JP5098086B2 - ケトース3−エピメラーゼとその製造方法並びに用途 - Google Patents
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Description
(1)D−又はL−ケトヘキソースの3位をエピマー化し、対応するD−又はL−ケトヘキソースを生成する。D−又はL−ケトペントースの3位をエピマー化し、対応するD−又はL−ケトペントースを生成する。
(2)D−又はL−ケトヘキソース及びD−又はL−ケトペントースの中ではD−フラクトース及びD−プシコースに対する基質特異性が最も高い。
●:1mM Mn2+イオン非存在下
○:1mM Mn2+イオン存在下
図5において、
f1 ori:f1ファージ複製起点
Kanr:カナマイシン耐性遺伝子
lacI:lacリプレッサー
(1)分子量
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、30,000±3,000ダルトンを示す。
(2)至適pH
45℃、30分間反応、1mM Mn2+イオン存在下の条件下で、pH9.0乃至9.5
(3)至適温度
pH8.0、30分間反応、1mM Mn2+イオン非存在下の条件下で、約50℃
1mM Mn2+イオン存在下で、約65℃
(4)pH安定性
30℃、60分間保持、1mM Mn2+イオン非存在下の条件下で、少なくともpH8乃至10の範囲で安定
1mM Mn2+イオン存在下で、pH4.5乃至9.5の範囲で安定
(5)温度安定性
pH8.0、10分間保持、1mM Mn2+イオン非存在下の条件下で、約50℃以下で安定
1mM Mn2+イオン存在下で、約75℃以下で安定
(6)金属イオンによる活性化
Mn2+及びMg2+イオンにより活性化される
澱粉部分分解物(商品名「パインデックス#4」、松谷化学工業株式会社販売)1.5%(w/v)、マルトース(商品名「サンマルトS」、株式会社林原商事販売)0.1%(w/v)、酵母エキス(商品名「酵母エキスS」、日本製薬株式会社販売)0.1%(w/v)、ポリペプトン(商品名「ポリペプトンS」、日本製薬株式会社販売)0.5%(w/v)、リン酸水素二カリウム0.1%(w/v)、リン酸二水素ナトリウム0.06%(w/v)、硫酸マグネシウム0.05%(w/v)、硫酸第一鉄0.001%(w/v)、硫酸マンガン0.001%(w/v)及び脱イオン水からなる液体培地を30L−容ジャーファーメンターに20L入れ、120℃、20分間滅菌した後、リゾビウム・レグミノサラム ATCC14480の種培養液1%(v/v)を無菌的に添加し、通気撹拌しながら27℃で72時間培養した。得られた培養液中のケトース3−エピメラーゼ活性は約1.0単位/ml−培養液であった。
実験1で得た培養液約10Lから遠心分離して菌体を集め、これを20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)1Lに懸濁し、細胞破砕機ダイノミル(ベッコーフェン製)を用いて破砕した。得られた菌体破砕懸濁液を遠心分離し、上清を回収して菌体破砕抽出液とした。菌体破砕抽出液は、20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に対して透析した後、セパビーズ(Sepabeads) FP−DA13(三菱化学株式会社製)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー(ゲル容量800ml)に供し、吸着したケトース3−エピメラーゼを食塩濃度0Mから0.6Mのリニアグラジエントで溶出させた。得られた活性画分を回収し、終濃度1Mとなるように硫安を添加し、ブチル−トヨパール(Butyl−Toyopearl) 650M(東ソー株式会社製)を用いた疎水クロマトグラフィー(ゲル容量100ml)に供したところ、ケトース3−エピメラーゼは吸着せず非吸着画分に溶出した。活性画分を20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に透析し、DEAE−トヨパール(Toyopearl) 650S(東ソー株式会社製)を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー(ゲル容量100ml)に供し、吸着したケトース3−エピメラーゼを食塩濃度0Mから0.6Mのリニアグラジエントで溶出させた。得られた活性画分を濃縮し、トヨパール HW−55S(東ソー株式会社製)を用いるゲル濾過クロマトグラフィー(ゲル容量300ml)に供し活性画分を回収した。得られた活性画分は、さらにリソース(Resouce) PHE(アマシャム・バイオサイエンス社製)を用いた疎水クロマトグラフィー、リソース Q(アマシャム・バイオサイエンス社製)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー及びスーパーデックス(Superdex) 200 HR26/60(アマシャム・バイオサイエンス社製)を用いたゲル濾過クロマトグラフィーに供して精製し、ケトース3−エピメラーゼ精製標品を得た。精製工程を表1にまとめた。
実験2の方法で得たケトース3−エピメラーゼ精製標品をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(5乃至20%(w/v)濃度勾配)に供し、同時に泳動した分子量マーカー(日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製)と比較して分子量を測定したところ、ケトース3−エピメラーゼの分子量は30,000±3,000ダルトンであることが判明した。
実験2の方法で得たケトース3−エピメラーゼ精製標品を用いて、ケトース3−エピメラーゼ活性に及ぼすpH、温度の影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図1(至適pH)、図2(至適温度)に示した。本発明のケトース3−エピメラーゼの至適pHは、45℃、30分間反応、1mM Mn2+イオン存在下の条件でpH9.0乃至9.5であった。至適温度はpH8.0、30分間反応、1mM Mn2+イオン非存在下(図2における符号●)の条件で約50℃であり、1mM Mn2+イオン存在下(図2における符号○)では約65℃であることが判明した。
実験2の方法で得たケトース3−エピメラーゼ精製標品を用いて、ケトース3−エピメラーゼのpH安定性及び温度安定性を調べた。pH安定性は、酵素を1mM MnCl2添加又は無添加の各pHの10mM緩衝液中で30℃、60分間保持した後、pHを8.0に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。温度安定性は、1mM MnCl2添加又は無添加の20mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)を用い、酵素溶液を各温度に10分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図3(pH安定性)、図4(温度安定性)に示した。図3から明らかなように、本発明のケトース3−エピメラーゼのpH安定性は、1mM Mn2+イオンの非存在下(図3における符号●)では少なくともpH8乃至10の範囲で安定であることが判明した。pH10を越えると活性測定において、生成するD−フラクトースの定量に支障をきたすため、pH10を越える範囲の安定性は評価できなかった。一方、1mM Mn2+イオン存在下(図3における符号○)では、pH4.5乃至9.5の範囲で安定であることが判明した。また、図4から明らかなように、温度安定性は、1mM Mn2+イオン非存在下(図4における●)では約50℃以下で安定であり、1mM Mn2+イオン存在下(図4における○)では約75℃以下で安定であることが判明した。
実験2の方法で得た精製酵素標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を、1mMのMnCl2を含まない基質溶液を用い、濃度1mMの各種金属塩存在下で活性測定することにより調べた。金属塩の内、塩化鉄の2種(FeCl2及びFeCl3)及び塩化水銀(HgCl2)は反応液中のD−フラクトースの定量に悪影響を及ぼすため、これら3種の金属イオン存在下におけるD−フラクトースの生成量については、HPLCを用いて定量した。結果を表2に示す。
実験2の方法で得た精製ケトース3−エピメラーゼ標品を用いて、本酵素のN末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー モデル492HT(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて分析したところ、配列表における配列番号1で示されるアミノ酸配列、すなわち、メチオニン−グルタミン酸−グリシン−フェニルアラニン−グリシン−バリン−ヒスチジン−スレオニン−セリン−メチオニン を有していることが判明した。
ケトース3−エピメラーゼをコードするDNAをリゾビウム・レグミノサラム ATCC14480からクローニングし、自律複製可能な組換えDNAの作製、酵素をコードするDNAの塩基配列の決定、及び形質転換体の調製を行った。
D−マンニトール2w/v%、酵母エキス(商品名『Bacto−yeast extract』、Difco社販売)0.1w/v%、ペプトン(商品名『Bacto−peptone』、Difco社販売)、0.5w/v%、リン酸二カリウム0.1w/v%、リン酸一ナトリウム・2水塩0.1w/v%、硫酸マグネシウム・7水塩0.05w/v%及び水からなる液体培地(pH7.0)を、500ml容三角フラスコ20本に50mlずつ入れ、オートクレーブで121℃、20分間滅菌し、冷却して、リゾビウム・レグミノサラム ATCC14480を接種し、27℃、230rpmで2日間回転振盪培養した。
実験3−5で得たケトース3−エピメラーゼのN末端アミノ酸配列(配列表における配列番号1で示されるアミノ酸配列)に基づき、同アミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列を有する蛋白質を、相同性検索プログラム『BLAST』を用い、データベース『GenBank』を対象に検索したところ、N末端アミノ酸配列のアミノ酸残基10残基中9残基が一致するシノリゾビウム・メリロティ(Sinorhizobium meliloti)1021由来の未知蛋白質が認められ、この蛋白質も糖質のエピメラーゼと推察された。なお、当該未知蛋白質は配列表における配列番号4で示されるアミノ酸配列を有しており、配列表における配列番号5で示される塩基配列を有するDNAによりコードされていた。リゾビウム・レグミノサラム ATCC14480のケトース3−エピメラーゼのアミノ酸配列が全域にわたり上記未知蛋白質のアミノ酸配列と相同性が高いとの前提をもとに、ケトース3−エピメラーゼをコードするDNAのクローニングを試みた。
実験4−2で決定したケトース3−エピメラーゼをコードするDNAの塩基配列を確定させる目的で、当該DNAにおける翻訳開始コドン及び終始コドンを含むプライマーを合成し、実験4−1で得た染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、ケトース3−エピメラーゼをコードするDNAの再クローニングを行い、塩基配列を再度解析した。また、上記プライマーは、再クローン化したケトース3−エピメラーゼをコードするDNAを発現用ベクターに組込む目的で、当該DNAの上流に制限酵素Nde I認識部位を導入し、下流に制限酵素Eco RI認識部位を導入すべく設計した。
組換えDNA『pCRDPE6』中のケトース3−エピメラーゼをコードするDNAを発現用ベクターに挿入し、大腸菌において組換え型ケトース3−エピメラーゼを発現させ、その活性を調べた。
実験4−3で得たケトース3−エピメラーゼをコードするDNAを含む組換えDNA『pCRDPE6』を制限酵素Nde I及びEco RIにより消化し、70℃で30分間熱処理して制限酵素を失活させた。この消化物を用いて、予め制限酵素Nde I及びEco RIで消化した発現ベクター、pET−38b(+)(ノバジェン社製)に市販のキット(商品名「Ligation Kit Ver.2.1、宝酒造製)を用いて挿入した。この反応物を用いて大腸菌JM109(東洋紡製)を形質転換し、目的とする組換えDNAを保持する形質転換体を選択し、この形質転換体から組換えDNAを単離して『pETDPE1』と命名した。次いで、pETDPE1を図5に示す。pETDPE1を用いて発現用宿主大腸菌Rosetta(DE3)(ノバジェン社製)を形質転換して形質転換体『ETDPE1』を調製した。
10g/lトリプトン(商品名『Bacto−tryptone』、Difco社販売)、5g/l酵母エキス(商品名『Bacto−yeast extract』、Difco社販売)及び10g/l食塩及び水からなる液体培地を、500ml容三角フラスコに100mlずつ入れ、オートクレーブで121℃、20分間滅菌し、冷却して、無菌的にpH7.5に調整した後、カナマイシン2mgを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験5−1の方法で得た形質転換体ETDPE1を接種し、37℃で回転振盪培養して濁度が約0.6に達した時点でイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を終濃度0.4mMになるように添加してケトース3−エピメラーゼ遺伝子の発現を誘導し、さらに27℃で3時間培養した。得られた培養物を、常法に従い、遠心分離して菌体を回収した。次いで、菌体を20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー(モデルUH−600、株式会社エスエムテー製)で細胞破砕し、その破砕物の遠心上清を細胞破砕可溶性画分とした。
実験2の方法で得たケトース3−エピメラーゼの精製標品を用いて、当該酵素の基質特異性を、各種D−又はL−ケトヘキソース及びD−又はL−ケトペントースを用いて調べた。D−フラクトース、D−プシコース、D−タガトース、D−ソルボース、D−キシルロース、D−リブロース、L−フラクトース、L−プシコース、L−タガトース、L−ソルボース、L−キシルロース又はL−リブロースを、それぞれ終濃度1%(w/v)になるように1mMのMnCl2を含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に溶解したものを基質溶液とし、実験2の方法で得たケトース3−エピメラーゼ精製標品をD−プシコース3−エピメラーゼ活性として基質固形物1グラム当たり2単位又は20単位ずつ加え、45℃で17時間反応させた。100℃で10分間保持して反応を停止させた後、それぞれの基質から生成したエピマーの含量を高速液体クロマトグラフィー(以下、HPLCと略称する。)を用いて測定した。HPLCは、カラムに『MCI GEL CK08EC』(株式会社三菱化学製)を用い、溶離液に水を用いて、カラム温度75℃、流速0.6ml/分の条件で行い、検出は示差屈折計RID−10A(株式会社島津製作所製)を用いて行った。結果を表4に示す。
他のリゾビウム属に属する微生物の内、ケトース3−エピメラーゼ産生能の認められたリゾビウム・フレディ(Rhizobium fredii) ATCC35423及びリゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti) ATCC9930を実験1の場合と同様にファーメンターで培養した。それぞれの培養液約10Lを用いて、実験2の場合と同様に菌体を破砕し、遠心上清を回収し、続いて、透析、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに供して部分精製酵素を調製した。得られた部分精製酵素について実験3の場合と同様に酵素的性質を調べた。これらの結果を、前述のリゾビウム・レグミノサラム ATCC14480由来のケトース3−エピメラーゼの性質及び公知のシュードモナス・チコリ ST−24由来の酵素の性質(Ken Izumoriら、Biosci. Biotech. Biochem.,57,1037−1039(1993)より抜粋)とともに表5にまとめた。
実験1で用いた液体培地を30L−容ジャーファーメンターに約20L入れ、120℃、20分間滅菌した後、リゾビウム・フレディ ATCC35423の種培養液1%(v/v)を無菌的に添加し、通気撹拌しながら27℃で60時間培養した。得られた培養液中のケトース3−エピメラーゼ活性は約0.7単位/ml−培養液であった。培養液約18Lから遠心分離して菌体を集め、これを20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)1.5Lに懸濁し、細胞破砕機ダイノミル(ベッコーフェン製)を用いて破砕した。得られた菌体破砕懸濁液を遠心分離し、上清を回収して菌体破砕抽出液とした。菌体破砕抽出液は、実験2の方法に準じてDEAE−トヨパール 650S(東ソー株式会社製)を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの段階まで精製し、ケトース3−エピメラーゼ部分精製酵素標品として総活性で約7,200単位を得た。
常法により、リゾビウム・レグミノサラム ATCC14480を突然変異させ、ケトース3−エピメラーゼ高産生変異株を取得した。実験1で用いた液体培地を30L−容ジャーファーメンターに約20L入れ、120℃、20分間滅菌した後、上記変異株の種培養液1%(v/v)を無菌的に添加し、通気撹拌しながら27℃で60時間培養した。得られた培養液中のケトース3−エピメラーゼ活性は約13単位/ml−培養液であった。培養液約18Lから遠心分離して菌体を集め、これを20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)1.5Lに懸濁し、細胞破砕機ダイノミル(ベッコーフェン製)を用いて破砕した。得られた菌体破砕懸濁液を遠心分離し、上清を回収して菌体破砕抽出液とした。菌体破砕抽出液は、実験2の方法に準じてDEAE−トヨパール 650S(東ソー株式会社製)を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの段階まで精製し、ケトース3−エピメラーゼ部分精製酵素標品として総活性で約82,000単位を得た。
D−フラクトースの10w/v%水溶液(pH8.0、1mMのMnCl2を含む)に、実施例1の方法で得たリゾビウム・フレディ ATCC35423由来の部分精製ケトース3−エピメラーゼを、D−フラクトース1グラム当り50単位の割合で加え、45℃、30時間反応させた。反応後、反応液を常法に従って、活性炭を用いて脱色し、次いで、H型イオン交換樹脂(商品名「ダイヤイオン SK1B」、三菱化学株式会社製造)及びOH型イオン交換樹脂(商品名「ダイヤイオン WA30」、三菱化学株式会社製造)を用いて脱塩し、減圧濃縮してD−プシコースを含む透明なシラップを得た。本シラップを塩型強酸性カチオン交換樹脂(アンバーライトCR−1310、Na型、オルガノ株式会社製造)を用いるカラムクロマトグラフィーにかけ、分離精製し、濃縮してシラップ状のD−プシコースを固形物当り収率約23%で得た。本品の理化学的性質は、標準のD−プシコースのそれとよく一致した。本品は、甘味料、発酵用炭素源、試薬、化学品、医薬品の原料及び中間体などとして有利に利用できる。また、本酵素反応が可逆的な反応であることから、原料としてD−プシコースを用いることにより、D−フラクトースを製品として採取することも容易である。
D−キシルロースの1%(w/v)水溶液(pH8.0、1mMのMnCl2を含む)に、実験1及び2の方法でDEAE−トヨパール工程まで部分精製したリゾビウム・レグミノサラム ATCC14480由来のケトース3−エピメラーゼをD−キシルロース1グラム当り20単位の割合で加え、45℃、50時間反応させた。反応後、反応液を実施例3と同様に、脱色、脱塩し、減圧濃縮してD−リブロースを含む透明なシラップを得た。本シラップを実施例3と同様に塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、分離精製し、濃縮してシラップ状のD−リブロースを固形物当り収率約16%で得た。本品の理化学的性質は、標準のD−リブロースのそれとよく一致した。本品は、甘味料、発酵用炭素源、試薬、化学品、医薬品の原料及び中間体などとして有利に利用できる。また、本酵素反応が可逆的な反応であることから、原料としてD−リブロースを用いることにより、D−キシルロースを製品として採取することも容易である。
1%(w/v)L−キシルロース水溶液(pH8.0、1mMのMnCl2を含む)に対し、実施例1の方法で得たリゾビウム・フレディ ATCC35423由来の部分精製ケトース3−エピメラーゼをL−キシルロース1グラム当り100単位の割合で加え、45℃、50時間反応した。反応後、反応液を実施例2と同様に、脱色、脱塩し、減圧濃縮してL−リブロースを含む透明なシラップを得た。本シラップを実施例3と同様に塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、分離精製し、濃縮してシラップ状のL−リブロースを固形物当り収率約25%で得た。本品の理化学的性質は、標準のL−リブロースのそれとよく一致した。本品は、甘味料、発酵用炭素源、試薬、化学品、医薬品の原料及び中間体などとして有利に利用できる。また、本酵素反応が可逆的な反応であることから、原料としてL−リブロースを用いることにより、L−キシルロースを製品として採取することも容易である。
1%(w/v)L−タガトース水溶液(pH8.0、1mMのMnCl2を含む)に対し、実施例2の方法で得た、リゾビウム・レグミノサラム ATCC14480の酵素高産生変異株由来の部分精製ケトース3−エピメラーゼをL−タガトース1グラム当り20単位の割合で加え、45℃、50時間反応した。反応後、反応液を実施例3と同様に、脱色、脱塩し、減圧濃縮してL−ソルボースを含む透明なシラップを得た。本シラップを実施例3と同様に塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、分離精製し、濃縮してシラップ状のL−ソルボースを固形物当り収率約25%で得た。本品の理化学的性質は、標準のL−ソルボースのそれとよく一致した。本品は、甘味料、発酵用炭素源、試薬、化学品、医薬品の原料及び中間体などとして有利に利用できる。また、本酵素反応が可逆的な反応であることから、原料としてL−ソルボースを用いることにより、L−タガトースを製品として採取することも容易である。
リゾビウム・レグミノサラム ATCC14480を実験1と同様の方法で培養し、遠心分離してケトース3−エピメラーゼ活性を発現した湿菌体100gを得た。次いで、この湿菌体を20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に溶解した2.5%アルギン酸ナトリウム(和光純薬工業株式会社販売)100mlに混練した。得られた菌体を含むスラリーを、マグネティックスターラーで攪拌した0.1MCaCl2溶液に、水面より約20cmの高さから連続的に滴下し、直径約2mmの球状のゲル化物を調製した。これを0.1MCaCl2溶液中に約2時間保持した後、吸引濾過してアルギン酸固定化菌体を回収した。この固定化菌体はケトース3−エピメラーゼ活性を発現していることから、カラムに充填するなどして固定化ケトース3−エピメラーゼとして有利に利用できる。
Claims (14)
- リゾビウム(Rhizobium)属に属する微生物から得ることができ、下記の基質特異性と理化学的性質を有するケトース3−エピメラーゼ:
(1)D−又はL−ケトヘキソースの3位をエピマー化し、対応するD−又はL−ケトヘキソースを生成する。D−又はL−ケトペントースの3位をエピマー化し、対応するD−又はL−ケトペントースを生成する;
(2)D−又はL−ケトヘキソース及びD−又はL−ケトペントースの中ではD−フラクトース及びD−プシコースに対する基質特異性が最も高い;
(3)分子量
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、30,000±3,000ダルトンを示す;
(4)至適pH
45℃、30分間反応、1mM Mn 2+ イオン存在下の条件下で、pH9.0乃至9.5;
(5)至適温度
pH8.0、30分間反応、1mM Mn 2+ イオン非存在下の条件下で、50℃;
1mM Mn 2+ イオン存在下で、65℃;
(6)pH安定性
30℃、60分間保持、1mM Mn 2+ イオン非存在下の条件下で、少なくともpH8乃至10の範囲で安定;
1mM Mn 2+ イオン存在下で、pH4.5乃至9.5の範囲で安定;
(7)温度安定性
pH8.0、10分間保持、1mM Mn 2+ イオン非存在下の条件下で、50℃以下で安定;
1mM Mn 2+ イオン存在下で、75℃以下で安定;
(8)金属イオンによる活性化
Mn 2+ 又はMg 2+ イオンにより活性化される。 - リゾビウム属に属する微生物が、リゾビウム・レグミノサラム(Rhizobium leguminosarum)、リゾビウム・フレディ(Rhizobium fredii)及びリゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)のいずれかである請求項1記載のケトース3−エピメラーゼ。
- 配列表における配列番号1で示されるアミノ酸配列をN末端アミノ酸配列として有する請求項1又は2記載のケトース3−エピメラーゼ。
- 配列表における配列番号2で示されるアミノ酸配列か、配列表における配列番号2で示されるアミノ酸配列において、酵素の活性を保持する範囲で1個以上10個未満のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する請求項1乃至3のいずれかに記載のケトース3−エピメラーゼ。
- 請求項4記載のケトース3−エピメラーゼをコードするDNA。
- 配列表における配列番号3で示される塩基配列か、又は配列表における配列番号3で示される塩基配列において、コードする酵素の活性を保持する範囲で1個以上30個未満の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項5記載のDNA。
- 遺伝子コードの縮重に基づき、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩基配列における塩基の1個以上30個未満を他の塩基で置換した請求項5又は6記載のDNA。
- 請求項5乃至7のいずれかに記載のDNAと、自律複製可能なベクターを含んでなる組換えDNA。
- 請求項8記載の組換えDNAを適宜の宿主に導入してなる形質転換微生物。
- リゾビウム属に属し、ケトース3−エピメラーゼ産生能を有する微生物を、栄養培地で培養して請求項1乃至4のいずれかに記載のケトース3−エピメラーゼを生成せしめ、これを採取することを特徴とするケトース3−エピメラーゼの製造方法。
- 請求項9記載の形質転換微生物を培養し、培養物から組換え型ケトース3−エピメラーゼを採取することを特徴とする組換え型ケトース3−エピメラーゼの製造方法。
- D−又はL−ケトヘキソース及びD−又はL−ケトペントースから選ばれる1種以上のケトースを含有する溶液に、リゾビウム(Rhizobium)属微生物に由来し、下記の基質特異性を有するケトース3−エピメラーゼを作用させて、該ケトースの3位をエピマー化することを特徴とするケトースの変換方法;
(1)D−又はL−ケトヘキソースの3位をエピマー化し、対応するD−又はL−ケトヘキソースを生成する。D−又はL−ケトペントースの3位をエピマー化し、対応するD−又はL−ケトペントースを生成する;
(2)D−又はL−ケトヘキソース及びD−又はL−ケトペントースの中ではD−フラクトース及びD−プシコースに対する基質特異性が最も高い。 - D−又はL−ケトヘキソース及びD−又はL−ケトペントースから選ばれる1種以上のケトースを含有する溶液に、リゾビウム(Rhizobium)属微生物に由来し、下記の基質特異性を有するケトース3−エピメラーゼを作用させて該ケトースの3位をエピマー化し、対応するケトースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするケトースの製造方法;
(1)D−又はL−ケトヘキソースの3位をエピマー化し、対応するD−又はL−ケトヘキソースを生成する。D−又はL−ケトペントースの3位をエピマー化し、対応するD−又はL−ケトペントースを生成する;
(2)D−又はL−ケトヘキソース及びD−又はL−ケトペントースの中ではD−フラクトース及びD−プシコースに対する基質特異性が最も高い。 - ケトースを採取する方法が、塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーによりケトースを採取する方法であることを特徴とする請求項13記載のケトースの製造方法。
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