JP5168943B2 - エプスタイン・バー・ウィルス核抗原2共活性化因子p100の検出による癌の検査方法および検査試薬 - Google Patents
エプスタイン・バー・ウィルス核抗原2共活性化因子p100の検出による癌の検査方法および検査試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5168943B2 JP5168943B2 JP2007049849A JP2007049849A JP5168943B2 JP 5168943 B2 JP5168943 B2 JP 5168943B2 JP 2007049849 A JP2007049849 A JP 2007049849A JP 2007049849 A JP2007049849 A JP 2007049849A JP 5168943 B2 JP5168943 B2 JP 5168943B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cancer
- antibody
- coactivator
- ebna2 coactivator
- ebna2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
Description
[1] エプスタイン・バー・ウィルス核抗原2 共活性化因子p100(Epstein-Barr virus nuclear antigen 2 Co-activator p100(EBNA2 共活性化因子 p100))を検出することによる癌の検査方法。
[2] EBNA2 共活性化因子 p100に対する抗体を用い、免疫化学的にEBNA2 共活性化因子 p100の検出を行う、[1]の検査方法。
[3] 前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、[1]又は[2]の検査方法。
[4] 前記抗体が少なくともEBNA2 共活性化因子 p100(Swiss Plot accession number Q7KZF4)のアミノ酸配列423〜440領域
RPASPATETVPAFSERTC (配列番号1)もしくは
アミノ酸配列806〜819領域
DDDARTDAVDSVVR (配列番号2)
又はその部分配列を認識することを特徴とする、[1]〜[3]のいずれかの検査方法。
[5] 前記抗体を検体と接触させ、検体中の抗原に結合した又は結合しなかった抗体を検出する、[2]〜[4]のいずれかの検査方法。
[6] 前記抗体を検体と接触させ、検体中の抗体に結合した又は結合しなかった抗原を検出する、[2]〜[4]のいずれかの検査方法。
[7] 前記検出が酵素標識、アイソトープ標識又は蛍光標識を利用した競合法、サンドイッチ法、蛍光偏光法を利用したホモジニアス測定法、表面プラズモン共鳴分析法を利用した結合測定からなる群から選択されるいずれかの方法によるものであることを特徴とする、[2]〜[6]のいずれかの検査方法。
[8] 前記検出が酵素標識、アイソトープ標識又は蛍光標識を利用した免疫組織化学的手法であることを特徴とする、[2]〜[7]のいずれかの検査方法。
[9] 前記検出に用いる検体がヒト細胞、ヒト組織あるいはそれらの抽出物を含む検体であることを特徴とする、[1]〜[8]のいずれかの検査方法。
[10] 前記癌が前立腺癌であることを特徴とする、[1]〜[9]のいずれかの検査方法。
[11] 前記癌がラテント癌を含まない主要癌であることを特徴とする、[1]〜[10]のいずれかの検査方法。
[12] [1]〜[11]のいずれかの癌の検査を実施するためのEBNA2 共活性化因子 p100検査試薬。
[13] 前記検出がEBNA2 共活性化因子 p100遺伝子を検出することによる、[1]の検査方法。
[14] 前記検出がヒト検体中の遺伝子を材料にポリメラーゼ連鎖反応を用い、遺伝子増幅した産物を検出することを特徴とする、[13]の検査方法。
[15] 前記遺伝子の検出がヒト検体に対しin situ ハイブリダイゼーションを用いることを特徴とする、[13]の検査方法。
[16] 前記癌が前立腺癌であることを特徴とする、[13]〜[15]のいずれかの検査方法。
[17] [13]〜[16のいずれか項記載の癌の検査方法を実施するためのEBNA2 共活性化因子 p100遺伝子検出用試薬。
[18] EBNA2 共活性化因子 p100に対する抗体を用いた癌の治療方法。
[19] EBNA2 共活性化因子 p100遺伝子発現を制御することによる癌の治療方法。
[20] 前記制御が、EBNA2 共活性化因子 p100遺伝子を特異的にノックダウンすることによる、[19]の治療方法。
[21] 前記特異的遺伝子のノックダウンがsiRNAによることを特徴とする、[20]の癌の治療方法。
[22] 前記癌が前立腺癌であることを特徴とする、[18]〜[21]のいずれかの療方法。
[23] EBNA2 共活性化因子 p100に対する抗体を含有する、癌の治療のための医薬組成物。
[24] 前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、[23]の医薬組成物。
[25] 前記抗体が少なくともEBNA2 共活性化因子 p100(Swiss Plot accession number Q7KZF4)のアミノ酸配列423〜440領域
RPASPATETVPAFSERTC (配列番号1)もしくは
アミノ酸配列806〜819領域
DDDARTDAVDSVVR (配列番号2)
又はその部分配列を認識することを特徴とする、[23]又は[24]の医薬組成物。
[26] 前記癌が前立腺癌であることを特徴とする、[23]〜[25]のいずれかの医薬組成物。
[27] 前記癌がラテント癌を含まない主要癌であることを特徴とする、[23]〜[26]のいずれかの医薬組成物。
[28] EBNA2 共活性化因子 p100遺伝子発現を制御できるsiRNAを含有する、癌の治療のための医薬組成物。
[29] 前記癌が前立腺癌であることを特徴とする、[28]の医薬組成物。
EBNA2 共活性化因子 p100アミノ酸配列423−440(RPASPATETVPAFSERTC)(配列番号1)のペプチドを合成、システイン残基を利用してマレイミド活性化KHLと結合させたものを免疫源とし、ウサギ皮下にアジュバントと共に2週間おきに8回の接種を行なった。全血清を採取後、抗血清中の目的抗体価をELISA法(enzyme linked immunosorbent assay)で抗原ペプチドとの反応力価を確認した。抗血清からの目的抗体の精製のため、抗血清を50%飽和硫酸アンモニウムにて沈殿濃縮後、プロテインG固定化カラムにてIgG画分を回収した。さらに抗原ペプチドを固定したカラムにてアフィニティー精製を行うことにより目的抗体の精製取得を行い、以下の実験に使用した。
癌細胞株としてアンドロゲン依存性および非依存性前立腺癌細胞を調整した。アンドロゲン依存性ヒト前立腺癌細胞として市販されているLNCaP細胞株(American Type Culture Collection(ATCC), Rockville, MD, USA)を用い、該LNCaP細胞株を、ウシ胎仔血清10%を含有する培養培地(例えば、Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium)中で維持、培養した後、該培養LNCaP細胞1x107個を0.1mlマトリゲル(Matrigel, Becton Dickinson Labware, NJ, USA)に混入して、雄ヌードマウス(BALB/c strain)の皮下に接種し、腫瘍が100から200mm3になったところで、精巣を摘除した。該腫瘍は一次的に縮小するが、まもなく再増殖を始めた。このときの精巣摘除前の腫瘍をアンドロゲン依存性前立腺癌、精巣摘除後に再増殖した腫瘍をアンドロゲン非依存性前立腺癌として用いた。本癌組織を各2匹のマウスより取得した。本癌組織を還元条件下、電気泳動を行なった後、ポリフッ化ビニリデン膜に転写し、抗EBNA2 共活性化因子ポリクローナル抗体にてウェスタンブロッティングにより検出した。その結果を図1に示す。アンドロゲン依存性癌組織ならびに非依存性癌組織いずれの検体においてもEBNA2 共活性化因子が同程度検出された。また、EBNA2 共活性化因子はアンドロゲン依存性獲得に伴う発現量の大きな変化は確認されなかった。
ヒト正常前立腺組織と前立腺癌組織は、手術を施した患者の摘除検体から採取した。主として、神奈川県相模原市にある北里大学病院泌尿器科で手術を受けた患者から同意を得て採取されたものである。正常組織2検体ならびに前立腺癌組織2検体をサンプルとし実施例2と同様に抗EBNA2 共活性化因子ポリクローナル抗体にてウェスタンブロッティングにより検出した。その結果を図2に示す。正常組織に比較し、前立腺癌組織において発現量の上昇が確認された。
実施例3同様に、ヒト前立腺正常組織3検体、ヒト前立腺癌組織3検体、前立腺癌細胞株3検体に対し、5’-tcatcaagatggtcctctca-3’(配列番号3)および5’-cttaatacgactcactatagggtgcaatgttttccccattgg-3’(配列番号4)をプライマーに用いRT-PCRにてmRNAの発現量の確認を行なった。その結果を図3に示す。前立腺癌組織2検体で強いmRNAの発現が確認され、正常組織1検体においても弱いながらmRNAの発現が確認された。また、前立腺癌細胞株においては全てのサンプルで強いmRNAの発現が確認された。
図3は正常組織をレーン1〜3に、前立腺癌組織をレーン4〜6に、前立腺癌細胞株をレーン7〜9に用い、RT-PCRにてmRNA発現の確認を行なった結果を示す。上段はEBNA2 共活性化因子のmRNA発現を、下段は各処理サンプル量に差がないことを確認する目的でアクチンを内部標準として検出した結果を示す。
EBNA2 共活性化因子 p100に対する相補的プライマー配列にT7 プロモーター配列を付加した5’-tcatcaagatggtcctctca-3'(配列番号3)および5’-cttaatacgactcactatagggtgcaatgtttt ccccattgg-3’ (配列番号4)を用いてOne step RT-PCR kit(QIAGEN)でRT-PCRによるEBNA2 共活性化因子 p100遺伝子を増幅した後PCR産物の取得、精製を行なった。PCR産物をDIG RNA ラベリングキット(Roche)を用いてイン・ビトロ転写を行い、EBNA2 共活性化因子 p100検出用cRNAプローブを作製した。10%ホルマリン固定パラフィン包埋切片をキシレン及び下降エタノール系列に処理して脱パラフィン後、10μg/mlのプロテイナーゼ Kで賦活化し、その後4%パラホルムアルデヒドで固定した後、0.2N HCl、0.25%無水酢酸/トリエタノールアミンで処理を行った。3%過酸化水素水を用いて内因性ペルオキシダーゼ不活化処理を行い、上昇エタノール系列後、風乾したものを検体とした。先に作製したcRNAプローブを50℃にて一昼夜反応させ、0.5%カゼインを含む緩衝液にてブロッキング処理後、ウサギ F(ab’) DIG/HRP抗体(400倍希釈、Dako Japan)を15分間反応させた。ビオチニルチラミドで処理した後、ストレプトアビジン−HRP(500倍希釈、Dako Japan)を反応させて、ジアミノベンジジンにて可視化した。ヘマトキシリンで核染色を行い、流水水洗後、脱水、透徹、封入操作を行ない染色像の観察を行った。その結果を図4に示す。主要癌組織(advance cancer)およびラテント癌(insignificant cancer)いずれの細胞においてもmRNAの発現を確認した。また、正常細胞においては明らかなmRNAの染色像は確認されず、前立腺癌の検出に本方法が有効であることが確認された。
前立腺癌組織をホルマリン固定パラフィン包埋した標本をキシレンおよび下降エタノール系列にて脱パラフィンし、10 mMクエン酸緩衝液(pH 6.0)で電子レンジを用いて10分間煮沸して抗原の賦活化を行う。組織サンプルと抗EBNA2 共活性化因子 p100抗体およびAMACR抗体(DAKO 、P504S)は4℃にて一昼夜反応を行い、抗原に結合した抗体検出のためのペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体を反応後、DABを用いて染色した。その結果を図5に示す。前立腺主要癌細胞において抗EBNA2 共活性化因子 p100抗体およびAMACR抗体いずれにおいても前立腺癌細胞特異的に強い染色像が確認された。
実施例6同様、前立腺癌組織サンプルと抗EBNA2 共活性化因子 p100抗体およびAMACR抗体は4℃にて一昼夜反応を行い、抗原に結合した抗体検出のためのペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体を反応後、ジアミノベンジジンを用いて染色した。その結果を図6に示す。同一患者切片におけるラテント癌細胞において抗EBNA2 共活性化因子 p100抗体では染色像は認められずAMACR抗体においてのみ前立腺癌細胞特異的に強い染色像が確認された。
EBNA2共活性化因子p100アミノ酸配列424-439(PASPATETVPAFSERT)(配列番号1)のアミノ末端にシステインを付加したCPASPATETVPAFSERTおよびアミノ酸配列806-819(DDDARTDAVDSVVR)(配列番号2)カルボキシ末端にシステインを付加したDDDARTDAVDSVVRCの合成ペプチドのシステイン残基を利用してマレイミド活性化KLHに結合させたものを抗原として、マレイミド活性化BSAに結合させたものをスクリーニング用抗原として調製した。ウィスター・ルイス・ラット7週令メスに対し、ペプチド付加KLH抗原250μgをフロイントの完全アジュバントと共に後足にエーテル麻酔下にて免疫を行なった。1ヵ月後、ラットより鼠頚リンパ節ならびに腸骨リンパ節を採取し、B細胞を回収した。マウスミエローマ細胞株PAIとポリエチレングリコール存在下、細胞融合を常法に従い行い、約10日間のHAT培地による選択を行なった。スクリーニング陽性ウェル中の細胞を限界釈放法にてモノクローナル化を行い、ハイブリドーマとして樹立した。この際、HT培地にて約10日間の培養を行った後、最終的にハイブリドーマ用培地にて培養を続け、抗体回収のために培養上清を回収した。培地はGIT培地(大日本住友製薬)500mLに対し、NCTC-109 培地(インビトロジェン)27.5 mL、不必須アミノ酸(インビトロジェン)5.5mL、ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン酸(インビトロジェン)5.5mLをろ過滅菌し添加したものをハイブリドーマ細胞培養用培地とした。本培地にHAT(Sigma-Aldrich Co.,HYBRYMAX、Cat.No.H0262)を添加したものをHAT培地として、HT(Sigma-Aldrich Co., HYBRYMAX、Cat.No.H0137)を添加したものをHT培地として用いた。ハイブリドーマのスクリーニングはペプチド付加BSAを96穴イムノプレート(Griener, Cat.No. 655001)に 50 ng/well にてコーティングした。具体的にはペプチド付加BSAをTBSにて希釈し1 μg/mL 溶液を調製した。本溶液を 50μL/wellにてイムノプレートに添加し、4℃にて一昼夜保存する。続いてTBSにて3回の洗浄後、3%-ウシ血清アルブミン(BSA;bovine serum albumin)を含むTBS溶液を250 μL/well にて添加し室温2時間放置した。TBSにて3回洗浄を行い、ハイブリドーマ細胞の培養上清を50μL/wellにて添加し、室温2時間放置する。TBSTにて4回洗浄を行なった後、0.2μg/mL HRP標識抗ラットIgG抗体および1% BSAを含むTBSTを50μL/wellにて添加し室温2時間放置した。TBSTにて4回洗浄を行ない、TMB 基質(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Cat.No.50-76-00)を50μl/wellで添加し室温30分放置後、1N-リン酸にて反応を停止しOD450の吸光度を測定した。反応性を示したものを陽性クローンとして選択し、限界希釈にてモノクローナル抗体の樹立を行った。
LNCap細胞を5% FCS、100単位/mL ペニシリン、100μg/mL ストレプトマイシンを含むDullbecco’s Modified Eagle Media(インビトロジェン)にて培養した。約1×107 細胞を回収し、RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いマニュアルに従いRNAを回収した。EBNA2共活性化因子P100のクローニングには5’ 側プライマーとしてEBNA2共活性化因子P100をコードする塩基配列にBamHI切断配列を添加した5’-catggatcctatggcgtcctccgcgcagagcggcg-3’(配列番号5)を使用し、3’側プライマーとしてEBNA2共活性化因子P100をコードする塩基配列にXbaI切断配列を付加した5’-ggctctagactagcggctgtagccaaattcgtctg-3(配列番号6)を使用し、OneStep RT-PCR Kit(QIAGEN)を用いマニュアルに従いEBNA2共活性化因子P100のcDNAを調製した。調製したcDNAをプライマーに付加した制限酵素BamH I ならびにXbaI切断部位を利用し切断し、pUC18ベクターのマルチクローニングサイトのBamH I ならびにXba Iを制限酵素にて切断したものに対しライゲーションを行ない目的のプラスミドを調製した。得られたEBNA2共活性化因子P100遺伝子の全長配列をABI PRISM(登録商標) 310 genetic analyzer(Applied Biosystems)にて確認した。大腸菌での蛋白質発現を目的にEBNA2共活性化因子P100のアミノ酸配列1-410残基に相当する目的遺伝子断片を取得するためのプライマーとして5’-catggatccatggcgtcctccgcgcagagcggcg-3’ (配列番号7)および5’-tcttcccaataagcttttttcgaag-3’ (配列番号8)を使用し、アミノ酸配列411-910残基に対するプライマーとして5’-aatttcttcgaaaaaagcttattgggaag-3’ (配列番号9)および5’-ggctctagactagcggctgtagccaaattcgtctg-3(配列番号10)を使用した。EBNA2共活性化因子P100遺伝子を含むpUC18をテンプレートとしてPCRを行い遺伝子フラグメントEBF1(アミノ酸配列1-410残基に対応)およびEBF2(アミノ酸配列411-910残基に対応)を得た。得られたEBF1およびEBF2のPCRプロダクトをそれぞれBamHI/HindIII 、HindIII /XbaIにて制限酵素処理した後、同様にBamHI/HindIII 、HindIII /XbaIで制限酵素処理したpCold TF ベクターにライゲーションにより導入した。取得したpCold-EBF1ならびに pCold-EBF2 プラスミドは遺伝子配列確認後、大腸菌株JM109に形質転換し蛋白質発現用大腸菌として用い蛋白質発現を実施した。蛋白質発現はpCold-EBF1ならびに pCold-EBF2を形質転換した大腸菌株を50μg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて吸光度600nmが0.5になるまで37℃にて培養した。その後15℃にて30分間静置後最終濃度1mMになるようイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシドを添加し24時間培養した。培養終了後、遠心分離により大腸菌を回収し、4mMのフェニルメチルスルフォニルフルオリド、0.1% Tween-20 を含むTBS(10mM-Tris-HCl、150mM NaCl、pH7.4)中にて超音波処理した後、遠心分離により溶液画分を回収した。発現した蛋白質はポリヒスチジン配列を有するトリガー蛋白質との融合蛋白質として発現されるためポリヒスチジンを利用した金属キレートカラムで精製が可能である。具体的には溶液画分を0.45μmのフィルターにて細胞破砕物などの沈殿物を除去した。HiTrap Chelating HP (GEヘルスケア)に、50mMのNiCl2溶液を5mL添加しニッケルを結合さた。15mLの純水にて洗浄後、0.5 M NaCl、0.1% Tween-20を含む20mMリン酸緩衝溶液、pH 7.4にてカラムを平衡化した。目的蛋白質を含むサンプルを0.5 M NaCl、0.1% Tween-20を含む20mMリン酸緩衝溶液、pH 7.4になるよう調製した後カラムにロードした。0.5 M NaCl、10mM イミダゾール、0.1% Tween-20を含む20mMリン酸緩衝溶液、pH 7.4の洗浄液で未結合物質を洗浄し、カラム通過溶液の280nmの吸光度が0.01以下になったことを確認した。0.5 M NaCl、500mM イミダゾール、0.1% Tween-20を含む20mMリン酸緩衝溶液、pH 7.4にて目的物をカラムから溶出した。精製した蛋白質は目的蛋白質であるEBF1(分子量46kDa)、EBF2(分子量56kDa)とトリガー蛋白質(分子量52kDa)との融合蛋白質となるためそれぞれ98kDa、108kDaの分子量が予想されSDS-PAGEにより予想分子量を示していることが確認された。その結果を図7に示す。
大腸菌にて発現させたpCold-EBF1ならびにpCold-EBF2に対する抗体の反応性をウェスタンブロッティングにより確認した。1μg/レーンにて精製蛋白質を還元条件化SDS-PAGEを行った後、PVDF膜に転写し、PVDF膜は3%スキムミルクを含むTBSにて一昼夜ブロッキング処理を行った。TBSにて洗浄後、1μg/mLの抗EBNA2共活性化因子P100抗体を含む1% ブロックエース-TBSTと2時間反応させた後、0.3μg/mLアルカリ性ホスファターゼ標識抗ラットIgG抗体(American Qualex社製;Cat.No.A103AT)を含む1% ブロックエース-TBSTあるいは、0.3μg/mLアルカリ性ホスファターゼ標識抗ウサギIgG抗体(Zymed社製)を含む1% ブロックエース-TBSTを添加した。2時間反応後、TBSTにて十分洗浄し、NBT/BCIP(PIERCE社製)にて発色により検出した。その結果を図8に示す。本結果より、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれもEBNA2共活性化因子P100と強い反応性を示すことが確認された。
実施例1にて取得したポリクローナル抗体および市販AMACR抗体(DAKO 、P504S)を用い多様な前立腺癌病理サンプルの免疫組織染色を実施例6に従い実施し、検体採取患者病態との関連性を調査した。免疫組織染色強度を図9に示すとおり0(染色像なし)、+1(弱染色像)、+2(中染色像)、+3(強染色像)の4段階に分類し、病理診断分類、PSA濃度、グリーソンスコア、pathological T Stage 分類との因果関係をEBNA2共活性化因子P100およびAMACRの比較にて比較検証した結果を示す。
Tissue array (US Biomax, Inc、Rockville, MD, USA)を用い、実施例6に記載の方法に従い各種癌組織の免疫組織染色を実施した。図15に示すとおり、前立腺癌、肺扁平上皮癌、大腸腺癌、胃腺癌、乳癌、皮膚黒色腫、脳星状細胞腫にて染色像を観察した。その染色強度を実施例11に従い分類した結果を図16に示す。前立腺癌、大腸癌で染色強度+2、肺癌、胃癌、乳癌、皮膚癌、脳腫瘍で染色強度+1、卵巣癌、食道癌、子宮頚癌、腎癌、肝癌では染色像を認めなかった。
前立腺癌細胞 PC3 に対し、siRNA2種を用い細胞増殖能の制御が可能であるかMTT assayにて抗腫瘍活性試験を実施した。具体的には、PC3 細胞を5×105cells/ウェルにて96穴プレートにて培養し、翌日DharmaFECT 2(GEヘルスサイエンス)を用いsiRNAを10pmol/ウェルにて遺伝子導入する。未処理群(Untreated)、siRNAを使用せず遺伝子導入操作を実施した群(Mock)、本試験とは無関係のsiRNAを用いた群(Nega)、siRNAを用いた2群(Si-1,Si-3)で処理開始後、2,3,4日目の細胞をMTT assay(Chemicon International, Inc.)にて細胞生存率を吸光度570nmにて検証した。Si-1、Si-3のそれぞれのセンス、アンチセンス配列は、Si-1 センス配列GGGAGAACACCCAGGAUAATT(配列番号11)、Si-1アンチセンス配列UUAUCCUGGGUGUUCUCCCTT(配列番号11)、Si-3センス配列CCGCAAAGCAGAAGAAAGATT(配列番号11)、Si-3 アンチセンス配列UCUUUCUUCUGCUUUGCGGTT(配列番号11)である。その結果、図17に示すとおりSi-1、Si-3 siRNAを用いた細胞で細胞増殖が強く抑制された。
Claims (7)
- ラテント癌を含まない主要癌を検出するために、エプスタイン・バー・ウィルス核抗原2 共活性化因子p100(Epstein-Barr virus nuclear antigen 2 Co-activator p100(EBNA2 共活性化因子 p100))(Swiss Plot accession number Q7KZF4)のアミノ酸配列423〜440領域
RPASPATETVPAFSERTC (配列番号1)
又はその部分配列からなるポリペプチドを動物に免疫して得られた抗血清より精製して得られた、当該配列又はその部分配列を認識する抗体を用い、免疫化学的に正常検体に対するEBNA2 共活性化因子 p100発現量の上昇を検出する方法。 - 前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記抗体を検体と接触させ、検体中の抗原に結合した又は結合しなかった抗体を検出する、請求項1又は2記載の方法。
- 前記検出が酵素標識、アイソトープ標識又は蛍光標識を利用した競合法、サンドイッチ法、蛍光偏光法を利用したホモジニアス測定法、表面プラズモン共鳴分析法を利用した結合測定からなる群から選択されるいずれかの方法によるものであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 前記検出が酵素標識、アイソトープ標識又は蛍光標識を利用した免疫組織化学的手法であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 前記検出に用いる検体がヒト細胞、ヒト組織あるいはそれらの抽出物を含む検体であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 前記癌が前立腺癌であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007049849A JP5168943B2 (ja) | 2006-09-15 | 2007-02-28 | エプスタイン・バー・ウィルス核抗原2共活性化因子p100の検出による癌の検査方法および検査試薬 |
DE602007003648T DE602007003648D1 (de) | 2006-09-15 | 2007-09-13 | Verfahren und Zusammensetzung zur Krebserkennung mittels Detektion des Epstein-Barr-Virus-Kernantigen-2-Koaktivators p100 |
EP07017947A EP1901070B1 (en) | 2006-09-15 | 2007-09-13 | Method and composition for detecting cancer by means of detection of Epstein-Barr virus nuclear antigen 2 coactivator p100 |
US11/856,107 US7939269B2 (en) | 2006-09-15 | 2007-09-17 | Method and composition for detecting cancer by means of detection of Epstein-Barr virus nuclear antigen 2 coactivator P100 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006250895 | 2006-09-15 | ||
JP2006250895 | 2006-09-15 | ||
JP2007049849A JP5168943B2 (ja) | 2006-09-15 | 2007-02-28 | エプスタイン・バー・ウィルス核抗原2共活性化因子p100の検出による癌の検査方法および検査試薬 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008096417A JP2008096417A (ja) | 2008-04-24 |
JP5168943B2 true JP5168943B2 (ja) | 2013-03-27 |
Family
ID=38805735
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007049849A Active JP5168943B2 (ja) | 2006-09-15 | 2007-02-28 | エプスタイン・バー・ウィルス核抗原2共活性化因子p100の検出による癌の検査方法および検査試薬 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7939269B2 (ja) |
EP (1) | EP1901070B1 (ja) |
JP (1) | JP5168943B2 (ja) |
DE (1) | DE602007003648D1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012070970A1 (ru) * | 2010-11-22 | 2012-05-31 | Farber Boris Slavinovich | Диагностический способ для прогноза развития и контроля эффективности лечения онкологических заболеваний |
WO2012070969A1 (ru) * | 2010-11-22 | 2012-05-31 | Farber Boris Slavinovich | Диагностический способ для прогноза развития и контроля эффективности лечения сердечно-сосудистых заболеваний |
EP3209335A1 (en) * | 2014-10-21 | 2017-08-30 | Hernández Hincapié, Frank J. | Agents for use in the detection of nuclease activity |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6255049B1 (en) * | 1998-02-27 | 2001-07-03 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Detection of metastatic cancer cells using PCTA-1 |
US20050014165A1 (en) * | 2003-07-18 | 2005-01-20 | California Pacific Medical Center | Biomarker panel for colorectal cancer |
JP2005080524A (ja) * | 2003-09-05 | 2005-03-31 | Japan Science & Technology Agency | 前立腺癌マーカポリペプチド、該ポリペプチドに対する抗体、及び該ポリペプチドを利用した前立腺癌の診断方法 |
WO2006013013A2 (en) * | 2004-08-04 | 2006-02-09 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with protective protein for beta-galactosidase (ppgb) |
JP2006174704A (ja) * | 2004-12-20 | 2006-07-06 | Japan Health Science Foundation | Ebウイルス核抗原−2に対するモノクローナル抗体 |
-
2007
- 2007-02-28 JP JP2007049849A patent/JP5168943B2/ja active Active
- 2007-09-13 EP EP07017947A patent/EP1901070B1/en active Active
- 2007-09-13 DE DE602007003648T patent/DE602007003648D1/de active Active
- 2007-09-17 US US11/856,107 patent/US7939269B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20080069819A1 (en) | 2008-03-20 |
JP2008096417A (ja) | 2008-04-24 |
EP1901070A2 (en) | 2008-03-19 |
EP1901070A3 (en) | 2008-05-21 |
US7939269B2 (en) | 2011-05-10 |
EP1901070B1 (en) | 2009-12-09 |
DE602007003648D1 (de) | 2010-01-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20180362626A1 (en) | csPCNA Isoform Antibodies And Uses Thereof | |
US9429577B2 (en) | Anti-uroplakin II antibodies systems and methods | |
JP5941615B2 (ja) | ヒトcxcl1タンパク質の免疫学的測定方法 | |
DK3054298T3 (en) | METHOD OF DETECTING TUMOR IN THE ARC | |
US20140004542A1 (en) | Systems and Methods for Anti-PAX8 Antibodies | |
JP5168943B2 (ja) | エプスタイン・バー・ウィルス核抗原2共活性化因子p100の検出による癌の検査方法および検査試薬 | |
JP2018520127A (ja) | Mcm5に結合するモノクローナル抗体 | |
KR101374758B1 (ko) | 항-사이토케라틴 8/18 복합체 자가면역항체를 포함하는 암 진단 마커 및 이의 항원을 포함하는 암 진단용 조성물 | |
KR101439856B1 (ko) | 항-atic 자가면역항체를 포함하는 간암 진단 마커 및 이의 항원을 포함하는 간암 진단용 조성물 | |
JPWO2009044561A1 (ja) | 抗proNT/NMNモノクローナル抗体 | |
WO2021030450A1 (en) | Novel lox-1 antibody compositions, lox1 neutralization assay and methods of treatment using same | |
JP6797107B2 (ja) | 膵臓機能異常の検出方法及び検出用キット | |
WO2022202826A1 (ja) | 悪性膵嚢胞性腫瘍の判定補助方法及び判定補助用キット | |
US20220048980A1 (en) | csPCNA Isoform Antibodies And Uses Thereof | |
JP6793514B2 (ja) | 新規甲状腺癌関連抗原に結合する抗体および甲状腺癌診断剤 | |
JP2010241783A (ja) | 抗atbf1抗体及びその用途 | |
AU2013228069A1 (en) | Cancer specific PCNA isoform binding antibodies and uses thereof | |
JP2012141175A (ja) | 癌の検出方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091222 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20120306 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120313 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120509 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120605 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120904 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20120911 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121016 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121029 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20121204 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20121217 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5168943 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160111 Year of fee payment: 3 |