JP5135646B2 - Interferon gamma removal material, interferon gamma removal column, and interferon gamma removal method - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターフェロンガンマ除去材料およびそれを用いたインターフェロンガンマ除去カラムに関する。特にヒト血液中のインターフェロンガンマを除去する事により、炎症などの病態を改善させる用途に好適に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
インターフェロン（ＩＦＮ）は抗ウィルス作用のあるサイトカインであり、α、β、γの３型がある。サイトカインとは、生体のさまざまな高次機能を維持する上で重要な細胞間情報伝達物質（糖タンパク）である。サイトカインは、免疫系、造血系、内分泌系、神経系などで作用する事が知られているが、それぞれのサイトカインは多機能であると共に、サイトカイン同士で機能の重複が見られ、複雑なネットワークを形成している。このうちインターフェロンについては、多くの免疫反応を制御することが明らかとなった。
【０００３】
炎症とは、さまざまな侵襲に対する基本的な生体防御反応である。その引き金となるのは炎症時に誘導される各種サイトカインである。インターロイキン１や腫瘍壊死因子、インターフェロンガンマ（以下ＩＦＮ−γと略す）などは炎症性サイトカインと呼ばれている。これらの炎症性サイトカインが脳内視床下部の体温中枢に作用して、炎症局所での発熱を誘導し、骨髄では貯留白血球を動員し、骨髄系細胞の増殖を促進する。さらに、肝臓に作用して急性期反応タンパク質の産生を誘導する。この様に、炎症性サイトカインをきっかけとして、種々の反応がはじまり、炎症局所への白血球の浸潤が起こる。組織へ浸潤した白血球はさまざまなプロテアーゼ、活性酸素、アラキドン酸代謝物、一酸化窒素などを産生することによって、組織破壊を引き起こす。こうして局所での炎症は全身の反応へと広がっていく。このことからも、ＩＦＮ−γなどの炎症性サイトカインが、炎症反応に重大な影響を与えているといえる。具体的には、感染した細菌の毒素による敗血症などの全身性炎症においても、ＩＦＮ−γなどの炎症性サイトカインが症状の増悪の一因となっている。
【０００４】
炎症に深く関わっていると考えられているリンパ球の一種であるヘルパーＴ細胞は大きくＴｈ１、Ｔｈ２と呼ばれる２つのグループに分化することがわかっている。この２つの細胞集団のアンバランスが、さまざまな免疫関連疾患の病態に関わるものと考えられている。単純に言えば、Ｔｈ１細胞は細胞障害性細胞であり、Ｔｈ２細胞は抗体産生を誘導する細胞であると言える。慢性の炎症性疾患である慢性関節リウマチや、Ｉ型（インスリン依存性）糖尿病などの自己免疫疾患ではＩＦＮ−γなどを産生するＴｈ１に、気管支喘息やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患ではインターロイキン４（以下ＩＬ−４と略す）などを産生するＴｈ２に偏っているといわれている。また、ＩＦＮ−γはＴｈ１への分化を促進してＴｈ２への分化を抑制し、ＩＬ−４はＴｈ２への分化を促進してＴｈ１への分化を抑制するという作用があり、２者は相互抑制的な関係にある。これらのことから、ＩＦＮ−γやＩＬ−４などは、免疫応答をその物質量で制御するだけでなく、免疫応答様式という質的な制御にも関与していると考えられている。このことからも、自己免疫疾患における炎症反応において、ＩＦＮ−γが重要な役割を果たしていると言える。
【０００５】
サイトカインを吸着する材料としては、特開平１０−１４７５１８号公報に報告されているが、血漿中のＩＦＮ−γを高効率で除去できる材料は報告されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はかかる炎症を引き起こすと言われている炎症性サイトカインの１つであるＩＦＮ−γを除去するための材料、およびそれを用いた除去カラムを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、生理活性物質が水不溶性担体に固定化されてなるＩＦＮ−γ除去材料である。
【０００８】
また本発明は、上記の材料を内蔵してなるＩＦＮ−γ除去カラムである。
【０００９】
また本発明は、上記のカラムにＩＦＮ−γを含む液体を通過させる、ＩＦＮ−γ除去方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明においては、ＩＦＮ−γ除去材料を提供することができる。本発明のＩＦＮ−γ除去材料は、生理活性物質が水不溶性担体に固定化されてなることが重要である。
【００１１】
本発明でいう生理活性物質とは、生物体内に含まれる物質で、その生理現象を促進あるいは抑制する機能を持ち、また、他の生物体の生命現象あるいは生物体相互の係わり合いに影響を及ぼす物質の総称である。具体的には、抗生物質やホルモン、ポリペプチド、多糖類、核酸等をいう。抗生物質としては、ポリミキシン、バンコマイシン、アクチノマイシン、バイオマイシン等が上げられ、ポリペプチドとしては、アルブミン、プロテインＡなどが上げられる。中でも該ポリミキシンとはBacillus Polymixaにより産生される抗生物質であり、ポリミキシンＡ、ポリミキシンＢ、ポリミキシンＤ、ポリミキシンＥ等のタイプがあり、グラム陰性菌に対して抗菌作用を有する。
【００１２】
本発明に用いられる不溶性担体の材料としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリイミド、ポリ（芳香族ビニル化合物）、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリテトラフルオロエチレンなどの合成高分子や、セルロース、コラーゲン、キチン、キトサン、デキストランおよびそれらの誘導体を含む天然高分子、などが好適に用いられる。さらに、金属、セラミックス、ガラスなどの無機材料を適当な高分子で被覆したり、表面を直接修飾したものも好適に用いられる。
【００１３】
特に、ポリスチレン、架橋ポリスチレン、アクリル酸・アクリロニトリル共重合体、カルボキシル基を有するポリビニルアルコールから選ばれるものを含むのが、官能基の導入が特に容易な点で好ましい。
【００１４】
本発明の材料の形状としては、繊維状、ビーズ状、平膜状、紛状などを用いることができるが、特に血球と血漿とを分離せずにカラムに循環する全血体外循環にも適している点で、繊維状やビーズ状のものが好ましく用いられる。更に繊維状としては、中空糸状や海島状が好ましい。海島状は海成分として上記のような官能基の導入が容易なものを用い、島成分として加工性と耐久性に優れたものを用いて補強することができる。例えば、海成分としてはポリスチレン、島成分としてはポリプロピレン等を用いることができる。
【００１５】
吸着率を上げるには、多孔性等、接触面積の大きいものが好ましい。更に、体外循環に用いるようなカラムに充填する場合には、圧損を抑えるよう考慮することも好ましい。例えばビーズとしては、粒径が５０〜１０００μｍのものが好ましく、２００〜７００μｍのものがさらに好ましい。また繊維状としては、体外循環に用いることを想定した場合、０．１〜１００ｍ²／ｇの表面積のものが好ましい。表面積はベット法によって測定されるものとする。
【００１６】
ＩＦＮ−γの吸着率は、繊維状のものであれば２５ｍｇ、ビーズ状のもであれば２００μｌに対して、２５０ｐｇ／ｍｌの濃度のＩＦＮ−γ添加正常ヒト血清１ｍｌを３７℃で２時間反応させたときの吸着率で示した場合、３０％以上、好ましくは５０％以上であることが望ましい。
【００１７】
上記のようなＩＦＮ−γ除去材料を容器に内蔵させ、ＩＦＮ−γ除去カラムとすることができる。
その態様の１例としては、本発明の繊維状のＩＦＮ−γ除去材料を布状とし、中空で軸表面に孔が形成された中心軸に巻き付けてカラムに詰め、中心軸内部にＩＦＮ−γを含有する液体を流し、中心軸に形成された孔から処理液を外部に流出するような構造のものが、効率よくＩＦＮ−γを吸着・除去できる点で好ましい。
【００１８】
本発明の除去カラムに、ＩＦＮ−γを含む血液や血漿等の液体を体外循環等で通過させることにより、ＩＦＮ−γを除去することができる。
【００１９】
本発明により、例えば炎症を引き起こしている患者の体液からＩＦＮ−γを人為的に除去することができ、炎症性疾患治療などの用途に好適に用いることができる。
【００２０】
【実施例】
以下に実施例を用いて詳細な検討を加えるが、発明の内容が実施例に限定されるものではない。
【００２１】
（ＩＦＮ−γ吸着率の測定法）
繊維状のものであれば２５ｍｇ、ビーズ状のもであれば２００μｌを用い、ＩＦＮ−γ２５０ｐｇ／ｍｌを添加した正常ヒト血清１ｍｌに３７℃で２時間浸漬させ、吸着除去前の血清中と吸着除去後の血清中とのＩＦＮ−γを酵素免疫測定法で測定した。吸着除去前の血清中のＩＦＮ−γ濃度をＡ、吸着除去後の血清中のＩＦＮ−γ濃度をＢとして、（Ａ−Ｂ／Ａ）Ｘ１００でＩＦＮ−γ吸着率（％）を算出した。
【００２２】
（実施例１）
ポリプロピレン（三井“ノーブレン”Ｊ３ＨＧ）５０重量部を島成分とし、ポリスチレン（“スタイロン”６６６）４６重量部、ポリプロピレン（住友“ノーブレン”ＷＦ−７２７−Ｆ）４重量部の混合物を海成分とする海島型複合繊維（島数１６、単糸繊度２．６デニール、引張強度２．９ｇ／ｄ、伸度５０％、フィラメント数４２）５０ｇを、Ｎ−メチロ−ル−α−クロルアセトアミド９０．５g、ニトロベンゼン６００g、９８％硫酸６００ｇおよびパラホルムアルデヒド１．２９gからなる混合溶液中に浸し、１０℃で２時間反応させた。繊維を反応液から取り出し、１０５０gのニトロベンゼンで洗浄した後、８５０ｍｌの水で洗浄し、次に２４％ＮａＯＨ溶液２５ｍｌで中和を行った。この繊維を１０００ｍｌのメタノールで洗浄し、最後に温水洗浄を行った。
【００２３】
上記で得られたクロルアセトアミドメチル化繊維に、ポリミキシンＢ（ＤＵＭＥＸ社製）１．０２ｇを６５０mlの水にとかしたものと０．１Ｎ ＮａＯＨ２５ｍｌを加え、１時間振とうし固定化反応を行った。反応した繊維は０．０７７Ｎ−塩酸６５０ｍｌで３回洗浄した後に、水６５０ｍｌで３回洗浄し、ポリミキシン固定化繊維を得た。ポリミキシン固定化量はアミノ酸分析法から６ｍｇ／ｇであった。
【００２４】
上記で得られたポリミキシン固定化繊維を蒸気滅菌し２５ｍｇにカットし、上記ＩＦＮ−γ吸着率の測定法に従い、ＩＦＮ−γの吸着率を算出した。その結果、ＩＦＮ−γの吸着率は８２．７％で、生理活性物質を固定化した担体によって、血清中のＩＦＮ−γがよく吸着除去された。
【００２５】
【発明の効果】
本発明により、ＩＦＮ−γ除去材料を提供することができた。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an interferon gamma removing material and an interferon gamma removing column using the same. In particular, it is suitably used for the purpose of improving pathological conditions such as inflammation by removing interferon gamma in human blood.
[0002]
[Prior art]
Interferon (IFN) is an antiviral cytokine and has three types: α, β, and γ. Cytokines are intercellular signal transmitters (glycoproteins) that are important for maintaining various higher-order functions of living bodies. Cytokines are known to act in the immune system, hematopoietic system, endocrine system, nervous system, etc., but each cytokine is multifunctional, and there is duplication of functions between cytokines, creating a complex network. Forming. Of these, interferon has been shown to control many immune responses.
[0003]
Inflammation is a basic biological defense reaction against various invasions. The trigger is various cytokines induced during inflammation. Interleukin 1, tumor necrosis factor, interferon gamma (hereinafter abbreviated as IFN-γ) and the like are called inflammatory cytokines. These inflammatory cytokines act on the body temperature center in the hypothalamus in the brain to induce fever in the local area of inflammation, recruit the leukocytes in the bone marrow, and promote the proliferation of myeloid cells. In addition, it acts on the liver to induce the production of acute phase response proteins. In this way, various reactions are triggered by inflammatory cytokines, and leukocyte infiltration into the inflamed area occurs. Leukocytes that infiltrate tissues cause tissue destruction by producing various proteases, active oxygen, arachidonic acid metabolites, nitric oxide, and the like. In this way, local inflammation spreads to systemic reactions. From this fact, it can be said that inflammatory cytokines such as IFN-γ have a significant influence on the inflammatory reaction. Specifically, inflammatory cytokines such as IFN-γ contribute to exacerbation of symptoms even in systemic inflammation such as sepsis caused by infected bacterial toxins.
[0004]
It has been found that helper T cells, which are a type of lymphocyte thought to be deeply involved in inflammation, are largely differentiated into two groups called Th1 and Th2. This imbalance between the two cell populations is thought to be involved in the pathology of various immune related diseases. Simply put, Th1 cells are cytotoxic cells, and Th2 cells are cells that induce antibody production. In the case of rheumatoid arthritis, which is a chronic inflammatory disease, and in autoimmune diseases such as type I (insulin-dependent) diabetes, Th1 produces IFN-γ and in the case of allergic diseases such as bronchial asthma and atopic dermatitis. It is said that it is biased toward Th2 which produces leukin 4 (hereinafter abbreviated as IL-4) and the like. In addition, IFN-γ promotes differentiation into Th1 and suppresses differentiation into Th2, and IL-4 promotes differentiation into Th2 and inhibits differentiation into Th1. Inhibiting relationship. From these facts, IFN-γ, IL-4 and the like are considered to be involved not only in controlling the immune response by the amount of substance but also in the qualitative control of the immune response mode. This also suggests that IFN-γ plays an important role in the inflammatory reaction in autoimmune diseases.
[0005]
As a material for adsorbing cytokines, JP-A-10-147518 has been reported, but no material capable of removing IFN-γ in plasma with high efficiency has been reported.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a material for removing IFN-γ, which is one of inflammatory cytokines that are said to cause such inflammation, and a removal column using the same.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention is an IFN-γ removing material in which a physiologically active substance is immobilized on a water-insoluble carrier.
[0008]
Moreover, this invention is an IFN-gamma removal column which incorporates said material.
[0009]
The present invention is also a method for removing IFN-γ, wherein a liquid containing IFN-γ is passed through the column.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, an IFN-γ removing material can be provided. In the IFN-γ removing material of the present invention, it is important that a physiologically active substance is immobilized on a water-insoluble carrier.
[0011]
The physiologically active substance referred to in the present invention is a substance contained in a living organism, has a function of promoting or suppressing the physiological phenomenon, and affects the life phenomenon of other living organisms or the relationship between organisms. A general term for substances. Specifically, it refers to antibiotics, hormones, polypeptides, polysaccharides, nucleic acids and the like. Examples of antibiotics include polymyxin, vancomycin, actinomycin, and biomycin. Examples of polypeptides include albumin and protein A. Among them, the polymyxin is an antibiotic produced by Bacillus Polymixa, which includes polymyxin A, polymyxin B, polymyxin D, polymyxin E, and the like, and has an antibacterial action against gram-negative bacteria.
[0012]
Insoluble carrier materials used in the present invention include synthetic polymers such as polystyrene, polypropylene, polyamide, polyimide, poly (aromatic vinyl compound), polyester, polymethyl methacrylate, polysulfone, polyethylene, polyvinyl alcohol, and polytetrafluoroethylene. In addition, natural polymers including cellulose, collagen, chitin, chitosan, dextran, and derivatives thereof are preferably used. Furthermore, a material in which an inorganic material such as metal, ceramics or glass is coated with an appropriate polymer or the surface is directly modified is also preferably used.
[0013]
In particular, it is preferable to include those selected from polystyrene, cross-linked polystyrene, acrylic acid / acrylonitrile copolymer, and polyvinyl alcohol having a carboxyl group from the viewpoint of easy introduction of functional groups.
[0014]
As the shape of the material of the present invention, a fiber shape, a bead shape, a flat membrane shape, a powder shape and the like can be used. In view of this, a fibrous or bead-like one is preferably used. Further, the fiber shape is preferably a hollow fiber shape or a sea island shape. The sea-island shape can be reinforced using a sea component that allows easy introduction of functional groups as described above, and an island component that is excellent in processability and durability. For example, polystyrene can be used as the sea component, and polypropylene or the like can be used as the island component.
[0015]
In order to increase the adsorption rate, those having a large contact area such as porosity are preferred. Furthermore, when packing a column used for extracorporeal circulation, it is also preferable to consider so as to suppress pressure loss. For example, the beads preferably have a particle size of 50 to 1000 μm, more preferably 200 to 700 μm. In addition, the fibrous form preferably has a surface area of 0.1 to 100 m ² / g when used for extracorporeal circulation. The surface area shall be measured by the bed method.
[0016]
The IFN-γ adsorption rate was 25 mg for fibers and 200 μl for beads, and 1 ml of normal human serum with IFN-γ added at a concentration of 250 pg / ml was reacted at 37 ° C. for 2 hours. When it is shown by the adsorption rate when it is used, it is desirably 30% or more, preferably 50% or more.
[0017]
The IFN-γ removal material as described above can be incorporated in a container to form an IFN-γ removal column.
As an example of the embodiment, the fibrous IFN-γ removing material of the present invention is made into a cloth shape, wound around a hollow central axis having a hole formed on the shaft surface, packed in a column, and IFN-γ inside the central axis. A structure in which a liquid containing nitrogen is allowed to flow and the processing liquid flows out through a hole formed in the central axis is preferable in that IFN-γ can be efficiently adsorbed and removed.
[0018]
By passing a liquid such as blood or plasma containing IFN-γ through the extracorporeal circulation through the removal column of the present invention, IFN-γ can be removed.
[0019]
According to the present invention, for example, IFN-γ can be artificially removed from the body fluid of a patient causing inflammation, and can be suitably used for applications such as inflammatory disease treatment.
[0020]
【Example】
Although detailed examination is added below using examples, the contents of the invention are not limited to the examples.
[0021]
(Measurement method of IFN-γ adsorption rate)
If it is fibrous, use 25 mg, and if it is beads, use 200 μl, immerse in 1 ml of normal human serum to which IFN-γ 250 pg / ml has been added for 2 hours at 37 ° C. The serum IFN-γ afterwards was measured by enzyme immunoassay. Assuming that the IFN-γ concentration in the serum before adsorption removal is A and the IFN-γ concentration in the serum after adsorption removal is B, the IFN-γ adsorption rate (%) was calculated by (AB / A) X100.
[0022]
Example 1
Sea island containing 50 parts by weight of polypropylene (Mitsui “Noblen” J3HG) as an island component, 46 parts by weight of polystyrene (“Styron” 666) and 4 parts by weight of polypropylene (Sumitomo “Noblen” WF-727-F) as sea components 50 g of type composite fiber (16 islands, single yarn fineness 2.6 denier, tensile strength 2.9 g / d, elongation 50%, filament number 42), 90.5 g of N-methylol-α-chloroacetamide, It was immersed in a mixed solution consisting of 600 g of nitrobenzene, 600 g of 98% sulfuric acid and 1.29 g of paraformaldehyde, and reacted at 10 ° C. for 2 hours. The fiber was removed from the reaction solution, washed with 1050 g of nitrobenzene, washed with 850 ml of water, and then neutralized with 25 ml of 24% NaOH solution. The fiber was washed with 1000 ml of methanol and finally washed with warm water.
[0023]
To the chloroacetamidomethylated fiber obtained above, 1.02 g of polymyxin B (manufactured by DUMEX) dissolved in 650 ml of water and 25 ml of 0.1N NaOH were added, and the mixture was shaken for 1 hour for immobilization reaction. The reacted fiber was washed 3 times with 650 ml of 0.077N-hydrochloric acid and then washed 3 times with 650 ml of water to obtain a polymyxin-immobilized fiber. The amount of polymyxin immobilized was 6 mg / g based on the amino acid analysis method.
[0024]
The polymyxin-immobilized fiber obtained above was steam sterilized and cut to 25 mg, and the IFN-γ adsorption rate was calculated according to the above IFN-γ adsorption rate measurement method. As a result, the adsorption rate of IFN-γ was 82.7%, and IFN-γ in the serum was well adsorbed and removed by the carrier on which the physiologically active substance was immobilized.
[0025]
【Effect of the invention】
According to the present invention, an IFN-γ removing material could be provided.

Claims (5)

抗生物質が水不溶性担体に固定化されてなるインターフェロンガンマ除去材料。 An interferon gamma removing material in which an antibiotic is immobilized on a water-insoluble carrier. 前記水不溶性担体が、繊維状の形態を持つ請求項１記載のインターフェロンガンマ除去材料。The interferon gamma removing material according to claim 1, wherein the water-insoluble carrier has a fibrous form. 前記水不溶性担体が、ビーズ状の形態を持つ請求項１記載のインターフェロンガンマ除去材料。The interferon gamma removing material according to claim 1 , wherein the water-insoluble carrier has a bead-like form. 前記水不溶性担体が、ポリスチレン、架橋ポリスチレン、アクリル酸・アクリロニトリル共重合体及びカルボキシル基を有するポリビニルアルコールから選ばれるものを含む請求項１〜３のいずれか一項記載のインターフェロンガンマ除去材料。The interferon gamma removing material according to any one of claims 1 to 3, wherein the water-insoluble carrier includes a material selected from polystyrene, crosslinked polystyrene, an acrylic acid / acrylonitrile copolymer, and a polyvinyl alcohol having a carboxyl group. 請求項１〜４のいずれか一項記載の材料を内蔵してなるインターフェロンガンマ除去カラム。The interferon gamma removal column which contains the material as described in any one of Claims 1-4 .