JP5089998B2 - 4−硫酸化ヒアルロン酸 - Google Patents
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Description
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、ヒアルロン酸分解酵素を用いた酵素化学的手法により、4位だけをすべて硫酸化した4−硫酸化ヒアルロン酸をはじめて合成した。
更に詳しくは、本発明者はヒアルビウロン酸の4位が硫酸化されたヒアルビウロン酸オキサゾリン誘導体を設計し、羊睾丸由来ヒアルロニダーゼを作用せしめることにより4−硫酸化ヒアルロン酸が生成することを見い出し、本発明を完成するに至った。
(4)下記の一般式(II)で表されるオキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめるにあたり、pHを6.0〜7.0に調整して製造されることを特徴とする(2)又は(3)記載の4−硫酸化ヒアルロン酸である。
本発明で使用する基質モノマーの合成手法を、図1に示す合成スキーム中のオキサゾリン誘導体(1)の合成を例として、その手順の一例を以下に示す。
すなわち、メチル(2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルトリクロロアセトイミデート)ウロネート(3)を糖供与体、ベンジル (2−アセトアミド−2−デオキシ−4,6−O−イソプロピリデン−β−D−グルコピラノシド(4)を糖受容体として用い、モレキュラーシーブス(MS4A)存在下、ジクロロメタン中、プロモーターとしてBF3・OEt2を用い、0℃でグリコシル化を行い、ベンジル(メチル2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3) −2−アセトアミド−2−デオキシ−4,6−O−イソプロピリデン−β−D−グルコピラノシド(5)を合成する。得られた(5)の脱保護反応は、ジクロロメタンに溶解・攪拌し、次いで水、トリフルオロ酢酸を添加して0℃で反応を行う。反応終了後、TFA存在下で反応溶液の温度を上昇させないように、速やかに飽和NaHCO3水溶液で分液処理を行い、シリカゲルカラムで精製を行ない、ベンジル(メチル2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3)−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(6)を合成する。(6)をTHFとピリジン=1:1に溶解し、−78℃で反応させることにより、ベンジル(メチル2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3)−6−o−アセチル−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(7)を得る。
次に、4位の遊離水酸基に硫酸基を導入した後、アノマー位のベンジル基を脱保護してオキサゾリン化を行い、トリエチルアンモニウム ベンジル(メチル2,3,4,−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3)−6−O−アセチル−4ーO−スルフォネート−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(8)を得る。(8)の精製をシリカゲルカラム及びゲルろ過により行い、2−メチル−4,5−ジヒドロ−[トリエチルアンモニウム−6−O−アセチル−4−O−スルフォネート−1,2−ジ−デオキシ−3−O−(2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−α−D−グルコピラノソ]−[2,1−d]−1,3−オキサゾ−ル(9)を得る。最後に、0℃でアルカリ分解により脱保護し、目的のソディウム(2−メチル−4,5−ジヒドロ−[4−O−スルフォ−1,2−ジデオキシ−3−O−(ソディウムβ−D−グルコピラノシルウロネート)−α−D−グルコピラノソ]−[2,1−d]−1,3−オキサゾール(1)を得ることができる。
反応pHは酵素の反応性と基質モノマーの安定性を考慮し、5〜10望ましくは6.5〜7.5が好適に採用される。反応温度は5℃〜60℃で、通常は20℃〜40℃が用いられる。
得られる4−硫酸化ヒアルロン酸の分子量は、基質モノマーの酵素触媒による重合反応時の条件を制御することにより種々の分子量の4−硫酸化ヒアルロン酸を得ることが可能である。
ベンジル(メチル2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3)−2−アセトアミド−2−デオキシ−4,6−O−イソプロピリデン−β−D−グルコピラノシド(5)の合成
遮光二口フラスコ中で、メチル(2,3,4−トリ−O−アセチル−α−D−グルコピラノシル トリクロロアセトイミデート)ウロネート(3)(667mg,1.39mmol)とベンジル2−アセトアミド−2−デオキシ−4,6−O−イソプロピリデン−β−D−グルコピラノシド(4)(350mg,0.99mmol)を脱水ジクロロメタン(10ml)に溶解させ、モレキュラーシーブス4A(MS4A;1.2g)を加え、0℃で脱水ジクロロメタン(0.7ml)に溶解したBF3・OEt2(175μl,1.39mmol)の溶液を加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下0℃で4時間攪拌した。反応をEt3N(0.45ml)の添加で停止した。その混合物を珪藻土(Celite)でろ過し、飽和NaHCO3水溶液に注ぎ、CHCl3で抽出した。有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥し、ろ過、濃縮した。その残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(2:1から1:2までn−ヘキサン−酢酸エチル)によって、精製し、白い固体として、ベンジル(メチル(2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3)−2−アセトアミド−2−デオキシ−4,6−O−イソプロピリデン−β−D−グルコピラノシド(476mg,0.69mmol,収率71%)を得た。
分析データは、以下の通りである。
1H−NMR (400MHz, CDCl3,TMS) :δ(ppm); 7.33−7.29 (m, 7H, aromatic), 5.78 (d, JNH,2 = 7.03 Hz, 1H, NH),5.24−5.15 (m, 3H, H−3', H−1, H−4’), 4.95 (t, J1’,2’ = J2’,3’ = 8.53 Hz, 1H, H−2’), 4.84 (dd, 2H,CH2Ph), 4.55−4.48(m, 3H, H−3, CH2Ph),3.95−3.91 (m, 2H, H−5', H−6a), 3.81−3.71 (m, 7H, H−6b, COOCH3, H−4), 3.40−3.34 (m, 1H, H−5),3.09−3.03 (dd, 1H, H−2), 2.08−1.99 (m, 14H, アセトアミドのCH3 , COCH3), 1.87 (s, 3H, isopropylidenのCH3), 1.65 (s, 3H, isopropylidenのCH3 ).
ベンジル(メチル2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3)−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(6)の合成
ナスフラスコ中で、ベンジル(メチル(2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3)−2−アセトアミド−2−デオキシ−4,6−O−イソプロピリデン−β−D−グルコピラノシド(124mg,0.18mmol)をジクロロメタン(10ml)と水(0.05ml)に溶解した。
その混合物に0℃でTFA(0.5ml,5%v/v)を加え、その後乾燥雰囲気下1時間攪拌した。反応溶液を飽和NaHCO3水溶液に入れ、CHCl3で抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過、濃縮した。残基をシリカゲルクロマトグラフィー(1:2から1:3までクロロホルム−酢酸エチル,その後酢酸エチル)で精製し、白色固体として、ベンジル(メチル2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3)−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(96mg,0.14mmol,82%)を得た。
分析データは、以下の通りである。
Rf 0.23 (EtOAc); [α] D 27 −46°(c 1.0, CHCl3);mp 207.1℃;
1H−NMR (400MHz, CDCl3,TMS) :δ(ppm); 7.79 (d, JNH,2= 8.53 Hz,1H,NH), 7.34−7.27 (m,5H,aromatic), 5.33 (t, J2’,3’ = J3’,4’ = 9.53 Hz,1H,H−3’), 4.96−4.92(m,2H,H−4', H−1'), 4.81−4.77 (m, 2H, H−2',CH2Ph), 4.65 (t, J5,6−OH = 5.52 Hz, 1H, 6−OH), 4.54−4.51(m, 2H, CH2Ph, 4−OH),4.43−4.37 (m, 2H, H−5',H−1), 3.72−3.68 (m, 1H, H−6a), 3.63 (m, 5H, COOCH3, H−2, H−3), 3.54−3.49 (m, 1H,H−6b), 3.23−3.21 (m, 1H,H−4), 3.23−3.16 (m,1H, H−5), 1.99−1.83 (m, 12H,acetamido, COCH3)
13C−NMR (100MHz, CDCl3):δ(ppm);169.70−167.50 (COCH3,COOCH3), 138.15,128.31−127.41 (aromatic), 100.25 (C−1), 99.42 (C−1'), 82.88 (C−3), 76.73 (C−5),71.60 (C−3’), 70.97 (C−5’), 70.74 (C−2'), 69.62 (CH2Ph), 69.30 (C−4'), 68.61 (C−4),60.96 (C−6), 53.98 (C−2), 52.79 (OCH3)
High resolusion FAB Mass
計算値:[M+H]+ =628.2236 m/z (C28H38NO15)
実測値:628.2242 m/z
ベンジル(メチル 2,3,4,−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3)−6−O−アセチル−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(7)の合成
ナスフラスコ中でベンジル(メチル 2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3)−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(93mg,0.14mmol)を脱水ピリジン(0.95ml)と脱水THF(s0.95ml)に溶解し、−78℃で脱水THF(0.5ml)に溶解したAcCl(10.5μl,0.14mmol)の溶液を加えた。その反応混合物を−78℃でアルゴン雰囲気下8時間攪拌した。反応は−78℃でメタノール(2ml)を添加することによって止め、その後溶液を濃縮して、飽和NaHCO3水溶液,1N塩酸水溶液に入れ、クロロホルムで抽出した。
有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過、濃縮した。残渣は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(1:1から1:3までn−ヘキサン−酢酸エチル,その後酢酸エチル)によって精製し、ベンジル(メチル2,3,4,−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3)−6−O−アセチル−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(46mg,0.07mmol,収率47%)を白色の固体として得た。
分析データは、以下の通りである。
Rf 0.51 (酢酸エチル);
1H−NMR (400MHz, CDCl3,TMS) :δ(ppm); 6.06 (d, JNH,2 =7.52 Hz, 1H, NH), 5.29−5.16 (m, 2H, H−3’, H−4’), 5.00−4.96 (m, 1H, H−2’),4.91−4.83 (m, 2H, H−1, CH2Ph),4.66 (d, J1’,2’ =7.52 Hz, 1H, H−1’), 4.55−4.47 (m, 2H, CH2PH, H−6a), 4.36−4.28 (m, 2H, H−3, H−6b), 4.12 (d, J4’,5’ = 10.0 Hz, 1H, H−5’), 3.99 (s, 1H, OH),3.79−3.69 (m, 2H, COOCH3,H−5), 3.55 (d, J = 6.04 Hz, 1H, H−4), 3.23−3.16 (m, 1H, H−2), 2.09−1.94(m, 15H, CH3 ofacetamido, COCH3).
13C−NMR (100MHz, CDCl3):δ(ppm); 170.21−168.37 (COCH3),166.14 (COOCH3),127.73−127.25 (aromatic), 99.49(C−1'), 97.86(C−1), 82.34(C−3), 72.74 (C−5),71.30 (C−3’), 70.99 (C−2, CH2Ph),68.57 (C−4), 67.86 (C−4'), 62.70 (C−6), 56.10 (C−2), 52.29 (COOCH3) 19.91−19.48 (COCH3).
High resolusion FAB Mass
計算値:[M+H]+ =670.2342 m/z (C30H40NO16)
実測値:670.2343 m/z
トリエチルアンモニウム ベンジル(メチル 2,3,4,−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3)−6−O−アセチル−4−O−スルフォネート−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(8)の合成
ナスフラスコ中で、ベンジル(メチル 2,3,4,−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3)−6−O−アセチル−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(295mg,0.44mmol)をDMF(10.5ml)に溶解させ、SO3・NMe3(366mg,2.64mmol)を50℃でアルゴン雰囲気下加えた。50℃で10時間攪拌後、反応混合物を乾固した。残渣を0.5%v/vトリエチルアミン含有シリカゲルクロマトグラフィー(溶出溶媒:1:2 n−ヘキサン−酢酸エチルその後酢酸エチル、その後クロロホルム,20:1クロロホルム:メタノール)によって精製し、白色非結晶粉末としてトリエチルアンモニウム ベンジル(メチル2,3,4,−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3)−6−O−アセチル−4−O−スルフォネート−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(370mg,0.43mmol,98%)を得た。
分析データは、以下の通りである。
Rf 0.16 (10:1 クロロホルム−メタノール);
1H−NMR (400MHz, CDCl3,TMS) :δ(ppm); 9.89 (s, 1H, (CH2CH3)3HN), 6.24 (d, JNH,2 = 8.52Hz,1H, NH), 5.32−5.27 (m, 1H,H−3), 5.14−5.10 (m, 2H, H−1', H−4’), 5.02−4.98 (m, 1H, H−2’), 4.85−4.78 (m, 2H,CH2PH, H−1),4.58−4.55 (m, 2H, CH2PH,H−4), 4.34−4.28 (m, 2H, H−6a, H−6b), 4.23−4.21 (m, 1H, H−5), 4.15−4.06 (m, 2H,H−5’, H−2), 3.70 (s, 3H, COOCH3),3.17−3.12 (m, 13H, (CH3CH2)3NH+),2.06−1.96 (m, 15H, CH3of acetamido, COCH3),1.28−1.24 (m, 21H, (CH3CH2)3NH+).
13C−NMR (100MHz, CDCl3):δ(ppm); 170.68, 170.23, 169.73 (CH3CO),167.49 (COOCH3),137.48−127.61 (aromatic), 99.05 (C−1), 97.72 (C−1'), 75.90 (C−3), 75.02 (C−5),73.02 (C−4), 72.13 (C−5'), 71.99 (C−3'), 70.51 (C−2'), 70.45 (CH2Ph), 69.69 (C−4'), 64.24 (C−6),52.61 (COOCH3),51.62 (C−2), 46.53 (HNCH2CH3), 8.66 (HNCH2CH3).
High resolusion FAB Mass
計算値:[M+H]+ =851.3114 m/z (C36H55N2O19S)
実測値 851.3132m/z
2−メチル−4,5−ジヒドロ−[トリエチルアンモニウム−6−O−アセチル−4−O−スルフォネート−1,2−ジ−デオキシ−3−O−(メチル2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−α−D−グルコピラノソ]−[2,1−d]−1,3−オキサゾ−ル(9)の合成
ナスフラスコ中で、トリエチルアンモニウム ベンジル(メチル2,3,4,−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−(1→3)−6−O−アセチル−4−O−スルフォネート−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(443mg,0.52mmol)をメタノール(40mL)とトリエチルアミン(0.4ml)に溶解し、活性炭(265mg)上の20%水酸化パラジウムを加えた。
混合物を室温で水素雰囲気下1時間はげしく攪拌し、Celiteでろ過後、濃縮により乾固した。残渣に対して、脱水ジクロロメタン(27ml)にN,N−ジメチルアミノピリジン(DMAP,38mg,0.31mmol),トリエチルアミン(72μl,0.51mmol),TsCl(118mg,0.62mmol)加えた。反応混合物を室温アルゴン雰囲気下3時間攪拌し、その後、追加のDMAP(38mg,0.31mmol),トリエチルアミン(72μl,0.51mmol),TsCl(118mg,0.62mmol)を加えた。室温、アルゴン雰囲気下で一晩攪拌し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム,その後0.5%v/vトリエチルアミンを含む20:1クロロホルム−メタノール)で精製した。さらに、セファデックス LH−20カラムクロマトグラフィー(1%v/vトリエタノールアミンを含むメタノール)で精製し、2−メチル−4,5−ジヒドロ−[トリエチルアンモニウム−6−O−アセチル−4−O−スルフォネート−1,2−ジ−デオキシ−3−O−(2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−α−D−グルコピラノソ]−[2,1−d]−1,3−オキサゾール(216mg,0.29mmol,56%)を白色非結晶粉末として得た。
分析データは、以下の通りである。
Rf 0.29 (10:1 クロロホルム−メタノール); [α] D 24 +11°;
1H−NMR (400MHz, CDCl3,TMS): δ(ppm); 9.89 (s, 1H, (CH2CH3)3HN), 5.56 (d, J1,2 = 7.00 Hz, 1H, H−1), 5.30−5.26 (m, 1H, H−3’), 5.19−514(m, 2H, H−1’ H−4’), 5.02−4.92 (m, 2H, H−2’), 4.68 (d, J = 1.76 Hz, H−4),4.41 (dd, J = 2.00 Hz, 1H, H−6a), 4.25 (d, J = 10.0 Hz, 1H, H−5’),4.16−4.08 (m, 2H, H−6a, H−2), 3.73 (s, 3H, COOCH3), 3.48−3.43 (m, 1H, H−5), 3.18−3.16 (m, 6H, (CH3CH2)3NH+), 1.37−1.25 (m, 9H, , (CH3CH2)3NH+).
13C−NMR (100MHz, CDCl3):δ(ppm); 171.41−169.81 (COCH3of acetamido), 167.76 (COOCH3),166.89 (COCH3 ofoxazoline), 101.08 (C−1’), 99.57 (C−1), 78.74 (C−3), 72.78 (C−3’), 72.56 (C−4),71.58 (C−2’), 69.86 (C−4’), 68.09 (C−5), 65.70 (C−6), 64.41 (C−2), 64.11 (C−5’),53.00 (COOCH3),21.24−20.92 (COCH3of acetamido), 14.32 (COCH3of oxazoline)
High resolusion FAB Mass
計算値:[M+H]+ =743.2539 (C29H47N2O18S)
実験値 743.2545.
ソディウム(2−メチル−4,5−ジヒドロ−[4−O−スルフォ−1,2−ジデオキシ−3−O−(ソディウムβ−D−グルコピラノシルウロネート)−α−D−グルコピラノソ]−[2,1−d]−1,3−オキサゾール(1)の合成
二口フラスコ中で、2−メチル−4,5−ジヒドロ−[トリエチルアンモニウム−6−O−アセチル−4−O−スルフォネート−1,2−ジ−デオキシ−3−O−(メチル 2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルウロネート)−α−D−グルコピラノソ]−[2,1−d]−1,3−オキサゾ−ル(92.1mg,0.12mmol)をメタノール(4.0ml)に溶解し、0℃で水酸化ナトリウム水溶液(1.0M,379μl,0.37mmol)を加え、1時間乾燥雰囲気下で攪拌し、その後室温で1時間攪拌した。その反応混合物にDowex50W−X8(H+form)を加えて、中和(pH10.4)した。その混合物を綿でろ過し、凍結乾燥して、黄色固体として、ソディウム(2−メチル−4,5−ジヒドロ−[4−O−スルフォ−1,2−ジデオキシ−3−O−(ソディウムβ−D−グルコピラノシルウロネート)−α−D−グルコピラノソ]−[2,1−d]−1,3−オキサゾール(62.3mg,純度98%)を得た。その1H−NMRの結果を図2に示した。1位プロトンに由来するピークが6.09ppmにJ1,2 = 7.52 Hzのダブレットピークとして観察され、これにより(1)がオキサゾリン環構造を取っていることが確認された。
分析データは、以下の通りである。
Rf 0.03 (2:1 クロロホルム−メタノール);
1H−NMR (400MHz, CDCl3,TMS):δ(ppm);6.09 (d, J1,2 =7.52 Hz, 1H, H−1), 4.69 (d, J = 8.04 Hz, 1H, H−4), 4.62 (d, J =7.52 Hz, 1H, H−1’), 4.40 (d, J = 2.52 Hz, 1H, H−3), 4.42 (d, J =7.00 Hz, 1H, H−2), 3.84−3.81 (dd, 1H, H−5’), 3.74−3.69 (m, 2H, H−4’, H−3’).352−3.48 (m, 2H, H−6a, H−6b), 3.45−3.41 (m, 1H, H−2’), 3.33−3.29 (m, 1H, H−5),2.22 (s, J = 2.22 Hz, 6H, acetone), 2.08 (s, 3H, CH3 of oxazoline).
13C−NMR (100MHz, CDCl3):δ(ppm); 176.33 (COONa), 169.29 (CH3C of oxazoline), 102.54 (C−1’), 100.06 (C−1), 77.26(C−5), 76.15 (C−3), 75.99 (C−4’), 73.38 (C−5), 72.96 (C−4), 72.46 (C−3'), 70.97(C−2'), 63.26 (C−2), 61.96 (C−6), 13.46 (CH3C of oxazoline)
High resolusion FAB Mass
計算値:[M+Na]+ =526.0214m/z(C14H19NO14SNa3)
実測値 526.0225m/z
酵素触媒重合による4−硫酸化ヒアルロン酸(2)の合成
基質モノマーであるソディウム(2−メチル−4,5−ジヒドロ−[4−O−スルフォ−1,2−ジデオキシ−3−O−(ソディウムβ−D−グルコピラノシルウロネート)−α−D−グルコピラノソ]−[2,1−d]−1,3−オキサゾール(10.5mg,20.8μmol)をリン酸緩衝液(50mM,pH6.5,210μl)に溶解し、羊精巣由来ヒアルロニダーゼ(Sigma社製,Lot No.122K1378,2660units/mg,以降、H−OTHと記す)を1.05mg加え、30℃で反応を行った。4時間反応後、反応懸濁液を90℃の湯浴中にて5分間加温することにより酵素を失活させた。その残渣を以下のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)条件で分析した。その結果、収率は62%であった。
SEC条件
検出器 :示差検出計
カラム :Shodex Ohpak SB−803HQ(8.0×300mm)
カラム温度:40℃
移動相 :0.1M 硝酸ナトリウム
流量 :0.5ml/min
その重合生成物を0.1M硝酸ナトリウム溶液を移動層とし、Shodex OhpakSB−803HQカラムを用いたSECによって分離した。集合させたフラクションをSpectra/Por CE 透析膜(分子量分画500)を用いて蒸留水に対して透析により脱塩し、凍結乾燥して4−硫酸化ヒアルロン酸(5mg,収率47%)を得た。4−硫酸化ヒアルロン酸を重水に溶解し1H−NMRによる測定を行ったところ、内部グリコシド結合に由来するピークが見られた。その結果を図3に示す。
酵素触媒重合挙動の追跡
基質モノマーの消費をモニタリングする方法は以下の通りである。化合物(1)(10.5mg,20.8μmol)をリン酸緩衝D2O溶液(50mM,pD7.0,100μl)に溶解した。その溶液を50μlずつにわけた。対照液に対しては、リン酸緩衝D2O溶液(50mM,pD7.0,50μl)だけを加えた。もう一方の溶液にはリン酸緩衝D2O溶液(50)mM,pD7.0,50μl)に溶解したH−OTH(0.5mg)を加えた。これら2つの試料をNMR試験チューブ中30℃に置き、経時的に反応液を採取し、その化合物(1)の濃度を1H NMRスペクトロメトリーによるH−1プロトンとメチルプロトンのシグナルの積分値から計算した。追跡結果を図4に示した。図4より、酵素添加系において、モノマー消費が促進されたことがわかった。即ちこのモノマーがヒアルロニダーゼにより認識され、オキサゾリンの開環反応が促進されることが認識された。この反応液を以下の条件で、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)測定によりで分析した。
SEC条件
検出器 :示差検出計
カラム :Shodex Ohpak SB−803HQ(8.0×300mm)
カラム温度:40℃
移動相 :0.1M 硝酸ナトリウム
流量 :0.5ml/min
その結果、18分近傍の二糖加水分解物のピークに加え、これよりも高分子量側の16分近傍に重合物由来のピークが検出された。その結果を図5に示す。これにより、目的物(2)の生成していることが示唆された。
4−硫酸化ヒアルロン酸合成における反応pHの影響
重合反応において、触媒酵素として、OTH(2660unit/mg)を基質モノマーに対して、10%w/w濃度添加し、50mMリン酸緩衝液中、モノマー濃度0.1Mで、表に示す反応時間30℃でpHを変えて反応した。結果を表1に示した。モノマー(1)は、pH6.0から7.0で重合生成物が得られたのに対して、pH7.5以上の条件において急激な重合活性の低下が見られた。
4−硫酸化ヒアルロン酸合成における酵素濃度の影響
重合反応において、触媒酵素であるH−OTHの添加量と反応時間を表2に記載の条件に変更した以外は、実施例9と同様の反応及び分析を行った。その結果を表2に示す。酵素濃度は10%w/wのときに最も良好な収率(62%)で重合生成物が得られた。このときの分子量は2860であった。
Claims (4)
- 下記の一般式(I)で表される4−硫酸化ヒアルロン酸。
- 下記の一般式(II)で表されるオキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめることにより製造される4−硫酸化ヒアルロン酸。
- ヒアルロン酸分解酵素が、ほ乳類由来のヒアルロニダーゼであることを特徴とする請求項2記載の4−硫酸化ヒアルロン酸。
- 下記の一般式(II)で表されるオキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめるにあたり、pHを6.0〜7.0に調整して製造されることを特徴とする請求項2又は3記載の4−硫酸化ヒアルロン酸。
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