JP4844137B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は顕微鏡装置、さらに詳しくは、超解像度を有する構造化照明顕微鏡装置に関するものである。

光学顕微鏡等の結像光学系による像形成においては、結像光学系固有の伝達関数が存在し、その伝達関数により結像される物体像の特性が制限される。さらに詳しくは、伝達する光学像のフーリエ成分（空間周波数成分）の内、その伝達関数によって定まる特定の空間周波数領域のみが伝達し、残りの空間周波数成分はカットされる。

例えば、一般の光学顕微鏡においては、対物レンズの開口数（ＮＡ）で定まるカットオフ周波数と呼ばれる空間周波数ｆcutoff、
ｆcutoff＝２ＮＡ／λ （ただし、λ：光の波長）
が存在し、入力した光学像のフーリエ成分の内、そのカットオフ周波数より高い空間周波数成分を結像させることはできない。

対物レンズの開口数は、対物レンズが観察物体Ｏより取り込める光の円錐の頂角の１／２のサイン関数に観察物体と対物レンズ前面の間の媒質の屈折率を掛け合わせたものであり、例えば空気中にある物体に対しては、開口数は１以上とならないので、カットオフ周波数は２／λ以上にはならない。したがって、空気中に置かれた光の波長の１／２より小さい周期を持つ微細構造は、一般の光学顕微鏡で解像できない。

ところが、観察物体と結像光学系の間に空間周波数を変調する手段を挿入することにより、結像光学系では伝達できない空間周波数領域の観察物体の空間周波数成分を結像に反映させることができる。ただし、その場合、結像光学系により結像された観察物体の像は変調を受けているので、その変調の回復（復調）手段を合わせて用いることにより、正しい観察物体像が形成できる。これを光学顕微鏡に適用した場合、従来のカットオフ周波数より高い空間周波数を持つ観察物体の微細構造を解像できるようになる。これを超解像と呼ぶ。

このような超解像を利用した顕微鏡装置は、生体試料から作成した固定標本などの被観察物を超解像観察するために使用されている。（特許文献１，２，非特許文献１，２など参照）。前述のように、この手法では、空間変調された照明光で被観察物の構造の空間周波数を変調し、解像限界を超える高い空間周波数の情報を顕微鏡光学系の結像に寄与させる。

但し、前述のように、超解像画像を観察するためには変調された被観察物の像（変調像）を復調する必要がある。復調の方法は大別して２種類あり、光学的な復調（非特許文献１，２参照）と、演算による復調（特許文献１，２参照）とがある。なお、光学的な復調は、回折格子などの空間変調素子を用いて変調像を再変調することによって実現する。

この他、公知技術でないが、本願の発明者等は、照明光学系中に置かれた回折格子の像を、被観察物の表面に結像させて照明を行い、前記照明光により照明された前記被観察物の像を、結像光学系により前記回折格子状に中間像として結像させ、前記回折格子を通過した前記中間像を、リレー光学系により、撮像素子上に結像させる顕微鏡装置であって、少なくとも前記回折格子から前記被観察物に至る前記照明光学系を構成する光学素子と、前記被観察物から前記回折格子に至る前記結像光学系を構成する光学素子が共用されている顕微鏡装置の発明を行い、特願２００５−２９９３２９号として特許出願している（先願発明という）。
特開平１１−２４２１８９号公報 米国再発行特許発明第３８３０７号明細書 W.Lukosz,"Optical systems with resolving powers exceeding the clasical limit.II",Journal of the Optical Society of America,Vol.37,PP.932,1967 W.Lukosz and M.Marchand,Opt. Acta. 10,241,1963

以上述べた何れの方法においても、超解像が得られる方向は、回折格子の格子の長さ方向と直角な方向である。よって、２次元的な超解像を得ようとすると、回折格子の向きを変化させて、複数方向（通常は３方向）での撮像を行い、その結果を演算処理する必要がある。

このような方法を実現する手段として、最も一般的に用いられている方法は、回折格子を回転させて、それに対応する像の撮像を行う方法であり、先願発明においても、その実施の形態においてはこの方法を採用している。

しかしながら、回折格子を回転させて正確に停止する方法では、停止位置の位置決めに時間がかかるという問題点がある。特に細胞を生きたまま観察するLive Cell等の観察には、高速での撮像が必要とされ、回折格子を回転させて位置決めする方法では、実用的でないという問題点がある。

本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、高速な観察が可能な顕微鏡装置を提供することを課題とする。

前記課題を解決するための第１の手段は、複数の光路を含み、各光路中に各々置かれた回折格子の像を被観察物の表面に結像させて照明を行う照明光学系と、前記照明光学系により照明された前記被観察物の像を、前記回折格子上に中間像として結像させる結像光学系と、前記中間像の像を形成するリレー光学系とを備えた顕微鏡装置であって、前記複数の回折格子は、互いに格子パターンの向きが異なり、前記照明光学系は、さらに光源からの光を前記複数の光路のうちの任意の光路に切り換えて導き、その光路中に配置された回折格子へ導く第１の照明光路切り換え手段と、前記第１の照明光路切り換え手段に同期して、照明された回折格子からの光を前記被観察物の表面へ導く第２の照明光路切り換え手段とを有し、前記結像光学系は、さらに前記被観察物からの光を前記照明された回折格子へ導く第１の観察光路切り換え手段と、前記第１の観察光路切り換え手段に同期して、前記照明された回折格子からの光を前記リレー光学系へ導く第２の観察光路切り換え手段とを備えたことを特徴とする顕微鏡装置である。

前記課題を解決するための第２の手段は、前記第１の手段であって、少なくとも前記第１の照明光路切り換え手段から前記被観察物に至る前記照明光学系を構成する光学素子と、前記被観察物から第２の観察光線光路切り換え手段に至る前記結像光学系を構成する光学素子が共用されており、前記第１の照明光路切り換え手段と前記第２の観察光線光路切り換え手段が同一であり、かつ、前記第２の照明光路切り換え手段と前記第１の観察光線光路切り換え手段とが同一であることを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第３の手段は、複数の光路を含み、各光路中に各々置かれた回折格子の像を被観察物の表面に結像させて照明を行う照明光学系と、前記照明光学系により照明された前記被観察の像を結像させる結像光学系とを備えた顕微鏡装置であって、前記複数の回折格子は、互いに格子パターンの向きが異なり、前記照明光学系は、光源からの光を前記複数の光路のうちの任意の光路に切り換えて導き、その光路中に配置された回折格子へ導く第１の照明光路切り換え手段と、前記第１の照明光路切り換え手段に同期して、照明された回折格子からの光を前記被観察物の表面へ導く第２の照明光路切り換え手段とを備えたことを特徴とする顕微鏡装置である。

前記課題を解決するための第４の手段は、前記第１の手段から第３の手段のいずれかであって、前記回折格子が、透過もしくは反射型の空間光変調素子であることを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第５の手段は、前記第１の手段であって、前記顕微鏡装置が、前記リレー光学系によって形成された像を撮像する撮像装置と、前記被観察物の表面に結像する前記回折格子の像の格子パターンの位相を変化させる位相変調手段とを備え、前記撮像装置の撮像時間は、前記格子パターンの位相Ｎ周期分（Ｎは自然数）であることを特徴とするものである。

本発明によれば、高速な観察が可能な顕微鏡装置を提供することができる。

以下、本発明の実施の形態の例を説明するが、これらの実施の形態の主なものは、先願発明の実施の形態の改良であるので、まず、先願発明の実施の形態の例を説明する。図１は、先願発明の実施の形態である顕微鏡装置の概略構成図である。図１に示すとおり、顕微鏡装置には、光源１、コレクタレンズ２、レンズ３、励起フィルタ４、ダイクロイックミラー５、レンズ７、回折格子８、第２対物レンズ９、対物レンズ１０、蛍光色素で標識された標本（生体標本など）１１、バリアフィルタ６、レンズ１２、撮像装置（ＣＣＤカメラなど）２５、制御・演算装置（回路やコンピュータなど）４２、画像表示装置４３、アクチュエータ４０、回転ステージ４１が配置される。

このうち、光源１、コレクタレンズ２、レンズ３、励起フィルタ４、ダイクロイックミラー５、レンズ７、回折格子８、第２対物レンズ９、対物レンズ１０が照明光学系ＬＳ１を構成しており、対物レンズ１０、第２対物レンズ９、回折格子８、レンズ７、ダイクロイックミラー５、バリアフィルタ６、レンズ１２が観察光学系ＬＳ２を構成している。また、対物レンズ１０と第２対物レンズ９とが結像光学系ＬＳ２１を構成し、レンズ７とレンズ１２とがリレー光学系ＬＳ２２を構成している。照明光学系ＬＳ１と観察光学系ＬＳ２とは、対物レンズ１０からダイクロイックミラー５までの光路を共有している。

照明光学系ＬＳ１の光源１からの光は、コレクタレンズ２において平行光に変換され、レンズ３により瞳共役面３１に光源像を形成する。その光源像３１からの光は、励起フィルタ４によって波長選択されたのちダイクロイックミラー５によって偏向され、照明光学系ＬＳ１と観察光学系ＬＳ２との共通光路へ入り、レンズ７により標本１１の共役面２２上に集光する。共役面２２から射出した光は、その共役面２２に配置された回折格子８を介して第２対物レンズ９へ入射し、平行光に変換された後、対物レンズ１０を介して標本１１上に回折格子８の像２３を形成する（このとき、対物レンズ１０の後側焦点面に光源像３２が形成される。）。これによって標本１１上は、空間変調された照明光で照明（構造化照明）される。

ここで、回折格子８は、例えば、１次元の周期構造をもつ位相型又は振幅型の回折格子である。特に、振幅型の回折格子は波長特性が良いため、光源１に白色光源を使用できるので好ましい。光源１としては、白色光源の代わりに単一波長の光源を用いてもよいし、レーザ光源からの光を光ファイバで導き、その端面に形成される二次光源を光源１として用いてもよい。

また、構造化照明の輝度分布（回折格子８の像２３の輝度分布）を正弦波状にするために、回折格子８で生じる次数２以上の余分な回折成分を除去することが望ましい。その際には、回折格子８よりも後段の適当な箇所（例えば対物レンズ１０の瞳面）で除去するとよい。或いは、回折格子８の濃度分布を予め正弦波状にしておけば、余分な回折成分の発生を抑え、光量の損失を抑えることができる。

さて、構造化照明された光を励起光として標本１１上では蛍光が発生する。このときに対物レンズ１０側から見た標本１１の構造は、構造化照明により変調されている。変調された構造には、モアレ縞が生じている。このモアレ縞は、標本１１が有する微細構造と構造化照明のパターンとが成すモアレ縞であり、標本１１の微細構造が、構造化照明の空間周波数の分だけ低い空間周波数帯域に変換されている。よって、解像限界を超える高い空間周波数の構造の光までもが、対物レンズ１０によって捉えられることになる。

対物レンズ１０によって捉えられた蛍光は、対物レンズ１０及び第２対物レンズ９からなる結像光学系ＬＳ２１により、共役面２２上に標本１１の変調像を形成する。その変調像は、その共役面２２に配置された回折格子８によって再変調される。このようにして生じた再変調像では、空間周波数を変化させた標本１１の構造が、元の空間周波数に戻される。この再変調像に、標本１１の復調像が含まれている。

但し、この再変調像には、復調像にとって不要な回折成分が含まれている。不要な回折成分とは、標本１１から射出された０次回折光に対し回折格子８で生じた±１次回折成分、標本１１から射出された−１次回折光に対する０次回折成分、標本１１から射出された＋１次回折光に対する０次回折成分である。これらの不要な回折成分を再変調像から除去するためには、回折格子８を１周期分若しくはＮ周期分（Ｎは自然数）動かして平均化すればよい。

再変調像からの蛍光は、レンズ７を介してダイクロイックミラー５を透過した後、観察光学系ＬＳ２の単独光路へ入り、バリアフィルタ６を透過したのち、レンズ１２を介して再変調像の拡大像２４を形成する。つまり、回折格子８で再変調された再変調像は、レンズ７及びレンズ１２からなるリレー光学系ＬＳ２２によって、拡大像２４へとリレーされる。この拡大像２４は、撮像装置２５によって撮像され、再変調像の画像データが生成される。なお、撮像装置２５で撮像する場合、回折格子８を１周期若しくはＮ周期（Ｎは自然数）動かしている間、再変調像を蓄積することによって平均化すれば、復調像の画像データを得ることができる。

この画像データは、標本１１を構造化照明によって超解像観察するための情報を含む。その画像データは、制御・演算装置４２によって取り込まれ、演算が施されてから、画像表示装置４３へと送出される。
以上、本顕微鏡装置は、標本１１の共役面２２から標本１１までの光路を照明光学系ＬＳ１と観察光学系ＬＳ２とで完全に共通光路にすると共に、その共役面２２に回折格子８を配置している。本顕微鏡装置ではこの回折格子８により、標本１１の微細構造の変調を図る。そして、変調された標本１１の微細構造は、この位置に配置された回折格子８により、自動的に再変調される。

なお、回折格子８は、アクチュエータ４０によって格子線に直交する方向Ｄｂへ移動可能である。この移動により、構造化照明の位相が変化する。制御・演算装置４２がアクチュエータ４０及び撮像装置２５を制御し、１フレーム分の画像データを蓄積している間にその位相を１周期分若しくはＮ周期分（Ｎは自然数）だけ変化させることで、その画像データから、構造化照明のパターンと、再変調時に生じた不要な回折成分とを消去する。

また、回折格子８は、回転ステージ４１によってアクチュエータ４０と共に光軸の周りを回転可能である。この回転により、構造化照明の方向が変化する。制御・演算装置４２が回転ステージ４１及び撮像装置２５を制御し、構造化照明の方向を複数方向に変化させる度に画像データを取得すれば、複数方向に亘り超解像観察するための情報を得ることができる。これにより、標本１１の二次元の超解像観察が可能となる。

また、以上の動作に必要なプログラムは、例えばＣＤ−ＲＯＭなどの記録媒体やインターネットを介して制御・演算装置４２に予めインストールされている。

次に、本顕微鏡装置のリレー光学系ＬＳ２２に必要な条件を説明する。

図２は、本顕微鏡装置における観察光学系ＬＳ２の標本１１からレンズ７までの結像光束の開口数を説明する図である。なお、図２では、光束の広がりの変化をわかりやすくするために、回折格子８の像２３と標本１１とをずらして描き、標本１１の共役面２２と回折格子８とをずらして描いている。

図２に示すとおり、標本１１の高い空間周波数の構造で発生した蛍光ＬＡは射出角度が大きいため、通常は破線のとおり進行して対物レンズ１０の瞳径内に入射することができない。しかし、その蛍光ＬＡは回折格子８の像２３（つまり構造化照明）により変調されるので、その射出角度が低周波数側（つまり小角度）に変化したものは、実線のとおり進行して対物レンズ１０の瞳径内に入射することが可能になる。

この蛍光ＬＡは、結像光学系ＬＳ２１によって共役面２２上に結像した後、回折格子８において再変調される。再変調された蛍光ＬＡ’の射出角度は、高周波側（つまり大角度）に戻されている。

このような蛍光ＬＡ’を含む結像光束を導光するためには、リレー光学系ＬＳ２２の物体側開口数ＮＡ’を、予め大きく設定しておく必要がある。

特に、構造化照明の空間周波数（つまり回折格子８の格子周波数）が高いほど、その結像光束の開き角は大きくなるので、リレー光学系ＬＳ２２の物体側開口数ＮＡ’も大きくする必要がある。

但し、一般に、構造化照明による超解像効果は、対物レンズ１０の解像限界の２倍程度である。なぜなら、照明光学系ＬＳ１によって標本１１上に投影される構造化照明の空間周波数は、対物レンズ１０の解像限界が上限だからである。したがって、リレー光学系ＬＳ２２の物体側開口数ＮＡ’は、或る程度大きければ十分である。

次に、制御・演算装置４２の制御に関する動作を説明する。図３は、本顕微鏡装置における観察光学系ＬＳ２の標本１１からレンズ７までの結像光束の開口数を説明する図である。図３に示すとおり、制御・演算装置４２は、再変調像の画像データを取得するに当たり、撮像装置２５の露光開始（ステップＳ１１）から露光終了（ステップＳ１３）までの期間に、構造化照明の位相を１周期分だけ変化させる（ステップＳ１２）。

このようにして取得された画像データは、構造化照明の位相変化中における再変調像の時間積分であり、構造化照明の輝度分布は正弦波状なので、この画像データからは、構造化照明のパターンは消去される。また、この画像データからは、再変調時に生じた不要な回折成分も消去される。よって、この画像データは、復調像を表す。

さらに、制御・演算装置４２は、構造化照明の方向を変化させてから（ステップＳ１５）、再びステップＳ１１〜Ｓ１３の処理を行い、構造化照明のパターンの消去された別の復調像の画像データを取得する。

そして、以上のステップＳ１１〜Ｓ１３における復調像の画像データの取得処理は、構造化照明の方向が予め決められた全方向に設定されるまで（ステップＳ１４ＹＥＳとなるまで）繰り返され、構造化照明のパターンの消去された復調像の画像データが、設定された方向の数だけ取得される。

例えば、制御・演算装置４２は、ステップＳ１１〜Ｓ１３の処理を、構造化照明の方向が０°，１２０°，２４０°の３方向に設定されるまで繰り返し、構造化照明のパターンの消去された３つの復調像の画像データＩ1，Ｉ2，Ｉ3を取得する。これらの復調像の画
像データＩ1，Ｉ2，Ｉ3の間では、超解像の方向が１２０°ずつ異なる。

次に、制御・演算装置４２の演算に関する動作を説明する。

図４は、制御・演算装置４２の演算に関する動作フローチャートである。ここでは、超解像の方向が１２０°ずつ異なる３つの復調像の画像データＩ1，Ｉ2，Ｉ3を取得した場
合の演算を説明する。

先ず、制御・演算装置４２は、３つの復調像の画像データＩ1，Ｉ2，Ｉ3の各々をフー
リエ変換し、波数空間で表現された３つの復調像の画像データＩk1，Ｉk2，Ｉk3を得る（ステップＳ２１）。これら復調像の画像データＩk1，Ｉk2，Ｉk3を図５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）に示した。

なお、図５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）において符号Ｉk±1は、変調された状態で（±１次回折光として）結像光学系ＬＳ２１によって伝達された成分（±１次変調成分）を示し、符号Ｉk0は、変調されない状態で（０次回折光として）結像光学系ＬＳ２１によって伝達された成分（０次変調成分）を示す。また、符号Ｄｂは、超解像の方向（構造化照明の方
向）を示し、符号Ｋは、構造化照明の空間周波数を示す。

続いて、制御・演算装置４２は、３つの復調像の画像データＩk1，Ｉk2，Ｉk3を、図６に示すとおり波数空間上で合成し、１つの合成画像データＩkを得る（ステップＳ２２）。３つの復調像の画像データＩk1，Ｉk2，Ｉk3は、互いのデータ範囲を重複させている（共通の空間周波数成分を含んでいる）ので、制御・演算装置４２は、合成に当たり、重複したデータについてはそれらの平均値をとり、その平均値を合成画像データＩkのデータとする。この平均によって、合成画像データＩkの低周波数成分の寄与が大きくなりすぎるのを抑えることで、高周波数成分の相対的な寄与が小さくなるのを防ぐことができる。

続いて、制御・演算装置４２は、合成画像データＩkを逆フーリエ変換し、実空間で表現された画像データＩを得る。この画像データＩは、１２０°ずつ異なる３方向に亘る標本１１の超解像画像を表現する（ステップＳ２３）。制御・演算装置４２は、この画像データＩを画像表示装置４３へ送出し、超解像画像を表示する。

以上、本顕微鏡装置では、図１に示したとおり標本１１からの光が回折格子８で再変調され、さらに回折格子８を動かして平均化して不要な回折成分を除去することによって復調像を得ている。したがって、復調演算をしない分だけ復調像の画像データは高速に得られる。

しかも、変調と再変調とに同一の回折格子８の同一の領域が用いられるので、仮にその回折格子８に形状誤差や配置誤差があったとしても、変調のパターンと再変調のパターンとを同一にすることができる。したがって、回折格子８の形状誤差や配置誤差は、復調像の画像データに対しノイズを殆ど与えない。このことは、構造化照明の位相を変化させたときや、構造化照明の方向を変化させたときにも同様に当てはまる。したがって、本顕微鏡装置では超解像画像が高精度に得られる。

また、本顕微鏡装置では、標本１１の共役面２２に回折格子８を配置する都合上、その共役面２に形成された再変調像をリレーしてから撮像装置２５で撮像する必要がある。しかし、本顕微鏡装置のリレー光学系ＬＳ２２は、超解像に必要な情報を確実に取得することができる。

また、本顕微鏡装置では、複数の画像データを合成する際に（図４ステップＳ２２）、それら画像データが共通して有する空間周波数成分を平均化するので、高周波数成分の減衰の少ない良好な超解像画像を得ることができる。

以下、本発明の実施の形態の例を説明するが、これらの実施の形態の基本的な構成は、図１に示した先願発明の実施の形態とほとんど同じであるので、図１と同じ部分には同じ符号を付してその説明を省略することがある。

図７は、本発明の第１の実施の形態である顕微鏡装置の概要を示す図である。顕微鏡装置には、光源１、コレクタレンズ２、レンズ３、励起フィルタ４、ダイクロイックミラー５、ガルバノミラーＭ１、レンズ７ａ〜７ｃ、回折格子８ａ〜８ｃ、ミラー３１ａ、３１ｃ、第２対物レンズ９ａ〜９ｃ、ガルバノミラーＭ２、対物レンズ１０、蛍光色素で標識された標本（生体標本など）１１、バリアフィルタ６、レンズ１２、撮像装置（ＣＣＤカメラなど）２５、制御・演算装置（回路やコンピュータなど）４２、画像表示装置４３が配置される。

このうち、光源１、コレクタレンズ２、レンズ３、励起フィルタ４、ダイクロイックミラー５、ガルバノミラーＭ１、レンズ７ａ〜７ｃ、回折格子８ａ〜８ｃ、ミラー３１ａ、３１ｃ、第２対物レンズ９ａ〜９ｃ、ガルバノミラーＭ２、対物レンズ１０が照明光学系を構成しており、対物レンズ１０、ガルバノミラーＭ２、第２対物レンズ９ａ〜９ｃ、ミラー３１ａ、３１ｃ、回折格子８ａ〜８ｃ、レンズ７ａ〜７ｃ、ガルバノミラーＭ１、ダイクロイックミラー５、バリアフィルタ６、レンズ１２が観察光学系を構成している。また、対物レンズ１０、ガルバノミラーＭ２、第２対物レンズ９ａ〜９ｃ、ミラー３１ａ、３１ｃが結像光学系を構成し、レンズ７ａ〜７ｃ、ガルバノミラーＭ１、ダイクロイックミラー５、バリアフィルタ６、レンズ１２がリレー光学系を構成している。照明光学系と観察光学系とは、対物レンズ１０からダイクロイックミラー５までの光路を共有している。

照明光学系の光源１からの光は、コレクタレンズ２において平行光に変換され、レンズ３により瞳共役面３１に光源像を形成する。その途中で励起フィルタ４によって波長選択されたのちダイクロイックミラー５によって偏向される。そして、ガルバノミラーＭ１により、方向を選択され、レンズ７ａ、７ｂ、７ｃのいずれかを介して、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃのいずれかを照明する。回折格子８ａ、８ｂ、８ｃの面は、それぞれ、標本１１の共役面２２ａ、２２ｂ、２２ｃに一致している。回折格子８ａ、８ｂ、８ｃのいずれかを通して、共役面２２ａ、２２ｂ、２２ｃのいずれかから射出した光は、第２対物レンズ９ａ、９ｂ、９ｃのいずれかへ入射し（その間に、共役面２２ａから射出した光は、ミラー３１ａにより、共役面２２ｃから射出した光はミラー３１ｃにより反射される）、平行光に変換された後、ガルバノミラーＭ２により反射され、対物レンズ１０を介して標本１１上に回折格子８ａ、８ｂ、８ｃのいずれかの像２３を形成する（このとき、対物レンズ１０の後側焦点面に光源像３２が形成される。）。これによって標本１１上は、空間変調された照明光で照明（構造化照明）される。なお、ガルバノミラーＭ１とガルバノミラーＭ２は同期して駆動され、照明された回折格子８ａ、８ｂ、８ｃのいずれかを通った光が標本１１に到達するようになっている。

回折格子８ａ、８ｂ、８ｃによって、標本１１上に形成される格子パターンは、その格子線の方向が６０°ずつずれている。よって、ガルバノミラーＭ１、Ｍ２によって光路を切り換え、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃを切り換えて使用することにより、図１に示す装置において、回転ステージ４１により回折格子８を１２０°ずつ回転させて測定を行ったのと同じ効果が得られる。ガルバノミラーＭ１、Ｍ２の駆動は高速で行えるので、高速な測定が可能となる。

ここで、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃは、例えば、１次元の周期構造をもつ位相型又は振幅型の回折格子である。特に、振幅型の回折格子は波長特性が良いため、光源１に白色光源を使用できるので好ましい。光源１としては、白色光源の代わりに単一波長の光源を用いてもよいし、レーザ光源からの光を光ファイバで導き、その端面に形成される二次光源を光源１として用いてもよい。

また、構造化照明の輝度分布（回折格子８の像２３の輝度分布）を正弦波状にするために、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃで生じる次数２以上の余分な回折成分を除去することが望ましい。例えば、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃが振幅型である場合は、余分な回折成分が生じやすいので、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃよりも後段の適当な箇所（例えば対物レンズ１０の瞳面）で除去するとよい。或いは、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃの濃度分布を予め正弦波状にしておけば、余分な回折成分の発生を抑え、光量の損失を抑えることができる。

また、光源１を照明光学系の光軸に対してシフトして使用するとより好ましい。その場合は、光源１を、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃの格子パターンとそれぞれ直角な方向へ所定の量だけシフトして、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃによる回折光のうち、０次と１次回折光が照明光学系ＬＳ１の光軸に対して対称になるようにするとよい。そのシフト量ｓは、光源１から回折格子８ａ、８ｂ、８ｃまでの光学系の合成焦点距離をｆｃ、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃの１次回折角をθｇとするとき、
ｓ＝ｆｃ×sin（θｇ／２） …（１）
となるように設定するとよい。

その理由を以下に説明する。標本上に形成する構造化照明は、使用する結像光学系の解像限界に近い、高い空間周波数であることが好ましい。すなわち回折格子８ａ、８ｂ、８ｃの格子パターンは空間周波数が高いことが望ましい。それは変調する空間周波数が大きいほど、変調の効果が高いため超解像効果が高いからである。また、構造化照明の輝度分布は正弦波状であることが好ましい。それは、構造化照明によって回折する標本の回折次数に不要な成分が発生しないからである。

回折格子８ａ、８ｂ、８ｃの格子パターンの空間周波数が高いと回折角が大きいため、光学系に入射する回折光束が少なくなる。しかし最低２つの回折光束を入射させないと標本面上に構造化照明のパターンを形成できない。一方、２光束の干渉でできる干渉パターンは強度分布が正弦波状である。

したがって構造化照明は、２光束干渉で形成すると都合がよい。０次光と１次光の２光束を光軸に対称に発生させて、標本１１上で干渉させれば２光束干渉が実現できる。そのためには、照明光は回折格子面に対し斜めに入射する必要がある。その入射角は、回折格子の１次回折角をθｇとすると、θｇ／２である。照明光を傾けるためには、ファイバ端を所定量シフトすればよいが、その方向は回折格子の格子パターンと直交する方向で、その量は、（１）式で表せる。（１）式は、光源１がランプ光源、レーザ光源いずれであっても、また、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃが位相型、濃度型のいずれであっても同じ式が当てはまる。

さて、構造化照明された光を励起光として標本１１上では蛍光が発生する。このときに対物レンズ１０側から見た標本１１の構造は、構造化照明により変調されている。変調された構造には、モアレ縞が生じている。このモアレ縞は、標本１１が有する微細構造と構造化照明のパターンとが成すモアレ縞であり、標本１１の微細構造が、構造化照明の空間周波数の分だけ低い空間周波数帯域に変換されている。よって、解像限界を超える高い空間周波数の構造の光までもが、対物レンズ１０によって捉えられることになる。

対物レンズ１０によって捉えられた蛍光は、対物レンズ１０、ガルバノミラーＭ２及び第２対物レンズ９からなる結像光学系により、共役面２２ａ、２２ｂ、２２ｃのいずれかの上に標本１１の変調像を形成するが、蛍光の通る経路は照明光が通る経路と同じ（向きは逆）とされている。その変調像は、その共役面２２ａ、２２ｂ、２２ｃに配置された回折格子８ａ、８ｂ、８ｃによって再変調される。このようにして生じた再変調像では、空間周波数を変化させた標本１１の構造が、元の空間周波数に戻される。この再変調像に、標本１１の復調像が含まれている。

但し、この再変調像には、復調像にとって不要な回折成分が含まれている。不要な回折成分とは、標本１１から射出された０次回折光に対し回折格子８ａ、８ｂ、８ｃで生じた±１次回折成分、標本１１から射出された−１次回折光に対する０次回折成分、標本１１から射出された＋１次回折光に対する０次回折成分である。これらの不要な回折成分を再変調像から除去するためには、回折格子８を１周期分若しくはＮ周期分（Ｎは自然数）動かして平均化すればよい。

再変調像からの蛍光は、レンズ７ａ、７ｂ、７ｃのいずれか（照明光が通っているもの）を介してガルバノミラーＭ１により反射され、ダイクロイックミラー５を透過した後、観察光学系の単独光路へ入り、バリアフィルタ６を透過したのち、レンズ１２を介して再変調像の拡大像２４を形成する。つまり、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃで再変調された再変調像は、レンズ７ａ、７ｂ、７ｃ及びレンズ１２を主要光学要素とするリレー光学系によって、拡大像２４へとリレーされる。この拡大像２４は、撮像装置２５によって撮像され、再変調像の画像データが生成される。なお、撮像装置２５で撮像する場合、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃを１周期若しくはＮ周期（Ｎは自然数）動かしている間、再変調像を蓄積することによって平均化すれば、復調像の画像データを得ることができる。

この画像データは、標本１１を構造化照明によって超解像観察するための情報を含む。その画像データは、制御・演算装置４２によって取り込まれ、演算が施されてから、画像表示装置４３へと送出される。
以上、本顕微鏡装置は、標本１１の共役面２２ａ、２２ｂ、２２ｃから標本１１までの光路を照明光学系と観察光学系とで完全に共通光路にすると共に、その共役面２２ａ、２２ｂ、２２ｃに回折格子８ａ、８ｂ、８ｃを配置している。本顕微鏡装置ではこの回折格子８ａ、８ｂ、８ｃにより、標本１１の微細構造の変調を図る。そして、変調された標本１１の微細構造は、この位置に配置された回折格子８ａ、８ｂ、８ｃにより、自動的に再変調される。

なお、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃは、アクチュエータ（図示せず）によって格子線に直交する方向へ移動可能である。この移動により、構造化照明の位相が変化する。制御・演算装置４２がアクチュエータ４０及び撮像装置２５を制御し、１フレーム分の画像データを蓄積している間にその位相を１周期分若しくはＮ周期分（Ｎは自然数）だけ変化させることで、その画像データから、構造化照明のパターンと、再変調時に生じた不要な回折成分とを消去する。

回折格子８ａ、８ｂ、８ｃをＳＬＭ（空間光変調素子：Spatial Light Modulator）により構成し、その画素のオン・オフ（透過、不透過）により格子パターンを形成するようにしておけば、回折格子ａ、８ｂ、８ｃを機械的に移動させなくても、構造化照明の位相を変化させることができるので好ましい。

以上の実施の形態は、回折格子と共役な位置に標本を置き、照明光学系により回折格子の像を標本上に作製すると共に、標本の像を同じ回折格子状に形成することによって像の復調を行う方式の顕微鏡装置に関するものであった。しかしながら、本発明は、特許文献１に記載されるような、回折格子と共役な位置に標本を置き、照明光学系により回折格子の像を標本上に作製すると共に、標本の像を撮像し、計算によって像の復調を行う方式の顕微鏡装置にも適用できる。

その例を図８に示す。図８において、図７に示された構成要素と同じ構成要素には、同じ符号を付してその説明を省略する。図８においては、光源として光ファイバＬＧの端面から放出される光が使用されている。その他の照明光学系は、図９に示したものとほぼ同じであるが、励起フィルタ４とダイクロイックミラーがガルバノミラーＭ２の後段に設けられている点が異なっている。しかしながら、この照明光学系の作用が、図７に示したものと同じであることは説明を要しないであろう。

標本１１から発生する蛍光は、対物レンズ１０を通してダイクロイックミラー５で偏向され、バリアフィルタ６を通して、レンズ１２により、標本１１の拡大像２４を撮像装置２５上に形成する。制御・演算装置４２は、この拡大像２４を取り込み、特許文献１に記載されるような演算を行って、標本１１の超解像の画像を得る。

この場合も、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃによって、標本１１上に形成される格子パターンは、その格子線の方向が６０°ずつずれている。よって、ガルバノミラーＭ１、Ｍ２によって光路を切り換え、回折格子８ａ、８ｂ、８ｃを切り換えて使用することにより、回折格子８を１２０°ずつ回転させて測定を行ったのと同じ効果が得られる。ガルバノミラーＭ１、Ｍ２の駆動は高速で行えるので、高速な測定が可能となる。

先願発明の実施の形態である顕微鏡装置の概略構成図である。 先願発明の実施の形態である顕微鏡装置における観察光学系ＬＳ２の標本１１からレンズ７までの結像光束の開口数を説明する図である。 先願発明の実施の形態である顕微鏡装置における観察光学系ＬＳ２の標本１１からレンズ７までの結像光束の開口数を説明する図である。 先願発明の実施の形態中の、制御・演算装置４２の演算に関する動作フローチャートである。 図４中のステップＳ２１を説明する図である。 図４中のステップＳ２２を説明する図である。 本発明の第１の実施の形態である顕微鏡装置の概要を示す図である。 本発明の第２の実施の形態である顕微鏡装置の概要を示す図である。

符号の説明

１…光源、２…コレクタレンズ、３…レンズ、４…励起フィルタ、５…ダイクロイックミラー、６…バリアフィルタ、７、７ａ〜７ｃ…レンズ、８、８ａ〜８ｃ…回折格子、９、９ａ〜９ｃ…第２対物レンズ、１０…対物レンズ、１１…標本、１２…レンズ、２２ａ〜２２ｃ…共役面、２３…回折格子８の像、２４…拡大像、２５…撮像装置、３１…光源像（瞳共役面）、３１ａ，３１ｂ…ミラー、３２…光源像（瞳共役面）、３３…瞳共役面、４２…制御・演算装置、４３…画像表示装置、Ｍ１，Ｍ２…ガルバノミラー、ＬＧ…光ファイバ

Claims (5)

1. 複数の光路を含み、各光路中に各々置かれた回折格子の像を被観察物の表面に結像させて照明を行う照明光学系と、前記照明光学系により照明された前記被観察物の像を、前記回折格子上に中間像として結像させる結像光学系と、前記中間像の像を形成するリレー光学系とを備えた顕微鏡装置であって、前記複数の回折格子は、互いに格子パターンの向きが異なり、前記照明光学系は、さらに光源からの光を前記複数の光路のうちの任意の光路に切り換えて導き、その光路中に配置された回折格子へ導く第１の照明光路切り換え手段と、前記第１の照明光路切り換え手段に同期して、照明された回折格子からの光を前記被観察物の表面へ導く第２の照明光路切り換え手段とを有し、前記結像光学系は、さらに前記被観察物からの光を前記照明された回折格子へ導く第１の観察光路切り換え手段と、前記第１の観察光路切り換え手段に同期して、前記照明された回折格子からの光を前記リレー光学系へ導く第２の観察光路切り換え手段とを備えたことを特徴とする顕微鏡装置。
2. 少なくとも前記第１の照明光路切り換え手段から前記被観察物に至る前記照明光学系を構成する光学素子と、前記被観察物から第２の観察光線光路切り換え手段に至る前記結像光学系を構成する光学素子が共用されており、前記第１の照明光路切り換え手段と前記第２の観察光線光路切り換え手段が同一であり、かつ、前記第２の照明光路切り換え手段と前記第１の観察光線光路切り換え手段とが同一であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 複数の光路を含み、各光路中に各々置かれた回折格子の像を被観察物の表面に結像させて照明を行う照明光学系と、前記照明光学系により照明された前記被観察の像を結像させる結像光学系とを備えた顕微鏡装置であって、前記複数の回折格子は、互いに格子パターンの向きが異なり、前記照明光学系は、光源からの光を前記複数の光路のうちの任意の光路に切り換えて導き、その光路中に配置された回折格子へ導く第１の照明光路切り換え手段と、前記第１の照明光路切り換え手段に同期して、照明された回折格子からの光を前記被観察物の表面へ導く第２の照明光路切り換え手段とを備えたことを特徴とする顕微鏡装置。
4. 前記回折格子が、透過もしくは反射型の空間光変調素子であることを特徴とする請求項１から請求項３のうちいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
5. 前記顕微鏡装置は、前記リレー光学系によって形成された像を撮像する撮像装置と、前記被観察物の表面に結像する前記回折格子の像の格子パターンの位相を変化させる位相変調手段とを備え、前記撮像装置の撮像時間は、前記格子パターンの位相Ｎ周期分（Ｎは自然数）であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。

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