前記物体の吸収率分布の３次元画像および屈折率分布の３次元画像を生成することを特徴とする請求項９に記載の３次元画像生成方法。
11. 前記回折光として、透過回折光および反射回折光を使用することを特徴とする請求項９に記載の３次元画像生成方法。
12. 前記参照光として０次光を使用することを特徴とする請求項９に記載の３次元画像生成方法。
13. 前記参照光として使用される０次光を経路上において減衰させることを特徴とする請求項１２に記載の３次元画像生成方法。
14. ０次光の一部が前記参照光として使用される０次光と分離されて、前記回折光と同じ経路を通るように構成され、干渉像から前記物体の３次元画像を生成する際に、前記回折光と同じ経路を通った０次光の位相を使用して前記回折光および前記参照光の間の位相誤差を補正することを特徴とする請求項１２に記載の３次元画像生成方法。
15. 前記光を反射する反射鏡を備え、前記反射鏡の傾きを変えることによって前記物体への前記光の照射方向を変化させ、前記反射鏡が前記物体の共役位置に配置され、０次光が、前記反射鏡に反射され、照射方向に関係なく、前記物体のフーリエ面の中心に集光されることを特徴とする請求項１２に記載の３次元画像生成方法。
16. 前記物体のフーリエ面の中心に微小反射鏡が配置され、前記微小反射鏡によって前記参照光として使用される０次光を反射することによって、前記参照光として使用される０次光の経路を前記回折光の経路と分離することを特徴とする請求項１５に記載の３次元画像生成方法。

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