JP5114637B2 - 小細胞肺癌の判定方法 - Google Patents
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規な組成物、方法および使用(例えば、特許文献1参照)や、肝炎ウイルスの感染に起因し慢性肝炎または肝硬変を発症した患者に対し、肝炎ウイルスに感染した患者のミトコンドリアDNAの塩基配列を評価することによって肝臓癌の発癌リスクを評価する方法(例えば、特許文献2参照)や、その遺伝子産物がCLL細胞および前立腺癌細胞の新生物性または腫瘍形成性増殖を抑制するmiR15およびmiR16のコピー数、変異状態または遺伝子発現を検出することによる慢性リンパ性白血病または前立腺癌の診断方法(例えば、特許文献3参照)や、無症候性期または初期段階の患者における発癌過程の存在を検出するのに適当な迅速な癌の診断方法や、癌患者の血清中に存在する炭酸脱水酵素IIの活性化化合物、すなわち腫瘍マーカー、該癌の診断方法によって、無症候性期または初期段階の患者の癌を検出することを特徴とする癌の処置方法;ならびに該癌の診断方法を行うためのキット(例えば、特許文献4参照)等が知られている。
実施例では9種類の培養細胞株を用いた。いずれの培養細胞株もヒト肺癌由来のものであり、小細胞癌としてSBC−3、SBC−5、腺癌としてNCI−H650、NCI−H1650、大細胞癌としてNCI−H661、NCI−H1581、NCI−H460、扁平上皮癌としてNCI−H2170、NCI−H1869を用いた。SBC−3の培養上清を分析し、他の培養上清と比較することで腫瘍マーカーの候補を検索した。これらの細胞株は、American Type Culture Collection (ATCC社)又は財団法人ヒューマン振興財団から入手することができる。
培養上清は以下のように回収した。各々の細胞を1×106となるよう10cmシャーレに播種し、一晩インキュベートして細胞をシャーレに接着させた。培地は10%のウシ胎児血清(fetal bovine serum:FBS)を含むRPMI1640(Sigma社製)を用いた。次にリン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline:PBS)で2回洗浄した後、FBSを含まないRPMI1640培地に交換した。系内にFBSが存在すると測定誤差が大きくなるため、実施例では無血清培地を使用した。RPMI1640培地で1時間インキュベートした後、培地を捨て、PBSでさらに2回洗浄し、RPMI1640培地を7ml加えた。48時間インキュベートした後この培地を回収し、実験に用いた。
SBC3培養細胞株の培養上清のMSスペクトルを測定した。培養上清1mlに対し、ZipTip(Millipore社製)を用いて脱塩・濃縮を行い、MSスペクトルを測定した。MSスペクトルはApplied Biosystems社製4700MALDI TOF/TOF質量分析計を用いて測定した。対照として細胞と接触していない培地を上述と同様の処理を行い、MSスペクトルを測定した。結果を図1に示す。図のように培養上清では分子量1000−10000付近に培地には存在しない分子が多く観測された。これらの分子はSBC3細胞が生成し、放出したものであると考えられる。また分子量から類推すると直接MS/MSスペクトルを測定し、タンパク質の配列を決定するためには分子量が大きすぎることが分かった。
SBC3培養上清中のタンパク質を、カラムクロマトグラフィーを用いて分離・精製した。カラムクロマトグラフィーシステムとしてProteomeLab PF2D(ベックマン社製)を、カラムとしてMightysil RP−18GP250−4.6(5μm:関東化学社製)を用いた。溶出曲線を図2に示す。図のように保持時間が18−19分前後に培地には無いピークが検出された。これらの全画分を回収し、MSスペクトルを測定した。一例として18−19分前後に溶出した画分のMSスペクトルを図3に示す。図のように分子量17300前後の分子が観測された。
カラムクロマトグラフィーで得られた18−19分前後の画分中のタンパク質をトリプシン消化し、MS/MS測定を行うことによって、タンパク質の配列を決定した。トリプシン消化は以下のように行った。得られた画分を減圧下で遠心濃縮し、0.2% RapiGest(Waters社製)を15μl加えタンパク質を溶解した。これにトリプシン溶液(8.3ng/μl、50mM 炭酸水素アンモニウム)を15μl加え37℃で1時間インキュベートした。500mM 塩酸3μlを加えて反応を停止した後、ZipTipを用いて脱塩を行い、MSスペクトルを測定した。MSスペクトルの結果を図4に示す。分子量17300前後のピークは観測されなかったことから、トリプシン消化が行われ、タンパク質が断片化していることが分かる。
他の小細胞癌としてSBC5の培養上清を上述の方法を用いて分析したところ、SBC3と同様にproNT/NMNの放出が確認できた。さらに、3種類の大細胞癌、2種類の腺癌、2種類の扁平上皮癌ではproNT/NMNの放出は検出できなかった。以上のことよりproNT/NMNは小細胞肺癌特異的なマーカーとして期待できると言える。なお、正常者の肺由来の細胞からproNT/NMNの放出は報告されていない。
また、SBC3培養上清を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、得られたタンパク質画分をトリプシンのみ、あるいはトリプシンとV8プロテアーゼの2種類の酵素で消化した。消化されたタンパク質断片(ペプチド)に対し、nanoLC−ESI−LIT−TOF質量分析計 NanoFrontier((株)日立ハイテクノロジーズ社製)での測定を行った。トリプシン消化は以下のように行った。
また、トリプシンとV8プロテアーゼの2種類の酵素での処理には、トリプシン溶液30μlのかえて、トリプシン・V8プロテアーゼ混合液30μl(トリプシンが1μg、V8プロテアーゼが1μg含まれた50mM炭酸水素アンモニウム溶液)を用いた。
proNT/NMNは分子内にNeurotensin(NT)、Neuromedin N(NMN)、Large Neuromedin N(Large NMN)の配列を有する(図10)。そこで、SBC3を無血清培養した培養上清、SBC−3を血清培養した培養上清、SBC3の細胞破砕液を泳動し、NT、Large NMNに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った(図11)。
抗体を使ってproNT/NMNが検出できたため、今後ELISAなど汎用の臨床検査を用いてもproNT/NMNが検出できる可能性を示している。
Claims (4)
- ヒトから採取した生体試料中の、配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドの発現量を測定することを特徴とする小細胞肺癌の判定方法。
- 肺癌患者から採取した生体試料中の、配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドの発現量を測定することを特徴とする小細胞肺癌再発のリスク評価方法。
- 抗癌剤を服用している小細胞肺癌患者から採取した生体試料中の、配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドの発現量を測定することを特徴とする抗癌剤の有効性の判定方法。
- ヒト小細胞肺癌培養細胞株を被検物質の存在下に培養し、細胞溶解物中の、配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価することを特徴とする小細胞肺癌の抑制剤・治療剤のスクリーニング方法。
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