JP5161581B2 - Cell culture container and cell culture method - Google Patents

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    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates

Description

本発明は、細胞培養容器及びそれを用いた細胞培養方法に関する。   The present invention relates to a cell culture container and a cell culture method using the same.

細胞死は、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）と、ネクローシス（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）に大別される。アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）とは、多細胞生物の体を構成する細胞の死に方の一種で、個体をより良い状態に保つために積極的に引き起こされる、管理・調節された細胞の自殺のことを意味する。生体内では、癌化した細胞（そのほか内部に異常を起こした細胞）のほとんどは、アポトーシスによって取り除かれ続けており、これにより、ほとんどの腫瘍の成長は未然に防がれていることが知られている。また、生物の発生過程では、あらかじめ決まった時期、決まった場所で細胞死が起こり（プログラムされた細胞死）、これが生物の形態変化などの原動力として働いているが、この細胞死もアポトーシスの仕組みによって起こる。例えば、オタマジャクシからカエルに変態する際に尻尾がなくなるのはアポトーシスによる。線虫では発生において起こるアポトーシスが全て記載されている。さらに免疫系でも自己抗原に反応する細胞の除去など重要な役割を果たすことが知られている。   Cell death is roughly divided into apoptosis and necrosis. Apoptosis is a type of death of the cells that make up the body of a multicellular organism, meaning controlled and regulated cell suicide that is actively triggered to keep an individual in better condition To do. In vivo, most cancerous cells (and other cells with abnormalities in the interior) continue to be removed by apoptosis, which is known to prevent most tumor growth. ing. In addition, in the development process of organisms, cell death occurs at a predetermined time and place (programmed cell death), which works as a driving force for changes in the morphology of the organism. This cell death is also the mechanism of apoptosis. Caused by. For example, the disappearance of the tail when transformed from a tadpole to a frog is due to apoptosis. In nematodes all apoptosis occurring in development is described. It is also known to play an important role in the immune system, such as the removal of cells that react with self-antigens.

これに対し、血行不良、外傷などによる細胞内外の環境の悪化によって起こる細胞死は、ネクローシス（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）または壊死（えし）と呼ばれ、これと区別される。Ａｐｏｐｔｏｓｉｓの語源はギリシャ語の「ａｐｏ−（離れて）」と「ｐｔｏｓｉｓ（下降）」に由来し、「（枯れ葉などが木から）落ちる」という意味である。   On the other hand, cell death caused by deterioration of the environment inside and outside the cell due to poor blood circulation, trauma, etc. is called necrosis or necrosis and is distinguished from this. The origin of Apoptosis comes from the Greek words “apo- (away)” and “ptosis (down)”, meaning “(dead leaves fall from trees)”.

壊死（えし）は、生物の組織の一部分が死ぬことである。通常の死とは違い、体の一部分を構成する細胞だけが死滅する。感染、物理的破壊、化学的損傷、血流の減少などが原因となる。血流減少によるものを特に梗塞と呼ぶ。細胞の死ではあっても、血球、皮膚、消化管の粘膜上皮のように正常な細胞、組織が次々に補充され機能的な障害、組織学的な異常を残さないものは壊死と呼ばない。壊死した組織は、生体の免疫系によって最終的には取り除かれ、欠損部分は元の組織が再生したり線維化したりすることで補われる。   Necrosis is the death of a part of a living tissue. Unlike normal death, only the cells that make up part of the body die. Caused by infection, physical destruction, chemical damage, decreased blood flow, etc. Those caused by decreased blood flow are called infarctions. Even if the cells are dead, normal cells such as blood cells, skin, and mucosal epithelium of the digestive tract, and tissues that are replenished one after another and do not leave functional disorders or histological abnormalities are not called necrosis. The necrotic tissue is finally removed by the living body's immune system, and the defective part is compensated by the regeneration or fibrosis of the original tissue.

このような細胞を検査、試験するためには、通常、組織から単離した細胞を培養する必要がある。組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索および薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。単離した細胞は、直ちに試験に用いられる場合もあるが、多くは細胞培養の方法により培養皿や試験管の中で培養が行われている。この培養系の中で種々の検査が行われる。   In order to examine and test such cells, it is usually necessary to culture cells isolated from tissues. Techniques for testing and examining cells isolated from tissues are indispensable in biotechnology-related fields. It is widely used for diagnosing diseases and pathological conditions, searching for new drugs and determining their efficacy, animal testing, plant testing, and testing for environmental pollutants. The isolated cells may be used immediately for testing, but in many cases, the cells are cultured in a culture dish or a test tube by a cell culture method. Various tests are performed in this culture system.

これらのアッセイは、通常均一な培養系を設定し、評価する薬物等の量、濃度などを変えてその効果をみるものである。そのため培養に用いる培養容器も一定の均一に形成されたものが用いられる。この培養容器は、培養皿（細胞培養ディッシュ）というものが一般的に用いられる。培養皿として一般的に用いられているものには、シャーレ、または６ウェルプレート、１２ウェル、４８ウェル、９６ウェルの各プレートがある（特許文献１）。最近の微量化への流れから、更に小口径で多数の培養皿からなる３８４ウェルプレートも使用され始めている。これらの培養皿の底部は平坦な平板状である。   In these assays, a uniform culture system is usually set up, and the effect is observed by changing the amount and concentration of the drug to be evaluated. Therefore, the culture container used for the culture is a uniform one. As this culture container, a culture dish (cell culture dish) is generally used. Commonly used culture dishes include petri dishes or 6-well plates, 12-well, 48-well, and 96-well plates (Patent Document 1). Due to the recent trend toward micro-volumes, 384-well plates consisting of a large number of culture dishes with a smaller diameter have begun to be used. The bottom of these culture dishes has a flat plate shape.

このように、現在、メディカル、バイオテクノロジー分野などで、培養試験、組織培養を目的に使用されている細胞培養ディッシュ（シャーレ）、プレートなどは、その底面の平板部分を培養面として使用されている。   As described above, in the medical and biotechnology fields, cell culture dishes (petri dishes) and plates that are currently used for culture tests and tissue culture use the flat plate portion on the bottom as the culture surface. .

しかしながら、組織細胞の培養は、底部が平板状の培養皿で行うと、細胞が薄く伸びて方向性のない形状となり、生体内で本来観られる形状や機能を示さなくなってしまう問題を有していた。例えば、平板状の培養皿や培養容器で脂肪細胞前駆細胞を培養し、分化誘導を行っても目的の脂肪細胞の形状に分化しないという問題を有していた。また、肝細胞ではスフェロイド状の細胞塊を形成しないという問題を有していた。   However, when tissue cells are cultured in a flat plate-shaped culture dish, the cells grow thin and have a non-directional shape, and the shape and function that are originally seen in vivo cannot be exhibited. It was. For example, there has been a problem that even if adipocyte precursor cells are cultured in a plate-shaped culture dish or culture vessel and differentiation is induced, they do not differentiate into the shape of the target adipocyte. In addition, hepatocytes have a problem of not forming spheroid-like cell clusters.

従って平板状では、目的とする効率の良い細胞増殖や細胞分化が困難なため、平板状表面にサイトカインや細胞外マトリックスを固定化する方法、特殊な装置を使用する方法が試みられている（特許文献２、特許文献３）。   Therefore, since it is difficult to efficiently target and proliferate and differentiate cells in the flat form, methods of immobilizing cytokines and extracellular matrix on the flat surface and methods using special devices have been attempted (patents). Literature 2, Patent Literature 3).

しかしながら、平板状表面に細胞増殖因子や細胞外マトリックスを固定化する方法では、初期のみ効率化が上がるが、それを維持できないことや、固定化方法が煩雑で安定的に製造できず、さらにコストが掛かる問題がある。また、特殊な装置を使用する方法は細胞種により結果が異なり、安定した効率化が見込めないことや、大掛かりな装置を使用するため操作性が悪いこと、さらにコストが掛かる等の問題がある。   However, the method of immobilizing cell growth factors and extracellular matrix on a flat plate surface increases efficiency only in the initial stage, but it cannot be maintained, the immobilization method is complicated and cannot be stably produced, and the cost is further increased. There is a problem that takes. In addition, the method using a special device has different results depending on the cell type, and there are problems that stable efficiency cannot be expected, that a large device is used, the operability is poor, and the cost is high.

また、細胞培養ディッシュ（シャーレ）、プレートを用いた培養試験や組織培養において、培養細胞から排出される炭酸ガスなどによるＰＨ変化は、培養細胞の活性に大きな影響を及ぼすことが知られている。このため、長期間培養においては、研究者が定期的（例えば２日ごとに）培養液を交換することで、培養細胞の活性を保っている。更に最新の研究例では、常に新鮮な培養液を循環可能なバイオリアクターを作製し、新規な人工臓器代替モデルが提案されている。   Further, in cell culture dishes (petri dishes), culture tests using plates, and tissue culture, changes in pH due to carbon dioxide gas discharged from cultured cells are known to have a significant effect on the activity of cultured cells. For this reason, in long-term culture, researchers maintain the activity of cultured cells by periodically changing the culture solution (for example, every two days). Furthermore, in the latest research example, a bioreactor capable of always circulating a fresh culture solution is produced, and a new artificial organ replacement model is proposed.

しかしながら、神経細胞や心筋、骨格筋のように再生しない組織のネクローシス（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）や、皮膚、消化管の粘膜上皮のような再生可能な組織の細胞死を抑制するための因子は明らかにされておらず、新鮮な培養液の交換だけでは、細胞死の抑制が実現できていないのが現状である。   However, factors for suppressing cell death of reproducible tissues such as necrosis of tissues that do not regenerate like nerve cells, heart muscle, and skeletal muscle, and mucosal epithelium of skin and digestive tract have been clarified. In addition, the current situation is that cell death cannot be suppressed only by exchanging a fresh culture solution.

特に、培養が難しいとされる培養種である、ラットの心筋細胞、神経細胞、角膜細胞などは、新鮮な培養液の交換を行っても、最初に分散（配置）した細胞数に対する生存率は２０〜４０％であるのが現状である。   In particular, rat cardiomyocytes, nerve cells, corneal cells, etc., which are difficult to cultivate, have a survival rate with respect to the number of cells initially dispersed (arranged) even if the fresh culture medium is replaced. The current situation is 20 to 40%.

近年、シリコンを材料とした半導体加工技術や、フォトリソグラフ法によるＮｉ製スタンパー（原盤）を用いた成形技術の発達によって、ミリからマイクロ、更にはナノレベルの微細化が試みられている。しかしながら、これらの微細加工技術によって製造された細胞培養多ウェルプレートなどは、サンプルの微量化、集積化が可能になるものの、培養が難しいとされる細胞種に対する提案はされていない。
特開平８−３２２５９３号公報 特開２００３−１８９８４３公報 特開２００５−１４３３４３公報 2. Description of the Related Art In recent years, attempts have been made to make micrometer-to-micro and even nano-level miniaturization with the development of semiconductor processing technology using silicon as a material and molding technology using a Ni stamper (master) by a photolithographic method. However, although the cell culture multi-well plate and the like produced by these microfabrication techniques can be reduced in volume and integrated, no proposal has been made for cell types that are difficult to culture.
JP-A-8-322593 JP 2003-189843 A JP 2005-143343 A

このように、従来の細胞培養容器では、細胞が薄く伸びた形状をとり，生体内で本来発現する形状や機能を示さなくなってしまい、効率よく，生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることが困難であるという問題があった。さらに、培養が困難な細胞種があるという問題点があった。
本発明が解決しようとする課題は、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる細胞培養容器及びそれを用いた細胞培養方法を提供することである。As described above, in the conventional cell culture container, the cells have a thin and elongated shape, and the shape and function that are originally expressed in the living body are not exhibited. There is a problem that it is difficult to efficiently proliferate or / and differentiate. Furthermore, there is a problem that some cell types are difficult to culture.
The problem to be solved by the present invention is to provide a cell culture container capable of efficiently proliferating or / and differentiating cells exhibiting the shape and function originally expressed in vivo, and a cell culture method using the same. It is to be.

本発明の第１の態様にかかる細胞培養容器は、凹凸パターンを有する細胞培養容器であって、前記凹凸パターンの凹凸により形成される凹部の大きさが培養細胞の相当直径の１．０倍〜４０倍であるものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。   The cell culture container according to the first aspect of the present invention is a cell culture container having a concavo-convex pattern, wherein the size of the recess formed by the concavo-convex pattern of the concavo-convex pattern is 1.0 times the equivalent diameter of the cultured cell. It is 40 times. Thereby, the cell which shows the shape and function which are originally expressed in the living body can be efficiently proliferated or / and differentiated.

本発明の第２の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記凹部が２段以上の凹凸により形成されることを特徴とするものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。   The cell culture container according to a second aspect of the present invention is characterized in that, in the above-mentioned cell culture container, the concave portion is formed by two or more concavo-convex portions. Thereby, the cell which shows the shape and function which are originally expressed in the living body can be efficiently proliferated or / and differentiated.

本発明の第３の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記２段以上の凹凸により形成される凹部の底部の大きさが培養細胞の相当直径の１．５倍〜１０倍であるものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。   The cell culture container according to a third aspect of the present invention is the above cell culture container, wherein the size of the bottom of the concave portion formed by the two or more steps of irregularities is 1.5 times to 10 times the equivalent diameter of the cultured cells. It is what is doubled. Thereby, the cell which shows the shape and function which are originally expressed in the living body can be efficiently proliferated or / and differentiated.

本発明の第４の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記２段以上の凹凸のうち少なくとも１段以上で形成される凹部が、少なくとも１つ以上の隣接する他の凹部と互いに連通することを特徴とするものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。   The cell culture container according to a fourth aspect of the present invention is the above cell culture container, wherein at least one of the two or more concavo-convex recesses is at least one other recess. And communicating with each other. Thereby, the cell which shows the shape and function which are originally expressed in the living body can be efficiently proliferated or / and differentiated.

本発明の第５の態様にかかる細胞培養容器トは、上記の細胞培養容器において、前記２段以上の凹凸により形成される凹部の最下段の高さが１μｍ〜１００μｍであることを特徴とするものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。   The cell culture container according to a fifth aspect of the present invention is characterized in that, in the above cell culture container, a height of a lowermost step of the recess formed by the two or more steps is 1 μm to 100 μm. Is. Thereby, the cell which shows the shape and function which are originally expressed in the living body can be efficiently proliferated or / and differentiated.

本発明の第６の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記凹凸により形成される凹部の底部に培養細胞の相当直径の０．００１〜０．９倍の大きさの凹みを複数有することを特徴とするものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。   A cell culture container according to a sixth aspect of the present invention is the above-described cell culture container, wherein a recess having a size of 0.001 to 0.9 times the equivalent diameter of the cultured cell is formed at the bottom of the recess formed by the unevenness. It is characterized by having multiple. Thereby, the cell which shows the shape and function which are originally expressed in the living body can be efficiently proliferated or / and differentiated.

本発明の第７の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記凹みの高さが０．１μｍ〜５０μｍであることを特徴とするものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。   The cell culture container according to a seventh aspect of the present invention is characterized in that, in the above-mentioned cell culture container, the height of the recess is 0.1 μm to 50 μm. Thereby, the cell which shows the shape and function which are originally expressed in the living body can be efficiently proliferated or / and differentiated.

本発明の第８の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記凹凸により形成される凹部の高さが１μｍ〜２００μｍであることを特徴とするものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。   The cell culture container according to an eighth aspect of the present invention is characterized in that, in the above-mentioned cell culture container, the height of the recess formed by the unevenness is 1 μm to 200 μm. Thereby, the cell which shows the shape and function which are originally expressed in the living body can be efficiently proliferated or / and differentiated.

本発明の第９の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記凹凸パターンが設けられた領域に表面処理が行われていることを特徴とするものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。   A cell culture container according to a ninth aspect of the present invention is characterized in that, in the above-mentioned cell culture container, a surface treatment is performed on a region where the uneven pattern is provided. Thereby, the cell which shows the shape and function which are originally expressed in the living body can be efficiently proliferated or / and differentiated.

本発明の第１０の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、容器素材が透明材料であることを特徴とするものである。これにより、観察を容易に行うことができる。   A cell culture container according to a tenth aspect of the present invention is characterized in that, in the cell culture container, the container material is a transparent material. Thereby, observation can be performed easily.

本発明の第１１の態様にかかる細胞の培養方法は、上記の細胞培養容器において、細胞培養容器に設けられた凹部に、細胞を注入して、前記細胞を培養するものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。   The cell culturing method according to the eleventh aspect of the present invention comprises culturing the cell by injecting the cell into a recess provided in the cell culture container in the cell culture container. Thereby, the cell which shows the shape and function which are originally expressed in the living body can be efficiently proliferated or / and differentiated.

本発明によれば、効率よく，生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる細胞培養容器及びそれを用いた細胞培養方法を提供することである。   According to the present invention, it is to provide a cell culture vessel capable of efficiently proliferating or / and differentiating cells exhibiting the shape and function originally expressed in vivo and a cell culture method using the same. .

本発明の実施の形態１にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。It is a top view which shows the structure of the cell culture container concerning Embodiment 1 of this invention. 本発明の実施の形態１にかかる細胞培養容器の構成を示す断面図である。It is sectional drawing which shows the structure of the cell culture container concerning Embodiment 1 of this invention. 本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。It is a top view which shows the structure of the cell culture container concerning Embodiment 2 of this invention. 本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の構成を拡大して示す平面図である。It is a top view which expands and shows the structure of the cell culture container concerning Embodiment 2 of this invention. 本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の構成を断面図である。It is sectional drawing about the structure of the cell culture container concerning Embodiment 2 of this invention. 本発明の実施例１にかかる細胞培養容器の構成を示す斜視図である。It is a perspective view which shows the structure of the cell culture container concerning Example 1 of this invention. 本発明の実施例２にかかる細胞培養容器の構成を示す斜視図である。It is a perspective view which shows the structure of the cell culture container concerning Example 2 of this invention. 本発明の実施例３にかかる細胞培養容器の構成を示す斜視図である。It is a perspective view which shows the structure of the cell culture container concerning Example 3 of this invention. 本発明の実施例４にかかる細胞培養容器の構成を示す斜視図である。It is a perspective view which shows the structure of the cell culture container concerning Example 4 of this invention.

符号の説明Explanation of symbols

１０ 細胞培養容器、１１ 第１の凸部、１２ 第２の凸部、１３ 凸部、１４ 凹部、
１５ 第１の凸部の側壁、１６ 第２の凸部の側壁、１７ 凹み10 cell culture vessel, 11 first convex part, 12 second convex part, 13 convex part, 14 concave part,
15 Side wall of first convex part, 16 Side wall of second convex part, 17 dent

組織細胞の培養を現在、市販されている細胞培養皿（シャーレ、またはウェルプレート）上で行うと、培養細胞は薄く伸びて方向性のない形状となる。研究者は、細胞の活性を確認する方法として、老廃物の排出によるＰＨの変化や、炭酸ガスの放出を電気化学センサ等によって、生体組織の測定データと、培養皿で培養した細胞の測定データとを比較することを試みているが、生体組織のデータを示す値が、培養皿では再現できていないのが現状である。したがって、市販されている細胞培養皿上での培養では、生体内では持っていた機能を培養細胞が示していないと判断されている。   When tissue cells are cultured on a cell culture dish (petri dish or well plate) that is currently commercially available, the cultured cells are thinly elongated and have a non-directional shape. As a method for confirming the activity of cells, researchers use biological sensors to measure changes in pH due to waste product discharge and carbon dioxide release, and data measured from cells cultured in a culture dish. However, at present, the values indicating the data of living tissue cannot be reproduced in the culture dish. Therefore, it is determined that the cultured cells do not exhibit the functions they have in vivo when cultured on a commercially available cell culture dish.

そこで、培養皿上に組織細胞の増殖に適した微細な容器パターンを形成し、その微細な容器パターン内で細胞を培養し、立体的に細胞を増殖させることで、生体内で持っていた機能を発現せしめるための研究が開始されたところである。さらなる課題は、その細胞を効率良く増殖および／または分化させることである。   Therefore, by forming a fine container pattern suitable for tissue cell growth on the culture dish, culturing cells in the fine container pattern, and growing the cells three-dimensionally, the function that had in vivo Research has started to make it appear. A further challenge is to efficiently proliferate and / or differentiate the cells.

本発明に係る細胞培養容器を用いた培養方法によると、微細凹凸パターンを設けることにより、生体内と同様な立体的な生育が可能であることに加え、微細凹凸により形成された立体的区画により細胞自身が産生する細胞増殖因子および／または分化誘導因子等の生理活性化物質を生体内と類似した濃度で培養できるため、生体内の細胞周囲の環境を模倣することが可能である。微細凹凸パターンは、例えば、側壁を複数個有し、それらの側壁によって形成された培養細胞を配置するための複数の空間を有し、さらに、側壁に開口部を設けることで、複数の空間が連通した連結構造を形成することにより、実現可能である。側壁を複数有することで、複数の空間を作製し、要求される用途に応じて空間の大きさを設定する。   According to the culture method using the cell culture container according to the present invention, by providing a fine uneven pattern, the same three-dimensional growth as in a living body is possible, and in addition, by the three-dimensional compartment formed by the fine unevenness. Since physiologically active substances such as cell growth factors and / or differentiation-inducing factors produced by the cells themselves can be cultured at a concentration similar to that in the living body, it is possible to mimic the environment surrounding the cells in the living body. The fine concavo-convex pattern has, for example, a plurality of side walls, a plurality of spaces for arranging cultured cells formed by these side walls, and further, by providing openings on the side walls, the plurality of spaces This can be realized by forming a connected connection structure. By having a plurality of side walls, a plurality of spaces are produced, and the size of the space is set according to the required application.

培養する細胞種に応じ、側壁、空間、開口部の寸法を設定することにより、多様な培養系において適用可能になると推測される。開口部とは、側壁によって形成された空間（凹部）同士が、連通するための構造を開口部とする。   It is presumed that the present invention can be applied to various culture systems by setting the dimensions of the side wall, space, and opening according to the cell type to be cultured. With an opening part, the structure for the space (concave part) formed by the side wall to communicate is made into an opening part.

側壁によって形成される空間の寸法は、細胞を培養する目的において最適な範囲であることが必要である。側壁によって形成される空間が、大きすぎると、細胞は平板上での培養と同様、薄く伸びて立体的な構造を示さず、空間が小さすぎると、その空間に細胞が入ることができなくなる。従って、空間の寸法は、培養する細胞種に応じて、単一、または複数個が収納できる範囲とすることが望ましい。   The size of the space formed by the side wall needs to be in an optimum range for the purpose of culturing cells. If the space formed by the side walls is too large, the cells will not be elongated and show a three-dimensional structure, as in the case of culturing on a flat plate, and if the space is too small, cells cannot enter the space. Therefore, it is desirable that the size of the space be in a range that can accommodate a single or a plurality of cells depending on the cell type to be cultured.

本発明者らは、鋭意研究した結果、特定のマイクロパターン形状において、細胞が産生する物質を拡散防止することによって、培養細胞の生存率を飛躍的に向上可能であることを見出し、本発明に至った。   As a result of diligent research, the present inventors have found that the survival rate of cultured cells can be dramatically improved by preventing the diffusion of substances produced by cells in a specific micropattern shape. It came.

細胞は、その培養過程において、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチンといった物質を産生している。炭酸ガスの排出によるＰＨ変化は培養細胞において、その活性低下の要因になる反面、これらの産生物質は基質材料に使用されるなど、細胞の基質表面の接着、および分化・増殖に欠かすことのできない材料でもある。   Cells produce substances such as fibronectin, laminin, collagen, and elastin during the culture process. The change in pH due to the discharge of carbon dioxide gas causes a decrease in the activity of cultured cells, but these produced substances are used as a substrate material, and are essential for cell surface adhesion, differentiation and proliferation. It is also a material.

本発明者らは、細胞培養容器に複数のマイクロパターンを形成し、そのパターンの側壁下部で細胞を培養することにより、細胞の産生物質の拡散を防止し、細胞の生存率を高めることに成功した。   The present inventors have succeeded in preventing the diffusion of cell product and increasing the cell viability by forming a plurality of micropatterns in the cell culture container and culturing the cells under the side wall of the pattern. did.

細胞の産生物質の拡散を防止し、細胞の生存率を高めることが目的であり、更に将来には、細胞培養株の生産性を高めることが期待される。したがって、本発明におけるマイクロパターンは、培養面積内における側壁下部の長さをいかに確保するかが課題となる。   The purpose is to prevent the diffusion of cell products and increase the cell viability, and in the future, it is expected to increase the productivity of cell cultures. Therefore, the problem with the micropattern in the present invention is how to secure the length of the lower portion of the side wall within the culture area.

側壁間の下部の幅は、単一細胞の最小サイズが４〜５μｍであることから、例えば、２μｍ以上であることが望ましい。   Since the minimum size of a single cell is 4-5 micrometers, the width | variety of the lower part between side walls is desirable to be 2 micrometers or more, for example.

側壁の幅は、培養面積内における側壁下部の長さを確保するために、できるだけ狭いことが望ましいが、工業技術的に再現可能な観点から、例えば、１μｍ以上とすることが望ましい。   The width of the side wall is preferably as narrow as possible in order to ensure the length of the lower part of the side wall within the culture area, but is preferably 1 μm or more from the viewpoint of being reproducible from an industrial technical point of view.

側壁の高さは、産生物質の拡散を抑制する観点から、例えば、１μｍ以上であることが望ましい。   The height of the side wall is preferably 1 μm or more, for example, from the viewpoint of suppressing the diffusion of the produced substance.

各段の凸部の幅と高さの比は、産生物質の拡散を防止する目的で、できるだけ高いことが望ましいが、工業技術的に再現可能な観点から、高さ／幅の比は、１／１〜２０／１のなかから選択することが望ましい。   The ratio of the width and height of the protrusions in each step is preferably as high as possible for the purpose of preventing the diffusion of the product, but from the viewpoint of reproducibility in terms of industrial technology, the ratio of height / width is 1 It is desirable to select from / 1 to 20/1.

さらに、本発明にかかる細胞培養容器は、人工臓器の代替となるバイオリアクターなどに対しても有効である。基板を重ね合わせることで、培養液を還流する空間を形成する際、培養細胞の産生物質の拡散を防止するための側壁よりも高い橋梁を、側壁と直行するように設け、培養液を側壁と直行する向きに流すことで、培養細胞からの炭酸ガスの放出によるＰＨ変化を防止し、かつ培養細胞の産生物質の拡散が可能となる。   Furthermore, the cell culture container according to the present invention is also effective for a bioreactor as an alternative to an artificial organ. When a space for refluxing the culture solution is formed by stacking the substrates, a bridge higher than the side wall for preventing the diffusion of the product of cultured cells is provided so as to be perpendicular to the side wall, and the culture solution is placed on the side wall. By flowing in the direction perpendicular, the PH change due to the release of carbon dioxide from the cultured cells can be prevented, and the product produced by the cultured cells can be diffused.

以下に、本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器について図を参照して説明する。   Below, the cell culture container concerning embodiment of this invention is demonstrated with reference to figures.

発明の実施の形態１．
以下、本発明の実施の形態１にかかる細胞培養容器の具体的な形状について図１及び図２を用いて説明する。図１は、本実施の形態にかかる細胞培養容器の構成の一例を示す平面図であり、図２は図１のＡ−Ａ'断面図である。もちろん、図１及び図２に示す構成は、本発明にかかる細胞培養容器の一例であり、図示した構成に限定されるものではない。Embodiment 1 of the Invention
Hereinafter, the specific shape of the cell culture container according to the first embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. 1 and 2. FIG. 1 is a plan view showing an example of the configuration of the cell culture container according to the present embodiment, and FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line AA ′ of FIG. Of course, the structure shown in FIG.1 and FIG.2 is an example of the cell culture container concerning this invention, and is not limited to the structure shown in figure.

細胞培養容器には、凹凸パターンが形成されている。凹凸パターンは２段の階段状に形成されている。従って、細胞培養容器の培養面には、２段の凸部１３が形成される。すなわち、格子状に形成された第１の凸部１１の上に直方体状の第２の凸部１２がマトリクス状に形成されている。この第１の凸部１１及び第２の凸部１２によって形成される空間が凹部１４となる。すなわち、隣接する第１の凸部１１の間の空間及び第２の凸部の間の空間が凹部１４になる。第１の凸部１１の側壁１５と隣接する第１の凸部１１の側壁との間及び第２の凸部１２の側壁１６と隣接する第２の凸部１２の側壁１６との間の空間により、細胞を培養するための凹部１４が形成される。第１の凸部１１の側壁１５及び第２の凸部１２の側壁１６は底面に対して略垂直に形成されている。従って、凹部１４は２段の凹凸を有する階段状となる。   An uneven pattern is formed in the cell culture container. The concavo-convex pattern is formed in two steps. Therefore, the two-step convex portion 13 is formed on the culture surface of the cell culture container. That is, the rectangular parallelepiped second convex portions 12 are formed in a matrix on the first convex portions 11 formed in a lattice shape. A space formed by the first convex portion 11 and the second convex portion 12 becomes a concave portion 14. That is, the space between the adjacent first convex portions 11 and the space between the second convex portions become the concave portions 14. Space between the side wall 15 of the first convex portion 11 and the side wall of the adjacent first convex portion 11 and between the side wall 16 of the second convex portion 12 and the side wall 16 of the second convex portion 12 adjacent to the second convex portion 12. Thus, a recess 14 for culturing the cell is formed. The side wall 15 of the first convex portion 11 and the side wall 16 of the second convex portion 12 are formed substantially perpendicular to the bottom surface. Accordingly, the concave portion 14 has a stepped shape having two steps.

第１の凸部１１は、図１に示すように矩形状の凹部１４の四辺を囲むよう格子状に配置されている。第２の凸部１２は、隣接する凹部１４の間の第１の凸部１１の上に島状に配置されている。第２の凸部１２は、矩形状の凹部１４の四辺のそれぞれに対して設けられている。なお、凹部１４の形状は矩形状に限らず、多角形状、円形状、楕円形状又はこれらの複合形状等であってもよい。   The 1st convex part 11 is arrange | positioned at the grid | lattice form so that the four sides of the rectangular recessed part 14 may be enclosed, as shown in FIG. The 2nd convex part 12 is arrange | positioned on the 1st convex part 11 between the adjacent recessed parts 14 at island shape. The second convex portion 12 is provided for each of the four sides of the rectangular concave portion 14. Note that the shape of the recess 14 is not limited to a rectangular shape, and may be a polygonal shape, a circular shape, an elliptical shape, or a composite shape thereof.

なお、凹凸パターンを２段以上とし、凹部１４を２段以上の凹凸から形成することが好ましい。すなわち、凹部１４を２段以上の階段状としてもよい。もちろん、凹部１４は１段であってもよく、３段以上であってもよい。これにより、培養に好適な形状とすることができる。   It is preferable that the uneven pattern has two or more steps and the recess 14 is formed by two or more steps. That is, the recess 14 may have a stepped shape having two or more steps. Of course, the recess 14 may be one step or three or more steps. Thereby, it can be set as the shape suitable for culture | cultivation.

凹凸パターンの凹凸により形成される凹部１４の大きさ（幅、奥行き）は培養細胞の相当直径の１．０倍〜４０倍であることが好ましい。すなわち、隣接する凸部１３の間の間隔が培養細胞の相当直径の１．０〜４０倍であること好ましい。換言すると、凹部１４の幅が培養細胞の相当直径の１．０〜４０倍であることが好ましい。また、隣接する第１の凸部１１の側壁１５間の幅は、単一細胞の最小サイズが４〜５μｍであることから、例えば、２μｍ以上であることが望ましい。さらに、凹部１４の底部の大きさ（幅、奥行き）を培養細胞の相当直径の１．５倍〜１０倍とすることが好ましい。すなわち、第１の凸部１１で形成される空間の幅を培養細胞の相当直径の１．５倍〜１０倍とすることが好ましい。換言すると、隣接する第１の凸部１１で形成される間の間隔を培養細胞の相当直径の１．５〜１０倍とすることが好ましい。これにより、培養に好適な大きさとすることができる。   The size (width, depth) of the recess 14 formed by the unevenness of the uneven pattern is preferably 1.0 to 40 times the equivalent diameter of the cultured cell. That is, it is preferable that the interval between the adjacent convex portions 13 is 1.0 to 40 times the equivalent diameter of the cultured cells. In other words, the width of the recess 14 is preferably 1.0 to 40 times the equivalent diameter of the cultured cells. Moreover, since the minimum size of a single cell is 4-5 micrometers, the width between the side walls 15 of the adjacent 1st convex part 11 is desirably 2 micrometers or more, for example. Furthermore, it is preferable that the size (width, depth) of the bottom of the recess 14 is 1.5 times to 10 times the equivalent diameter of the cultured cells. That is, it is preferable that the width of the space formed by the first convex portion 11 is 1.5 to 10 times the equivalent diameter of the cultured cell. In other words, it is preferable that the interval between the adjacent first protrusions 11 is 1.5 to 10 times the equivalent diameter of the cultured cells. Thereby, it can be set as a suitable size for culture.

また、２段の凹部１４は、少なくとも１つ以上の隣接する２段の凹部１４と互いに連通することが好ましい。ここでは、第１の凸部１１の上側で隣接する２段の凹部１４が連通している。すなわち、隣接する第２の凸部１２の側壁１６間の空間で隣接する２段の凹部１４とを連通させている。具体的には、第１の凸部１１を格子状に設けて、その上に島状の第２の凸部１２を点在させる。これにより、第２の凸部１２によって空間が完全に隔てられることがなくなるため、第１の凸部１１の上の空間によって隣接する２段の凹部１４が連通する。また、凹部１４を２段以上とした場合、１段以上で形成される空間が、少なくとも隣接する凹部１４で互いに連通していることが好ましい。すなわち、２段以上の凹凸のうち少なくとも１段以上で形成される凹部が、隣接する他の凹部と互いに連通することが好ましい。この場合、最も上側の凸部を下側の凸部の上に島状に形成することによって、凹部１４を連通させることができる。凹部１４を形成する少なくとも１段の高さで、隣接する凹部１４が連通する。このように、凹凸パターンに開口部を設け、凹部を互いに連通させることが好ましい。もちろん、凹部は、１つ以上の他の凹部と連通していればよい。これにより、培養に好適な形状とすることができる。   Moreover, it is preferable that the two-stage recess 14 communicates with at least one adjacent two-stage recess 14. Here, adjacent two-stage recesses 14 communicate with each other on the upper side of the first protrusions 11. That is, the two adjacent concave portions 14 communicate with each other in the space between the side walls 16 of the adjacent second convex portions 12. Specifically, the first convex portions 11 are provided in a lattice shape, and the island-shaped second convex portions 12 are scattered on the first convex portions 11. As a result, since the space is not completely separated by the second convex portion 12, the two adjacent concave portions 14 communicate with each other by the space above the first convex portion 11. Moreover, when the recessed part 14 is made into 2 steps | paragraphs or more, it is preferable that the space formed by 1 step | paragraph or more is mutually connected by the adjacent recessed part 14 at least. That is, it is preferable that the recess formed in at least one or more of the two or more concavo-convex portions communicate with other adjacent recesses. In this case, the concave portion 14 can be communicated by forming the uppermost convex portion in an island shape on the lower convex portion. Adjacent recesses 14 communicate with each other at a height of at least one level forming the recesses 14. Thus, it is preferable to provide openings in the concavo-convex pattern so that the recesses communicate with each other. Of course, the recess only needs to communicate with one or more other recesses. Thereby, it can be set as the shape suitable for culture | cultivation.

また、凹部１４の高さを１〜２００μｍとすることが好ましい。すなわち、第１の凸部１１の高さと第２の凸部１２の高さの和を１〜２００μｍとすることが好ましい。これにより、培養に好適な大きさとすることができる。   Moreover, it is preferable that the height of the recessed part 14 shall be 1-200 micrometers. That is, it is preferable that the sum of the height of the first convex portion 11 and the height of the second convex portion 12 be 1 to 200 μm. Thereby, it can be set as a suitable size for culture.

また、第１の凸部１１の高さを１〜１００μｍとすることが好ましい。すなわち、階段状の凹部１４の最下段の高さを１〜１００μｍとすることが好ましい。これにより、凹部１４の底部の高さが１〜１００μｍとなり、培養に好適な大きさとすることができる。   Moreover, it is preferable that the height of the 1st convex part 11 shall be 1-100 micrometers. That is, it is preferable that the height of the lowermost step of the stepped recess 14 is 1 to 100 μm. Thereby, the height of the bottom part of the recessed part 14 will be 1-100 micrometers, and it can be set as the suitable size for culture | cultivation.

凸部１３の幅は、培養面積内における側壁の長さを確保するために、できるだけ狭いことが望ましいが、工業技術的に再現可能な観点から、例えば、１μｍ以上とすることが望ましい。具体的には、第２の凸部１２の幅を１μｍ以上とする。換言すると、第２の凸部１２を構成する２つの側壁１６間の間隔を１μｍ以上とする。また、第１の凸部１１の幅は、第２の凸部１２以上であればよい。すなわち、第２の凸部１２が第１の凸部１１の上で、第１の凸部１１よりもはみ出ていなければよい。   The width of the convex portion 13 is desirably as narrow as possible in order to ensure the length of the side wall within the culture area, but is desirably, for example, 1 μm or more from the viewpoint of being reproducible in terms of industrial technology. Specifically, the width of the second convex portion 12 is set to 1 μm or more. In other words, the interval between the two side walls 16 constituting the second convex portion 12 is set to 1 μm or more. Moreover, the width | variety of the 1st convex part 11 should just be the 2nd convex part 12 or more. In other words, the second convex portion 12 may not protrude beyond the first convex portion 11 on the first convex portion 11.

凹部１４の高さは、産生物質の拡散を抑制する観点から、例えば、１μｍ以上であることが望ましい。すなわち、第１の凸部１１と第２の凸部１２のの高さの和が１μｍ以上であることが好ましい。さらに、凹部１４の高さを２００μｍ以下とすることが好ましい。   The height of the recess 14 is preferably 1 μm or more, for example, from the viewpoint of suppressing the diffusion of the produced substance. That is, it is preferable that the sum of the heights of the first convex portion 11 and the second convex portion 12 is 1 μm or more. Furthermore, it is preferable that the height of the recess 14 is 200 μm or less.

第２の凸部１２の幅と高さの比は、産生物質の拡散を防止する目的で、できるだけ高いことが望ましいが、工業技術的に再現可能な観点から、高さ／幅の比は、１／１〜２０／１のなかから選択することが望ましい。すなわち、第２の凸部１２の高さが第２の凸部１２の幅の１〜２０倍とすることが望ましい。さらに、第１の凸部の高さ／幅も１／１〜２０／１とすることが好ましい。これにより、精度よく細胞培養容器を生産することができる。   The ratio between the width and the height of the second convex portion 12 is desirably as high as possible for the purpose of preventing the diffusion of the product, but from the viewpoint of reproducibility in terms of industrial technology, the height / width ratio is: It is desirable to select from 1/1 to 20/1. That is, it is desirable that the height of the second convex portion 12 is 1 to 20 times the width of the second convex portion 12. Furthermore, it is preferable that the height / width of the first protrusion is also 1/1 to 20/1. Thereby, a cell culture container can be produced with high accuracy.

さらに凹凸パターンが設けられた領域に表面処理を行うことが好ましい。すなわち、凸部１３の上面及び側面、並びに、隣接する凸部１３の間の底面に表面処理を行うことが好ましい。表面処理としては、例えば、有機材料または無機材料のコーティング処理を行うことができる。有機材料または無機材料は目的によって適宜公知の材料を選択すればよい。また、紫外線、電子線などの活性エネルギー線で処理したり、その他薬品により直接表面を改質しても良い。   Furthermore, it is preferable to perform a surface treatment on the region where the uneven pattern is provided. That is, it is preferable to perform surface treatment on the upper surface and side surfaces of the convex portion 13 and the bottom surface between the adjacent convex portions 13. As the surface treatment, for example, a coating treatment of an organic material or an inorganic material can be performed. As the organic material or the inorganic material, a known material may be appropriately selected depending on the purpose. Further, the surface may be modified with an active energy ray such as an ultraviolet ray or an electron beam, or directly modified with other chemicals.

細胞培養容器上の凹凸パターンは、シリコンを材料とした半導体加工技術や、フォトリソグラフ法によるＮｉ製スタンパー（原盤）を用いた成形技術によって形成することができる。例えば、シリコンを材料とした半導体加工技術の場合、シリコン基板上にレジストを塗布し、レジストを露光、現像してレジストをパターニングする。このレジストの上からシリコンをエッチングすることによって、シリコン基板がパターニングされ、凹凸パターンが形成される。そして、レジストを剥離することにより、所望の凹凸パターンを有するシリコン製細胞培養容器が完成する。もちろん、細胞培養容器用の基板はシリコン基板に限らず、ガラス基板や樹脂基板であってもよい。このように半導体加工技術を用いることによって、精度よく凹凸パターンを形成することができる。   The concavo-convex pattern on the cell culture vessel can be formed by a semiconductor processing technique using silicon as a material or a forming technique using a Ni stamper (master) by a photolithographic method. For example, in the case of a semiconductor processing technique using silicon as a material, a resist is applied on a silicon substrate, and the resist is exposed and developed to pattern the resist. By etching the silicon from above the resist, the silicon substrate is patterned to form an uneven pattern. Then, by removing the resist, a silicon cell culture vessel having a desired uneven pattern is completed. Of course, the substrate for the cell culture container is not limited to a silicon substrate, and may be a glass substrate or a resin substrate. As described above, by using the semiconductor processing technique, the uneven pattern can be formed with high accuracy.

また、Ｎｉスタンパを用いた成形技術の場合、まず、基板上に第１のレジスト層を塗布、露光し、さらにその上から第２のレジスト層を塗布、露光する。この第１のレジスト層及び第２のレジストを一括原像することによって基板上に凹凸パターンを形成することができる。そして、この凹凸パターンが形成された基板に導電性膜を蒸着法やスパッタリング法によって付着する。そして、導電性薄膜の上から金属をメッキにより堆積して金属構造体を形成する。金属構造体を基板から剥離することによってスタンパを形成することができる。このスタンパを用いて成形することによって、高精度の細胞培養溶液を高い生産性で製造することができる。この場合、細胞培養容器は、例えば、樹脂材料により形成される。もちろん、金属構造体を作成するための構造体をシリコン基板やガラス基板などによって形成してもよい。さらに、細胞培養容器の製造方法は、上記の方法に限定されるものではない。具体的には、機械切削や、ガラスへのエッチング処理法などにより、細胞培養容器１０を製造してもよい。これによって、大面積・細胞培養株製造も可能となる。また、細胞培養容器の素材をガラスや樹脂などの透明材料とすることによって、細胞の観察を容易に行うことができる。   In the case of a molding technique using a Ni stamper, first, a first resist layer is applied and exposed on a substrate, and then a second resist layer is applied and exposed thereon. An uneven pattern can be formed on the substrate by batch original images of the first resist layer and the second resist. Then, a conductive film is attached to the substrate on which the concavo-convex pattern is formed by vapor deposition or sputtering. Then, a metal structure is formed by depositing metal on the conductive thin film by plating. The stamper can be formed by peeling the metal structure from the substrate. By molding using this stamper, a highly accurate cell culture solution can be produced with high productivity. In this case, the cell culture container is formed of, for example, a resin material. Of course, a structure for forming a metal structure may be formed using a silicon substrate, a glass substrate, or the like. Furthermore, the manufacturing method of a cell culture container is not limited to said method. Specifically, the cell culture vessel 10 may be manufactured by mechanical cutting, glass etching, or the like. This also makes it possible to produce large-area cell culture strains. In addition, by using a transparent material such as glass or resin as the material of the cell culture container, it is possible to easily observe the cells.

上記の構造を有する細胞培養容器１０によって、生体内で本来発現する形状や類似機能を示し，効率よく増殖および／または分化させることができる。さらに、培養細胞の生存率を向上することができる。すなわち、凹部１４に細胞を注入して、培養液を供給することによって、効率よく、細胞を培養することができる。さらに、安価で観察の容易な細胞培養容器を提供することができる。   The cell culture container 10 having the above structure exhibits a shape or similar function that is originally expressed in a living body, and can be efficiently proliferated and / or differentiated. Furthermore, the survival rate of cultured cells can be improved. That is, cells can be efficiently cultured by injecting cells into the recess 14 and supplying a culture solution. Furthermore, it is possible to provide a cell culture container that is inexpensive and easy to observe.

また、微細凹凸パターンにより形成された空間内で細胞培養を行うことで，生体内で本来発現する立体形状を示すことができ、微細凹凸の立体的区画により細胞自身が産生する細胞増殖因子や分化誘導因子等の生理活性物質の細胞周囲濃度が向上する。このため，効率よく増殖および／または分化させる細胞培養容器を提供することができ。さらに透明樹脂素材で作製することで安価で観察の容易な細胞培養容器を提供することができる。   In addition, by culturing cells in the space formed by the fine uneven pattern, the three-dimensional shape originally expressed in the living body can be shown, and the cell growth factor and differentiation produced by the cell itself by the three-dimensional division of the fine unevenness. The pericellular concentration of physiologically active substances such as inducers is improved. Therefore, it is possible to provide a cell culture container that can efficiently proliferate and / or differentiate. Furthermore, it is possible to provide a cell culture container that is inexpensive and easy to observe by being made of a transparent resin material.

また、凹凸パターンを２段とする細胞培養容器は、人工臓器の代替となるバイオリアクターなどに対しても有効である。基板を重ね合わせることで、培養液を還流する空間を形成する際、培養細胞の産生物質の拡散を防止するための側壁よりも高い橋梁を、側壁と直行するように設け、培養液を側壁と直行する向きに流すことで、培養細胞からの炭酸ガスの放出によるＰＨ変化を防止し、かつ培養細胞の産生物質の拡散が可能となる。   In addition, the cell culture container having two concavo-convex patterns is also effective for a bioreactor that substitutes for an artificial organ. When a space for refluxing the culture solution is formed by stacking the substrates, a bridge higher than the side wall for preventing the diffusion of the product of cultured cells is provided so as to be perpendicular to the side wall, and the culture solution is placed on the side wall. By flowing in the direction perpendicular, the PH change due to the release of carbon dioxide from the cultured cells can be prevented, and the product produced by the cultured cells can be diffused.

なお、本実施の形態では、第１の凸部１１の上に第２の凸部１２が設けられている構成について説明したが、本発明はこれに限るものではない。例えば、第１の凸部１１の上に第２の凸部１２が設けられていない構成でもよい。すなわち、高さの異なる第１の凸部と第２の凸部とが、それぞれ異なる位置に設けられていてもよい。この場合、２段以上の階段状の凸部ではなく、高さの異なる２種類以上の凸部が設けられている構成となる。   In the present embodiment, the configuration in which the second convex portion 12 is provided on the first convex portion 11 has been described, but the present invention is not limited to this. For example, the structure in which the 2nd convex part 12 is not provided on the 1st convex part 11 may be sufficient. That is, the 1st convex part and 2nd convex part from which height differs may be provided in a respectively different position. In this case, two or more types of convex portions having different heights are provided instead of the two or more stepped convex portions.

発明の実施の形態２．
本実施の形態にかかる細胞培養容器の構成について図３、図４及び図５を用いて説明する。図３は、本実施の形態にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。図４は、図３に示された点線内の構成を拡大して示す平面図である。図５は、図４のＢ−Ｂ'断面図である。なお、実施の形態１で説明した構成と同様の構成については、説明を省略する。Embodiment 2 of the Invention
The configuration of the cell culture container according to this embodiment will be described with reference to FIGS. 3, 4, and 5. FIG. FIG. 3 is a plan view showing the configuration of the cell culture container according to the present embodiment. 4 is an enlarged plan view showing the configuration within the dotted line shown in FIG. 5 is a cross-sectional view taken along the line BB ′ of FIG. Note that description of the same configuration as that described in Embodiment 1 is omitted.

本実施の形態にかかる細胞培養容器１０は実施の形態１と同様の凹凸パターンが形成されている。従って、第１の凸部１１及び第２の凸部１２の形状、寸法については、実施の形態１と同様であるため説明を省略する。さらに、本実施の形態にかかる細胞培養容器１０には、実施の形態１で説明した構成に加え、凹部１４の底面に凹み１７が形成されている。すなわち、隣接する第１の凸部１１の間において、底面に凹み１７が設けられている。凹み１７は隣接する第１の凸部１１の間において、複数設けられている。従って、第１の凸部１１の側壁１５の近傍において、細胞培養容器１０の断面形状は、３段の階段状となる。凹み１７は凹部１４の底面にマトリクス状に配置されている。   The cell culture container 10 according to the present embodiment has an uneven pattern similar to that of the first embodiment. Accordingly, the shapes and dimensions of the first convex portion 11 and the second convex portion 12 are the same as those in the first embodiment, and thus the description thereof is omitted. Further, in the cell culture container 10 according to the present embodiment, in addition to the configuration described in the first embodiment, a recess 17 is formed on the bottom surface of the recess 14. That is, a recess 17 is provided on the bottom surface between the adjacent first protrusions 11. A plurality of recesses 17 are provided between the adjacent first protrusions 11. Therefore, in the vicinity of the side wall 15 of the first convex portion 11, the cross-sectional shape of the cell culture container 10 is a three-step step shape. The recesses 17 are arranged in a matrix on the bottom surface of the recess 14.

このように、本実施の形態にかかる細胞培養容器１０では、細胞培養容器１０の凹部１４の底面に複数の微細な凹み１７が形成されている。凹み１７の幅は、培養細胞の相当直径以下とすることが好ましい。さらに、凹み１７の幅を、培養細胞の相当直径の０．００１〜０．９倍とすることが好ましい。また、凹み１７の深さは、０．１μｍ〜５０μｍであることが好ましい。すなわち、凹み１７によって形成される空間の大きさを培養細胞の相当直径の０．００１倍以上０．９倍以下とし、空間の高さを０．１〜５０μｍとすることが好ましい。   Thus, in the cell culture container 10 according to the present embodiment, a plurality of fine recesses 17 are formed on the bottom surface of the recess 14 of the cell culture container 10. It is preferable that the width of the recess 17 is not more than the equivalent diameter of the cultured cell. Furthermore, the width of the recess 17 is preferably 0.001 to 0.9 times the equivalent diameter of the cultured cells. Moreover, it is preferable that the depth of the dent 17 is 0.1 μm to 50 μm. That is, it is preferable that the size of the space formed by the recess 17 is 0.001 to 0.9 times the equivalent diameter of the cultured cells, and the height of the space is 0.1 to 50 μm.

また、凹凸パターンを２段あるいは３段以上としてもよい。凹凸パターンを２段構成とする場合、凹部１４を設けるための第１の凸部１１を形成する。そして、第１の凸部１１によって形成された凹部１４の底面に複数の凹み１７が配設される。   Further, the uneven pattern may be two steps or three steps or more. When the concavo-convex pattern has a two-stage configuration, the first convex portion 11 for forming the concave portion 14 is formed. A plurality of recesses 17 are disposed on the bottom surface of the recess 14 formed by the first protrusion 11.

第１の凸部１１及び第２の凸部１２は、実施の形態１と同様の形状とすることができる。すなわち、凹部１４及び凸部１３の寸法は、実施の形態１で示した範囲とすることが好ましい。凹凸パターンが設けられている領域に表面処理を行ってもよい。また、本実施の形態にかかる細胞培養容器１０は、実施の形態１で示した製造方法と同様の方法により、製造することができる。   The 1st convex part 11 and the 2nd convex part 12 can be made into the same shape as Embodiment 1. FIG. That is, it is preferable that the dimensions of the concave portion 14 and the convex portion 13 are in the range shown in the first embodiment. Surface treatment may be performed on a region where the uneven pattern is provided. Moreover, the cell culture container 10 concerning this Embodiment can be manufactured by the method similar to the manufacturing method shown in Embodiment 1. FIG.

上記の構造を有する細胞培養容器１０によって、生体内で本来発現する形状や類似機能を示し，効率よく増殖および／または分化させることができる。さらに、安価で観察の容易な細胞培養容器を提供することができる。従って、実施の形態１と同様の効果を得ることができる。   The cell culture container 10 having the above structure exhibits a shape or similar function that is originally expressed in a living body, and can be efficiently proliferated and / or differentiated. Furthermore, it is possible to provide a cell culture container that is inexpensive and easy to observe. Therefore, the same effect as in the first embodiment can be obtained.

次に本発明にかかる細胞培養容器の実施例について図６〜図９を用いて説明する。   Next, an embodiment of the cell culture container according to the present invention will be described with reference to FIGS.

［実施例１］
実施例１にかかる細胞培養容器の形状について図６を用いて説明する。図６は、本実施例にかかる細胞培養容器の形状を示す斜視図である。図６では、２段の階段状の凸部１３が一列に並んで設けられている。凸部１３のそれぞれは奥行き方向に延在して設けられている。隣接する凸部１３の間の凹部１４は培養液が流れる凹溝となる。隣接する凹部１４は、凸部１３の外側で互いに連通している。ここで、隣接する凸部１３の間の凹部１４が細胞を培養するための培地Ｓとなる。図６に示す形状にすることによって、飛躍的な培地の確保が可能となる。なお、細胞培養容器の表面上において、複数の凸部１３が配列されている方向を幅方向とし、それと直交する方向を奥行き方向とする。ここで、第１の凸部１１と第１の凸部１１の上に設けられた第２の凸部１２の奥行き方向の大きさは略一致している。[Example 1]
The shape of the cell culture container according to Example 1 will be described with reference to FIG. FIG. 6 is a perspective view showing the shape of the cell culture container according to the present example. In FIG. 6, two stepped convex portions 13 are provided in a line. Each of the convex portions 13 is provided extending in the depth direction. Concave portions 14 between adjacent convex portions 13 become concave grooves through which the culture solution flows. Adjacent concave portions 14 communicate with each other outside the convex portion 13. Here, the concave portions 14 between the adjacent convex portions 13 serve as the medium S for culturing cells. By making the shape shown in FIG. 6, it becomes possible to secure a dramatic medium. In addition, on the surface of a cell culture container, let the direction where the several convex part 13 is arranged be a width direction, and let the direction orthogonal to it be a depth direction. Here, the first protrusion 11 and the second protrusion 12 provided on the first protrusion 11 have substantially the same size in the depth direction.

図６に示すように、細胞培養容器１０の奥行き方向の大きさをＡ、細胞培養容器の幅をＢ、細胞培養容器１０の厚み（高さ）をＣ、第２の凸部１２の奥行き方向の大きさをｄ、第２の凸部１２の幅をｅ、第２の凸部１２の高さをｆ、隣接する第２の凸部１２間の間隔をｇとする。ここで、本実施例にかかる細胞培養容器１０におけるＡ、Ｂ、Ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇの好適な値を表１に示す。 As shown in FIG. 6, the size of the cell culture container 10 in the depth direction is A, the width of the cell culture container B is B, the thickness (height) of the cell culture container 10 is C, and the depth direction of the second convex portion 12 . Is d, the width of the second convex portion 12 is e, the height of the second convex portion 12 is f, and the interval between the adjacent second convex portions 12 is g. Here, Table 1 shows suitable values of A, B, C, d, e, f, and g in the cell culture container 10 according to the present example.

Figure 0005161581
Figure 0005161581

表１には、細胞の培養試験に適した寸法と、培養株の製造及び組織培養に適した寸法とが記載されている。表１に示す寸法の範囲に凸部１３及び細胞培養容器１０の大きさを設定することにより、培養に好適な細胞培養容器、あるいは培養株の製造及び組織培養に適した容器を得ることができる。ここで、ｆ／ｅが１／１〜２０／１とする。すなわち、第２の凸部１２の高さを幅の１倍〜２０倍とする。さらに、第１の凸部１１の奥行き方向の大きさ、幅及び高さ、並びに、隣接する第１の凸部１１の間隔もｄ〜ｇと同様の範囲に設定する。なお、第２の凸部１２が第１の凸部１１よりも小さくなるように設定する。すなわち、第１の凸部１１の奥行き方向の大きさ及び幅が第２の凸部第２の奥行き方向の大きさ及び幅よりもそれぞれ大きい値になるように設定すればよい。 Table 1 describes dimensions suitable for cell culture tests and dimensions suitable for culture production and tissue culture. By setting the size of the convex portion 13 and the cell culture vessel 10 within the range of the dimensions shown in Table 1, a cell culture vessel suitable for culturing, or a vessel suitable for production of a culture strain and tissue culture can be obtained. . Here, f / e is assumed to be 1/1 to 20/1. That is, the height of the second convex portion 12 is set to 1 to 20 times the width. Further, the size, width, and height of the first convex portion 11 in the depth direction, and the interval between the adjacent first convex portions 11 are also set in the same range as d to g. The second convex portion 12 is set to be smaller than the first convex portion 11 . That may be set such that the magnitude and the width in the depth direction of the first convex portion 11 is respectively larger than the size and width of the second protrusion second depth direction.

［実施例２］
実施例２にかかる細胞培養容器の形状について図７を用いて説明する。図７は、本実施例にかかる細胞培養容器の形状を示す斜視図である。図７では、２段の階段状の凸部１３がマトリクス状に配列されている。すなわち、本実施例では、細胞培養容器１０が第１の凸部１１の上に、第１の凸部１１よりも小さい第２の凸部１２が配置された構成を有している。この第１の凸部１１及び第２の凸部１２からなる凸部１３がマトリクス状に配列されている。隣接する凹部１４は、第１の凸部１１の上側で互いに連通している。凸部１３と凸部１３との間の凹部１４において、細胞が培養される。すなわち、凹部１４が細胞の培地となる。図７に示す形状にすることによって、飛躍的な培地の確保が可能となる。[Example 2]
The shape of the cell culture container according to Example 2 will be described with reference to FIG. FIG. 7 is a perspective view showing the shape of the cell culture container according to the present example. In FIG. 7, two steps of step-like convex portions 13 are arranged in a matrix. That is, in this embodiment, the cell culture container 10 has a configuration in which the second convex portion 12 smaller than the first convex portion 11 is disposed on the first convex portion 11. Convex portions 13 including the first convex portion 11 and the second convex portion 12 are arranged in a matrix. Adjacent concave portions 14 communicate with each other on the upper side of the first convex portion 11. Cells are cultured in the recess 14 between the projection 13 and the projection 13. That is, the recess 14 becomes a cell culture medium. By making the shape shown in FIG. 7, it becomes possible to secure a dramatic medium.

図７に示すように、細胞培養容器１０の奥行き方向の大きさをＡ、細胞培養容器の幅をＢ、細胞培養容器１０の厚み（高さ）をＣ、第１の凸部１１の奥行き方向の大きさをｄ、第１の凸部１１の幅をｅ、第１の凸部１１の高さをｆ、隣接する第１の凸部１１間の間隔をｇとする。ここで、本実施例にかかる細胞培養容器１０におけるＡ、Ｂ、Ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇの好適な値を表２に示す。   As shown in FIG. 7, the size of the cell culture container 10 in the depth direction is A, the width of the cell culture container B is B, the thickness (height) of the cell culture container 10 is C, and the depth direction of the first convex portion 11. Is d, the width of the first protrusion 11 is e, the height of the first protrusion 11 is f, and the distance between the adjacent first protrusions 11 is g. Here, Table 2 shows suitable values of A, B, C, d, e, f, and g in the cell culture container 10 according to the present example.

Figure 0005161581
Figure 0005161581

表２には、細胞の培養試験に適した寸法と、培養株の製造及び組織培養に適した寸法とが記載されている。表２に示す寸法の範囲に凸部１３及び細胞培養容器１０の大きさを設定することにより、培養に好適な細胞培養容器、あるいは培養株の製造及び組織培養に適した容器を得ることができる。ここで、ｆ／ｅが１／１〜２０／１とする。すなわち、第１の凸部１１の高さを幅の１倍〜２０倍とする。さらに、第２の凸部１２の奥行き方向の大きさ、幅及び高さ、並びに、隣接する第２の凸部１２の間隔もｄ〜ｇと同様の範囲に設定する。なお、第１の凸部１１が第２の凸部１２よりも小さくなるように設定する。すなわち、第２の凸部１２の奥行き方向の大きさ及び幅が第１の凸部１１の奥行き方向の大きさ及び幅よりもそれぞれ大きい値になるように設定すればよい。   Table 2 describes dimensions suitable for cell culture tests and dimensions suitable for culture production and tissue culture. By setting the size of the convex portion 13 and the cell culture vessel 10 within the range of dimensions shown in Table 2, a cell culture vessel suitable for culturing, or a vessel suitable for production of a culture strain and tissue culture can be obtained. . Here, f / e is assumed to be 1/1 to 20/1. That is, the height of the first convex portion 11 is set to 1 to 20 times the width. Furthermore, the size, width, and height of the second convex portion 12 in the depth direction, and the interval between the adjacent second convex portions 12 are also set in the same range as d to g. The first convex portion 11 is set to be smaller than the second convex portion 12. That is, the size and width of the second convex portion 12 in the depth direction may be set to be larger than the size and width of the first convex portion 11 in the depth direction.

［実施例３］
実施例３にかかる細胞培養容器の形状について図８を用いて説明する。図８は、本実施例にかかる細胞培養容器の形状を示す斜視図である。本実施例では、人口臓器代替などを目的とした、バイオリアクターなど、培養液を循環させることができるモデルについて説明する。図８では、第１の凸部１１と第１の凸部１１よりも高い第２の凸部１２がそれぞれ異なる箇所に設けられている。すなわち、高さの異なる第１の凸部１１と第２の凸部１２とが別々に設けられている。具体的には、第２の凸部１２が細胞培養容器１０の両端にそれぞれ設けられ、その間に複数の第１の凸部１１が設けられている。第２の凸部１２は、細胞培養容器１０の端縁に沿って設けられている。細胞培養容器１０の両端に設けられた第２の凸部１２は、中央に設けられた第１の凸部１１よりも高くなっている。すなわち、第２の凸部１２が第１の凸部１１の側壁１６よりも高い橋梁となる。これにより、ＰＨの維持、細胞からの産出物質の拡散防止が可能となる。[Example 3]
The shape of the cell culture container according to Example 3 will be described with reference to FIG. FIG. 8 is a perspective view showing the shape of the cell culture container according to this example. In this example, a model capable of circulating a culture solution, such as a bioreactor, for the purpose of artificial organ replacement or the like will be described. In FIG. 8, the 1st convex part 11 and the 2nd convex part 12 higher than the 1st convex part 11 are provided in the respectively different location. That is, the first convex portion 11 and the second convex portion 12 having different heights are provided separately. Specifically, the 2nd convex part 12 is provided in the both ends of the cell culture container 10, respectively, and the some 1st convex part 11 is provided among them. The second convex portion 12 is provided along the edge of the cell culture container 10. The 2nd convex part 12 provided in the both ends of the cell culture container 10 is higher than the 1st convex part 11 provided in the center. That is, the second convex portion 12 is a bridge higher than the side wall 16 of the first convex portion 11. As a result, it is possible to maintain PH and prevent diffusion of substances produced from cells.

第１の凸部１１は、第２の凸部１２が設けられている方向に沿って１列に配列されている。そして、各々の第１の凸部１１は、第２の凸部１２が設けられている方向と直交する方向に設けられている。凸部１３のそれぞれは奥行き方向に延在して設けられている。隣接する凸部１３の間の凹部１４は培養液が流れる凹溝となる。これにより、第２の凸部１２と直交する方向に培養液が流れる。すなわち、細胞培養容器１０の中央部を介して一端から他端へ、培養液が流れる。これにより、産出物質の拡散防止が可能となる。また、隣接する凹部１４は、第１の凸部１１の上側で互いに連通している。これにより、培養液を循環させることができる。   The 1st convex part 11 is arranged in 1 row along the direction in which the 2nd convex part 12 is provided. And each 1st convex part 11 is provided in the direction orthogonal to the direction in which the 2nd convex part 12 is provided. Each of the convex portions 13 is provided extending in the depth direction. Concave portions 14 between adjacent convex portions 13 become concave grooves through which the culture solution flows. Thereby, a culture solution flows in the direction orthogonal to the 2nd convex part 12. FIG. That is, the culture solution flows from one end to the other end through the central portion of the cell culture vessel 10. This makes it possible to prevent the diffusion of the produced substance. Further, the adjacent concave portions 14 communicate with each other on the upper side of the first convex portion 11. Thereby, the culture solution can be circulated.

図８に示すように、細胞培養容器１０の奥行き方向の大きさをＡ、細胞培養容器１０の幅をＢ、細胞培養容器１０の厚み（高さ）をＣ、第１の凸部１１の奥行き方向の大きさをｄ、第１の凸部１１の幅をｅ、第１の凸部１１の高さをｆ、隣接する第１の凸部１１間の間隔をｇとする。本実施例にかかる細胞培養容器１０におけるＡ、Ｂ、Ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇの好適な値を表３に示す。   As shown in FIG. 8, the size of the cell culture container 10 in the depth direction is A, the width of the cell culture container 10 is B, the thickness (height) of the cell culture container 10 is C, and the depth of the first convex portion 11. The size of the direction is d, the width of the first protrusion 11 is e, the height of the first protrusion 11 is f, and the distance between the adjacent first protrusions 11 is g. Table 3 shows suitable values of A, B, C, d, e, f, and g in the cell culture container 10 according to this example.

Figure 0005161581
Figure 0005161581

表３には、細胞の培養試験に適した寸法と、培養株の製造及び組織培養に適した寸法とが記載されている。表３に示す寸法の範囲に凸部１３及び細胞培養容器１０の大きさを設定することにより、培養に好適な細胞培養容器、あるいは培養株の製造及び組織培養に適した容器を得ることができる。ここで、ｆ／ｅが１／１〜２０／１とする。すなわち、第１の凸部１１の高さを幅の１倍〜２０倍とする。さらに、第２の凸部１２の奥行き方向の大きさ、幅及び高さ、並びに、隣接する第２の凸部１２の間隔もｄ〜ｇと同様の範囲に設定する。   Table 3 describes dimensions suitable for cell culture tests and dimensions suitable for culture production and tissue culture. By setting the size of the convex portion 13 and the cell culture vessel 10 within the range of dimensions shown in Table 3, a cell culture vessel suitable for culture, or a vessel suitable for production of a culture strain and tissue culture can be obtained. . Here, f / e is assumed to be 1/1 to 20/1. That is, the height of the first convex portion 11 is set to 1 to 20 times the width. Furthermore, the size, width, and height of the second convex portion 12 in the depth direction, and the interval between the adjacent second convex portions 12 are also set in the same range as d to g.

［実施例４］
実施例４にかかる細胞培養容器の形状について図９を用いて説明する。図９は、本実施例にかかる細胞培養容器の形状を示す斜視図である。本実施例では、人口臓器代替などを目的とした、バイオリアクターなど、培養液を循環させることができるモデルについて説明する。本実施例では、実施の形態２に対応する細胞培養容器１０の構成について説明する。図９に示すように、細胞培養容器１０には、第１の凸部１１によって形成される凹部１４の底面に複数の凹み１７が設けられている。[Example 4]
The shape of the cell culture container according to Example 4 will be described with reference to FIG. FIG. 9 is a perspective view showing the shape of the cell culture container according to this example. In this example, a model capable of circulating a culture solution, such as a bioreactor, for the purpose of artificial organ replacement or the like will be described. In this example, the configuration of the cell culture container 10 corresponding to the second embodiment will be described. As shown in FIG. 9, the cell culture container 10 is provided with a plurality of recesses 17 on the bottom surface of the recess 14 formed by the first protrusion 11.

細胞培養容器１０の両端には、それぞれ第１の凸部１１が設けられている。すなわち、２つの第１の凸部１１はそれぞれ細胞培養容器１０の端辺に沿って設けられている。そして、隣接する第１の凸部１１の間には、複数の凹み１７がマトリクス状に配列されている。第１の凸部１１は凹み１７の側壁よりも高い橋梁となる。   First convex portions 11 are provided at both ends of the cell culture container 10, respectively. That is, the two first convex portions 11 are respectively provided along the end sides of the cell culture container 10. A plurality of recesses 17 are arranged in a matrix between the adjacent first protrusions 11. The first convex portion 11 is a bridge higher than the side wall of the recess 17.

図９に示すように、細胞培養容器１０の奥行き方向の大きさをＡ、細胞培養容器１０の幅をＢ、細胞培養容器１０の厚み（高さ）をＣ、凹み１７の奥行き方向の大きさをｄ、凹み１７の幅をｅ、凹み１７の高さをｆ、隣接する凹み１７の間の間隔をｇとする。ここで、本実施例にかかる細胞培養容器１０におけるＡ、Ｂ、Ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇの好適な値を表３に示す。   As shown in FIG. 9, the size of the cell culture vessel 10 in the depth direction is A, the width of the cell culture vessel 10 is B, the thickness (height) of the cell culture vessel 10 is C, and the size of the recess 17 in the depth direction. Is d, the width of the recess 17 is e, the height of the recess 17 is f, and the distance between the adjacent recesses 17 is g. Here, Table 3 shows suitable values of A, B, C, d, e, f, and g in the cell culture container 10 according to the present example.

Figure 0005161581
Figure 0005161581

表４には、細胞の培養試験に適した寸法と、培養株の製造及び組織培養に適した寸法とが記載されている。表４に示す寸法の範囲に凸部１３及び細胞培養容器１０の大きさを設定することにより、培養に好適な細胞培養容器、あるいは培養株の製造及び組織培養に適した容器を得ることができる。ここで、ｆ／ｅが１／１〜２０／１とすることが好ましい。すなわち、凹み１７の深さを幅の１倍〜２０倍とする。さらに、第１の凸部１１の奥行き方向の大きさ、幅及び高さ、並びに、隣接する第１の凸部１１の間隔もｄ〜ｇと同様の範囲に設定する。   Table 4 describes dimensions suitable for cell culture tests and dimensions suitable for culture production and tissue culture. By setting the size of the convex portion 13 and the cell culture container 10 within the range of dimensions shown in Table 4, a cell culture container suitable for culture, or a container suitable for production of a culture strain and tissue culture can be obtained. . Here, it is preferable that f / e is 1/1 to 20/1. That is, the depth of the recess 17 is 1 to 20 times the width. Further, the size, width, and height of the first convex portion 11 in the depth direction, and the interval between the adjacent first convex portions 11 are also set in the same range as d to g.

本発明は、例えば、組織から単離した細胞を培養し、試験、検査に用いるための細胞培養容器に利用される。   The present invention is used, for example, in a cell culture container for culturing cells isolated from tissues and using them for testing and testing.

Claims (10)

凹凸パターンを有する細胞培養容器であって、
前記凹凸パターンの２段以上の凹凸により形成される凹部が、幅２μｍ〜３，０００μｍの範囲であり、
前記２段以上の凹凸が階段状であり、
前記２段以上の凹凸のうち少なくとも１段以上で形成される凹部が、少なくとも１つ以上の隣接する他の凹部と互いに連通する細胞培養容器。A cell culture container having a concavo-convex pattern,
Recess formed by two or more stages of unevenness of the uneven pattern, Ri range der width 2Myuemu～3,000myuemu,
The two or more steps of unevenness are stepped,
A cell culture container in which a recess formed in at least one or more of the two or more steps is connected to at least one other adjacent recess . 前記２段以上の凹凸は、第１の凸部と、前記第１の凸部の上に設けられ、前記第１の凸部より小さい第２の凸部とによって階段状に形成され、
前記第２の凸部が、幅１μｍ〜２，０００μｍ、高さ１μｍ〜２，０００μｍの範囲であり、前記第２の凸部の高さを前記第２の凸部の幅の１倍〜２０倍とすることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。The unevenness of two or more steps is formed in a step shape by a first convex portion and a second convex portion that is provided on the first convex portion and is smaller than the first convex portion,
The second convex portion has a width of 1 μm to 2,000 μm and a height of 1 μm to 2,000 μm, and the height of the second convex portion is 1 to 20 times the width of the second convex portion. The cell culture container according to claim 1 , wherein the cell culture container is doubled. 前記２段以上の凹凸により形成される凹部の最下段の高さが１μｍ〜１００μｍであることを特徴とする請求項１または２記載の細胞培養容器。The cell culture container according to claim 1 or 2, wherein the height of the lowermost step of the recess formed by the two or more steps is 1 µm to 100 µm. 前記凹凸により形成される凹部の底部に幅が１〜２０００μｍの大きさの凹みを複数有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の細胞培養容器。The cell culture container according to any one of claims 1 to 3, wherein a plurality of recesses having a width of 1 to 2000 µm are provided at a bottom of the recess formed by the unevenness. 前記凹みの高さが０．１μｍ〜５０μｍであることを特徴とする請求項４記載の細胞培養容器。The cell culture container according to claim 4, wherein the height of the recess is 0.1 μm to 50 μm. 前記凹凸により形成される凹部の高さが１μｍ〜２００μｍであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の細胞培養容器。The cell culture container according to any one of claims 1 to 5 , wherein a height of the concave portion formed by the irregularities is 1 µm to 200 µm. 前記凹凸パターンが設けられた領域に表面処理が行われていることを特徴とする請求項１乃至６いずれかに記載の細胞培養容器。The cell culture container according to any one of claims 1 to 6, wherein a surface treatment is performed on a region where the uneven pattern is provided. 容器素材が透明材料であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の細胞培養容器。The cell culture container according to any one of claims 1 to 7 , wherein the container material is a transparent material. 凹凸パターンを有し、前記凹凸パターンの２段以上の凹凸により形成される凹部を有し、前記２段以上の凹凸が階段状であり、前記２段以上の凹凸のうち少なくとも１段以上で形成される凹部が、少なくとも１つ以上の隣接する他の凹部と互いに連通する細胞培養容器を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、
前記細胞培養容器として、前記凹部の大きさが培養する細胞の相当直径の１．０倍〜４０倍である容器を選択し、
選択した前記細胞培養容器に設けられた前記凹部に、細胞を注入して、前記細胞を培養する細胞培養方法。Has an uneven pattern, the have a recess formed by two or more stages of the unevenness of the uneven pattern, wherein two or more stages of the irregularities is stepped, forming at least one or more stages of the two or more stages of irregularities A cell culture method for culturing cells using a cell culture vessel in which the recessed portion is in communication with at least one or more other adjacent recessed portions ,
As the cell culture container, select a container whose size of the recess is 1.0 to 40 times the equivalent diameter of the cells to be cultured,
A cell culture method for injecting cells into the recesses provided in the selected cell culture container and culturing the cells. 前記細胞培養容器として、前記凹部の底部の大きさが培養する細胞の相当直径の１．５倍〜１０倍である容器を選択することを特徴とする請求項９記載の細胞培養方法。The cell culture method according to claim 9 , wherein a container having a size of a bottom portion of the concave portion of 1.5 to 10 times an equivalent diameter of a cell to be cultured is selected as the cell culture vessel.
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