JP5155368B2 - Cytotoxic T lymphocytes - Google Patents

Description

本発明は、ＲＮＡを導入したＴリンパ球を抗原提示細胞として利用した抗原特異的なＴリンパ球の誘導方法、および誘導されたＴリンパ球のがんまたは感染症の治療剤としての利用に関する。また、腫瘍関連抗原であるＭＡＧＥ−Ａ４またはＳＡＧＥに特異的なＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびその認識する抗原ペプチド、並びにそれらのＣＴＬ誘導剤および制がん剤としての利用に関する。さらに、該ＣＴＬを検出するために有用なＭＨＣ−抗原ペプチド複合体を４量体化したテトラマーに関する。   The present invention relates to a method for inducing antigen-specific T lymphocytes using RNA-introduced T lymphocytes as antigen-presenting cells, and the use of the induced T lymphocytes as a therapeutic agent for cancer or infectious diseases. Further, as HLA-A2402-restricted cytotoxic T lymphocytes (CTL) specific to tumor-associated antigens MAGE-A4 or SAGE, and antigen peptides that recognize them, as well as CTL inducers and anticancer agents thereof About the use of. Furthermore, the present invention relates to a tetramer obtained by tetramerizing an MHC-antigen peptide complex useful for detecting the CTL.

細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）には、抗原ペプチドと主要組織適合性抗原遺伝子複合体（major histo-compatibility gene complex；以下、ＭＨＣと略す）にコードされる主要組織適合性抗原ＭＨＣ（ヒトの場合 human leukocyte antigenと呼ばれ、以下、ＨＬＡと略す）分子との結合物である複合体を特異的なＴ細胞レセプター（T cell receptor；以下、ＴＣＲと略す）によって認識し、その複合体を細胞表面に提示している細胞を傷害することのできるものがある。このようなＣＴＬは自身と同じＨＬＡ分子を有する標的細胞のみを認識し傷害することから、ＨＬＡ拘束性ＣＴＬと呼ばれる。したがって該細胞傷害反応が成立するためには、１）特異的ＴＣＲを持ったＣＴＬが存在すること、２）ＨＬＡに提示されＣＴＬに認識される抗原ペプチドとなるために、ＨＬＡ分子との結合だけでなく、ＴＣＲによる認識を受ける複合体を形成できる抗原ペプチドが存在すること、が必要である。   Cytotoxic T lymphocytes (CTL) include a major histocompatibility antigen MHC (human human) encoded by an antigen peptide and a major histo-compatibility gene complex (hereinafter abbreviated as MHC). A human leukocyte antigen (hereinafter abbreviated as HLA) is a complex that binds to a molecule and is recognized by a specific T cell receptor (hereinafter abbreviated as TCR). Some can damage cells presenting on the surface. Such a CTL is called HLA-restricted CTL because it recognizes and damages only target cells having the same HLA molecule as itself. Therefore, in order for the cytotoxic reaction to be established, 1) the presence of a CTL having a specific TCR, and 2) the formation of an antigen peptide that is presented to the HLA and recognized by the CTL, so that it only binds to the HLA molecule. Rather, there must be an antigenic peptide that can form a complex that is recognized by the TCR.

このような抗原ペプチドは、例えば哺乳類細胞の細胞内で合成された抗原等が小胞体でプロセスされ、小さいエピトープペプチドに分解されることにより生じ、更にＨＬＡ分子と会合し、細胞表面に提示される。すなわち、多くのサブユニットよりなるプロテオソーム複合体の中で、タンパク質は８〜１５アミノ酸よりなるペプチドに分解され、そのうちのいくつかがＴＡＰトランスポーターにより細胞質から小胞体に運ばれる。これらのペプチドは小胞体でクラスＩ／β２ミクログロブリン（microglobulin）のヘテロダイマーに結合できれば、３分子複合体として安定化され、ゴルジ装置を通って、細胞表面に輸送される。腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原タンパク質を発現している腫瘍細胞は、腫瘍細胞表面にＴリンパ球に認識される、ＨＬＡ拘束性抗原ペプチドを提示できるはずである。
さらに、ウイルス、細菌や原虫、真菌による感染においても、これらの微生物の有する抗原に対するＣＴＬが感染防御に重要な役割を果していることが明らかにされている。 Such an antigen peptide is produced, for example, by processing an antigen synthesized in a mammalian cell in the endoplasmic reticulum and decomposing it into small epitope peptides, which are further associated with HLA molecules and presented on the cell surface. . That is, in a proteosome complex composed of many subunits, the protein is broken down into peptides consisting of 8 to 15 amino acids, and some of them are transported from the cytoplasm to the endoplasmic reticulum by the TAP transporter. If these peptides can bind to class I / β2 microglobulin heterodimers in the endoplasmic reticulum, they are stabilized as a trimolecular complex and transported through the Golgi apparatus to the cell surface. Tumor cells expressing tumor-associated antigens or tumor-specific antigen proteins should be able to present HLA-restricted antigen peptides that are recognized by T lymphocytes on the tumor cell surface.
Furthermore, it has been clarified that CTLs against antigens possessed by these microorganisms play an important role in infection protection even in the case of infection with viruses, bacteria, protozoa and fungi.

ＨＬＡクラスＩ分子は主としてＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃがあり、これらに結合して提示される抗原ペプチドは、８〜１０個のアミノ酸よりなり、更に各々のＨＬＡ分子によって異なる一定の構造上の特徴があることが知られている。例えば、世界的に最も頻度の高いＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合するペプチドとしてはＮ末端より２番目にＬｅｕ、且つＣ末端にＬｅｕ又はＶａｌを有する９〜１０個のアミノ酸よりなるペプチドが最も良く知られているものである。また、日本人を始めとするアジアの人種に多いＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチドはＮ末端より２番目にＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐのいずれか、且つＣ末端にＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅのいずれかを有する９〜１０個のアミノ酸よりなるものであるペプチドが最もよく知られている〔非特許文献１〕。   HLA class I molecules mainly include HLA-A, -B, and -C, and antigen peptides that are presented by binding to these consist of 8 to 10 amino acids, and have a specific structure that differs depending on each HLA molecule. It is known that For example, the most common peptide that binds to the HLA-A2.1 molecule in the world is the peptide consisting of 9 to 10 amino acids having Leu second from the N-terminus and Leu or Val at the C-terminus. It is a known one. In addition, peptides that bind to HLA-A24 molecules, which are common in Asian races including Japanese, are Tyr, Phe, Met, Trp second from the N terminus, and Leu, Ile, Trp, Peptides consisting of 9 to 10 amino acids having any of Phe are best known [Non-patent Document 1].

現在までに抗原ペプチドが同定されている腫瘍抗原としては、ＨＬＡ−Ａ１に対するＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＨＬＡ−Ａ２．１に対するＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＥＡ等、ＨＬＡ−Ｃｗ１に対するＭＡＧＥ−３、ＨＬＡ−Ｂ４４に対するＭＡＧＥ−３、ＨＬＡ−Ｂ３７に対するＭＡＧＥ−Ａ４、ＨＬＡ−Ａ２４に対してはＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＣＥＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、チロシナーゼ、β−カテニン（catenin）等がある。これらの中の多くは、まず腫瘍細胞を認識するクラスＩ拘束性のＣＴＬを株化し、このＣＴＬの認識する腫瘍抗原を同定し、続いて遺伝子工学的方法により腫瘍抗原タンパク質中最小単位を見出し、更にＨＬＡクラスＩ分子への結合モチーフに関する情報を基に最小単位中のペプチドが見出されている〔非特許文献２〕。また、まず前記のＨＬＡクラスＩ分子結合ペプチドに共通したモチーフ構造を基に、腫瘍抗原タンパク質中のＨＬＡクラスＩ分子結合ペプチドを見出し、続いて抗原提示細胞を利用してＣＴＬを誘導可能なものを選択した後、最終的に腫瘍細胞に対して傷害性を有するＣＴＬが誘導できているかどうかにより抗原ペプチドが決定されている〔非特許文献３、４〕。   Tumor antigens for which antigenic peptides have been identified to date include MAGE-1, MAGE-3 for HLA-A1, MAGE-3 for HLA-A2.1, MART1, tyrosinase, gp100, HER2 / neu, CEA, etc. MAGE-3 for HLA-Cw1, MAGE-3 for HLA-B44, MAGE-A4 for HLA-B37, MLA-1, MAGE-2, MAGE-3, CEA, HER2 / neu, tyrosinase for HLA-A24 , Β-catenin and the like. Many of them first established a class I-restricted CTL that recognizes tumor cells, identified the tumor antigen recognized by this CTL, and subsequently found the smallest unit in the tumor antigen protein by genetic engineering methods. Furthermore, peptides in the smallest unit have been found based on information on binding motifs to HLA class I molecules [Non-patent Document 2]. In addition, based on the motif structure common to the above-mentioned HLA class I molecule-binding peptides, HLA class I molecule-binding peptides in tumor antigen proteins are found, and then those that can induce CTLs using antigen-presenting cells After selection, the antigenic peptide is determined based on whether or not CTLs that are ultimately toxic to tumor cells can be induced [Non-patent Documents 3 and 4].

一方、ＨＬＡクラスＩ分子はいくつかのサブタイプに分類されるが、その保有サブタイプの種類は人種間で大きく異なり、世界的にはＨＬＡ−Ａ２が最も多く、白色人種の４５％を占めている。そして、このＨＬＡ−Ａ２拘束性の抗原ペプチドの同定が最も進んでいる。日本人ではＨＬＡ−Ａ２は４０％を占めるが、そのサブタイプを見ると白色人種と同じＨＬＡ−Ａ^*０２０１は２０％で、残りの多くはＡ^*０２０６である。これらのサブタイプへの結合ペプチドは異なり、主として研究されているＨＬＡ−Ａ２はＨＬＡ−Ａ^*０２０１である。一方、日本人ではＨＬＡ−Ａ２４が６０％以上を占めており、このＨＬＡ−Ａ２４はアジア人種では他の人種に比べて比率が高い。従って、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原ペプチドの発見はアジア人種、特に日本人において腫瘍細胞特異的に作用するＣＴＬを誘導する事による、腫瘍治療に有用なＣＴＬの提供に重要な役割を示す。 On the other hand, HLA class I molecules are classified into several subtypes, but the types of possessed subtypes vary greatly among races, and HLA-A2 is the most common in the world, accounting for 45% of white races. is occupying. And identification of this HLA-A2-restricted antigen peptide is most advanced. In Japanese, HLA-A2 accounts for 40%, but looking at its subtype, HLA-A ^* 0201 is 20%, and the rest is A ^* 0206. The binding peptides to these subtypes are different, and the mainly studied HLA-A2 is HLA-A ^* 0201. On the other hand, HLA-A24 accounts for 60% or more in Japanese, and the ratio of HLA-A24 is higher in Asian races than in other races. Therefore, the discovery of HLA-A24-restricted antigenic peptides has an important role in providing CTLs useful for tumor therapy by inducing CTLs that act specifically on tumor cells in Asian races, particularly Japanese.

同じ抗原でも、ＨＬＡの違いに基づいて抗原ペプチドが異なるため、抗原ペプチドを利用したＣＴＬの誘導は煩雑である。この問題を解決するために色々な工夫がなされているが、まだ満足できる成果は得られていない。工夫されていることの一つは、患者自身（自家）由来の抗原提示細胞に抗原遺伝子を形質導入し、これを利用したＴリンパ球誘導方法である。抗原提示細胞として、プロフェッショナル抗原提示細胞として知られている、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞が検討され、樹状細胞を中心として、ワクチンのアジュバント等として使用する臨床試験が実施されている〔非特許文献５〕。しかし、これらの抗原提示細胞は、免疫誘導に必要な量を準備するのに労力を要することが課題である。Ｂ細胞はＥＢウイルスによる不死化による大量調製が可能であるが、ウイルスを使用している点から安全性上問題がある。また、遺伝子導入法に関しても、ウイルスベクターやプラスミドＤＮＡを用いる遺伝子導入は、遺伝子が染色体上に挿入され、新たな変異体を生じる可能性が否定できない。   Even with the same antigen, the antigen peptide differs based on the difference in HLA, and therefore induction of CTL using the antigen peptide is complicated. Various attempts have been made to solve this problem, but satisfactory results have not yet been obtained. One of the devised methods is a method for inducing T lymphocytes by transducing an antigen gene into antigen-presenting cells derived from the patient himself (self). As antigen-presenting cells, B cells, macrophages, and dendritic cells, which are known as professional antigen-presenting cells, have been studied, and clinical trials using dendritic cells as a vaccine adjuvant and the like have been conducted [non- Patent Document 5]. However, it is a problem that these antigen-presenting cells require labor to prepare an amount necessary for immunity induction. B cells can be prepared in large quantities by immortalization with EB virus, but there is a problem in safety from the point of using virus. In addition, regarding gene transfer methods, gene transfer using a viral vector or plasmid DNA cannot be denied that the gene is inserted on the chromosome and a new mutant is generated.

ジャーナル オブ イムノロジー（J. Immunol.）、第１５５巻、第４３０７〜４３１２頁（１９９５）Journal of Immunol., 155, 4307-4312 (1995) プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ ザ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. U S A）、第９１巻、第３５１５〜３５１９頁（１９９４）Proceedings of the National Academy of the Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 91, pp. 3515-3519 (1994) プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第９１巻、第２１０５〜２１０９頁（１９９４）Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 91, 2105-2109 (1994) ジャーナル オブ イクスペリメンタル オブ メディシン（J. Exp. Med.）、第１７９巻、第９２１〜９３０頁（１９９４）Journal of Experimental of Medicine (J. Exp. Med.), 179, 921-930 (1994) ジャーナル オブ イムノセラピー（J. Immunotherapy ）、第２１巻、第４１〜４７頁（１９９８）Journal of Immunotherapy, Vol. 21, pp. 41-47 (1998)

ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原の場合、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＣＥＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、チロシナーゼ、βカテニン等があるがＨＬＡ−Ａ２．１に比べると未だにその解析は遅れており、種々の腫瘍抗原に対する新たな抗原ペプチドの発見が望まれる。したがってアジア人種、特に日本人において腫瘍細胞特異的に作用するＣＴＬの解析も遅れており、腫瘍治療に有用なＣＴＬの提供が不可能であった。   HLA-A24-restricted antigen peptides include MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, CEA, HER2 / neu, tyrosinase, β-catenin, etc. in the case of tumor-associated antigens, but still not as compared with HLA-A2.1. The analysis has been delayed, and the discovery of new antigenic peptides against various tumor antigens is desired. Therefore, analysis of CTLs that act specifically on tumor cells in Asian races, particularly Japanese, has also been delayed, and it has been impossible to provide CTLs useful for tumor treatment.

また、プロフェッショナル抗原提示細胞として知られている、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞を使用してＣＴＬ誘導を行う試みは、これらの細胞の取り扱い、例えば採取や拡大に問題を有している。なお、従来、Ｔリンパ球の抗原提示能については知られていない。   Attempts to induce CTLs using B cells, macrophages, and dendritic cells, known as professional antigen-presenting cells, have problems in handling these cells, for example, collection and expansion. Conventionally, the antigen presenting ability of T lymphocytes is not known.

ＣＴＬは、その細胞表面のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）とＣＤ３分子の複合体により、抗原提示細胞または標的細胞表面のＭＨＣ分子に結合している抗原ペプチドをＭＨＣ分子と共に認識して、活性化され、さまざまな免疫反応を起こすため、ＣＴＬの動態や機能に関する解析は、細胞自身を使用する必要があり、各種細胞株、抗原遺伝子形質転換株などを用いて、種々の工夫をしながら行われてきた。しかし、最近使用されているＭＨＣテトラマーはＭＨＣ−抗原ペプチド複合体をビオチン−ストレプトアビジン法で４量体化したものであり、抗原提示細胞や標的細胞の代わりに、また目的のＴＣＲを有するＣＴＬの特異的測定法として有用性が高いことが明らかになっている。しかし、ＴＣＲに応じて、すなわち、ＨＬＡおよび抗原ペプチドの違いに応じて、それぞれに必要なテトラマーが異なるため、多種類のテロラマーが必要とされている。   The CTL is activated by recognizing together with the MHC molecule the antigen peptide bound to the MHC molecule on the surface of the antigen-presenting cell or target cell by a complex of its cell surface T cell receptor (TCR) and the CD3 molecule, In order to cause various immune responses, analysis of CTL dynamics and functions requires the use of the cells themselves, and has been carried out using various cell lines, antigen gene transformants, etc. . However, the recently used MHC tetramer is a tetramer of the MHC-antigen peptide complex by the biotin-streptavidin method. Instead of antigen-presenting cells and target cells, CTLs having the desired TCR are also available. It has become clear that it is highly useful as a specific measurement method. However, depending on the TCR, that is, depending on the difference between the HLA and the antigenic peptide, different tetramers are required for each, and therefore, a large variety of telomers are required.

本発明者らは、腫瘍抗原に対する有用なＣＴＬの誘導方法を検討した結果、自家リンパ球をフィトヘムアグルチニン等のＴ細胞活性化剤で刺激し、これに抗原をコードするＲＮＡを電気穿孔法で導入したものを抗原提示細胞として使用したところ、抗原特異的なＣＴＬを誘導できることを明らかにした。さらに、腫瘍抗原であるＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＡＧＥに対するＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬを誘導し、このＣＴＬの認識するＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドが、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを同定した。そしてこの抗原ペプチドがヒト末梢血リンパ球よりＣＴＬを誘導するために有用であることを明らかにした。同時に、配列番号１または２の抗原ペプチドを使用して調製されるＭＨＣ−抗原ペプチド複合体をビオチン−ストレプトアビジンで４量体化したテトラマーを調製し、これがＣＴＬの検出に有用であることを明らかにし、本発明を完成させた。   As a result of studying a method for inducing a useful CTL against a tumor antigen, the present inventors have stimulated autologous lymphocytes with a T cell activator such as phytohemagglutinin, and electroporated RNA encoding the antigen thereto. It was clarified that the antigen-specific CTL can be induced by using the cells introduced in step 1 as antigen-presenting cells. Furthermore, HLA-A24-restricted CTL against MAGE-A4 and SAGE, which are tumor antigens, is induced, and the HLA-A24-restricted antigen peptide recognized by this CTL consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 Identified as a peptide. It was clarified that this antigen peptide is useful for inducing CTL from human peripheral blood lymphocytes. At the same time, a tetramer was prepared by tetramerizing MHC-antigen peptide complex prepared using the antigen peptide of SEQ ID NO: 1 or 2 with biotin-streptavidin, and this proved useful for the detection of CTL The present invention was completed.

本発明の第１の態様は、目的とする抗原をコードするＲＮＡを導入した、前記抗原を認識するＴリンパ球を誘導する活性を有するＴリンパ球に関する。   A first aspect of the present invention relates to a T lymphocyte having an activity of inducing a T lymphocyte recognizing the antigen, into which RNA encoding the target antigen is introduced.

本発明の第２の態様は、第１の態様のＴリンパ球を含有する免疫誘導剤に関する。   The second aspect of the present invention relates to an immunity-inducing agent containing the T lymphocyte of the first aspect.

本発明の第３の態様は、第１の態様のＴリンパ球を抗原提示細胞として使用することを特徴とする、前記抗原を認識するＴリンパ球の誘導方法に関する。   A third aspect of the present invention relates to a method for inducing a T lymphocyte that recognizes the antigen, wherein the T lymphocyte of the first aspect is used as an antigen-presenting cell.

本発明の第４の態様は、第２の態様のＴリンパ球の誘導方法によって誘導されたＴリンパ球を有効成分として含有してなるがんまたは感染症の治療剤に関する。   A fourth aspect of the present invention relates to a therapeutic agent for cancer or infectious disease comprising T lymphocytes induced by the T lymphocyte induction method of the second aspect as an active ingredient.

本発明の第５の態様は、配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を認識するＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球に関する。   According to a fifth aspect of the present invention, there is provided at least one antigen peptide selected from human major histocompatibility antigen (HLA) -A24-restricted antigen peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and a functional derivative thereof, and HLA- The present invention relates to a CD8-positive cytotoxic T lymphocyte that recognizes a cell that presents a complex with an A24 molecule on the cell surface.

本発明の第６の態様は、第５の態様の細胞傷害性Ｔリンパ球を有効成分として含有してなる制がん剤に関する。   The sixth aspect of the present invention relates to an anticancer drug comprising the cytotoxic T lymphocyte of the fifth aspect as an active ingredient.

本発明の第７の態様は、配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分として含有してなる、第５の態様の細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤に関する。   According to a seventh aspect of the present invention, at least one antigen peptide selected from human major histocompatibility antigen (HLA) -A24-restricted antigen peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and a functional derivative thereof is used as an active ingredient. It is related with the inducer of the cytotoxic T lymphocyte of the 5th aspect contained as.

本発明の第８の態様は、配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分として含有してなる制がん剤に関する。   In an eighth aspect of the present invention, at least one antigen peptide selected from human major histocompatibility antigen (HLA) -A24-restricted antigen peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and a functional derivative thereof is an active ingredient. It relates to an anticancer drug comprising as

本発明の第９の態様は、配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体を含有する、第５の態様の細胞傷害性Ｔリンパ球の有するＴ細胞レセプター検出用のテトラマーに関する。   The ninth aspect of the present invention is the cytotoxicity according to the fifth aspect, comprising the human major histocompatibility antigen (HLA) -A24-restricted antigen peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and a functional derivative thereof. The present invention relates to a tetramer for detecting a T cell receptor possessed by T lymphocytes.

本発明により、取得の容易なＴリンパ球を抗原提示細胞として使用するＣＴＬの誘導方法が提供される。また、（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性の新規な抗原ペプチドが提供される。前記の抗原提示細胞、抗原ペプチドを使用して誘導されるＣＴＬは、例えばがんの治療において有用である。   According to the present invention, a method for inducing CTL using T lymphocytes that can be easily obtained as antigen-presenting cells is provided. Moreover, a novel antigen peptide restricted by (HLA) -A24 is provided. CTLs induced using the antigen-presenting cells and antigen peptides are useful, for example, in the treatment of cancer.

ＨＨＤＡ２４０２＋／−β２ｍ−／− マウスにおけるペプチドの免疫原性を示す図である。 （ａ）ＥＢＮＡ３ＡｃＤＮＡ、（ｂ）ＭＡＧＥ−Ａ４ｃＤＮＡおよび（ｃ）ＳＡＧＥｃＤＮＡのプラスミドを用いて遺伝子銃で免疫したマウスから調製した脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。FIG. 2 shows the immunogenicity of peptides in HHDA2402 +/− β2m − / − mice. It is a figure which shows the result of the IFN-gamma ELISPOT assay of the CD8 + T cell derived from the spleen prepared from the mouse | mouth immunized with the gene gun using the plasmid of (a) EBNA3A cDNA, (b) MAGE-A4 cDNA, and (c) SAGE cDNA. ＭＡＧＥ−Ａ４由来ペプチドのヒトにおける免疫原性を示す図である。 （ａ）ＭＡＧＥ−Ａ４またはＳＡＧＥのｍＲＮＡを導入した自家ＣＤ４＋ＰＨＡ幼芽細胞で２回感作したヒトのバルクＣＴＬのＩＦＮ−γ ELISPOTアッセイの結果を示す図である。ＭＡＧＥ−Ａ４またはＳＡＧＥのｍＲＮＡを導入した自家ＬＣＬをＡＰＣとして使用した。 （ｂ）ウェル＃２をＭＡＧＥ−Ａ４またはＳＡＧＥのｍＲＮＡを導入した自家ＬＣＬ、自家ＰＢＭＣとＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）で増幅した結果を示す図である。得られた細胞を候補ペプチドをパルスしたＴ２Ａ２４をＡＰＣとして使用してELISPOTアッセイを行った。It is a figure which shows the immunogenicity in a human of a MAGE-A4 origin peptide. (A) It is a figure which shows the result of the IFN-gamma ELISPOT assay of the human bulk CTL sensitized twice with the autologous CD4 + PHA blast cell which introduce | transduced MAGE-A4 or SAGE mRNA. Autologous LCL introduced with MAGE-A4 or SAGE mRNA was used as APC. (B) It is a figure which shows the result of having amplified well # 2 by the autologous LCL which introduce | transduced MAGE-A4 or SAGE mRNA, autologous PBMC, and IL-2 (20 IU / ml). The obtained cells were subjected to ELISPOT assay using T2A24 pulsed with a candidate peptide as APC. MAGE-A4_143-151ペプチドの細胞内でプロセス後にＨＬＡ−Ａ２４０２と共に細胞表面へ提示した結果を示す図である。 （aの左）MAGE-A4_143-151特異的ＣＴＬ＃２−２８細胞はMAGE-A4_143-151A24テトラマー染色で陽性であり、（aの右）対照テトラマーでは陰性であった。（ｂの左）この＃２−２８細胞はＨＬＡ−Ａ２４０２依存性にMAGE-A4_143-151特異的な細胞傷害性を示し、また、（ｂの右）ＨＬＡ−Ａ２４０２とＭＡＧＥ−Ａ４を発現する腫瘍細胞株で細胞内でプロセスされたMAGE-A4_143-151ペプチドを認識した。It is a figure which shows the result of having shown to the cell surface with HLA-A2402 after the process in the cell of the MAGE-A4 _143-151 peptide. (Left of a) MAGE-A4 _143-151 specific CTL # 2-28 cells were positive with MAGE-A4 _143-151 A24 tetramer staining (right of a) negative with control tetramer. (Left to b) This # 2-28 cell shows MAGE-A4 _143-151- specific cytotoxicity depending on HLA-A2402, and (right to b) expresses HLA-A2402 and MAGE-A4 The tumor cell line recognized MAGE-A4 _143-151 peptide processed intracellularly. SAGE_715-723ペプチドのヒトにおける免疫原性を示す図である。 （ａ）ＳＡＧＥ ｍＲＮＡ導入自家ＣＤ４＋ＰＨＡ幼芽細胞で２回感作して得られたヒトバルクＣＴＬ細胞を用いたＩＦＮ−γ ELISPOTアッセイの結果を示す図である。標的細胞としては、SAGE_715-723ペプチドをパルスした、または対照ペプチドをパルスしたＴ２Ａ２４細胞を使用した。 （ｂ）ウェル＃２のバルクＣＴＬを拡大培養した結果を示す図である。得られたＣＴＬはSAGE_715-723A24テトラマー染色で陽性であった。 （ｃ）SAGE_715-723ペプチドをパルスしたＴ２Ａ２４を標的細胞として使用した場合だけにＩＦＮ−γを遊離した。It is a figure which shows the immunogenicity in human of SAGE _715-723 peptide. (A) It is a figure which shows the result of the IFN-gamma ELISPOT assay using the human bulk CTL cell obtained by sensitizing twice with SAGE mRNA introduction | transduction autologous CD4 + PHA blast cells. As target cells, T2A24 cells pulsed with SAGE _715-723 peptide or pulsed with control peptide were used. (B) It is a figure which shows the result of having expanded and cultured bulk CTL of well # 2. The obtained CTL was positive by SAGE _715-723 A24 tetramer staining. (C) IFN-γ was released only when T2A24 pulsed with SAGE _715-723 peptide was used as a target cell. SAGE_715-723ペプチドの細胞内プロセス後のＨＬＡ−Ａ２４０２と共に細胞表面へ提示した結果を示す図である。 （ａ）SAGE_715-723特異的バルクＣＴＬから得られたSAGE_715-723特異的ＣＴＬ＃２２細胞は、SAGE_715-723A24テトラマー染色で陽性であった。 （ｂ）この＃２２細胞（１×１０⁴個）と、ＳＡＧＥ ｃＤＮＡ形質転換２９３Ａ２４細胞（１×１０⁴個）を９６ウェル丸底プレートで１８時間培養したところ、ＩＦＮ−γが遊離された。 （ｃ）この＃２２細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４０２およびＳＡＧＥを発現するＫ５６２Ａ２４とＲ２７Ａ２４に細胞傷害性を示した（ｃの左と中）。また、ＳＡＧＥ ｍＲＮＡを導入したＡ２４０２陽性のＬＣＬに対しても特異的細胞傷害性を示した（ｃの右）。It is a figure which shows the result of having shown to the cell surface with HLA-A2402 after the intracellular process of a SAGE _715-723 peptide. (A) SAGE _715-723 SAGE _715-723 specific CTL # 22 cells obtained from specific bulk CTL was positive in SAGE _715-723 A24 tetramer staining. (B) When # 22 cells (1 × 10 ⁴ cells) and SAGE cDNA-transformed 293A24 cells (1 × 10 ⁴ cells) were cultured in a 96-well round bottom plate for 18 hours, IFN-γ was released. (C) The # 22 cells were cytotoxic to K562A24 and R27A24 expressing HLA-A2402 and SAGE (left and middle in c). It also showed specific cytotoxicity against A2402-positive LCL introduced with SAGE mRNA (right of c). 健常人ＰＢＭＣの中のSAGE_715-723特異的プレカーサーを検出した結果を示す図である。 各ウェルに５×１０⁵個のＣＤ８＋Ｔ細胞を入れ、これをSAGE_715-723ペプチドをパルスしたＣＤ８−ＰＢＭＣで感作した。１０日目に、テトラマーアッセイを行ったところ、試験した６人中３人でSAGE_715-723A24テトラマー陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞が検出された。図６はその一例の解析結果である。It is a figure which shows the result of having detected the SAGE _715-723 specific precursor in healthy person PBMC. 5 × 10 ⁵ CD8 + T cells were placed in each well and sensitized with CD8-PBMC pulsed with SAGE _715-723 peptide. A tetramer assay was performed on the 10th day, and SAGE _715-723 A24 tetramer positive CD8 + T cells were detected in 3 out of 6 people tested. FIG. 6 shows an example of the analysis result.

本発明の第１の態様は、目的とする抗原をコードするＲＮＡを導入した自家Ｔリンパ球を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用することを特徴とする、該抗原認識性のＴリンパ球を誘導する方法に関する。   A first aspect of the present invention is to induce an antigen-recognizing T lymphocyte, wherein an autologous T lymphocyte into which an RNA encoding a target antigen is introduced is used as an antigen-presenting cell (APC). On how to do.

本発明には、当該抗原を特異的に認識する細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導が望まれる抗原（目的とする抗原）をコードするＲＮＡが使用される。前記抗原には特に限定はないが、例えば、腫瘍関連抗原、感染性微生物抗原が例示される。   In the present invention, RNA encoding an antigen (target antigen) for which induction of cytotoxic T lymphocytes that specifically recognize the antigen is desired is used. The antigen is not particularly limited, and examples thereof include tumor-associated antigens and infectious microorganism antigens.

腫瘍関連抗原としては、ＭＡＧＥファミリーのほか、ＳＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、ｈＴＥＲＴ等があげられる。感染性微生物抗原としては、ＥＢＮＡ−３Ａ等のＥＢウイルス抗原、ＣＭＶｐｐ６５等のサイトメガロウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ＨＩＶウイルス抗原、Salmonella抗原、Shigella抗原、Enterobacter抗原、原虫や真菌由来の抗原などが挙げられる。   Examples of tumor-associated antigens include SAGE, LAGE, NY-ESO-1, WT-1, and hTERT in addition to the MAGE family. Infectious microorganism antigens include EB virus antigens such as EBNA-3A, cytomegalovirus antigens such as CMVpp65, herpes virus antigens, influenza virus antigens, HIV virus antigens, Salmonella antigens, Shigella antigens, Enterobacter antigens, protozoa and fungi Examples include antigens.

抗原をコードするＲＮＡは通常の遺伝子工学的手法により調製することが可能である。また、細胞から調製したＲＮＡも使用可能である。例えば、抗原をコードするＲＮＡを細胞より抽出してｃＤＮＡに逆転写し、このｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅しておけば、この増幅ＤＮＡをテンプレートにして転写したＲＮＡを本発明に使用することができる。ｃＤＮＡがクローニングされたプラスミドが得られている場合は、これをＲＮＡ合成のテンプレートとして使用可能である。このような手法により、少量の細胞からでも本発明に使用可能な十分量のＲＮＡを調製することが可能である。   The RNA encoding the antigen can be prepared by ordinary genetic engineering techniques. Moreover, RNA prepared from cells can also be used. For example, if RNA encoding an antigen is extracted from a cell and reverse transcribed into cDNA, and this cDNA is amplified by PCR, RNA transcribed using this amplified DNA as a template can be used in the present invention. When a plasmid in which cDNA is cloned is obtained, it can be used as a template for RNA synthesis. By such a technique, it is possible to prepare a sufficient amount of RNA that can be used in the present invention even from a small amount of cells.

抗原提示細胞として使用されるＴリンパ球に抗原をコードするＲＮＡを人為的に導入する方法には特に限定はなく、エレクトロポレーション（電気穿孔法）、パーティクルガン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、リポソーム法などの物理的方法で導入することができる。また、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いた遺伝子導入を行い、細胞内でＲＮＡを発現させることができる。   There is no particular limitation on the method for artificially introducing RNA encoding the antigen into T lymphocytes used as antigen-presenting cells. Electroporation (electroporation), particle gun method, calcium phosphate method, lipofection method, liposome It can be introduced by physical methods such as law. Alternatively, RNA can be expressed in cells by introducing a gene using a viral vector such as a retroviral vector, a lentiviral vector, or an adenoviral vector.

抗原提示細胞として使用されるＴリンパ球は患者自身のＣＤ３陽性細胞（自家Ｔリンパ球）、もしくは患者とＨＬＡのタイプが一致するドナー由来のＣＤ３陽性細胞であれば、ＣＤ４、ＣＤ８陽性いずれでも良いが、好ましくはＣＤ４陽性Ｔリンパ球である。なお、同種造血幹細胞移植等の移植を受けた患者では、移植片のドナーのＴリンパ球を使用することも可能である。Ｔリンパ球はフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）等のレクチンや抗ＣＤ３抗体を用いて、ＩＬ−２、ＩＬ−７などを添加した培地で活性化することが必要である。活性化に使用される条件は通常使用される条件であれば特に特定されない。抗原提示細胞として使用するために、ガンマ線照射やマイトマイシンなどの処理をされる。   The T lymphocyte used as the antigen-presenting cell may be either CD4 or CD8 positive as long as it is a patient's own CD3 positive cell (autologous T lymphocyte) or a CD3 positive cell derived from a donor whose HLA type matches that of the patient. Are preferably CD4-positive T lymphocytes. In patients who have undergone transplantation such as allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, it is also possible to use T lymphocytes of the donor of the transplant. T lymphocytes need to be activated in a medium supplemented with IL-2, IL-7, etc., using a lectin such as phytohemaglutinin (PHA), concanavalin A (ConA), or an anti-CD3 antibody. The conditions used for activation are not particularly specified as long as they are normally used. In order to use it as an antigen-presenting cell, it is treated with gamma irradiation or mitomycin.

上記の第１の態様のＴリンパ球を抗原提示細胞として使用し、抗原認識製Ｔリンパ球を誘導することができる（本発明の第３の態様）。誘導される抗原認識性Ｔリンパ球は、ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはＣＤ４陽性のヘルパーＴリンパ球のいずれかであるが、使用される出発材料によって異なり、例えば、血液から採取した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）や、ＰＢＭＣより抗ＣＤ８抗体と磁気ビーズを使用した方法で分離したＣＤ８陽性リンパ球が使用可能であり、ＰＢＭＣを使用すれば、抗原認識性ＣＴＬ及びヘルパーＴリンパ球の通常両者が混在したリンパ球が得られるが、ＣＤ８陽性細胞を使用すれば、ＣＴＬを含有するリンパ球が得られる。   The T lymphocyte according to the first aspect described above can be used as an antigen-presenting cell to induce antigen-recognized T lymphocytes (third aspect of the present invention). The antigen-recognizing T lymphocytes that are induced are either CD8 positive cytotoxic T lymphocytes (CTL) or CD4 positive helper T lymphocytes, but depend on the starting material used, for example from blood Collected peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and CD8 positive lymphocytes separated from PBMC by using anti-CD8 antibody and magnetic beads can be used, and if PBMC is used, antigen-recognizing CTL and helper T Lymphocytes usually containing both lymphocytes can be obtained. If CD8 positive cells are used, lymphocytes containing CTL can be obtained.

イン ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で該ＣＴＬを誘導する場合、例えば上記のＴリンパ球とＨＬＡのタイプが一致する生体よりの体外摘出試料を用い誘導することができる。本明細書における体外摘出試料とは、血液のほか、手術などにより摘出したリンパ節、脾臓、その他各種臓器が包含され、これらの試料に存在するリンパ球や浸潤リンパ球細胞が好適に使用される。   When the CTL is induced in vitro, it can be induced using, for example, an in vitro extracted sample from a living body having the same type of T lymphocyte and HLA. The extracorporeal sample in this specification includes blood, lymph nodes, spleen, and other various organs removed by surgery, etc., and lymphocytes and infiltrating lymphocyte cells present in these samples are preferably used. .

例えば血液を用いる場合、ＨＬＡタイプが一致するヒトの血液より調製した末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cells；以下、ＰＢＭＣと略す）より得られるリンパ球に、上記の抗原ＲＮＡを導入したＴリンパ球による抗原刺激を繰り返し与えることによりＣＴＬを誘導することができる。誘導されたＣＴＬは、クローン化することにより安定した細胞傷害性を有するリンパ球として維持することもできる。例えば、誘導されたＣＴＬにフィーダー細胞、抗原、各種サイトカイン、抗ＣＤ３抗体刺激を与えることにより増殖させることができる。   For example, when blood is used, T lymphocytes obtained by introducing the above antigen RNA into lymphocytes obtained from peripheral blood mononuclear cells (hereinafter referred to as PBMC) prepared from human blood of the same HLA type. CTL can be induced by repeatedly applying antigen stimulation with spheres. The induced CTL can be maintained as lymphocytes having stable cytotoxicity by cloning. For example, the induced CTL can be proliferated by giving a feeder cell, antigen, various cytokines, and anti-CD3 antibody stimulation.

誘導された抗原特異的ＣＴＬの活性は、ＣＴＬを誘導した抗原由来のペプチドをパルスした後、放射性物質等で標識した標的細胞に対する傷害性（放射性物質の遊離）によって測定できる。また、抗原ペプチドをパルスした抗原提示細胞に対するＣＴＬの増殖反応を放射能の取り込みによって測定することも可能である。抗原ＤＮＡで形質導入、または抗原ＲＮＡを導入した標的細胞または抗原提示細胞として使用可能である。またはＣＴＬや標的細胞より抗原特異的に遊離される抗原特異的なＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ等サイトカイン量を測定することにより検出することができる。その他蛍光色素等によって標識された抗原ペプチド−ＨＬＡ複合体の使用によって直接確認することもできる。この場合、例えばＣＴＬをＣＴＬ特異的抗体とカップリングさせた第１蛍光マーカーと接触させてから第２蛍光マーカーとカップリングさせた抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体を接触させ、そして二重標識細胞の存在をＦＡＣＳ（fluorescence−activated cell sorting）分析によって行ことができる。   The activity of the induced antigen-specific CTL can be measured by damaging a target cell labeled with a radioactive substance or the like (release of the radioactive substance) after pulsing a peptide derived from the antigen that induced the CTL. It is also possible to measure the proliferation response of CTL to antigen-presenting cells pulsed with an antigen peptide by radioactivity uptake. It can be used as a target cell or antigen-presenting cell into which antigen DNA is transduced or antigen RNA is introduced. Alternatively, it can be detected by measuring the amount of cytokines such as antigen-specific GM-CSF and IFN-γ that are specifically released from CTLs and target cells. In addition, it can be directly confirmed by using an antigen peptide-HLA complex labeled with a fluorescent dye or the like. In this case, for example, CTL is contacted with a first fluorescent marker coupled with a CTL-specific antibody, and then an antigen peptide-MHC complex coupled with a second fluorescent marker is contacted, and the presence of a double-labeled cell Can be performed by FACS (fluorescence-activated cell sorting) analysis.

こうして、第１の態様のＴリンパ球を使用して誘導されたＣＴＬは、がんまたは感染症の治療剤として使用することができる（本発明の第４の態様）。当該治療剤は、後述の第６の態様の制がん剤に準じて製剤化し、治療に供することができる。   Thus, the CTL induced using the T lymphocytes of the first aspect can be used as a therapeutic agent for cancer or infectious diseases (the fourth aspect of the present invention). The therapeutic agent can be formulated according to the anticancer agent of the sixth aspect described later and used for treatment.

本発明の第２の態様は第１の態様のＴリンパ球を有効成分として含有してなる免疫誘導剤に関する。該免疫誘導剤は、該Ｔリンパ球を医薬的に許容される希釈剤に懸濁した形で提供される。なお、ここで言う希釈剤とは例えば該Ｔリンパ球の保存に適した培地、生理食塩水、又はリン酸緩衝生理食塩水である。培地としては、特に限定するものではないが、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ１０などの培地が一般的に挙げられる。また該免疫誘導剤には医薬的に許容される担体が安定化の目的で添加されていてもよい。なおここで言う担体とはヒト血清アルブミン等である。該免疫誘導剤には第１の態様のＴリンパ球を、Ｔリンパ球１種類当り１０⁴〜１０⁸個／ｍｌ、好ましくは５×１０⁵〜５×１０⁷個／ｍｌ含有させる。 The second aspect of the present invention relates to an immunity-inducing agent comprising the T lymphocyte of the first aspect as an active ingredient. The immunity-inducing agent is provided in the form of the T lymphocytes suspended in a pharmaceutically acceptable diluent. The diluent referred to here is, for example, a medium, physiological saline, or phosphate buffered saline suitable for storage of the T lymphocytes. Although it does not specifically limit as a culture medium, Media, such as RPMI, AIM-V, and X-VIVO10, are generally mentioned. In addition, a pharmaceutically acceptable carrier may be added to the immunity-inducing agent for the purpose of stabilization. The carrier referred to here is human serum albumin or the like. The immunity-inducing agent contains the T lymphocytes of the first aspect at 10 ⁴ to 10 ⁸ cells / ml, preferably 5 × 10 ^{5 to} 5 × 10 ⁷ cells / ml per T lymphocyte type.

前記の免疫誘導剤は前記Ｔリンパ球のドナーに対して（autologous）投与できるほか、ＨＬＡのタイプが一致する別の個体に（allogenic）投与することができる。上記免疫誘導剤をヒトに投与する場合、例えば皮下、皮内、静脈内へ注射器で投与することができ、成人１人当りの投与量としては通常Ｔリンパ球数が、Ｔリンパ球１種類当り１０⁶〜１０¹⁰個となるようにする。なお上記範囲は目安でありこれに限定されるものではない。さらに、当該製剤の投与は所望の効果が得られるまで反復することができる。また有効成分であるＴリンパ球１種類当り１０⁶〜１０¹⁰個となるようにする。なお上記範囲は目安でありこれに限定されるものではない。また、含有される細胞は、投与するヒト由来のもの、もしくはＨＬＡのタイプが同一であるため、該免疫誘導剤の毒性は特に認められない。 The immunity-inducing agent can be administered to the T lymphocyte donor (autologous) or can be administered to another individual with a matching HLA type (allogenic). When the immunity-inducing agent is administered to humans, it can be administered, for example, subcutaneously, intradermally or intravenously with a syringe. The dose per adult is usually T lymphocytes per T lymphocyte. 10 ⁶ to 10 ¹⁰ . In addition, the said range is a standard and is not limited to this. Furthermore, the administration of the formulation can be repeated until the desired effect is obtained. The number of T lymphocytes as active ingredients is 10 ⁶ to 10 ¹⁰ . In addition, the said range is a standard and is not limited to this. In addition, since the contained cells are derived from the human being administered or have the same HLA type, toxicity of the immunity-inducing agent is not particularly observed.

前記の免疫誘導剤が投与された個体においては、該免疫誘導剤に含有されるＴリンパ球に導入されたＲＮＡにコードされた抗原を認識するＣＴＬが誘導される。   In an individual administered with the immunity-inducing agent, CTL that recognizes an antigen encoded by RNA introduced into T lymphocytes contained in the immunity-inducing agent is induced.

本発明の第５の態様は、配列番号１または２で表されるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドまたはその機能的誘導体とＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を認識するＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。配列番号１、２に示されるアミノ酸配列のペプチドはそれぞれＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＡＧＥ由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドである。従って、前記ＣＴＬは標的細胞または抗原提示細胞に対して特異的に細胞溶解又はサイトカイン遊離反応等を起こす。   In a fifth aspect of the present invention, CD8 recognizes a cell presenting a complex of the HLA-A24-restricted antigen peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or a functional derivative thereof and an HLA-A24 molecule on the cell surface. Positive cytotoxic T lymphocytes (CTL). The peptides having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 are MAGE-A4 and SAGE-derived HLA-A24-restricted antigen peptides, respectively. Therefore, the CTL specifically causes cell lysis or cytokine release reaction with respect to target cells or antigen-presenting cells.

本明細書において、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドの機能的誘導体とは、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体形成能を有すると共に、形成された複合体が配列番号１又は２で表される抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を認識するＣＴＬに認識されるものを意味する。例えば、配列番号１又は２で表されるペプチドのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が、欠失、他のアミノ酸若しくはアミノ酸アナログに置換、及び／又は１又は数個のアミノ酸若しくはアミノ酸アナログの付加、又はそれらの組み合わせによってアミノ酸配列は異なるが、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体形成能を有すると共に、形成された複合体が本発明のＣＴＬに認識されるペプチドである。機能的誘導体のアミノ酸配列長は、９〜１０残基が好ましいが、これに特に限定されない。なお、本明細書におけるアミノ酸アナログとは、種々のアミノ酸のＮ−アシル化物、Ｏ−アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等を意味する。   In the present specification, a functional derivative of an HLA-A24-restricted antigen peptide has an ability to form a complex with an HLA-A24 molecule, and the formed complex is represented by SEQ ID NO: 1 or 2. It is recognized by CTL that recognizes the complex of HLA-A24 molecule. For example, in the amino acid sequence of the peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2, one or several amino acids are deleted, substituted with other amino acids or amino acid analogs, and / or one or several amino acids or amino acid analogs The amino acid sequence varies depending on the addition or a combination thereof, but has the ability to form a complex with the HLA-A24 molecule, and the formed complex is a peptide recognized by the CTL of the present invention. The amino acid sequence length of the functional derivative is preferably 9 to 10 residues, but is not particularly limited thereto. The amino acid analog in the present specification means N-acylated products, O-acylated products, esterified products, acid amidated products, alkylated products and the like of various amino acids.

また、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体がＣＴＬに認識されれば、抗原ペプチドのＮ末端や遊離のアミノ基は、ホルミル基、アセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）基等が結合していてもよい。また、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体がＣＴＬに認識されれば、抗原ペプチドのＣ末端や遊離のカルボキシル基は、メチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基等が結合していてもよい。   In addition, if a complex with HLA-A24 molecule is recognized by CTL, the N-terminus and free amino group of the antigen peptide are bound to formyl group, acetyl group, t-butoxycarbonyl (t-Boc) group and the like. It may be. In addition, if the complex with HLA-A24 molecule is recognized by CTL, the C-terminus and free carboxyl group of the antigen peptide may be bonded to a methyl group, an ethyl group, a t-butyl group, a benzyl group, or the like. Good.

機能的誘導体は、配列番号１又は２で表される抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を認識するＣＴＬを用いることにより同定することが出来、例えば、下記方法が挙げられる。   The functional derivative can be identified by using CTL that recognizes a complex of the antigen peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and the HLA-A24 molecule, and examples thereof include the following methods.

第１の方法は、機能的誘導体としての候補物質とＨＬＡ−Ａ２４発現細胞を混合し、ＨＬＡ−Ａ２４分子に未結合の候補物質を洗浄後、ＣＴＬと反応させる。候補物質特異的な、細胞傷害性、サイトカイン遊離、又は増殖反応が認められれば機能的誘導体であると判断出来る。   In the first method, a candidate substance as a functional derivative is mixed with HLA-A24-expressing cells, and a candidate substance unbound to the HLA-A24 molecule is washed and then reacted with CTL. If a candidate substance-specific cytotoxicity, cytokine release, or proliferative response is observed, it can be judged as a functional derivative.

第２の方法としては、候補物質を抗原提示能を有する細胞に添加し、適当な時間、例えば、抗原が細胞内に取り込まれプロセッシングを受け、抗原ペプチドとＨＬＡ分子複合体が細胞表面に提示されるために要する時間、反応させた後、ＣＴＬと反応させる。候補物質特異的なサイトカイン遊離又は増殖反応が認められれば、該物質は機能的誘導体であると判断出来る。   As a second method, a candidate substance is added to a cell having an antigen-presenting ability, and for an appropriate time, for example, the antigen is taken into the cell and processed, and the antigen peptide and the HLA molecule complex are presented on the cell surface. After reacting for the time required for the reaction, it is reacted with CTL. If a candidate substance-specific cytokine release or proliferation reaction is observed, it can be determined that the substance is a functional derivative.

第３の方法としては、後述の抗原提示能を有する細胞上のＨＬＡ−Ａ２４分子上にペプチドを提示させることが可能な発現ベクターに候補物質のアミノ酸配列をコードする核酸を結合させ、該組換えベクターにより形質転換された抗原提示能を有する細胞とＣＴＬを反応させる。候補物質特異的なサイトカイン遊離又は増殖反応が認められれば、該物質は機能的誘導体であると判断出来る。   As a third method, a nucleic acid encoding the amino acid sequence of a candidate substance is bound to an expression vector capable of presenting a peptide on an HLA-A24 molecule on a cell having the antigen-presenting ability described later, and the recombination is performed. CTLs are reacted with cells having antigen-presenting ability transformed with a vector. If a candidate substance-specific cytokine release or proliferation reaction is observed, it can be determined that the substance is a functional derivative.

上記機能的誘導体としては、例えば、配列番号１又は２で表されるペプチドのアミノ酸配列において、ＨＬＡ−Ａ２４分子への結合を強めるために、Ｎ末端より２番目のアミノ酸がＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチドに特徴的なＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐより選択されるアミノ酸に置換、及び／又はＣ末端のアミノ酸がＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチドに特徴的なＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅより選択されるアミノ酸に置換されたペプチドのうち、ＨＬＡ−Ａ２４分子との結合能を有し、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体が配列番号１又は２記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体をＣＴＬに認識されるペプチドが挙げられる。例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸であるＰｈｅをＬｅｕに置換したペプチドが挙げられる。   As the functional derivative, for example, in the amino acid sequence of the peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2, the second amino acid from the N-terminal binds to the HLA-A24 molecule in order to strengthen the binding to the HLA-A24 molecule. Substitution with amino acids selected from Tyr, Phe, Met, Trp, which are characteristic for peptides to be selected, and / or selection from Leu, Ile, Trp, Phe, which is characteristic for peptides whose C-terminal amino acid binds to HLA-A24 molecule Among the peptides substituted with the amino acid to be bound, the complex with the HLA-A24 molecule is a complex of the peptide of SEQ ID NO: 1 or 2 and the HLA-A24 molecule. Examples include peptides recognized by CTL. For example, the peptide which substituted Phe which is the C terminal amino acid of the amino acid sequence of sequence number 2 by Leu is mentioned.

また、配列番号１又は２記載のアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列で表されるペプチドにおいて、置換されるそれぞれのアミノ酸と側鎖の類似したアミノ酸若しくはアミノ酸アナログに置換したペプチドのうち、ＨＬＡ−Ａ２４分子と結合能を有し、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体が本発明のＣＴＬに認識されるペプチドも挙げられる。側鎖の類似したアミノ酸としては、例えば、グリシン（Ｇｌｙ）とアラニン（Ａｌａ）；バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とメチオニン（Ｍｅｔ）；アスパラギン（Ａｓｎ）とグルタミン（Ｇｌｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）とグルタミン酸（Ｇｌｕ）；セリン（Ｓｅｒ）とスレオニン（Ｔｈｒ）；リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）とチロシン（Ｔｙｒ）が挙げられる。   In addition, in the peptide represented by the amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 were substituted, each substituted amino acid was substituted with an amino acid or amino acid analog having a similar side chain. Among the peptides, peptides having binding ability with HLA-A24 molecules and having complexes with HLA-A24 molecules recognized by the CTLs of the present invention are also included. Examples of amino acids having similar side chains include glycine (Gly) and alanine (Ala); valine (Val), isoleucine (Ile), leucine (Leu) and methionine (Met); asparagine (Asn) and glutamine (Gln). Aspartic acid (Asp) and glutamic acid (Glu); serine (Ser) and threonine (Thr); lysine (Lys) and arginine (Arg); phenylalanine (Phe) and tyrosine (Tyr).

本発明の第６の態様は、第５の態様のＣＴＬを有効成分として含有する制がん剤に関する。   The sixth aspect of the present invention relates to a cancer drug containing the CTL of the fifth aspect as an active ingredient.

該制がん剤は、特に第５の態様のＣＴＬが認識する抗原、すなわちＭＡＧＥ−４またはＳＡＧＥの発現が認められるがんの治療に有用である。   The anticancer agent is particularly useful for the treatment of cancer in which expression of an antigen recognized by the CTL of the fifth aspect, that is, MAGE-4 or SAGE is observed.

該制がん剤は、前記のＣＴＬを医薬的に許容される希釈剤に懸濁した形で提供される。なお、ここで言う希釈剤とは例えば該ＣＴＬの保存に適した培地、生理食塩水、又はリン酸緩衝生理食塩水である。培地としては、特に限定するものではないが、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ１０などの培地が一般的に挙げられる。また該制がん剤には医薬的に許容される担体が安定化の目的で添加されていてもよい。なおここで言う担体とはヒト血清アルブミン等である。該制がん剤には第５の態様のＣＴＬを、ＣＴＬ１種類当り１０⁴〜１０⁸個／ｍｌ、好ましくは５×１０⁵〜５×１０⁷個／ｍｌ含有させる。 The anticancer agent is provided in a form in which the CTL is suspended in a pharmaceutically acceptable diluent. The diluent referred to here is, for example, a medium, physiological saline, or phosphate buffered saline suitable for storing the CTL. Although it does not specifically limit as a culture medium, Media, such as RPMI, AIM-V, and X-VIVO10, are generally mentioned. In addition, a pharmaceutically acceptable carrier may be added to the anticancer agent for the purpose of stabilization. The carrier referred to here is human serum albumin or the like. The anticancer agent contains the CTL of the fifth aspect at 10 ⁴ to 10 ⁸ / ml, preferably 5 × 10 ^{5 to} 5 × 10 ⁷ / ml per CTL type.

上記制がん剤をヒトに投与する場合注射器で投与することができ、成人１人当りの投与量としては通常ＣＴＬ数が、ＣＴＬ１種類当り１０⁶〜１０¹⁰個となるようにする。なお、上記範囲は目安でありこれに限定されるものではない。また、有効成分であるＣＴＬは投与するヒト由来のもの、もしくはＨＬＡのタイプが同一であるため、該免疫誘導剤の毒性は特に認められない。 When the anticancer drug is administered to humans, it can be administered with a syringe, and the dose per adult is usually 10 ⁶ to 10 ¹⁰ per CTL type. In addition, the said range is a standard and is not limited to this. Moreover, since the CTL which is an active ingredient is derived from the human to be administered or the HLA type is the same, toxicity of the immunity-inducing agent is not particularly recognized.

本発明の第７の態様は、配列番号１または２の抗原ペプチドまたはその機能的誘導体を有効成分として含有する第５の態様のＣＴＬの誘導剤に関する。ＣＴＬ誘導剤は、抗原ペプチドを単独、又は他の分子（ヘルパーＴ細胞抗原ペプチド及び／又はアジュバント）との混合物として生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した形で供給される。該抗原ペプチドは、高級脂肪酸やヘルパーＴ細胞抗原ペプチドとの共有結合体あるいはＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体としてもよい。該誘導剤には抗原ペプチドを、抗原ペプチド１種類当り０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜９５重量％含有させる。   The seventh aspect of the present invention relates to the CTL inducer of the fifth aspect, which contains the antigenic peptide of SEQ ID NO: 1 or 2 or a functional derivative thereof as an active ingredient. The CTL inducer is supplied in a form suspended in physiological saline or phosphate buffered saline as an antigen peptide alone or as a mixture with other molecules (helper T cell antigen peptide and / or adjuvant). The antigen peptide may be a covalent conjugate with a higher fatty acid or a helper T cell antigen peptide or a complex with an HLA-A24 molecule. The inducer contains 0.01 to 100% by weight, preferably 0.1 to 95% by weight, of an antigen peptide per type of antigen peptide.

該ＣＴＬ誘導剤は、イン ビトロで本発明のＣＴＬを増殖させるための培地への添加物、Ｔリンパ球増殖活性、遅延型皮膚反応を指標とした免疫感作状態の診断などに利用することができる。例えば培地への添加物として使用する場合、使用量は培地中のペプチド濃度として、抗原ペプチド１種類当り１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌである。培地としては血清を含有するＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖなどの培地が一般的に挙げられる。   The CTL inducer can be used for in vitro diagnosis of an immunization state using, for example, an additive to a medium for growing the CTL of the present invention, T lymphocyte proliferation activity, and delayed skin reaction as an index. it can. For example, when used as an additive to the medium, the amount used is 1 ng / ml to 100 μg / ml, preferably 10 ng / ml to 1 μg / ml, as the peptide concentration in the medium. Examples of the medium generally include RPMI and AIM-V medium containing serum.

本発明の第８の態様は、配列番号１または２の抗原ペプチドまたはその機能的誘導体を有効成分から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを含有する制がん剤に関する。該制がん剤は、１）抗原ペプチドを単独、２）抗原ペプチドと医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤との混合物、又は３）更に必要ならば上記１）若しくは２）に補助剤を加えた形で提供される。なおここで言う担体とは例えば、ヒト血清アルブミンであり、また希釈剤とは例えばリン酸緩衝液、蒸留水、生理食塩水等である。また補助剤とは薬学的に許容されるアジュバント等が挙げられる。アジュバントとしては、（ａ）フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュバント、（ｂ）フロイント不完全アジュバント、（ｃ）水酸化アルミニウム、みょうばん等の無機物ゲル、（ｄ）リゾレシチン、ジメチルオクタデシルアンモニウムブロミド等の界面活性剤、（ｅ）硫酸デキストラン、ポリＩＣ等のポリアニオン、（ｆ）ムラミルペプチド、タフトシン等のペプチド、（ｇ）リビ（Ｒｉｂｉ）社製のモノホスホリルリピド（monophosphoryl lipid；ＭＰＬ）Ａ等があるが、特に限定されない。該制がん剤をヒトに投与する場合、例えば皮下、皮内、静脈内へ注射器で投与することもできるし、噴霧等の方法で粘膜からの経皮吸収等で投与してもよい。該制がん剤には抗原ペプチドを、抗原ペプチド１種類当り０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜９５重量％含有させる。成人１人当りの投与量はペプチド濃度として、抗原ペプチド１種類当り０．１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、更に好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇである。なおヒトに投与した場合、該ペプチドの毒性は特に認められない。   The eighth aspect of the present invention relates to an anticancer agent containing at least one antigenic peptide selected from active ingredients of the antigenic peptide of SEQ ID NO: 1 or 2 or a functional derivative thereof. The anti-cancer agent is: 1) the antigen peptide alone, 2) a mixture of the antigen peptide and a pharmaceutically acceptable carrier and / or diluent, or 3) if necessary, supplementing 1) or 2) above. Provided in the form of an added agent. The carrier here is, for example, human serum albumin, and the diluent is, for example, phosphate buffer, distilled water, physiological saline, or the like. Examples of adjuvants include pharmaceutically acceptable adjuvants. Examples of adjuvants include (a) Freund's complete adjuvant, (b) Freund's incomplete adjuvant, (c) inorganic gels such as aluminum hydroxide and alum, (d) surfactants such as lysolecithin and dimethyloctadecyl ammonium bromide, (E) polyanions such as dextran sulfate and poly IC, (f) peptides such as muramyl peptide and tuftsin, (g) monophosphoryl lipid (MPL) A manufactured by Ribi, etc. It is not limited. When the anticancer agent is administered to humans, it can be administered, for example, subcutaneously, intradermally or intravenously with a syringe, or by percutaneous absorption from the mucosa by a method such as spraying. The anticancer agent contains 0.01 to 100% by weight, preferably 0.1 to 95% by weight, of an antigen peptide per one type of antigen peptide. The dose per adult is 0.1 μg / kg to 10 mg / kg, preferably 1 μg / kg to 1 mg / kg, more preferably 1 μg / kg to 100 μg / kg as a peptide concentration per antigen peptide. When administered to humans, toxicity of the peptide is not particularly observed.

本発明の第９の態様は、配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体を含有する、第５の態様の細胞傷害性Ｔリンパ球の有するＴＣＲに結合するテトラマーに関する。該テトラマーはβ２ミクログロブリン存在下で作製したＨＬＡ−Ａ２４分子と抗原ペプチドの複合体をビオチン−ストレプトアビジン法で４量体化したものであり、ＣＴＬの細胞傷害性測定の代わりに短時間で測定できる簡便な活性測定法として有用である。特に、ＰＢＭＣ等のＣＴＬが微量しか含有されない検体中のＣＴＬの検出やＣＴＬの分離に有用である。   The ninth aspect of the present invention is the cytotoxicity according to the fifth aspect, comprising the human major histocompatibility antigen (HLA) -A24-restricted antigen peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and a functional derivative thereof. The present invention relates to a tetramer that binds to TCR of T lymphocytes. This tetramer is a complex of HLA-A24 molecule and antigen peptide prepared in the presence of β2 microglobulin and tetramerized by biotin-streptavidin method, and measured in a short time instead of CTL cytotoxicity measurement. This is useful as a simple method for measuring activity. In particular, it is useful for detection of CTL in a specimen containing only a trace amount of CTL such as PBMC and separation of CTL.

患者の体内におけるＴリンパ球のモニタリングのために使用されるELISPOT（Enzyme-linked Immunospot）や細胞傷害性試験の標的細胞に使用可能である。
テトラマーは細胞傷害性Ｔリンパ球のモニタリングに有用である。 It can be used for ELISPOT (Enzyme-linked Immunospot) used for monitoring T lymphocytes in a patient's body and target cells for cytotoxicity tests.
Tetramers are useful for monitoring cytotoxic T lymphocytes.

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

実施例１ ＨＬＡ−Ａ２４０２トランスジェニックマウスを使用したＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）の同定
（１）材料と方法
ＨＨＤＡ２４０２＋／− β２ｍ−／− ｍｉｃｅ
ＨＬＡ−Ａ２４０２のリーダー配列、ヒトβ２ ミクログロブリン、ＨＬＡ−Ａ２４０２ α１およびα２ドメイン、Ｈ−２Ｄ^b α３のトランスメンブレンドメイン、および細胞質ドメインからなるＤＮＡコンストラクト（ＨＨＤＡ２４０２）を構築し、これを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビロジェン社製）にクローニングした。ＨＨＤＡ２４０２の４−ｋｂのＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片を妊娠Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の卵子に注入した。ＨＨＤＡ２４０２発現マウスをβ２ｍ−／− ｍｉｃｅ（Jackson Laboratory, Bar Harbor、ME）と交配させ、得られるＨＨＤＡ２４０２ ＋／−β２ｍ ＋／−をβ２ｍ−／−マウスと交配させ、ＨＨＤＡ２４０２＋／− β２ｍ−／−マウス（以下、ＨＨＤＡ２４０２マウス）を作製した。 Example 1 Identification of HLA-A2402 Restricted CTL Epitope (Antigen Peptide) Using HLA-A2402 Transgenic Mice (1) Materials and Methods HHDA2402 +/− β2m − / − mice
A DNA construct (HHDA2402) consisting of the leader sequence of HLA-A2402, human β2 microglobulin, HLA-A2402 α1 and α2 domains, the transmembrane domain of H-2D ^b α3, and the cytoplasmic domain was constructed, and this was constructed using the expression vector pcDNA3. 1 (manufactured by Invirogen). The 4-kb SalI-NotI fragment of HHDA2402 was injected into eggs from pregnant C57BL / 6 mice. HHDA2402-expressing mice are crossed with β2m − / − mice (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), and the resulting HHDA2402 +/− β2m +/− is crossed with β2m − / − mice to generate HHDA2402 +/− β2m − / − mice. (Hereinafter referred to as HHDA2402 mouse).

（２）細胞株
ＴＡＰトランスポーター欠損株Ｔ２にＨＬＡ−Ａ２４０２ｃＤＮＡをトランスフェクトしてＴ２Ａ２４株を作製した。その他以下の細胞株を使用した。乳癌細胞株Ｒ２７（Ａ２４０２陰性）、食道癌株ＫＥ−４（Ａ２４０２陽性）、同ＴＥ−１０（Ａ２４０２陽性）、慢性骨髄性白血病株Ｋ５６２（Ａ２４０２陰性）、肺癌株１１−１８（Ａ２４０２陽性）、胎児性腎細胞２９３（Ａ２４０２陰性）。Ｒ２７Ａ２４４、Ｋ５６２Ａ２４、２９３Ａ２４はＨＬＡ−Ａ２４０２ｃＤＮＡをトランスフェクトして作製した。ヒトＢ−リンパ芽球（ＬＣＬ）はＨＬＡ−Ａ２４０２陽性または陰性のボランティア由来の細胞よりＥＢＶウイルスを用いて常法により作製した。 (2) Cell line A T2A24 strain was prepared by transfecting the TAP transporter-deficient strain T2 with HLA-A2402 cDNA. In addition, the following cell lines were used. Breast cancer cell line R27 (A2402 negative), esophageal cancer line KE-4 (A2402 positive), TE-10 (A2402 positive), chronic myeloid leukemia line K562 (A2402 negative), lung cancer line 11-18 (A2402 positive), Fetal kidney cells 293 (A2402 negative). R27A244, K562A24, and 293A24 were prepared by transfecting HLA-A2402 cDNA. Human B-lymphoblasts (LCL) were prepared from cells derived from HLA-A2402 positive or negative volunteers using EBV virus by a conventional method.

（３）プラスミド
全長のＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＡＧＥ、ＥＢＮＡ−３ＡのｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。 (3) Plasmid Full-length MAGE-A4, SAGE, and EBNA-3A cDNAs were cloned into pcDNA3.1.

（４）遺伝子銃による免疫
ＨＨＤＡ２４０２マウス（６〜８週齢、雌）の腹壁内にプラスミドＤＮＡをコートした金粒子をHelios Gene Gun System（Bio-Rad）を用いてヘリウム加圧３５０〜４００ｐｓｉで投与した。なお、金粒子は製造元のマニュアルに従って調製した。２週後にブースターの投与を行い、その１週後に脾細胞を採取した。 (4) Immunization with gene gun Gold particles coated with plasmid DNA in the abdominal wall of HHDA2402 mice (6-8 weeks old, female) are administered with helium pressure 350-400 psi using Helios Gene Gun System (Bio-Rad) did. Gold particles were prepared according to the manufacturer's manual. A booster was administered 2 weeks later, and splenocytes were collected 1 week later.

（５）マウスＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製
最終免疫後１週目に、ＣＤ８ ａｌｐｈａ（Ｌｙｔ２）マイクロビーズを用いたMACS system（Miltenyi Biotec, Germany）により、ＣＤ８陽性細胞をポジティブセレクションした。得られたＴ細胞画分はフローサイトメトリー分析で９５％以上の純度であった。 (5) Preparation of mouse CD8 positive T cells One week after the final immunization, CD8 positive cells were positively selected by MACS system (Miltenyi Biotec, Germany) using CD8 alpha (Lyt2) microbeads. The obtained T cell fraction was 95% or more pure by flow cytometry analysis.

（６）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（マウス）
９６ウェルのニトロセルロースELISPOTプレート（MAHA S4510; Millipore, Bedford, MA）を２μｇ／ｍｌのanti-mouse IFN-gamma mAb（clone R4-6A2, PharMingen）で４℃にて一夜コートした。各ウェルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、ＦＣＳ入り培地でブロッキングした（３７℃、２時間）。免疫マウス由来の分離した新鮮ＣＤ８陽性細胞（１×１０⁵／ｗｅｌｌ）および各種ペプチドパルスしたＣＤ８陰性細胞（１×１０⁶／ｗｅｌｌ）を各ウェルに撒き、最終液量が２００μｌになるようにした。３７℃で２２時間培養後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入りＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で十分に洗浄し、１．２５μｇ／ｍｌ biotinylated anti-mouse IFN-gamma mAb（PharMingen）を加え、４℃で一夜培養した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、１μｇ／ｍｌ streptavidin-alkaline phosphatase conjugate（Mabtech）を１００μｌ加え、室温で９０分反応、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、alkaline phosphatase conjugate substrate kit（BioRad, Hercules, CA）で染色した。そして、蒸留水で洗浄し反応を停止、その後プレートを乾燥、スポットをカウントした。 (6) ELISPOT assay (mouse)
A 96-well nitrocellulose ELISPOT plate (MAHA S4510; Millipore, Bedford, MA) was coated overnight at 4 ° C. with 2 μg / ml anti-mouse IFN-gamma mAb (clone R4-6A2, PharMingen). Each well was washed with phosphate buffered saline (PBS) and then blocked with a medium containing FCS (37 ° C., 2 hours). Separated fresh CD8-positive cells (1 × 10 ⁵ / well) derived from immunized mice and CD8-negative cells (1 × 10 ⁶ / well) pulsed with various peptides were seeded in each well so that the final volume was 200 μl. . After culturing at 37 ° C. for 22 hours, thoroughly washed with PBS containing 0.05% Tween 20 (PBS-Tween), added with 1.25 μg / ml biotinylated anti-mouse IFN-gamma mAb (PharMingen), and cultured at 4 ° C. overnight. did. After washing with PBS-Tween, 100 µl of 1 µg / ml streptavidin-alkaline phosphatase conjugate (Mabtech) was added, reacted at room temperature for 90 minutes, washed with PBS-Tween, and stained with alkaline phosphatase conjugate substrate kit (BioRad, Hercules, CA) . Then, the reaction was stopped by washing with distilled water, the plate was then dried, and spots were counted.

（７）エピトープペプチドの推定
ＨＬＡ−Ａ２４０２結合能を持つ可能性のある９残基ペプチドを、BioInformatics & Molecular Analysis Section（BIMAS） HLA Peptide Binding Predictionウェブサイト（ＵＲＬ；http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla-bind/）で検索した。下記表１記載のＳＡＧＥ由来の５個のペプチド、ＭＡＧＥ−Ａ４由来の１０ペプチドを選び、ペプチド合成機により化学合成した。その他、ＥＢウイルス由来のEBNA3A_246-254（RYSIFFDYM）およびHER2由来のHER2_63-71（TYLPTNASL）を合成した。使用したペプチドの純度は９０％以上である。 (7) Epitope peptide estimation A 9-residue peptide that may have HLA-A2402 binding ability is obtained from the BioInformatics & Molecular Analysis Section (BIMAS) HLA Peptide Binding Prediction website (URL; http: //bimas.dcrt.nih). .gov / molbio / hla-bind /). Five SAGE-derived peptides listed in Table 1 below and 10 peptides derived from MAGE-A4 were selected and chemically synthesized using a peptide synthesizer. In addition, EBNA3A _246-254 (RYSIFFDYM) derived from EB virus and HER2 _63-71 (TYLPTNASL) derived from HER2 were synthesized. The purity of the peptide used is 90% or more.

ＥＢウイルス由来のＥＢＮＡ３Ａ遺伝子をコードする発現プラスミドを遺伝子銃でＨＨＤＡ２４０２マウスに免疫した。２回免疫後、脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を調製し、上記EBNA3A_246-254ペプチドでパルスしたＣＤ８陰性細胞を標的細胞として使用してＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。その結果、EBNA3A_246-254ペプチド特異的ＣＴＬが検出された（図１ａ）。次に、腫瘍・精巣抗原であるＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＡＧＥ由来の候補ペプチド（上記表１）について同様にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。その結果、ＭＧＥ−Ａ４では２つのペプチド（MAGE-A4_239-247and MAGE-A4_143-151）が陽性であった（図１ｂ）。同様にＳＡＧＥでも２つのペプチド（SAGE_776-784and SAGE_715-723）が陽性であった（図１ｃ）。次に、野生型のＣ５７ＢＬ６マウスを上記と同様の実験を行ったところ、MAGE-A4_239-247とSAGE_776-784のみが陽性であった。従って、MAGE-A4_143-151とSAGE_715-723が、ＨＬＡ−Ａ２４０２に提示される抗原ペプチドであると同定された。 HHDA2402 mice were immunized with a gene gun with an expression plasmid encoding the EBNA3A gene derived from EB virus. After immunization twice, CD8 + T cells derived from spleen were prepared, and ELISPOT assay was performed using CD8 negative cells pulsed with the EBNA3A _246-254 peptide as target cells. As a result, EBNA3A _246-254 peptide-specific CTL was detected (FIG. 1a). Next, ELISPOT assay was similarly conducted on candidate peptides derived from MAGE-A4 and SAGE (Table 1 above), which are tumor / testis antigens. As a result, two peptides (MAGE-A4 _239-247 and MAGE-A4 _143-151 ) were positive in MGE-A4 (FIG. 1b). Similarly, two peptides (SAGE _776-784 and SAGE _715-723 ) were positive in SAGE (FIG. 1c). Next, when wild-type C57BL6 mice were _subjected to the same experiment as described above, only MAGE-A4 _239-247 and SAGE _776-784 were positive. Therefore, MAGE-A4 _143-151 and SAGE _715-723 were identified as antigenic peptides presented to HLA-A2402.

実施例２ ｍＲＮＡを導入したＣＤ４陽性ＰＨＡ幼芽細胞を使用したＨＬＡ−２４０２抗原ペプチド特異的ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の調製
（１）ｍＲＮＡの調製
ＭＡＧＥ−Ａ４及びＳＡＧＥプラスミドを直鎖にした。インビトロ転写はＴ７ポリメラ−ゼ（mMESSAGE mMACHINE T7 Kit; Ambion, Austin, TX）を使用して製造元のマニュアルに従って行った。その後、ポリＡポリメラーゼ（Poly(A) Tailing Kit; Ambion, Austin, TX）を使用して製造元のマニュアルに従ってポリアデニル化した。得られたＲＮＡを水に懸濁し、−８０℃で使用前まで保存した。 Example 2 Preparation of HLA-2402 Antigen Peptide Specific Human Cytotoxic T Lymphocytes (CTL) Using CD4-Positive PHA Seed Cells Introduced with mRNA (1) Preparation of mRNA MAGE-A4 and SAGE plasmid were linearized I made it. In vitro transcription was performed according to the manufacturer's manual using T7 polymerase (mMESSAGE mMACHINE T7 Kit; Ambion, Austin, TX). Subsequently, polyadenylation was performed using poly A polymerase (Poly (A) Tailing Kit; Ambion, Austin, TX) according to the manufacturer's manual. The obtained RNA was suspended in water and stored at −80 ° C. until use.

（２）ＣＤ４陽性フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）幼芽細胞の調製
ＭＡＣＳ ＣＤ４マイクロビーズ（Miltenyi Biotec, Germany）を用いたポジティブ選択によって分離して得られた新鮮なＣＤ４陽性細胞を、２４ウェルプレート（Corning, NY）に１ウェル当り１〜２×１０⁶個／ｍｌ ＲＰＭＩ−１６４０培地（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１０％非働化ヒトＡＢ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）の細胞濃度で植えた。Day 0に１０μｇ／ｍｌのＰＨＡ（HA15, Murex, UK）を培地に添加した。Day 3に培地の半量をＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ−７（４０ｎｇ／ｍｌ）を含む完全培地に交換した。同じ操作を３日ごとに繰り返した。得られた活性化ＣＤ４陽性細胞を培養後１４〜２８日目にエレクトロポレーションを行い、抗原提示細胞として使用した。 (2) Preparation of CD4 positive phytohemagglutinin (PHA) blast cells Fresh CD4 positive cells obtained by separation by positive selection using MACS CD4 microbeads (Miltenyi Biotec, Germany) Corning, NY) cells at 1-2 × 10 ⁶ cells / ml RPMI-1640 medium (25 mM Hepes, 10% inactivated human AB serum, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin) per well. Planted in concentration. On Day 0, 10 μg / ml PHA (HA15, Murex, UK) was added to the medium. On Day 3, half of the medium was replaced with complete medium containing IL-2 (20 U / ml) and IL-7 (40 ng / ml). The same operation was repeated every 3 days. The obtained activated CD4 positive cells were electroporated 14 to 28 days after culture and used as antigen-presenting cells.

（３）ｍＲＮＡ導入ＣＤ４陽性幼芽細胞を用いたIn vitroでのヒトＣＴＬ誘導
ＰＢＭＣよりMACS CD8 Microbeads（Miltenyi Biotec）を用いて分離したＣＤ８＋Ｔ細胞５×１０⁵個を、１×１０⁵個の放射線（３０Ｇｙ）照射したｍＲＮＡ導入ＣＤ４＋ＰＨＡ幼芽細胞で、９６ウェル丸底プレート（Nunc）中で刺激した。7日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を１×１０⁵個の放射線（３０Ｇｙ）照射したｍＲＮＡ導入ＣＤ４＋ＰＨＡ幼芽細胞で再刺激し、さらにＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍ）入り培地で７日間培養した。 (3) In vitro human CTL induction using mRNA-introduced CD4 positive blast cells 5 × 10 ⁵ CD8 + T cells isolated from PBMC using MACS CD8 Microbeads (Miltenyi Biotec) are 1 × 10 ⁵ radiation. (30 Gy) Irradiated mRNA-introduced CD4 + PHA blast cells were stimulated in 96-well round bottom plates (Nunc). Seven days later, CD8 + T cells were restimulated with mRNA-introduced CD4 + PHA blast cells irradiated with 1 × 10 ⁵ radiation (30 Gy), and further cultured in a medium containing IL-2 (20 IU / m) for 7 days.

（４）ＣＴＬのインビトロ増幅
抗原特異的ＣＴＬを含有する、感作ＣＤ８＋Ｔ細胞を増幅するために、標的抗原ｍＲＮＡをエレクトロポレーションで導入した自己ＬＣＬ（５×１０⁶個）、自己ＰＢＭＣ（２．５×１０⁷個）とＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）を加え、抗ＣＤ３抗体なしで２５ｍｌフラスコ（Corning）で培養した。 (4) In vitro amplification of CTL In order to amplify sensitized CD8 + T cells containing antigen-specific CTL, self-LCL (5 × 10 ⁶ cells) into which target antigen mRNA was introduced by electroporation, self-PBMC (2. 5 × 10 ⁷ ) and IL-2 (20 IU / ml) were added and cultured in a 25 ml flask (Corning) without anti-CD3 antibody.

（５）限界希釈
９６ウェル丸底プレート（Nunc）に０．３個／ウェルとなるように希釈し、自家ＰＢＭＣ（５×１０⁴個／ウェル）、放射線照射ＬＣＬ（１×１０⁴個／ウェル）、ＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）、および抗ＣＤ３ｍＡｂ（３０ｎｇ／ｍｌ）を加えて培養した。標的である抗原提示細胞を溶解するＣＤ８＋Ｔ細胞はさらに放射線照射ＰＢＭＣ、放射線照射ＬＣＬおよび抗ＣＤ３ｍＡｂ存在下で増幅した。 (5) Limiting dilution Dilute to 96 / well round bottom plate (Nunc) to 0.3 / well, autologous PBMC (5 × 10 ⁴ / well), irradiation LCL (1 × 10 ⁴ / well) ), IL-2 (20 IU / ml), and anti-CD3 mAb (30 ng / ml). CD8 + T cells that lyse target antigen-presenting cells were further amplified in the presence of irradiated PBMC, irradiated LCL and anti-CD3 mAb.

（６）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ヒト）
９６ウェルのニトロセルロースELISPOTプレート（MAHA S4510; Millipore, Bedford, MA）を２μｇ／ｍｌ antihuman IFN-γ mAb（1-D1K）で４℃にて一夜コートした。各ウェルをＰＢＳで洗浄後、１０％ヒトＡＢ血清入り培地でブロッキングした（３７℃、２時間）。エフェクター細胞（２×１０⁴／ｗｅｌｌ）およびペプチドパルスしたＴ２Ａ２４細胞（５×１０⁴／ｗｅｌｌ）を各ウェルに撒いた。３７℃で１８時間培養後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄し、１．２５μｇ／ｍｌ biotinylated anti-mouse IFN-gamma mAb（PharMingen）を加え、４℃で一夜培養した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、１μｇ／ｍｌ streptavidin-alkaline phosphatase conjugate（Mabtech）を１００μｌ加え、室温で６０分反応、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、alkaline phosphatase conjugate substrate kit（BioRad, Hercules, CA）で染色した。そして、蒸留水で洗浄し反応を停止、その後プレートを乾燥、スポット数をカウントした。 (6) ELISPOT assay (human)
A 96-well nitrocellulose ELISPOT plate (MAHA S4510; Millipore, Bedford, MA) was coated overnight at 4 ° C. with 2 μg / ml antihuman IFN-γ mAb (1-D1K). Each well was washed with PBS and then blocked with a medium containing 10% human AB serum (37 ° C., 2 hours). Effector cells (2 × 10 ⁴ / well) and peptide-pulsed T2A24 cells (5 × 10 ⁴ / well) were seeded in each well. After culturing at 37 ° C. for 18 hours, the plate was thoroughly washed with PBS-Tween, added with 1.25 μg / ml biotinylated anti-mouse IFN-gamma mAb (PharMingen), and cultured at 4 ° C. overnight. After washing with PBS-Tween, 100 μl of 1 μg / ml streptavidin-alkaline phosphatase conjugate (Mabtech) was added, reacted at room temperature for 60 minutes, washed with PBS-Tween, and then stained with alkaline phosphatase conjugate substrate kit (BioRad, Hercules, CA). . Then, the reaction was stopped by washing with distilled water, the plate was then dried, and the number of spots was counted.

（７）⁵¹Ｃｒ遊離細胞傷害性アッセイ
細胞傷害性は常法に従って行った。標的細胞は１００μＣｉ（３．７×１０⁶Ｂｑ） ⁵¹Ｃｒで標識し、１×１０⁴個を９６ウェルのＶ底プレート（Nunc）で細胞数を変えたエフェクター細胞と３７℃で反応させた。５時間後、１００μｌの上清を集め、測定した。アッセイは３連で行い、３ウェルの特異的溶解％の平均を計算した。
特異的細胞傷害活性（％）＝〔（各ウェルの測定値−最小放出値）／（最大放出値−最小放出値）〕×１００
上式において、最小放出値は標的細胞及びＫ５６２細胞のみ入っているウェルの⁵¹Ｃｒ量であり、標的細胞からの⁵¹Ｃｒの自然遊離量を示す。また、最大放出値は、標的細胞に界面活性剤トリトンＸ−１００を加えて細胞を破壊した際の⁵¹Ｃｒ遊離量を示している。 (7) ⁵¹ Cr free cytotoxicity assay Cytotoxicity was performed according to a conventional method. Target cells were labeled with 100 μCi (3.7 × 10 ⁶ Bq) ⁵¹ Cr, and 1 × 10 ⁴ cells were reacted at 37 ° C. with effector cells having different cell numbers in a 96-well V-bottom plate (Nunc). After 5 hours, 100 μl of supernatant was collected and measured. The assay was performed in triplicate and the average% specific lysis for 3 wells was calculated.
Specific cytotoxic activity (%) = [(measured value of each well−minimum release value) / (maximum release value−minimum release value)] × 100
In the above formula, the minimum release value is the amount of ⁵¹ Cr in a well containing only target cells and K562 cells, and indicates the spontaneous release amount of ⁵¹ Cr from the target cells. Further, the maximum release value indicates the ⁵¹ Cr release amount when the cell is destroyed by adding the surfactant Triton X-100 to the target cells.

健常人より調製したＣＤ８＋細胞をインビトロでｍＲＮＡ導入した自家ＣＤ４＋ＰＨＡ幼芽細胞で感作した。ＭＡＧＥ−Ａ４ ｍＲＮＡを導入した自家ＣＤ４＋ＰＨＡ幼芽細胞で２回刺激後に、ＭＡＧＥ−Ａ４特異的バルクＣＴＬが得られた（図２ａ）。このバルク細胞をｍＲＮＡ導入自家ＬＣＬ、自家ＰＢＭＣ及びＩＬ−２で増幅して得られた細胞は、MAGE-A4_143-151ペプチドをパルスしたＴ２Ａ２４細胞に特異的な反応を示した（図２ｂ）。限界希釈法に得られた＃２−２８細胞は、MAGE-A4_143-151テトラマーによって陽性に染色されたが、対象として使用したテトラマーでは染色されなかった（図３ａ）。そして、この＃２−２８細胞は、MAGE-A4_143-151ペプチドをパルスした標的細胞にＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性に細胞傷害性を示した（図３ｂ左）。さらに、この２−２８細胞はＭＡＧＥ−Ａ４およびＨＬＡ−Ａ２４０２の両者を発現する腫瘍細胞株に対して細胞傷害性を示した（図３ｂ右）。このことからMAGE-A4_143-151ペプチドは、ｍＲＮＡ導入ＣＤ４＋ＰＨＡ幼芽細胞だけでなくＨＬＡ−２４０２陽性の腫瘍細胞でもＭＡＧＥ−Ａ４抗原が細胞内でプロセスされ抗原提示されることを示している。 CD8 + cells prepared from healthy subjects were sensitized with autologous CD4 + PHA blasts into which mRNA was introduced in vitro. MAGE-A4 specific bulk CTLs were obtained after two stimulations with autologous CD4 + PHA blasts transfected with MAGE-A4 mRNA (FIG. 2a). Cells obtained by amplifying this bulk cell with mRNA-introduced autologous LCL, autologous PBMC and IL-2 showed a reaction specific to T2A24 cells pulsed with MAGE-A4 _143-151 peptide (FIG. 2b). The # 2-28 cells obtained by the limiting dilution method were positively stained with the MAGE-A4 _143-151 tetramer, but were not stained with the tetramer used as a target (FIG. 3a). The # 2-28 cells showed HLA-A2402-restricted cytotoxicity to the target cells pulsed with the MAGE-A4 _143-151 peptide (left of FIG. 3b). Furthermore, the 2-28 cells showed cytotoxicity against tumor cell lines expressing both MAGE-A4 and HLA-A2402 (right side of FIG. 3b). This indicates that the MAGE-A4 _143-151 peptide is processed in the cell and presented as an antigen not only in mRNA-introduced CD4 + PHA blast cells but also in HLA-2402-positive tumor cells.

次に、SAGE_715-723特異的バルクＣＴＬがｔｒｕｎｃａｔｅｄ ＳＡＧＥ ｍＲＮＡを導入したＣＤ４＋幼芽細胞で２回刺激により誘導された（図４ａ）。フローサイトメトリー分析により、このバルクＣＴＬがSAGE_715-723ＨＬＡ−Ａ２４テトラマー陽性のＣＤ８＋細胞を含有していることが明らかとなった（図４ｂ）。SAGE_715-723特異的ＨＬＡ−Ａ２４ ＣＴＬ細胞＃２２を限界希釈法により作製した。この＃２２細胞はSAGE_715-723HLA-A24テトラマー陽性であった（図５ａ）。この細胞はＳＡＧＥ遺伝子全長をコードするプラスミドで遺伝子導入した２９３−Ａ２４０２と共培養するとＩＦＮ−γを分泌した（図５ｂ）。この細胞は、Ｋ５６２Ａ２４及びＲ２７Ａ２４（両者ともＨＬＡ−Ａ２４０２とＳＡＧＥを発現する）いずれにも細胞傷害性を示した（図５ｃ左及び中）。さらにＳＡＧＥ遺伝子のｍＲＮＡを導入したA2402+LCL細胞に対して特異的な細胞傷害性を示した(図５ｃ右)。 Next, SAGE _715-723- specific bulk CTLs were induced in CD4 + blast cells transfected with truncated SAGE mRNA by stimulation twice (FIG. 4a). Flow cytometric analysis revealed that this bulk CTL _contained SAGE _715-723 HLA-A24 tetramer positive CD8 + cells (FIG. 4b). SAGE _715-723- specific HLA-A24 CTL cells # 22 were prepared by the limiting dilution method. The # 22 cells were SAGE _715-723 HLA-A24 tetramer positive (FIG. 5a). This cell secreted IFN-γ when co-cultured with 293-A2402 gene-transfected with a plasmid encoding the full-length SAGE gene (FIG. 5b). The cells were cytotoxic to both K562A24 and R27A24 (both expressing HLA-A2402 and SAGE) (FIG. 5c left and middle). Furthermore, it showed specific cytotoxicity against A2402 + LCL cells into which mRNA of the SAGE gene was introduced (right of FIG. 5c).

実施例３ SAGE_715-723特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞はＡ２４０２陽性健常人から高い確率で誘導される。
in vitroでのペプチドをパルスしたＣＤ８−のＰＢＭＣを用いたヒトＣＴＬの誘導
１×１０⁷個のＣＤ８陰性ＰＢＭＣに１０μＭのペプチドで室温で１時間、３７℃で５％ＣＯ₂で１時間パルスした後、抗原提示細胞として使用した。次に、分離した５×１０⁵個のＣＤ８＋Ｔ細胞に対して、ペプチドをパルスした１×１０⁶個のＣＤ８−ＰＢＭＣで１０〜１２日間刺激した。１、４、７日目に、培地を半量交換し、ヒトＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−７（５０ｎｇ／ｍｌ）を追加した。誘導は２４ウェル（Nunc）プレートで２００μｌのＲＰＭＩ培地（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１０％非働化ヒトＡＢ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）で行った。 Example 3 SAGE _715-723- specific CD8 + T cells are induced with high probability from A2402-positive healthy individuals.
Induction of human CTL using peptide-pulsed CD8-PBMC in vitro 1 × 10 ⁷ CD8-negative PBMCs were pulsed with 10 μM peptide for 1 hour at room temperature and 37 ° C. with 5% CO ₂ for 1 hour. Later, it was used as an antigen-presenting cell. The isolated 5 × 10 ⁵ CD8 + T cells were then stimulated with 1 × 10 ⁶ CD8-PBMC pulsed with the peptide for 10-12 days. On days 1, 4, and 7, half of the medium was changed and human IL-2 (20 IU / ml) and IL-7 (50 ng / ml) were added. Induction was performed in 200 μl RPMI medium (25 mM Hepes, 10% inactivated human AB serum, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin) in a 24-well (Nunc) plate.

ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性SAGE_715-723特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２４０２陽性の健常人ボランティアにおいて、SAGE_715-723ペプチドをパルスしたＣＤ８陰性のＰＢＭＣでin vitroで一回ＣＤ８＋細胞を刺激することによって誘導されるかを検討した。６人のＨＬＡ−Ａ２４０２＋健常人のうち３人において、in vitroでの混合リンパ球反応１０日後にSAGE_715-723ＨＬＡ−Ａ２４テトラマー陽性Ｔ細胞が検出された。図６にその一例の解析結果を示す。 HLA-A2402-restricted SAGE _715-723- specific CTL is induced by stimulating CD8 + cells once in vitro with CD8-negative PBMC pulsed with SAGE _715-723 peptide in healthy volunteers positive for HLA-A2402 We examined what to do. SAGE _715-723 HLA-A24 tetramer positive T cells were detected 10 days after in vitro mixed lymphocyte reaction in 3 out of 6 HLA-A2402 + healthy subjects. FIG. 6 shows an example of the analysis result.

実施例４ テトラマー作製及びフローサイトメトリー分析
ＭＨＣ−ペプチドテトラマーの作製は、ＨＬＡ−Ａ２４０２重鎖とβ２−ミクログロブリンは不溶性重合体として大腸菌で発現させた。重鎖のＣ末端は、ビオチン化酵素BirAの基質となる配列を付加した。モノマーのＨＬＡ／β２−ミクログロブリン／ペプチド複合体は、in vitroでMAGE-A4_143-151ペプチドまたはSAGE_715-723の存在下にフォールディングさせた。ＭＨＣはBirA酵素組換え体（Avidity, Denver, CO, USA）でビオチン化され、phycoerythrin-labelled streptavidin（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）を使用して４量体化された。 Example 4 Preparation of tetramer and flow cytometry analysis
For the preparation of MHC-peptide tetramer, HLA-A2402 heavy chain and β2-microglobulin were expressed in E. coli as insoluble polymers. A sequence serving as a substrate for the biotinylation enzyme BirA was added to the C-terminus of the heavy chain. _Monomeric HLA / β2-microglobulin / peptide complexes were folded in vitro in the presence of MAGE-A4 _143-151 peptide or SAGE _715-723 . MHC was biotinylated with BirA enzyme recombinant (Avidity, Denver, CO, USA) and tetramerized using phycoerythrin-labelled streptavidin (Molecular Probes, Eugene, OR, USA).

染色においては、感作ＣＤ８＋Ｔ細胞をテトラマー２０μｇ／ｍｌで３７℃で３０分反応させ、その後、Tricolor anti-CD8 monoclonal antibody（Caltag, Burlingame, CA, USA）と氷上で１５分間反応させた。洗浄後、染色した細胞はフローサイトメトリー（FACSCalibur; Becton Dickinson）で分析した。   For staining, sensitized CD8 + T cells were reacted with tetramer 20 μg / ml at 37 ° C. for 30 minutes, and then reacted with Tricolor anti-CD8 monoclonal antibody (Caltag, Burlingame, Calif., USA) for 15 minutes on ice. After washing, the stained cells were analyzed by flow cytometry (FACSCalibur; Becton Dickinson).

なお、本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
〔１〕 目的とする抗原をコードするＲＮＡを導入した、前記抗原を認識するＴリンパ球を誘導する活性を有するＴリンパ球。
〔２〕 Ｔリンパ球がフィトヘムアグルチニンで活性化されたＣＤ４陽性細胞である前記〔１〕記載のＴリンパ球。
〔３〕 前記〔１〕または〔２〕記載のＴリンパ球を含有する免疫誘導剤。
〔４〕 目的とする抗原をコードするＲＮＡを導入したＴリンパ球を抗原提示細胞として使用することを特徴とする、前記抗原を認識するＴリンパ球の誘導方法。
〔５〕 Ｔリンパ球がフィトヘムアグルチニンで活性化されたＣＤ４陽性細胞である前記〔４〕記載の誘導方法。
〔６〕 抗原を認識するＴリンパ球がＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球であることを特徴とする前記〔４〕記載の誘導方法。
〔７〕 抗原が腫瘍関連抗原または感染性微生物抗原である前記〔４〕〜〔６〕いずれか記載の誘導方法。
〔８〕 癌組織から調製したＲＮＡを使用することを特徴とする前記〔７〕記載の誘導方法。
〔９〕 ＥＢＮＡ３Ａ、ＣＭＶｐｐ６５の少なくとも一つのウイルス抗原を発現するＲＮＡを使用することを特徴とする前記〔７〕記載の誘導方法。
〔１０〕 前記〔４〕〜〔９〕いずれか記載の方法によって誘導されたＴリンパ球を有効成分として含有してなるがんまたは感染症の治療剤。
〔１１〕 配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を認識するＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球。
〔１２〕 前記〔１１〕記載の細胞傷害性Ｔリンパ球を有効成分として含有してなる制がん剤。
〔１３〕 配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分として含有してなる、前記〔１１〕記載の細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
〔１４〕 配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分として含有してなる制がん剤。
〔１５〕 配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体を含有する、前記〔１１〕記載の細胞傷害性Ｔリンパ球の有するＴ細胞レセプター検出用のテトラマー。 In addition, the following are mentioned as an aspect of this invention.
[1] A T lymphocyte having an activity of inducing a T lymphocyte recognizing the antigen, into which an RNA encoding the target antigen is introduced.
[2] The T lymphocyte according to [1] above, wherein the T lymphocyte is a CD4 positive cell activated with phytohemaglutinin.
[3] An immunity-inducing agent containing the T lymphocyte according to [1] or [2].
[4] A method for inducing T lymphocytes that recognize antigens, wherein T lymphocytes into which RNA encoding a target antigen is introduced are used as antigen-presenting cells.
[5] The induction method according to [4], wherein the T lymphocyte is a CD4-positive cell activated with phytohemaglutinin.
[6] The induction method according to [4], wherein the T lymphocyte recognizing an antigen is a CD8 positive cytotoxic T lymphocyte.
[7] The induction method according to any one of [4] to [6], wherein the antigen is a tumor-related antigen or an infectious microorganism antigen.
[8] The induction method according to [7] above, wherein RNA prepared from cancer tissue is used.
[9] The induction method according to [7], wherein RNA expressing at least one viral antigen of EBNA3A and CMVpp65 is used.
[10] A therapeutic agent for cancer or infectious disease comprising T lymphocytes induced by the method according to any one of [4] to [9] as an active ingredient.
[11] A complex of at least one antigen peptide selected from human major histocompatibility antigen (HLA) -A24-restricted antigen peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and a functional derivative thereof and an HLA-A24 molecule CD8-positive cytotoxic T lymphocytes that recognize cells that present on the cell surface.
[12] An anticancer agent comprising the cytotoxic T lymphocyte according to [11] as an active ingredient.
[13] A human major histocompatibility antigen (HLA) -A24-restricted antigen peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and at least one antigen peptide selected from functional derivatives thereof as an active ingredient, The inducer of cytotoxic T lymphocyte according to [11] above.
[14] A system comprising at least one antigen peptide selected from the human major histocompatibility antigen (HLA) -A24-restricted antigen peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and a functional derivative thereof as an active ingredient. Cancer drug.
[15] The cytotoxic T lymphocyte according to [11] above, which contains the human major histocompatibility antigen (HLA) -A24-restricted antigen peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and a functional derivative thereof Tetramer for T cell receptor detection.

本発明の抗原認識Ｔリンパ球の誘導方法は、ＨＬＡに関係なく、抗腫瘍性または抗感染性微生物抗原に対する特異的Ｔリンパ球を誘導できることから、誘導した特異的Ｔリンパ球は、がんまたは感染症に対する免疫療法における治療剤として有用である。また、腫瘍関連抗原であるＭＡＧＥ−Ａ４またはＳＡＧＥに特異的なＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびその認識する抗原ペプチドは免疫療法における制がん剤として有用である。さらに、該抗原ペプチドを使用したＭＨＣ−抗原ペプチド複合体テトラマーは、調製したＣＴＬの機能測定やＣＴＬ投与後のモニタリングに有用である。   Since the method for inducing antigen-recognizing T lymphocytes of the present invention can induce specific T lymphocytes against antitumor or anti-infectious microbial antigens regardless of HLA, the induced specific T lymphocytes are cancer or It is useful as a therapeutic agent in immunotherapy for infectious diseases. In addition, HLA-A2402-restricted cytotoxic T lymphocytes (CTLs) specific to MAGE-A4 or SAGE, which are tumor-associated antigens, and antigen peptides that recognize them are useful as anticancer agents in immunotherapy. Furthermore, the MHC-antigen peptide complex tetramer using the antigen peptide is useful for measuring the function of the prepared CTL and monitoring after CTL administration.

Claims (5)

配列番号２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を認識するＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球。 Human major histocompatibility antigens of SEQ ID NO: 2 (HLA) -A24 restricted antigen peptide and HLA-A24 complex with molecules of cells recognizing CD8 positive presented on the cell surface cytotoxic T lymphocytes ball. 請求項１記載の細胞傷害性Ｔリンパ球を有効成分として含有してなる制がん剤。   An anticancer agent comprising the cytotoxic T lymphocyte according to claim 1 as an active ingredient. 配列番号２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを有効成分として含有してなる、請求項１記載の細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。 Comprising as an active ingredient the human major histocompatibility antigens (HLA) A24 restricted antigen peptide represented by SEQ ID NO: 2, inducer of cytotoxic T lymphocytes according to claim 1. 配列番号２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを有効成分として含有してなる制がん剤。 Human major histocompatibility antigens (HLA) A24 anticancer agent comprising a restricted antigen peptide as an active component represented by SEQ ID NO: 2. 配列番号２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを含有する、請求項１記載の細胞傷害性Ｔリンパ球の有するＴ細胞レセプター検出用のテトラマー。 Containing human major histocompatibility antigens (HLA) A24 restricted antigen peptide represented by SEQ ID NO: 2, tetramer for T cell receptor detection with the cytotoxic T lymphocyte according to claim 1, wherein.

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