JP5168693B2 - 試料の高さの計測方法 - Google Patents
試料の高さの計測方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5168693B2 JP5168693B2 JP2008254162A JP2008254162A JP5168693B2 JP 5168693 B2 JP5168693 B2 JP 5168693B2 JP 2008254162 A JP2008254162 A JP 2008254162A JP 2008254162 A JP2008254162 A JP 2008254162A JP 5168693 B2 JP5168693 B2 JP 5168693B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- refractive index
- liquid
- coherent light
- measurement sample
- measurement
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 title claims 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 102
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 63
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 58
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 claims description 50
- 238000005498 polishing Methods 0.000 claims description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims 3
- 239000005357 flat glass Substances 0.000 claims 1
- 238000010030 laminating Methods 0.000 claims 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 38
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000010363 phase shift Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Length Measuring Devices By Optical Means (AREA)
Description
すなわち、試料片にレーザ光などの可干渉光を照射し、試料片を通過した可干渉光(物体光)と試料片を通過しない可干渉光(参照光)とを拡大レンズで拡大し、両可干渉光を重畳して結像させて干渉像を得、この干渉像内における計測部分と非計測部分との位相差に基づき試料片の屈折率分布を計測するものである。
図1のような干渉計で、試料計測部近傍を通過した可干渉光、すなわち物体光を対物レンズで拡大して結像し、これと試料計測部を含まない経路を通った可干渉光すなわち参照光とを像面で重ねることにより、図2のような干渉像が得られる。干渉縞の間隔dは、物体光と参照光のなす角度2θとレーザ光の波長λ0によって決まり、それらの間には
厚さ、あるいは屈折率を測定したい部分は中央灰色の部分で、不定形の微小物体の場合はこれが被計測試料、周囲の白い部分は例えば液体である。被計測部分の屈折率をnb、厚さをtとし、周りの部分の屈折率をnaとする。Aを通った光すなわち参照光とBを通った光すなわち物体光を比べると、両者の差は厚さtの部分の有無だけである。照射する光の波長をλ0とし、屈折率naの部分における波長をλa、 屈折率nbの部分における波長をλbとすると、被計測部分と周囲部における照射光の波長は、屈折率の定義から
と表される。これより、それぞれの部分の厚さtの中に入る波の数をNa、 Nbとすると、
となる。従って、厚さtの部分を通過したときにA、B間に生じる波の数の差は
と表すことができる。この波の数の差は、試料を透過した後も光路差としてそのまま残るため、A,B間の光路差は
とあらわされる。これに上記数2および数4を代入すると
とあらわされる。C1およびC2は、物体光と参照光の振幅で決まる定数である。位相分布は、図3の参照光Aに対してはφA(x、y)、物体光Bに対してはφB(x,y)となるので、上記式(1)左辺の位相差は、
である。この値は、干渉像の干渉縞分布から直接求めることもできるが、高精度に求める方法として物体波と参照波の相対的な位相を2π/M(M:3以上の正数)ずつずらしたM枚の干渉像から、
という式で求める方法(位相シフト法)が知られている。ここで、Im(x,y)はm枚目の干渉像の強度分布、左辺の単位はラジアンである。左辺第1項は、2本の光が角度θ傾いて干渉したことに対応するもので、数値的に取り除くことができるため、求められたφ(x,y)から式(1)の左辺を求めることができる。すなわち、厚さtが既知であればA,B2点間の屈折率の差(nb-na)、被計側部と周辺部の屈折率が既知であれば厚さtが求められる。
この発明は、屈折率と高さが未知の不定型な微小試料の高さ(厚さ)を同一の装置、方法を用いて高精度で計測することを可能とすることを課題とするものである。
従来の技術においては、通常厚さの測定にはマイクロメータが利用されているが、細胞の厚さをマイクロメータで測定することは不可能である。
他方、生物・医学の分野では、細胞の形態と細胞の健全性とは関連があると考えられている。
しかしながら、生きたままの細胞の厚さの計測手段はこれまで存在しなかった。この発明は、計測試料を細胞に限定するものではないが、主に、従来不可能であった生きたままの細胞の厚さの計測を可能とすることを課題とするものである。
この発明は以下の3つのプロセスで構成される。
すなわち、計測試料を液体中に配設し、液体の組成、濃度あるいはその両者を変化させつつ計測を行い、その屈折率が計測試料の屈折率と等しくなるような組成、濃度などの条件を備えた液体を特定する第一のプロセスと、前記第一のプロセスで特定された液体中に置かれた計測基準体を用いてその液体の屈折率を測定して、計測試料の屈折率を求める第二のプロセスと、第一、第二のプロセスとは異なる液体中に計測試料を配設し、その液体の屈折率が既知であればその値を用い、液体の屈折率が未知の場合は前記第二のプロセスと同様の方法あるいは別の方法により事前に計測して既知となった計測試料の屈折率を用いて、計測試料の高さを計測する第三のプロセスで構成するもので、具体的には以下のとおりである。
前記二つの可干渉光の位相差が0であるということは、液体の屈折率と計測試料の屈折率とが一致していることを意味している。
すなわち、第一のプロセスの目的は、計測試料と屈折率が一致した液体を求めることであり、その液体の具体的な組成や濃度、屈折率を知る必要はない。
次いで前記計測基準体と液体とを視野内に含む領域を通過した可干渉光と、屈折率が均一である部分のみを通過した可干渉光とを干渉させて干渉像を形成し、前記干渉像内の前記計測基準体の高さが既知の部分を透過した可干渉光と前記液体を通過した可干渉光の間の位相差を計測し、該位相差と前記板状体の既知の屈折率並びに高さから前記液体の屈折率を計測する。前記液体の屈折率と計測試料の屈折率は等しいので、このプロセスにより、計測試料の屈折率を決定することができる。
この発明に使用する計測基準体は可干渉光の入射面および射出面が研磨されていればその形状に制約はないが、細胞を計測する場合は計測基準体として2枚のガラス板を積層し、その積層面と直交する面を研磨して楔状に形成したものを使用することが好ましい(請求項3)。その理由は以下のとおりである。
より、0.5ないし0.6波長程度になる。一方、水の屈折率は1.33、細胞を計測する場合には培養液は濃度が濃い場合でも1.38程度と予想されるので、ガラスとの屈折率差は少なくとも0.08,一般には0.1ないし0.15程度になると予想される。この値を上式に代入すると、位相のずれは8倍から10数倍になり、数波長に達する。計測できる位相ずれの量は波長の整数倍を除いた部分なので、正確に波長単位で書くと数14のΔφ’の部分である。
整数Nは波長数が1とか2のときには容易に類推できるが、数波長になった場合にはこの結果だけからNの値を決めることは困難である。培養液の屈折率も必ずしも均一ではなく、たとえば細胞が成長している周辺では組成、濃度が変化していることが考えられ、また培養が進めば当初とは濃度は変わり得るので、この整数波長分の曖昧さが問題となる。
計測基準体をくさび状にすると、同一試料、同一条件で連続して計測基準体の異なる厚さの位置で計測ができるため、複数の計測結果から上式のNを決めることができるので、液体の屈折率を高精度で計測可能となり、もって計測試料の高さを高精度で計測することができる。
まず第一のプロセスでは、液体中に計測試料すなわち細胞をおき、該液体すなわち培養液の組成、濃度を変化させ、前記式(1)の値がゼロとなるような条件を求める。式(1)の値がゼロということは、式(1)および図3において、naとnbが等しいことを意味している。従って、培養液の屈折率を何らかの方法で知ることが出来れば、それが計測試料の屈折率ということになる。
液体の屈折率自体は従来から測定可能であり、アッベの方法などが知られているが、標準サンプルとの目視比較により屈折率を求めるため、個人差が出やすく、高い精度も得られにくい。一方干渉計測では、高い精度は達成可能であるが、計測される位相変化が厚さと屈折率の積に比例するので、何らかの方法で厚さを決めないと屈折率を求めることができない。
そこで本発明の第二のプロセスにおいて、可干渉光の光路に沿った液体の所定の距離に対する位相変化量を計測し、液体の屈折率を決定する。
屈折率の異なるガラス板2とガラス板3(屈折率の差は0.01以下程度であることが好ましい。例えば屈折率1.5168と屈折率1.5112)とを積層し、積層面と直交する面4を研磨して楔状に形成して計測基準体1を構成してある。この計測基準体1の高さは楔状根本側で50ミクロン程度、先端側で10ミクロン以下程度が望ましい。
前記計測基準体1を液体である培養液6が入れられたトレー8に、楔形状の斜面が可干渉光の入射面および射出面になるごとく、すなわち一般には積層面が垂直になるごとく載置する(図5)。
この干渉計測装置では、干渉素子14として複プリズムを用いている。図示されていない光源から可干渉光、例えばレーザ光を計測基準体1の積層面と平行な方向、ここでは鉛直方向に照射する。光路Aは培養液6のみ(もしくはサンプル外など屈折率が均一である部分)を透過し、他方の光路Bは前記計測基準体1を構成するガラス板2とガラス板3を含む領域を透過するように設定してある。
ここで、光路Aと光路Bの可干渉光は、それぞれ対物レンズ13及び図示されていない共通の拡大レンズを経て拡大され、干渉素子14によって重畳して結像し、図7のような干渉像15を形成する。
ここでは説明の便宜上、ガラス板2、ガラス板3および培養液6を全て領域内に含む場合の干渉像を示した。この干渉像は、図6の干渉光学系で得られるものに対応している。従って計測基準体1は右下がりのくさび状で、斜面を上から見たものである。ガラス板2とガラス板3の周囲は培養液で、深さと屈折率が一定であるため、均一な間隔の直線的な干渉縞となっている。また屈折率は、培養液<ガラス板3<ガラス板2であるので、培養液部に対してガラス板3の部分で干渉縞が右にずれ、ガラス板2の部分ではさらに右にずれている。前記干渉像から前記ガラス板2,ガラス板3それぞれを透過した両可干渉光の間の位相差を、例えば図7のガラス板2とガラス板3の積層面に垂直な線A−A’上で計測する。
高い精度でこの位相差を計測するためには、[0005]で述べたように、位相シフト法、すなわち光路Aと光路Bを通る可干渉光の相対的な位相差を2π/M(M:3以上の正数)ずつずらせたM枚の干渉像から、式(2)を用いて計算で求める。
すなわち、ガラス板2を透過した光とガラス板3を透過した光の位相の差をΔφ1として、前述式(1)をここに当てはめると、
という関係が成り立つ。いま、ガラス板2の屈折率ng2とガラス板3の屈折率ng3は既知であるから、このΔφ1を用いてこの部分の厚さtを求めることができる。たとえば、上述のng2=1.5168、ng3=1.5112を用い、計測に用いる可干渉光の波長をλ0=0.5000ミクロン
、測定された位相差をΔφ1=0.8500ラジアンとすると、A-A’線の高さは12.08ミクロンとなる。
ガラス板2を透過した光と培養液6のみを透過した光の位相の差をΔφ2とすると、
の関係を満たす。厚さtは前段の測定で判明した量、屈折率ng2は既知であるから、このΔφ2を用いて未知であった培養液6の屈折率nliqを求めることができる。
しかし同一試料、同一条件で数点の測定ができれば、厚さとの関連から整数分を決定することができる。図9はその原理を示したものである。今、計測基準体1の斜面上で、A,B,CおよびDの4点で計測したとする。実際に得られる位相差は、横軸の上下に記したΔφ’AないしΔφ’Dである。計測基準体1の楔状厚さ分布の薄い側、図7では右端の厚さを10ミクロン以下程度とすれば、[0018]で示した計算例のように、位相差が1波長以下程度になるので、図9においてtDの位置を適当に選ぶことにより、厚さtと位相変化Δφの関係の近似的な直線を引くことができる。Δφ’A、Δφ’B、Δφ’Cはそれぞれ2Nπ(N=0,1,2???)から上向きもしくは下向きに量った量であるので、図9に示したように前記の近似的な直線と各測定値とが全てつじつまが合うように並べることにより、波長の整数倍の曖昧さを完全に排除することができ、培養液の屈折率を高い精度で求めることが可能になる。また、この複数測定値から培養液の屈折率を決定する過程で、最小自乗法等を併用すれば、屈折率の値をさらに正確に決定することができる。こうして得られた培養液の屈折率は、第一のプロセスにおいて細胞の屈折率と同じであることが判っているので、この第二のプロセスによって、細胞の屈折率を決定できたことになる。
細胞の干渉像を得るためには、細胞5を含む領域を透過した可干渉光と、培養液6のみ、あるいはトレーの外部の屈折率が均一である領域を通った可干渉光とを干渉させる。この干渉像の例を図11に示す。
細胞の周囲では、可干渉光は屈折率が均一で深さが一定の培養液のみを透過しているので、干渉縞は間隔が一定で直線である。細胞内部における位相変化は、前記式(1)で、横方向の位置座標をx、縦方向の位置座標をyとすると、
となる。厳密には細胞各部で屈折率の分布があるが、ここでは簡単のため、細胞内部では屈折率が均一であるとした。この式から判るように、位相変化量は細胞の各部の厚さtに比例するので、厚い部分ほど干渉縞がずれることになる。[0017]で説明した位相シフト法を用いれば、Δφ(x,y)の分布を高精度で求めることができる。細胞5の屈折率ncellは第一および第二のプロセス、培養液6の屈折率は第二のプロセスと同様の手法によって求めることにより既知であるので、細胞5の各部の厚さが解る。
2 ガラス板
3 ガラス板
4 端面(入射面)
5 細胞(計測試料)
6 培養液
15 干渉像
Claims (3)
- 屈折率及び厚さの分布が未知である計測試料の形状を計測するものであって、
前記計測試料を液体中に浸漬させ、前記液体の屈折率を変化させる毎に、前記計測試料と前記液体部分を含む領域を透過した可干渉光と、屈折率が均一である領域のみを通過した可干渉光を干渉させて干渉像を形成し、該干渉像から前記液体部分を通った可干渉光と前記計測試料部分を通った可干渉光の間の位相差を計測し、該位相差がゼロとなる条件を備えた液体を特定する第一のプロセスと、
前記第一のプロセスにより特定された液体中に、屈折率が既知でかつその値が異なる2種以上の透明な板状体を積層した積層板状体から少なくとも対向する2端面が積層界面に垂直となるごとく切り出し、かつ該両端面を平滑になした計測基準体を、その平滑になした端面が入射面および射出面になるごとく浸漬し、視野内に前記2種以上の透明な板状体の境界部分を含む領域を通過した可干渉光と、視野内の屈折率が均一である部分のみを通過した可干渉光とを干渉させて干渉像を形成し、
前記干渉像から一の板状体と他の板状体のそれぞれを通過した可干渉光の間の位相差を計測し、該位相差と前記板状体の既知の屈折率から前記計測基準体の高さを計測し、
次いで、視野内に前記2種以上の透明な板状体の内の一の板状体と前記液体部分の境界を含む領域を通過した可干渉光と、視野内の屈折率が均一である部分のみを通過した可干渉光とを干渉させて干渉像を形成し、
前記干渉像から一の板状体と前記液体のそれぞれを通過した可干渉光の間の位相差を計測し、該位相差と前記板状体の既知の屈折率および先に求めた前記板状体の厚さから前記液体の屈折率を求め、該屈折率をもって計測試料の屈折率と見なす第二のプロセスと、
屈折率が既知であり、かつ前記第一および第二のプロセスとは異なる液体中に前記計測試料を浸漬し、視野内に前記計測試料と前記液体部分とを含む領域を通過した可干渉光と、視野内の屈折率が均一である部分のみを通過した可干渉光とを干渉させて干渉像を形成し、
前記干渉像から前記計測試料と前記液体のそれぞれを通過した可干渉光の間の位相差を計測し、該位相差と第二のプロセスで既知となった前記計測試料の屈折率および前記液体の屈折率に基づいて、計測試料の高さを計測する第三のプロセスとを備えることを特徴とする、
計測試料の高さ計測方法 - 計測試料は細胞とした、請求項1記載の計測試料の高さ計測方法
- 計測基準体は、2枚以上の板ガラスを積層し、その積層面と直交する面を研磨して楔状に形成した、請求項1又は2に記載の計測試料の高さ計測方法
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008254162A JP5168693B2 (ja) | 2008-09-30 | 2008-09-30 | 試料の高さの計測方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008254162A JP5168693B2 (ja) | 2008-09-30 | 2008-09-30 | 試料の高さの計測方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010085235A JP2010085235A (ja) | 2010-04-15 |
JP5168693B2 true JP5168693B2 (ja) | 2013-03-21 |
Family
ID=42249336
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008254162A Active JP5168693B2 (ja) | 2008-09-30 | 2008-09-30 | 試料の高さの計測方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5168693B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20190008645A1 (en) * | 2015-12-29 | 2019-01-10 | Zm Praezisionsdentaltechnik Gmbh | Orthopaedic Implant |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5904665B2 (ja) * | 2012-04-27 | 2016-04-13 | 株式会社 エフケー光学研究所 | 位相計測装置、位相計測プログラム及び位相計測方法 |
JP6762183B2 (ja) * | 2016-09-25 | 2020-09-30 | 株式会社 エフケー光学研究所 | 位相計測装置 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2652667B2 (ja) * | 1988-07-01 | 1997-09-10 | 旭光学工業株式会社 | 試液の屈折率測定方法 |
JP2678464B2 (ja) * | 1988-06-27 | 1997-11-17 | 旭光学工業株式会社 | 屈折率測定方法 |
JPH0221203A (ja) * | 1988-07-09 | 1990-01-24 | Brother Ind Ltd | 位相差検出装置 |
EP1451646B1 (en) * | 2001-12-04 | 2018-09-19 | Ecole Polytechnique Féderale de Lausanne (EPFL) | Apparatus and method for digital holographic imaging |
JP5092150B2 (ja) * | 2008-06-05 | 2012-12-05 | 株式会社 エフケー光学研究所 | 試料片の厚さ及び屈折率の計測方法及び装置 |
-
2008
- 2008-09-30 JP JP2008254162A patent/JP5168693B2/ja active Active
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20190008645A1 (en) * | 2015-12-29 | 2019-01-10 | Zm Praezisionsdentaltechnik Gmbh | Orthopaedic Implant |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2010085235A (ja) | 2010-04-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103890539B (zh) | 膜厚测定方法 | |
KR101593080B1 (ko) | 회절 위상 현미경 시스템 및 이를 이용한 측정방법 | |
Yang et al. | Single-shot and phase-shifting digital holographic microscopy using a 2-D grating | |
JP2008122394A (ja) | 偏光解析測定方法および装置 | |
JP5168693B2 (ja) | 試料の高さの計測方法 | |
CN105352915A (zh) | 一种折射率二维分布的动态测量方法 | |
JP2678464B2 (ja) | 屈折率測定方法 | |
JP5058117B2 (ja) | 培養容器および細胞厚さ測定方法 | |
US9494505B2 (en) | Scanning non-contact surface microrheometer | |
TWI467227B (zh) | 穿透式三維顯微裝置及方法 | |
Lemesle et al. | Height fluctuations and surface gradients in topographic measurements | |
Joo et al. | Recent progress on optical tomographic technology for measurements and inspections of film structures | |
US6449049B1 (en) | Profiling of aspheric surfaces using liquid crystal compensatory interferometry | |
JP5092150B2 (ja) | 試料片の厚さ及び屈折率の計測方法及び装置 | |
JP2016109670A (ja) | 屈折率分布計測方法、屈折率分布計測装置、及び光学素子の製造方法 | |
JP2020188717A (ja) | 細胞の数、形態又は形状を測定する方法及び装置 | |
JP4183089B2 (ja) | 表面形状および/または膜厚測定方法およびその装置 | |
KR102570084B1 (ko) | 3차원 반사도 곡면을 이용한 두께 측정 방법 | |
US20220091033A1 (en) | System and method for measuring a refractive index of a medium | |
JP2017106768A (ja) | 厚み測定装置 | |
Gut | Methods of determining the beat length of planar waveguides | |
JP6623029B2 (ja) | 光学的距離計測装置 | |
CN115684086A (zh) | 一种基于双劈尖干涉模型测量溶液折射率的装置及方法 | |
Townsend et al. | Quantitative phase measurements using a quadrature tomographic microscope | |
JPWO2015001650A1 (ja) | Vブロック方式の屈折率測定装置並びにこれに用いられる屈折率算出装置及び屈折率算出方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110829 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20121204 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20121205 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20121214 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5168693 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |