JP2003000242A - Cytotoxic t lymphocyte - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、前立腺特異膜抗原
（prostate specific membrane antigen, 以下、ＰＳＭ
Ａと略す）の異常発現を伴う疾患、例えば、癌、具体的
には、前立腺癌などの治療及び診断に有用な技術に関す
る。より詳しくは、癌、具体的には、前立腺癌を始めと
するＰＳＭＡが異常発現している癌の治療及び診断に有
用な、抗原ペプチドとヒト主要組織適合性抗原（ＨＬ
Ａ）分子との複合体を認識しうるＴ細胞レセプターを有
する細胞傷害性Ｔリンパ球(cytotoxic T lymphocytes；
ＣＴＬともいう）、該抗原ペプチド、該ＣＴＬを誘導す
る際等に有用なＣＴＬ誘導剤、該ＣＴＬの誘導方法、前
記癌に有用な制癌剤、該ＣＴＬの感受性細胞の検出方法
及びその検出剤、ＨＬＡ−Ａ２４分子の検出方法並びに
該ＣＴＬにより傷害を受ける標的細胞及びその調製方法
に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a prostate specific membrane antigen (hereinafter referred to as PSM).
The present invention relates to a technique useful for treating and diagnosing a disease accompanied by abnormal expression of (abbreviated as A), for example, cancer, specifically, prostate cancer. More specifically, an antigenic peptide and a human major histocompatibility complex (HL) useful for the treatment and diagnosis of cancer, specifically, cancer in which PSMA is aberrantly expressed such as prostate cancer.
A) Cytotoxic T lymphocytes having a T cell receptor capable of recognizing a complex with a molecule;
(Also referred to as CTL), the antigenic peptide, a CTL inducer useful when inducing the CTL, a method for inducing the CTL, an antitumor agent useful for the cancer, a method for detecting sensitive cells of the CTL, and an agent for detecting the same, HLA -A method for detecting A24 molecule, a target cell damaged by the CTL, and a method for preparing the same.
【０００２】[0002]
【従来の技術】前立腺癌は、特に米国において最も罹患
率の高い癌種であるが、日本を始めとするアジア諸国に
おいても急増している。前立腺癌は、ホルモン療法及び
放射線療法に感受性が高いとされている。しかしなが
ら、治療の長期化に伴い、ホルモン不応性癌が生じるた
め、そのような病態に対する有効な治療法が望まれてお
り、 免疫治療が期待されている。2. Description of the Related Art Prostate cancer is the most prevalent cancer type in the United States, but the number is rapidly increasing in Asian countries including Japan. Prostate cancer is said to be sensitive to hormone therapy and radiation therapy. However, hormone-refractory cancer occurs with the prolongation of treatment, and therefore an effective treatment method for such a pathological condition is desired, and immunotherapy is expected.
【０００３】ＣＴＬには、抗原ペプチドと主要組織適合
性抗原遺伝子複合体（major histo-compatibility gene
complex；以下、ＭＨＣと略す）にコードされる主要組
織適合性抗原ＭＨＣクラスＩ（ヒトの場合、human leuk
ocyte antigen クラスＩと呼ばれ、以下、ＨＬＡクラス
Ｉと略す）分子との結合物である複合体を特異的なＴ細
胞レセプター（T cell receptor ；以下、ＴＣＲと略
す）によって認識し、それにより、該複合体を細胞表面
に提示している細胞を傷害することのできるものがあ
る。このようなＣＴＬは、該ＣＴＬ自体と同じＭＨＣク
ラスＩ分子を有する標的細胞のみを認識し傷害すること
から、ＭＨＣクラスＩ分子拘束性ＣＴＬと呼ばれる。CTL contains an antigen peptide and a major histo-compatibility gene complex.
complex; major histocompatibility antigen MHC class I (hereinafter, human leuk in the case of human) encoded by MHC
It is called a cell antigen class I, and is hereinafter referred to as HLA class I). A complex that is a conjugate with a molecule is recognized by a specific T cell receptor (hereinafter, abbreviated as TCR), and Some are capable of damaging cells presenting the complex on the cell surface. Such a CTL is called an MHC class I molecule-restricted CTL because it recognizes and damages only a target cell having the same MHC class I molecule as the CTL itself.
【０００４】したがって、該細胞傷害反応が成立するた
めには、１）特異的ＴＣＲを持ったＣＴＬが存在するこ
と、２）ＨＬＡクラスＩ分子に提示され、かつＣＴＬに
認識される抗原ペプチドとなるために、ＭＨＣクラスＩ
抗原分子との結合だけでなく、ＴＣＲによる認識を受け
る複合体を形成できる抗原ペプチドが存在すること、が
必要である。Therefore, in order for the cytotoxic reaction to be established, 1) the presence of a CTL having a specific TCR, and 2) an antigen peptide presented by an HLA class I molecule and recognized by the CTL. For MHC class I
It is necessary that there is an antigenic peptide that is capable of forming a complex that is recognized by TCR as well as bound to the antigen molecule.
【０００５】このような抗原ペプチドは、例えば哺乳類
細胞の細胞内で合成された抗原等が小胞体でプロセスさ
れ、小さいエピトープペプチドに分解されることにより
生じ、更にＭＨＣクラスＩ分子と会合し、細胞表面に提
示される。すなわち、多くのサブユニットよりなるプロ
テオソーム複合体の中で、タンパク質は、８〜１５アミ
ノ酸よりなるペプチドに分解され、そのうちのいくつか
がＴＡＰトランスポーターにより細胞質から小胞体に運
ばれる。これらのペプチドは、小胞体でクラスＩ／β2
ミクログロブリン(microglobulin) のヘテロダイマーに
結合できれば、３分子複合体として安定化され、ゴルジ
装置を通って、細胞表面に輸送される。腫瘍関連抗原又
は腫瘍特異的抗原タンパク質を発現している腫瘍細胞
は、腫瘍細胞表面にＴリンパ球に認識される、ＭＨＣク
ラスＩ分子拘束性抗原ペプチドを提示できるはずであ
る。Such an antigen peptide is produced, for example, when an antigen or the like synthesized in the cells of a mammalian cell is processed by the endoplasmic reticulum and decomposed into a small epitope peptide, which further associates with an MHC class I molecule, Presented on the surface. That is, in the proteosome complex composed of many subunits, the protein is decomposed into peptides of 8 to 15 amino acids, some of which are transported from the cytoplasm to the endoplasmic reticulum by the TAP transporter. These peptides are class I / β2 in the endoplasmic reticulum.
If it is able to bind to the heterodimer of microglobulin, it is stabilized as a trimolecular complex and transported to the cell surface through the Golgi apparatus. Tumor cells expressing tumor-associated antigens or tumor-specific antigen proteins should be able to present MHC class I molecule-restricted antigen peptides recognized by T lymphocytes on the surface of tumor cells.
【０００６】Ｔリンパ球に認識される最初の腫瘍特異抗
原として、Ｐ．ファン デル ブルガン（P. van der B
ruggen）らによりメラノーマ（melanoma）抗原Ｅ（以
下、ＭＡＧＥと略す）と呼ばれる遺伝子がクローニン
グ、同定された〔Ｐ．ファン デル ブルガン（P. van
der Bruggen）ら、サイエンス（Science ）、第２５４
巻、第１６４３〜１６４７頁（１９９１）〕。Ｐ．ファ
ン デル ブルガンらは、メラノーマ患者由来のＣＴＬ
クローンと、該ＣＴＬに認識される同じ患者由来の一連
のメラノーマ細胞株と、該細胞株のうちのいくつかが該
ＣＴＬに耐性であるように免疫選択されて得られた細胞
株とを用いて、発現クローニング法によりＭＡＧＥを単
離した。As the first tumor-specific antigen recognized by T lymphocytes, P. P. van der B
ruggen) et al. have cloned and identified a gene called melanoma antigen E (hereinafter abbreviated as MAGE) [P. Van der Burgan (P. van
der Bruggen) et al., Science, No. 254.
Vol. 1643-1647 (1991)]. P. Van der Burgan et al. Reported CTLs derived from patients with melanoma.
Using a clone, a series of melanoma cell lines from the same patient recognized by the CTL, and a cell line obtained by immunoselecting some of the cell lines to be resistant to the CTL. , MAGE was isolated by the expression cloning method.
【０００７】すなわち、ＣＴＬに認識されたメラノーマ
細胞株より調製した５ｋｂのＤＮＡ断片を、元々ＣＴＬ
に認識されなかった細胞株に形質導入すると、得られた
形質導入株が、前記ＣＴＬクローンによって認識される
ことが示されている。前記ＤＮＡ断片は、推定分子量約
２６，０００のタンパク質をコードしている。このタン
パク質をコードした遺伝子は、ＭＡＧＥ−１と呼ばれて
いる。また、ｍＲＮＡ分析によって、転移性だけでなく
初期段階のメラノーマ由来の４０％の細胞株が前記ＭＡ
ＧＥ−１を発現していることが示されている。ＭＡＧＥ
−１タンパク質由来の抗原は、ＨＬＡ−Ａ１拘束性であ
り、ＭＡＧＥ−１特異的ＣＴＬクローンは、ＨＬＡクラ
スＩ分子の一種であるＨＬＡ−Ａ１分子に結合した９ア
ミノ酸残基からなるペプチドを認識することが示されて
いる〔Ｃ．トラヴァーサリ（C. Traversari ）ら、ジャ
ーナル オブ イクスペリメンタル オブ メディシン
（Journal of Experimental of Medicine ）、第１７６
巻、第１４５３〜１４５７頁（１９９２）〕。That is, a 5 kb DNA fragment prepared from a CTL-recognized melanoma cell line was originally used as CTL.
It has been shown that when transduced into a cell line which is not recognized by the CTL clone, the resulting transduced strain is recognized by the CTL clone. The DNA fragment encodes a protein having an estimated molecular weight of about 26,000. The gene encoding this protein is called MAGE-1. Moreover, mRNA analysis revealed that 40% of the cell lines derived from melanoma in the early stage as well as metastatic
It has been shown to express GE-1. MAGE
The antigen derived from the -1 protein is HLA-A1-restricted, and the MAGE-1-specific CTL clone recognizes a peptide consisting of 9 amino acid residues bound to the HLA-A1 molecule, which is a type of HLA class I molecule. [C. C. Traversari et al., Journal of Experimental of Medicine, No. 176.
Vol., Pp. 1453-1457 (1992)].
【０００８】腫瘍抗原として知られている抗原として
は、多くのものがあるが、ＣＤ８陽性のＣＴＬに認識さ
れる抗原としては、上記のＭＡＧＥ−１を始めとして数
十種以上存在することが知られているＭＡＧＥファミリ
ー、ｇｐ１００、チロシナーゼ（tyrosinase）、ＣＥ
Ａ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ等がよく知られている。ＣＴＬに
認識されるものは、腫瘍抗原タンパク質由来のペプチド
であり、ＨＬＡクラスＩ分子との複合体として提示され
る。Although there are many antigens known as tumor antigens, it is known that there are several dozen or more antigens recognized by CD8-positive CTLs, including MAGE-1 described above. Known MAGE family, gp100, tyrosinase, CE
A, HER2 / neu, etc. are well known. What is recognized by CTL is a peptide derived from a tumor antigen protein, which is presented as a complex with an HLA class I molecule.
【０００９】ＨＬＡクラスＩ分子は、主としてＨＬＡ−
Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃがあり、これらに結合して
提示される抗原ペプチドは、８〜１０個のアミノ酸から
なり、更に各々のＨＬＡ分子の種類によって異なる一定
の構造上の特徴があることが知られている。例えば、世
界的に最も頻度の高いＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合する
ペプチドとしては、Ｎ末端より２番目の位置にLeu が配
置され、かつＣ末端の位置にLeu 又はVal が配置された
ペプチドであって、９〜１０個のアミノ酸残基からなる
ペプチドが最も良く知られている。また、日本人を始め
とするアジアの人種に多いＨＬＡ−Ａ２４分子に結合す
るペプチドとしては、Ｎ末端より２番目の位置にTyr 、
Phe 、Met 又はTrp のいずれかが配置され、かつＣ末端
の位置にLeu 、Ile 、Trp 又はPhe のいずれかが配置さ
れたペプチドであって、９〜１０個のアミノ酸からなる
ペプチドが最もよく知られている〔Ａ．コンドー (A. K
ondo) ら、ジャーナル オブ イムノロジー (Journal
of Immunology)、第１５５巻、第４３０７〜４３１２頁
（１９９５）〕。HLA class I molecules are mainly HLA-
There are A, HLA-B, and HLA-C, and the antigenic peptide presented by binding to these consists of 8 to 10 amino acids, and further has certain structural characteristics that differ depending on the type of each HLA molecule. It is known. For example, a peptide that binds to the most frequently occurring HLA-A2.1 molecule in the world is a peptide in which Leu is located at the second position from the N-terminal and Leu or Val is located at the C-terminal position. Among them, the peptides consisting of 9 to 10 amino acid residues are the best known. In addition, as a peptide that binds to HLA-A24 molecule, which is often found in Asian races including Japanese, Tyr at the second position from the N-terminal,
A peptide in which either Phe, Met or Trp is located and Leu, Ile, Trp or Phe is located at the C-terminal position, and a peptide consisting of 9 to 10 amino acids is the best known [A. Condo (A. K
ondo) et al., Journal of Immunology (Journal
of Immunology), Volume 155, pp. 4307-4312 (1995)].
【００１０】現在までに抗原ペプチドが同定されている
腫瘍抗原としては、ＨＬＡ−Ａ１に対するＭＡＧＥ−
１、ＭＡＧＥ−３；ＨＬＡ−Ａ２．１に対するＭＡＧＥ
−３、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＨＥＲ
２／ｎｅｕ、ＣＥＡ等；ＨＬＡ−Ｃｗ１に対するＭＡＧ
Ｅ−３、ＨＬＡ−Ｂ４４に対するＭＡＧＥ−３等；ＨＬ
Ａ−Ａ２４に対するＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡ
ＧＥ−３、ＣＥＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、チロシナーゼ、
β−カテニン（ｃａｔｅｎｉｎ）等が挙げられる。The tumor antigens whose antigenic peptides have been identified to date are MAGE- against HLA-A1.
1, MAGE-3; MAGE for HLA-A2.1
-3, MART1, tyrosinase, gp100, HER
2 / neu, CEA, etc .; MAG for HLA-Cw1
E-3, MAGE-3 etc. for HLA-B44; HL
MAGE-1, MAGE-2, MA for A-A24
GE-3, CEA, HER2 / neu, tyrosinase,
Examples include β-catenin.
【００１１】前立腺癌においては、前立腺特異的膜抗原
(Prostate specific membrane antigen；以下、ＰＳＭ
Ａと称す) という腫瘍マーカーが発現しており、これら
を標的とした抗原ペプチドの提供が期待される。ＰＳＭ
Ａ由来の抗原ペプチドに関しては、配列番号：３ (ＰＳ
Ｍ−Ｐ１：LLHETDSAV)のアミノ酸配列を有する９残基か
らなるペプチド及び配列番号：４ (ＰＳＭ−Ｐ２：ALFD
IESKV)のアミノ酸配列を有する９残基からなるペプチド
の２種のペプチドがＨＬＡ−Ａ２．１拘束性抗原ペプチ
ドとして同定されている〔プロステート (Prostate) 、
第２８巻、第６５〜６９頁（１９９６）〕。また、ＰＳ
ＭＡは、前立腺癌における腫瘍細胞のみならず、腫瘍部
位での新生血管においても発現していることが知られて
いる〔チャン(Chang S. S.) ら、キャンサーリサーチ(C
ancer Research) 、第５９巻，第３１９２〜３１９８頁
（１９９９）〕。In prostate cancer, the prostate-specific membrane antigen
(Prostate specific membrane antigen; hereinafter PSM
A tumor marker (referred to as A) is expressed, and it is expected that antigen peptides targeting these will be provided. PSM
Regarding the antigenic peptide derived from A, SEQ ID NO: 3 (PS
Peptide consisting of 9 residues having the amino acid sequence of M-P1: LLHETDSAV and SEQ ID NO: 4 (PSM-P2: ALFD
Two peptides, peptides consisting of 9 residues having the amino acid sequence of IESKV) have been identified as HLA-A2.1 restricted antigenic peptides [Prostate,
28, 65-69 (1996)]. Also, PS
MA is known to be expressed not only in tumor cells in prostate cancer but also in new blood vessels at the tumor site [Chang SS et al. Cancer Research (C
ancer Research), Vol. 59, pp. 3192-3198 (1999)].
【００１２】これらの腫瘍抗原ペプチドの多くは、まず
腫瘍細胞を認識するクラスＩ拘束性のＣＴＬを株化し、
前記ＣＴＬが認識する腫瘍抗原を同定し、ついで遺伝子
工学的方法により腫瘍抗原タンパク質中のＣＴＬが認識
しうる最小単位を見出し、更にＨＬＡクラスＩ分子への
結合モチーフに関する情報を基に、前記最小単位の中か
ら、抗原性を有するペプチドを同定することにより、見
出されている〔Ｙ．カワカミ (Y. Kawakami)ら、プロシ
ーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オ
ブ ザ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ (Proceedi
ngs of the National Academy of the Sciences of the
United States of America)、第９１巻、第３５１５〜
３５１９頁（１９９４）〕。また、まず前記のＨＬＡク
ラスＩ分子結合ペプチドに共通したモチーフ構造を基
に、腫瘍抗原タンパク質中のＨＬＡクラスＩ分子結合ペ
プチドを見出し、ついで、抗原提示細胞を利用してＣＴ
Ｌを誘導可能なものを選択した後、最終的に腫瘍細胞に
対して傷害性を有するＣＴＬが誘導できているかどうか
により抗原ペプチドが決定されている〔Ｅ．セリス（E.
Celis）ら、プロシーディングズ オブ ザ ナショナ
ル アカデミー オブサイエンシーズ オブ ザ ＵＳ
Ａ、第９１巻、第２１０５〜２１０９頁（１９９４）、
Ｂ．ゴーグラー (B. Gaugler) ら、ジャーナル オブ
イクスペリメンタル オブ メディシン、第１７９巻、
第９２１〜９３０頁（１９９４）〕。[0012] Many of these tumor antigen peptides first establish a class I-restricted CTL that recognizes tumor cells,
The tumor antigen recognized by the CTL is identified, and then the minimum unit that can be recognized by the CTL in the tumor antigen protein is found by a genetic engineering method, and further based on the information on the binding motif to the HLA class I molecule, the minimum unit. It was found by identifying a peptide having antigenicity from among the above [Y. Y. Kawakami et al., Proceedings of the National Academy of the Sciences of the USA (Proceedi
ngs of the National Academy of the Sciences of the
United States of America), Volume 91, 3515-
3519 (1994)]. In addition, first, based on the motif structure common to the above HLA class I molecule-binding peptides, the HLA class I molecule-binding peptides in tumor antigen proteins were found, and then CT was detected using antigen presenting cells.
After selecting those capable of inducing L, the antigenic peptide is finally determined by whether or not CTL, which is toxic to tumor cells, can be induced [E. Celis (E.
Celis) et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the US
A, Vol. 91, pp. 2105-2109 (1994),
B. B. Gaugler et al., Journal of
Experimental of Medicine, Volume 179,
921-930 (1994)].
【００１３】しかしながら、ペプチド中にＨＬＡ−Ａ２
４結合モチーフを有することは、ＣＴＬを誘導するため
の１つの条件にすぎず、実際に細胞への選択的細胞傷害
活性を示すかどうかを推測することは困難であるのが現
状である。However, the HLA-A2 in the peptide
Having a 4-binding motif is only one condition for inducing CTL, and it is currently difficult to speculate whether it actually exhibits selective cytotoxic activity on cells.
【００１４】一方、ＨＬＡクラスＩ分子は、いくつかの
サブタイプに分類され、保有サブタイプの種類は、人種
間で大きく異なっている。世界的には、ＨＬＡ−Ａ２を
保有する場合が最も多く、白色人種の４５％を占めてお
り、該ＨＬＡ−Ａ２拘束性の抗原ペプチドの同定が最も
進んでいる。On the other hand, HLA class I molecules are classified into several subtypes, and the types of retained subtypes differ greatly among races. In the world, HLA-A2 is the most common case, accounting for 45% of Caucasians, and the HLA-A2-restricted antigenic peptide is most identified.
【００１５】日本人においては、前記ＨＬＡ−Ａ２は４
０％を占めるが、そのサブタイプを見ると、白色人種と
同じＨＬＡ−Ａ* 0201は２０％で、残りの多くはＨＬＡ
−Ａ * 0206である。これらのサブタイプへの結合ペプチ
ドは異なり、主に研究されているＨＬＡ−Ａ２は、ＨＬ
Ａ−Ａ* 0201である。一方、日本人ではＨＬＡ−Ａ２４
が６０％以上を占めており、このＨＬＡ−Ａ２４はアジ
ア人種では他の人種に比べて比率が高い。In Japanese, the HLA-A2 is 4
It accounts for 0%, but by looking at its subtype,
Same HLA-A*0201 is 20% and most of the rest is HLA
-A *It is 0206. Binding peptides to these subtypes
HLA-A2, which is mainly studied, is HL
A-A*It is 0201. On the other hand, in Japan, HLA-A24
Account for over 60%, and this HLA-A24
Oh, the ratio is higher in other races than in other races.
【００１６】しかしながら、前記ＨＬＡ−Ａ２４による
拘束性を示す抗原ペプチドについて、ＭＡＧＥ−１、Ｍ
ＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＣＥＡ、ＨＥＲ２／ｎｅ
ｕ、チロシナーゼ、β−カテニン等があるがＨＬＡ−Ａ
２．１に比べると未だにその解析は遅れており、種々の
腫瘍抗原に対する新たな抗原ペプチドの発見が望まれて
いる。また、アジア人種、特に日本人において腫瘍細胞
特異的に作用するＣＴＬの解析も遅れており、腫瘍治療
に有用なＣＴＬの提供が困難であるのが現状である。However, regarding the antigenic peptides which are restricted by HLA-A24, MAGE-1, M
AGE-2, MAGE-3, CEA, HER2 / ne
u, tyrosinase, β-catenin, etc., but HLA-A
The analysis is still behind that of 2.1, and the discovery of new antigenic peptides against various tumor antigens is desired. In addition, analysis of CTLs that act specifically on tumor cells has been delayed in Asian races, especially in Japanese, and it is currently difficult to provide CTLs useful for tumor treatment.
【００１７】[0017]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アジ
ア人種、特に日本人において、前立腺特異膜抗原 (pros
tate specific membrane antigen, 以下、ＰＳＭＡと略
す) の異常発現を伴う疾患、例えば、癌、具体的には、
前立腺癌などの治療及び診断に有用な技術、例えば、Ｃ
ＴＬ等を提供することにある。詳しくは、例えば、本発
明は、ＰＳＭＡの異常発現を伴う疾患、例えば、癌、具
体的には、前立腺癌などの治療及び診断を行なうこと、
ＨＬＡ−Ａ２４及びＰＳＭＡ共に陽性の細胞、特に腫瘍
細胞を選択的に傷害することができること、癌治療を目
的とした細胞医薬（制癌剤等）として用いることができ
ること、体外摘出試料中のＨＬＡ−Ａ２４及びＰＳＭＡ
共に陽性の細胞、特に腫瘍細胞の有無の検出を行なうこ
との少なくとも１つを達成しうるＣＴＬを提供すること
を目的とする。また、本発明は、かかるＣＴＬを選択的
に誘導することができること、かかるＣＴＬの誘導剤と
して使用できること、前記ＣＴＬの誘導に基づく癌など
の疾患の治療を可能にすることの少なくとも１つを達成
しうるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びそれをコ
ードする核酸を提供することを目的とする。また、本発
明は、前記ＣＴＬの調製に用いること、前記ＣＴＬの誘
導に基づく癌などの疾患の治療を可能にすることの少な
くとも１つを達成しうる抗原提示細胞を提供することを
目的とする。さらに、本発明は、本発明のＣＴＬを、効
率よく、選択的に得ることができるＣＴＬの誘導方法及
びＣＴＬ誘導剤を提供することを目的とする。さらに、
ＣＴＬの感受性細胞を、効率よく、選択的に検出するこ
とができること、ＨＬＡのタイピング、癌、具体的に
は、前立腺癌などの疾患を診断することの少なくとも１
つを達成しうるＣＴＬの感受性細胞の検出方法及び検出
剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、ヒ
ト主要組織適合抗原未発現細胞及び／又は抗原タンパク
質未発現細胞でのヒト主要組織適合抗原及び／又は抗原
タンパク質の発現を行ないうる、細胞傷害性Ｔリンパ球
により傷害を受ける標的細胞及びそれを効率よく得るこ
とが可能な該標的細胞の調製方法を提供することを目的
とする。The object of the present invention is to identify the prostate specific membrane antigen (pros) in Asian races, especially in Japanese.
tate specific membrane antigen, hereinafter abbreviated as PSMA), such as cancer, specifically,
Techniques useful in the treatment and diagnosis of prostate cancer, such as C
It is to provide TL and the like. Specifically, for example, the present invention provides treatment and diagnosis of diseases associated with abnormal expression of PSMA, such as cancer, specifically prostate cancer.
Both HLA-A24 and PSMA positive cells, especially tumor cells, can be selectively injured, can be used as a cell drug (anticancer drug, etc.) for the purpose of treating cancer, and HLA-A24 in an in vitro excised sample and PSMA
It is an object of the present invention to provide a CTL that can achieve at least one of detecting both the presence of positive cells, especially the presence of tumor cells. Further, the present invention achieves at least one of being capable of selectively inducing such CTL, being able to be used as an inducer of such CTL, and being capable of treating a disease such as cancer based on the induction of said CTL. It is intended to provide a possible HLA-A24-restricted antigenic peptide and a nucleic acid encoding the same. Another object of the present invention is to provide an antigen-presenting cell that can be used for the preparation of the CTL and can achieve at least one of the treatment of diseases such as cancer based on the induction of the CTL. . Further, it is an object of the present invention to provide a CTL inducing method and a CTL inducing agent capable of efficiently and selectively obtaining the CTL of the present invention. further,
At least one of being able to detect CTL sensitive cells efficiently and selectively, and diagnosing HLA typing, cancer, specifically, diseases such as prostate cancer
It is an object of the present invention to provide a method for detecting CTL sensitive cells and a detection agent capable of achieving the above-mentioned two. Furthermore, the present invention is injured by cytotoxic T lymphocytes capable of expressing human major histocompatibility antigen and / or antigen protein in cells that do not express human major histocompatibility antigen and / or antigen protein. It is an object of the present invention to provide a target cell and a method for preparing the target cell that can efficiently obtain the target cell.
【００１８】[0018]
【課題を解決するための手段】本発明は、
〔１〕 下記（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）配列番号：１若しくは２に示されるアミノ酸配
列、又は（ｂ）配列番号：１若しくは２において、下記
〜：
少なくとも１残基のアミノ酸の欠失、
少なくとも１残基のアミノ酸の、他のアミノ酸若しく
はアミノ酸アナログとの置換、及び
少なくとも１残基の他のアミノ酸若しくはアミノ酸ア
ナログの付加からなる群より選ばれた少なくとも１種の
変異を有するアミノ酸配列のアミノ酸配列を有し、かつ
該配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列からなる
ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に
提示する細胞を特異的に認識しうるＴ細胞レセプターを
有するＣＴＬを誘導しうる性質を有するヒト主要組織適
合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド、
〔２〕 前記〔１〕記載のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペ
プチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提
示する細胞を特異的に認識しうるＴ細胞レセプターを有
してなる細胞傷害性Ｔリンパ球、〔３〕 前記〔１〕記
載のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを使用すること
により、細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導することを特徴と
する、細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導方法、〔４〕
（１）前記〔１〕記載のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプ
チドと、マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞からなる
群より選択された１種の抗原提示能を有する細胞とを接
触させて抗原提示細胞を得、得られた抗原提示細胞を用
いて、抗原提示能を有する細胞に抗原刺激を与え、それ
により、エフェクター細胞を得る工程、（２）前記工程
（１）で得られたエフェクター細胞と、前記〔２〕記載
の細胞傷害性Ｔリンパ球により傷害を受ける標的細胞と
を接触させて、細胞傷害活性の有無を検出する工程、及
び（３）前記工程（２）において、細胞傷害活性を呈し
たエフェクター細胞を細胞傷害性Ｔリンパ球として選別
する工程、を含む、前記〔３〕記載の誘導方法、〔５〕
ＩＬ−７の存在下、リンパ球１個に対し、抗原提示細
胞０．０１〜１個の割合で接触させる、前記〔４〕記載
の誘導方法、〔６〕 ＩＬ−７とキーホール リムペッ
ト ヘモシアニンとの存在下、末梢血単核球に、該末梢
血単核球を含む溶液１ｍｌあたり、前記〔１〕記載のＨ
ＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド１ｎｇ〜１００μｇを
添加する、前記〔４〕記載の誘導方法、〔７〕 前記
〔１〕記載のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを有効
成分として含有してなる、前記〔２〕記載の細胞傷害牲
Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を得るためのＣＴＬ誘導剤、
〔８〕 前記〔１〕記載のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペ
プチドを有効成分として含有してなる制癌剤、The present invention provides [1] the following (a) or (b): (a) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, or (b) the SEQ ID NO: 1 or 2 In the following, the group consisting of: deletion of at least one amino acid, substitution of at least one amino acid with another amino acid or amino acid analog, and addition of at least one other amino acid or amino acid analog. Presenting on the cell surface a complex of an HLA-A24 molecule with a peptide having an amino acid sequence having at least one mutation selected from the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 or 2 Major histocompatibility complex (HLA) -A24-restricted having the property of inducing CTL having a T cell receptor capable of specifically recognizing Original peptide,
[2] Cytotoxicity comprising a T cell receptor capable of specifically recognizing cells presenting a complex of the HLA-A24-restricted antigenic peptide according to [1] and an HLA-A24 molecule on the cell surface T lymphocytes, [3] A method for inducing cytotoxic T lymphocytes, which comprises inducing cytotoxic T lymphocytes by using the HLA-A24-restricted antigen peptide according to [1] above. , [4]
(1) An antigen-presenting cell by contacting the HLA-A24-restricted antigen peptide according to [1] with one cell having an antigen-presenting ability selected from the group consisting of macrophages, B cells and dendritic cells. And a step of using the obtained antigen-presenting cells to give antigen stimulation to cells having an antigen-presenting ability, thereby obtaining effector cells, (2) the effector cells obtained in the step (1), The step of contacting the target cell damaged by the cytotoxic T lymphocyte according to the above [2] to detect the presence or absence of the cytotoxic activity, and (3) the step of displaying the cytotoxic activity in the step (2). The step of selecting the effector cells as described above as cytotoxic T lymphocytes, [5]
Inducing method according to the above [4], which comprises contacting one lymphocyte with 0.01 to 1 antigen-presenting cells in the presence of IL-7, [6] IL-7 and keyhole limpet hemocyanin In the presence of H., per 1 ml of a solution containing the peripheral blood mononuclear cells, H in accordance with the above [1],
The method of inducing according to [4] above, which comprises adding 1 ng to 100 µg of LA-A24-restricted antigenic peptide, [7] comprising the HLA-A24-restricted antigenic peptide according to [1] as an active ingredient, 2] A CTL inducer for obtaining the cytotoxic T lymphocyte (CTL) described above,
[8] A carcinostatic agent comprising the HLA-A24-restricted antigenic peptide according to [1] above as an active ingredient,
〔９〕
前記〔２〕記載の細胞傷害性Ｔリンパ球を有効成分とし
て含有してなる制癌剤、〔１０〕 前記〔１〕記載のＨ
ＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子
との複合体を細胞表面に提示してなる抗原提示細胞、
〔１１〕 前記〔１０〕記載の抗原提示細胞を有効成分
として含有してなる、前記〔２〕記載の細胞傷害牲Ｔリ
ンパ球（ＣＴＬ）を得るためのＣＴＬ誘導剤、〔１２〕
前記〔１０〕記載の抗原提示細胞を有効成分として含
有してなる制癌剤、〔１３〕 前記〔２〕記載の細胞傷
害性Ｔリンパ球と被検細胞とを接触させ、それにより、
ＣＴＬによる細胞溶解、サイトカイン遊離及びＣＴＬの
増殖からなる群より選ばれた変化が生じる場合、該被検
細胞が、前記〔２〕記載の細胞傷害性Ｔリンパ球に感受
性のある細胞（感受性細胞）であることの指標とするこ
とを特徴とする、細胞傷害性Ｔリンパ球の感受性細胞の
検出方法、〔１４〕 前記〔２〕記載の細胞傷害性Ｔリ
ンパ球を有効成分として含有してなる、細胞傷害性Ｔリ
ンパ球の感受性細胞の検出剤、〔１５〕 前記〔１〕記
載のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドの存在下、前記
〔２〕記載の細胞傷害性Ｔリンパ球と被検細胞とを接触
させることを特徴とする、被検細胞におけるヒト主要組
織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４分子の検出方法、〔１
６〕 前記〔１〕記載のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプ
チドをコードしてなる核酸、〔１７〕 ヒト主要組織適
合性抗原をコードする核酸及び／又は抗原タンパク質を
コードする核酸を細胞に導入する工程を含む、細胞傷害
性Ｔリンパ球により傷害を受ける標的細胞の調製方法、
〔１８〕 核酸の細胞への導入が、アデノウイルスベク
ターを介して実施される、前記〔１７〕記載の調製方
法、〔１９〕 ヒト主要組織適合性抗原をコードする核
酸が、ＨＬＡ−Ａ２４をコードする核酸である、前記
〔１７〕又は〔１８〕記載の調製方法、〔２０〕 抗原
タンパク質をコードする核酸が、前記〔１６〕記載の核
酸である、前記〔１７〕〜〔１９〕いずれかに記載の調
製方法、並びに〔２１〕 前記〔１７〕〜〔２０〕いず
れかに記載の調製方法により得られる、細胞傷害性Ｔリ
ンパ球により傷害を受ける標的細胞、に関する。[9]
An anticancer agent containing the cytotoxic T lymphocyte according to [2] above as an active ingredient, [10] H according to [1] above
An antigen-presenting cell obtained by presenting a complex of an LA-A24-restricted antigen peptide and an HLA-A24 molecule on the cell surface,
[11] A CTL inducer for obtaining the cytotoxic T lymphocyte (CTL) according to [2], which comprises the antigen-presenting cell according to [10] as an active ingredient, [12]
[13] An anticancer agent comprising the antigen-presenting cell according to [10] above as an active ingredient, [13] The cytotoxic T lymphocyte according to [2] above is brought into contact with a test cell, and thereby,
When a change selected from the group consisting of cytolysis by CTL, cytokine release and CTL proliferation occurs, the test cell is a cell sensitive to the cytotoxic T lymphocyte described in [2] above (sensitive cell). A method for detecting sensitive cells of cytotoxic T lymphocytes, which comprises using as an active ingredient the cytotoxic T lymphocytes according to [2] above. [15] a cytotoxic T lymphocyte sensitive cell detecting agent, [15] in the presence of the HLA-A24-restricted antigenic peptide according to [1], the cytotoxic T lymphocyte according to [2] and a test cell; A method for detecting a human major histocompatibility complex (HLA) -A24 molecule in a test cell, which comprises contacting
6] A step of introducing into a cell a nucleic acid encoding the HLA-A24-restricted antigen peptide according to [1], [17] a nucleic acid encoding a human major histocompatibility complex and / or a nucleic acid encoding an antigen protein A method of preparing a target cell damaged by a cytotoxic T lymphocyte, comprising:
[18] The preparation method according to the above [17], wherein the nucleic acid is introduced into a cell via an adenovirus vector, [19] the nucleic acid encoding a human major histocompatibility antigen encodes HLA-A24. [17] or [18], wherein the nucleic acid encoding the antigenic protein is the nucleic acid according to [16], wherein [17] or [19] And [21] a target cell damaged by cytotoxic T lymphocytes, which is obtained by the preparation method according to any one of [17] to [20].
【００１９】[0019]
【発明の実施の形態】本発明は、腫瘍抗原であるＰＳＭ
Ａタンパク質中のＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有する
ペプチドを中心として多くの候補ペプチドの中から抗原
ペプチドを探索した結果、多くの候補ペプチドの中で
も、配列番号：１又は２で示されるアミノ酸配列からな
るペプチドを用いてリンパ球を抗原刺激した場合、ＨＬ
Ａ−Ａ２４を発現している健常人の末梢血単核球から、
該腫瘍抗原発現細胞を選択的に傷害する細胞傷害性Ｔリ
ンパ球（ＣＴＬ）を誘導できるという本発明者らの知見
に基づく。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention relates to a tumor antigen, PSM.
As a result of searching for an antigen peptide among many candidate peptides centering on a peptide having an HLA-A24 binding motif in protein A, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 among many candidate peptides. When lymphocytes were stimulated with HL, HL
From peripheral blood mononuclear cells of healthy subjects expressing A-A24,
It is based on the findings of the present inventors that it can induce cytotoxic T lymphocytes (CTLs) that selectively damage the tumor antigen-expressing cells.
【００２０】なお、本明細書においては、ＨＬＡ−Ａ２
４拘束性抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体
を細胞表面に提示する細胞を表わす用語として、「標的
細胞」及び「抗原提示細胞」なる語を使用する。In the present specification, HLA-A2 is used.
The terms “target cell” and “antigen-presenting cell” are used as terms that represent cells that present a complex of a 4-restricted antigenic peptide and HLA-A24 molecule on the cell surface.
【００２１】特に、前記「標的細胞」は、該細胞を特異
的に認識する細胞傷害性Ｔリンパ球（以下、ＣＴＬとも
称する）により傷害を受ける細胞をいう。一方、前記
「抗原提示細胞」は、ＭＨＣ分子と共に抗原を提示し、
Ｔリンパ球の活性化を惹起する機能を有する細胞を意味
し、特に断りのない限り、ＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ａ２４
分子である細胞とする。[0021] In particular, the "target cell" refers to a cell damaged by a cytotoxic T lymphocyte (hereinafter also referred to as CTL) that specifically recognizes the cell. On the other hand, the “antigen presenting cell” presents an antigen together with an MHC molecule,
It means a cell having a function of inducing activation of T lymphocytes, and unless otherwise specified, the MHC molecule is HLA-A24.
A cell that is a molecule.
【００２２】前記「抗原提示能を有する細胞」とは、該
細胞に存在するＭＨＣ分子と抗原ペプチドとが複合体を
形成することにより、抗原提示細胞となることができる
細胞を意味し、特に断りのない限り、該ＭＨＣ分子がＨ
ＬＡ−Ａ２４分子である細胞とする。本明細書におい
て、癌とは、悪性腫瘍をいい、癌腫、肉腫の何れをも含
む。また、本明細書における癌には、腫瘍細胞のみなら
ず、腫瘍関連部位、例えば、腫瘍部位内の新生血管等も
含まれる。The above-mentioned "cell capable of presenting an antigen" means a cell which can become an antigen presenting cell by forming a complex between an MHC molecule present in the cell and an antigen peptide, and is not specifically mentioned. Unless the MHC molecule is H
The cell is the LA-A24 molecule. In the present specification, cancer refers to malignant tumor and includes both carcinoma and sarcoma. Further, the cancer in the present specification includes not only tumor cells but also tumor-related sites such as neovascularization in the tumor site.
【００２３】本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチ
ドは、下記（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）配列番号：１若しくは２に示されるアミノ酸配
列、又は（ｂ）配列番号：１若しくは２において、下記
〜：
少なくとも１残基のアミノ酸の欠失、
少なくとも１残基のアミノ酸の、他のアミノ酸若しく
はアミノ酸アナログとの置換、及び
少なくとも１残基の他のアミノ酸若しくはアミノ酸ア
ナログの付加からなる群より選ばれた少なくとも１種の
変異を有するアミノ酸配列のアミノ酸配列を有し、かつ
該配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列からなる
ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に
提示する細胞を特異的に認識しうるＴ細胞レセプターを
有するＣＴＬを誘導しうる性質、を有することに１つの
特徴がある。なお、本明細書においては、前記配列番
号：１又は２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド
をＰＳＭＡ抗原ペプチドと称する場合もある。The HLA-A24-restricted antigen peptide of the present invention has the following (a) or (b): (a) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, or (b) SEQ ID NO: 1 or 2. From the group consisting of: deletion of at least one residue amino acid, substitution of at least one residue amino acid with another amino acid or amino acid analog, and addition of at least one residue other amino acid or amino acid analog. Presenting a complex of a peptide having an amino acid sequence having at least one selected amino acid sequence and having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 and an HLA-A24 molecule on a cell surface One characteristic is that it has a property of inducing CTL having a T cell receptor capable of specifically recognizing cells. In the present specification, the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 may be referred to as PSMA antigen peptide.
【００２４】本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチ
ドによれば、ＰＳＭＡの異常発現を伴う疾患、例えば、
癌の治療及び診断に有用な、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣ
ＴＬ、すなわち、該ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との
複合体を細胞表面に提示する細胞を特異的に認識しうる
Ｔ細胞レセプターを有するＣＴＬを誘導することができ
るという優れた効果を発揮する。すなわち、本発明のＨ
ＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドは、アジア人種、特に
日本人に多い、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であるため、腫瘍
などの疾患の治療として、アジア人種、特に日本人に対
して特に有効に、腫瘍細胞及び／又は腫瘍関連部位、具
体的には、ＰＳＭＡを異常発現する腫瘍細胞及び／又は
腫瘍関連部位、特に前立腺癌細胞及び／又は前立腺癌関
連部位を特異的に抑制することができるという優れた効
果を発揮する。According to the HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention, diseases associated with abnormal expression of PSMA, for example,
HLA-A24-restricted C useful for the treatment and diagnosis of cancer
It exerts an excellent effect of inducing TL, that is, CTL having a T cell receptor capable of specifically recognizing cells that present a complex of the peptide and HLA-A24 molecule on the cell surface. That is, H of the present invention
The LA-A24-restricted antigenic peptide is HLA-A24-restricted, which is common in Asian races, especially in Japanese. Therefore, it is particularly effective for Asian races, particularly in Japanese, as a treatment for diseases such as tumors. Excellent ability to specifically suppress tumor cells and / or tumor-related sites, specifically, tumor cells and / or tumor-related sites that abnormally express PSMA, particularly prostate cancer cells and / or prostate cancer-related sites Exert the effect.
【００２５】なお、本発明には、本発明のＨＬＡ−Ａ２
４拘束性抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体
を細胞表面に提示する細胞を特異的に認識しうるＴ細胞
レセプターを有するＣＴＬも包含される。In the present invention, the HLA-A2 of the present invention is used.
A CTL having a T cell receptor capable of specifically recognizing a cell that presents a complex of a 4-restricted antigenic peptide and an HLA-A24 molecule on the cell surface is also included.
【００２６】本明細書において、「抗原ペプチド」と
は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、該ＭＨＣクラスＩ分
子との複合体形成能を有すると共に、形成された複合体
が特異的なＣＴＬのＴＣＲによって認識される抗原性を
有するものであるペプチドを意味する。As used herein, the term "antigen peptide" means a CTL TCR that binds to an MHC class I molecule and has the ability to form a complex with the MHC class I molecule, and that the formed complex is specific. It means a peptide that has the antigenicity recognized by.
【００２７】また、本明細書において、「ＨＬＡ拘束性
抗原ペプチド」とは、ＭＨＣクラスＩ分子がＨＬＡ分子
である抗原ペプチドであることを意味する。In the present specification, the "HLA-restricted antigenic peptide" means that the MHC class I molecule is an HLA molecule.
【００２８】本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチ
ドは、アミノ酸のみからなるホモメリックペプチドであ
ってもよく、非アミノ酸成分を含むヘテロメリックペプ
チドであってもよい。また、前記アミノ酸は、天然型の
アミノ酸であってもよく、化学修飾されたアミノ酸であ
ってもよい。さらに、前記ペプチドは、単量体であって
もよく、多量体であってもよい。The HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention may be a homomeric peptide consisting of only amino acids or a heteromeric peptide containing a non-amino acid component. The amino acid may be a naturally occurring amino acid or a chemically modified amino acid. Furthermore, the peptide may be a monomer or a multimer.
【００２９】本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチ
ドとしては、例えば、配列番号：１又は２に示されるア
ミノ酸配列において、少なくとも１残基のアミノ酸、具
体的には、１若しくは数個のアミノ酸について、欠失、
置換及び付加からなる群より選択された少なくとも１つ
の変異により、該配列番号：１又は２に示されるアミノ
酸配列とは異なるが、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体形
成能を有すると共に、形成された複合体が、配列番号：
１又は２に示される抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子
との複合体を細胞表面に提示する細胞を特異的に認識し
うるＴ細胞レセプターを有するＣＴＬに認識されるペプ
チドが挙げられる。The HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention includes, for example, at least one amino acid residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, specifically one or several amino acids. , Deletion,
At least one mutation selected from the group consisting of substitution and addition differs from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 but has the ability to form a complex with the HLA-A24 molecule and is formed. The complex is SEQ ID NO:
Examples thereof include peptides recognized by CTL having T cell receptors capable of specifically recognizing cells that present a complex of the antigenic peptide shown in 1 or 2 and HLA-A24 molecule on the cell surface.
【００３０】前記変異としては、具体的には、
少なくとも１残基のアミノ酸の欠失、
少なくとも１残基のアミノ酸の、他のアミノ酸若しく
はアミノ酸アナログとの置換、及び
少なくとも１残基の他のアミノ酸若しくはアミノ酸ア
ナログの付加、などが挙げられる。かかる変異は、単独
であってもよく、これらの組み合わせであってもよい。Specific examples of the mutation include deletion of at least one amino acid residue, substitution of at least one amino acid residue with another amino acid or amino acid analog, and at least one residue amino acid residue. Alternatively, addition of amino acid analogs and the like can be mentioned. Such mutation may be a single mutation or a combination thereof.
【００３１】本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチ
ドのアミノ酸配列の長さは、配列番号：１又は２に示さ
れるアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分
子との複合体を細胞表面に提示する細胞を特異的に認識
しうるＴ細胞レセプターを有するＣＴＬを誘導しうる性
質を発揮するものであればよく、９〜１０残基であるこ
とが望ましいが、特に限定されるものではない。例え
ば、前記配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列に
おいて、の変異を有するアミノ酸配列からなるペプチ
ドである場合には、アミノ酸配列の長さは、９〜１０残
基であることが望ましいが、特に限定されるものではな
い。前記配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列に
おいて、の変異を有するアミノ酸配列からなるペプチ
ドである場合には、アミノ酸配列の長さは、９〜１０残
基であることが望ましいが、特に限定されるものではな
い。The length of the amino acid sequence of the HLA-A24-restricted antigen peptide of the present invention is such that the complex of the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 and the HLA-A24 molecule is presented on the cell surface. Any compound capable of inducing CTL having a T cell receptor capable of specifically recognizing a cell may be used, and it is preferably 9 to 10 residues, but is not particularly limited. For example, in the case of a peptide consisting of an amino acid sequence having the mutation of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, the length of the amino acid sequence is preferably 9 to 10 residues, It is not particularly limited. In the case of a peptide consisting of an amino acid sequence having the mutation of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, the length of the amino acid sequence is preferably 9 to 10 residues, but is not particularly limited. It is not something that will be done.
【００３２】前記アミノ酸アナログとしては、種々のア
ミノ酸のＮ−アシル化物、Ｏ−アシル化物、エステル化
物、酸アミド化物、アルキル化物等が挙げられる。Examples of the amino acid analog include N-acylated products, O-acylated products, esterified products, acid amidated products and alkylated products of various amino acids.
【００３３】また、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体が、
配列番号：１又は２に示される抗原ペプチドとＨＬＡ−
Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を特異
的に認識しうるＴ細胞レセプターを有するＣＴＬに認識
されるものであれば、抗原ペプチドのＮ末端や遊離のア
ミノ基には、ホルミル基、アセチル基、ｔ−ブトキシカ
ルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）基等が結合していてもよく、抗
原ペプチドのＣ末端や遊離のカルボキシル基には、メチ
ル基、エチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基等が結合し
ていてもよい。Further, a complex with the HLA-A24 molecule is
HLA- and the antigenic peptide shown in SEQ ID NO: 1 or 2
As long as it is recognized by a CTL having a T cell receptor capable of specifically recognizing a cell that presents a complex with an A24 molecule on the cell surface, the N-terminal of the antigenic peptide or a free amino group is a formyl group. , An acetyl group, a t-butoxycarbonyl (t-Boc) group, etc. may be bonded, and a methyl group, an ethyl group, a t-butyl group, a benzyl group, etc. may be added to the C-terminal or free carboxyl group of the antigen peptide. May be bonded.
【００３４】また、本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原
ペプチドは、生体内への導入を容易にしうる各種修飾を
施されたものであってもよい。Further, the HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention may be one which has been subjected to various modifications to facilitate its introduction into a living body.
【００３５】本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチ
ドは、配列番号：１又は２に示される抗原ペプチドとＨ
ＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する細胞
を特異的に認識しうるＴ細胞レセプターを有するＣＴＬ
を用いることにより、選別することができる。前記選別
は、例えば、下記方法１〜３などにより行なうことがで
きる。The HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention comprises the antigenic peptide shown in SEQ ID NO: 1 or 2 and H
CTL having a T cell receptor capable of specifically recognizing cells that present a complex with LA-A24 molecule on the cell surface
Can be selected by using. The selection can be performed by, for example, the following methods 1 to 3.
【００３６】方法１
本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドとしての候
補物質とＨＬＡ−Ａ２４発現細胞とを混合し、ＨＬＡ−
Ａ２４分子に未結合の候補物質を洗浄除去後、得られた
候補物質結合ＨＬＡ−Ａ２４発現細胞とＣＴＬとを反応
させる。候補物質特異的な細胞傷害性、サイトカイン遊
離又は増殖反応などが認められた場合、前記候補物質が
本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドであると判
断できる。 Method 1 A candidate substance as the HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention is mixed with HLA-A24 expressing cells, and HLA-A24 is expressed.
After washing and removing the candidate substance not bound to the A24 molecule, the obtained candidate substance-bound HLA-A24-expressing cells are reacted with CTL. When the candidate substance-specific cytotoxicity, cytokine release or proliferative reaction and the like are observed, it can be determined that the candidate substance is the HLA-A24-restricted antigen peptide of the present invention.
【００３７】方法２
候補物質と抗原提示能を有する細胞とを接触させ、適当
な時間、例えば、抗原が細胞内に取り込まれプロセッシ
ングを受け、抗原ペプチドとＨＬＡ分子複合体が細胞表
面に提示されるために要する時間、反応させた後、得ら
れた反応物とＣＴＬとを反応させる。候補物質特異的な
サイトカイン遊離又は増殖反応が認められた場合、前記
候補物質が本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド
であると判断できる。 Method 2 A candidate substance is brought into contact with a cell having an antigen-presenting ability, and an antigen is taken up into the cell and processed for an appropriate time, for example, and an antigen peptide and an HLA molecule complex are presented on the cell surface. After reacting for the time required for the reaction, the obtained reaction product is reacted with CTL. When a candidate substance-specific cytokine release or proliferative reaction is observed, it can be judged that the candidate substance is the HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention.
【００３８】方法３
後述の抗原提示能を有する細胞上のＨＬＡ−Ａ２４分子
上にペプチドを提示させることが可能な発現ベクター
に、候補物質のアミノ酸配列をコードする核酸を組込
み、得られた組換えベクターを用いて形質転換された抗
原提示能を有する細胞とＣＴＬとを反応させる。候補物
質特異的なサイトカイン遊離又は増殖反応が認められた
場合、前記候補物質が本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗
原ペプチドであると判断できる。 Method 3 A recombinant obtained by incorporating a nucleic acid encoding the amino acid sequence of a candidate substance into an expression vector capable of presenting a peptide on the HLA-A24 molecule on cells having antigen-presenting ability described below. The cells capable of presenting antigens transformed with the vector are reacted with CTL. When a candidate substance-specific cytokine release or proliferative reaction is observed, it can be judged that the candidate substance is the HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention.
【００３９】本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチ
ドにおいては、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体が、配列
番号：１又は２に示される抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２
４分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を特異的に
認識しうるＴ細胞レセプターを有するＣＴＬに認識され
るものであれば、例えば、配列番号：１又は２で示され
るアミノ酸配列において、ＨＬＡ−Ａ２４分子への結合
を強めるために、Ｎ末端より２番目のアミノ酸がＨＬＡ
−Ａ２４分子に結合するペプチドに特徴的なアミノ酸：
Tyr 、Phe 、Met 及びTrp からなる群より選択されたア
ミノ酸に置換、及び／又はＣ末端のアミノ酸がＨＬＡ−
Ａ２４分子に結合するペプチドに特徴的なアミノ酸：Le
u 、Ile 、Trp 及びPhe からなる群より選択されたアミ
ノ酸に置換されたペプチドであってもよい。例えば、配
列番号：２のアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸(Phe) が
Leu に置換された配列番号：５のアミノ酸配列を有する
ペプチドが挙げられる。In the HLA-A24-restricted antigen peptide of the present invention, the complex with the HLA-A24 molecule is the antigen peptide shown in SEQ ID NO: 1 or 2 and HLA-A2.
As long as it is recognized by CTL having a T cell receptor capable of specifically recognizing a cell that presents a complex with 4 molecules on the cell surface, for example, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, In order to enhance the binding to the HLA-A24 molecule, the second amino acid from the N-terminus is HLA.
-Amino acids characteristic of peptides that bind to the A24 molecule:
Substitution with an amino acid selected from the group consisting of Tyr, Phe, Met and Trp, and / or the C-terminal amino acid is HLA-
Amino acids characteristic of peptides that bind to A24 molecule: Le
It may be a peptide substituted with an amino acid selected from the group consisting of u, Ile, Trp and Phe. For example, the C-terminal amino acid (Phe) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is
An example is a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 substituted with Leu.
【００４０】また、配列番号：１又は２に示されるアミ
ノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換された
アミノ酸配列を有するペプチドとしては、それぞれの置
換対象アミノ酸と側鎖の類似したアミノ酸若しくはアミ
ノ酸アナログに置換したペプチドであって、かつＨＬＡ
−Ａ２４分子と結合能を有し、ＨＬＡ−Ａ２４分子との
複合体が配列番号：１又は２に示される抗原ペプチドと
ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する細
胞を特異的に認識しうるＴ細胞レセプターを有するＣＴ
Ｌに認識されるペプチドも挙げられる。Further, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, a peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids have been replaced is, An analog-substituted peptide and HLA
-Specifically for cells that have the ability to bind to A24 molecule and whose complex with the HLA-A24 molecule presents the complex of the antigenic peptide shown in SEQ ID NO: 1 or 2 and the HLA-A24 molecule on the cell surface CT with recognizable T cell receptor
Peptides recognized by L are also included.
【００４１】側鎖の類似したアミノ酸としては、例え
ば、グリシン(Gly) とアラニン(Ala)；バリン(Val) 、
イソロイシン(Ile) 、ロイシン(Leu) とメチオニン(Me
t) ；アスパラギン(Asn) とグルタミン(Gln) ；アスパ
ラギン酸(Asp) とグルタミン酸(Glu) ；セリン(Ser) と
スレオニン(Thr) ；リジン(Lys) とアルギニン(Arg) ；
フェニルアラニン(Phe) とチロシン(Tyr) が挙げられ
る。As amino acids having similar side chains, for example, glycine (Gly) and alanine (Ala); valine (Val),
Isoleucine (Ile), Leucine (Leu) and Methionine (Me
t); asparagine (Asn) and glutamine (Gln); aspartic acid (Asp) and glutamic acid (Glu); serine (Ser) and threonine (Thr); lysine (Lys) and arginine (Arg);
Examples include phenylalanine (Phe) and tyrosine (Tyr).
【００４２】具体的には、配列番号：１又は２に示され
るアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換
されたアミノ酸配列を有するペプチドとしては、配列番
号：２において、Ｎ末端のアミノ酸(Asn) をGln に置換
した配列番号：６に示されるアミノ酸配列を有するペプ
チド；Ｎ末端より５番目のアミノ酸(Thr) をSer に置換
した配列番号：７に示されるアミノ酸配列を有するペプ
チドが挙げられる。Specifically, a peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 has the amino acid at the N-terminal of SEQ ID NO: 2 ( Examples include a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in which Asn) is replaced with Gln; a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 in which the fifth amino acid (Thr) from the N-terminus is replaced with Ser. .
【００４３】また、配列番号：１又は２に示されるアミ
ノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換された
アミノ酸配列を有するペプチドは、配列番号：１又は２
に示される抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合
体を細胞表面に提示する細胞を特異的に認識しうるＴ細
胞レセプターを有するＣＴＬに認識されるものであれ
ば、側鎖の類似していないアミノ酸との置換を有してい
てもよい。例えば、配列番号：２に示されるアミノ酸配
列において、１又は数個のアミノ酸が、他のアミノ酸又
はアミノ酸アナログ、例えば、Ala に置換されたアミノ
酸配列を有するペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４
分子との結合能を有し、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体
が、配列番号：１又は２に示される抗原ペプチドとＨＬ
Ａ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を
特異的に認識しうるＴ細胞レセプターを有するＣＴＬに
認識されるペプチドが挙げられる。Further, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, the peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted is SEQ ID NO: 1 or 2.
The side chains are not similar as long as they are recognized by CTL having a T cell receptor capable of specifically recognizing a cell that presents a complex of the antigenic peptide and HLA-A24 molecule shown in FIG. It may have a substitution with an amino acid. For example, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are replaced with other amino acids or amino acid analogs, for example, Ala, and HLA-A24
The complex with the HLA-A24 molecule has the ability to bind to the molecule, and the complex with the HLA-A24 molecule is represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and the HL
Peptides recognized by CTLs having T cell receptors capable of specifically recognizing cells that present a complex with the A-A24 molecule on the cell surface can be mentioned.
【００４４】例えば、配列番号：１又は２に示されるア
ミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換され
たアミノ酸配列を有するペプチドとしては、配列番号：
８又は９のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドが
挙げられる。前記ペプチド中におけるAla への置換が可
能であるＮ末端及びＮ末端より５番目の位置のアミノ酸
は、本来のアミノ酸と異なる他のアミノ酸、又はアミノ
酸アナログに置換できる可能性がある。For example, as a peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, SEQ ID NO:
Examples include peptides having an amino acid sequence of either 8 or 9. The N-terminal and the amino acid at the 5th position from the N-terminal in the peptide, which can be substituted with Ala, may be replaced with another amino acid different from the original amino acid or an amino acid analog.
【００４５】また、本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原
ペプチドは、配列番号：１又は２のＮ末端又はＣ末端に
アミノ酸が付加されたペプチドであっても、配列番号：
１又は２に示される抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子
との複合体を細胞表面に提示する細胞を特異的に認識し
うるＴ細胞レセプターを有するＣＴＬに認識されるペプ
チドであればよい。それらは、抗原提示細胞内で配列番
号：１又は２のペプチドとなるように、適切なアミノ酸
が付加され、それにより、ＨＬＡ−Ａ２４分子に効率よ
く提示される。例えば、ＰＳＭＡ由来のペプチド断片で
あって、かつ配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配
列を含有し、かつ該アミノ酸配列よりアミノ酸残基数の
多いペプチド、具体的には、１５〜２５アミノ酸残基か
らなるペプチドが好適に利用される。Further, the HLA-A24-restricted antigen peptide of the present invention may be a peptide in which an amino acid is added to the N-terminal or C-terminal of SEQ ID NO: 1 or 2, even if the peptide is SEQ ID NO:
Any peptide can be used as long as it is a peptide recognized by CTL having a T cell receptor capable of specifically recognizing a cell that presents a complex of the antigenic peptide shown in 1 or 2 and an HLA-A24 molecule on the cell surface. Appropriate amino acids are added so that they become the peptide of SEQ ID NO: 1 or 2 in the antigen-presenting cell, and thereby they are efficiently presented to the HLA-A24 molecule. For example, a peptide fragment derived from PSMA, containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and having a larger number of amino acid residues than the amino acid sequence, specifically, 15 to 25 amino acid residues. Peptides consisting of groups are preferably used.
【００４６】本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチ
ドは、液相又は固相のアミノ酸のカップリングによる有
機化学的方法により調製することができる。また、前記
ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４
拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列をコードした核酸を
用いた組換えＤＮＡ技術を利用しても調製することがで
きる。組換えＤＮＡ技術によって得られたペプチドは、
必要に応じ、適当な有機化学的又は生化学的手法等を用
いることにより、修飾してもよい。The HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention can be prepared by an organic chemical method by coupling a liquid or solid phase amino acid. The HLA-A24-restricted antigenic peptide is HLA-A24.
It can also be prepared using recombinant DNA technology using a nucleic acid encoding the amino acid sequence of a restricted antigen peptide. Peptides obtained by recombinant DNA technology are
If necessary, it may be modified by using an appropriate organic chemical or biochemical method.
【００４７】本発明には、前記ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗
原ペプチドをコードした核酸も含まれる。すなわち、本
発明の核酸にコードされるポリペプチドは、配列番号：
１又は２に示される抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子
との複合体を細胞表面に提示する細胞を特異的に認識し
うるＴ細胞レセプターを有するＣＴＬに認識されるもの
である範囲において、各種変異を有するバリアントであ
ってもよい。また、かかる核酸は、縮重を介して前記核
酸と異なる核酸であってもよい。The present invention also includes a nucleic acid encoding the HLA-A24-restricted antigenic peptide. That is, the polypeptide encoded by the nucleic acid of the present invention has the SEQ ID NO:
Within the range of being recognized by CTL having a T cell receptor capable of specifically recognizing a cell that presents a complex of the antigenic peptide shown in 1 or 2 and an HLA-A24 molecule on the cell surface, various mutations may be made. May have a variant. Further, such nucleic acid may be a nucleic acid that is different from the above-mentioned nucleic acid through degeneracy.
【００４８】ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドをコー
ドした核酸としては、例えば、ＰＳＭＡ遺伝子が挙げら
れ、該遺伝子の配列は、Ｒ．Ｓ．イスラエリ(R.S Israe
li)ら、Cancer Research 、第５３巻、第２２７〜２３
０頁（１９９３）に開示されている。前記配列より、前
記ペプチドをコードする領域を選択し、使用することが
できる。The nucleic acid encoding the HLA-A24-restricted antigenic peptide includes, for example, the PSMA gene, and the sequence of the gene is R. S. RS Israe
li) et al., Cancer Research, 53, 227-23.
0 (1993). From the sequence, a region encoding the peptide can be selected and used.
【００４９】本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球は、本発明
のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４
分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を特異的に認
識しうるＴ細胞レセプターを有することを１つの特徴と
する。本発明のＣＴＬによれば、本発明のＨＬＡ−Ａ２
４拘束性抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体
を提示する細胞のみを特異的に傷害することができる。
すなわち、本発明のＣＴＬによれば、腫瘍細胞、特に前
立腺癌細胞を特異的に傷害することができる。The cytotoxic T lymphocytes of the present invention include the HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention and HLA-A24.
One feature is to have a T cell receptor capable of specifically recognizing cells that present a complex with a molecule on the cell surface. According to the CTL of the present invention, the HLA-A2 of the present invention
Only cells that present a complex of the 4-restricted antigenic peptide and the HLA-A24 molecule can be specifically injured.
That is, according to the CTL of the present invention, tumor cells, particularly prostate cancer cells, can be specifically injured.
【００５０】さらに、本発明のＣＴＬは、アジア人種、
特に日本人に多い、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であるため、
該ＣＴＬにより、腫瘍治療として、アジア人種、特に日
本人に対して特に有効に、腫瘍細胞、特に前立腺癌細胞
を特異的に傷害することができる。Further, the CTL of the present invention is an Asian race,
Especially because it is HLA-A24 restricted, which is common in Japanese people,
The CTL can specifically injure tumor cells, particularly prostate cancer cells, as a tumor treatment particularly effectively for Asian races, especially Japanese.
【００５１】また、本発明のＣＴＬは、標的細胞に対し
て特異的に細胞溶解又はサイトカイン遊離反応等を起こ
す。なお、本明細書におけるＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２４
分子上に提示された抗原ペプチドの抗原性を認識し傷害
活性を有するものであり、その他の抗原性認識などによ
り限定されるものではない。Further, the CTL of the present invention specifically causes cell lysis or cytokine release reaction with respect to target cells. In addition, CTL in this specification is HLA-A24.
It recognizes the antigenicity of the antigenic peptide presented on the molecule and has a damaging activity, and is not limited by other antigenicity recognition and the like.
【００５２】本発明のＣＴＬは、配列番号：１又は２に
示される抗原ペプチド、すなわち、ＰＳＭＡ抗原ペプチ
ドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示す
る細胞を特異的に認識しうるＴ細胞レセプターを有して
いるので、ＨＬＡ−Ａ２４及びＰＳＭＡ共に陽性の腫瘍
細胞に対して特異的にサイトカインを産生できる。した
がって、腫瘍に対する細胞医薬として、また該ＣＴＬ感
受性細胞の検出等に使用することができる。ＨＬＡ−Ａ
２４及びＰＳＭＡ共に陽性である細胞は、ＨＬＡ−Ａ２
４又はＰＳＭＡ遺伝子を導入したものであってよい。The CTL of the present invention is capable of specifically recognizing cells presenting the antigen peptide represented by SEQ ID NO: 1 or 2, that is, the complex of the PSMA antigen peptide and HLA-A24 molecule on the cell surface. Since it has a cell receptor, both HLA-A24 and PSMA can produce a cytokine specifically to positive tumor cells. Therefore, it can be used as a cell drug for tumors and for detecting the CTL-sensitive cells. HLA-A
Cells positive for both 24 and PSMA were HLA-A2
4 or PSMA gene may be introduced.
【００５３】本発明のＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性
抗原ペプチドを使用することにより、細胞傷害性Ｔリン
パ球を誘導することを特徴とする方法により得ることが
できる。かかる細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導方法も本発
明に含まれる。The CTL of the present invention can be obtained by a method characterized by inducing cytotoxic T lymphocytes by using an HLA-A24-restricted antigen peptide. The method of inducing such cytotoxic T lymphocytes is also included in the present invention.
【００５４】本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導方法
としては、具体的には、（１）本発明のＨＬＡ−Ａ２４
拘束性抗原ペプチドと、マクロファージ、Ｂ細胞及び樹
状細胞からなる群より選択された１種の抗原提示能を有
する細胞とを接触させて抗原提示細胞を得、得られた抗
原提示細胞を用いて、抗原提示能を有する細胞に抗原刺
激を与え、それにより、エフェクター細胞を得る工程、
（２）前記工程（１）で得られたエフェクター細胞と、
本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球により傷害を受ける標的
細胞とを接触させて、細胞傷害活性の有無を検出する工
程、及び（３）前記工程（２）において、細胞傷害活性
を呈したエフェクター細胞を細胞傷害性Ｔリンパ球とし
て選別する工程、を含む方法が挙げられる。The method for inducing the cytotoxic T lymphocytes of the present invention specifically includes (1) the HLA-A24 of the present invention.
An antigen-presenting cell is obtained by contacting a restricted antigen peptide with a cell having an antigen-presenting ability of one kind selected from the group consisting of macrophages, B cells and dendritic cells, and using the obtained antigen-presenting cell A step of stimulating cells having an antigen presenting ability to obtain an effector cell,
(2) The effector cell obtained in the step (1),
A step of contacting a target cell damaged by the cytotoxic T lymphocyte of the present invention to detect the presence or absence of cytotoxic activity, and (3) the effector cell exhibiting cytotoxic activity in the step (2) Is selected as a cytotoxic T lymphocyte.
【００５５】イン ビトロ(in vitro) で該ＣＴＬを誘
導する場合、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４を発現している生
体由来の体外摘出試料を用い、本発明のＨＬＡ−Ａ２４
拘束性抗原ペプチドにより該体外摘出試料を刺激するこ
とにより誘導することができる。前記「体外摘出試料」
としては、血液、手術などにより摘出したリンパ節、脾
臓、その他各種臓器などが挙げられる。また、本発明に
おいては、これらの試料に存在するリンパ球や浸潤リン
パ球細胞が好適に使用される。In the case of inducing the CTL in vitro, for example, an in vitro excised sample derived from a living body expressing HLA-A24 is used, and the HLA-A24 of the present invention is used.
It can be induced by stimulating the extirpated sample with a restricted antigen peptide. "Extracorporeally removed sample"
Examples include blood, lymph nodes removed by surgery, spleen, and other various organs. Further, in the present invention, lymphocytes and infiltrating lymphocyte cells present in these samples are preferably used.
【００５６】例えば、血液を用いる場合、ＨＬＡ−Ａ２
４陽性のヒト血液より調製した末梢血単核球（peripher
al blood mononuclear cells；以下、ＰＢＭＣともい
う）に繰り返し抗原刺激を与えることによりＣＴＬを誘
導することができる。For example, when blood is used, HLA-A2
Peripheral blood mononuclear cells (peripher) prepared from 4-positive human blood
CTL can be induced by repeatedly giving antigen stimulation to al blood mononuclear cells (hereinafter, also referred to as PBMC).
【００５７】前記抗原刺激は、例えば、リンパ芽球を調
製した同一血液より調製した抗原提示能を有する細胞に
おいて、本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを
ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体として細胞表面に提示す
る細胞（抗原提示細胞）；該ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原
ペプチド等を用いることにより実施できる。The above-mentioned antigen stimulation is carried out, for example, by using the HLA-A24-restricted antigen peptide of the present invention as a complex with an HLA-A24 molecule in cells having an antigen-presenting ability prepared from the same blood prepared from lymphoblasts. Cells presenting on the surface (antigen-presenting cells); this can be performed by using the HLA-A24-restricted antigenic peptide and the like.
【００５８】誘導されたＣＴＬは、更に、抗ＣＤ３抗体
等による刺激や本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプ
チド若しくは抗原提示細胞存在下に各種刺激を加えるこ
とにより、増殖させることができる。例えば、ＩＬ−７
存在下、ＰＢＭＣより調製したリンパ球１個に対し抗原
提示細胞を０．０１〜１個の割合で混合することにより
ＣＴＬ誘導を実施することができる。別の態様として、
ＩＬ−７及びキーホール リムペット ヘモシアニン
（Keyhole Limpet Hemocyanin ；ＫＬＨ）存在下、ＰＢ
ＭＣに本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを細
胞培養液中、抗原ペプチド１種類当り１ｎｇ／ｍｌ〜１
００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／
ｍｌ添加することにより、ＣＴＬを誘導することができ
る。The induced CTL can be proliferated by further stimulation with an anti-CD3 antibody or the like or various stimulations in the presence of the HLA-A24-restricted antigen peptide of the present invention or antigen presenting cells. For example, IL-7
In the presence, CTL induction can be performed by mixing antigen-presenting cells at a ratio of 0.01 to 1 with respect to 1 lymphocyte prepared from PBMC. In another aspect,
PB in the presence of IL-7 and Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH)
The HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention is added to MC in the cell culture medium at 1 ng / ml to 1 per antigen peptide.
00 μg / ml, preferably 10 ng / ml to 1 μg / ml
CTL can be induced by adding ml.
【００５９】誘導されたＣＴＬは、クローン化すること
により安定した細胞傷害性を有するリンパ球として維持
することもできる。例えば、誘導されたＣＴＬに抗原、
各種サイトカイン、抗ＣＤ３抗体刺激を与えることによ
り増殖させることができる。The induced CTL can be maintained as lymphocytes having stable cytotoxicity by cloning. For example, the antigen on the induced CTL,
It can be proliferated by giving various cytokines and anti-CD3 antibody stimulation.
【００６０】誘導された特異的ＣＴＬは、ＣＴＬを誘導
した抗原ペプチドと放射性物質等で標識した標的細胞に
対する傷害性、放射能の取り込みによって測定できるＣ
ＴＬ増殖の抗原特異的な増加若しくはＣＴＬや標的細胞
より抗原特異的に遊離されるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ
等のサイトカイン量を測定することにより検出すること
ができる。例えば、前記した、51Ｃｒ標識標的細胞に対
するＣＴＬの傷害性を測定する方法によって評価するこ
とができる。The induced specific CTL can be measured by the toxicity of the CTL-inducing antigenic peptide and the target cells labeled with a radioactive substance, and the uptake of radioactivity C
Antigen-specific increase in TL proliferation or GM-CSF and IFN-γ released specifically from CTL and target cells
It can be detected by measuring the amount of cytokine such as. For example, it can be evaluated by the above-mentioned method for measuring the toxicity of CTL against 51 Cr-labeled target cells.
【００６１】具体的には、９６穴プレートなどの各ウェ
ルに51Ｃｒ標識標的細胞と、混入するＮＫ細胞による非
特異的傷害活性を除くための細胞（例えば、Ｋ５６２細
胞など）とを含む細胞混合物と、ＣＴＬとを混合し、適
切な時間、インキュベートした後、遊離された51Ｃｒ量
をガンマカウンターなどにより測定する。ついで、下記
式１：Specifically, a cell mixture containing 51 Cr-labeled target cells in each well of a 96-well plate or the like and cells for removing non-specific damaging activity by contaminating NK cells (eg, K562 cells). And CTL are mixed and incubated for an appropriate time, and the amount of liberated 51 Cr is measured by a gamma counter or the like. Then, the following formula 1:
【００６２】[0062]
【数１】 [Equation 1]
【００６３】〔式中、最小放出値は、標的細胞と非特異
的傷害活性を除くための細胞とのみ入っているウェルの
51Ｃｒ量であり、標的細胞からの51Ｃｒの自然遊離量を
示し、最大放出値は、界面活性剤などを用いて標的細胞
を破壊した場合の51Ｃｒの遊離量を示す〕に従って、特
異的細胞傷害活性を算出することができる。[Wherein the minimum release value is the value of the well containing only the target cells and cells for removing the non-specific damaging activity.
The amount of 51 Cr is the spontaneous release amount of 51 Cr from the target cells, and the maximum release value is the release amount of 51 Cr when the target cells are destroyed by using a surfactant or the like]. The cytotoxic activity can be calculated.
【００６４】その他、蛍光色素等によって標識された抗
原ペプチドや複合体の使用によって直接確認することも
できる。この場合、例えばＣＴＬをＣＴＬ特異的抗体と
カップリングさせた第１蛍光マーカーと接触させてから
第２蛍光マーカーとカップリングさせた抗原ペプチド−
ＭＨＣ複合体を接触させ、そして二重標識細胞の存在を
ＦＡＣＳ(fluorescence-activated cell sorting) 分析
によって行なうことができる。Alternatively, it can be directly confirmed by using an antigen peptide or a complex labeled with a fluorescent dye or the like. In this case, for example, the antigenic peptide obtained by contacting CTL with a first fluorescent marker coupled with a CTL-specific antibody and then coupling it with a second fluorescent marker-
The MHC complex can be contacted and the presence of double labeled cells can be performed by FACS (fluorescence-activated cell sorting) analysis.
【００６５】一方、イン・ビボ(in vivo)におけるＣＴ
Ｌの誘導は、例えば、本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗
原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面
に提示した抗原提示細胞を生体に投与することにより実
施することができる。ヒトに投与する場合、成人１人当
りの投与量は通常１０4 〜１０9 個であることが望まし
い。別法として、本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペ
プチドを適当なアジュバントと混合し生体に投与するこ
とにより、該ペプチドに特異的なＣＴＬを誘導すること
もできる。On the other hand, CT in vivo
The induction of L can be carried out, for example, by administering to an organism, antigen-presenting cells in which the complex of the HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention and the HLA-A24 molecule is presented on the cell surface. When administered to humans, the dose per adult is usually preferably 10 4 to 10 9 . Alternatively, the HLA-A24-restricted antigen peptide of the present invention can be mixed with a suitable adjuvant and administered to a living body to induce CTL specific to the peptide.
【００６６】前記アジュバントとしては、例えば、フ
ロイント(Freund)完全アジュバント、フロイント不完
全アジュバント、水酸化アルミニウム、みょうばん等
の無機物ゲル、リゾレシチン、ジメチルオクタデシル
アンモニウムブロミド等の界面活性剤、硫酸デキスト
ラン、ポリＩＣ等のポリアニオン、ムラミルペプチ
ド、タフトシン等のペプチド、リビ(Ribi)社製のモノ
ホスホリルリピド（monophosphoryl lipid；ＭＰＬ）Ａ
等が挙げられる。生体におけるＣＴＬの誘導には抗原ペ
プチドとアジュバントの混合物のほか、ＭＨＣクラスII
拘束性のヘルパーＴ細胞抗原ペプチドを混合し投与して
もよい。Examples of the adjuvant include Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, inorganic gels such as aluminum hydroxide and alum, surfactants such as lysolecithin and dimethyloctadecyl ammonium bromide, dextran sulfate, poly IC and the like. Polyanion, peptides such as muramyl peptide and tuftsin, monophosphoryl lipid (MPL) A manufactured by Ribi
Etc. For the induction of CTLs in the body, in addition to the mixture of antigen peptide and adjuvant, MHC class II
The restrictive helper T cell antigen peptide may be mixed and administered.
【００６７】なお、本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原
ペプチドは生体内における安定化のため適当なリンカー
を介して高級脂肪酸やヘルパーＴ細胞抗原ペプチドと共
有結合させ投与してもよい。ヒトに投与する場合、成人
１人あたりの投与量は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプ
チド濃度として、抗原ペプチド１種類あたり０．１μｇ
／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１
ｍｇ／ｋｇ、更に好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ
／ｋｇである。The HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention may be covalently bound to a higher fatty acid or helper T cell antigenic peptide via a suitable linker for stabilization in vivo and administered. When administered to humans, the dose per adult is 0.1 μg per antigen peptide as the HLA-A24-restricted antigen peptide concentration.
/ Kg to 10 mg / kg, preferably 1 μg / kg to 1
mg / kg, more preferably 1 μg / kg to 100 μg
/ Kg.
【００６８】ＣＴＬを誘導するための本発明のＨＬＡ−
Ａ２４拘束性抗原ペプチドによる刺激のために、該ＨＬ
Ａ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子と
の複合体を用いることもできる。この場合、ＨＬＡ−Ａ
２４分子は天然のＨＬＡ−Ａ２４分子である必要はな
く、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドとの結合性を本
質的に保存している断片であってもよい。これらの断片
は、例えば、天然のＨＬＡ−Ａ２４分子のタンパク質分
解又は組換えＤＮＡ技術により調製することができる。
この複合体はβ2 −ミクログロブリン、更に複合体を認
識する抗体を共存させて安定化させることができる。HLA of the present invention for inducing CTL-
Due to stimulation with the A24-restricted antigenic peptide, the HL
A complex of the A-A24-restricted antigenic peptide and the HLA-A24 molecule can also be used. In this case, HLA-A
Twenty-four molecules need not be naturally occurring HLA-A24 molecules, but may be fragments that essentially preserve the binding to HLA-A24-restricted antigenic peptides. These fragments can be prepared, for example, by proteolytic digestion of the native HLA-A24 molecule or recombinant DNA technology.
This complex can be stabilized by the coexistence of β 2 -microglobulin and an antibody that recognizes the complex.
【００６９】本発明のＣＴＬは、本発明のＨＬＡ−Ａ２
４拘束性抗原ペプチドにより誘導されるため、かかるペ
プチドを有効成分として含有した、細胞傷害牲Ｔリンパ
球（ＣＴＬ）を得るためのＣＴＬ誘導剤として用いるこ
とができる。かかるＣＴＬ誘導剤も、本発明の範囲に含
まれる。The CTL of the present invention is the HLA-A2 of the present invention.
Since it is induced by a 4-restricted antigen peptide, it can be used as a CTL inducer containing such peptide as an active ingredient to obtain cytotoxic T lymphocytes (CTL). Such CTL inducers are also included in the scope of the present invention.
【００７０】本発明のＣＴＬ誘導剤は、例えば、前記Ｈ
ＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを単独、又は他の分子
（ヘルパーＴ細胞抗原ペプチド及び／又はアジュバン
ト）との混合物として、生理食塩水又はリン酸緩衝生理
食塩水に懸濁した形態で供給されうる。前記ＨＬＡ−Ａ
２４拘束性抗原ペプチドは、高級脂肪酸やヘルパーＴ細
胞抗原ペプチドとの共有結合体あるいはＨＬＡ−Ａ２４
分子との複合体として用いてもよい。The CTL inducer of the present invention is, for example, the above H
The LA-A24-restricted antigen peptide may be supplied alone or as a mixture with other molecules (helper T cell antigen peptide and / or adjuvant) in the form of suspension in physiological saline or phosphate buffered saline. The HLA-A
The 24-restricted antigen peptide is a covalent conjugate with a higher fatty acid or a helper T cell antigen peptide, or HLA-A24.
It may be used as a complex with a molecule.
【００７１】本発明のＣＴＬ誘導剤における本発明のＨ
ＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドの含有量は、ＣＴＬを
誘導するに十分な量であればよく、例えば、抗原ペプチ
ドを、抗原ペプチド１種類あたり、０．０１〜１００重
量％、好ましくは０．１〜９５重量％含有させることが
望ましい。かかる含有量は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４抗
原陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、イン・ビト
ロで、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドの含有量が異
なる剤のそれぞれを添加して刺激しながら培養した場合
に、ＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞を特異的に認識するＣＴＬ
が誘導される剤における該ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペ
プチドの含有量として決定することができる。ここで、
ＣＴＬの誘導の有無は、例えば、標的細胞に反応してＣ
ＴＬが産生する種々のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−
γ）の量を慣用のＥＬＩＳＡ法等により測定することに
よって調べることができる。また、51Ｃｒで標識標的細
胞に対するＣＴＬの傷害性を測定する方法によっても調
べることができる。H of the present invention in the CTL inducer of the present invention
The content of the LA-A24-restricted antigenic peptide may be an amount sufficient to induce CTL, and for example, the antigenic peptide is contained in an amount of 0.01 to 100% by weight, preferably 0.1 It is desirable that the content be ˜95% by weight. For example, peripheral blood lymphocytes are isolated from HLA-A24 antigen-positive humans, and each agent is added in vitro with each of the agents having a different content of HLA-A24-restricted antigen peptide while stimulating. CTL that specifically recognizes HLA-A24 positive cells when cultured
It can be determined as the content of the HLA-A24-restricted antigenic peptide in the agent that induces. here,
The presence or absence of CTL induction depends on, for example, C in response to target cells.
Various cytokines produced by TL (eg, IFN-
It can be investigated by measuring the amount of γ) by a conventional ELISA method or the like. It can also be examined by a method of measuring the toxicity of CTL to labeled target cells with 51 Cr.
【００７２】本発明のＣＴＬ誘導剤は、イン・ビトロで
本発明のＣＴＬを増殖させるための培地への添加物、Ｔ
リンパ球増殖活性、遅延型皮膚反応を指標とした免疫感
作状態の診断などに利用することができる。例えば、培
地への添加物として使用する場合、使用量は培地中のペ
プチド濃度として、抗原ペプチド１種類当たり１ｎｇ／
ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜
１μｇ／ｍｌである。また、後述の制癌剤としての応用
も可能である。The CTL inducing agent of the present invention is T, which is an additive to a medium for growing the CTL of the present invention in vitro.
It can be used for diagnosing immunization status using lymphocyte proliferation activity and delayed skin reaction as indicators. For example, when used as an additive to a medium, the amount used is the concentration of peptide in the medium, 1 ng / per antigen peptide
ml-100 μg / ml, preferably 10 ng / ml-
It is 1 μg / ml. Further, it can be applied as a carcinostatic agent described later.
【００７３】本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチ
ドによれば、本発明のＣＴＬを誘導することができ、ま
た該ＣＴＬは、アジア人種、特に日本人に多い、ＨＬＡ
−Ａ２４拘束性であるため、腫瘍治療として、アジア人
種、特に日本人に対して特に有効に、腫瘍細胞、特に前
立腺癌細胞を特異的に傷害することができる制癌剤、例
えば、前記ＣＴＬ又はその誘導に基づく制癌剤が提供さ
れる。したがって、本発明により、（１）本発明のＨＬ
Ａ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを有効成分として含有し
た制癌剤及び（２）本発明のＣＴＬを有効成分して含有
した制癌剤が提供されうる。かかる制癌剤も本発明の範
囲に含まれる。The HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention can induce the CTLs of the present invention, and the CTLs are present in Asian races, especially in Japanese.
Since it is A24-restricted, it is an anticancer agent capable of specifically injuring tumor cells, particularly prostate cancer cells, particularly effectively for Asian races, particularly Japanese as tumor therapy, for example, the aforementioned CTL or its Induction-based anti-cancer agents are provided. Therefore, according to the present invention, (1) the HL of the present invention
An anti-cancer agent containing the A-A24-restricted antigen peptide as an active ingredient and (2) an anti-cancer agent containing the CTL of the present invention as an active ingredient can be provided. Such an anticancer agent is also included in the scope of the present invention.
【００７４】本発明の制癌剤は、（１）本発明のＨＬＡ
−Ａ２４拘束性抗原ペプチド、あるいは（２）本発明の
ＣＴＬ、を有効成分として含有しているため、該制癌剤
によれば、前立腺特異膜抗原 (prostate specific memb
rane antigen, 以下、ＰＳＭＡと略す) が異常発現して
いる癌、特に前立腺癌における腫瘍細胞を特異的に傷害
できるという優れた性質を発揮する。The anticancer agent of the present invention comprises (1) the HLA of the present invention
Since it contains -A24-restricted antigenic peptide or (2) the CTL of the present invention as an active ingredient, according to the anti-cancer agent, a prostate specific membrane antigen (prostate specific membrane antigen) can be obtained.
It exhibits the excellent property of being able to specifically injure tumor cells in cancer in which rane antigen (abbreviated as PSMA, hereinafter, abbreviated as PSMA) is aberrantly expressed, particularly in prostate cancer.
【００７５】本発明の制癌剤は、１）本発明のＨＬＡ−
Ａ２４拘束性抗原ペプチド又は本発明のＣＴＬを単独、
２）本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド又は本
発明のＣＴＬと薬学的に許容される担体及び／又は希釈
剤との混合物、又は３）更に必要ならば上記１）若しく
は２）に補助剤を加えた剤形で提供される。なお、前記
担体としては例えば、ヒト血清アルブミンが挙げられ
る。また、希釈剤としては、例えば、リン酸緩衝液、蒸
留水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、本発明のＣ
ＴＬの保存に適した培地等が挙げられる。培地として
は、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖなどの培地が一般的に挙げら
れる。さらに、補助剤としては、薬学的に許容される上
記アジュバント等が挙げられる。本発明の制癌剤をヒト
に投与する場合、注射器で投与することもできるし、噴
霧等の方法で粘膜からの経皮吸収等で投与してもよい。
また、注射剤として用いる場合、注射剤用溶剤（例え
ば、水、エタノール、グリセリン等）を含有してもよ
い。The anticancer agent of the present invention comprises: 1) the HLA-of the present invention
A24-restricted antigenic peptide or CTL of the present invention alone,
2) A mixture of the HLA-A24-restricted antigen peptide of the present invention or the CTL of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier and / or diluent, or 3) if necessary, an adjunct to the above 1) or 2). Is provided in the dosage form. In addition, examples of the carrier include human serum albumin. Examples of the diluent include phosphate buffer solution, distilled water, physiological saline, phosphate buffered saline, and C of the present invention.
Examples thereof include a medium suitable for storing TL. As the medium, mediums such as RPMI and AIM-V are generally mentioned. Furthermore, examples of the adjuvant include the above-mentioned pharmaceutically acceptable adjuvants and the like. When the anticancer drug of the present invention is administered to humans, it may be administered by a syringe, or may be administered by transdermal absorption from mucous membranes by a method such as spraying.
When used as an injection, it may contain a solvent for injection (for example, water, ethanol, glycerin, etc.).
【００７６】本発明の制癌剤における有効成分量は、本
発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドにより誘導さ
れるＣＴＬ量又は本発明のＣＴＬ量が、前立腺特異膜抗
原 (prostate specific membrane antigen, 以下、ＰＳ
ＭＡと略す) が異常発現している癌、特に前立腺癌にお
ける腫瘍細胞を傷害するに十分な量であればよい。The amount of the active ingredient in the antitumor agent of the present invention is the amount of CTL induced by the HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention or the amount of CTL of the present invention is a prostate specific membrane antigen (hereinafter referred to as PS).
(Abbreviated as MA) is an amount that is sufficient to damage tumor cells in which cancer is aberrantly expressed, particularly prostate cancer.
【００７７】前記「腫瘍細胞を傷害するに十分な量」
は、例えば、前記した、51Ｃｒ標識標的細胞に対するＣ
ＴＬの傷害性を測定する方法によって評価することがで
きる。“Amount Enough to Injure Tumor Cells”
Is, for example, C for 51 Cr-labeled target cells described above.
It can be evaluated by a method for measuring the damage of TL.
【００７８】本発明の制癌剤の薬理作用は、前記のよう
に、腫瘍細胞の傷害により評価すること；腫瘍を有する
マウス等に本発明の制癌剤を投与し、腫瘍の大きさの変
化を指標として評価することができる。The pharmacological action of the antitumor agent of the present invention should be evaluated by tumor cell injury as described above; the antitumor agent of the present invention is administered to tumor-bearing mice and the like, and the change in tumor size is evaluated as an index. can do.
【００７９】本発明の制癌剤の剤形は、注射剤であって
もよく、体内への親和性を高めるべく、リポソーム製
剤、直径数μｍの薬学的に許容されるビーズに結合させ
た粒子状の製剤、脂質などを結合させた製剤などの剤形
であってもよい。The dosage form of the anticancer drug of the present invention may be an injection, and in order to enhance its affinity to the body, it is in the form of particles in the form of a liposome, which is bound to pharmaceutically acceptable beads having a diameter of several μm. It may be a dosage form such as a preparation or a preparation in which a lipid or the like is bound.
【００８０】前記注射剤は、単独で又はブドウ糖、アミ
ノ酸等の通常の補助剤と混合して静脈内投与してもよ
く、更に必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしく
は腹腔内投与してもよい。The above-mentioned injections may be administered intravenously alone or in a mixture with usual adjuvants such as glucose and amino acids, and if necessary, they may be administered intramuscularly, intracutaneously, subcutaneously or intraperitoneally alone. You may.
【００８１】投与方法としては、皮内投与、皮下投与、
静脈注射、経口投与、経鼻投与などが挙げられる。The administration method includes intradermal administration, subcutaneous administration,
Examples include intravenous injection, oral administration, and nasal administration.
【００８２】なお、本発明の制癌剤は、免疫治療におい
て併用可能な他の制癌剤をも用いることができる。As the anti-cancer agent of the present invention, other anti-cancer agents that can be used together in immunotherapy can be used.
【００８３】前記（１）の制癌剤においては、本発明の
ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを、抗原ペプチド１
種類あたり、０．０１〜１００重量％、好ましくは０．
１〜９５重量％含有させる。成人１人あたりの投与量
は、ペプチド濃度として、抗原ペプチド１種類あたり
０．１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ
／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、更に好ましくは１μｇ／ｋｇ〜
１００μｇ／ｋｇである。本発明の制癌剤は、人体への
適応性に優れている。In the anticancer drug of the above (1), the HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention is replaced by the antigenic peptide 1
0.01 to 100% by weight, preferably 0.
1 to 95% by weight is contained. The dose per adult is 0.1 μg / kg to 10 mg / kg, preferably 1 μg, as the peptide concentration, per antigen peptide.
/ Kg to 1 mg / kg, more preferably 1 μg / kg to
It is 100 μg / kg. The anticancer agent of the present invention has excellent adaptability to the human body.
【００８４】前記（２）の制癌剤における本発明のＣＴ
Ｌの含有量は、ＣＴＬ１種類あたり、１０4 〜１０8 個
／ｍｌ、好ましくは５×１０5 〜５×１０7 個／ｍｌで
あることが望ましい。The CT of the present invention in the anticancer drug of (2) above
The content of L is 10 4 to 10 8 pieces / ml, preferably 5 × 10 5 to 5 × 10 7 pieces / ml, per 1 type of CTL.
【００８５】前記（２）の制癌剤をヒトに投与する場
合、注射剤として注射器で投与することができ、成人１
人あたりの投与量としては、患者の年齢、体重、疾患の
状態などにより適宜設定され得、例えば、ＣＴＬ数が、
ＣＴＬ１種類あたり１０6 〜１０10個となるようにして
もよい。なお、上記範囲は、目安であり、これに限定さ
れるものではない。本発明の制癌剤においては、有効成
分であるＣＴＬは投与するヒト由来のものであるため、
人体への適応性に優れている。When the above anticancer drug (2) is administered to humans, it can be administered as an injection by a syringe.
The dose per person can be appropriately set depending on the age, weight, disease state of the patient, and the like, and for example, the CTL number is
The number of CTLs may be 10 6 to 10 10 per type. The above range is a guideline and is not limited to this. In the antitumor agent of the present invention, since the active ingredient, CTL, is derived from the human being to be administered,
Excellent adaptability to the human body.
【００８６】前記（２）の制癌剤は、有効成分であるＣ
ＴＬにより認識可能な抗原ペプチドを発現している腫瘍
細胞を有する前立腺癌患者を始めとする癌患者に投与す
ることができる。したがって、ＰＳＭＡ抗原ペプチドを
用い誘導された本発明のＣＴＬを有効成分として含有す
る制癌剤は、ＨＬＡ−Ａ２４とＰＳＭＡとが共に陽性の
腫瘍細胞よりなる前立腺癌等の癌の免疫治療に有用であ
る。The anticancer drug of (2) above is C which is an active ingredient.
It can be administered to cancer patients, including prostate cancer patients who have tumor cells expressing an antigenic peptide recognizable by TL. Therefore, the antitumor agent containing the CTL of the present invention induced by using the PSMA antigen peptide as an active ingredient is useful for immunotherapy of cancer such as prostate cancer composed of tumor cells positive for both HLA-A24 and PSMA.
【００８７】さらに、本発明により、ＨＬＡ−Ａ２４拘
束性抗原ペプチド、すなわち、ＰＳＭＡ抗原ペプチドと
ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗
原提示細胞が提供されうる。本発明の抗原提示細胞によ
れば、本発明のＣＴＬの誘導に用いることができる。Furthermore, the present invention can provide an antigen-presenting cell that presents an HLA-A24-restricted antigenic peptide, that is, a complex of a PSMA antigen peptide and an HLA-A24 molecule on the cell surface. The antigen-presenting cell of the present invention can be used for inducing the CTL of the present invention.
【００８８】本発明の抗原提示細胞は、抗原提示能を有
する細胞を用いることにより調製することができる。The antigen presenting cell of the present invention can be prepared by using a cell having an antigen presenting ability.
【００８９】抗原提示能を有する細胞としては、例え
ば、本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドとＨＬ
Ａ−Ａ２４分子との複合体をその細胞表面に提示するこ
とが可能な、マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞（Ｄ
Ｃ：dendritic cells ）をはじめめとする白血球細胞等
が挙げられる。前記ＤＣは、細胞あたりの抗原提示量が
多く、また抗原提示に必要な細胞表面分子〔ＣＤ８０、
ＣＤ８３、ＣＤ８６等のコスティミュラトリー・シグナ
ル (co-stimulatory signal)分子等〕の発現量も高いた
め、抗原提示能を有する細胞として特に好適である。The cells capable of presenting antigens include, for example, the HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention and HL.
Macrophages, B cells, dendritic cells (D) capable of presenting a complex with AA24 molecule on their cell surface.
C: dendritic cells) and other white blood cells and the like. The DC has a large amount of antigen presentation per cell, and is a cell surface molecule [CD80,
Since the expression level of costimulatory signal molecules such as CD83 and CD86] is high, it is particularly suitable as a cell having an antigen presenting ability.
【００９０】前記抗原提示能を有する細胞は、前記体外
摘出試料より調製することができる。例えば、前記ＤＣ
は、１）ＰＢＭＣよりいくつかの細胞表面マーカー等を
基に単離精製する方法、２）単球よりＧＭ−ＣＳＦとＩ
Ｌ−４により誘導する方法、３）ＣＤ３４陽性細胞より
ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＳＣＦ等のサイトカインで
誘導する方法等により調製することができる。The cells capable of presenting the antigen can be prepared from the in vitro excised sample. For example, the DC
1) Method for isolating and purifying PBMC based on some cell surface markers, etc. 2) GM-CSF and I from monocytes
It can be prepared by a method of inducing with L-4, 3) a method of inducing from CD34-positive cells with cytokines such as GM-CSF, TNF-α, SCF and the like.
【００９１】抗原提示能を有する細胞の表面に、本発明
のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを提示させるに
は、例えば、上記抗原提示能を有する細胞と本発明のＨ
ＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドとを混合後、必要に応
じて過剰量を洗浄し、ＨＬＡ−Ａ２４分子上に前記抗原
ペプチドを負荷させる方法等が挙げられる。なお、上記
抗原提示能を有する細胞の調製方法における１）の方法
で調製した細胞のように、既にＨＬＡ−Ａ２４分子上に
本発明とは無関係の抗原ペプチドを提示していると考え
られる細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを負
荷する前に酸処理などを行なうことにより、ＨＬＡ−Ａ
２４分子上に存在する本発明のＣＴＬを誘導出来ないペ
プチドを除去してもよい。In order to present the HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention on the surface of cells having antigen presenting ability, for example, cells having the above antigen presenting ability and H of the present invention can be presented.
After mixing with the LA-A24-restricted antigenic peptide, an excess amount is washed as necessary to load the above-mentioned antigenic peptide on the HLA-A24 molecule. In addition, like the cells prepared by the method 1) in the method for preparing cells having the above-mentioned antigen-presenting ability, cells considered to have already presented an antigenic peptide unrelated to the present invention on the HLA-A24 molecule are , HLA-A24-restricted antigenic peptide is treated with acid before loading to give HLA-A
Peptides present on 24 molecules that cannot induce CTLs of the present invention may be removed.
【００９２】本発明の抗原提示細胞は、単一のＨＬＡ−
Ａ２４拘束性抗原ペプチドが負荷された細胞のほか、細
胞１個あたり数種類のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチ
ドが負荷された細胞であってもよい。The antigen presenting cell of the present invention is a single HLA-
In addition to cells loaded with the A24-restricted antigenic peptide, cells may be cells loaded with several types of HLA-A24-restricted antigenic peptides per cell.
【００９３】また、別法として、Ｂ細胞やＣＤ３４陽性
細胞に対して、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを提
示させることのできる発現ベクターにより、前記抗原提
示能を有する細胞を形質転換する方法が挙げられる。As another method, a method of transforming cells having the antigen-presenting ability with an expression vector capable of presenting the HLA-A24-restricted antigenic peptide to B cells or CD34-positive cells can be mentioned. To be
【００９４】このようなベクターとしては、ｐｃＤＮＡ
３、ｐＭＱＭｎｅｏ、ｐＣＥＰ４等の市販のプラスミド
に、組換えＤＮＡ技術によってＰＳＭＡをコードする遺
伝子を組込んだ、発現用プラスミドベクターが挙げられ
る。更に該発現ベクターは、細胞表面に提示させたい抗
原ペプチドの両端に細胞内で効率良くプロテアーゼの分
解を受けるように適当なアミノ酸配列をコードする遺伝
子が付加されていてもよい。ＰＳＭＡ分子を高発現する
前立腺癌細胞であるＬＮＣａＰ細胞にＨＬＡ−Ａ２４遺
伝子を導入した発現ベクターにより形質転換した細胞又
はその細胞抽出物も利用可能である。ＨＬＡ−Ａ２４発
現ベクター及びＰＳＭＡ発現ベクターを用いて同時に形
質転換した細胞又はその細胞抽出物も利用可能である。
更に、レトロウィルスベクターやアデノウィルスベクタ
ーも好適に利用される。Examples of such a vector include pcDNA
3, a plasmid vector for expression in which a gene encoding PSMA is incorporated into a commercially available plasmid such as pMQMneo or pCEP4 by a recombinant DNA technique. Further, the expression vector may have a gene encoding an appropriate amino acid sequence added to both ends of an antigen peptide to be displayed on the cell surface so that the cell can be efficiently decomposed by protease in the cell. A cell obtained by transforming an LNCaP cell, which is a prostate cancer cell that highly expresses a PSMA molecule, with an expression vector into which the HLA-A24 gene has been introduced, or a cell extract thereof can also be used. A cell co-transformed with the HLA-A24 expression vector and the PSMA expression vector or a cell extract thereof can also be used.
Furthermore, retrovirus vectors and adenovirus vectors are also preferably used.
【００９５】抗原提示細胞は、好ましくは、非増殖性で
あることが好ましい。細胞を非増殖性とするためには、
Ｘ線等の放射線照射又はマイトマイシン(mitomycin) 等
の薬剤による処理を行なえばよい。The antigen presenting cells are preferably non-proliferative. To make cells non-proliferative,
Irradiation with X-rays or the like or treatment with a drug such as mitomycin may be performed.
【００９６】前記のようにして得られた細胞が、抗原提
示細胞であるかどうかは、ＣＴＬのサイトカイン産生量
を調べることなどにより評価することができる。Whether or not the cells obtained as described above are antigen-presenting cells can be evaluated by examining the amount of CTL cytokine production.
【００９７】また、ヒト主要組織適合性抗原をコードす
る核酸及び／又は抗原タンパク質をコードする核酸を細
胞に導入することにより、細胞傷害性Ｔリンパ球により
傷害を受ける当該ヒト主要組織適合性抗原と該抗原に拘
束性である抗原タンパク質由来のペプチドとの複合体を
細胞表面に提示する標的細胞を調製することができる。
本発明には、かかる標的細胞の調製方法及び該調製方法
により得られる、細胞傷害性Ｔリンパ球により傷害を受
ける標的細胞も含まれる。本発明の標的細胞によれば、
これまで標的細胞が樹立されていなかったために評価不
能であった細胞傷害性Ｔリンパ球の評価が可能である。
また、本発明の標的細胞の調製方法によれば、任意のヒ
ト主要組織適合抗原や抗原タンパク質の発現が可能であ
るため、既存の標的細胞では知られていない組合せのヒ
ト主要組織適合抗原と抗原タンパク質とを発現する標的
細胞の作製が可能である。Further, by introducing a nucleic acid encoding a human major histocompatibility antigen and / or a nucleic acid encoding an antigen protein into a cell, the human major histocompatibility antigen concerned is damaged by cytotoxic T lymphocytes. Target cells can be prepared that present a complex with a peptide derived from an antigen protein that is restricted to the antigen on the cell surface.
The present invention also includes a method for preparing such a target cell and a target cell obtained by the method and damaged by cytotoxic T lymphocytes. According to the target cell of the present invention,
It is possible to evaluate cytotoxic T lymphocytes that could not be evaluated because target cells have not been established until now.
Further, according to the method for preparing a target cell of the present invention, since any human major histocompatibility antigen or antigen protein can be expressed, a combination of human major histocompatibility antigen and antigen that is not known in existing target cells can be obtained. It is possible to produce target cells that express the protein.
【００９８】前記ヒト主要組織適合性抗原をコードする
核酸としては、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４をコードする核
酸が挙げられる。かかる核酸の配列は、ジーンバンク
（ＧｅｎＢａｎｋ）のアクセッション番号L47206に開示
されている。前記核酸は、前記した配列情報を基に適切
な試料から公知の方法、例えば、ＰＣＲ法等により入手
することができる。Examples of the nucleic acid encoding the human major histocompatibility antigen include a nucleic acid encoding HLA-A24. The sequence of such a nucleic acid is disclosed in GenBank, Accession No. L47206. The nucleic acid can be obtained from an appropriate sample based on the above-mentioned sequence information by a known method, for example, the PCR method.
【００９９】ヒト主要組織適合性抗原をコードする核酸
及び／又は抗原タンパク質をコードする核酸を適切な細
胞に導入することにより、その両者を発現する細胞であ
り、かつ細胞傷害Ｔリンパ球により傷害を受ける細胞を
得ることができる。By introducing a nucleic acid encoding a human major histocompatibility antigen and / or a nucleic acid encoding an antigen protein into appropriate cells, cells expressing both of them are damaged by cytotoxic T lymphocytes. You can get the cells to receive.
【０１００】核酸の細胞への導入は、導入対象の細胞に
適したベクターを介して行なうことができ、高い導入効
率を得る観点から、好ましくは、アデノウイルスベクタ
ーを介して行なうことができる。The nucleic acid can be introduced into the cells via a vector suitable for the cells to be introduced, and from the viewpoint of obtaining high introduction efficiency, it can be preferably introduced via an adenovirus vector.
【０１０１】また、アデノウイルスベクターを用いる場
合、慣用の相同組換え等により、ヒト主要組織適合性抗
原をコードする核酸及び／又は抗原タンパク質をコード
する核酸を導入し、該核酸が導入されたアデノウイルス
ベクターを含有したアデノウイル粒子を調製することが
でき〔例えば、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ（グローバー）
ら、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ４，Ｍａｍｍａｌｉａｎ
Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（日本語版：
宝酒造株式会社発行）〕、例えば、ＣＯＳ−ＴＰＣ法
[ミヤケ(S. Miyake) ら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A、第93巻、第1320頁(1966)] により調製することでき
る。When an adenovirus vector is used, a nucleic acid encoding a human major histocompatibility antigen and / or a nucleic acid encoding an antigen protein is introduced by conventional homologous recombination and the adenovirus into which the nucleic acid is introduced is introduced. Adenovirus particles containing a viral vector can be prepared [eg, D. M. Glover
Et al., DNA Cloning 4, Mammalian
Systems Second Edition A
Practical Approach (Japanese version:
Issued by Takara Shuzo Co., Ltd.)], for example, COS-TPC method
[S. Miyake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 93, 1320 (1966)].
【０１０２】アデノウイルスベクターを用いる核酸の導
入は、公知の方法、例えば、ＣＯＳ−ＴＰＣ法により調
製した前記アデノウイルスベクターを含有したアデノウ
イルス粒子を導入対象の細胞として感染させることがで
きる。The introduction of nucleic acid using an adenovirus vector can be performed by a known method, for example, adenovirus particles containing the adenovirus vector prepared by the COS-TPC method can be infected as cells to be introduced.
【０１０３】また、前記ベクターには、ヒト主要組織適
合性抗原をコードする核酸及び／又は抗原タンパク質を
コードする核酸を発現を細胞内で行なうに適したエレメ
ントが存在することが望ましい。例えば、発現対象の核
酸の上流に、転写を制御するプロモーター配列等の制御
配列、翻訳開始コドンなどを付加し、下流には翻訳終始
コドンを付加し、それにより細胞内で複製し、機能する
組換えベクターを作製することができる。Further, it is desirable that the vector contains an element suitable for intracellular expression of a nucleic acid encoding a human major histocompatibility antigen and / or a nucleic acid encoding an antigen protein. For example, a regulatory sequence such as a promoter sequence that controls transcription, a translation initiation codon, etc. are added upstream of the nucleic acid to be expressed, and a translation termination codon is added downstream, whereby a group that replicates in the cell and functions. A replacement vector can be produced.
【０１０４】具体的には、アデノウイルスベクターを用
い、動物細胞に導入する場合、プロモーターとしては、
ＳＶ４０遺伝子プロモーター、アデノウイルス主要後期
遺伝子プロモーター、チミジンキナーゼ遺伝子プロモー
ター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、β−アク
チン遺伝子プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＲα
プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＣＭＧプロモー
ター、ＰＧＫプロモーター等が挙げられる。本発明にお
いては、発現強度の観点から、例えば、ＣＡＧプロモー
ターが好適に使用される。Specifically, when the adenovirus vector is used and introduced into animal cells, the promoter is
SV40 gene promoter, adenovirus major late gene promoter, thymidine kinase gene promoter, metallothionein gene promoter, β-actin gene promoter, CAG promoter, SRα
Examples include promoters, EF1α promoters, CMG promoters, PGK promoters and the like. In the present invention, for example, the CAG promoter is preferably used from the viewpoint of expression intensity.
【０１０５】前記アデノウイルスベクターにより、ヒト
主要組織適合性抗原をコードする核酸及び／又は抗原タ
ンパク質をコードする核酸を発現させる場合、導入対象
の細胞としては、ヒト主要組織適合性抗原と抗原タンパ
ク質のどちらか一方のみを発現する、あるいはこの両者
ともに発現しない細胞などが挙げられる。When a nucleic acid encoding a human major histocompatibility antigen and / or a nucleic acid encoding an antigen protein is expressed by the adenovirus vector, cells to be introduced include human major histocompatibility antigen and antigen protein. Examples include cells that express only one or both of them.
【０１０６】また、得られたトランスフェクタントは、
用いられた細胞に応じて、適当な培地で培養すればよ
い。The transfectant obtained was
It may be cultured in an appropriate medium depending on the cells used.
【０１０７】得られたトランスフェクタントが、前記ヒ
ト主要組織適合性抗原及び／又は抗原タンパク質を提示
しているかどうかは、ＣＴＬによるサイトカイン産生量
により評価することができる。Whether or not the obtained transfectant presents the human major histocompatibility antigen and / or antigen protein can be evaluated by the amount of cytokine produced by CTL.
【０１０８】また、本発明の抗原提示細胞は、ＨＬＡ−
Ａ２４拘束性抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複
合体を細胞表面に提示しているので、本発明のＣＴＬが
誘導されるため、かかる抗原提示細胞をＣＴＬ誘導剤と
して使用できる。本発明には、かかるＣＴＬ誘導剤も含
まれる。かかる誘導剤は、本発明の抗原提示細胞を有効
成分として含有するものである。Further, the antigen presenting cells of the present invention are HLA-
Since the complex of the A24-restricted antigen peptide and the HLA-A24 molecule is presented on the cell surface, the CTL of the present invention is induced, and thus such antigen-presenting cell can be used as a CTL inducer. The present invention also includes such a CTL inducer. Such an inducer contains the antigen-presenting cell of the present invention as an active ingredient.
【０１０９】本発明のＣＴＬ誘導剤は、該抗原提示細胞
を、細胞の保存に適した培地、生理食塩水、又はリン酸
緩衝生理食塩水に懸濁した剤形で供給されうる。培地と
しては、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ１０等の
培地が挙げられる。また、前記培地又は緩衝液には、血
清アルブミン等を安定化の目的で添加してもよい。The CTL inducer of the present invention can be supplied in a dosage form in which the antigen-presenting cells are suspended in a medium suitable for cell preservation, physiological saline, or phosphate buffered saline. Examples of the medium include RPMI, AIM-V, X-VIVO10 and the like. In addition, serum albumin or the like may be added to the medium or buffer solution for the purpose of stabilization.
【０１１０】本発明のＣＴＬ誘導剤における抗原提示細
胞の含有量は、ＣＴＬを誘導するに十分な量であればよ
く、抗原提示細胞１種類あたり１０3 〜５×１０6 個／
ｍｌ、好ましくは１０4 〜１０6 個／ｍｌであることが
望ましい。かかる含有量は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４抗
原陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、イン・ビト
ロで、抗原提示細胞の含有量が異なる剤のそれぞれを添
加して刺激しながら培養した場合に、ＨＬＡ−Ａ２４陽
性細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導される剤におけ
る抗原提示細胞の含有量として決定することができる。The content of antigen-presenting cells in the CTL inducer of the present invention may be an amount sufficient to induce CTL, and is 10 3 to 5 × 10 6 cells / antigen-presenting cell / type.
It is desirable that it is ml, preferably 10 4 to 10 6 cells / ml. Such a content is obtained, for example, when peripheral blood lymphocytes are isolated from an HLA-A24 antigen-positive human and cultured in vitro while adding and stimulating agents having different contents of antigen-presenting cells. , HLA-A24 positive cells can be determined as the content of antigen-presenting cells in the agent that induces CTL.
【０１１１】本発明のＣＴＬ誘導剤は、イン ビトロで
本発明のＣＴＬを増殖させるための培地への添加物とし
ての利用のほか、Ｔリンパ球増殖活性を指標とした免疫
感作状態の診断などにも利用することができる。例え
ば、培地への添加物として使用する場合、ＣＴＬへ誘導
するリンパ球１個に対し通常０．０１〜１個の割合で用
いることができる。The CTL inducer of the present invention is used as an additive to a medium for proliferating the CTL of the present invention in vitro, and in the diagnosis of immunization state using T lymphocyte proliferative activity as an index. Can also be used for For example, when it is used as an additive to a medium, it can be usually used in a ratio of 0.01 to 1 per 1 lymphocyte that induces CTL.
【０１１２】また、本発明の抗原提示細胞によれば、ア
ジア人種、特に日本人に多い、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の
ＣＴＬを誘導できるため、かかる抗原提示細胞自体を
癌、特に前立腺癌に対する制癌剤として用いることがで
きる。本発明の制癌剤には、（３）本発明の抗原提示細
胞を有効成分として含有した制癌剤も含まれる。Further, since the antigen-presenting cells of the present invention can induce HLA-A24-restricted CTL, which is often found in Asian races, especially Japanese, the antigen-presenting cells themselves are anticancer agents for cancer, especially prostate cancer. Can be used as The anticancer drug of the present invention also includes (3) an anticancer drug containing the antigen-presenting cell of the present invention as an active ingredient.
【０１１３】前記（３）の制癌剤は、本発明の抗原提示
細胞を薬学的に許容されうる希釈剤に懸濁した剤形で提
供される。前記希釈剤とは、細胞の保存に適した培地、
リン酸緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。培地として
は、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ１０などの培
地などが挙げられる。また、前記（３）の制癌剤には、
安定化のために、薬学的に許容される担体を含有しても
よい。前記担体としては、ヒト血清アルブミン等が挙げ
られる。The anticancer drug of (3) above is provided in a dosage form in which the antigen-presenting cells of the present invention are suspended in a pharmaceutically acceptable diluent. The diluent is a medium suitable for storing cells,
Examples thereof include phosphate buffer solution and physiological saline. Examples of the medium include RPMI, AIM-V, X-VIVO10 and the like. In addition, the anticancer drug of (3) above,
A pharmaceutically acceptable carrier may be included for stabilization. Examples of the carrier include human serum albumin and the like.
【０１１４】前記（３）の制癌剤における抗原提示細胞
の含有量（有効成分量）は、該抗原提示細胞により誘導
されるＣＴＬの量が、前立腺特異膜抗原 (prostate spe
cific membrane antigen, 以下、ＰＳＭＡと略す) が異
常発現している癌、特に前立腺癌における腫瘍細胞を傷
害するに十分な量であればよい。かかる有効成分量は、
前記（１）又は（２）の制癌剤の場合と同様に決定する
ことができる。前記有効成分量は、具体的には、制癌剤
中、抗原提示細胞１種類につき１０5 〜１０8個／ｍ
ｌ、好ましくは５×１０5 〜５×１０7 個／ｍｌである
ことが望ましい。The content (active ingredient amount) of the antigen-presenting cells in the anticancer drug of (3) above is determined by the amount of CTL induced by the antigen-presenting cells being the prostate specific membrane antigen (prostate spe).
Cific membrane antigen (hereinafter, abbreviated as PSMA) may be in an amount sufficient to damage tumor cells in which cancer is aberrantly expressed, particularly prostate cancer. The amount of such active ingredient is
It can be determined in the same manner as in the case of the anticancer drug of (1) or (2). Specifically, the amount of the active ingredient is 10 5 to 10 8 cells / m 2 per type of antigen-presenting cells in the anticancer drug.
1, preferably 5 × 10 5 to 5 × 10 7 cells / ml.
【０１１５】前記（３）の制癌剤をヒトに投与する場
合、注射器で投与することができ、成人１人あたりの投
与量は、患者の年齢、体重、疾患の状態などにより適宜
設定され得、例えば、抗原提示細胞数として、抗原提示
細胞１種類あたり通常１０4 〜１０9 個であることが望
ましい。なお、上記範囲はあくまで目安であり、これに
限定されるものではない。また、有効成分である抗原提
示細胞は投与するヒト由来のものであるため、人体への
適応性に優れている。When the above-mentioned anticancer drug (3) is administered to humans, it can be administered by a syringe, and the dose per adult can be appropriately set according to the age, weight, disease state of the patient, and the like. The number of antigen-presenting cells is usually preferably 10 4 to 10 9 per kind of antigen-presenting cells. It should be noted that the above range is merely a guide and is not limited to this. In addition, since the antigen-presenting cells, which are the active ingredient, are derived from the human being to be administered, they have excellent adaptability to the human body.
【０１１６】かかる制癌剤は、免疫治療において併用可
能な他の制癌剤をも用いることができる。As such a carcinostatic agent, another carcinostatic agent which can be used in combination in immunotherapy can also be used.
【０１１７】本発明のＣＴＬによれば、かかるＣＴＬに
感受性を示す細胞を検出することができる。本発明に
は、ＣＴＬの感受性細胞の検出方法も含まれる。According to the CTL of the present invention, cells sensitive to such CTL can be detected. The present invention also includes a method for detecting CTL sensitive cells.
【０１１８】本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球の感受性細
胞の検出方法は、本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球と被検
細胞とを接触させ、それにより、変化が生じる場合、該
被検細胞が、本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球に感受性の
ある細胞（感受性細胞）であることの指標とすることを
特徴とする。[0118] The method for detecting a cytotoxic T lymphocyte sensitive cell of the present invention comprises contacting the cytotoxic T lymphocyte of the present invention with a test cell, which causes a change in the test cell when the change occurs. Is an indicator that the cells are sensitive to the cytotoxic T lymphocytes of the present invention (sensitive cells).
【０１１９】前記「被検細胞」とは、末梢血リンパ球、
組織等の体外摘出試料由来のヒト細胞又は株化細胞を意
味する。また、本明細書における「感受性細胞」とは、
ＣＴＬにより認識され、細胞溶解あるいはサイトカイン
遊離を引き起こされる腫瘍細胞をはじめとする、異常細
胞を意味する。The "test cell" is a peripheral blood lymphocyte,
It means a human cell or cell line derived from an in vitro excised sample such as a tissue. Further, the “sensitive cell” in the present specification means
It means abnormal cells including tumor cells that are recognized by CTL and cause cell lysis or cytokine release.
【０１２０】ＣＴＬと被検細胞中の感受性細胞との接触
により生じる変化としては、例えば、ＣＴＬによる細胞
溶解、サイトカイン遊離、ＣＴＬの増殖等が挙げられ
る。The changes caused by the contact between CTLs and sensitive cells in the test cells include, for example, cell lysis by CTLs, cytokine release, CTL proliferation and the like.
【０１２１】細胞溶解の検出は、例えば、ラジオアイソ
トープや蛍光色素により被検細胞を標識後、ＣＴＬと混
合した際に、被検細胞より遊離されるラジオアイソトー
プ量や蛍光色素量を測定することにより実施できる。Cell lysis can be detected, for example, by labeling the test cells with radioisotopes or fluorescent dyes and then measuring the amount of radioisotope or fluorescent dye released from the test cells when mixed with CTL. Can be implemented.
【０１２２】サイトカイン遊離の検出は、ＣＴＬ又は被
検細胞からのＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γ等の遊
離量を測定することにより実施することができる。The detection of cytokine release can be carried out by measuring the release amount of GM-CSF, TNF, IFN-γ or the like from CTL or test cells.
【０１２３】ＣＴＬの増殖は、 3Ｈ−チミジンの細胞へ
の取り込み量の測定や、顕微鏡観察などによるＣＴＬ細
胞数の測定などにより実施することができる。Proliferation of CTL can be carried out by measuring the amount of 3 H-thymidine incorporated into cells, measuring the number of CTL cells by microscopic observation, and the like.
【０１２４】この変化により、被検細胞中に存在するＨ
ＬＡ−Ａ２４及びＰＳＭＡ共に陽性の腫瘍細胞を検出す
ることが可能である。Due to this change, H existing in the test cells
It is possible to detect tumor cells positive for both LA-A24 and PSMA.
【０１２５】また、かかる検出方法には、本発明のＣＴ
Ｌを有効成分として含有した、ＣＴＬに感受性の細胞の
検出剤が好適に用いられる。かかる検出剤も本発明に含
まれる。Further, the CT of the present invention is used in such a detection method.
A detection agent for cells sensitive to CTL, which contains L as an active ingredient, is preferably used. Such detection agents are also included in the present invention.
【０１２６】本発明の検出剤は、前記ＣＴＬの保存に適
した培地、生理食塩水、又はリン酸緩衝生理食塩水に懸
濁した剤形で提供される。The detection agent of the present invention is provided in a dosage form suspended in a medium, physiological saline, or phosphate buffered physiological saline suitable for storing the CTL.
【０１２７】培地としては、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ又は
Ｘ−ＶＩＶＯ１０などの培地が挙げられる。また、前記
培地又は緩衝液には、ＣＴＬ安定化の目的で、血清アル
ブミン等を添加してもよい。Examples of the medium include RPMI, AIM-V or X-VIVO10. Further, serum albumin or the like may be added to the medium or the buffer solution for the purpose of stabilizing CTL.
【０１２８】前記検出剤におけるＣＴＬの含有量（有効
成分量）は、前記ＣＴＬと被検細胞中の感受性細胞との
接触により生じる変化〔例えば、ＣＴＬによる細胞溶
解、サイトカイン遊離、ＣＴＬの増殖等〕を生じさせる
に十分な量であればよい。具体的には、ＣＴＬの含有量
は、ＣＴＬ１種類につき、１０4 〜１０8 個／ｍｌであ
ることが望ましい。The content of CTL (amount of active ingredient) in the detection agent is changed by contact between the CTL and sensitive cells in the test cells (eg, cell lysis by CTL, cytokine release, proliferation of CTL, etc.). It is sufficient if the amount is sufficient to cause Specifically, the content of CTLs is preferably 10 4 to 10 8 pieces / ml for each type of CTL.
【０１２９】本発明の検出剤は、被検細胞中における本
発明のＣＴＬに感受性細胞の検出の他、被検細胞に発現
するＨＬＡがＨＬＡ−Ａ２４であるか同定するＨＬＡタ
イピングにも用いられうる。The detecting agent of the present invention can be used not only for detecting cells sensitive to the CTL of the present invention in a test cell but also for HLA typing for identifying whether HLA expressed in the test cell is HLA-A24. .
【０１３０】本発明の検出剤は、さらに、前記変化の検
出を行なうための試薬、例えば、標識などを適宜含有し
てもよい。The detection agent of the present invention may further contain a reagent for detecting the above change, for example, a label or the like as appropriate.
【０１３１】本発明により、被検細胞におけるヒト主要
組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４分子の検出方法も提
供される。ヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４
分子の検出方法は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド
の存在下、本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球と被検細胞と
を接触させることを１つの特徴とする。The present invention also provides a method for detecting a human major histocompatibility complex (HLA) -A24 molecule in a test cell. Human major histocompatibility complex (HLA) -A24
The method for detecting a molecule is characterized in that the cytotoxic T lymphocyte of the present invention is contacted with a test cell in the presence of an HLA-A24-restricted antigen peptide.
【０１３２】例えば、被検細胞表面上のＨＬＡ−Ａ２４
分子は、本発明のＣＴＬと被検細胞とを接触させること
によって生じる変化を指標に検出することができる。Ｃ
ＴＬと被検細胞との接触により生じる変化としては、例
えば、ＣＴＬによる細胞溶解、サイトカイン遊離、又は
ＣＴＬの増殖が挙げられる。かかる変化は、前述のよう
に検出することができる。For example, HLA-A24 on the surface of test cells
The molecule can be detected using, as an index, a change caused by bringing the CTL of the present invention into contact with a test cell. C
Examples of the change caused by the contact between the TL and the test cell include cell lysis by CTL, cytokine release, or proliferation of CTL. Such a change can be detected as described above.
【０１３３】前記測定結果により、ＨＬＡ−Ａ２４分子
の発現の有無の検出のみならず、被検細胞上のＨＬＡ−
Ａ２４分子の発現量を測定することも可能である。From the above measurement results, not only the presence or absence of the expression of HLA-A24 molecule was detected, but also HLA-A24 on the test cells was detected.
It is also possible to measure the expression level of the A24 molecule.
【０１３４】なお、被検細胞においてＰＳＭＡが発現し
ているかどうかが不明である場合、以下の方法によりＨ
ＬＡ−Ａ２４分子を検出することができる。本方法にお
いては、反応液中に被検細胞及び最終０．０１〜５０μ
ｇ／ｍｌとなるように、本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性
抗原ペプチド、更に該抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分
子との複合体を認識する本発明のＣＴＬを共存させ、該
ＣＴＬと被検細胞を接触させればよい。If it is unknown whether PSMA is expressed in the test cells, H
The LA-A24 molecule can be detected. In this method, the test cells and the final amount of 0.01 to 50 μm are added to the reaction solution.
The HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention and the CTL of the present invention that recognizes a complex of the antigenic peptide and the HLA-A24 molecule are allowed to coexist at a concentration of g / ml. Just contact them.
【０１３５】本発明により、補体活性化工程が必須であ
った従来の抗ＨＬＡ抗体を用いたＨＬＡ分子の検出方法
では検出が困難であった腫瘍細胞のＨＬＡ−Ａ２４分子
の検出が可能となる。According to the present invention, it becomes possible to detect HLA-A24 molecule in tumor cells, which was difficult to detect by the conventional method for detecting HLA molecule using an anti-HLA antibody which requires a complement activation step. .
【０１３６】[0136]
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
【０１３７】実施例１ ＰＳＭＡ抗原ペプチド特異的Ｃ
ＴＬの調製
本実施例におけるＣＴＬは、抗原提示用樹状細胞（Ｄ
Ｃ）を用いた誘導法により調製した。Example 1 PSMA Antigen Peptide Specific C
Preparation of TL The CTL in this example is an antigen-presenting dendritic cell (D
It was prepared by the induction method using C).
【０１３８】（１）ＣＴＬ誘導用ペプチドの選択及び合
成
７５０アミノ酸からなるＰＳＭＡタンパク質のアミノ酸
配列について、ＨＬＡ−Ａ２４結合性モチーフ構造を有
する配列を有するペプチド（Ｎ末端より２番目の残基
が、Tyr 、Phe 、Trp 及びMet からなる群より選ばれた
アミノ酸であり、Ｃ末端残基が、Leu 、Ile 、Phe 及び
Trp からなる群より選ばれたアミノ酸であるペプチド）
を中心に、ＰＳＭＡ抗原ペプチドの候補ペプチドとし
て、表１に示した９個のペプチドを選択した。(1) Selection and Synthesis of CTL Inducing Peptide Regarding the amino acid sequence of the PSMA protein consisting of 750 amino acids, a peptide having a sequence having an HLA-A24 binding motif structure (the second residue from the N-terminal is Tyr , Phe, Trp, and Met, whose C-terminal residues are Leu, Ile, Phe, and
A peptide that is an amino acid selected from the group consisting of Trp)
The nine peptides shown in Table 1 were selected as candidate peptides of the PSMA antigen peptide.
【０１３９】[0139]
【表１】 [Table 1]
【０１４０】なお、表１において、「配列番号」の項の
番号は、各ペプチドのアミノ酸配列を示した配列表の配
列番号を示す。また、「ＰＳＭＡ中の位置」の項の番号
は、ＰＳＭＡタンパク質のＮ末端からのアミノ酸残基数
を示す。また、「名称」の項の記号は、本発明者らが命
名したペプチドの名称を示す。これらをペプチド合成機
（ＰＳＳＭ−８：島津製作所製）を用い、固相Ｆｍｏｃ
法にて作製した。In Table 1, the number in the "SEQ ID NO" section indicates the sequence number in the sequence listing showing the amino acid sequence of each peptide. Moreover, the number in the "position in PSMA" section indicates the number of amino acid residues from the N-terminus of the PSMA protein. The symbol in the “name” section indicates the name of the peptide named by the present inventors. These were solid phase Fmoc using a peptide synthesizer (PSSM-8: Shimadzu).
It was produced by the method.
【０１４１】（２）エフェクター細胞の調製
前記（１）で調製したＰＳＭＡ２４−１〜ＰＳＭＡ２４
−９の９種のペプチドについて、ＨＬＡ−Ａ２４を保有
する健常人のＰＢＭＣより各々のペプチドを認識するエ
フェクター細胞を誘導し、細胞傷害活性を測定した。以
下に、調製の操作を示す。(2) Preparation of effector cells PSMA24-1 to PSMA24 prepared in (1) above
For 9 kinds of peptides of -9, effector cells recognizing each peptide were induced from PBMC of healthy people carrying HLA-A24, and cytotoxic activity was measured. The operation of preparation is shown below.
【０１４２】 ＰＢＭＣの調製
ＨＬＡ−Ａ２４を保有する健常人から成分採血により採
血を行なった。採血液を、フィコール−パック（Ficoll
-Paque）分離液（ファルマシア社製）上に重層し、５０
０×ｇで２０分間室温で遠心分離した。中間層のＰＢＭ
Ｃを回収し、洗浄して：９０％牛胎児血清（FCS 、イン
ターゲン社製）と１０％ジメチルスルホキシド（シグマ
社製）とからなる保存液に懸濁した状態で液体窒素中に
保存した（保存ＰＢＭＣ）。Preparation of PBMC Blood was collected from a healthy person carrying HLA-A24 by component blood collection. Blood samples were collected from Ficoll-Pack (Ficoll
-Paque) Overlaid on the separated liquid (Pharmacia), 50
Centrifuge at 0xg for 20 minutes at room temperature. PBM in the middle layer
C was collected, washed, and stored in liquid nitrogen in a state of being suspended in a storage solution consisting of 90% fetal calf serum (FCS, manufactured by Intergen) and 10% dimethyl sulfoxide (manufactured by Sigma) ( Save PBMC).
【０１４３】 標的細胞の調製
ＨＬＡ−Ａ２４を発現しているＥＢＶトランスフォーム
Ｂ細胞であるＴＩＳＩ（ＷＳＮＯ９０４２）に測定前日
に（１）で調製したＰＳＭＡ２４−１からＰＳＭＡ２４
−９いずれかのペプチドを個別に１０μｇ／ｍｌを含む
５種類の培地〔以下、該培地で培養したＴＩＳＩをＴＩ
ＳＩ（＋）と表記〕、又はペプチドを含まない培地〔以
下、該培地で培養したＴＩＳＩをＴＩＳＩ（−）と表
記〕中で一晩培養して用いた。測定当日、各５×１０6
個のＴＩＳＩ（＋）及びＴＩＳＩ（−）を各々２００μ
ＣｉのＮａ2 51ＣｒＯ4 溶液中に３７℃で１時間混和
し、その後１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培養液で
洗浄し51Ｃｒ標識した標的細胞として用いた。Preparation of Target Cells PSMA24-1 to PSMA24 prepared in (1) on the day before measurement in TISI (WSNO9042), which is an EBV transformed B cell expressing HLA-A24.
-9 5 kinds of media containing 10 μg / ml of each peptide [hereinafter, TISI cultured in the media is referred to as TI
SI (+)] or a peptide-free medium [hereinafter, TISI cultured in the medium is represented as TISI (-)] was used after culturing overnight. 5 × 10 6 each on the day of measurement
200μ each for TISI (+) and TISI (-)
The cells were mixed in Ci Na 2 51 CrO 4 solution at 37 ° C. for 1 hour, washed with RPMI1640 culture medium containing 10% FCS, and used as 51 Cr-labeled target cells.
【０１４４】 エフェクター細胞の調製
前記で調製した保存ＰＢＭＣを融解し、洗浄後、細胞
懸濁液１５ｍｌをＴ−７５フラスコ（コーニング社製）
に入れ、１．５時間３７℃で放置後、フラスコ接着細胞
にＧＭ−ＣＳＦ（シェーリング社製）１０００Ｕ／ｍｌ
とＩＬ−４（ジェンザイム社製）１０００Ｕ／ｍｌとを
含有した５Ｈ−ＲＰＭＩを２５ｍｌ添加し、３７℃のＣ
Ｏ2 インキュベーター内で培養し、ＤＣを誘導した。７
日後に、細胞を回収し、ペプチド４０μｇ／ｍｌとβ2
ミクログロブリン1 μｇ／ｍｌと１％ウシ血清アルブミ
ンとを含有したＰＢＳ中に３×１０6 個／ｍｌとなるよ
うに懸濁し、室温で４時間反応させた。その後、Ｘ線照
射（５５００Ｒａｄ）を行ない、１×１０6 個／ｍｌと
なるように５Ｈ−ＲＰＭＩで希釈し、抗原提示細胞とし
た。Preparation of effector cells The stored PBMC prepared above is thawed and washed, and 15 ml of the cell suspension is added to a T-75 flask (manufactured by Corning).
And leave it at 37 ° C. for 1.5 hours, then attach GM-CSF (Schering) 1000 U / ml to the flask adherent cells.
25 ml of 5H-RPMI containing 1000 U / ml of IL-4 (manufactured by Genzyme) was added, and C at 37 ° C was added.
DC was induced by culturing in an O 2 incubator. 7
After a day, cells were harvested and 40 μg / ml peptide and β 2
The cells were suspended in PBS containing 1 μg / ml of microglobulin and 1% bovine serum albumin at 3 × 10 6 cells / ml and reacted at room temperature for 4 hours. Then, X-ray irradiation (5500 Rad) was performed, and diluted with 5H-RPMI to 1 × 10 6 cells / ml to obtain antigen-presenting cells.
【０１４５】前記で得られた保存ＰＢＭＣを融解後、
細胞濃度が２×１０7 個／ｍｌとなるように、４℃で、
１％ヒトＡＢ血清を含有したリン酸緩衝化生理食塩水
（ＰＢＳ）（以下、１Ｈ−ＰＢＳと略す）に懸濁し、Ｐ
ＢＭＣ懸濁液を得た。ついで、２×１０7 個／ｍｌのＰ
ＢＭＣに対して、１Ｈ−ＰＢＳで洗浄した抗ＣＤ８抗体
を結合したビーズ（Dynabeads M450、ダイナル社製）を
１４０μｌ加え、１時間、４℃で反応させた。After thawing the stored PBMC obtained above,
Adjust the cell concentration to 2 × 10 7 cells / ml at 4 ℃.
Suspended in phosphate buffered saline (PBS) containing 1% human AB serum (hereinafter abbreviated as 1H-PBS),
A BMC suspension was obtained. Then 2 × 10 7 pieces / ml P
To BMC, 140 μl of beads (Dynabeads M450, manufactured by Dynal Co., Ltd.) bound with anti-CD8 antibody washed with 1H-PBS were added and reacted at 4 ° C. for 1 hour.
【０１４６】その後、前記ＰＢＭＣ懸濁液の調製時に用
いた細胞数１×１０8 個に対して、０．９ｍｌの１Ｈ−
ＰＢＳに懸濁し、得られた懸濁液に、０．１ｍｌの細胞
解離用ビーズ（DETACHaBEAD 、ダイナル社製）を添加し
た。ついで、得られた溶液を１時間室温で混和し、解離
した細胞を回収し、１Ｈ−ＰＢＳで洗浄した。Then, 0.9 ml of 1H- was added to 1 × 10 8 cells used in the preparation of the PBMC suspension.
The cells were suspended in PBS, and 0.1 ml of cell dissociation beads (DETACHaBEAD, manufactured by Dynal) was added to the obtained suspension. Then, the obtained solution was mixed for 1 hour at room temperature, and the dissociated cells were collected and washed with 1H-PBS.
【０１４７】得られた洗浄細胞を２×１０6 個／ｍｌと
なるように、５Ｈ−ＲＰＭＩに懸濁した。得られた懸濁
液を、ＰＳＭＡ２４−１〜ＰＳＭＡ２４−９のいずれか
のペプチドと共に培養したＤＣ懸濁液のそれぞれと等量
ずつ混和し、さらに最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるよう
にＩＬ−７を添加した。得られた溶液を、４８ウェル培
養プレートの各ウェルに０．５ｍｌずつ分注し、３７℃
のＣＯ2 インキュベーター内で培養した。翌日、培養物
に、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０を含有した５Ｈ−Ｒ
ＰＭＩを５０μｌ添加した。The washed cells thus obtained were suspended in 5H-RPMI at 2 × 10 6 cells / ml. The obtained suspension was mixed with an equal amount of each of the DC suspensions cultured with the peptide of any of PSMA24-1 to PSMA24-9, and further IL-7 was added so that the final concentration was 10 ng / ml. Was added. Dispense the resulting solution into each well of a 48-well culture plate in an amount of 0.5 ml at 37 ° C.
The cells were cultured in a CO 2 incubator. The next day, the cultures contained 5H-R containing 100 ng / ml IL-10.
50 μl of PMI was added.
【０１４８】１週間後に各ウェルの培養上清を除き、細
胞を０．５ｍｌの５Ｈ−ＲＰＭＩに懸濁し、懸濁液を得
た。ついで、Ｘ線照射（５５００Ｒａｄ）を行なったＰ
ＢＭＣから得られた接着細胞を、２０μｇ／ｍｌのＰＳ
ＭＡ２４−１〜ＰＳＭＡ２４−９のいずれかのペプチド
と１μｇ／ｍｌのβ2 ミクログロブリンとを含む１ＨＳ
Ａ−ＰＢＳ（１％ヒト血清アルブミンを含有したリン酸
緩衝化生理食塩水）と２時間室温放置し、各ウェルを洗
浄して得られた再刺激用抗原提示細胞を含む各ウェル
に、前記懸濁液を添加した。After one week, the culture supernatant of each well was removed, and the cells were suspended in 0.5 ml of 5H-RPMI to obtain a suspension. Then, P was irradiated with X-rays (5500 Rad)
Adherent cells obtained from BMC were treated with 20 μg / ml PS
1HS containing any one of MA24-1 to PSMA24-9 and 1 μg / ml β 2 microglobulin
A-PBS (phosphate-buffered physiological saline containing 1% human serum albumin) was allowed to stand at room temperature for 2 hours, and each well was washed. The suspension was added.
【０１４９】翌日、終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるように
ＩＬ−１０を各ウェルに添加した。さらに、２日おきに
最終濃度２０ＩＵ／ｍｌとなるようにｒＩＬ−２を含有
した５Ｈ−ＲＰＭＩを各ウェルに添加し、１週間ＣＯ2
インキュベーター内で培養した。同様の再刺激を更に３
回行なった後、各ウェルにおけるエフェクター細胞につ
いて標的細胞に対する細胞傷害活性を測定した。The next day, IL-10 was added to each well so that the final concentration was 10 ng / ml. Furthermore, 5H-RPMI containing rIL-2 was added to each well so that the final concentration was 20 IU / ml every 2 days, and CO 2 was added for 1 week.
Cultured in an incubator. 3 more similar restimulations
After repeating, the effector cells in each well were measured for cytotoxic activity against target cells.
【０１５０】細胞傷害活性を示したＰＳＭＡ２４−３及
びＰＳＭＡ２４−５エフェクター細胞について、個別に
抗ＣＤ３抗体を用いて増殖させた。増殖した細胞を５Ｈ
−ＲＰＭＩに懸濁し、下記（３）の方法で標的細胞に対
する細胞傷害活性を測定した。PSMA24-3 and PSMA24-5 effector cells that showed cytotoxic activity were grown individually with anti-CD3 antibody. 5H for grown cells
-Suspended in RPMI, and the cytotoxic activity against target cells was measured by the following method (3).
【０１５１】（３）ＣＴＬによる細胞傷害活性の測定
前記（２）で得られたエフェクター細胞を、３×１０3
〜１×１０6 個／ｍｌとなるように５Ｈ−ＲＰＭＩで希
釈した。得られた希釈物を９６ウェル培養プレートの各
ウェルに１００μl ／ウェルずつ分注した。ついで、各
ウェルに１×１０4 個の51Ｃｒ標識標的細胞と３×１０
5 個のＫ５６２細胞とを含有した１００μl の細胞懸濁
液を添加し、細胞混合物を得た。なお、前記Ｋ５６２細
胞は、混入するＮＫ細胞による非特異的傷害活性を除く
ために用いた。(3) Measurement of cytotoxic activity by CTL The effector cells obtained in (2) above were treated with 3 × 10 3 cells.
It was diluted with 5H-RPMI to be about 1 × 10 6 cells / ml. The resulting dilution was dispensed at 100 μl / well into each well of a 96-well culture plate. Then, 1 × 10 4 51 Cr-labeled target cells and 3 × 10 4 cells were added to each well.
100 μl of cell suspension containing 5 K562 cells was added and a cell mixture was obtained. The K562 cells were used to remove nonspecific damaging activity due to contaminating NK cells.
【０１５２】前記細胞混合物を４００×ｇで１分間遠心
分離後、３７℃のＣＯ2 インキュベーター中に５時間放
置した。その後、各ウェルの培養液上清１００μｌを採
取しガンマカウンターを用いて、遊離された51Ｃｒ量を
測定した。The cell mixture was centrifuged at 400 × g for 1 minute and then left in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 5 hours. Then, 100 μl of the culture supernatant of each well was collected and the amount of released 51 Cr was measured using a gamma counter.
【０１５３】特異的細胞傷害活性を、以下の式１に従っ
て算出した。The specific cytotoxic activity was calculated according to the following formula 1.
【０１５４】[0154]
【数２】 [Equation 2]
【０１５５】前記式１において、最小放出値は、標的細
胞とＫ５６２細胞とのみが入っているウェルの51Ｃｒ量
であり、標的細胞からの51Ｃｒの自然遊離量を示す。ま
た、最大放出値は、標的細胞に界面活性剤トリトンＸ−
１００を加えて細胞を破壊した際の51Ｃｒ遊離量を示
す。In the above formula 1, the minimum release value is the amount of 51 Cr in the well containing only the target cells and K562 cells, and represents the spontaneous release amount of 51 Cr from the target cells. In addition, the maximum release value was that Triton X-
The amount of 51 Cr released when 100 is added to destroy the cells is shown.
【０１５６】ＰＳＭＡ２４−３又はＰＳＭＡ２４−５に
より誘導したエフェクター細胞のＴＩＳＩ（−）及びＴ
ＩＳＩ（＋）に対する各種Ｅ／Ｔでの特異的細胞傷害性
曲線を図１及び図２に示す。TISI (-) and T of effector cells induced by PSMA24-3 or PSMA24-5
Specific cytotoxicity curves at various E / Ts against ISI (+) are shown in FIGS. 1 and 2.
【０１５７】図１は、ＰＳＭＡ２４−３で誘導したエフ
ェクター細胞を用いた結果を示す。また、図２は、ＰＳ
ＭＡ２４−５で誘導したエフェクター細胞を用いた結果
を示す。また、白四角印（□）は標的細胞としてＴＩＳ
Ｉ（−）を、黒丸印（●）はＴＩＳＩ（＋）を用いた結
果を示す。なお、図１及び２において、縦軸は、特異的
細胞傷害活性（％）であり、横軸は、Ｅ／Ｔ比である。FIG. 1 shows the results using PSMA24-3 induced effector cells. In addition, in FIG.
The result using MA24-5 induced effector cells is shown. The white squares (□) are TIS as target cells.
I (-) and black circles (●) show the results using TISI (+). 1 and 2, the vertical axis represents the specific cytotoxic activity (%) and the horizontal axis represents the E / T ratio.
【０１５８】その結果、ＰＳＭＡ２４−３及びＰＳＭＡ
２４−５で誘導して得られたエフェクター細胞が各々の
ペプチド添加したＴＩＳＩ（＋）に対して抗原ペプチド
特異的な細胞傷害性を示した。As a result, PSMA24-3 and PSMA
The effector cells obtained by inducing with 24-5 showed antigen peptide-specific cytotoxicity to each peptide-added TISI (+).
【０１５９】以上の結果より、ＰＳＭＡ２４−３（配列
番号：１）及びＰＳＭＡ２４−５（配列番号：２）によ
り誘導して得られたエフェクター細胞は、抗原ペプチド
特異的な細胞傷害性を示すＣＴＬであることがわかる。From the above results, the effector cells obtained by inducing with PSMA24-3 (SEQ ID NO: 1) and PSMA24-5 (SEQ ID NO: 2) were CTLs showing antigenic peptide-specific cytotoxicity. I know there is.
【０１６０】実施例２ ＰＳＭＡ抗原ペプチド機能的誘
導体の作製
（１）ＰＳＭＡ２４−５改変体の合成
実施例１の（１）で合成したＰＳＭＡ２４−５に基づ
き、表２に示す７種の誘導体を設計した。Example 2 Production of PSMA Antigen Peptide Functional Derivatives (1) Synthesis of Modified PSMA24-5 Based on PSMA24-5 synthesized in (1) of Example 1, seven kinds of derivatives shown in Table 2 were designed. did.
【０１６１】[0161]
【表２】 [Table 2]
【０１６２】表２に示したＰＳＭＡ２４−５−１Ａ〜Ｐ
ＳＭＡ２４−５−９Ｌの７種のペプチドをペプチド合成
機を用いて作製した。PSMA 24-5-1A to P shown in Table 2
Seven peptides of SMA24-5-9L were prepared using a peptide synthesizer.
【０１６３】（２）ＰＳＭＡ２４−５の機能的誘導体の
同定
ＰＳＭＡ２４−５とＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を認
識する前記実施例１において得られたＣＴＬが、表２に
示したペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を認識
するかどうかを確認した。(2) Identification of functional derivative of PSMA24-5 The CTL obtained in Example 1 which recognizes the complex of PSMA24-5 and HLA-A24 molecule is the peptide shown in Table 2 and HLA-. It was confirmed whether or not to recognize the complex with the A24 molecule.
【０１６４】まず、実施例１の（２）と同様の方法で調
製したＰＳＭＡ２４−５を認識するＣＴＬが、51Ｃｒ標
識ＴＩＳＩ（−）細胞と、ＰＳＭＡ２４−５−１Ａ〜Ｐ
ＳＭＡ２４−５−９Ｌペプチドからなる群より選ばれた
ペプチドを用い実施例１の（２）と同様の方法で調製し
た７種の51Ｃｒ標識ＴＩＳＩ（＋）細胞とに対し、細胞
傷害性を示すかどうかを確認した。First, CTLs recognizing PSMA24-5 prepared by the same method as in (2) of Example 1 were 51 Cr-labeled TISI (-) cells and PSMA24-5-1A to PMA.
It shows cytotoxicity to seven kinds of 51 Cr-labeled TISI (+) cells prepared by the same method as in (2) of Example 1 using a peptide selected from the group consisting of SMA24-5-9L peptide. I confirmed.
【０１６５】その結果、ＰＳＭＡ２４−５を認識するＣ
ＴＬは、ＰＳＭＡ２４−５−１Ａ、ＰＳＭＡ２４−５−
５Ａ及びＰＳＭＡ２４−５−９Ｌからなる群より選ばれ
た１種を添加した培地での培養により得られた51Ｃｒ標
識ＴＩＳＩ（＋）に対し、明らかな細胞傷害性を示すこ
とがわかる。なお、該ＣＴＬは、51Ｃｒ標識ＴＩＳＩ
（−）細胞に対しては細胞傷害性を示さなかった。した
がって、ＰＳＭＡ２４−５−１Ａ（配列番号：８）、Ｐ
ＳＭＡ２４−５−５Ａ（配列番号：９）及びＰＳＭＡ２
４−５−９Ｌ（配列番号：５）が、ＰＳＭＡ２４−５の
機能的誘導体であることが明らかとなった。As a result, C recognizing PSMA24-5
TL is PSMA24-5-1A, PSMA24-5-
It can be seen that it exhibits clear cytotoxicity to 51 Cr-labeled TISI (+) obtained by culturing in a medium containing one selected from the group consisting of 5A and PSMA24-5-9L. The CTL is 51 Cr-labeled TISI.
It did not show cytotoxicity to (-) cells. Therefore, PSMA24-5-1A (SEQ ID NO: 8), P
SMA24-5-5A (SEQ ID NO: 9) and PSMA2
It was revealed that 4-5-9L (SEQ ID NO: 5) is a functional derivative of PSMA24-5.
【０１６６】実施例３ アデノウイルスを利用したＣＴ
Ｌの評価
（１）アデノウイルスによる遺伝子導入標的細胞の作製
内在的に抗原を提示する標的細胞として、ＨＬＡ−Ａ２
４とＰＳＭＡとを発現している腫瘍細胞を作成した。す
なわち、ＰＳＭＡ発現、ＨＬＡ−Ａ２４非発現前立腺癌
細胞株であるＬＮＣａＰ細胞には、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝
子導入アデノウイルスベクターで遺伝子を細胞に導入し
た。ＨＬＡ−Ａ２４発現、ＰＳＭＡ非発現癌細胞である
ＭＫＮ４５、８８８ｍｅｌ、ＳＷ４８０、Ｔ．Ｔには、
ＰＳＭＡ遺伝子導入アデノウイルスベクターを用いて、
ＰＳＭＡ遺伝子を細胞に導入した。Example 3 CT using adenovirus
Evaluation of L (1) Preparation of gene transfer target cells by adenovirus HLA-A2 was used as a target cell that endogenously presents an antigen.
Tumor cells expressing 4 and PSMA were generated. That is, the LNCaP cells, which are PSMA-expressing and HLA-A24 non-expressing prostate cancer cell lines, were introduced with the HLA-A24 gene-transferring adenovirus vector. HLA-A24 expressing, PSMA non-expressing cancer cells MKN45, 888mel, SW480, T.I. T has
Using the PSMA gene transfer adenovirus vector,
The PSMA gene was introduced into the cells.
【０１６７】遺伝子導入アデノウイルスベクターは、Ｃ
ＯＳ−ＴＰＣ法により作成した。The gene transfer adenovirus vector is C
It was created by the OS-TPC method.
【０１６８】まず、５×１０5 個／ｍｌの細胞懸濁液４
ｍｌを、６ウェル細胞培養プレートにまき、一晩培養し
た。培養後、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子導入アデノウイルス
もしくはＰＳＭＡ遺伝子導入アデノウイルス又は遺伝子
導入していないアデノウイルスを、ＭＯＩ＝２０〜３０
で前記細胞に感染させ、さらに２日間培養した。アデノ
ウイルス感染した細胞を回収し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰ
ＭＩ１６４０培養液で洗浄して、標的細胞を調製した。First, 5 × 10 5 cells / ml of cell suspension 4
ml was seeded on a 6-well cell culture plate and cultured overnight. After culturing, HLA-A24 gene-transduced adenovirus, PSMA gene-transduced adenovirus, or non-transduced adenovirus was subjected to MOI = 20 to 30.
Were infected with the above cells and cultured for a further 2 days. Adenovirus-infected cells are collected and 10% FCS-containing RP
Target cells were prepared by washing with MI1640 medium.
【０１６９】（２）遺伝子導入標的細胞を用いたＣＴＬ
の機能評価
アデノウイルスによる遺伝子導入細胞が、ＣＴＬの抗原
特異的な反応を評価する標的細胞として機能するかどう
かについて、ＣＴＬのサイトカイン産生能で確認した。(2) CTL using target cells for gene transfer
Whether the adenovirus-transfected cells function as target cells for evaluating the CTL antigen-specific reaction was confirmed by the CTL cytokine-producing ability.
【０１７０】実施例１の（２）と同様に誘導したエフェ
クター細胞を１×１０5 個／ｍｌとなるように５Ｈ−Ｒ
ＰＭＩで希釈後、得られた希釈物を、９６ウェルＵ底培
養プレートの各ウェルに１００μl ／ウェルずつ分注し
た。ついで、各ウェルに上記（１）で調製した１×１０
4 個の標的細胞を含有した１００μl の細胞懸濁液を添
加した。Effector cells induced in the same manner as in (2) of Example 1 were treated with 5H-R at 1 × 10 5 cells / ml.
After dilution with PMI, 100 μl / well of the obtained dilution was dispensed into each well of a 96-well U-bottom culture plate. Then, add 1 × 10 5 cells prepared in (1) above to each well.
100 μl of cell suspension containing 4 target cells was added.
【０１７１】培養プレートを３７℃のＣＯ2 インキュベ
ーター中に一晩放置した。その後、各ウェルの培養液上
清１００μｌを採取し、ヒトＩＦＮ−γ測定用ＥＬＩＳ
Ａキット（ジェンザイムテクノ社製）を用いてＩＦＮ−
γを測定した。ＩＦＮ−γ産生量については、同時に測
定したＩＦＮ−γ標品の検量線より算出した。Culture plates were left overnight in a CO 2 incubator at 37 ° C. Then, 100 μl of the culture supernatant of each well was collected and used for human IFN-γ measurement ELIS.
IFN-using A kit (manufactured by Genzyme Techno)
γ was measured. The amount of IFN-γ produced was calculated from the calibration curve of the IFN-γ standard that was simultaneously measured.
【０１７２】ＰＳＭＡ２４−３又はＰＳＭＡ２４−５に
より誘導したＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子導入した
前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰに対して、ＩＦＮ−γを産生
したが、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子導入していないＬＮＣａ
Ｐに対してはＩＦＮ−γを産生しなかった。CTLs induced by PSMA24-3 or PSMA24-5 produced IFN-γ but not HLA-A24 gene-transferred LNCaP in the HLA-A24 gene-transferred prostate cancer cell line LNCaP.
IFN-γ was not produced for P.
【０１７３】また、ＰＳＭＡ２４−３により誘導したＣ
ＴＬは、ＰＳＭＡ遺伝子導入したＨＬＡ−Ａ２４発現細
胞株８８８ｍｅｌ、ＳＷ４８０に対して、ＩＦＮ−γを
産生した。また、ＰＳＭＡ２４−５により誘導したＣＴ
Ｌは、ＰＳＭＡ遺伝子導入したＨＬＡ−Ａ２４発現細胞
株ＭＫＮ４５、Ｔ．Ｔに対して、ＩＦＮ−γを産生し
た。いずれのＣＴＬも、ＨＬＡ−Ａ２４非発現細胞株Ｍ
ＫＮ２８及び５２６ｍｅｌに対して、ＩＦＮ−γを産生
しなかった。C induced by PSMA24-3
TL produced IFN-γ against the HLA-A24-expressing cell line 888mel and SW480 into which the PSMA gene had been introduced. In addition, CT induced by PSMA24-5
L is a PSMA gene-transfected HLA-A24-expressing cell line MKN45, T. IFN-γ was produced against T. Both CTLs are HLA-A24 non-expressing cell lines M
IFN-γ was not produced for KN28 and 526mel.
【０１７４】以上の結果より、ＰＳＭＡ２４−３特異的
ＣＴＬ及びＰＳＭＡ２４−５特異的ＣＴＬは、ＨＬＡ−
Ａ２４遺伝子導入又はＰＳＭＡ遺伝子導入したＨＬＡ−
Ａ２４発現、ＰＳＭＡ発現標的細胞に対して、ＩＦＮ−
γを産生したことから、アデノウイルスを用いた遺伝子
導入細胞がＣＴＬ機能評価に利用できること、更にこれ
らの遺伝子導入細胞がＨＬＡ−Ａ２４分子上に本発明の
抗原ペプチドを提示することから抗原提示細胞として利
用可能であることが明らかである。From the above results, PSMA24-3 specific CTL and PSMA24-5 specific CTL were found to be HLA-
A24 gene-introduced or PSMA gene-introduced HLA-
IFN- was used against A24-expressing and PSMA-expressing target cells.
Since γ was produced, transgenic cells using adenovirus can be used for CTL function evaluation, and since these transgenic cells present the antigenic peptide of the present invention on HLA-A24 molecule, they can be used as antigen presenting cells. Clearly available.
【０１７５】配列表フリーテキスト
配列番号：１は、合成したＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペ
プチド（ＰＳＭＡ２４−３）の配列である。 Sequence Listing Free Text SEQ ID NO: 1 is the sequence of the synthesized HLA-A24-restricted antigenic peptide (PSMA24-3).
【０１７６】配列番号：２は、合成したＨＬＡ−Ａ２４
拘束性抗原ペプチド（ＰＳＭＡ２４−５）の配列であ
る。SEQ ID NO: 2 is a synthetic HLA-A24
This is the sequence of the restricted antigen peptide (PSMA24-5).
【０１７７】配列番号：３は、ＨＬＡ−Ａ２．１拘束性
抗原ペプチド（ＰＳＭ−Ｐ１）の配列である。SEQ ID NO: 3 is the sequence of HLA-A2.1 restricted antigenic peptide (PSM-P1).
【０１７８】配列番号：４は、ＨＬＡ−Ａ２．１拘束性
抗原ペプチド（ＰＳＭ−Ｐ２）の配列である。SEQ ID NO: 4 is the sequence of HLA-A2.1 restricted antigen peptide (PSM-P2).
【０１７９】配列番号：５は、配列番号：２のペプチド
の誘導体ペプチド（ＰＳＭＡ２４−５−９Ｌ）の配列で
ある。SEQ ID NO: 5 is the sequence of a derivative peptide (PSMA24-5-9L) of the peptide of SEQ ID NO: 2.
【０１８０】配列番号：６は、配列番号：２のペプチド
の誘導体ペプチド（ＰＳＭＡ２４−５−１Ｑ）の配列で
ある。SEQ ID NO: 6 is the sequence of a derivative peptide (PSMA24-5-1Q) of the peptide of SEQ ID NO: 2.
【０１８１】配列番号：７は、配列番号：２のペプチド
の誘導体ペプチド（ＰＳＭＡ２４−５−５Ｓ）の配列で
ある。SEQ ID NO: 7 is the sequence of a derivative peptide (PSMA24-5-5S) of the peptide of SEQ ID NO: 2.
【０１８２】配列番号：８は、配列番号：２のペプチド
の誘導体ペプチド（ＰＳＭＡ２４−５−１Ａ）の配列で
ある。SEQ ID NO: 8 is a sequence of a derivative peptide (PSMA24-5-1A) of the peptide of SEQ ID NO: 2.
【０１８３】配列番号：９は、配列番号：２のペプチド
の誘導体ペプチド（ＰＳＭＡ２４−５−５Ａ）の配列で
ある。SEQ ID NO: 9 is the sequence of a peptide derivative (PSMA24-5-5A) of the peptide of SEQ ID NO: 2.
【０１８４】配列番号：１０は、ＨＬＡ−Ａ２４結合モ
チーフを有する合成ペプチド（ＰＳＭＡ２４−１）の配
列である。SEQ ID NO: 10 is a sequence of a synthetic peptide (PSMA24-1) having an HLA-A24 binding motif.
【０１８５】配列番号：１１は、ＨＬＡ−Ａ２４結合モ
チーフを有する合成ペプチド（ＰＳＭＡ２４−２）の配
列である。SEQ ID NO: 11 is a sequence of a synthetic peptide (PSMA24-2) having an HLA-A24 binding motif.
【０１８６】配列番号：１２は、ＨＬＡ−Ａ２４結合モ
チーフを有する合成ペプチド（ＰＳＭＡ２４−４）の配
列である。SEQ ID NO: 12 is a sequence of a synthetic peptide (PSMA24-4) having an HLA-A24 binding motif.
【０１８７】配列番号：１３は、ＨＬＡ−Ａ２４結合モ
チーフを有する合成ペプチド（ＰＳＭＡ２４−６）の配
列である。SEQ ID NO: 13 is a sequence of synthetic peptide (PSMA24-6) having an HLA-A24 binding motif.
【０１８８】配列番号：１４は、ＨＬＡ−Ａ２４結合モ
チーフを有する合成ペプチド（ＰＳＭＡ２４−７）の配
列である。SEQ ID NO: 14 is a sequence of a synthetic peptide (PSMA24-7) having an HLA-A24 binding motif.
【０１８９】配列番号：１５は、ＨＬＡ−Ａ２４結合モ
チーフを有する合成ペプチド（ＰＳＭＡ２４−８）の配
列である。SEQ ID NO: 15 is a sequence of a synthetic peptide (PSMA24-8) having an HLA-A24 binding motif.
【０１９０】配列番号：１６は、ＨＬＡ−Ａ２４結合モ
チーフを有する合成ペプチド（ＰＳＭＡ２４−９）の配
列である。SEQ ID NO: 16 is a sequence of synthetic peptide (PSMA24-9) having an HLA-A24 binding motif.
【０１９１】配列番号：１７は、配列番号：２のペプチ
ドの誘導体ペプチド（ＰＳＭＡ２４−５−４Ａ）の配列
である。SEQ ID NO: 17 is the sequence of a peptide derivative (PSMA24-5-4A) of the peptide of SEQ ID NO: 2.
【０１９２】配列番号：１８は、配列番号：２のペプチ
ドの誘導体ペプチド（ＰＳＭＡ２４−５−６Ａ）の配列
である。SEQ ID NO: 18 is the sequence of a derivative peptide (PSMA24-5-6A) of the peptide of SEQ ID NO: 2.
【０１９３】配列番号：１９は、配列番号：２のペプチ
ドの誘導体ペプチド（ＰＳＭＡ２４−５−７Ａ）の配列
である。SEQ ID NO: 19 is the sequence of a peptide derivative (PSMA24-5-7A) of the peptide of SEQ ID NO: 2.
【０１９４】配列番号：２０は、配列番号：２のペプチ
ドの誘導体ペプチド（ＰＳＭＡ２４−５−８Ａ）の配列
である。SEQ ID NO: 20 is the sequence of a derivative peptide (PSMA24-5-8A) of the peptide of SEQ ID NO: 2.
【０１９５】[0195]
【発明の効果】本発明によれば、アジア人種、特に日本
人において、癌、具体的には、前立腺癌を始めとするＰ
ＳＭＡが異常発現している癌の治療及び診断に有用な技
術が提供されうる。具体的には、本発明のＣＴＬによれ
ば、癌、具体的には、前立腺癌を始めとするＰＳＭＡが
異常発現している癌の治療及び診断を行なうことがで
き、ＨＬＡ−Ａ２４及びＰＳＭＡ共に陽性の腫瘍細胞を
選択的に傷害することができ、かつ癌治療を目的とした
細胞医薬（制癌剤等）として用いることができ、かつ体
外摘出試料中のＨＬＡ−Ａ２４及びＰＳＭＡ共に陽性の
腫瘍細胞の有無の検出を行なうことができるという優れ
た効果を奏する。本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペ
プチドによれば、かかるＣＴＬを選択的に誘導すること
ができる。したがって、本発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性
抗原ペプチドは、ＣＴＬの誘導剤及び制癌剤として有用
である。また、本発明の抗原提示細胞は、該ＣＴＬを調
製する方法あるいは制癌剤として有用である。さらに、
本発明のＣＴＬの誘導方法によれば、本発明のＣＴＬ
を、効率よく、選択的に得ることができるという優れた
効果を奏する。また、本発明のＣＴＬの誘導剤によれ
ば、本発明のＣＴＬを、効率よく、選択的に誘導するこ
とができ、アジア人種、特に日本人において、癌、具体
的には、前立腺癌を始めとするＰＳＭＡが異常発現して
いる癌の治療に有用であるという優れた性質を発現す
る。本発明のＣＴＬの感受性細胞の検出方法及び検出剤
によれば、ＣＴＬの感受性細胞を、効率よく、選択的に
検出することができるという優れた効果を奏する。した
がって、本発明のＣＴＬの感受性細胞の検出方法及び検
出剤によれば、ＨＬＡのタイピング、癌、具体的には、
前立腺癌などの診断などへの応用が可能であるという優
れた効果を奏する。さらに、本発明の核酸によれば、本
発明のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを効率よく供
給するきことができるという優れた効果を奏する。ま
た、本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球により傷害を受ける
標的細胞の調製方法によれば、既存の標的細胞では知ら
れていない組合せのヒト主要組織適合抗原と抗原タンパ
ク質とを発現する標的細胞を作製することができるとい
う優れた効果を奏する。さらに、本発明の細胞傷害性Ｔ
リンパ球により傷害を受ける標的細胞によれば、これま
で、標的細胞が樹立していなかったために評価不能であ
った細胞傷害Ｔリンパ球の評価ができるという優れた効
果を奏する。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, in Asian races, in particular, Japanese, cancer, specifically prostate cancer and other P
A technique useful for treating and diagnosing a cancer in which SMA is abnormally expressed can be provided. Specifically, the CTL of the present invention enables the treatment and diagnosis of cancer, specifically, cancer in which PSMA such as prostate cancer is aberrantly expressed, and both HLA-A24 and PSMA can be treated. Positive tumor cells can be selectively injured and can be used as a cell drug (anticancer drug, etc.) for the purpose of treating cancer, and both of HLA-A24 and PSMA positive tumor cells in an in vitro excised sample It has an excellent effect that the presence / absence can be detected. The HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention can selectively induce such CTL. Therefore, the HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention is useful as a CTL inducer and a cancer drug. Further, the antigen-presenting cell of the present invention is useful as a method for preparing the CTL or a cancer drug. further,
According to the CTL induction method of the present invention, the CTL of the present invention
It has an excellent effect that it can be efficiently and selectively obtained. Further, the CTL inducer of the present invention can efficiently and selectively induce the CTL of the present invention, and can induce cancer, specifically prostate cancer, in Asian races, particularly Japanese. It exhibits the excellent property that it is useful for the treatment of cancers in which PSMA is aberrantly expressed. According to the method and agent for detecting CTL sensitive cells of the present invention, there is an excellent effect that CTL sensitive cells can be efficiently and selectively detected. Therefore, according to the method and agent for detecting CTL sensitive cells of the present invention, HLA typing, cancer, specifically,
It has an excellent effect that it can be applied to diagnosis of prostate cancer and the like. Furthermore, the nucleic acid of the present invention has an excellent effect that the HLA-A24-restricted antigenic peptide of the present invention can be efficiently supplied. Further, according to the method for preparing a target cell damaged by a cytotoxic T lymphocyte of the present invention, a target cell expressing a human major histocompatibility antigen and an antigen protein in a combination which is not known in the existing target cells can be obtained. It has an excellent effect that it can be manufactured. Furthermore, the cytotoxic T of the present invention
The target cells damaged by lymphocytes have an excellent effect that it is possible to evaluate cytotoxic T lymphocytes that could not be evaluated until now because the target cells have not been established.
【０１９６】[0196]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takara Shuzo Co. Ltd. <120> Cytotoxic T lymphocyte <130> TS-14-001 <150> JP2001-104693 <151> 2001-04-03 <160> 20 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for HLA-A24 restric ted antigen peptide which is synthesized. <400> 1 Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe 1 5 [Sequence list] SEQUENCE LISTING <110> Takara Shuzo Co. Ltd. <120> Cytotoxic T lymphocyte <130> TS-14-001 <150> JP2001-104693 <151> 2001-04-03 <160> 20 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for HLA-A24 restric ted antigen peptide which is synthesized. <400> 1 Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe 1 5
【０１９７】 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for HLA-A24 restric ted antigen peptide which is synthesized. <400> 2 Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe 1 5 [0197] <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for HLA-A24 restric ted antigen peptide which is synthesized. <400> 2 Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe 1 5
【０１９８】 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for HLA-A2.1 restri cted antigen peptide. <400> 3 Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val 1 5 [0198] <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for HLA-A2.1 restri cted antigen peptide. <400> 3 Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val 1 5
【０１９９】 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for HLA-A2.1 restri cted antigen peptide. <400> 4 Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val 1 5 [0199] <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for HLA-A2.1 restri cted antigen peptide. <400> 4 Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val 1 5
【０２００】 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 5 Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Leu 1 5 [0200] <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 5 Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Leu 1 5
【０２０１】 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 6 Gln Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe 1 5 [0201] <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 6 Gln Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe 1 5
【０２０２】 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 7 Asn Tyr Ala Arg Ser Glu Asp Phe Phe 1 5 [0202] <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 7 Asn Tyr Ala Arg Ser Glu Asp Phe Phe 1 5
【０２０３】 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 8 Ala Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe 1 5 [0203] <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 8 Ala Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe 1 5
【０２０４】 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 9 Asn Tyr Ala Arg Ala Glu Asp Phe Phe 1 5 [0204] <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 9 Asn Tyr Ala Arg Ala Glu Asp Phe Phe 1 5
【０２０５】 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide having HLA-A24 binding motif. <400> 10 Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys Leu Leu 1 5 10 [0205] <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide having HLA-A24 binding motif. <400> 10 Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys Leu Leu 1 5 10
【０２０６】 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide having HLA-A24 binding motif. <400> 11 Thr Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu 1 5 [0206] <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide having HLA-A24 binding motif. <400> 11 Thr Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu 1 5
【０２０７】 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide having HLA-A24 binding motif. <400> 12 Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Tyr Ser Ile 1 5 [0207] <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide having HLA-A24 binding motif. <400> 12 Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Tyr Ser Ile 1 5
【０２０８】 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide having HLA-A24 binding motif. <400> 13 Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile Pro His Leu 1 5 10 [0208] <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide having HLA-A24 binding motif. <400> 13 Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile Pro His Leu 1 5 10
【０２０９】 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide having HLA-A24 binding motif. <400> 14 Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu 1 5 10 [0209] <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide having HLA-A24 binding motif. <400> 14 Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu 1 5 10
【０２１０】 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide having HLA-A24 binding motif. <400> 15 Lys Tyr Ala Gly Glu Ser Phe Pro Gly Ile 1 5 10 [0210] <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide having HLA-A24 binding motif. <400> 15 Lys Tyr Ala Gly Glu Ser Phe Pro Gly Ile 1 5 10
【０２１１】 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide having HLA-A24 binding motif. <400> 16 Thr Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe 1 5 10 [0211] <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide having HLA-A24 binding motif. <400> 16 Thr Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe 1 5 10
【０２１２】 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 17 Asn Tyr Ala Ala Thr Glu Asp Phe Phe 5 [0212] <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 17 Asn Tyr Ala Ala Thr Glu Asp Phe Phe Five
【０２１３】 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 18 Asn Tyr Ala Arg Thr Ala Asp Phe Phe 5 [0213] <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 18 Asn Tyr Ala Arg Thr Ala Asp Phe Phe Five
【０２１４】 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 19 Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Ala Phe Phe 5 [0214] <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 19 Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Ala Phe Phe Five
【０２１５】 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 20 Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Ala Phe 5[0215] <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pep tide which is a derivative of the peptide of SEQ ID NO: 2. <400> 20 Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Ala Phe Five
【図１】図１は、ＰＳＭＡ２４−３で誘導したエフェク
ター細胞を用いた結果を示す。白四角印（□）は標的細
胞としてＴＩＳＩ（−）を、黒丸印（●）はＴＩＳＩ
（＋）を用いた結果を示す。縦軸は、特異的細胞傷害活
性（％）であり、横軸は、Ｅ／Ｔ比である。FIG. 1 shows the results using PSMA24-3 induced effector cells. White squares (□) indicate TISI (-) as target cells, black circles (●) indicate TISI.
The results using (+) are shown. The vertical axis represents the specific cytotoxic activity (%), and the horizontal axis represents the E / T ratio.
【図２】図２は、ＰＳＭＡ２４−５で誘導したエフェク
ター細胞を用いた結果を示す。白四角印（□）は標的細
胞としてＴＩＳＩ（−）を、黒丸印（●）はＴＩＳＩ
（＋）を用いた結果を示す。縦軸は、特異的細胞傷害活
性（％）であり、横軸は、Ｅ／Ｔ比である。FIG. 2 shows the results using PSMA24-5-induced effector cells. White squares (□) indicate TISI (-) as target cells, black circles (●) indicate TISI.
The results using (+) are shown. The vertical axis represents the specific cytotoxic activity (%), and the horizontal axis represents the E / T ratio.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ１２Ｎ 5/02 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 5/02 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｋ 5/06 Ｃ１２Ｒ 1:91 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 5/02 5/00 Ｅ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 黒目 徹 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 竹迫 一任 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 Ｆターム(参考） 2G045 AA24 AA26 BA13 BB20 BB35 CA17 CA18 DA36 DA78 FB07 FB08 FB12 GC15 JA01 4B024 AA01 AA12 AA15 BA31 CA04 DA02 EA02 GA11 GA18 HA15 HA17 4B065 AA92X AA94X AB01 BA02 BB19 CA24 CA44 4C085 AA02 CC21 4C087 AA01 BB63 NA14 ZB26 4H045 AA11 AA30 BA15 DA86 EA28 FA74 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) C07K 7/06 C12N 5/02 4H045 C12N 5/02 G01N 33/50 K 5/06 C12R 1:91 G01N 33 / 50 C12N 15/00 A // (C12N 5/02 5/00 E C12R 1:91) (C12N 5/06 C12R 1:91) (72) Inventor Toru Kurome 3-4-1 Seta, Otsu City, Shiga Prefecture No. Sake Brewery Co., Ltd. Central Research Institute (72) Inventor Kazutaka Takesako 3-4-1 Seta, Otsu City, Shiga Prefecture No. 60 Brewery Co., Ltd. Central Research Laboratory (72) Inventor Ikuno Kato, 3-4 Seta, Otsu City, Shiga Prefecture No. 1 F-term in Central Research Laboratory of Takara Shuzo Co., Ltd. (reference) 2G045 AA24 AA26 BA13 BB20 BB35 CA17 CA18 DA36 DA78 FB07 FB08 FB12 GC15 JA01 4B024 AA01 AA12 AA15 BA31 CA04 DA02 EA02 GA11 GA18 HA1 5 HA17 4B065 AA92X AA94X AB01 BA02 BB19 CA24 CA44 4C085 AA02 CC21 4C087 AA01 BB63 NA14 ZB26 4H045 AA11 AA30 BA15 DA86 EA28 FA74
Claims (21)
列、又は （ｂ）配列番号：１若しくは２において、下記〜： 少なくとも１残基のアミノ酸の欠失、 少なくとも１残基のアミノ酸の、他のアミノ酸若しく
はアミノ酸アナログとの置換、及び 少なくとも１残基の他のアミノ酸若しくはアミノ酸ア
ナログの付加からなる群より選ばれた少なくとも１種の
変異を有するアミノ酸配列のアミノ酸配列を有し、かつ 該配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列からなる
ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に
提示する細胞を特異的に認識しうるＴ細胞レセプターを
有するＣＴＬを誘導しうる性質を有するヒト主要組織適
合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド。1. The following (a) or (b): (a) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, or (b) in SEQ ID NO: 1 or 2, the following: to at least one amino acid residue Has at least one mutation selected from the group consisting of deletion of at least one residue, substitution of at least one amino acid with another amino acid or amino acid analog, and addition of at least one residue other amino acid or amino acid analog. T cell capable of specifically recognizing a cell having an amino acid sequence of an amino acid sequence and presenting a complex of a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 and an HLA-A24 molecule on the cell surface A human major histocompatibility complex (HLA) -A24-restricted antigen peptide having the property of inducing CTL having a receptor.
原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面
に提示する細胞を特異的に認識しうるＴ細胞レセプター
を有してなる細胞傷害性Ｔリンパ球。2. A cytotoxicity comprising a T cell receptor capable of specifically recognizing a cell presenting a complex of the HLA-A24-restricted antigenic peptide according to claim 1 and an HLA-A24 molecule on a cell surface. Sex T lymphocytes.
原ペプチドを使用することにより、細胞傷害性Ｔリンパ
球を誘導することを特徴とする、細胞傷害性Ｔリンパ球
の誘導方法。3. A method for inducing cytotoxic T lymphocytes, which comprises inducing cytotoxic T lymphocytes by using the HLA-A24-restricted antigenic peptide according to claim 1.
束性抗原ペプチドと、マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状
細胞からなる群より選択された１種の抗原提示能を有す
る細胞とを接触させて抗原提示細胞を得、得られた抗原
提示細胞を用いて、抗原提示能を有する細胞に抗原刺激
を与え、それにより、エフェクター細胞を得る工程、
（２）前記工程（１）で得られたエフェクター細胞と、
請求項２記載の細胞傷害性Ｔリンパ球により傷害を受け
る標的細胞とを接触させて、細胞傷害活性の有無を検出
する工程、及び（３）前記工程（２）において、細胞傷
害活性を呈したエフェクター細胞を細胞傷害性Ｔリンパ
球として選別する工程、を含む、請求項３記載の誘導方
法。4. (1) Contacting the HLA-A24-restricted antigenic peptide according to claim 1 with a cell having an antigen-presenting ability selected from the group consisting of macrophages, B cells and dendritic cells Obtaining antigen-presenting cells by using the obtained antigen-presenting cells, the cells having antigen-presenting ability are subjected to antigen stimulation, thereby obtaining effector cells,
(2) The effector cell obtained in the step (1),
The step of contacting the target cell damaged by the cytotoxic T lymphocyte according to claim 2 to detect the presence or absence of the cytotoxic activity, and (3) the step (2), which exhibited the cytotoxic activity. The method according to claim 3, comprising a step of selecting effector cells as cytotoxic T lymphocytes.
し、抗原提示細胞０．０１〜１個の割合で接触させる、
請求項４記載の誘導方法。5. In the presence of IL-7, one lymphocyte is contacted with 0.01 to 1 antigen-presenting cells,
The guiding method according to claim 4.
モシアニンとの存在下、末梢血単核球に、該末梢血単核
球を含む溶液１ｍｌあたり、請求項１記載のＨＬＡ−Ａ
２４拘束性抗原ペプチド１ｎｇ〜１００μｇを添加す
る、請求項４記載の誘導方法。6. The HLA-A according to claim 1, wherein per 1 ml of a solution containing the peripheral blood mononuclear cells in the peripheral blood mononuclear cells in the presence of IL-7 and keyhole limpet hemocyanin.
The induction method according to claim 4, wherein 1 ng to 100 µg of 24 restricted antigenic peptides is added.
原ペプチドを有効成分として含有してなる、請求項２記
載の細胞傷害牲Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を得るためのＣＴ
Ｌ誘導剤。7. A CT for obtaining a cytotoxic T lymphocyte (CTL) according to claim 2, which comprises the HLA-A24-restricted antigen peptide according to claim 1 as an active ingredient.
L inducer.
原ペプチドを有効成分として含有してなる制癌剤。8. An anti-cancer agent comprising the HLA-A24-restricted antigenic peptide according to claim 1 as an active ingredient.
有効成分として含有してなる制癌剤。9. An anti-cancer agent comprising the cytotoxic T lymphocyte according to claim 2 as an active ingredient.
抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表
面に提示してなる抗原提示細胞。10. An antigen-presenting cell obtained by presenting a complex of the HLA-A24-restricted antigenic peptide according to claim 1 and an HLA-A24 molecule on the cell surface.
成分として含有してなる、請求項２記載の細胞傷害牲Ｔ
リンパ球（ＣＴＬ）を得るためのＣＴＬ誘導剤。11. The cytotoxic T according to claim 2, which comprises the antigen-presenting cell according to claim 10 as an active ingredient.
A CTL inducer for obtaining lymphocytes (CTL).
成分として含有してなる制癌剤。12. An anticancer agent comprising the antigen presenting cell according to claim 10 as an active ingredient.
と被検細胞とを接触させ、それにより、ＣＴＬによる細
胞溶解、サイトカイン遊離及びＣＴＬの増殖からなる群
より選ばれた変化が生じる場合、該被検細胞が、請求項
２記載の細胞傷害性Ｔリンパ球に感受性のある細胞（感
受性細胞）であることの指標とすることを特徴とする、
細胞傷害性Ｔリンパ球の感受性細胞の検出方法。13. When the cytotoxic T lymphocyte of claim 2 is contacted with a test cell, which causes a change selected from the group consisting of cell lysis by CTLs, cytokine release and proliferation of CTLs. The test cell is used as an indicator that it is a cell (sensitive cell) sensitive to the cytotoxic T lymphocyte according to claim 2.
A method for detecting sensitive cells of cytotoxic T lymphocytes.
を有効成分として含有してなる、細胞傷害性Ｔリンパ球
の感受性細胞の検出剤。14. An agent for detecting a cytotoxic T lymphocyte-sensitive cell, which comprises the cytotoxic T lymphocyte according to claim 2 as an active ingredient.
抗原ペプチドの存在下、請求項２記載の細胞傷害性Ｔリ
ンパ球と被検細胞とを接触させることを特徴とする、被
検細胞におけるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ
２４分子の検出方法。15. A test cell, which comprises contacting the cytotoxic T lymphocyte of claim 2 with a test cell in the presence of the HLA-A24-restricted antigenic peptide of claim 1. Human major histocompatibility complex (HLA) -A
A method for detecting 24 molecules.
抗原ペプチドをコードしてなる核酸。16. A nucleic acid encoding the HLA-A24-restricted antigenic peptide according to claim 1.
核酸及び／又は抗原タンパク質をコードする核酸を細胞
に導入する工程を含む、細胞傷害性Ｔリンパ球により傷
害を受ける標的細胞の調製方法。17. A method for preparing a target cell damaged by cytotoxic T lymphocytes, which comprises the step of introducing into a cell a nucleic acid encoding a human major histocompatibility antigen and / or a nucleic acid encoding an antigen protein.
スベクターを介して実施される、請求項１７記載の調製
方法。18. The preparation method according to claim 17, wherein the introduction of the nucleic acid into the cell is performed via an adenovirus vector.
核酸が、ＨＬＡ−Ａ２４をコードする核酸である、請求
項１７又は１８記載の調製方法。19. The preparation method according to claim 17 or 18, wherein the nucleic acid encoding a human major histocompatibility antigen is a nucleic acid encoding HLA-A24.
請求項１６記載の核酸である、請求項１７〜１９いずれ
かに記載の調製方法。20. A nucleic acid encoding an antigen protein,
The preparation method according to any one of claims 17 to 19, which is the nucleic acid according to claim 16.
製方法により得られる、細胞傷害性Ｔリンパ球により傷
害を受ける標的細胞。21. A target cell that is damaged by cytotoxic T lymphocytes, which is obtained by the method according to any one of claims 17 to 20.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009520477A (en) * | 2005-12-21 | 2009-05-28 | セントクローネ エービー | Improved expansion of tumor-reactive T lymphocytes for immunotherapy of cancer patients |
| CN109988748A (en) * | 2017-12-29 | 2019-07-09 | 深圳华大生命科学研究院 | A method of tumor specific T cells are screened from TIL |
| JP2023509527A (en) * | 2020-01-10 | 2023-03-08 | エルジー・ケム・リミテッド | Compositions comprising antigen-presenting cells co-expressing MHC and tumor antigens and cancer treatment using the same |
-
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- 2002-03-29 JP JP2002093493A patent/JP2003000242A/en active Pending
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