JP5080597B2 - GANP gene-introduced transgenic mammal and use thereof - Google Patents

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Description

本発明は、GANP遺伝子を導入したトランスジェニック哺乳動物及びその利用に関する。より詳細には、本発明は、GANPを高発現し、高親和性抗体を産生することができるトランスジェニック哺乳動物、該トランスジェニック哺乳動物を用いて高親和性抗体を産生する方法、及び得られた高親和性抗体の利用に関する。   The present invention relates to a transgenic mammal introduced with a GANP gene and use thereof. More specifically, the present invention relates to a transgenic mammal that highly expresses GANP and can produce a high-affinity antibody, a method for producing a high-affinity antibody using the transgenic mammal, and a resultant It relates to the use of high affinity antibodies.

免疫系の機能は、T細胞の効果を主とする細胞性免疫反応に基づく機能と抗体の効果を主とする液性免疫に基づく機能とに分類される。実際は、この両者の機能は協調して免疫応答が行われる。抗体は骨髄で生まれるB細胞の細胞表面レセプターとして表出している。生体で形成される最初の抗体が認識する抗原の多様性は109〜1011個のオーダーに上ると言われ、そのような抗体（抗原レセプター）は、環境に存在しうるあらゆる抗原決定基を認識する。しかしながら、この多様な抗原レセプターは抗原に対して結合する能力は概して低く、低親和性の抗体が産生されることが多いが、これでは十分な免疫応答とはならない。 The function of the immune system is classified into a function based on a cellular immune response mainly including the effect of T cells and a function based on humoral immunity mainly including the effect of antibodies. In fact, these two functions cooperate to produce an immune response. Antibodies are expressed as cell surface receptors for B cells born in the bone marrow. The diversity of antigens recognized by the first antibody formed in the body is said to be on the order of 10 9 to 10 11 , and such an antibody (antigen receptor) has any antigenic determinant that can exist in the environment. recognize. However, this diverse antigen receptor generally has a low ability to bind to antigens, and low affinity antibodies are often produced, but this is not a sufficient immune response.

リンパ球、特にB細胞/免疫グロブリン（抗体）は、その免疫反応に基づく各種用途、例えば病原体等の抗原検出のためのキット、診断薬、治療薬として利用されている。このような抗原検出薬、あるいは各種疾患治療薬における抗体として、抗原に対する反応性が高い抗体を使用すると、抗原に対する感度が優れ、かつ同一投与量での治療薬としての性能が優れる。しかしながら、これまでの所、抗体の親和性を高める手段は知られていない。   Lymphocytes, particularly B cells / immunoglobulins (antibodies), are used in various applications based on their immune responses, such as kits for detecting antigens such as pathogens, diagnostic agents, and therapeutic agents. When an antibody having high reactivity to an antigen is used as an antibody in such an antigen detection drug or a therapeutic drug for various diseases, the sensitivity to the antigen is excellent and the performance as a therapeutic drug at the same dose is excellent. However, so far, no means for increasing the affinity of antibodies is known.

ところで、生体は病原体や異物が体内に侵入すると、それらを抗原として認識して、末梢のリンパ組織において、抗原と直接結合する抗体のV領域の遺伝子に高頻度の体細胞突然変異を誘導する。その変化にはT細胞の刺激を必要としており、胚中心(Germinal center)領域で活性化T細胞から刺激を受けると考えられる。近年、本発明者らはこの領域の活性化B細胞で選択的に発現が上昇する分子GANPを見出している（特許文献１）。この分子はDNAへリカーゼ活性を有するMCM(minichromosome maintenance)と呼ばれる分子と直接結合し、さらにRNAプライマーゼ活性を有することから、DNA複製に関連することが示唆されている。しかしながら、免疫系におけるGANPの機能については解明されていなかった。   By the way, when a pathogen or a foreign substance enters the body, the living body recognizes them as antigens, and induces high-frequency somatic mutations in the V region genes of antibodies that directly bind to the antigens in peripheral lymphoid tissues. The change requires stimulation of T cells and is thought to be stimulated by activated T cells in the germinal center region. In recent years, the present inventors have found a molecule GANP whose expression is selectively increased in activated B cells in this region (Patent Document 1). This molecule binds directly to a molecule called MCM (minichromosome maintenance) having DNA helicase activity, and further has RNA primase activity, suggesting that it is related to DNA replication. However, the function of GANP in the immune system has not been elucidated.

国際公開第00/50611号International Publication No. 00/50611

本発明は、各種疾患の診断薬及び治療薬として有効な高親和性抗体、当該抗体を産生するためのトランスジェニック哺乳動物、該高親和性抗体又は高親和性抗体産生細胞を用いた薬剤を提供することを目的とする。   The present invention provides a high-affinity antibody effective as a diagnostic and therapeutic agent for various diseases, a transgenic mammal for producing the antibody, and a drug using the high-affinity antibody or high-affinity antibody-producing cells The purpose is to do.

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、GANP遺伝子を導入したトランスジェニック動物を作製し、抗原で免疫すると、このトランスジェニック動物は高親和性抗体を産生し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。   As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has produced a transgenic animal into which a GANP gene has been introduced, and when immunized with an antigen, the transgenic animal can produce a high-affinity antibody. The headline and the present invention were completed.

すなわち、本発明は以下の通りである。
(1) GANP遺伝子を導入したトランスジェニック哺乳動物又はその子孫。
導入したGANP遺伝子はB細胞で発現することができる。また、本発明のトランスジェニック哺乳動物又はその子孫は、GANP遺伝子をトランスフェクトしたES細胞から発生させることが可能である。哺乳動物としては、例えばマウスが挙げられる。
(2) 前記トランスジェニック哺乳動物又はその子孫の一部。
(3) 前記トランスジェニック哺乳動物又はその子孫に抗原を投与し、得られる動物又は子孫から抗体を採取することを特徴とする高親和性抗体の製造方法。 That is, the present invention is as follows.
(1) A transgenic mammal into which a GANP gene has been introduced or a progeny thereof.
The introduced GANP gene can be expressed in B cells. Moreover, the transgenic mammal of the present invention or its progeny can be generated from ES cells transfected with the GANP gene. Examples of mammals include mice.
(2) A part of the transgenic mammal or its progeny.
(3) A method for producing a high-affinity antibody, comprising administering an antigen to the transgenic mammal or a progeny thereof and collecting an antibody from the animal or the progeny obtained.

(4) 前記(3)記載の方法により得られる高親和性抗体又はその断片。
本発明の抗体は、親和性が1×10-7 (M) 以下で示されるものである。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
(5) 前記抗体又はその断片のV領域を含む、ヒト型化抗体若しくはヒト抗体又はそれらの断片。
(6) 前記抗体又はその断片、及び前記ヒト型化抗体若しくはヒト抗体又はそれらの断片からなる群から選択される少なくとも１つを含有する医薬組成物。
(7) 抗原を投与した請求項１〜４のいずれかに記載のトランスジェニック哺乳動物又はその子孫から採取される、高親和性抗体産生細胞。 (4) A high affinity antibody or fragment thereof obtained by the method described in (3) above.
The antibody of the present invention has an affinity of 1 × 10 −7 (M) or less. The antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
(5) A humanized antibody or human antibody or a fragment thereof comprising the V region of the antibody or fragment thereof.
(6) A pharmaceutical composition comprising at least one selected from the group consisting of the antibody or a fragment thereof and the humanized antibody or human antibody or a fragment thereof.
(7) A high-affinity antibody-producing cell collected from the transgenic mammal or the progeny thereof according to any one of claims 1 to 4 to which an antigen has been administered.

本発明によるGANPを過剰発現したマウスを用いることによって、従来では得られることのできなかったウイルス抗原に特異的で高親和性の抗体を速やかに作製することができる。そのため、エイズやC型肝炎のように遷延する感染による病状悪化を当該のウイルス抗原の変異に遅れないで特異的で強力な抗体を速やかに得ることが可能となると期待される。また、これによって、感染患者からのウイルスの抗原の変異に対応するオーダーメードの特異的抗体を作製することができる。抗体の作製に必要な免疫期間は１０日程度で十分であり、そのうち高親和性の変異を持つ抗体の産生効率は６０％近くに上る。ベッドサイドの患者サンプルを用いる高親和性抗体の産生プロトコールはワクチン療法に変わる新しい免疫療法となると期待される。   By using a mouse overexpressing GANP according to the present invention, it is possible to rapidly produce a high-affinity antibody specific for a viral antigen that could not be obtained conventionally. Therefore, it is expected that specific and powerful antibodies can be rapidly obtained without delaying the disease state deterioration due to persistent infection such as AIDS and hepatitis C without delaying the mutation of the virus antigen. This also makes it possible to produce tailor-made specific antibodies corresponding to viral antigen mutations from infected patients. The immunization period required for antibody production is about 10 days, and the production efficiency of antibodies having high-affinity mutations is close to 60%. High affinity antibody production protocols using bedside patient samples are expected to be a new immunotherapy alternative to vaccine therapy.

抗GANPモノクローナル抗体およびALP結合抗ラットIg抗体を用いた免疫組織化学分析の結果を示す。スケールバーは100μm。The result of the immunohistochemical analysis using an anti-GANP monoclonal antibody and an ALP binding anti-rat Ig antibody is shown. Scale bar is 100 μm. 雌NZBマウスの膝窩のリンパ節中のGANPhi細胞の出現速度を示す。スケールバーは100μm。The rate of appearance of GANP hi cells in the popliteal lymph nodes of female NZB mice is shown. Scale bar is 100 μm. 雌NZBマウスの脾臓中のGANPhi細胞の出現速度を示す。スケールバーは100μm。The appearance rate of GANP hi cells in the spleen of female NZB mice is shown. Scale bar is 100 μm. 複数系統のマウス由来の脾臓切片を抗GANPモノクローナル抗体で染色した結果を示す。RP; 赤脾髄, F; 濾胞。スケールバーは100μm。The results of staining spleen sections from multiple strains of mice with anti-GANP monoclonal antibodies are shown. RP; red pulp, F; follicle. Scale bar is 100 μm. 脾臓の赤脾髄におけるGANPhi 細胞の同定を示す。Figure 5 shows the identification of GANP hi cells in the splenic red pulp.

GANPhi 細胞における形質細胞マーカーの同定を示す。スケールバーは100μm。The identification of plasma cell markers in GANP hi cells is shown. Scale bar is 100 μm. TD-Ag免疫によるC57BL/6マウスの脾臓の赤脾髄領域におけるGANPhi細胞の発現を示す。スケールバーは100μm。The expression of GANP hi cells in the spleen region of the spleen of C57BL / 6 mice by TD-Ag immunization is shown. Scale bar is 100 μm. Daudi細胞にマウスGANPを安定的に発現させたトランスフェクタントの体細胞突然変異を示す。The somatic mutation of a transfectant that stably expressed mouse GANP in Daudi cells is shown. Daudi細胞にマウスGANPを安定的に発現させたトランスフェクタントの体細胞突然変異を示す。The somatic mutation of a transfectant that stably expressed mouse GANP in Daudi cells is shown. Daudi細胞にマウスGANPを安定的に発現させたトランスフェクタントの体細胞突然変異を示す。The somatic mutation of a transfectant that stably expressed mouse GANP in Daudi cells is shown.

B細胞でGANPを過剰発現させたトランスジェニックマウスの作製の概要を示す。An outline of production of a transgenic mouse in which GANP is overexpressed in B cells is shown. B細胞でGANPを過剰発現させたトランスジェニックマウスの作製の概要を示す。An outline of production of a transgenic mouse in which GANP is overexpressed in B cells is shown. B細胞でGANPを過剰発現させたトランスジェニックマウスの作製の概要を示す。An outline of production of a transgenic mouse in which GANP is overexpressed in B cells is shown. GANP過剰発現トランスジェニック（Tg）マウス又は野生型マウスにおける体細胞突然変異を解析した結果を示す。The result of analyzing somatic mutation in a GANP overexpression transgenic (Tg) mouse or a wild type mouse is shown. GANP過剰発現トランスジェニック（Tg）マウス又は野生型マウスにおける体細胞突然変異を解析した結果を示す。The result of analyzing somatic mutation in a GANP overexpression transgenic (Tg) mouse or a wild type mouse is shown. GANP過剰発現トランスジェニック（Tg）マウス又は野生型マウスにおける体細胞突然変異を解析した結果を示す。The result of analyzing somatic mutation in a GANP overexpression transgenic (Tg) mouse or a wild type mouse is shown. GANP過剰発現トランスジェニック（Tg）マウス又は野生型マウスにおける体細胞突然変異を解析した結果を示す。The result of analyzing somatic mutation in a GANP overexpression transgenic (Tg) mouse or a wild type mouse is shown. GANP過剰発現トランスジェニック（Tg）マウス又は野生型マウスにおける体細胞突然変異を解析した結果を示す。The result of analyzing somatic mutation in a GANP overexpression transgenic (Tg) mouse or a wild type mouse is shown. GANP過剰発現トランスジェニック（Tg）マウス又は野生型マウスにおける体細胞突然変異を解析した結果を示す。The result of analyzing somatic mutation in a GANP overexpression transgenic (Tg) mouse or a wild type mouse is shown.

B細胞特異的GANP欠損マウス(B-GANP-/-)の作製の概要を示す。An outline of production of a B cell-specific GANP-deficient mouse (B-GANP − / − ) is shown. B細胞特異的GANP欠損マウス(B-GANP-/-)の作製の概要を示す。An outline of production of a B cell-specific GANP-deficient mouse (B-GANP − / − ) is shown. B細胞特異的GANP欠損マウス(B-GANP-/-)の作製の概要を示す。An outline of production of a B cell-specific GANP-deficient mouse (B-GANP − / − ) is shown. B細胞特異的GANP欠損マウス(B-GANP-/-)の作製の概要を示す。An outline of production of a B cell-specific GANP-deficient mouse (B-GANP − / − ) is shown. B細胞特異的GANP欠損マウス(B-GANP-/-)の作製の概要を示す。An outline of production of a B cell-specific GANP-deficient mouse (B-GANP − / − ) is shown. B細胞特異的GANP欠損マウス(B-GANP-/-)を用いた細胞表面染色の結果（フローサイトメトリー）を示す。The results (flow cytometry) of cell surface staining using B cell-specific GANP-deficient mice (B-GANP − / − ) are shown. B細胞の増殖アッセイの結果を示す。ほとんど差はなかったが、抗CD40抗体刺激による増殖のみが約1/2に減少していた。The results of a B cell proliferation assay are shown. Although there was almost no difference, only the proliferation by anti-CD40 antibody stimulation was reduced to about 1/2.

免疫をしていないCre-flox/+マウス及びB-GANP-/-マウス血清中の抗体価を示す。各種アイソタイプの抗体価に差はなかった。Antibody titers in sera of non-immunized Cre-flox / + mice and B-GANP − / − mice are shown. There was no difference in the antibody titers of various isotypes. B-GANP-/-マウスにおける抗体産生を測定した結果を示す。The result of measuring antibody production in B-GANP − / − mice is shown. GCをピーナッツアグルチニンで染色した結果を示す。The result of staining GC with peanut agglutinin is shown. B-GANP-/-マウスにおける抗原特異的抗体産生を測定した結果を示す。The result of measuring antigen-specific antibody production in B-GANP − / − mice is shown. 100μｇのNP-CGを免疫し、免疫後14日及び35日目における親和性の成熟の度合いをディファレンシャルELISAにより測定した結果を示す。The results of immunization with 100 μg of NP-CG and measurement of the degree of maturity of affinity on the 14th and 35th days after immunization by differential ELISA are shown. GC-B細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。The results of flow cytometry of GC-B cells are shown.

Cre-flox/+のVH186.2をPCRで増幅し、シークエンス解析を行った結果を示す（図20Aから図20Fに順に続く）。Cre-flox / + V H 186.2 was amplified by PCR, and the results of sequence analysis are shown (in order from FIG. 20A to FIG. 20F). Cre-flox/+のVH186.2をPCRで増幅し、シークエンス解析を行った結果を示す（図20Aから図20Fに順に続く）。Cre-flox / + V H 186.2 was amplified by PCR, and the results of sequence analysis are shown (in order from FIG. 20A to FIG. 20F). Cre-flox/+のVH186.2をPCRで増幅し、シークエンス解析を行った結果を示す（図20Aから図20Fに順に続く）。Cre-flox / + V H 186.2 was amplified by PCR, and the results of sequence analysis are shown (in order from FIG. 20A to FIG. 20F). Cre-flox/+のVH186.2をPCRで増幅し、シークエンス解析を行った結果を示す（図20Aから図20Fに順に続く）。Cre-flox / + V H 186.2 was amplified by PCR, and the results of sequence analysis are shown (in order from FIG. 20A to FIG. 20F). Cre-flox/+のVH186.2をPCRで増幅し、シークエンス解析を行った結果を示す（図20Aから図20Fに順に続く）。Cre-flox / + V H 186.2 was amplified by PCR, and the results of sequence analysis are shown (in order from FIG. 20A to FIG. 20F). Cre-flox/+のVH186.2をPCRで増幅し、シークエンス解析を行った結果を示す（図20Aから図20Fに順に続く）。Cre-flox / + V H 186.2 was amplified by PCR, and the results of sequence analysis are shown (in order from FIG. 20A to FIG. 20F). Cre-flox/+のVH186.2をPCRで増幅し、シークエンス解析を行った結果を示す（図20Gから図20Lに順に続く）。Cre-flox / + V H 186.2 was amplified by PCR, and the results of sequence analysis are shown (in order from FIG. 20G to FIG. 20L). Cre-flox/+のVH186.2をPCRで増幅し、シークエンス解析を行った結果を示す（図20Gから図20Lに順に続く）。Cre-flox / + V H 186.2 was amplified by PCR, and the results of sequence analysis are shown (in order from FIG. 20G to FIG. 20L). Cre-flox/+のVH186.2をPCRで増幅し、シークエンス解析を行った結果を示す（図20Gから図20Lに順に続く）。Cre-flox / + V H 186.2 was amplified by PCR, and the results of sequence analysis are shown (in order from FIG. 20G to FIG. 20L). Cre-flox/+のVH186.2をPCRで増幅し、シークエンス解析を行った結果を示す（図20Gから図20Lに順に続く）。Cre-flox / + V H 186.2 was amplified by PCR, and the results of sequence analysis are shown (in order from FIG. 20G to FIG. 20L). Cre-flox/+のVH186.2をPCRで増幅し、シークエンス解析を行った結果を示す（図20Gから図20Lに順に続く）。Cre-flox / + V H 186.2 was amplified by PCR, and the results of sequence analysis are shown (in order from FIG. 20G to FIG. 20L). Cre-flox/+のVH186.2をPCRで増幅し、シークエンス解析を行った結果を示す（図20Gから図20Lに順に続く）。Cre-flox / + V H 186.2 was amplified by PCR, and the results of sequence analysis are shown (in order from FIG. 20G to FIG. 20L).

Cre-flox/+及びB-GANP-/-マウスにおけるIgG1の変異の頻度を示す。The frequency of IgG1 mutations in Cre-flox / + and B-GANP − / − mice is shown. VH186.2の33番目のWをLに変異させたときの変異の頻度を示す。The frequency of mutation when 33rd W of V H 186.2 is mutated to L is shown. 活性化誘導細胞死(AICD)の測定結果及びアポトーシスの抑制結果を示す。The measurement result of activation-induced cell death (AICD) and the suppression result of apoptosis are shown. 抗CD40及び抗CD95刺激に対する細胞のアポトーシス感受性を測定した結果を示す。The result of having measured the apoptosis sensitivity of the cell with respect to anti-CD40 and anti-CD95 stimulation is shown. TUNELアッセイによりアポトーシス細胞を検出した結果を示す。The result of detecting apoptotic cells by TUNEL assay is shown. TUNELアッセイによりアポトーシス細胞を検出した結果を示す。The result of detecting apoptotic cells by TUNEL assay is shown. アポトーシス抑制に関与するBcl-2ファミリーのRNA発現レベルを示す。The RNA expression level of the Bcl-2 family involved in apoptosis suppression is shown. GANPトランスジェニックマウスを用いて高親和性抗体を産生した結果を示す。The result of producing high affinity antibodies using GANP transgenic mice is shown. GANPトランスジェニックマウス由来のハイブリドーマクローンを用いて高親和性抗体を産生した結果を示す。The result of producing a high affinity antibody using a hybridoma clone derived from a GANP transgenic mouse is shown. GANPトランスジェニックマウス由来のハイブリドーマクローン培養上清を用いたBiacoreによる結合解離曲線を示す。The binding dissociation curve by Biacore using the hybridoma clone culture supernatant derived from a GANP transgenic mouse is shown.

GANPトランスジェニックマウス由来のハイブリドーマクローン培養上清を用いたBiacoreによる結合解離曲線を示す。The binding dissociation curve by Biacore using the hybridoma clone culture supernatant derived from a GANP transgenic mouse is shown. GANP-GST融合タンパク質の構造の概略を示す。The outline of the structure of GANP-GST fusion protein is shown. MCMと直接結合するGANPの領域を決定するためのプルダウンアッセイの結果を示す。左に大きさのスタンダードの位置を示す。The results of a pull-down assay to determine the region of GANP that directly binds to MCM are shown. The position of the size standard is shown on the left. in vitro翻訳されたMCMを用いたプルダウンアッセイの結果を示す。The result of the pull-down assay using MCM translated in vitro is shown. GANP各構築物とMCMの結合を免疫沈降によって示す。Binding of each GANP construct to MCM is shown by immunoprecipitation. GANP各構築物とMCMの結合を免疫沈降によって示す。Binding of each GANP construct to MCM is shown by immunoprecipitation. GANP各構築物とMCMの結合を免疫沈降によって示す。Binding of each GANP construct to MCM is shown by immunoprecipitation. GANP構築物の構造の概要及び、構築物の細胞内での分布を示す。An outline of the structure of the GANP construct and the distribution of the construct in the cell are shown.

GANP構築物の細胞内での分布を示す。The intracellular distribution of the GANP construct is shown. MCM3の核における局在化を示す。The localization in the nucleus of MCM3 is shown. GANPの発現によって誘導されるMCM3の細胞質局在化を示す。2 shows cytoplasmic localization of MCM3 induced by GANP expression. 核に局在する対照タンパク質を示す。A control protein localized in the nucleus is shown. MCM３変異体の局在化におけるGANP構築物の効果を示す。Figure 3 shows the effect of GANP construct on the localization of MCM3 mutants. ヘテロカリオンアッセイによって検出されるMCM3の核-細胞質間シャトリングを示す。Figure 3 shows nuclear-cytoplasmic shuttling of MCM3 detected by heterokaryon assay. 細胞周期の間のGANPの局在化を示す。Shows the localization of GANP during the cell cycle.

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、GANP遺伝子を非ヒト哺乳動物に導入してトランスジェニック動物を作製し、そのようなトランスジェニック動物を抗原で免疫すると、高親和性の抗体が得られる知見に基づいて完成されたものである。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention has been completed based on the knowledge that a high-affinity antibody can be obtained by introducing a GANP gene into a non-human mammal to produce a transgenic animal and immunizing such transgenic animal with an antigen. It is.


１．GANP
GANPは、胚中心結合核タンパク質(Germinal center-associated nuclear protein)と呼ばれており、酵母Sac3タンパク質とホモロジーを有する210kDaの核タンパク質である（WO00/50611号公報）。そして、SAC3はアクチン形成の抑制物質として特徴づけられている。また、GANPは、濾胞樹状細胞(follicular dendritic cells: FDC)により囲まれる胚中心(germinal center, GC)B細胞において選択的にアップレギュレートされ、リン酸化依存性RNA-プライマーゼ活性を有し、B細胞の細胞周期調節に関与しているタンパク質である (Kuwahara, K. et al., (2000) Blood 95, 2321-2328)。
本発明においては、GANPタンパク質のアミノ酸配列を、マウスについて配列番号2に、ヒトについて配列番号4に示す。また、GANPタンパク質をコードする遺伝子（GANP遺伝子という）の塩基配列を、マウスについて配列番号1に、ヒトについて配列番号3に示す。なお、上記アミノ酸配列及び塩基配列は、国際公開WO00/50611号公報にも記載されている。
1. GANP
GANP is called a germinal center-associated nuclear protein and is a 210 kDa nuclear protein having homology with the yeast Sac3 protein (WO00 / 50611). SAC3 has been characterized as an inhibitor of actin formation. GANP is selectively up-regulated in germinal center (GC) B cells surrounded by follicular dendritic cells (FDCs) and has phosphorylation-dependent RNA-primase activity. It is a protein involved in cell cycle regulation of B cells (Kuwahara, K. et al., (2000) Blood 95, 2321-2328).
In the present invention, the amino acid sequence of the GANP protein is shown in SEQ ID NO: 2 for mice and SEQ ID NO: 4 for humans. Further, the base sequence of a gene encoding GANP protein (referred to as GANP gene) is shown in SEQ ID NO: 1 for mice and SEQ ID NO: 3 for humans. The amino acid sequence and the base sequence are also described in International Publication WO00 / 50611.

またGANPタンパク質は変異体でもよく、配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であってRNAプライマーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。例えば、配列番号2又は4に示すアミノ酸配列のうち1若しくは複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1個〜10個、さらに好ましくは1個〜5個））のアミノ酸が欠失しており、1若しくは複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1個〜10個、さらに好ましくは1個〜5個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されており、及び／又は1若しくは複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1個〜10個、さらに好ましくは1個〜5個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記GANPタンパク質と同様のRNAプライマーゼ活性を有するGANP変異型タンパク質を使用することもできる。   In addition, the GANP protein may be a variant, and may be an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and the protein has RNA primase activity. Good. For example, one or more (preferably one or several (eg, 1 to 10, more preferably 1 to 5)) amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 are deleted. One or more (preferably one or several (eg, 1 to 10, more preferably 1 to 5)) amino acids are substituted with other amino acids, and / or one or more RNA primase having an amino acid sequence to which other amino acids (preferably one or several (eg, 1 to 10, more preferably 1 to 5)) are added, and similar to the GANP protein A GANP mutant protein having activity can also be used.

「RNAプライマーゼ活性」とは、RNA複製において、5'→3'方向に進む鎖の伸長とは逆向きの鎖（ラギング鎖）を合成する際に、伸長の開始点となる短いプライマーのRNAを合成する酵素活性を意味する。通常はαプライマーゼと呼ばれるDNAポリメラーゼαと結合する分子が用いられるが、胚中心B細胞では第二のプライマーゼであるGANPプライマーゼも誘導されている。
GANPタンパク質は、上記配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列又はこれらの変異型アミノ酸配列のほか、N末端側の一部の配列（例えば配列番号２に示すアミノ酸配列の1〜600番、好ましくは139〜566番）又はこれらの変異型アミノ酸配列を有するものも含まれる。 “RNA primase activity” refers to a short primer RNA that serves as the starting point of elongation when synthesizing a strand (lagging strand) in the opposite direction to the elongation of a strand that proceeds in the 5 ′ → 3 ′ direction during RNA replication. Means the enzymatic activity to synthesize Normally, a molecule that binds to DNA polymerase α called α-primase is used, but GANP primase, which is the second primase, is also induced in germinal center B cells.
In addition to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 or a mutant amino acid sequence thereof, GANP protein is a partial sequence on the N-terminal side (for example, 1 to 600 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably 139 ˜566) or those having these mutant amino acid sequences are also included.

本発明において、動物に導入するためのGANP遺伝子は、上記GANPタンパク質、N末側の一部の配列、又は変異型タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。そのような遺伝子として、例えば配列番号1又は3に示す塩基配列を有するものを使用することができる。配列番号1又は3に示す塩基配列のうち、コード領域のみの塩基配列であってもよい。また、上記配列番号1又は3に示す塩基配列に相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、RNAプライマーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を使用することも可能である。
「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイズさせた後の洗浄時の条件であって塩（ナトリウム）濃度が150〜900mMであり、温度が55〜75℃、好ましくは塩（ナトリウム）濃度が250〜450 mMであり、温度が68℃での条件をいう。 In the present invention, examples of the GANP gene for introduction into animals include the above-mentioned GANP protein, a partial sequence at the N-terminal side, or a gene encoding a mutant protein. As such a gene, for example, a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 can be used. Of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, it may be a base sequence of only the coding region. It is also possible to use a gene that hybridizes with a sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 under a stringent condition and encodes a protein having RNA primase activity. .
“Stringent conditions” are the conditions for washing after hybridization, the salt (sodium) concentration is 150 to 900 mM, the temperature is 55 to 75 ° C., preferably the salt (sodium) concentration is 250. It is about 450 mM and the temperature is 68 ° C.

遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばGeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）を用いて行うことができる。
変異遺伝子の詳細並びに取得方法は国際公開WO00/50611号公報にも記載されている。 In order to introduce a mutation into a gene, a mutation introduction kit using a site-directed mutagenesis method, for example, GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen), by a known method such as Kunkel method or Gapped duplex method. , TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Takara Bio Inc.) can be used.
Details of the mutant gene and the method for obtaining it are also described in International Publication No. WO00 / 50611.

なお、抗μ抗体及び抗CD-40モノクローナル抗体でB細胞をin vitro刺激すると、GANP発現のアップレギュレーションのみならず、GANPタンパク質のアミノ酸配列のうち特定のセリン残基（例えば502番目のセリン: S502）のリン酸化を引き起こす。この反応は、GANPのRNA-プライマーゼ活性についてキーとなる反応である(Kuwahara, K. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 10279-10283)。GANPタンパク質のN末端側のRNA-プライマーゼドメインはセリン残基を含んでおり、そのリン酸化はin vitroにおいてCdk2によって触媒される。C末端側ドメインにより、GANPはMCM3複製ライセンシング因子に結合する(Kuwahara, K. et al., (2000) Blood 95, 2321-2328; Abe, E. et al. (2000) Gene 255, 219-227)。   In addition, when B cells were stimulated in vitro with anti-μ antibody and anti-CD-40 monoclonal antibody, not only up-regulation of GANP expression but also a specific serine residue in the amino acid sequence of GANP protein (for example, the 502nd serine: S502) ) Causes phosphorylation. This reaction is a key reaction for the RNA-primase activity of GANP (Kuwahara, K. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 10279-10283). The N-terminal RNA-primase domain of GANP protein contains a serine residue, and its phosphorylation is catalyzed by Cdk2 in vitro. Due to the C-terminal domain, GANP binds to the MCM3 replication licensing factor (Kuwahara, K. et al., (2000) Blood 95, 2321-2328; Abe, E. et al. (2000) Gene 255, 219-227 ).


２．GANP遺伝子を導入したトランスジェニック哺乳動物
本発明は、GANP遺伝子を導入したトランスジェニック哺乳動物に関するものであり、当該トランスジェニック哺乳動物は、好ましくは、導入したGANP遺伝子をB細胞で発現することができる。
2. The present invention relates to a transgenic mammal into which a GANP gene has been introduced, and the transgenic mammal can preferably express the introduced GANP gene in B cells. .

(1) GANP遺伝子とその関連分子
GANP遺伝子とその関連分子で形成される複合体は、遺伝子に変異を誘導するプロセスで直接および間接的に必要な分子である。GANPタンパク質は、遺伝子変異を修復する際に、高親和性の抗体が得られるようにV領域の変異の誘導を促す能力を保有していることから、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、このGANP遺伝子又はその変異遺伝子の導入によって、獲得性免疫の高親和性抗体産生を促進することができる。また、この遺伝子を過剰に発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、速やかに抗原に対する結合力の高い抗体を産生することができる。従って、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物を所定の抗原で免疫することで、従来では得られないような高親和性の抗体を簡便に得ることができる。その結果、難治性の病原微生物や異物を排除できるポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を得ることができる。また、本発明のトランスジェニック哺乳動物を用いてヒト型化抗体を作製することによって、あるいは、本発明のトランスジェニック哺乳動物が産生する抗体のV領域を含む一本鎖抗体を作製することによって、抗体療法の効力を飛躍的に高めることが可能となる。 (1) GANP gene and related molecules
The complex formed by the GANP gene and its related molecules is a molecule that is required directly and indirectly in the process of inducing mutations in the gene. Since the GANP protein has the ability to promote the induction of mutations in the V region so that high-affinity antibodies can be obtained when repairing gene mutations, the transgenic mammal of the present invention has the ability to promote this GANP protein. By introducing a gene or a mutant gene thereof, high affinity antibody production of acquired immunity can be promoted. In addition, transgenic non-human mammals that overexpress this gene can rapidly produce antibodies with high binding power to the antigen. Therefore, by immunizing the transgenic non-human mammal with a predetermined antigen, a high-affinity antibody that cannot be obtained conventionally can be easily obtained. As a result, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody that can exclude refractory pathogenic microorganisms and foreign substances can be obtained. Further, by producing a humanized antibody using the transgenic mammal of the present invention, or by producing a single chain antibody containing the V region of the antibody produced by the transgenic mammal of the present invention, It becomes possible to dramatically increase the efficacy of antibody therapy.

本発明のトランスジェニック哺乳動物は、GANP又はその変異遺伝子の導入によって、B細胞で高親和性抗体の産生を促進することができ、前記高親和性抗体産生細胞はアポトーシスを誘導するシグナルに対して抵抗性を有する。
本発明者らは、GANPが獲得免疫応答の抗体産生に機能している分子であることを確認するため、先ずGANP遺伝子の欠損マウスをB細胞選択的に欠損するように企図して作製した。その結果、GANP遺伝子が欠損しても、免疫系の細胞の発達、分化、増殖には影響が見られず、また抗体の産生総和には大きな変化は見られないことが判明した。 The transgenic mammal of the present invention can promote the production of high-affinity antibodies in B cells by introducing GANP or a mutant gene thereof, and the high-affinity antibody-producing cells respond to signals that induce apoptosis. Has resistance.
In order to confirm that GANP is a molecule that functions in antibody production of an acquired immune response, the present inventors first made a GANP gene-deficient mouse with the intention of deleting B cells selectively. As a result, it was found that even when the GANP gene was deficient, there was no effect on the development, differentiation and proliferation of cells of the immune system, and no significant change was seen in the total production of antibodies.

ここで、抗原と反応したB細胞がそのまま増殖し、抗体産生細胞に分化するものは、ある種の抗原の場合に限られており、通常の抗原に対する抗体産生についてはT細胞の共存を必要とする。T細胞が存在しなくても抗体が産生されるような抗原をT細胞非依存性抗原という。これに対し、T細胞非依存性抗原以外の一般の抗原をT細胞依存性抗原という。T細胞依存性抗原の場合は、B細胞の抗体産生細胞への分化がヘルパーT細胞により補助される。
病原ウイルスの抗原決定基（抗原エピトープとも言う）の多くはそれ自体免疫原性が弱く、T細胞によって認識されるキャリアタンパク質のペプチド抗原によって活性化を受ける。 Here, B cells that have reacted with antigens proliferate as they are and differentiate into antibody-producing cells are limited to certain antigens, and T cells need to coexist for the production of antibodies against normal antigens. To do. Antigens that produce antibodies even in the absence of T cells are referred to as T cell-independent antigens. In contrast, general antigens other than T cell-independent antigens are referred to as T cell-dependent antigens. In the case of a T cell-dependent antigen, differentiation of B cells into antibody-producing cells is assisted by helper T cells.
Many of the antigenic determinants (also called antigenic epitopes) of pathogenic viruses are themselves weakly immunogenic and are activated by peptide antigens of carrier proteins recognized by T cells.

本発明においては、通常の動物では、強力な抗体を産生できないような可溶性の抗原に対する抗体産生応答に対して、GANP遺伝子導入動物では高頻度に高親和性の抗体を産生することができることを調べるため、ハプテンとして解析が進んでいるニトロフェニル基 (NP基)をニワトリ-ガンマグロブリンと結合させて抗原(NP-CGという)を作製し、T細胞性依存性抗原の反応を調べた。
ここで、C57BL/6マウスのNPに対する反応は単一のV領域で行われることが知られている。この反応は、抗体のIgG重鎖のV領域（VH186.2という）とL鎖ラムダ1遺伝子によってのみ形成されるというものである。このシステムを使えば、アイソタイプがIgG1の抗体について、VH186.2のアミノ酸配列を調べることによって高親和性抗体の遺伝子変異を調べることが可能である。しかも、最も強い親和性は、重鎖V領域（VH186.2）のアミノ酸配列のうち、第33番目のアミノ酸であるトリプトファン(W)がロイシン(L)に変異(W33-L)したときに生じることが報告されている。 In the present invention, it is examined that high-affinity antibodies can be produced with high frequency in GANP transgenic animals in response to antibody production responses to soluble antigens that cannot produce strong antibodies in normal animals. Therefore, an antigen (referred to as NP-CG) was prepared by combining a nitrophenyl group (NP group), which has been analyzed as a hapten, with chicken-gamma globulin, and the reaction of a T cell-dependent antigen was examined.
Here, it is known that the response of C57BL / 6 mice to NP occurs in a single V region. This reaction is formed only by the IgG heavy chain V region (referred to as V H 186.2) of the antibody and the L chain lambda 1 gene. With this system, the isotype of IgG 1 antibody, it is possible to examine the genetic variation of high affinity antibodies by examining the amino acid sequence of the V H 186.2. Moreover, the strongest affinity occurs when tryptophan (W), the 33rd amino acid in the amino acid sequence of the heavy chain V region (V H 186.2) is mutated (W33-L) to leucine (L). It has been reported.

そこで、本発明者は、GANP遺伝子欠損マウスでW33-L変異を起こさせたときに、高親和性抗体が産生されるか否かを調べた。その結果、対照であるCre-flox/+マウスに比べて高親和性抗体産生はほとんど見られなかった。従って、GANP遺伝子は、高親和性抗体を産生するための重要な機能を有する遺伝子であることが判明した。このことをさらに検証するために、GANP遺伝子を過剰に発現するマウスを作製した。GANP遺伝子の過剰発現は、マウス免疫グロブリンプロモーター部分とヒト免疫グロブリン遺伝子イントロンエンハンサー部分をGANP遺伝子の5'側に連結して、B細胞で選択的に発現させることによって行った。   Therefore, the present inventor examined whether a high affinity antibody was produced when a W33-L mutation was caused in a GANP gene-deficient mouse. As a result, almost no high-affinity antibody production was seen compared to the control Cre-flox / + mouse. Therefore, the GANP gene was found to be a gene having an important function for producing a high affinity antibody. In order to further verify this, mice that overexpress the GANP gene were generated. Overexpression of the GANP gene was performed by linking a mouse immunoglobulin promoter portion and a human immunoglobulin gene intron enhancer portion to the 5 ′ side of the GANP gene and selectively expressing them in B cells.

上記GANP過剰発現マウスも正常に生まれ、リンパ組織の発達、分化、増殖には変化が見られないが、NP-CGに対する反応では、著しく高親和性型のV領域遺伝子(W33-L)が増加していた。RNAプライマーゼ活性がこの際にどのような機能的な役割を担っているかについてはまだ確定されていないが、(i) GANP分子のプライマーゼ活性をみる指標となる502番目のセリン残基のリン酸化が胚中心の高親和性B細胞の生み出される領域の細胞（セントロサイト）に高いこと、(ii) Daudi細胞へのganp遺伝子導入実験によって誘導されるV領域の突然変異の頻度が高いことから、GANP分子のRNA プライマーゼ活性あるいはそれに関わる502番目のセリン残基のリン酸化が高親和性抗体産生に関連していると考えている。この結果は、GANP分子を高発現させること、及びRNAプライマーゼ活性を賦活化することが、免疫応答による高親和性抗体の産生に必要であることを示すものである。   The above GANP-overexpressing mice are also born normally, and there is no change in the development, differentiation, and proliferation of lymphoid tissues, but the response to NP-CG significantly increases the high affinity V region gene (W33-L). Was. The functional role of RNA primase activity at this time has not yet been determined, but (i) the phosphorylation of the serine residue at position 502, which serves as an indicator of the primase activity of the GANP molecule. Oxidation is high in cells (centrosites) where high-affinity B cells are generated in the germinal center, and (ii) the frequency of V region mutations induced by ganp gene transfer experiments into Daudi cells is high We believe that the RNA primase activity of GANP molecule or phosphorylation of the 502nd serine residue associated with it is related to high affinity antibody production. This result indicates that high expression of GANP molecules and activation of RNA primase activity are necessary for production of high affinity antibodies by immune response.

(2) GANP遺伝子導入用哺乳動物
本発明における「哺乳動物」とは、ウシ、ウマ、ブダ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター及びモルモット等の任意の非ヒト哺乳動物を意味し、好ましくはマウス、ウサギ、ラットまたはハムスターであり、特に好ましくはマウスである。
本発明のトランスジェニック哺乳動物は、未受精卵、受精卵、***およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）の細胞に対して、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE-デキストラン法などにより、GANP遺伝子を導入することにより作製することができる。また、上記遺伝子導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とするGANP遺伝子を転移させ、細胞培養、組織培養などに利用することもできる。さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより、トランスジェニック哺乳動物を作製することもできる。 (2) Mammals for GANP gene introduction In the present invention, “mammal” means any non-human mammal such as cow, horse, buda, goat, rabbit, dog, cat, mouse, rat, hamster and guinea pig. Of these, mice, rabbits, rats and hamsters are preferred, and mice are particularly preferred.
The transgenic mammal of the present invention preferably has a stage of embryogenesis in the development of a non-human mammal (more preferably, a single cell) with respect to an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm and a germ cell containing the progenitor cell thereof. Alternatively, the GANP gene can be applied to cells at the fertilized egg cell stage and generally before the 8-cell stage by the calcium phosphate method, electric pulse method, lipofection method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc. It can produce by introducing. In addition, by the gene introduction method, the target GANP gene can be transferred to somatic cells, living organs, tissue cells, etc., and used for cell culture, tissue culture, and the like. Furthermore, a transgenic mammal can also be produced by fusing these cells with the above-mentioned embryo cells by a known cell fusion method.

GANP遺伝子を対象動物に導入させる際、当該遺伝子を対象となる動物の細胞で発現させうるプロモーターの下流に連結した遺伝子構築物として導入することが好ましい。具体的には、目的とするGANP遺伝子を有する各種哺乳動物由来のGANP遺伝子を発現させうる各種プロモーターの下流に、GANP遺伝子を連結したベクターを、対象となる哺乳動物の受精卵（例えば、マウス受精卵）にマイクロインジェクションすることによって、目的とするGANP遺伝子を高発現するトランスジェニック哺乳動物を作製することができる。   When a GANP gene is introduced into a target animal, it is preferably introduced as a gene construct linked downstream of a promoter that can be expressed in cells of the target animal. Specifically, a vector in which a GANP gene is linked downstream of various promoters capable of expressing a GANP gene derived from various mammals having the target GANP gene is used as a fertilized egg (eg, mouse fertilization) of the target mammal. Eggs) can be microinjected to produce a transgenic mammal that highly expresses the target GANP gene.

(3) 発現ベクター
GANP遺伝子の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルス又はバキュロウイルスなどの動物又は昆虫ウイルスなどが用いられる。
遺伝子発現の調節を行うプロモーターとしては、たとえばウイルス由来遺伝子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）由来遺伝子のプロモーターなどを使用することが可能である。 (3) Expression vector
GANP gene expression vectors include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as λ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, animal or insect viruses such as vaccinia virus or baculovirus Etc. are used.
Examples of promoters that regulate gene expression include virus-derived gene promoters, promoters of various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.) and birds (chicken, etc.). It is possible to use.

ウイルス由来遺伝子のプロモーターとしては、例えばサイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、JCウイルス、乳癌ウイルス等由来遺伝子のプロモーターが挙げられる。
各種哺乳動物及び鳥類由来遺伝子のプロモーターとしては、例えば、アルブミン、インスリンII、エリスロポエチン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンK1,K10およびK14、コラーゲンI型およびII型、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ-水酸化酵素、内皮レセプターチロシンキナーゼ、ナトリウムカリウムアデノシン3リン酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインI及びIIA、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、MHCクラスI抗原、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子1α（EF-1α）、βアクチン、α及びβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１及び２、ミエリン基礎タンパク、血清アミロイドPコンポーネント、ミオグロビン、レニンなどの遺伝子のプロモーターが挙げられる。 Examples of virus-derived gene promoters include promoters of genes derived from cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus and the like.
Examples of promoters derived from various mammals and birds include albumin, insulin II, erythropoietin, endothelin, osteocalcin, muscle creatine kinase, platelet-derived growth factor β, keratin K1, K10 and K14, collagen types I and II, atrium Natriuretic factor, dopamine β-hydroxylase, endothelial receptor tyrosine kinase, sodium potassium adenosine 3 kinase, neurofilament light chain, metallothionein I and IIA, metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen, smooth muscle α-actin , Polypeptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β actin, α and β myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, serum amyloid P component, myoglobin, renin It is done.

上記ベクターは、トランスジェニック哺乳動物において目的とするメッセンジャーRNAの転写を終結するターミネターを有していてもよい。その他、GANP遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の5'上流、プロモーター領域と翻訳領域間、あるいは翻訳領域の3'下流 に連結することも所望により可能である。
本発明の好ましい態様では、免疫グロブリンプロモーターの下流にGANP遺伝子を連結することにより、あるいはヒト免疫グロブリン遺伝子イントロンエンハンサー部分をGANP遺伝子の5'側に連結することにより、GANP遺伝子をB細胞で選択的に発現させることができる。 The vector may have a terminator that terminates transcription of the target messenger RNA in the transgenic mammal. In addition, for the purpose of further expressing the GANP gene, splicing signals of each gene, enhancer region, part of intron of eukaryotic gene 5 'upstream of promoter region, between promoter region and translation region, or 3 of translation region 'Connecting downstream is possible if desired.
In a preferred embodiment of the present invention, the GANP gene is selectively expressed in B cells by linking the GANP gene downstream of the immunoglobulin promoter or by linking the human immunoglobulin gene intron enhancer portion to the 5 ′ side of the GANP gene. Can be expressed.

(4) GANP遺伝子の導入
受精卵細胞段階におけるGANP遺伝子の導入は、対象の哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保することが好ましい。遺伝子導入後の作出動物の胚芽細胞においてGANP遺伝子が過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てにGANP遺伝子を過剰に有することを意味する。そして、遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てにGANP蛋白質を過剰に有する。
本発明においては、導入遺伝子を相同染色体の一方に持つヘテロ接合体を取得し、ヘテロ接合体同士を交配することで導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモ接合体を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が導入されたGANP遺伝子を安定に保持する。そして、GANP遺伝子を過剰に有することを確認して、通常の飼育環境で繁殖継代することができる。 (4) Introduction of GANP gene The introduction of the GANP gene at the fertilized egg cell stage is preferably ensured to be excessively present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal. Excessive GANP gene in the germ cells of the produced animal after gene transfer means that all the offspring of the produced animal have excess GANP gene in all of the germ cells and somatic cells. And the offspring of this type of animal that inherited the gene has an excess of GANP protein in all of its germ cells and somatic cells.
In the present invention, a heterozygote having a transgene on one of the homologous chromosomes is obtained, and a homozygote having the transgene on both of the homologous chromosomes is obtained by mating the heterozygotes. The GANP gene into which all the offspring have been introduced is stably retained. And it can confirm that it has GANP gene excessively and can breed and pass in a normal breeding environment.

トランスジェニック対象動物が有する内在性の遺伝子とは異なる遺伝子である外来性GANP遺伝子を対象非ヒト哺乳動物（好ましくはマウスなど）、又はその先祖の受精卵（バッククロス）に転移する際に用いられる受精卵は、同種の雄哺乳動物と雌哺乳動物を交配させることによって得られる。
受精卵は自然交配によっても得られるが、雌哺乳動物の性周期を人工的に調節した後、雄哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌哺乳動物の性周期を人工的に調節する方法としては、例えば、初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン(PMSG)）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)）を、例えば腹腔注射などにより投与する方法が好ましい。 Used when transferring an exogenous GANP gene, which is a gene different from the endogenous gene of the transgenic target animal, to the target non-human mammal (preferably mouse etc.) or its ancestral fertilized egg (back cross) A fertilized egg is obtained by crossing male and female mammals of the same species.
Although fertilized eggs can be obtained by natural mating, a method of mating with a male mammal after artificially adjusting the sexual cycle of the female mammal is preferred. Examples of methods for artificially adjusting the female sexual cycle include follicle stimulating hormone (pregnant horse serum gonadotropin (PMSG)) and then luteinizing hormone (human chorionic gonadotropin (hCG)). For example, by intraperitoneal injection.

得られた受精卵に、前述の方法により外来性GANP遺伝子を導入した後、雌哺乳動物に人工的に移植・着床することにより、外来性遺伝子を組み込んだDNAを有する非ヒト哺乳動物が得られる。雌哺乳動物に黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)を投与後、雄哺乳動物と交配させることにより受精能を誘起された偽妊娠雌哺乳動物に、受精卵を人工的に移植・着床させる方法が好ましい。遺伝子を導入する全能性細胞としては、マウスの場合、受精卵や初期胚を用いることができる。また培養細胞への遺伝子導入法としては、トランスジェニック哺乳動物個体の産出効率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、DNAのマイクロインジェクションが好ましい。
遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（マウスの場合には、例えば、尾部先端）からDNAを抽出し、サザン解析やPCR法により導入遺伝子の存在を確認することができる。導入遺伝子の存在が確認された個体を初代（Founder）とすれば、導入遺伝子はその子(F1)の50%に伝達される。さらに、このF1個体を野生型動物または他のF1動物と交配させることにより、２倍体染色体の片方（ヘテロ接合）または両方（ホモ接合）に導入遺伝子を有する個体(F2)を作製することができる。 After introducing the exogenous GANP gene into the resulting fertilized egg according to the method described above, artificial transplantation and implantation into a female mammal yields a non-human mammal having a DNA incorporating the exogenous gene. It is done. A method of artificially transplanting and implanting fertilized eggs to pseudopregnant female mammals whose fertility was induced by mating with male mammals after administering luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) to female mammals preferable. In the case of a mouse, a fertilized egg or an early embryo can be used as a totipotent cell into which a gene is introduced. In addition, as a method for introducing a gene into a cultured cell, DNA microinjection is preferable in consideration of the production efficiency of a transgenic mammal individual and the transgene transfer efficiency to the next generation.
The fertilized egg into which the gene has been injected is then transplanted into the oviduct of the foster parent, and after raising and born the animal to the foster parent, a part of the body (in the case of a mouse, for example, the tip of the tail) DNA can be extracted from and the presence of the transgene can be confirmed by Southern analysis or PCR. If an individual in which the presence of a transgene is confirmed is a founder, the transgene is transmitted to 50% of its offspring (F1). Furthermore, an individual (F2) having a transgene in one (heterozygous) or both (homozygous) of a diploid chromosome can be produced by mating this F1 individual with a wild type animal or another F1 animal. it can.

あるいは、GANP蛋白質高発現トランスジェニック哺乳動物は、上記したGANP遺伝子をES細胞（embryonic stem cell）に導入することによって作製することもできる。例えば、正常マウス胚盤胞（blastocyst）に由来するHPRT陰性（ヒポキサンチングアニン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている）ES細胞に、GANP遺伝子を導入する。当該GANP遺伝子がマウス内在性遺伝子上に相同組み換えを起こさせ、インテグレートされたES細胞をHATセレクション法により選別する。次いで、選別したES細胞を、別の正常マウスから取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする。得られた胚盤胞を、仮親としての別の正常マウスの子宮に移植する。その後、仮親マウスからキメラトランスジェニックマウスが生まれる。生まれたキメラトランスジェニックマウスを正常マウスと交配させることにより、ヘテロトランスジェニックマウスを得ることができる。そして、ヘテロトランスジェニックマウス同士を交配することにより、ホモトランスジェニックマウスが得られる。   Alternatively, a transgenic mammal with a high GANP protein expression can be produced by introducing the above-described GANP gene into an ES cell (embryonic stem cell). For example, the GANP gene is introduced into HPRT-negative (hypoxanthating aniline phosphoribosyltransferase gene-deficient) ES cells derived from normal mouse blastocysts. The GANP gene causes homologous recombination on the mouse endogenous gene, and the integrated ES cells are selected by the HAT selection method. Next, the selected ES cells are microinjected into a fertilized egg (blastocyst) obtained from another normal mouse. The obtained blastocyst is transplanted into the uterus of another normal mouse as a temporary parent. Thereafter, a chimeric transgenic mouse is born from the temporary parent mouse. A heterotransgenic mouse can be obtained by mating the born chimeric transgenic mouse with a normal mouse. And a homotransgenic mouse is obtained by mating heterotransgenic mice.

本発明においては、上記したトランスジェニック哺乳動物に限らず、その子孫、並びにトランスジェニック哺乳動物又はその子孫の一部も本発明の範囲内である。トランスジェニック哺乳動物の一部としては、当該トランスジェニック哺乳動物又はその子孫の組織、器官及び細胞などが挙げられ、器官または組織としては、脾臓、胸腺、リンパ節、骨髄あるいは扁桃腺などが挙げられ、細胞としてはB細胞などが挙げられる。
本発明のトランスジェニック哺乳動物は、B細胞をさらに活性化する哺乳動物と交配することも可能であり、これによりさらに高親和性抗体を産生することが可能である。 In the present invention, not only the above-described transgenic mammals, but also progeny thereof, and transgenic mammals or part of the progeny are within the scope of the present invention. Examples of the transgenic mammal include tissues, organs, and cells of the transgenic mammal or its progeny, and examples of the organ or tissue include spleen, thymus, lymph node, bone marrow, and tonsils. Examples of the cells include B cells.
The transgenic mammal of the present invention can be crossed with a mammal that further activates B cells, thereby producing a higher affinity antibody.

最近、MRL/lprマウスでB細胞が末梢のリンパ節での活性化の際に胚中心を経過した後、T細胞領域でさらにV領域の突然変異誘導が亢進していることが報告されている。また、本発明者らもMRL/lprマウスにおいてGANP遺伝子がIgプロモーター、エンハンサーの下流に結合して作成したganpトランスジェニックマウスに見られるのと同等の高い発現が、非免疫の状態で見られることを見出している。このことは、正常では自己の抗原に対しては高親和性の抗体はできないのに対して、この自己免疫疾患マウスでは、GANP分子の異常な活性化が起こるために、自己の抗原に対しての高親和性抗体が産生されることとなる可能性が示唆される。   Recently, it has been reported that in the MRL / lpr mice, B cells have passed through the germinal center during activation in peripheral lymph nodes, and then V region mutation induction is further enhanced in the T cell region. . In addition, the present inventors also found that in MRL / lpr mice, high expression equivalent to that seen in ganp transgenic mice prepared by binding the GANP gene downstream of the Ig promoter and enhancer is seen in a non-immune state. Is heading. This is because, normally, high-affinity antibodies against self-antigens cannot be produced, but in this autoimmune disease mouse, abnormal activation of GANP molecules occurs, so This suggests the possibility of producing high-affinity antibodies.

そこで、上記B細胞をさらに活性化する動物として、自己免疫疾患マウスであるとされるMRL/lpr, NZB, (NZB x NZW)F1などを用いれば、さらに高い変異誘導を期待できる。
以上のことを利用したMLR/lprマウスのGANPトランスジェニックマウスを作製することによって、スーパー高親和性抗体産生マウスを作出できる可能性がある。すなわち、本発明のGANP遺伝子過剰発現トランスジェニック哺乳動物とさまざまな自己免疫疾患モデル動物との交配により、高親和性抗体を産生できる哺乳動物を作製することができる。 Therefore, if MRL / lpr, NZB, (NZB x NZW) F1, or the like, which is an autoimmune disease mouse, is used as an animal that further activates the B cells, higher mutation induction can be expected.
There is a possibility that a super high affinity antibody-producing mouse can be produced by producing a GANP transgenic mouse of MLR / lpr mouse utilizing the above. That is, a mammal capable of producing a high-affinity antibody can be produced by crossing the GANP gene overexpression transgenic mammal of the present invention with various autoimmune disease model animals.


３．高親和性抗体の作製
本発明でいう抗体とは、抗原と特異的に結合する活性を有する蛋白質を意味し、好ましくはB細胞が産生するものである。本発明では、抗原に対する反応性が高い抗体のことを高親和性抗体と言う。「高親和性」とは、抗体が抗原と結合する結合能が高いことを意味し、本発明においては、抗体の結合能が一般のマウスなどの動物を用いて作製した抗体と比較して高く、また逆に当該の抗原から解離することが遅い抗体のことをいう。これは、抗原決定基（エピトープ）に対して、立体的に密接して結合する能力が高く特異的であることを意味するとともに、抗体が結合することによって抗原決定基のみならずその抗原の構造の変換をきたすことによって結果的に強力な活性（毒性の中和、ウイルスなどの感染性阻止、病原体の不活性化、生体内からの排除の促進、抗原分子の変性を引き起こす等、生物活性を示すもの）を示すことも包含している。
3. Production of High Affinity Antibody The antibody referred to in the present invention means a protein having an activity of specifically binding to an antigen, and is preferably produced by B cells. In the present invention, an antibody having high reactivity with an antigen is referred to as a high affinity antibody. “High affinity” means that an antibody has a high binding ability to bind to an antigen. In the present invention, the binding ability of an antibody is higher than that of an antibody prepared using a general animal such as a mouse. Conversely, it refers to an antibody that slowly dissociates from the antigen. This means that the antigenic determinant (epitope) has a high ability to bind in close steric manner and is specific, and the structure of the antigen as well as the antigenic determinant by binding to the antibody. As a result, the biological activity is increased by neutralizing the toxicity, blocking the infectiousness of viruses, inactivating pathogens, promoting elimination from the living body, and causing denaturation of antigen molecules. To indicate).

また、抗体の結合能（親和性）は、スキャッチャード解析やBiacore と呼ばれる表面プラズモン共鳴センサーにより、解離定数(KD)、解離速度定数(Kdiss)、結合速度定数(Kass)として測定することができる。Biacore装置は、センサーチップ、マイクロ流路系、SPR検出系の3つの技術を統合して分子結合の強さ、速さ、選択性を測定するというものであり、標識を使わずにリアルタイムで生体分子の検出と複数個の分子間での相互作用のモニタリングを行うことができる。Biacore装置としては、例えばBiacore 3000、Biacore 2000、Biacore X、Biacore J、Biacore Q（いずれもBiacore社）などが挙げられる。   The binding ability (affinity) of an antibody can be measured as a dissociation constant (KD), dissociation rate constant (Kdiss), or binding rate constant (Kass) using a Scatchard analysis or a surface plasmon resonance sensor called Biacore. it can. The Biacore device integrates the three technologies of sensor chip, microchannel system, and SPR detection system to measure the strength, speed, and selectivity of molecular bonds. Molecule detection and interaction between multiple molecules can be monitored. Examples of the Biacore apparatus include Biacore 3000, Biacore 2000, Biacore X, Biacore J, Biacore Q (all of which are Biacore).

上記Biacore によって、抗体の親和性を示すパラメーター、すなわち解離定数(KD)、解離速度定数(Kdiss) [1/Sec] 及び結合速度定数(Kass) [1/M.Sec]を測定する。
抗体は、解離定数（KD値）が小さい値であるほど親和性が高いという点で好ましい。抗体の結合能（親和性）は、Kdiss及びKassの２つのパラメーターにより決定され、
KD[M]＝ Kdiss/Kass
により表わされる。
抗原の種類等複数の要因によって、得られる抗体の親和性は異なるが、一般には、KD値は1×10-7(M) 以下であることが好ましく、例えば1×10-8(M) 以下、1×10-10(M)以下、あるいは1×10-11(M)以下のものが挙げられる。 The Biacore measures the antibody affinity parameters, ie, the dissociation constant (KD), the dissociation rate constant (Kdiss) [1 / Sec] and the association rate constant (Kass) [1 / M.Sec].
The antibody is preferable in that the lower the dissociation constant (KD value), the higher the affinity. Antibody binding capacity (affinity) is determined by two parameters, Kdiss and Kass,
KD [M] ＝ Kdiss / Kass
Is represented by
The affinity of the obtained antibody varies depending on multiple factors such as the type of antigen, but in general, the KD value is preferably 1 × 10 −7 (M) or less, for example, 1 × 10 −8 (M) or less. 1 × 10 −10 (M) or less, or 1 × 10 −11 (M) or less.

本発明においては、作製された抗体が上記いずれかの作用又は性質を発揮する抗体であるときに、「高親和性」であると判断される。
抗体分子の親和性亢進は抗体遺伝子の可変領域（V領域）遺伝子に体細胞突然変異（SHM）が誘導することによって生まれる。抗体の抗原に対する特異性は、抗原を生体に免疫した当初から認められるが、初期の抗体の多くはIgMクラスであり、また抗原に対する結合親和性は高くはなく、病原体や異物を除去したり、不活化する能力は低い。しかし、抗原を生体に投与して数回の追加免疫を行うと抗体の抗原に対する結合親和性が高まる。この際、B細胞はT細胞からの刺激が必要であり、末梢のリンパ組織の胚中心領域でその活性化が行われるとされている。V領域遺伝子の突然変異誘導に必要な分子としては、最近、胚中心で発現するRNAエディティング分子AIDであると報告されている。さらに、ウラシルDNAグリコシダーゼ、またDNA複製に必要なDNAポリメラーゼとしてミスを生じやすいDNAポリメラーゼゼータ（ζ）とアイオタ（ι）が関与していることが報告されているが、これらの機能を制御する分子はまだ明らかにされていない。GANP分子は新たなSHM誘導分子としてその機能が明らかにされたものであり、その分子の発現上昇がSHM誘導に重要な鍵を握る。とりわけ、高親和性抗体を産生するために重要であることが明らかになった。 In the present invention, when the prepared antibody is an antibody that exhibits any of the above actions or properties, it is determined to be “high affinity”.
The increased affinity of antibody molecules is caused by induction of somatic mutation (SHM) in the variable region (V region) gene of the antibody gene. The specificity of the antibody for the antigen is recognized from the beginning of immunization of the antigen to the living body, but most of the early antibodies are of the IgM class, and the binding affinity for the antigen is not high, removing pathogens and foreign substances, The ability to inactivate is low. However, when an antigen is administered to a living body and several booster immunizations are performed, the binding affinity of the antibody to the antigen increases. At this time, B cells need to be stimulated from T cells and are said to be activated in the germinal center region of peripheral lymphoid tissues. Recently, it has been reported that an RNA editing molecule AID expressed at the germinal center is a molecule necessary for inducing mutation in the V region gene. In addition, uracil DNA glycosidase and DNA polymerase zeta (ζ) and iota (ι), which are prone to mistakes as DNA polymerase necessary for DNA replication, have been reported to be involved, but molecules that control these functions Has not yet been revealed. The GANP molecule has been clarified in its function as a new SHM-inducing molecule, and the increase in the expression of the molecule is an important key for SHM induction. In particular, it has been found to be important for producing high affinity antibodies.

C57BL/6マウスにハプテン・キャリアの抗原としてニトロフェニル-ニワトリγグロブリンを免疫することにより誘導される抗体は、H鎖はVH186.2ローカスを用い、L鎖はλ1である。この際、追加免疫をして得られる抗体はIgG1抗体であり、そのうち特に結合親和性の高い抗体のV領域配列に誘導される突然変異は、33番目のトリプトファンがロイシンに変異したものであることが知られている。本明細書の実施例では、このモデルシステムで高い高親和性型のV領域突然変異が誘導されており、これは、高親和性抗体が誘導されたことを示す分子レベルでの明らかな証拠であると言える。
従って、上記トランスジェニック哺乳動物又はその子孫に抗原を投与して抗体を産生することによって、高親和性抗体を得ることができる。即ち、GANP蛋白質を高発現させた動物に目的とする抗原を常法によって投与し、感作された動物の血液又は脾臓等の組織（これらの組織に限定されない）のリンパ球より高親和性抗体を調製することができる。高親和性抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。 An antibody derived by immunizing C57BL / 6 mice with nitrophenyl-chicken γ globulin as a hapten carrier antigen uses V H 186.2 locus for the H chain and λ1 for the L chain. At this time, the antibody obtained by booster immunization is IgG 1 antibody, and the mutation induced in the V region sequence of the antibody having particularly high binding affinity is a mutation of the 33rd tryptophan to leucine. It is known. In the examples herein, a high-affinity type V region mutation was induced in this model system, which is clear evidence at the molecular level that high-affinity antibodies were induced. It can be said that there is.
Therefore, a high affinity antibody can be obtained by producing an antibody by administering an antigen to the transgenic mammal or its progeny. That is, a high-affinity antibody is produced by administering a target antigen to an animal in which GANP protein is highly expressed by a conventional method, and sensitizing the blood or spleen or other tissues (not limited to these tissues) of the animal. Can be prepared. The high affinity antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.

ポリクローナル抗体を産生する方法としては、例えば、抗原を本発明のトランスジェニック哺乳動物に投与して免疫し、免疫された哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。
免疫感作の方法は当業者に公知であり、例えば抗原を１回以上投与することにより行うことができる。
抗原の種類は特に限定されるものではなく、抗原決定基としての立体構造を持ちうる物質すべてが該当し、タンパク質、酵素、ペプチド、糖、脂質、DNA, RNA,プリオンなどのあらゆる生体成分のほか、癌抗原、ウイルス抗原、有機、無機合成抗原など任意のものを使用することができる。 As a method for producing a polyclonal antibody, for example, an antigen is administered to the transgenic mammal of the present invention for immunization, blood is collected from the immunized mammal, and the antibody is separated and purified from the collected blood. Can be obtained.
Methods of immunization are known to those skilled in the art and can be performed, for example, by administering the antigen one or more times.
The type of antigen is not particularly limited, and includes all substances that can have a three-dimensional structure as an antigenic determinant. In addition to all biological components such as proteins, enzymes, peptides, sugars, lipids, DNA, RNA, and prions. Any antigen such as cancer antigen, virus antigen, organic or inorganic synthetic antigen can be used.

抗原投与は、例えば7〜30日間隔で2〜3回投与すればよい。投与量は１回につき、例えば抗原約0.05〜2mg程度とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができるが、静脈内、腹膜腔内もしくは皮下に注射することにより投与することが好ましい。また、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント又は水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができるが、投与経路や条件等に応じてアジュバントを使用しない場合もある。
免疫感作した哺乳動物を一定期間飼育した後、哺乳動物の血清をサンプリングし、抗体価を測定する。抗体価が上昇してきたときに、例えば100μg〜1000μgの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。最後の投与から１〜２ケ月後に免疫感作した哺乳動物から血液を採取して、その血液をタンパク質の分離に採用される各種常法、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム又はポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等によって、ポリクローナル抗血清として、ポリクローナル抗体を得ることができる。 Antigen administration may be performed 2-3 times at intervals of 7-30 days, for example. The dose can be about 0.05 to 2 mg of antigen per dose, for example. The administration route is not particularly limited, and subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, and the like can be selected as appropriate, but by intravenous, intraperitoneal or subcutaneous injection. Administration is preferred. In addition, the antigen can be used by dissolving in an appropriate buffer, for example, a complete buffer containing a commonly used adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide. It may not be used.
After the immunized mammal is bred for a certain period, the serum of the mammal is sampled and the antibody titer is measured. When the antibody titer increases, booster immunization can be performed using, for example, 100 μg to 1000 μg of antigen. Blood is collected from a immunized mammal 1 to 2 months after the last administration, and the blood is used in various conventional methods employed for protein separation, such as centrifugation, precipitation using ammonium sulfate or polyethylene glycol, gel Polyclonal antibodies can be obtained as polyclonal antisera by filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, or the like.

モノクローナル抗体を産生する方法としては、ハイブリドーマ法を挙げることができる。先ず、アジュバント中に目的とする抗原を構成するペプチドを懸濁し、得られる懸濁液を、免疫動物（即ち、本発明のトランスジェニック哺乳動物）の皮下または真皮内に投与する。抗原の種類は前記と同様である。用いられるアジュバントとしては、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、BCG、トレハロースダイマイコレート(TDM)、リポ多糖(LPS)、ミョウバンアジュバント、シリカアジュバント等が挙げられるが、抗体の誘導能等の関係から、フロイントの完全アジュバント(CFA)とフロイントの不完全アジュバント(IFA)とを組み合わせて使用することが好ましい。
モノクローナル抗体の産生において、免疫動物は抗原の初回免疫後、更に、追加免疫を数回行い、適当な日数を経過した後に部分採血を行い、抗体価を測定することが好ましい。本発明の方法で産生される抗体は高親和性抗体であるため、上記免疫は初回のみで十分である可能性がある。なお、抗体価は、例えば酵素イムノアッセイ（以下「ELISA」という）法等、公知の方法により測定することができる。 A hybridoma method can be mentioned as a method for producing a monoclonal antibody. First, a peptide constituting the target antigen is suspended in an adjuvant, and the resulting suspension is administered subcutaneously or intradermally in an immunized animal (ie, the transgenic mammal of the present invention). The type of antigen is the same as described above. Examples of adjuvants used include Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, BCG, trehalose dimycolate (TDM), lipopolysaccharide (LPS), alum adjuvant, silica adjuvant, etc. In view of this, it is preferable to use a combination of Freund's complete adjuvant (CFA) and Freund's incomplete adjuvant (IFA).
In the production of monoclonal antibodies, it is preferable that the immunized animal performs several additional immunizations after the initial immunization with the antigen, and after a suitable number of days have passed, perform partial blood sampling to measure the antibody titer. Since the antibody produced by the method of the present invention is a high affinity antibody, the first immunization may be sufficient only for the first time. The antibody titer can be measured by a known method such as an enzyme immunoassay (hereinafter referred to as “ELISA”) method.

次いで、感作の終了した免疫動物から脾臓を摘出し、B細胞を得る。この際、抗原に結合するB細胞を得ることが、その後のスクリーニングを軽減できる点で好ましい。ここで得られるB細胞は高親和性抗体産生細胞であり、これをそのまま免疫賦活剤として使用することもできる。また、B細胞から直接V領域遺伝子を得て、そのV領域の体細胞突然変異を測定することもできる。
次いで、B細胞を常法に従いミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを作製する。例えば、マウスの場合であれば、脾臓を摘出し、摘出した脾臓を、例えばハンクスの平衡塩溶液（HBSS）中に置き、ピンセットで細胞を押し出して脾臓リンパ球（B細胞）を得る。得られた脾臓リンパ球は、トリパンブルー等の染色液で染めて生細胞数をカウントし、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマとする。
細胞融合に用いられるミエローマ細胞は特に限定されず、公知のものを使用できる。例えば、P3-X63.Ag8 (X63)、P3-X63.Ag8.U1 (P3U1)、P3/NS I/1-Ag4-1(NSI)、Sp2/0-Ag14(Sp2/0)等を挙げることができる。ミエローマ細胞の選択にあたっては、抗体産生細胞との適合性を適宜考慮する。 Next, the spleen is removed from the immunized animal after sensitization to obtain B cells. At this time, it is preferable to obtain B cells that bind to the antigen because the subsequent screening can be reduced. The B cells obtained here are high-affinity antibody-producing cells, which can be used as they are as immunostimulators. It is also possible to obtain V region genes directly from B cells and measure somatic mutations in the V region.
Subsequently, the B cells are fused with myeloma cells according to a conventional method to prepare an antibody-producing hybridoma. For example, in the case of a mouse, the spleen is removed, the removed spleen is placed in, for example, Hank's balanced salt solution (HBSS), and the cells are extruded with tweezers to obtain spleen lymphocytes (B cells). The obtained spleen lymphocytes are dyed with a staining solution such as trypan blue, the number of viable cells is counted, and fused with myeloma cells to form hybridomas.
The myeloma cells used for cell fusion are not particularly limited, and known ones can be used. For example, P3-X63.Ag8 (X63), P3-X63.Ag8.U1 (P3U1), P3 / NS I / 1-Ag4-1 (NSI), Sp2 / 0-Ag14 (Sp2 / 0), etc. Can do. In selecting myeloma cells, the compatibility with antibody-producing cells is taken into consideration as appropriate.

細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、1×106〜1×107個/mlの抗体産生細胞と2×105〜2×106個/mlのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。
細胞の融合方法は、センダイウイルス法、ポリエチレングリコール法、プロトプラスト法等、当該分野で公知の方法を任意に選択して用いることができるが、特にポリエチレングリコール法が、細胞毒性が比較的少なく、融合操作も簡単であるという理由から好ましい。細胞融合促進剤としてのポリエチレングリコールは、平均分子量1000〜6000ダルトンのものを使用することができる。なお、抗体を大量に作り出したい場合は、ビニルピリジン誘導体で刺激した抗体産生細胞と骨髄腫細胞を細胞融合させたハイブリドーマを用いることが好ましい。 Cell fusion is performed by using 1 × 10 6 to 1 × 10 7 antibody-producing cells and 2 × 10 5 to 2 × 10 6 in animal cell culture media such as serum-free DMEM and RPMI-1640 media. Per ml of myeloma cells (cell ratio of antibody-producing cells to myeloma cells is preferably 5: 1), and a fusion reaction is performed in the presence of a cell fusion promoter.
As a cell fusion method, any method known in the art such as Sendai virus method, polyethylene glycol method, protoplast method and the like can be selected and used. In particular, the polyethylene glycol method has relatively little cytotoxicity and is fused. It is preferable because the operation is simple. Polyethylene glycol as a cell fusion promoter can be used having an average molecular weight of 1000 to 6000 daltons. When producing a large amount of antibody, it is preferable to use a hybridoma obtained by fusing antibody-producing cells stimulated with a vinylpyridine derivative and myeloma cells.

得られたハイブリドーマは、常法に従い、HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン含有培地）中で適当な期間培養し、ハイブリドーマの選択を行う。次いで、目的とする抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った後、ハイブリドーマのクローニングを行う。
スクリーニング法としては、公知の抗体検出方法を用いることができ、例えば、ELISA法、ラジオイムノアッセイ（以下「RIA」という）法、プラーク法、凝集反応法等を用いることができる。また、クローニング法としては、当該分野で公知の方法を用いることができ、例えば、限界希釈法、軟寒天法およびFACS法等を用いることができる。得られたハイブリドーマは、適当な培養液中で培養するか、あるいはハイブリドーマと適合性のある、例えばマウス腹腔内に投与する。こうして得られる培養液中または腹水中から、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等により、所望のモノクローナル抗体を単離精製することができる。 The obtained hybridoma is cultured in an HAT medium (medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) for an appropriate period according to a conventional method, and the hybridoma is selected. Subsequently, after screening for the target antibody-producing hybridoma, the hybridoma is cloned.
As a screening method, a known antibody detection method can be used. For example, an ELISA method, a radioimmunoassay (hereinafter referred to as “RIA”) method, a plaque method, an agglutination method, or the like can be used. As a cloning method, a method known in the art can be used. For example, a limiting dilution method, a soft agar method, a FACS method, or the like can be used. The obtained hybridoma is cultured in an appropriate culture solution, or is administered intraperitoneally, for example, compatible with the hybridoma. The desired monoclonal antibody can be isolated and purified from the culture medium or ascites thus obtained by salting out, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, or the like.

また、上記した抗体の断片及びV領域の一本鎖抗体も本発明の範囲内である。抗体の断片としては、前述したポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはF(ab')2、Fab'、Fab、Fv（variable fragment of antibody）、sFv、dsFv（disulphide stabilized Fv）あるいはdAb（single domain antibody）等が挙げられる。ここで、「F(ab')2」及び「Fab'」とは、イムノグロブリン（モノクローナル抗体）を、それぞれ蛋白分解酵素であるペプシン、パパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の２本のH鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、IgGをパパインで処理すると、ヒンジ領域中の２本のH鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてVL（L鎖可変領域）とCL（L鎖定常領域）からなるL鎖、及びVH（H鎖可変領域）とCHγ1（H鎖定常領域中のγ1領域）とからなるH鎖フラグメントがC末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な２つの抗体フラグメントを製造することができる。これら２つの相同な抗体フラグメントを各々Fab'という。またIgGをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記２つのFab'がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをF(ab')2という。一本鎖抗体は、VL とVHをリンカーでつないだ構造を持つ。 In addition, the above-described antibody fragments and V chain single-chain antibodies are also within the scope of the present invention. The antibody fragment means a partial region of the aforementioned polyclonal antibody or monoclonal antibody, specifically, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, Fv (variable fragment of antibody), sFv, dsFv (disulphide stabilized Fv) or dAb (single domain antibody). Here, “F (ab ′) 2 ” and “Fab ′” are produced by treating immunoglobulin (monoclonal antibody) with proteolytic enzymes pepsin, papain, etc., respectively. It means an antibody fragment produced by digestion before and after a disulfide bond existing between heavy chains of a book. For example, when IgG is treated with papain, it is cleaved upstream of the disulfide bond existing between the two H chains in the hinge region, and L consisting of V L (L chain variable region) and C L (L chain constant region). And two homologous antibody fragments in which the H chain fragment composed of V H (H chain variable region) and C H γ1 (γ1 region in the H chain constant region) is linked by a disulfide bond in the C-terminal region. be able to. Each of these two homologous antibody fragments is called Fab ′. In addition, when IgG is treated with pepsin, an antibody fragment that is cleaved downstream of the disulfide bond existing between the two heavy chains in the hinge region to produce a slightly larger antibody fragment than the two Fab's connected in the hinge region is produced. Can do. This antibody fragment is called F (ab ') 2 . Single-chain antibodies have a structure in which VL and VH are connected by a linker.

本発明の高親和性抗体はヒト型化抗体やヒト抗体でもよい。これらの抗体は、免疫系をヒトのものと入れ換えた哺乳動物を用いて、該哺乳動物を免疫して、通常のモノクローナル抗体と同様に直接ヒト抗体を作製することができる。
ヒト型化抗体を作製する場合は、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（complementarity determining region；CDR）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域(FR)はヒト由来のものを、CDRはマウス由来のものからなる再構成した可変領域を作製する。
次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト型化抗体のヒト以外のアミノ酸配列に由来する部分は、CDR及び極く一部のFRのみである。CDRは超可変アミノ酸配列により構成されており、これらは種特異的配列を示さないため、マウスCDRを有するヒト型化抗体を使用することが可能である。ヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である。 The high affinity antibody of the present invention may be a humanized antibody or a human antibody. These antibodies can be directly immunized in the same manner as ordinary monoclonal antibodies by immunizing a mammal using a mammal whose immune system is replaced with that of a human.
When preparing humanized antibodies, complementarity determining regions (CDRs) are transplanted from mouse antibody variable regions to human variable regions, and framework regions (FR) are derived from humans. Creates a reconstituted variable region consisting of a mouse-derived one.
These humanized reshaped human variable regions are then linked to human constant regions. The part derived from the non-human amino acid sequence of the finally reconstituted humanized antibody is only CDR and a part of FR. CDRs are composed of hypervariable amino acid sequences, and since these do not show species-specific sequences, it is possible to use humanized antibodies with mouse CDRs. Methods for producing humanized antibodies are well known in the art.

ヒト抗体は、一般にV領域の抗原結合部位、すなわち超過変領域(Hyper Variable region)についてはその特異性と結合親和性が問題となるが、構造的にどの動物で作製してもかまわない（マウス、ラット等）。一方、V領域のそのほかの部分や定常領域の構造はヒトの抗体と同じ構造をしていることが望ましい。ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作成する方法が確立されている。
本発明の抗体のアイソタイプは特に限定されず、例えば、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、IgM、IgA（IgA1、IgA2）、IgDまたはIgEの任意のアイソタイプを有することができる。 Human antibodies generally have a problem with the specificity and binding affinity of the antigen binding site in the V region, that is, the hypervariable region, but any animal can be structurally produced (mouse) , Rats, etc.). On the other hand, the rest of the V region and the structure of the constant region are preferably the same as those of human antibodies. A method for creating a gene sequence common to humans by a genetic engineering technique has been established.
The isotype of the antibody of the present invention is not particularly limited. For example, the antibody has any isotype of IgG (IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 , IgG 4 ), IgM, IgA (IgA 1 , IgA 2 ), IgD or IgE Can do.


４．高親和性抗体の利用
本発明の高親和性抗体は、疾患の診断、治療又は予防のための薬剤として有用である。
4). Use of High Affinity Antibody The high affinity antibody of the present invention is useful as a drug for diagnosing, treating or preventing a disease.

(1) 疾患の診断
本発明の抗体を用いた各種疾患の診断方法は、各種疾患の疑いのある被験者から採取した検体、例えば血清等と本発明の抗体とを抗原抗体反応によって結合させ、結合した抗体量により検体中の目的とする抗原の量を検出することにより行う。抗体量の検出は、公知の免疫学的測定法に従って行えばよく、例えば、免疫沈降法、免疫凝集法、標識免疫測定法、免疫比ろう法、免疫比濁法等を用いることができる。特に標識免疫測定法が簡便かつ高感度という点で好ましい。標識免疫測定法では、検体中の抗体価は標識抗体を用いて直接検出した標識量で表すほか、既知濃度あるいは既知抗体価の抗体を標準液として用いて相対的に表してもよい。すなわち、標準液と検体を同測定系にて同時に測定し、標準液の値を基準にして検体中の抗体価を相対的に表すことができる。 (1) Diagnosis of disease A method for diagnosing various diseases using the antibody of the present invention comprises binding a sample collected from a subject suspected of various diseases, such as serum, and the antibody of the present invention by an antigen-antibody reaction. The detection is carried out by detecting the amount of the target antigen in the specimen from the amount of antibody obtained. The amount of antibody may be detected in accordance with a known immunological measurement method. For example, an immunoprecipitation method, an immunoagglutination method, a labeled immunoassay method, an immunopneumoassay method, an immunoturbidimetric method, or the like can be used. In particular, a labeled immunoassay is preferable in terms of simplicity and high sensitivity. In the labeled immunoassay method, the antibody titer in the sample may be represented by a labeled amount directly detected using a labeled antibody, or may be relatively represented by using an antibody having a known concentration or a known antibody titer as a standard solution. That is, the standard solution and the sample can be measured simultaneously in the same measurement system, and the antibody titer in the sample can be relatively expressed based on the value of the standard solution.

標識免疫測定法としては、公知の測定法、例えば、ELISA法、RIA法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法等を任意に利用することができる。用いる標識物質は、上記測定法に応じて、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、および化学発光化合物等を適宜選択すればよい。前記酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等を挙げることができる。上記標識物質はアビジン−ビオチン複合体を用いることにより、標識物質の検出感度を向上させることも可能である。また、放射性同位体としては、主に125Iが、蛍光化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等が挙げられる。化学発光化合物としては、ロフィン、ルミノール、ルシゲニン等が挙げられる。上記標識物質による抗体の標識は、常法に従って行うことができる。以下、標識抗体を用いた標識免疫測定法について説明する。 As the labeled immunoassay, a known assay such as ELISA, RIA, fluorescence immunoassay, chemiluminescence immunoassay and the like can be arbitrarily used. As a labeling substance to be used, an enzyme, a radioisotope, a fluorescent compound, a chemiluminescent compound, or the like may be appropriately selected according to the measurement method. Examples of the enzyme include peroxidase, alkaline phosphatase, acid phosphatase, glucose oxidase and the like. By using an avidin-biotin complex as the labeling substance, the detection sensitivity of the labeling substance can be improved. Examples of the radioactive isotope include 125 I, and examples of the fluorescent compound include fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC). Examples of chemiluminescent compounds include lophine, luminol, and lucigenin. Labeling of the antibody with the labeling substance can be performed according to a conventional method. Hereinafter, a labeled immunoassay method using a labeled antibody will be described.

標識免疫測定法による、各種疾患を検出する方法としては、公知の非競合反応系あるいは競合反応系を用いて行うことができる。非競合反応系においては、固相が必要である（固相法）。競合反応系においては、必ずしも固相を必要としない（液相法）が、固相を用いた方が、測定操作が簡便になるため好ましい。固相の材質としては、例えば、ポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバー、セルロース等が挙げられ、固相の形状としては、球状、ウェル状、チューブ状、シート状等が挙げられるが、これらに限定されず、標識免疫測定法に用いられる公知のものを任意に用いることができる。   As a method for detecting various diseases by the labeled immunoassay method, a known non-competitive reaction system or competitive reaction system can be used. In the non-competitive reaction system, a solid phase is required (solid phase method). In a competitive reaction system, it is not always necessary to use a solid phase (liquid phase method), but it is preferable to use a solid phase because the measurement operation is simple. Examples of the solid phase material include polystyrene, nylon, glass, silicon rubber, and cellulose. Examples of the solid phase shape include a spherical shape, a well shape, a tube shape, and a sheet shape, but are not limited thereto. In addition, a publicly known one used for labeled immunoassay can be arbitrarily used.

非競合反応系の場合、測定操作は、検体または本発明の抗体を固相化した後、本発明の抗体または検体と反応させ、次いであらかじめ標識しておいた抗免疫グロブリン抗体（二次抗体）を加えて固相化した検体と反応している抗体と反応させる。この二次抗体の標識により、検体に結合した抗体量を検出することができる。検出された標識化二次抗体の量は、検体中の目的とする抗原の量と正相関するので、これにより検体中の目的とする抗原の量を求めることができる。
競合反応系では、一定量の抗体に対して、検体と一定量の目的とする抗原を競合的に結合させる。例えば、検体を固相化した後に、あらかじめ目的とする抗原を添加し反応させた本発明の抗体と反応させる。次に、固相化された検体と反応した抗体を、あらかじめ標識しておいた抗免疫グロブリン抗体（二次抗体）と反応させ、標識物質によって抗体の量を検出することができる。検出される標識量は、添加された目的とする抗原の量と逆相関する。そのほかの競合反応系としては、本発明の抗体を固相化して、これに検体と反応させた後、あらかじめ標識しておいた目的とする抗原を反応させる。検出される標識量は、抗体と結合した検体中のGANP蛋白質量と逆相関する。 In the case of a non-competitive reaction system, the measurement operation is carried out by immobilizing the specimen or the antibody of the present invention, reacting with the antibody or specimen of the present invention, and then pre-labeling an anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody). To react with the antibody reacting with the solid-phased specimen. The amount of antibody bound to the specimen can be detected by this secondary antibody labeling. Since the amount of the labeled secondary antibody detected is positively correlated with the amount of the target antigen in the sample, it is possible to determine the amount of the target antigen in the sample.
In the competitive reaction system, a sample and a certain amount of the target antigen are competitively bound to a certain amount of antibody. For example, after solidifying the specimen, the target antigen is added and reacted with the antibody of the present invention reacted in advance. Next, the antibody reacted with the solid-phased specimen can be reacted with a previously labeled anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody), and the amount of the antibody can be detected with the labeling substance. The amount of label detected is inversely related to the amount of target antigen added. As another competitive reaction system, the antibody of the present invention is immobilized, reacted with a sample, and reacted with a target antigen that has been labeled in advance. The amount of label detected is inversely correlated with the amount of GANP protein in the sample bound to the antibody.

前記した抗原または抗体の固相化法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法等、公知の方法を使用できる。特に、物理的吸着法が簡便という点で好ましい。また、抗免疫グロブリン抗体（二次抗体）としては、例えば、抗IgG抗体、抗IgM抗体等を用いることができる。これらの抗体は、抗体分子をそのまま使用してもよいし、あるいは抗体を酵素処理して得られる抗原結合部位を含む抗体フラグメントであるFab、Fab'、F(ab')2を使用してもよい。さらに、標識した抗免疫グロブリン抗体の代わりに、抗体分子に特異的な親和性をもつ物質、例えばIgGに特異的な親和性をもつプロテインＡ等を標識して使用してもよい。 As the above-described method for immobilizing an antigen or antibody, a known method such as a physical adsorption method, a covalent bond method, an ion bond method, or a cross-linking method can be used. In particular, the physical adsorption method is preferable because it is simple. Moreover, as an anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody), an anti-IgG antibody, an anti-IgM antibody, etc. can be used, for example. For these antibodies, antibody molecules may be used as they are, or Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 which are antibody fragments containing an antigen binding site obtained by enzymatic treatment of an antibody may be used. Good. Further, instead of the labeled anti-immunoglobulin antibody, a substance having a specific affinity for the antibody molecule, for example, protein A having a specific affinity for IgG may be used.

前記標識免疫測定法の好適な例として、酵素を標識とした免疫測定法、ELISA法を挙げることができる。ELISA法は、例えば、96穴プレートに検体またはその希釈液を入れて、４℃〜室温で一晩、または37℃で1〜3時間程度静置して検出すべきGANP蛋白質を吸着させて固相化する。次に、本発明の抗体を反応させ、次いであらかじめ酵素を結合させた抗免疫グロブリン抗体（二次抗体）を反応させる。最後に酵素と反応する適当な発色性の基質（例えば、酵素がホスファターゼの場合はp-ニトロフェニルリン酸等）を加え、この発色によって抗体を検出する。
また、本発明の高親和性抗体を利用することにより、各種疾患の治療薬の薬効評価を行うことができる。本発明の高親和性抗体を利用した薬効評価方法は、各種疾患患者あるいは各種疾患モデル動物に対して薬剤を投与後、これら生体中のウイルス等の抗原の量を本発明の抗体を用いて検出し、その量を比較することにより、生体中の抗原の量を通して各種疾患の治療薬としての薬効を評価することができる。 Preferable examples of the labeled immunoassay method include an immunoassay method using an enzyme as a label and an ELISA method. In the ELISA method, for example, a specimen or a diluted solution thereof is placed in a 96-well plate and allowed to stand at 4 ° C. to room temperature overnight or at 37 ° C. for about 1 to 3 hours to adsorb the GANP protein to be detected. Phase. Next, the antibody of the present invention is reacted, and then an anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody) conjugated with an enzyme in advance is reacted. Finally, an appropriate chromogenic substrate that reacts with the enzyme (for example, p-nitrophenyl phosphate when the enzyme is phosphatase) is added, and the antibody is detected by this color development.
In addition, by using the high affinity antibody of the present invention, it is possible to evaluate the efficacy of therapeutic agents for various diseases. The drug efficacy evaluation method using the high-affinity antibody of the present invention is to detect the amount of antigens such as viruses in the living body using the antibody of the present invention after administering the drug to various disease patients or various disease model animals. Then, by comparing the amounts, the efficacy as therapeutic agents for various diseases can be evaluated through the amount of antigen in the living body.

本発明の高親和性抗体は、各種疾患診断用キットの形態で提供することができる。該キットは、本発明の診断方法や本発明の薬効評価方法に使用することができる。本発明のキットは以下の(a)及び(b)から選ばれる少なくとも一つ以上を含む。
(a)本発明の抗体またはその標識物
(b)前項(a)記載の抗体またはその標識物を固定した固相化試薬
ここで、抗体の標識物とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、または化学発光化合物によって標識されたものを意味する。
また本発明のキットにおける抗体、もしくはこれらの標識物を固定する固相の材質としては、ポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバー、セルロース等が挙げられ、固相の形状としては、球状、ウェル状、チューブ状、シート状等が挙げられるが、これらに限定されない。該固相化試薬の代わりに、固相と固相化に必要な固相化試薬を添付したものでもよい。固相化試薬として、例えば物理的吸着による固相化の場合は、50mM炭酸塩緩衝液（pH 9.6）、10 mMトリス-塩酸緩衝液(pH8.5、100mM塩化ナトリウム含有)、PBS等のコーティング液と、さらに必要に応じてコーティング液に0.5％のゼラチン等を含有させたブロッキング液が挙げられる。 The high affinity antibody of the present invention can be provided in the form of various disease diagnosis kits. The kit can be used in the diagnostic method of the present invention and the drug efficacy evaluation method of the present invention. The kit of the present invention comprises at least one selected from the following (a) and (b).
(a) Antibody of the present invention or label thereof
(b) Solid-phase reagent on which the antibody or labeled product thereof described in (a) above is immobilized.Here, the labeled product of the antibody is a product labeled with an enzyme, a radioisotope, a fluorescent compound, or a chemiluminescent compound. means.
Examples of the solid phase material for immobilizing the antibody in the kit of the present invention or these labeled substances include polystyrene, nylon, glass, silicon rubber, cellulose, and the like, and the solid phase has a spherical shape, a well shape, Examples include, but are not limited to, tube shapes and sheet shapes. Instead of the solid phase reagent, a solid phase and a solid phase reagent necessary for solid phase may be attached. In the case of solid phase immobilization by physical adsorption, for example, 50 mM carbonate buffer (pH 9.6), 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5, containing 100 mM sodium chloride), PBS, etc. And a blocking solution containing 0.5% gelatin or the like in the coating solution as required.

また、本発明のキットにおける抗体は、PBS等に溶解させた状態、あるいはゲルに結合させた状態（以下、「吸収用ゲル」と略す）であってもよい。前記吸収用ゲルはさらに適量を、バッチ法による吸収処理用に0.5〜2ml程度のマイクロ遠沈チューブに予めパッケージングされた状態であってもよく、あるいはカラム法による吸収処理用にカラム容量が0.1 〜5 mlのミニカラムに予め充填された状態であってもよい。
本発明のキットは、上記した構成要素のほか、本発明の検出を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質（発色性基質等）、酵素基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。前記検体用希釈液としては、例えばPBS（生理的リン酸緩衝液、pH7.4）、137mM塩化ナトリウムおよび3mM塩化カリウムを含むpH7.4かつ20mMのトリス-塩酸緩衝液（以下、「TBS」と略す）、0.05％Tween20、0.1〜1％のBSAを含有させたPBS、あるいはTBS等を挙げることができる。該検体用希釈液は、検体希釈以外、例えば抗体の希釈等に用いてもよい。 The antibody in the kit of the present invention may be in a state dissolved in PBS or the like, or in a state bound to a gel (hereinafter abbreviated as “absorbing gel”). The absorption gel may be in a state of being prepackaged in a micro centrifuge tube of about 0.5 to 2 ml for the absorption treatment by the batch method, or the column capacity may be 0.1 for the absorption treatment by the column method. It may be pre-packed in a ~ 5 ml minicolumn.
In addition to the above-described components, the kit of the present invention includes other reagents for carrying out the detection of the present invention, such as an enzyme substrate (chromogenic substrate, etc.), enzyme substrate solution when the label is an enzyme label. In addition, an enzyme reaction stop solution, a sample dilution solution, or the like may be included. Examples of the diluent for specimen include PBS (physiological phosphate buffer, pH 7.4), 7.4 mM and 20 mM Tris-HCl buffer (hereinafter referred to as “TBS”) containing 137 mM sodium chloride and 3 mM potassium chloride. (Abbreviated), PBS containing 0.05% Tween 20, 0.1 to 1% BSA, or TBS. The sample diluent may be used for, for example, antibody dilution other than sample dilution.

(2) 疾患の治療又は予防用医薬組成物
本発明の高親和性抗体は、疾患の病原となる抗原の活性を中和させる作用を有するものであれば、疾患の治療又は予防のための医薬組成物として有用である。本発明の医薬組成物は、本発明の高親和性抗体またはその断片を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。
ここで「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐剤およびペッサリーなどが含まれる。 (2) Pharmaceutical composition for treatment or prevention of disease As long as the high affinity antibody of the present invention has an action of neutralizing the activity of an antigen that causes disease, the drug for treatment or prevention of the disease Useful as a composition. The pharmaceutical composition of the present invention is preferably provided in the form of a pharmaceutical composition comprising the high affinity antibody of the present invention or a fragment thereof as an active ingredient and further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier” refers to excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, colorants, sweeteners, thickeners. , Flavoring agents, solubilizers or other additives. By using one or more of such carriers, pharmaceuticals in the form of tablets, pills, powders, granules, injections, solutions, capsules, troches, elixirs, suspensions, emulsions or syrups, etc. A composition can be prepared. These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally. Other forms for parenteral administration include topical solutions containing one or more active substances and prescribed by conventional methods, suppositories for enteric administration, pessaries, and the like.

本発明の薬剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該薬剤に含有される活性成分である高親和性抗体の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回につき10μgから1000mg、好ましくは10μgから100mgの範囲で投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。   The dose of the drug of the present invention varies depending on the patient's age, sex, weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, type of high-affinity antibody that is an active ingredient contained in the drug, Usually, it can be administered in the range of 10 μg to 1000 mg, preferably 10 μg to 100 mg per adult, but it is not limited to this range.

例えば、注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に0.1μg抗体/ml担体〜10mg抗体/ml担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において1kg体重あたり、１μg〜100mgの割合で、好ましくは50μg〜50mgの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。   For example, in the case of an injection, it is dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection to a concentration of 0.1 μg antibody / ml carrier to 10 mg antibody / ml carrier. Or it can manufacture by suspending. The injection thus produced is 1 μg to 100 mg per kg body weight, preferably 50 μg to 50 mg per day for a human patient in need of treatment. Can be administered several times to several times. Examples of the administration form include intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, and intraperitoneal injection, and intravenous injection is preferred. In addition, injections can be prepared as non-aqueous diluents (for example, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, etc.), suspensions or emulsions. . Such sterilization of the injection can be performed by filtration sterilization through a bacteria-retaining filter, blending of a bactericide, or irradiation. The injection can be produced as a form prepared at the time of use. That is, it can be used as a sterile solid composition by lyophilization, etc., and dissolved in sterile water for injection or other solvents before use.


５．本発明の応用
本発明者らは、B細胞腫瘍株にGANPの過剰発現を誘導した上で解析を行った結果、B細胞腫瘍株はGANP遺伝子導入によって、飛躍的なV領域遺伝子の体細胞突然変異誘導効果を有することを示した。この効果は、GANPのRNAプライマーゼ活性に必要な502番目のセリンのリン酸化が起こらないような変異遺伝子を用いた場合には見られないことから、V領域遺伝子の体細胞突然変異の飛躍的な誘導には、RNAプライマーゼ活性が必要であることを示している。この結果は、臨床的な補助免疫賦活剤として、GANPが特異的抗体産生の増強効果を有することを示すものである。
5. Application of the present invention As a result of conducting analysis after inducing overexpression of GANP in a B cell tumor line, the present inventors found that a B cell tumor line was suddenly transformed into a somatic cell of a V region gene by introducing the GANP gene. It was shown to have a mutagenesis effect. This effect is not seen when using a mutant gene that does not cause phosphorylation of the 502nd serine, which is necessary for the RNA primase activity of GANP. This indicates that RNA primase activity is required for proper induction. This result indicates that GANP has an effect of enhancing specific antibody production as a clinical adjuvant immunostimulator.

ベクターとしてレトロウイルスベクターを使用し、CD40、BAFFなどのTNFファミリー分子を介する刺激をGANPと併用することも、臨床的な補助免疫賦活作用にとって効果的である。また、この遺伝子導入を骨髄細胞レベルで行うことによって、T細胞における高親和性結合の誘導も期待できる。エイズ、C型肝炎ウイルス、成人T細胞白血病、狂牛病などの高親和性抗体が得られない場合や、あるいは得られたとしてもすぐに抗原の変異が起こるために十分に高親和性抗体の産生が持続できない場合には、この遺伝子導入は優れた効果を発揮すると期待できる。   Using a retroviral vector as a vector and combining stimulation with a GANP with a TNF family molecule such as CD40 and BAFF is also effective for clinical adjuvant immune activation. Moreover, induction of high-affinity binding in T cells can be expected by performing this gene transfer at the bone marrow cell level. If high-affinity antibodies such as AIDS, hepatitis C virus, adult T-cell leukemia, and mad cow disease cannot be obtained, or even if they are obtained, antigen mutations will occur immediately. If production cannot be sustained, this gene transfer can be expected to exert excellent effects.

本発明のGANP遺伝子過剰発現哺乳動物は、生物学研究試薬、臨床検査試薬作製に有効なモノクローナル抗体の開発に有効である。例えば、特定のシグナル伝達分子に対するモノクローナル抗体を機能ドメインや機能モチーフに特異的にそして結合力の高い高親和性抗体を簡便に作製することは非常に活用される範囲が広い。多くの抗体はそれほど多くのスクリーニングをかけないため、ウエスタン解析と免疫沈降に用いることができない場合がある。この場合、本発明のトランスジェニック哺乳動物を用いれば、比較的少ないクローンの抗体から高親和性抗体産生細胞を短時間で選別することができ、経費、時間、労力の削減する効果は大きい。特にリン酸化抗体、遺伝子変異部分に対する特異抗体の作製は診断薬、あるいは抗体を用いた薬物の選択的注入法に応用できる。また遺伝子の配列やヌクレオチド部分に選択的に結合する高親和性抗体の産生も可能となる。   The mammal overexpressing the GANP gene of the present invention is effective for the development of a monoclonal antibody effective for the preparation of a biological research reagent or clinical test reagent. For example, simple production of a high-affinity antibody that is specific to a functional domain or a functional motif and that has a high binding force for a monoclonal antibody against a specific signal transduction molecule has a wide range of applications. Many antibodies do not undergo as much screening and may not be used for Western analysis and immunoprecipitation. In this case, if the transgenic mammal of the present invention is used, high-affinity antibody-producing cells can be selected from a relatively small number of clone antibodies in a short time, and the effect of reducing cost, time and labor is great. In particular, the production of a specific antibody against a phosphorylated antibody or gene mutation portion can be applied to a selective injection method of a diagnostic agent or a drug using the antibody. In addition, it is possible to produce a high affinity antibody that selectively binds to a gene sequence or nucleotide portion.

無機物、炭水化物、化学合成物など、任意の物質の立体構造の一部は、抗原モチーフとして認識される。従来には高親和性抗体は得られていないが、自己免疫疾患マウスとの交配で作製されるマウスは、あらゆる抗原に対して高親和性抗体を得るために有効である。この方法で結合力が10-11Mオーダーの高親和性抗体ができる可能性があり、ELISA法の技術開発を導入することにより、微量物質の検出を簡便に行う技術を開発することが可能である。
また、本発明によれば、RNAプライマーゼ不活性型GANP遺伝子を含む、アレルギー疾患又は自己免疫疾患のための遺伝子治療剤を提供することも可能である。「RNAプライマーゼ不活性型GANP遺伝子」とは、RNAプライマーゼドメイン欠損、又はRNAプライマーゼドメインが変異した遺伝子を意味し、502番目のセリン残基の変異を含む近傍の遺伝子の変異によってGANP分子の構造および機能的な変化を生じた遺伝子のことを意味する。 A part of the three-dimensional structure of an arbitrary substance such as an inorganic substance, a carbohydrate, or a chemical composition is recognized as an antigen motif. Conventionally, no high-affinity antibody has been obtained. However, a mouse produced by mating with an autoimmune disease mouse is effective for obtaining a high-affinity antibody against any antigen. This method has the potential to produce high-affinity antibodies with binding power on the order of 10 -11 M. By introducing the technological development of the ELISA method, it is possible to develop a technology that can easily detect trace substances. is there.
In addition, according to the present invention, it is also possible to provide a gene therapy agent for allergic diseases or autoimmune diseases including an RNA primase inactive GANP gene. “RNA primase inactive GANP gene” means an RNA primase domain deficient or a gene with a mutated RNA primase domain. It means a gene that has undergone structural and functional changes.

本発明の遺伝子治療剤は、RNAプライマーゼ不活性型GANP遺伝子を含む組み換えベクターを、遺伝子治療剤に用いる基剤と一緒に配合することにより製造することができる。組み換えベクターの構築の際に用いるベクターとしては、ウイルスベクターとしてレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどが挙げられ、あるいは動物発現用プラスミドを使用することもできる。ベクターは好ましくはウイルスベクターである。RNAプライマーゼ不活性型GANP遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換え体DNAを含有するウイルス粒子を調製し、遺伝子治療剤に用いる基剤と一緒に配合することにより遺伝子治療剤を製造することができる。   The gene therapy agent of this invention can be manufactured by mix | blending the recombinant vector containing RNA primase inactive type GANP gene with the base used for a gene therapy agent. Examples of vectors used in the construction of the recombinant vector include retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, baculovirus vectors, vaccinia virus vectors, etc., or animal expression plasmids may be used. it can. The vector is preferably a viral vector. When the RNA primase inactive GANP gene is incorporated into a virus vector, a virus particle containing recombinant DNA is prepared and mixed with the base used for the gene therapy agent to produce a gene therapy agent be able to.

遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等が挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、pH調整剤、植物油、もしくは界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
本発明の遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与等の局所投与を行ってもよい。本発明の遺伝子治療剤の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として1μg/kgから1000mg/kg程度の範囲であり、好ましくは10μg/kgから100mg/kg程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。 As a base used for a gene therapy agent, a base usually used for an injection can be used. For example, salt solution such as distilled water, sodium chloride or a mixture of sodium chloride and an inorganic salt, mannitol, lactose, dextran, etc. And a solution such as glucose, an amino acid solution such as glycine and arginine, an organic acid solution or a mixed solution of a salt solution and a glucose solution, and the like. Alternatively, according to conventional methods known to those skilled in the art, these bases are injected as solutions, suspensions or dispersions using osmotic pressure adjusting agents, pH adjusting agents, vegetable oils, or surfactants. Agents can also be prepared. These injections can also be prepared as preparations for dissolution at the time of use by operations such as powdering and freeze-drying.
The administration form of the gene therapy agent of the present invention may be normal systemic administration such as intravenous or intraarterial administration, or local administration such as local injection or oral administration. The dosage of the gene therapy agent of the present invention varies depending on age, sex, symptom, administration route, administration frequency, and dosage form, but generally ranges from about 1 μg / kg to 1000 mg / kg of recombinant gene per day for adults. Preferably, it is in the range of about 10 μg / kg to 100 mg / kg. The frequency of administration is not particularly limited.


実施例
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
Examples The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to the examples.

自己免疫疾患モデル動物におけるGANPの発現とその機能
（材料及び方法） Expression of GANP and its function (materials and methods) in animal models of autoimmune diseases

１．動物
NZB、NZW、B/WF1、MRL/lpr、及びBXSB マウスはJapan SLC Co.から購入した。
C57BL/6 及びBALB/cマウスはCharles River Japanから購入した。NODマウスは大阪大学大学院の宮崎博士から供与された。 1. animal
NZB, NZW, B / WF1, MRL / lpr, and BXSB mice were purchased from Japan SLC Co.
C57BL / 6 and BALB / c mice were purchased from Charles River Japan. NOD mouse was provided by Dr. Miyazaki of Osaka University Graduate School.

２．抗体及び試薬
マウスB220（RA3-6B2）、マウスIgM (AM/3) 及びマウスIgD (CS/15)に対するラットモノクローナル抗体はハイブリドーマの培養上清から精製し、D-ビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(Roche diagnostics, Branchburg, NJ)で標識した。ビオチン標識ラット抗マウスSyndecan-1及び抗マウスCD5モノクローナル抗体は購入した（BD PharMingen, San Diego, CA）。ビオチン標識ピーナッツアグルチニン(PNA)はVector Laboratories (Burlingame, CA)から購入した。 2. Antibodies and Reagents Rat monoclonal antibodies against mouse B220 (RA3-6B2), mouse IgM (AM / 3) and mouse IgD (CS / 15) were purified from the hybridoma culture supernatant, and D-biotin-N-hydroxysuccinimide ester ( Roche diagnostics, Branchburg, NJ). Biotin-labeled rat anti-mouse Syndecan-1 and anti-mouse CD5 monoclonal antibody were purchased (BD PharMingen, San Diego, CA). Biotin-labeled peanut agglutinin (PNA) was purchased from Vector Laboratories (Burlingame, CA).

３．免疫
トリニトロフェニル-キーホールリンペットヘモシアニン(Trinitrophenyl keyhole limpet hemocyanin (TNP-KLH)及びTNP-FicollはBiosearch Technologies (Novato, CA)から購入した。完全フロイントアジュバンドに乳化した100μgのTNP-KLHまたはPBS中の25μgのTNP-Ficollをマウスの腹腔内に注入した。14日後、リンパ器官を取得し、免疫組織分析用にOCT 化合物とともに凍結した。 3. Immunity Trinitrophenyl keyhole limpet hemocyanin (TNP-KLH) and TNP-Ficoll were purchased from Biosearch Technologies (Novato, Calif.) 100 μg TNP-KLH or PBS emulsified in complete Freund's adjuvant. 25 μg of TNP-Ficoll was injected intraperitoneally into the mice, 14 days later, lymphoid organs were obtained and frozen with OCT compounds for immunohistochemical analysis.

４．免疫組織分析
６μmの凍結切片をアセトンで５分間固定し、PBS中の3% BSAで15分間ブロッキングし、ラット抗マウスGANPモノクローナル抗体(42-23) [Kuwahara K., 他、2000, Blood 95: 2321-2328]またはラット抗-pSer502 GANPモノクローナル抗体 (PG/103) [Kuwahara K.,他、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10279-10283]と一緒に１時間インキュベートした。切片をのせたスライドグラスをPBSで数回洗浄し、アルカリホスファターゼ (ALP)-結合ヤギ抗ラットIgG 抗体(ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA)と一緒にインキュベートした。発色はVector Blue kit (Vector)を用いて行った。二重染色のために、反応はビオチン標識抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)-結合ストレプトアビジン(Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を組み合わせて行った。3-3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド(DAB; 同仁化学)による発色後、切片をPBS中1%グルタルアルデヒドで１分間固定した。Aquatex (Merck, Darmstadt, Germany)をマウンティングのために用いた。インビボで増殖活性のある細胞を検出するために、ブロモデオキシウリジン (BrdU) (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO; 1 mg／マウス)を屠殺する２時間前に静脈内に注入した。DNA合成を行う細胞を抗BrdUモノクローナル抗体 (BD PharMingen)とALP-結合ヤギ抗マウスIg 抗体(Sigma)とを組み合わせて染色しVector Red (Vector)により発色させて検出した。PAS染色は既報の通り行った [Jiang Y.他、1997, J. Immunol. 158: 992-997]。 4). Immunohistochemical analysis Frozen sections of 6 μm were fixed with acetone for 5 minutes, blocked with 3% BSA in PBS for 15 minutes, and rat anti-mouse GANP monoclonal antibody (42-23) [Kuwahara K., et al., 2000, Blood 95: 2321-2328] or rat anti-pSer 502 GANP monoclonal antibody (PG / 103) [Kuwahara K., et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10279-10283]. The glass slides with the sections were washed several times with PBS and incubated with alkaline phosphatase (ALP) -conjugated goat anti-rat IgG antibody (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, Calif.). Color development was performed using Vector Blue kit (Vector). For double staining, the reaction was performed using a combination of biotin-labeled antibody and horseradish peroxidase (HRP) -conjugated streptavidin (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). After color development with 3-3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; Dojindo), the sections were fixed with 1% glutaraldehyde in PBS for 1 minute. Aquatex (Merck, Darmstadt, Germany) was used for mounting. Bromodeoxyuridine (BrdU) (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO; 1 mg / mouse) was injected intravenously 2 hours before sacrifice to detect cells that were proliferating in vivo. Cells for DNA synthesis were detected by staining with a combination of anti-BrdU monoclonal antibody (BD PharMingen) and ALP-conjugated goat anti-mouse Ig antibody (Sigma) and coloring with Vector Red (Vector). PAS staining was performed as previously reported [Jiang Y. et al., 1997, J. Immunol. 158: 992-997].

５．結果
(1) MRL/lpr マウスのリンパ節におけるGANPhi細胞の出現
GANP発現は自己免疫傾向の高活性B細胞で高発現している。高レベルのGANPを発現するリンパ細胞（GANPhi 細胞)は、MRL/lprマウスの末梢リンパ節において非免疫状態において自発的に出現する。
抗GANPモノクローナル抗体およびALP結合抗ラットIg抗体を用いて、自己免疫疾患モデルMRL/lpr、NZBおよび正常C57BL/6雌マウス由来の膝窩リンパ節について免疫組織化学分析を行った。
結果を図１に示す。Vector Blue（ALP基質）で染色されたGANPhi細胞は７週目にMRL/lprマウスのリンパ節で観察されたのに対し、同年齢のNZBマウスでは観察されず、40週目に出現した（図１）。正常C57BL/6マウスでは、極少数のGANPhi細胞が全期間を通じて観察された。 5. result
(1) Appearance of GANP hi cells in lymph nodes of MRL / lpr mice
GANP expression is highly expressed in highly active B cells with an autoimmune tendency. Lymphocytes expressing high levels of GANP (GANP hi cells) appear spontaneously in a non-immune state in the peripheral lymph nodes of MRL / lpr mice.
Immunohistochemical analysis was performed on popliteal lymph nodes from autoimmune disease models MRL / lpr, NZB and normal C57BL / 6 female mice using anti-GANP monoclonal antibody and ALP-conjugated anti-rat Ig antibody.
The results are shown in FIG. GANP hi cells stained with Vector Blue (ALP substrate) were observed in the lymph nodes of MRL / lpr mice at 7 weeks, whereas they were not observed in NZB mice of the same age and appeared at 40 weeks ( FIG. 1). In normal C57BL / 6 mice, very few GANP hi cells were observed throughout the period.

自己免疫疾患モデルマウスは、C57BL/6 マウスと比較してリンパ細胞の増加は顕著であり、非免疫条件下ではGANPhi細胞は示されない（図１)。そのようなGANPhi細胞の出現を、加齢の間少しずつ自己免疫状態を引き起こすNZBマウスのリンパ節で調べた。若いNZBマウス（７週齢）は、膝窩リンパ節にGANPhi 細胞を有さないが、加齢したNZB (40 週齢)は多数のGANPhi 細胞を有した。
GANP RNAプライマーゼ活性はB細胞の活性化と分化において重要な役割を担っている可能性がある。そこで、NZBマウスで抗pSer502 モノクローナル抗体を用いて、RNAプライマーゼ活性の重要なリン酸化部位であるSer502のリン酸化状態を比較した。
NZBマウスのリンパ節中のGANPおよびpSer502 GANPの発現を比較した。pSer502 GANPは抗pSer502 GANP(PG/103)モノクローナル抗体(青)で検出し、全切片をビオチン標識抗B220モノクローナル抗体で染色した後、HRP結合ストレプトアビジンとDAB(茶色)を組み合わせて検出した。２回の独立した実験から代表的データを示した（図２）。 The autoimmune disease model mouse has a marked increase in lymphocytes compared to C57BL / 6 mice, and GANP hi cells are not shown under non-immune conditions (FIG. 1). The appearance of such GANP hi cells was examined in the lymph nodes of NZB mice, which cause an autoimmune condition little by little during aging. Young NZB mice (7 weeks of age) do not have GANP hi cells in the popliteal lymph nodes, whereas aged NZB (40 weeks of age) have a large number of GANP hi cells.
GANP RNA primase activity may play an important role in B cell activation and differentiation. Therefore, the anti-pSer 502 monoclonal antibody was used in NZB mice to compare the phosphorylation state of Ser 502 , which is an important phosphorylation site for RNA primase activity.
The expression of GANP and pSer 502 GANP in lymph nodes of NZB mice was compared. pSer 502 GANP was detected with anti-pSer 502 GANP (PG / 103) monoclonal antibody (blue), and all sections were stained with biotin-labeled anti-B220 monoclonal antibody, and then detected with a combination of HRP-conjugated streptavidin and DAB (brown). . Representative data from two independent experiments are shown (Figure 2).

図２において、下段の図（グラフ）は、加齢の間に濾胞外領域のGANPhi(黒の棒)およびpSer502 GANPhi(斜線の棒)の細胞数を示す。
GANPの発現は８週目で顕著であり、GANPhi 細胞が32週までの全期間を通じて検出された (図２;上図)。対照的に、pSer502-陽性細胞は８週目に最大であったが、その後、陽性細胞は顕著に減少した(図２；真中の図)。 ピーク年齢に基づく顕微鏡観察での反応性細胞数を図に示す(図２；下図)。これらの結果から、GANP発現は最初にＲＮＡプライマーゼ活性を伴うが、この活性は長期間に渡っては調節されていないことが分かる。 In FIG. 2, the lower diagram (graph) shows the number of cells in the extrafollicular region GANP hi (black bars) and pSer502 GANP hi (hatched bars) during aging.
GANP expression was prominent at 8 weeks, and GANP hi cells were detected throughout the entire period up to 32 weeks (FIG. 2; upper panel). In contrast, pSer 502 -positive cells were maximal at 8 weeks, after which positive cells were significantly reduced (FIG. 2; middle panel). The number of reactive cells in microscopic observation based on peak age is shown in the figure (FIG. 2; lower figure). These results indicate that GANP expression is initially accompanied by RNA primase activity, but this activity has not been regulated over time.

(2) 自己免疫傾向マウスの脾臓の赤脾髄におけるGANPhi細胞の自発的出現
自己免疫傾向NZBマウスの膝窩リンパ節で検出されたGANPhi細胞が非免疫状況下の脾臓に出現するかどうかを調べた。
免疫染色は前記(1)の操作（図２）と同様に行った。３回の独立した実験からの代表的データを示した（図３）。
GANPhi細胞は４週目に脾臓に出現し、細胞数は12週目に最大値に達したが、24週後に消失した(図３;上図)。pSer502 GANPの発現も８週目と12週目に検出された (図３;真中の図)。赤脾髄の相対細胞数と比較した結果、脾臓に出現したGANPhi細胞は 12週後には末梢リンパ節に移動していることが分かる。GANPhi の増加は、自己免疫疾患の発症に先行する自己抗体の産生量に比例している (図２及び図３; Theofilopoulos A.N.,他、1985, Adv. Immunol. 37: 269-390)。 (2) whether autoimmune-prone mice spleen GANP hi cells in the red pulp spontaneous appearance autoimmune-prone NZB mice GANP hi cells detected in the popliteal lymph nodes appear in the spleen under non-immune conditions I investigated.
Immunostaining was performed in the same manner as in the operation (1) (FIG. 2). Representative data from three independent experiments are shown (Figure 3).
GANP hi cells appeared in the spleen at 4 weeks and reached the maximum value at 12 weeks, but disappeared after 24 weeks (FIG. 3; upper panel). Expression of pSer 502 GANP was also detected at 8th and 12th weeks (FIG. 3; middle figure). As a result of comparison with the relative number of cells in the red spleen, GANP hi cells that appeared in the spleen migrated to peripheral lymph nodes after 12 weeks. The increase in GANP hi is proportional to the amount of autoantibody produced prior to the onset of autoimmune disease (FIGS. 2 and 3; Theofilopoulos AN, et al., 1985, Adv. Immunol. 37: 269-390).

GANPhi細胞の出現は自己免疫傾向マウスにおけるB細胞の異常と関連している可能性があるので、非免疫条件下で各種の自己免疫傾向マウス（８週齢）におけるGANPhi細胞の出現を調べた。
結果を図４に示す。GANPhi 細胞はMRL/lpr、NZB及びB/WF1の赤脾髄で顕著に出現した。
GANPhi細胞の数はSLE-モデルマウスのBXSB 及びNODの脾臓にはそれほど増加しなかったが、対照のBALB/cマウス（図４） 及びC57BL/6マウス (図１)と比較すれば増加していた。脾臓の切片は、GC様構造としてPNA+ B細胞の連想又は未熟の会合を示した。GC様領域でのGANPの発現は、正常C57BL/6マウス及びBALB/cマウスに、T細胞依存性抗原(T cell-dependent Ags: TD-Ags)を免疫することによって作製したGCでのGANPの発現と比較して高くない。しかし、GANPhi 細胞は、自己免疫傾向マウスの赤脾髄領域で顕著に出現していた(図４)。 Since the appearance of GANP hi cells may be related to B cell abnormalities in autoimmune-prone mice, we investigated the appearance of GANP hi cells in various autoimmune-prone mice (8 weeks old) under non-immune conditions It was.
The results are shown in FIG. GANP hi cells appeared prominently in the red pulp of MRL / lpr, NZB and B / WF1.
The number of GANP hi cells did not increase significantly in the spleen of BXSB and NOD in SLE-model mice, but increased compared to control BALB / c mice (Fig. 4) and C57BL / 6 mice (Fig. 1). It was. Spleen sections showed association or immature association of PNA + B cells as GC-like structures. The expression of GANP in the GC-like region indicates that GANP in a GC prepared by immunizing normal C57BL / 6 mice and BALB / c mice with T cell-dependent antigens (T cell-dependent Ags: TD-Ags). Not high compared to expression. However, GANP hi cells appeared prominently in the red pulp region of autoimmune-prone mice (FIG. 4).

さらに、GANPhi 細胞集団を、リンパ系細胞のマーカー分析によって解析した。
ビオチン標識抗B220モノクローナル抗体、ビオチン標識抗Syndecan-1モノクローナル抗体、ビオチン標識抗IgMモノクローナル抗体、及び抗IgG抗体を用いて、NZBマウスの脾臓切片について二重染色を行い、GANPhi 細胞を同定した。
結果を図５に示す。図５に示すパネルの左の列は、上から下に順にビオチン標識抗IgMモノクローナル抗体、抗IgG抗体、ビオチン標識抗B220モノクローナル抗体及びビオチン標識抗Syndecan-1モノクローナル抗体を用いたときの図である。中央の列は、上記それぞれの抗体を用いたのと同じ切片でのGANPの発現を示す。右の列は左の列と中央の列を重ね合わせた図である。右列の二重に染色された細胞は、GANPhi 細胞がB220-Syndecan1+IgM+であることを示す。GANP発現は、IgM、IgG及びB200の場合は赤色で示し、Syndecan-1の場合は緑色で示す。マーカーは、IgM、IgG及びB200は緑色で示し、Syndecan-1の場合は赤色で示す。 Furthermore, the GANP hi cell population was analyzed by marker analysis of lymphoid cells.
Double staining was performed on spleen sections of NZB mice using biotin-labeled anti-B220 monoclonal antibody, biotin-labeled anti-Syndecan-1 monoclonal antibody, biotin-labeled anti-IgM monoclonal antibody, and anti-IgG antibody, and GANP hi cells were identified.
The results are shown in FIG. The left column of the panel shown in FIG. 5 is a diagram when biotin-labeled anti-IgM monoclonal antibody, anti-IgG antibody, biotin-labeled anti-B220 monoclonal antibody and biotin-labeled anti-Syndecan-1 monoclonal antibody are used in order from top to bottom. . The middle column shows the expression of GANP in the same section with each of the above antibodies. The right column is a diagram in which the left column and the central column are superimposed. The double-stained cells in the right column indicate that GANP hi cells are B220 − Syndecan1 + IgM + . GANP expression is shown in red for IgM, IgG and B200, and green for Syndecan-1. As for markers, IgM, IgG and B200 are shown in green, and in the case of Syndecan-1, they are shown in red.

GANPhi 細胞はB220-Syndecan-1+ の表現型を発現し、多量のIgM を細胞中に発現する(図５)。CR1、Thy-1、GL-7、CD23及びPNAについては陰性であり、これらの結果から、GANPhi 細胞がB系細胞の後期成熟段階、おそらく形質細胞であることが示される。このGANPhi 細胞が増殖性形質芽細胞であるかどうかを調べるために、NZBマウスにBrdU (1 mg／マウス)を投与（静脈内注入）し、インビボでBrdUを取り込ませるために２時間インキュベートした。その後、マウスから脾臓切片を調製した。
切片を抗GANPモノクローナル抗体（青）及び抗BrdUモノクローナル抗体（赤）で二重染色した。PAS染色を常法に従って行った。
結果を図６に示す。GCは胚中心を示す（左）。GANP単一陽性GANPhi 細胞は矢印で示し、PAS単一陽性細胞を矢頭で示す（中央）。 GANP hi cells express the B220 − Syndecan-1 + phenotype and express large amounts of IgM in the cells (FIG. 5). It is negative for CR1, Thy-1, GL-7, CD23 and PNA, and these results indicate that GANP hi cells are the late mature stage of B lineage cells, possibly plasma cells. In order to examine whether these GANP hi cells are proliferating plasmablasts, NZB mice were administered BrdU (1 mg / mouse) (intravenous injection), and incubated for 2 hours to incorporate BrdU in vivo. . Thereafter, spleen sections were prepared from the mice.
Sections were double-stained with anti-GANP monoclonal antibody (blue) and anti-BrdU monoclonal antibody (red). PAS staining was performed according to a conventional method.
The results are shown in FIG. GC indicates the germinal center (left). GANP single positive GANP hi cells are indicated by arrows, and PAS single positive cells are indicated by arrows (middle).

また、切片をビオチン標識抗CD-5モノクローナル抗体で染色した。PALS領域は、リンパ節動脈周囲鞘を示す（右）。図６は、３回の独立した実験から代表的データを示した。
GANPhi 細胞はBrdU 取り込みについて陽性ではないことから（図６）、これらの細胞は増殖性ではなく、形質芽細胞段階より成熟していることが示唆された。
B-1細胞の異常な分化として、Mott細胞形成が自己免疫傾向マウスで観察される。Mott細胞は形質細胞の異常な形態であり、多量のIgM 分子が、PAS染色により細胞質内Russell小体として検出される粗面小胞体結合小胞に蓄積している [Jiang Y.,他、1997, J. Immunol. 158: 992-997]。GANPhi 細胞はPAS-染色で染色されず(図６)、これによりGANPhi 細胞をB-1 細胞由来形質細胞のMott細胞と区別することができる。脾臓GANPhi 集団はCD5発現が陰性であり(図６)、NZBマウス(12週)から得た腹膜細胞は GANPhi 細胞について陰性であったことから、B-1細胞は多量のGANPを発現していないことが示される。これらの結果から、GANPhi 細胞は自己免疫状態で高活性のB細胞に分類され、この集団がB-1細胞の起源とは異なる起源の系統であることが示唆される。 The sections were stained with biotin-labeled anti-CD-5 monoclonal antibody. The PALS region shows the perilymphatic sheath (right). FIG. 6 shows representative data from three independent experiments.
GANP hi cells were not positive for BrdU incorporation (FIG. 6), suggesting that these cells are not proliferative and mature from the plasmablast stage.
As abnormal differentiation of B-1 cells, Mott cell formation is observed in autoimmune-prone mice. Mott cells are an abnormal form of plasma cells, and large amounts of IgM molecules accumulate in rough endoplasmic reticulum-associated vesicles detected as cytoplasmic Russell bodies by PAS staining [Jiang Y., et al., 1997 , J. Immunol. 158: 992-997]. GANP hi cells are not stained with PAS- staining (Fig. 6), thereby to distinguish GANP hi cells with Mott cells B-1 cell-derived plasma cells. The splenic GANP hi population was negative for CD5 expression (Fig. 6), and peritoneal cells obtained from NZB mice (12 weeks) were negative for GANP hi cells, so B-1 cells expressed large amounts of GANP. Not shown. These results suggest that GANP hi cells are classified as highly active B cells in an autoimmune state, and that this population is a lineage of a different origin from that of B-1 cells.

(3) TD-Agでの免疫による正常マウスにおけるGANPhi細胞の誘導
二次リンパ器官におけるGANPhi形質細胞の出現が、自己免疫傾向マウスに限られているかどうかを調べた。
雌C57BL/6 マウス(７週齢)を、TNP-Ficoll (TI-2-Ag)又はTNP-KLH (TD-Ag)で腹腔内免疫し、14日後に脾臓を得た。TNP-Ficollで免疫したマウスは、ビオチン標識抗IgDモノクローナル抗体で対比染色した場合、GANPhi 細胞を赤脾髄領域で示さなかった（図７左）。TNP-KLHで免疫したマウスは 、GANPhi細胞の誘導を赤脾髄領域で示した（図７右）。図７において、GANPhi細胞は矢印で示す。WPは白脾髄領域を示す。
GANPhi 形質細胞集団は、数は非常に少ないが、TD-Agsによる免疫によって正常C57BL/6及びBALB/c マウスの脾臓においても誘導される(図７)。T細胞非依存性Ag (T cell-independent Ag: TI-Ag) による免疫はそのような細胞の誘導において効果は小さい。GANPhi 細胞集団はB220loIgMhiIgDloGL-7loPNAlo CD5loCD40lo と同様の表現型を示したが、Syndecan-1+を示した。 (3) Induction of GANP hi cells in normal mice by immunization with TD-Ag We examined whether the appearance of GANP hi plasma cells in secondary lymphoid organs was restricted to autoimmune-prone mice.
Female C57BL / 6 mice (7 weeks old) were immunized intraperitoneally with TNP-Ficoll (TI-2-Ag) or TNP-KLH (TD-Ag), and spleens were obtained 14 days later. Mice immunized with TNP-Ficoll did not show GANP hi cells in the red pulp region when counterstained with biotin-labeled anti-IgD monoclonal antibody (left of FIG. 7). Mice immunized with TNP-KLH showed induction of GANP hi cells in the red pulp region (right of FIG. 7). In FIG. 7, GANP hi cells are indicated by arrows. WP indicates the white pulp region.
The GANP hi plasma cell population is very few but is also induced in spleens of normal C57BL / 6 and BALB / c mice by immunization with TD-Ags (FIG. 7). Immunization with T cell-independent Ag (TI-Ag) is less effective in inducing such cells. The GANP hi cell population showed a phenotype similar to B220 lo IgM hi IgD lo GL-7 lo PNA lo CD5 lo CD40 lo , but showed Syndecan-1 + .

これらの結果から、自己免疫傾向マウスにおけるGANPhi 形質細胞の生成は、TD-Agに対する免疫応答のために提供されるのと同様の刺激によって誘導されることが示される。GCで増殖と分化を経たAg駆動B細胞は、GANPを発現しながらより長い間、形質細胞段階として赤脾髄領域に局在化している可能性がある。
These results indicate that the generation of GANP hi plasma cells in autoimmune-prone mice is induced by stimuli similar to those provided for an immune response against TD-Ag. Ag-driven B cells that have undergone proliferation and differentiation in GC may be localized to the red pulp region as a plasma cell stage for a longer time while expressing GANP.

GANPの過剰発現
（方法）
１．Daudi細胞への安定なトランスフェクション
10μgの線状化したpCXN-2マウスGANP又はGANPS/A502 cDNAをDaudi細胞に、Gene Pulser II (Bio-Rad)を用いてエレクトロポレーションを行った。48時間後、G418 (Promega; 1 mg/ml)により選択を開始して、マウスGANPを安定に発現するDaudi細胞を得た。 GANP overexpression (method)
1. Stable transfection into Daudi cells
10 μg of linearized pCXN-2 mouse GANP or GANPS / A502 cDNA was electroporated into Daudi cells using Gene Pulser II (Bio-Rad). After 48 hours, selection was initiated with G418 (Promega; 1 mg / ml) to obtain Daudi cells stably expressing mouse GANP.

２．DaudiトランスフェクタントのIg VH 転写物の分析
全RNAを全細胞からTrizol (Invitrogen)を用いて抽出した。cDNAを既報の通り取得した（Kuwahara, K. et al., Blood 95, 2321-2328 (2000)）。LVH3- CH1Cμ転写物を以下のプライマー及び反応液を用いて増幅した。増幅は、Pfu Turbo (Stratagene)を用いた。 2. Analysis of Daudi transfectant Ig V H transcripts Total RNA was extracted from whole cells using Trizol (Invitrogen). cDNA was obtained as previously reported (Kuwahara, K. et al., Blood 95, 2321-2328 (2000)). The LV H 3-C H 1Cμ transcript was amplified using the following primers and reaction solution. For amplification, Pfu Turbo (Stratagene) was used.

5'-LVH3 プライマー：
5'-CTATAACCATGGACCATGGACATACTTTGTTCC-3' （配列番号５）
3'-XbaI-CH1-Cμプライマー ：
5'-TGCATGCATTCTAGAGTTGCCGTTGGGGTGCTGGAC-3' （配列番号６） 5'-LV H 3 Primer:
5'-CTATAACCATGGACCATGGACATACTTTGTTCC-3 '(SEQ ID NO: 5)
3'-XbaI-C H 1-Cμ Primer:
5'-TGCATGCATTCTAGAGTTGCCGTTGGGGTGCTGGAC-3 '(SEQ ID NO: 6)

反応液組成：
Reaction solution composition:

反応条件：
94℃ 1 min
[94℃ 1 min; 62℃ 1 min ; 72℃ 1 min] ×35 サイクル
72℃ 10 min
4℃ Reaction conditions:
94 ℃ 1 min
[94 ℃ 1 min; 62 ℃ 1 min; 72 ℃ 1 min] x 35 cycles
72 ℃ 10 min
4 ℃

PCR産物をNcoI及びXbaIで消化し、ゲルで精製し、NcoI-XbaIで消化したプラスミドとライゲーションした。コンピテント細菌に形質転換後、QIAprepキット(QIAGEN)を用いて調製した少量のプラスミドDNAの塩基配列を自動シークエンサー（Applied Biosystems）により決定した。   The PCR product was digested with NcoI and XbaI, gel purified and ligated with NcoI-XbaI digested plasmid. After transformation into competent bacteria, the base sequence of a small amount of plasmid DNA prepared using the QIAprep kit (QIAGEN) was determined by an automatic sequencer (Applied Biosystems).

３．GANP-トランスジェニック（Tg）マウスの作製
導入遺伝子は、pLGベクターのXhoIサイトに5.6 kbのマウスGANP遺伝子を導入して作製した。このベクターはヒト免疫グロブリンイントロンエンハンサー領域（２kb EcoRIフラグメント）を持ち、B細胞での強力な発現を行う、特異的ベクターである。この遺伝子を直線化してマウスに遺伝子導入を行った。マウスGANP全長cDNAを含む線状化したpLG vector（Koike, M. et al. Int. Immunol. 7, 21-30 (1995)）をC57BL/6 マウスの受精卵にマイクロインジェクションした。マウスの尾のゲノムDNAおよび以下のプライマー及び反応液を用いて導入遺伝子の存在についてスクリーニングした。 3. Preparation of GANP-transgenic (Tg) mouse The transgene was prepared by introducing a 5.6 kb mouse GANP gene into the XhoI site of the pLG vector. This vector has a human immunoglobulin intron enhancer region (2 kb EcoRI fragment) and is a specific vector that performs strong expression in B cells. This gene was linearized and introduced into mice. A linearized pLG vector (Koike, M. et al. Int. Immunol. 7, 21-30 (1995)) containing mouse GANP full-length cDNA was microinjected into fertilized eggs of C57BL / 6 mice. The presence of the transgene was screened using mouse tail genomic DNA and the following primers and reactions.

1-5' プライマー：
5'-TCCCGCCTTCCAGCT GTGAC-3'（配列番号７）
1-3'プライマー：
5'-GTGCTGCTGTGTTATGTCCT-3' （配列番号８） 1-5 'primer:
5'-TCCCGCCTTCCAGCT GTGAC-3 '(SEQ ID NO: 7)
1-3 'primer:
5'-GTGCTGCTGTGTTATGTCCT-3 '(SEQ ID NO: 8)

反応液組成：
Reaction solution composition:

反応条件：
[98℃ 5 sec; 59℃ 5 sec ; 72℃ 10 sec] ×35 サイクル
4℃ Reaction conditions:
[98 ℃ 5 sec; 59 ℃ 5 sec; 72 ℃ 10 sec] × 35 cycles
4 ℃

４．RT-PCR
全RNAは、脾臓又は脾臓B細胞からTrizol(Invitrogen)を用いて抽出し、RT-PCRは、2種のプライマー1-5'及び 1-3'を用いて行い、cDNAを合成した（Kuwahara, K. et al., Blood 95, 2321-2328 (2000)）。GANP 転写物はアガロースゲル電気泳動により検出した。β-アクチン転写物は対照として用いた。 4). RT-PCR
Total RNA was extracted from spleen or splenic B cells using Trizol (Invitrogen), and RT-PCR was performed using two primers 1-5 ′ and 1-3 ′ to synthesize cDNA (Kuwahara, K. et al., Blood 95, 2321-2328 (2000)). GANP transcripts were detected by agarose gel electrophoresis. β-actin transcript was used as a control.

５．結果
(1) Daudi細胞にマウスGANPを安定的に発現させたトランスフェクタントのV領域遺伝子の体細胞突然変異（SHM）
GANP遺伝子を、インビトロでSHMの分析に使用される各種ヒトBリンパ球細胞に導入した（Rogozin, I. B., et al., Nat. Immunol. 2, 530-536 (2001); Kuwahara, K. et al. Blood 95, 2321-2328 (2000); 及びDenepoux, S. et al., Immunity 6, 35-46 (1997)）。多くのB細胞株にはトランスフェクションできなかったが、維持中はSHMを通常は生成しないAIDを発現するDaudi B細胞にはGANP遺伝子を導入できた。
このクローンは、野生型及び偽トランスフェクションした細胞と比較して高頻度のSHM (5 x 10-4/bp)をV領域で示した。
VH3-CH1Cμの断片をPCRで増幅してプラスミドにサブクローニングし、シークエンスした。 5. result
(1) Somatic mutation (SHM) of transfectant V region gene that stably expressed mouse GANP in Daudi cells
The GANP gene was introduced into various human B lymphocyte cells used for analysis of SHM in vitro (Rogozin, IB, et al., Nat. Immunol. 2, 530-536 (2001); Kuwahara, K. et al Blood 95, 2321-2328 (2000); and Denepoux, S. et al., Immunity 6, 35-46 (1997)). Many B cell lines failed to transfect, but the GANP gene could be introduced into Daudi B cells expressing AID that normally do not produce SHM during maintenance.
This clone showed a higher frequency of SHM (5 × 10 −4 / bp) in the V region compared to wild type and mock transfected cells.
The V H 3-C H 1Cμ fragment was amplified by PCR, subcloned into a plasmid, and sequenced.

体細胞変異の模式図を図８Ａ〜Ｃに示す。縦線（「｜」）はサイレントミューテーション（アミノ酸が変わらない）、もう一つの記号（縦線に●印を付したもの）にはアミノ酸が置換している変異を示す。Daudi/mockではほとんど変異が入っていないが、Daudi/GANP-14, 15, 17, 21の4クローンは、程度の差はあるが変異を多く認める。DNAプライマーゼ活性の制御に関係する502番目のセリンをアラニンに置換した変異体（GANP S/A)を導入したトランスフェクタントでは変異の入る効率が減少する。
SHMは、定常領域遺伝子には誘導されなかった（図８Ａ〜Ｃ）。GANPのRNAプライマーゼ活性はS502でのリン酸化により調節され、これは特異的モノクローナル抗体により検出できる（Kuwahara, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283 (2001)）。インビトロ及びインビボでのB細胞の刺激は共にS502のリン酸化を誘導するので（Kuwahara, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283 (2001)）、このリン酸化がDaudi B細胞でのSHMの生成に関与するかどうかを調べた。
非リン酸化GANP変異体(GANP-S502A)を導入した場合、SHMは誘発されなかったことから（図８Ａ）、S502のリン酸化が、GC-B細胞でのSHMの生成に重要であることが示唆された。 Schematic diagrams of somatic mutation are shown in FIGS. The vertical line (“|”) shows silent mutation (amino acid does not change), and another symbol (vertical line with a mark ● indicates a mutation in which the amino acid is substituted. Daudi / mock has almost no mutation, but 4 clones of Daudi / GANP-14, 15, 17, and 21 have many mutations to some extent. Transfectants introduced with a mutant (GANP S / A) in which the 502nd serine substituted for alanine (GANP S / A), which is involved in the control of DNA primase activity, reduces the efficiency of mutation.
SHM was not induced in the constant region gene (FIGS. 8A-C). The RNA primase activity of GANP is regulated by phosphorylation at S502, which can be detected with a specific monoclonal antibody (Kuwahara, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283 (2001) )). Both in vitro and in vivo stimulation of B cells induces phosphorylation of S502 (Kuwahara, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283 (2001)). Was involved in the production of SHM in Daudi B cells.
Since SHM was not induced when a non-phosphorylated GANP mutant (GANP-S502A) was introduced (FIG. 8A), phosphorylation of S502 is important for generation of SHM in GC-B cells. It was suggested.

(2) B細胞でGANPを過剰発現させたトランスジェニックマウス
免疫応答におけるGANPの関与を調べるために、ヒトIgエンハンサー及びプロモーターの制御下にマウスGANPを過剰発現させたGANP-トランスジェニック (Tg)マウスを作製した（図９Ａ及びＢ）。GANP mRNAの発現の亢進は、RT-PCRで確認した。
このマウスは、B細胞でGANPの発現の増加を示し（図９Ｃ）、骨髄、脾臓及びリンパ節の細胞の表層マーカー分析において、B系細胞の通常の分化を示した。
SHMにおけるGANPのインビボでの役割を調べるために、TD-AgであるNP-CGの免疫後におけるVH186.2 領域について調べた。すなわち、GANP過剰発現トランスジェニック（Tg）マウスに50μgのNP-CGを2週間おきに3回免疫して、VH186.2をPCRで増幅し、体細胞突然変異を解析した。 (2) Transgenic mice overexpressing GANP in B cells GANP-transgenic (Tg) mice overexpressing mouse GANP under the control of human Ig enhancers and promoters to investigate the involvement of GANP in the immune response Were prepared (FIGS. 9A and 9B). Increased expression of GANP mRNA was confirmed by RT-PCR.
This mouse showed increased expression of GANP in B cells (FIG. 9C) and showed normal differentiation of B lineage cells in surface marker analysis of bone marrow, spleen and lymph node cells.
In order to investigate the in vivo role of GANP in SHM, the V H 186.2 region after immunization with TD-Ag, NP-CG, was examined. Specifically, GANP overexpressing transgenic (Tg) mice were immunized with 50 μg of NP-CG three times every two weeks, V H 186.2 was amplified by PCR, and somatic mutations were analyzed.

結果を図10に示す。変異の数はTgでやや増加しているが、高親和性を示す33番目のWがLに変わる変異(SHM)は、Tgで約3倍に増加していた。なお、CDRは相補鎖決定領域を示す。
VH186.2ローカスは、高親和性IgG(γ1λ1)NP-応答について特有のパターンのSHMを示す。NP-CGでの免疫後における全脾臓B細胞の配列分析により、野生型マウスと比較してGANP-Tg マウスではSHMの頻度が僅かに増加していることが示された(図10)。
この変異は、ハプテン特異的B細胞の親和性成熟に重要であることが以前に示されている（Allen, D. et al., EMBO J. 1995-2001 (1988)）。
The results are shown in FIG. The number of mutations slightly increased with Tg, but the mutation (SHM) in which 33rd W showing high affinity changed to L (SHM) increased about 3-fold with Tg. CDR represents a complementary strand determining region.
V H 186.2 locus shows a unique pattern of SHM for high affinity IgG (γ1λ1) NP-response. Sequence analysis of whole spleen B cells after immunization with NP-CG showed that the frequency of SHM was slightly increased in GANP-Tg mice compared to wild type mice (FIG. 10).
This mutation has previously been shown to be important for affinity maturation of hapten-specific B cells (Allen, D. et al., EMBO J. 1995-2001 (1988)).

B細胞特異的GANP欠損マウス(B-GANP-/-マウス)の作製
（方法）
１．CD19-Cre/+GANP flox マウスの樹立
GANPゲノムDNAを用いて、エクソンIIの下流にネオマイシン耐性遺伝子（neo）を挿入することによってターゲッティングベクターを調製した。loxP部位は、neoの３’側の隣接領域とエクソンI及びIIの間のイントロンに導入した。
つまり、エクソンIIをloxP配列で挿んだfloxマウスを作製し、これとCD19-Creマウスとを交配させて、B細胞でGANPが欠損するマウスを樹立した（図11A及びB）。
直線化したターゲッティングベクターをTT2 ES 細胞（Yagi, T. et al. Anal. Biochem. 214, 70-76 (1993)）にエレクトロポレーションによりトランスフェクションした。G418で選択後、ES コロニーを拾い上げ、プロテナーゼKと一緒にインキュベートした。相同組換え体を下記neo2プライマー及びCGK3'-2プライマーによりスクリーニングした。 Generation of B cell-specific GANP-deficient mice (B-GANP -/- mice) (method)
1. Establishment of CD19-Cre / + GANP flox mice
A targeting vector was prepared by inserting a neomycin resistance gene (neo) downstream of exon II using GANP genomic DNA. The loxP site was introduced into the intron between the exon I and II and the adjacent region 3 ′ of neo.
That is, a flox mouse in which exon II was inserted with a loxP sequence was prepared, and this was mated with a CD19-Cre mouse to establish a B cell-deficient mouse with GANP (FIGS. 11A and B).
The linearized targeting vector was transfected into TT2 ES cells (Yagi, T. et al. Anal. Biochem. 214, 70-76 (1993)) by electroporation. After selection with G418, ES colonies were picked and incubated with proteinase K. Homologous recombinants were screened with the following neo2 primer and CGK3′-2 primer.

neo2プライマー：
5'-GCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAAT-3' （配列番号９）
CGK3'-2プライマー
5'-GGCACCAAGCATGCACGGAGTACACAGA-3' （配列番号１０） neo2 primer:
5'-GCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAAT-3 '(SEQ ID NO: 9)
CGK3'-2 primer
5'-GGCACCAAGCATGCACGGAGTACACAGA-3 '(SEQ ID NO: 10)

相同組み換えは、BamHIで消化したESクローンのDNAをプローブAを用いてサザンブロット分析することにより確認した。4kbのバンドを示す3個の陽性クローンを用いて、ICR胚盤胞へのマイクロインジェクションによりキメラ初代マウスを作製した。なお、B細胞でGANPの発現が見られないことは、サザンブロッティング、RT-PCRと細胞染色で確認した（図11C、D及びE）。
GANP flox/+マウスは少なくとも10回、C57BL/6マウスと戻し交配した。B細胞におけるGANP遺伝子を欠失させるために、GANP-floxed マウスとCD19-Cre ノックインマウス（Rickert, R. C., et al., Nucleic Acids Res. 25, 1317-1318 (1997)）とを交配した。 Homologous recombination was confirmed by Southern blot analysis using DNA from ES clones digested with BamHI. Chimeric primary mice were prepared by microinjection into ICR blastocysts using 3 positive clones showing 4 kb bands. The absence of GANP expression in B cells was confirmed by Southern blotting, RT-PCR and cell staining (FIGS. 11C, D and E).
GANP flox / + mice were backcrossed at least 10 times with C57BL / 6 mice. In order to delete the GANP gene in B cells, GANP-floxed mice and CD19-Cre knock-in mice (Rickert, RC, et al., Nucleic Acids Res. 25, 1317-1318 (1997)) were mated.

２．FACS分析
リンパ器官由来の単一細胞懸濁物を、各ビオチン標識モノクローナル抗体により氷上で１時間染色した。染色バッファーで洗浄後、細胞をFITC結合ストレプトアビジン (Amersham Bioscience)及びPE結合モノクローナル抗体で１時間インキュベートした。リンパ細胞を、CellQuestソフトウエアを用いて FACScan (Becton Dickinson)により分析した。 2. FACS analysis Single cell suspensions from lymphoid organs were stained with each biotin-labeled monoclonal antibody for 1 hour on ice. After washing with staining buffer, cells were incubated with FITC-conjugated streptavidin (Amersham Bioscience) and PE-conjugated monoclonal antibody for 1 hour. Lymphocytes were analyzed by FACScan (Becton Dickinson) using CellQuest software.

３．B細胞の精製
脾臓細胞をCre-flox/+マウス及び B-GANP-/-マウス(7から8週齢) から単離し、0.15 M 塩化アンモニウム緩衝液で処理して赤血球を除いた。プラスチック皿上で37℃で30分間インキュベーションした後、未接着細胞をリンパ球として回収し、T細胞をDynabeads-anti-mouse Thy1.2 モノクローナル抗体(Dynal)を添付のプロトコールに従って使用して除去した。B細胞の純度(90%以上)をFITC結合抗B220モノクローナル抗体(BD Pharmingen)を用いた細胞表層染色により確認した。 3. Purification of B cells Spleen cells were isolated from Cre-flox / + mice and B-GANP − / − mice (7 to 8 weeks old) and treated with 0.15 M ammonium chloride buffer to remove erythrocytes. After incubation for 30 minutes at 37 ° C. on plastic dishes, non-adherent cells were collected as lymphocytes and T cells were removed using Dynabeads-anti-mouse Thy1.2 monoclonal antibody (Dynal) according to the attached protocol. The purity (90% or more) of B cells was confirmed by cell surface staining using FITC-conjugated anti-B220 monoclonal antibody (BD Pharmingen).

４．インビトロ増殖アッセイ
精製したB細胞を、10%熱不働化FCS(JRH Biosciences)、2 mMのL-グルタミン及び5×10-5 Mの2-メルカプトエタノールを含むRPMI-1640 培地（***促進剤を含むものと含まないもの）中において、96穴マイクロタイタープレートで2×105 細胞／ウエルで48時間インキュベートした。細胞を、0.2μCi/ウエルの[3H]-チミジン(ICN)で16時間パルスしてから回収し、取り込まれた放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。
***促進剤は、アフィニティー精製したヤギ抗マウスμ鎖特異的抗体(10μg/ml)[F(ab')2] (ICN)、ラット抗マウスCD40モノクローナル抗体(LB429; 10μg/ml)及びLPS(Sigma; 10μg/ml)を用いた。 4). In Vitro Proliferation Assay Purified B cells were treated with RPMI-1640 medium containing 10% heat-inactivated FCS (JRH Biosciences), 2 mM L-glutamine and 5 × 10 −5 M 2-mercaptoethanol (containing mitogens). In a 96-well microtiter plate for 48 hours at 2 × 10 5 cells / well. Cells were pulsed with 0.2 μCi / well of [ 3 H] -thymidine (ICN) for 16 hours and then harvested, and the incorporated radioactivity was measured with a scintillation counter.
Mitogenic agents include affinity purified goat anti-mouse μ chain specific antibody (10 μg / ml) [F (ab ′) 2 ] (ICN), rat anti-mouse CD40 monoclonal antibody (LB429; 10 μg / ml) and LPS (Sigma 10 μg / ml) was used.

５．抗原及び免疫
TNP-KLH、TNP-Ficoll及びニトロフェニル-ニワトリγグロブリン(NP-CG) (23:1)は、Biosearch Technologiesから購入した。50μgのTNP-KLH及びNP-CG （アルミニウムで沈殿）、又は25μgのTNP-Ficoll（PBSに溶解）をCre-flox/+マウス及びB-GANP-/-マウスの腹腔内に注入した。 5. Antigen and immunity
TNP-KLH, TNP-Ficoll and nitrophenyl-chicken gamma globulin (NP-CG) (23: 1) were purchased from Biosearch Technologies. 50 μg of TNP-KLH and NP-CG (precipitated with aluminum) or 25 μg of TNP-Ficoll (dissolved in PBS) were injected into the peritoneal cavity of Cre-flox / + mice and B-GANP − / − mice.

６．抗原特異的抗体産生の測定
抗原投与の10日後と14日後に、免疫したマウスから血清を回収した。5μg/ウエルのTNP-BSA (Biosearch Technology) をELISAプレートに被覆した。各ウエルをPBS中の3% BSAでブッロキングし、段階希釈した血清とインキュベートした。PBS-0.1% Tween 20で洗浄後、ウエルをビオチン結合isotype特異的モノクローナル抗体及びアルカリホスファターゼ(ALP)結合ストレプトアビジン(Southern Biotechnology)とともにインキュベートした。発色は基質の存在下で行った。
血清中のNP結合抗体の親和性を求めるために、NP2結合抗体のNP25結合抗体に対する割合を、被覆抗原にNP2-BSA（1分子あたり2個のNPがBSAに結合したもの）及びNP25-BSA（1分子あたり25個のNPがBSAに結合したもの）(Biosearch Technology)を用いたディファレンシャルELISAにより計算した。 6). Measurement of antigen-specific antibody production Serum was collected from immunized mice 10 and 14 days after antigen administration. 5 μg / well of TNP-BSA (Biosearch Technology) was coated on an ELISA plate. Each well was blocked with 3% BSA in PBS and incubated with serially diluted serum. After washing with PBS-0.1% Tween 20, the wells were incubated with biotin-conjugated isotype specific monoclonal antibody and alkaline phosphatase (ALP) -conjugated streptavidin (Southern Biotechnology). Color development was performed in the presence of the substrate.
In order to determine the affinity of NP-binding antibodies in serum, the ratio of NP2-binding antibodies to NP25-binding antibodies was determined by coating NP2-BSA (two NPs per molecule bound to BSA) and NP25-BSA. Calculation was performed by differential ELISA using (Biosearch Technology) (25 NPs bound to BSA per molecule).

７．免疫組織化学
免疫したマウスからの8μmの脾臓切片をアセトンで軽く固定した。サンプルをPBS-Tween 20中の3% BSAでブロックし、抗IgDモノクローナル抗体及びALP-結合抗ラットIgG(ICN)抗体とともにインキュベートした。第一の発色はVector Blueキット(Vector)を用いて行った。第二の発色は、サンプルをビオチン結合ピーナッツアグルチニン(PNA)(Vecor)及び西洋わさびペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(Kirkegaard & Perry)とともにインキュベートし、次に3,3'-ジアミノベンジジンテトラ塩酸塩(Dojindo)とともにインキュベートした。PBS中の1%グルタルアルデヒドを用いてサンプルを固定した後、Aquatex(Merck)によりマウンティングを行った。 7). Immunohistochemistry 8 μm spleen sections from immunized mice were lightly fixed with acetone. Samples were blocked with 3% BSA in PBS-Tween 20 and incubated with anti-IgD monoclonal antibody and ALP-conjugated anti-rat IgG (ICN) antibody. The first color development was performed using a Vector Blue kit (Vector). The second color development is the incubation of the sample with biotin-conjugated peanut agglutinin (PNA) (Vecor) and horseradish peroxidase-conjugated streptavidin (Kirkegaard & Perry) and then 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Dojindo) Incubated with. Samples were fixed with 1% glutaraldehyde in PBS and then mounted with Aquatex (Merck).

８．VH186.2 遺伝子の配列分析
NP-CGで免疫したCre-flox/+及びB-GANP-/-マウスからのNP-結合IgG1dullCD38low B細胞を、(4-ヒドロキシ-5-ヨード-3-ニトロフェニル)アセチル (NIP)を用いてFACS Vantage (Becton Dickinson Biosciences)で分画し、プロテナーゼKと一緒に37℃で一晩インキュベートした。ライセートを用いて、PCRを既報の通り（Takahashi, Y., et al. Immunity 14, 181-192 (2001)）２回実施した。VH186.2 遺伝子DNAをpBluescriptにライゲーションし、自動シークエンサーにより配列を決定した。 8). Sequence analysis of the V H 186.2 gene
NP-binding IgG1 dull CD38 low B cells from Cre-flox / + and B-GANP − / − mice immunized with NP-CG were treated with (4-hydroxy-5-iodo-3-nitrophenyl) acetyl (NIP) Were fractionated on a FACS Vantage (Becton Dickinson Biosciences) and incubated with proteinase K at 37 ° C. overnight. PCR was performed twice using lysates as previously reported (Takahashi, Y., et al. Immunity 14, 181-192 (2001)). V H 186.2 gene DNA was ligated to pBluescript, and the sequence was determined by an automatic sequencer.

９．アポトーシス細胞の検出
Cre-flox/+及びB-GANP-/-マウスから精製したB細胞を40時間、種々の試薬で刺激した(Watanabe, N. et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47, 541-547)。AICDには、24ウエルプレートに抗μ抗体(50μg/ml)を固定した。そのほかの場合には、精製したB細胞を種々の刺激物質で48時間刺激し、続いて抗Fasモノクローナル抗体(Jo2;BD Pharmingen)で4時間インキュベートした(Wang, J. et al. (1996) J. Exp. Med. 184, 831-838)。細胞を、プロピジウムアイオダイド(PI)溶液(50μg/ml PI, 0.1% Triton X-100, 0.1% クエン酸ナトリウム)を用い、室温で1時間インキュベートし、アポトーシス細胞(%)をFACScanでG1以下領域として計算した。なお、アポトーシス細胞は、トリパンブルーによる染色後、顕微鏡下での確認も行った。 9. Detection of apoptotic cells
B cells purified from Cre-flox / + and B-GANP − / − mice were stimulated with various reagents for 40 hours (Watanabe, N. et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47, 541-547 ). For AICD, anti-μ antibody (50 μg / ml) was immobilized on a 24-well plate. In other cases, purified B cells were stimulated with various stimulants for 48 hours, followed by incubation with anti-Fas monoclonal antibody (Jo2; BD Pharmingen) for 4 hours (Wang, J. et al. (1996) J Exp. Med. 184, 831-838). Incubate the cells with propidium iodide (PI) solution (50 μg / ml PI, 0.1% Triton X-100, 0.1% sodium citrate) for 1 hour at room temperature. As calculated. Apoptotic cells were also confirmed under a microscope after staining with trypan blue.

１０．TUNELアッセイ
Cre-flox/+及びB-GANP-/-マウスをSRBC(ヒツジ赤血球細胞)で免役した後、それぞれの脾臓切片を調製し、PBS中の4%パラホルムアルデヒドで凍結切片を固定した。切片サンプルを、MEBSTAIN Apoptosis Kit II(MBL)で処理し、PIで対比染色した。TdT媒介dUTP-ビオチンニック-エンド標識（TUNEL）アッセイと共に行う実験用に、切片は抗IgG1 モノクローナル抗体(BD Pharmingen)及びAlexa546-結合ヤギ抗ラットIgG抗体(Molecular Probes)を用いた染色も行った。陽性シグナルを検出し、結果を蛍光顕微鏡(BX51; Olympus)により確認した。 10. TUNEL assay
After Cre-flox / + and B-GANP − / − mice were immunized with SRBC (sheep red blood cells), spleen sections were prepared, and frozen sections were fixed with 4% paraformaldehyde in PBS. Section samples were treated with MEBSTAIN Apoptosis Kit II (MBL) and counterstained with PI. Sections were also stained with anti-IgG 1 monoclonal antibody (BD Pharmingen) and Alexa546-conjugated goat anti-rat IgG antibody (Molecular Probes) for experiments performed with the TdT-mediated dUTP-biotin nick-endo labeling (TUNEL) assay . A positive signal was detected, and the result was confirmed by a fluorescence microscope (BX51; Olympus).

１１．結果
(1) RNAプライマーゼGANPの役割
RNAプライマーゼGANPの役割を調べるために、Cre-loxP システムを用いてCD19+ B細胞にしてGANP遺伝子を欠失させた B-GANP-/-マウスを作製した(図11A及びB)。B-GANP-/-マウス遺伝子は、エクソンIIをほとんど欠損していた（図11C）。B-GANP-/-細胞はGANP mRNAを発現せず(図11D)、また免疫染色によればタンパク質をほとんど発現しなかった（図11E）。B-GANP-/-マウスは正常に成育し、骨髄、脾臓、胸腺、リンパ節で正常な数のリンパ細胞を示した。フローサイトメトリー分析では、B-GANP-/-は、骨髄、脾臓及びリンパ節の細胞上に、対照であるCre-flox/+マウスと同様の表面マーカープロフィールを示し(図12)、Cre-flox/+（対照）と差はなかった。 11. result
(1) Role of RNA primase GANP
In order to investigate the role of RNA primase GANP, B-GANP − / − mice in which the GANP gene was deleted were generated using CD19 + B cells using the Cre-loxP system (FIGS. 11A and B). The B-GANP − / − mouse gene was almost deficient in exon II (FIG. 11C). B-GANP − / − cells did not express GANP mRNA (FIG. 11D) and, according to immunostaining, expressed almost no protein (FIG. 11E). B-GANP − / − mice grew normally and showed a normal number of lymphocytes in the bone marrow, spleen, thymus and lymph nodes. In flow cytometry analysis, B-GANP − / − showed a surface marker profile similar to that of the control Cre-flox / + mice on bone marrow, spleen and lymph node cells (FIG. 12). There was no difference from / + (control).

B-GANP-/-のリンパ節では、sIgMlowsIgDhigh を発現する成熟B細胞（IgM+IgD+）の数が減少していた。B-GANP-/-マウス由来のB細胞は、インビトロで抗μ抗体、抗μ抗体＋抗CD40モノクローナル抗体、またはリポ多糖による刺激後に通常の増殖応答を示した（図13：B-GANP-/-は白の棒、Cre-flox/+は黒の棒）。一方、B-GANP-/-マウス由来のB細胞は、抗CD40モノクローナル抗体(5, 10μg/mL)による刺激後に増殖活性が低下した（図13）。このことは、B-GANP-/-マウスのB細胞の増殖では、CD40/CD145相互作用への反応がわずかに損なわれていることを示す。血清Ig量はCre-flox/+マウスと同様であった（図14）。 In B-GANP − / − lymph nodes, the number of mature B cells (IgM + IgD + ) expressing sIgM low sIgD high was decreased. B cells derived from B-GANP − / − mice showed a normal proliferative response in vitro after stimulation with anti-μ antibody, anti-μ antibody + anti-CD40 monoclonal antibody, or lipopolysaccharide (FIG. 13: B-GANP − / - white bar, Cre-flox / + black bars). On the other hand, the proliferation activity of B cells derived from B-GANP − / − mice decreased after stimulation with anti-CD40 monoclonal antibody (5, 10 μg / mL) (FIG. 13). This indicates that B-GANP − / − mouse B cell proliferation is slightly impaired in response to the CD40 / CD145 interaction. Serum Ig levels were similar to Cre-flox / + mice (Figure 14).

(2) B-GANP-/-マウスにおける抗原特異的抗体産生
TI-Ag及びTD-Agによる免疫後のB-GANP-/-マウスの免疫応答を調べた。TI抗原であるトリニトロフェニル(TNP)-Ficollを免疫して14日後に、抗TNP抗体価をELISAで測定した。その結果、(TNP)-FicollはB-GANP-/-マウス及びCre-flox/+マウスにおいて同様の応答を誘導し、特に差はなかった（図15）。
胚中心(GC)形成を調べてみると、TD-AgであるTNP-keyhole limpet hemocyanin (KLH)及びNP-CGなどのTD-Agsに応答して、変異体マウスはCre-flox/+マウスと比べて遅延したGC形成を示した。 (2) Antigen-specific antibody production in B-GANP -/- mice
The immune response of B-GANP − / − mice after immunization with TI-Ag and TD-Ag was examined. 14 days after immunization with TI antigen trinitrophenyl (TNP) -Ficoll, anti-TNP antibody titer was measured by ELISA. As a result, (TNP) -Ficoll induced similar responses in B-GANP − / − mice and Cre-flox / + mice, and there was no particular difference (FIG. 15).
Examination of germinal center (GC) formation revealed that mutant mice and Cre-flox / + mice responded to TD-Ags such as TNP-keyhole limpet hemocyanin (KLH) and TD-Ags such as NP-CG. Compared with delayed GC formation.

GC形成のピーク応答については、Cre-flox/+は、10日目にGC-B細胞のマーカーであるピーナッツアグルチニンで染色された大きな成熟したGCを示した（図16の矢印）。免疫後10日ではB-GANP-/-の方がGC形成がやや少なかった。しかし、14日後ではCre-flox/+に比べてB-GANP-/-の方が数が多くなっており、20日後でもGC形成が遷延していた（図16の矢印）。
B-GANP-/-マウスは14日目にGCの明白な形成を示したので、抗原特異的抗体応答を測定した（図17）。TD抗原であるTNP-KLHによる免疫では、B-GANP-/-マウスは10日目まで明確なGCを示さず、抗体価はほとんど差がなかったが、TNP-KLHによる免疫後の14日目には、B-GANP-/-でGCの段階的な増加と拡大を示した (図17)。変異体マウスはTNP-KLHに対してCre-flox/+マウスと同様の抗体応答を示した。 For the peak response of GC formation, Cre-flox / + showed large mature GC stained with peanut agglutinin, a marker for GC-B cells, on day 10 (arrows in FIG. 16). 10 days after immunization, B-GANP -/-produced slightly less GC. However, after 14 days, the number of B-GANP -/- was larger than that of Cre-flox / +, and GC formation was prolonged even after 20 days (arrow in Fig. 16).
Since B-GANP − / − mice showed clear formation of GCs on day 14, antigen-specific antibody responses were measured (FIG. 17). In immunization with TD antigen TNP-KLH, B-GANP -/- mice did not show a clear GC until day 10, and there was little difference in antibody titer, but 14 days after immunization with TNP-KLH Showed a gradual increase and expansion of GC at B-GANP -/- (Fig. 17). Mutant mice showed an antibody response to TNP-KLH similar to Cre-flox / + mice.

(3) B-GANP-/-マウスにおける親和性成熟の障害
B-GANP-/-マウスにおけるGCの特徴（抗体応答が低親和性であること）をさらに調べるために、抗原特異的IgG1+ GC-B細胞をNP-CGによる免疫後に調べた。
異なる分子量を有するNPのハプテン/タンパク質コンジュゲートを用いたディファレンシャルELISAにより、マルチハプテンNP25-BSAコンジュゲートに対する応答と比較した。
B-GANP-/-マウスにおいて、NP2-BSAコンジュゲートに対する抗体応答は、NP-CG免疫後35日目において低親和性(13%)であった。この値は、Cre-flox/+マウスの値(42%)と比較して抗体反応は著しく減少していた（図18）。 (3) Impairment of affinity maturation in B-GANP -/- mice
To further investigate the characteristics of GC in B-GANP − / − mice (antibody response is low affinity), antigen-specific IgG1 + GC-B cells were examined after immunization with NP-CG.
A differential ELISA using hapten / protein conjugates of NPs with different molecular weights was compared to the response to the multi-hapten NP25-BSA conjugate.
In B-GANP − / − mice, the antibody response to the NP2-BSA conjugate was low affinity (13%) at 35 days after NP-CG immunization. This value was significantly reduced in antibody response compared to the value of Cre-flox / + mice (42%) (FIG. 18).

また、図19に示す通り、NP-特異的IgG1dullCD38low B細胞はB-GANP-/-マウスでは著しく減少した。すなわち、免疫後10日目において、Cre-flox/+マウスでは1,164細胞/106細胞であるのに対し、B-GANP-/-マウスでは88細胞/106細胞であった。また、14日目においては、Cre-flox/+が879細胞に対し、B-GANP-/-は83細胞であった。なお、この傾向は20日目も同様であった。
対照的に、IgG1highCD38high メモリーB細胞は減少しなかった。これらの結果は、GANP の無発現変異はIgG1highCD38low GC-B細胞段階でB細胞の分化に欠陥を生じさせていることを示す。
B-GANP-/-マウスにおける抗体の親和性成熟の減少を確認するため、NP-CGで免疫した後の脾臓B細胞のVH186.2領域の配列を調べた。 Further, as shown in FIG. 19, NP-specific IgG1 dull CD38 low B cells were markedly decreased in B-GANP − / − mice. That is, on day 10 after immunization, the number of Cre-flox / + mice was 1,164 cells / 10 6 cells, whereas that of B-GANP − / − mice was 88 cells / 10 6 cells. On the 14th day, Cre-flox / + was 879 cells and B-GANP − / − was 83 cells. This trend was similar on the 20th day.
In contrast, IgG1 high CD38 high memory B cells were not reduced. These results indicate that the GANP non-expression mutation causes defects in B cell differentiation at the IgG1 high CD38 low GC-B cell stage.
In order to confirm a decrease in antibody affinity maturation in B-GANP − / − mice, the sequence of the V H 186.2 region of splenic B cells after immunization with NP-CG was examined.

SHMはB細胞分化のこの段階で生じるため、VH186.2 ローカスのSHMについて各種の精製したB細胞を調べた。なお、VH186.2 ローカスは、高親和性IgG (γ1λ1) NP-応答のために利用されている(Cumano, A. & Rajewsky, K. (1985) Eur. J. Immunol. 15, 512-520)。IgM ローカスはCre-flox/+と比較して差異がなかった。
次に、Cre-flox/+又はB-GANP-/-にNP-CGを免疫し、NP-結合IgG1弱陽性CD38弱陽性を示すGC-B細胞（Ag-結合IgG1 B細胞）についてソーティングした（図19）。また、ソーティング後の細胞からゲノムDNAを抽出し、VH186.2をPCRで増幅し、シークエンス解析を行い、VH186.2 の配列を比較した（図20Ａ〜Ｌ）。図20A〜FはCre-flox/+のVH186.2 の配列を、図20G〜LはB-GANP-/-のVH186.2 の配列を比較したものである。 Since SHM occurs at this stage of B cell differentiation, various purified B cells were examined for V H 186.2 locus SHM. In addition, V H 186.2 locus is used for high affinity IgG (γ1λ1) NP-response (Cumano, A. & Rajewsky, K. (1985) Eur. J. Immunol. 15, 512-520) . IgM locus was not different compared to Cre-flox / +.
Next, Cre-flox / + or B-GANP -/- are immunized with NP-CG and sorted for GC-B cells (Ag-binding IgG 1 B cells) that show NP-binding IgG 1 weak positive CD38 weak positive (Figure 19). Further, genomic DNA was extracted from the sorted cells, V H 186.2 was amplified by PCR, sequence analysis was performed, and the sequences of V H 186.2 were compared (FIGS. 20A to L). FIGS. 20A to 20F compare the sequences of Cre-flox / + V H 186.2, and FIGS. 20G to L compare B-GANP − / − sequences of V H 186.2.

B-GANP-/-マウスにおいて、IgV領域配列の全体の変異は14×10-3であり、Cre-flox/+マウス(21×10-3)と比較して変異の数が減少していた（図21）。さらに、W33からLへの高親和性型の変異（33番目のアミノ酸残基トリプトファンからリシンへの変異、C57BL/6 マウスで顕著に見られる）は13%(2/15 V領域）であり、変異型マウスでは、Cre-flox/+マウスの値(71%, 10/14 V領域)と比較してより顕著に減少し、親和性は1/3に低下した（図22）。
以上の結果より、GANPは抗体の親和性の成熟に必須であることが示された。 In B-GANP -/- mice, the total variation of IgV region sequence was 14 x 10 -3 , and the number of mutations was reduced compared to Cre-flox / + mice (21 x 10 -3 ) (Figure 21). Furthermore, 13% (2/15 V region) of the high-affinity mutation from W33 to L (mutation from the 33rd amino acid residue tryptophan to lysine, prominently found in C57BL / 6 mice), Mutant mice showed a more marked decrease compared to Cre-flox / + mice values (71%, 10/14 V region), and the affinity decreased to 1/3 (FIG. 22).
From the above results, it was shown that GANP is essential for antibody affinity maturation.

(4) B-GANP-/-マウスB細胞におけるアポトーシスからの保護機能
B-GANP-/-マウスにおいて、高親和性抗体の産生が減少するのは、抗原刺激後のB細胞が不安定であるためであると考えられる。そこで、B細胞の感受性を調べるため、in vitroでのB細胞のアポトーシスを検討した。
正常なB細胞は、強力に架橋したB細胞抗原受容体により活性化誘導細胞死(AICD)が誘導され、AICDは、CD40の刺激によって阻止された。B-GANP-/- B細胞では、AICDの刺激に対する感受性は正常B細胞（対照）と同程度であったが、抗CD40を介するアポトーシスの抑制の程度については、Cre-flox/+対照B細胞よりも劣っていた（図23）。このことは、B-GANP-/-マウスは、GC形成期の間、抗原反応性B細胞の保護機能に欠けることを示す。 (4) Protective function against apoptosis in B-GANP -/- mouse B cells
In B-GANP − / − mice, the production of high-affinity antibodies decreases because the B cells after antigen stimulation are unstable. In order to investigate the sensitivity of B cells, we examined apoptosis of B cells in vitro.
Normal B cells induced activation-induced cell death (AICD) by strongly cross-linked B cell antigen receptors, and AICD was blocked by CD40 stimulation. B-GANP -/- B cells were as sensitive to AICD stimulation as normal B cells (control), but the degree of inhibition of apoptosis via anti-CD40 was similar to Cre-flox / + control B cells. (Figure 23). This indicates that B-GANP − / − mice lack the protective function of antigen-reactive B cells during the GC formation phase.

GCでは、抗原刺激されたB細胞とCD40/CD154との相互作用によってFas/CD95の表面発現が誘導され、Fas誘導性アポトーシスに感受性を持つようになる。そこで、本発明者は、in vitroにおいてアポトーシスを誘導する抗CD95刺激に対するB-GANP-/-B細胞の感受性を測定した。
まず、脾臓B細胞を抗CD40モノクローナル抗体(LB429)、抗μ抗体＋抗CD40モノクローナル抗体、IL-4+抗CD40モノクローナル抗体、及び抗μ抗体＋IL-4+抗CD40モノクローナル抗体で48時間刺激し、次に抗CD95モノクローナル抗体を培地に添加した。
その結果、B-GANP-/-マウスのB細胞のアポトーシス応答は、Cre-flox/+マウスのB細胞の応答と同様であり、B-GANP-/-マウス及び Cre-flox/+マウスでは差がなかった（図24）。 In GC, Fas / CD95 surface expression is induced by the interaction between antigen-stimulated B cells and CD40 / CD154, and becomes sensitive to Fas-induced apoptosis. Therefore, the present inventor measured the sensitivity of B-GANP − / − B cells to anti-CD95 stimulation that induces apoptosis in vitro.
First, spleen B cells were stimulated with anti-CD40 monoclonal antibody (LB429), anti-μ antibody + anti-CD40 monoclonal antibody, IL-4 + anti-CD40 monoclonal antibody, and anti-μ antibody + IL-4 + anti-CD40 monoclonal antibody for 48 hours, Next, anti-CD95 monoclonal antibody was added to the medium.
As a result, the apoptotic response of B cells in B-GANP-/-mice was similar to that of Cre-flox / + mice, and was different between B-GANP -/- mice and Cre-flox / + mice. There was no (Figure 24).

上記の通り、抗CD40(LB429)処理後に抗CD95で刺激しても、発現誘導は、B-GANP-/-マウス及び Cre-flox/+マウスでは差がなかった。このことは、B-GANP-/- マウスのB細胞においては、in vivoでGC-B細胞により通常受けるアポトーシス刺激に対して感受性を有することを示す。そこで、TUNELアッセイを、TD-AgとしてSRBCを用いて免疫した後の組織切片について行った。
その結果、TUNEL陽性細胞は、B-GANP-/-マウスのGC領域において増加しており、ほとんどの細胞は、IgG1を発現することも示された（図25、26）。これらの結果は、B-GANP-/-マウスのアポトーシス細胞は、ほとんどがGC-B細胞であることが示された（図25、26）
次に、種々の悪性リンパ腫細胞及び正常B細胞のCD40媒介性アポトーシス抑制に必要な分子であると認識されているBcl-2ファミリーメンバーのRNA発現を検討した。 As described above, even when stimulated with anti-CD95 after anti-CD40 (LB429) treatment, expression induction was not different between B-GANP − / − mice and Cre-flox / + mice. This indicates that B cells of B-GANP − / − mice are sensitive to apoptotic stimuli normally received by GC-B cells in vivo. Therefore, TUNEL assay was performed on tissue sections after immunization with SRBC as TD-Ag.
As a result, TUNEL positive cells were increased in the GC region of B-GANP − / − mice, and most cells were also shown to express IgG1 (FIGS. 25 and 26). These results indicated that most of the apoptotic cells in B-GANP − / − mice were GC-B cells (FIGS. 25 and 26).
Next, RNA expression of Bcl-2 family members recognized as molecules necessary for CD40-mediated apoptosis suppression of various malignant lymphoma cells and normal B cells was examined.

抗μ抗体＋IL-4で刺激すると、Cre-flox/+ B細胞におけるbcl-2の転写の明らかな増加を誘導し、抗CD40 mAbはその発現をさらにアップレギュレートした(図27)。また、B-GANP-/- B細胞については、抗μ抗体によるbcl-2転写物と同様のアップレギュレーションを示したが、抗CD40 mAb(抗CD40 mAb単独又は抗μAb + IL-4 + 抗CD40 mAb)に対する応答は、Cre-flox/+のB細胞ほど高くはなかった(図27)。すなわち、アポトーシス抑制に関与するBcl-2ファミリーのRNA発現レベルは、抗CD40抗体で刺激したときのB-GANP-/-マウスB細胞において、対照よりも低下していた（図27）。 Stimulation with anti-μ antibody + IL-4 induced a clear increase in bcl-2 transcription in Cre-flox / + B cells, and anti-CD40 mAb further upregulated its expression (FIG. 27). B-GANP-/-B cells showed the same up-regulation as anti-μ antibody bcl-2 transcripts, but anti-CD40 mAb (anti-CD40 mAb alone or anti-μAb + IL-4 + anti-CD40 The response to mAb) was not as high as that of Cre-flox / + B cells (FIG. 27). That is, the Bcl-2 family RNA expression level involved in apoptosis suppression was lower in B-GANP − / − mouse B cells when stimulated with anti-CD40 antibody than in the control (FIG. 27).

変異B細胞中のbcl-XL、bax及びbadについては、Cre-flox/+ B細胞のレベルと同程度であった(図27)。
以上の結果は、GANPは、GC-B細胞においてCD-40を介したBcl-2の誘導に関する情報伝達を制御しており、in vivoでの高親和性BCR+ B細胞の生存に大きく寄与していることを示す。 The levels of bcl-X L , bax and bad in the mutant B cells were similar to the level of Cre-flox / + B cells (FIG. 27).
These results indicate that GANP regulates signal transduction related to the induction of Bcl-2 via CD-40 in GC-B cells, and greatly contributes to the survival of high-affinity BCR + B cells in vivo. Indicates that

(5) まとめ
B-GANP-/-マウス及びGANP-Tg マウスの結果は、GANPがTD-Agによる免疫後における高親和性B細胞の生成に関与していることを実証している。GANPの役割としては、GC-B細胞でDNAポリメラーゼの効率的なリクルートと調節を仲介している可能性がある。V-領域SHMを有する GC-B細胞が高親和性BCRを取得すると、それらは選択されるべきであり、そしてさらにB細胞のV領域のSHM は抑制されて、インビボで高親和性抗体の産生が保証されるはずである。GC-B細胞でのAIDの発現はDNA変異を絶えず生成する可能性があるため、AID活性の調節がB細胞での高親和性BCRを維持するために必要であるかもしれない。B-GANP-/-マウスでの結果から、GANPがSHMプロセスに必要であることが示される。
(5) Summary
The results of B-GANP − / − mice and GANP-Tg mice demonstrate that GANP is involved in the generation of high affinity B cells after immunization with TD-Ag. The role of GANP may mediate efficient recruitment and regulation of DNA polymerases in GC-B cells. When GC-B cells with V-region SHM acquire high-affinity BCR, they should be selected, and further SH-cells in the B-cell V region are suppressed, producing high affinity antibodies in vivo. Should be guaranteed. Since expression of AID in GC-B cells can continually generate DNA mutations, modulation of AID activity may be necessary to maintain high affinity BCR in B cells. Results with B-GANP − / − mice indicate that GANP is required for the SHM process.

GANPトランスジェニックマウスを用いた高親和性抗体の産生
１．ディファレンシャルELISAによる抗体価の比較
野生型(WT)マウスとGANPトランスジェニック(Tg)マウスの２匹ずつにNP-CG 100 μｇを免疫し、28日後の血清を取り、ELISAを行った。20μg/mlのNP2-BSAとNP17-BSAをELISAプレートに４℃で1晩コーティングした。3% BSA／PBS-0.1% Tween20で1時間ブロックし、血清を1時間反応させた。PBS-0.1%Tween20で３回洗い、ビオチン標識抗マウスIgG1抗体(Southern Biotechnology)で1時間反応させた。PBS-0.1%Tween20で３回洗い、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン(Southern Biotechnology)で30分反応させた。PBS-0.1%Tween20で３回、TBSで１回洗い、p-Nitrophenyl phosphateを基質として発色させた。吸光度を405nmで測定した。
結果を図28に示す。図28の結果から、GANPトランスジェニックマウスを使用することにより高親和性抗体が産生されることが分かる。 Production of high-affinity antibodies using GANP transgenic mice Comparison of antibody titers by differential ELISA Two wild-type (WT) mice and GANP transgenic (Tg) mice were immunized with 100 μg of NP-CG, and the serum after 28 days was collected and subjected to ELISA. 20 μg / ml NP2-BSA and NP17-BSA were coated on ELISA plates at 4 ° C. overnight. After blocking with 3% BSA / PBS-0.1% Tween20 for 1 hour, the serum was reacted for 1 hour. The plate was washed 3 times with PBS-0.1% Tween 20 and reacted with a biotin-labeled anti-mouse IgG 1 antibody (Southern Biotechnology) for 1 hour. The plate was washed 3 times with PBS-0.1% Tween 20, and reacted with alkaline phosphatase-labeled streptavidin (Southern Biotechnology) for 30 minutes. The plate was washed three times with PBS-0.1% Tween20 and once with TBS, and developed with p-Nitrophenyl phosphate as a substrate. Absorbance was measured at 405 nm.
The results are shown in FIG. From the results in FIG. 28, it can be seen that high affinity antibodies are produced by using GANP transgenic mice.

２．ELISA及びBiacoreを用いた抗原-抗体結合親和性解析
野生型(WT)マウスとGANPトランスジェニック(Tg)マウスに、免疫抗原としてNP-CGを免疫し、それぞれのマウスを用いて細胞融合を行い、得られた陽性ハイブリドーマの培養上清において、ELISA法及びBiacoreを用いて抗原と反応する抗体の結合曲線を得た。得られた結合曲線から、Tgマウスの有用性を導いた。
(1) 材料
(a) 動物
野生型（WT）マウスとGANPトランスジェニック（Tg）マウス。
(b) 抗体及び試薬
NP16-CG（一分子あたり１６個のNPがCGニワトリイムノグロブリンに結合したもの）、NP2-BSA（一分子あたり２個のNPがBSA（牛血清アルブミン）に結合したもの）、NP17-BSA（一分子あたり１７個のNPがBSAに結合したもの）、HRP標識抗マウスIgG、IgA及びIgMを用いた。 2. Antigen-antibody binding affinity analysis using ELISA and Biacore Wild type (WT) mice and GANP transgenic (Tg) mice were immunized with NP-CG as an immunizing antigen, and cell fusion was performed using each mouse. In the culture supernatant of the obtained positive hybridoma, a binding curve of an antibody that reacts with an antigen was obtained by ELISA and Biacore. The usefulness of Tg mice was derived from the obtained binding curves.
(1) Material
(a) Animals Wild type (WT) mice and GANP transgenic (Tg) mice.
(b) Antibodies and reagents
NP16-CG (16 NPs per molecule bound to CG chicken immunoglobulin), NP2-BSA (2 NPs bound to BSA (bovine serum albumin) per molecule), NP17-BSA ( 17 NPs per molecule bound to BSA), HRP-labeled anti-mouse IgG, IgA and IgM were used.

(2) 方法及び結果
野生型（WT）マウスとGANPトランスジェニック（Tg）マウスの各５匹に、免疫抗原としてNP16-CGを、２週間をおきに３回免疫し、３回免疫後に採血し、抗血清を用いて抗体価の比較をしたところ、前記１項に記載の結果と同様にGANP-Tgマウスの有用性が確認された。
この中から、力価の高いマウスの脾細胞を用いて、P3U1ミエローマ細胞と細胞融合を実施し、GANP-Tgマウスの脾細胞数(6.0×107個）、WTの脾細胞数(4.8×107)に基づき、1×105/ウェルになるようにまきこみ、GANP-Tgマウス由来の細胞は600クローン、WTマウス由来の細胞は480クローンをHAT培地にて培養した。
HAT培養９日後の培養上清を用いて、NP2-BSA（１μg／mL）を固相化抗原としてELISA法を実施した。GANP-TgマウスおよびWTマウスの培養上清のそれぞれから、ELISA吸光度結果において高親和性抗体の産生を示す上位2.5％のクローンを選出し、HT培地にてクローニングを実施した。 (2) Methods and results Five wild mice each (WT) and GANP transgenic (Tg) mice were immunized three times every two weeks with NP16-CG as an immunizing antigen, and blood was collected after three immunizations. When the antibody titers were compared using antisera, the usefulness of GANP-Tg mice was confirmed in the same manner as the results described in the above item 1.
Among these, spleen cells of high titers were used to perform cell fusion with P3U1 myeloma cells, the number of spleen cells of GANP-Tg mice (6.0 × 10 7 ), the number of WT spleen cells (4.8 × Based on 10 7 ), cells were seeded at 1 × 10 5 / well, and 600 clones of cells derived from GANP-Tg mice and 480 clones of cells derived from WT mice were cultured in HAT medium.
Using the culture supernatant after 9 days of HAT culture, ELISA was performed using NP2-BSA (1 μg / mL) as an immobilized antigen. From each of the culture supernatants of GANP-Tg mice and WT mice, the top 2.5% clones showing production of high affinity antibodies in the ELISA absorbance results were selected and cloned in HT medium.

HT培養９日後の培養上清を用いて、NP2-BSA（１μg／mL）を固相化抗原としてELISA法を実施した結果、GANP-Tgは６クローン（クローン名：G2-6, G2-9, G2-12, G2-14, G2-15, G2-16）、WTは１クローン（クローン名：W2-7）のハイブリドーマを樹立した。
GANP-Tgマウス、WTマウスのそれぞれのクローンをRPMI培地にて培養し、以下の実験に用いるのに適した培養上清を１ｍＬずつ確保した。この培養上清を用いて、以下の評価検討を実施した。 Using the culture supernatant after 9 days of HT culture, ELISA was performed using NP2-BSA (1 μg / mL) as a solid phase antigen. As a result, GANP-Tg was found to be 6 clones (clone names: G2-6, G2-9). , G2-12, G2-14, G2-15, G2-16), and WT established 1 clone (clone name: W2-7) hybridoma.
Each clone of GANP-Tg mouse and WT mouse was cultured in RPMI medium, and 1 mL of culture supernatant suitable for use in the following experiment was secured. Using this culture supernatant, the following evaluation study was carried out.

(a) ELISA法
抗体価を評価するにあたり、抗原の性質の異なるもの、いわゆる、CG一分子あたりNP含有率の異なる物質を用いて、そのELISA反応性の比率をもって評価した。
本法は、NPの親和性を測るのに有用な測定法であり、簡便で多くの検査をすることができるので、一次スクリーニングとして適当で信頼できるものである。 (a) ELISA method In evaluating the antibody titer, substances having different antigen properties, that is, substances having different NP contents per CG molecule were used and evaluated by the ratio of ELISA reactivity.
This method is a useful measurement method for measuring the affinity of NP, and is simple and capable of many tests. Therefore, it is suitable and reliable as a primary screening.

まず、NP2-BSA（１μg／mL）とNP17-BSA（１μg／mL）をそれぞれ固相化抗原として用い、４℃で一晩固相化した。固相化プレートをPBS-Tween20で洗浄した後、スキムミルクPBS-Tween20にてブロッキングを実施した。さらにプレートをPBS-Tween20で洗浄した後、GANP-Tgマウスの６クローン（クローン名：G2-6, G2-9, G2-12, G2-14, G2-15, G2-16）及びWTマウスの1クローン（クローン名：W2-7）のRPMI培養上清（原液〜２５６倍希釈液）を用いて、室温で１時間固相化抗原と反応させた。次に、プレートをPBS-Tween20で洗浄した後、HRP標識抗マウスIgG、IgA及びIgMを室温で１時間反応させた。さらに、プレートをPBS-Tween20で洗浄した後、オルトフェニレンジアミン（OPD）にて５分間発色し、２N硫酸を用いて反応を停止した。
吸光度は、ELISA READERを用いて、490nmにて測定した。
ELISAの結果を図29に示す。図29の結果よりGANP-Tgマウスを使用することにより、高親和性抗体が産生されることがわかる。 First, NP2-BSA (1 μg / mL) and NP17-BSA (1 μg / mL) were used as immobilized antigens, respectively, and immobilized at 4 ° C. overnight. The solid-phased plate was washed with PBS-Tween20 and then blocked with skim milk PBS-Tween20. Further, after washing the plate with PBS-Tween 20, 6 clones of GANP-Tg mice (clone names: G2-6, G2-9, G2-12, G2-14, G2-15, G2-16) and WT mice One clone (clone name: W2-7) of RPMI culture supernatant (stock solution to 256-fold diluted solution) was used to react with the immobilized antigen at room temperature for 1 hour. Next, after the plate was washed with PBS-Tween 20, HRP-labeled anti-mouse IgG, IgA and IgM were reacted at room temperature for 1 hour. Further, the plate was washed with PBS-Tween 20, and then developed with orthophenylenediamine (OPD) for 5 minutes, and the reaction was stopped using 2N sulfuric acid.
Absorbance was measured at 490 nm using an ELISA READER.
The results of ELISA are shown in FIG. From the results in FIG. 29, it can be seen that high affinity antibodies are produced by using GANP-Tg mice.

(b) Biacoreを用いた高親和性解析
上記ELISAの結果で、一番親和性の高いと予想されるクローンについて、Biacoreを用いて物理化学的結合能を調べた。
Biacoreによる解析は、NP2-BSA（1μg／mL）をリガンドとしてBiacoreチップに結合させたものに、アナライト溶液として一番親和性の高いと思われるTg(G2-9)、一番低いと思われるTg(G2-15)、及びWT(W2-7)の３クローンのRPMI培養上清を用いて、それぞれの結合速度定数(k ass)、解離速度定数(k diss)、及び親和性の指標となる解離定数KD (KD = k diss／k ass)を算出した。KDが小さい程、親和性は高いと評価される。 (b) High affinity analysis using Biacore With respect to the clones predicted to have the highest affinity as a result of the above ELISA, physicochemical binding ability was examined using Biacore.
Analysis by Biacore shows that Tg (G2-9), which has the highest affinity as an analyte solution, is the lowest in NP2-BSA (1 μg / mL) bound to a Biacore chip as a ligand. Using three RPMI culture supernatants of Tg (G2-15) and WT (W2-7), the binding rate constant (k ass), dissociation rate constant (k diss), and affinity index The dissociation constant KD (KD = k diss / k ass) was calculated. The smaller the KD, the higher the affinity.

その結果として、G2-9（ELISA: 82.9% NP2/NP17比）のビアコアのパターンを図30に示す。図30に示す曲線(a)〜(e)は、抗体濃度がそれぞれ26.6、13.3、6.65、3.33及び1.66 nMのものである。上記結果から、結合速度定数(k ass)=1.48×105、解離速度定数(k diss) = 9.63×10-4、そして親和性の指標となる解離定数は、KD (KD = k diss／k ass)=6.50×10-9となった。
一方、ELISAの結果から比較的親和性の低いと予想されるG2-15（ELISA: 33.9% NP2/NP17比）のビアコアのパターンを図31に示す。図31に示す曲線(a)〜(e)は、抗体濃度がそれぞれ23.0、11.5、5.75、2.88及び1.44nMのものである。 As a result, the pattern of the via core of G2-9 (ELISA: 82.9% NP2 / NP17 ratio) is shown in FIG. Curves (a) to (e) shown in FIG. 30 are for antibody concentrations of 26.6, 13.3, 6.65, 3.33 and 1.66 nM, respectively. From the above results, the association rate constant (k ass) = 1.48 × 10 5 , the dissociation rate constant (k diss) = 9.63 × 10 −4 , and the dissociation constant indicating the affinity is KD (KD = k diss / k ass) = 6.50 × 10 -9 .
On the other hand, FIG. 31 shows the pattern of G2-15 (ELISA: 33.9% NP2 / NP17 ratio) beer core, which is expected to have relatively low affinity from the ELISA results. Curves (a) to (e) shown in FIG. 31 are for antibody concentrations of 23.0, 11.5, 5.75, 2.88 and 1.44 nM, respectively.

結合速度定数(k ass) = 5.33×104、解離速度定数(k diss) = 1.56×10-2、そして親和性の指標となる解離定数は、KD (KD = k diss／k ass)=2.92×10-7となった。この値は、ELISA法でも同等の親和性を示すW2-7（ELISA: 31.6% NP2/NP17比）の活性を持つKD値=1.67×10-7と近似していた。
以上をもって、GANPトランスジェニック（Tg）マウスを使用することにより、高親和性抗体が産生されることが明らかである。
The association rate constant (k ass) = 5.33 × 10 4 , the dissociation rate constant (k diss) = 1.56 × 10 −2 , and the dissociation constant indicating the affinity is KD (KD = k diss / k ass) = 2.92 × 10 -7 . This value was close to the KD value = 1.67 × 10 −7 having the activity of W2-7 (ELISA: 31.6% NP2 / NP17 ratio) showing the same affinity even in the ELISA method.
From the above, it is clear that high affinity antibodies are produced by using GANP transgenic (Tg) mice.

GANPとMCM3の会合、細胞周期中の核／細胞質間の移動
１．概要
本実施例では、本発明者は部分切断型の変異体GANPを用いることによってGANPのMCM3結合領域を決定し、GANP特異的な領域における502番目のアミノ酸のリン酸化セリン(pSer502)に対する特異的なモノクローナル抗体を用いてNIH-3T3細胞におけるGANPの局在を特徴づけた。
プライマーゼとMCMとの結合は、一つの連動した機能であり、両者が結合した分子複合体はDNAを二重鎖から解く作用を有する。従って、GANP部分断片がMCMと結合すれば、当該GANP断片もプライマーゼ活性を発揮し、高親和性抗体の産生作用を有するものと考えられる。
そこで、GANP及びその部分断片、Map80及びMCM3の核／細胞質区画の局在を、cDNAトランスフェクションと細胞融合実験を用いて解析した。
得られたデータから、GANPはMCM3と結合することが示され、さらに、GANPの局在はMCM3の発現によって影響されることが示された。GANPはMap80の結合機序とは異なる結合機序によってMCM3と会合する。これらの結果は、MCM3に結合したGANPは、Map80/MCM3APの機能とは異なる独特の機能を介することを示す。 Association of GANP and MCM3, movement between nucleus / cytoplasm during cell cycle Overview In this example, the present inventor determined the MCM3-binding region of GANP by using a partially truncated mutant GANP, and the specificity of the 502nd amino acid for phosphorylated serine (pSer 502 ) in the GANP-specific region. A monoclonal antibody was used to characterize the localization of GANP in NIH-3T3 cells.
The binding between primase and MCM is one linked function, and the molecular complex in which both are bound has the action of releasing DNA from the duplex. Therefore, if the GANP partial fragment binds to MCM, it is considered that the GANP fragment also exhibits primase activity and has a high affinity antibody production action.
Therefore, the localization of GANP and its partial fragments, Map80 and MCM3 nuclear / cytoplasmic compartments were analyzed using cDNA transfection and cell fusion experiments.
The data obtained showed that GANP binds to MCM3, and further, the localization of GANP was affected by the expression of MCM3. GANP associates with MCM3 by a binding mechanism different from that of Map80. These results indicate that GANP bound to MCM3 is mediated by a unique function different from that of Map80 / MCM3AP.

２．材料および方法
2.1. 細胞および細胞培養
NIH-3T3、COS7、HelaおよびSwiss-3T3細胞を、10%熱不活化FCS（大日本製薬）、2 mM L-グルタミン(Biowhittaker)、100 μg/mlストレプトマイシン、100 U/mlペニシリン及び50 μM 2-メルカプトエタノールを補充したD-MEM培地(Invitrogen)中で、37℃で、5% CO2のもとで維持した（Takei, Y. et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 22177-22180、 Sakaguchi, N. et al., (1988) EMBO J. 7, 3457-3464、Kimura, H. et al., (1995) Nucl. Acids Res. 23, 2097-2104）。BAL17はRPMI-1640培地(Invitrogen)中で培養した。 2. Materials and methods
2.1. Cells and cell culture
NIH-3T3, COS7, Hela and Swiss-3T3 cells were treated with 10% heat-inactivated FCS (Dainippon Pharmaceutical), 2 mM L-glutamine (Biowhittaker), 100 μg / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin and 50 μM 2 -Maintained in D-MEM medium (Invitrogen) supplemented with mercaptoethanol at 37 ° C. under 5% CO 2 (Takei, Y. et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 22177-22180, Sakaguchi, N. et al., (1988) EMBO J. 7, 3457-3464, Kimura, H. et al., (1995) Nucl. Acids Res. 23, 2097-2104). BAL17 was cultured in RPMI-1640 medium (Invitrogen).

2.2. リン酸化GANPおよびMCM3の細胞内局在化
NIH-3T3をPBS (pH 7.4)中で3.7%パラホルムアルデヒドで5分間固定し、0.2% Triton X-100を用いて透過性とした（Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13, 4311-4320）。ラット抗pSer502 GANPモノクローナル抗体（Kuwahara, K. et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283）及びウサギ抗MCM3抗体Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13, 4311-4320を一次抗体として使用した。次に二次抗体として、GANPに対してはAlexa488結合ヤギ抗ラットIgG抗体(Molecular Probes)を使用し、MCM3に対してはAlexa546結合ヤギ抗ウサギIgG抗体(Molecular Probes)を使用して、ヨウ化TOTO-3 (Molecular Probes)で対比染色し、そして共焦点レーザー顕微鏡(FV500; オリンパス)によって観察した。 2.2. Intracellular localization of phosphorylated GANP and MCM3
NIH-3T3 was fixed in PBS (pH 7.4) with 3.7% paraformaldehyde for 5 minutes and permeabilized with 0.2% Triton X-100 (Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13 , 4311-4320). Rat anti-pSer 502 GANP monoclonal antibody (Kuwahara, K. et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283) and rabbit anti-MCM3 antibody Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13, 4311-4320 was used as the primary antibody. Next, as a secondary antibody, use an Alexa488-conjugated goat anti-rat IgG antibody (Molecular Probes) for GANP and an Alexa546-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (Molecular Probes) for MCM3. Counterstained with TOTO-3 (Molecular Probes) and observed with a confocal laser microscope (FV500; Olympus).

2.3. 発現のためのcDNA構築物
pSRα-MCM3-HAは文献に記載されている（Kimura, H. et al., (1995) Nucl. Acids Res. 23, 2097-2104）。SV40 T-Agの3つの核局在化シグナル(NLS)を担持するpECFP-NucベクターはClontechより購入した。下記の組み合わせの3'及び5'プライマーを用いて得たPCR断片をpGEX-4T-1 (Amersham)に導入し、それらを用いて異なる形のマウスganp cDNAをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として調製した。 2.3. CDNA constructs for expression
pSRα-MCM3-HA has been described in the literature (Kimura, H. et al., (1995) Nucl. Acids Res. 23, 2097-2104). The pECFP-Nuc vector carrying three nuclear localization signals (NLS) of SV40 T-Ag was purchased from Clontech. PCR fragments obtained using the following combinations of 3 ′ and 5 ′ primers were introduced into pGEX-4T-1 (Amersham), and they were used to convert different forms of mouse ganp cDNA with glutathione S-transferase (GST). Prepared as a fusion protein.

GANP1-5'：5'-GGGGATCCATACCCGG TGAACCCCTT-3' （配列番号１１）
GANP1-3'：5'-GGGTCGACGCGCACAGACTTTCCCCTGA-3' （配列番号１２）
GANP2-5'：5'-GGGAATTCTCCCGCCTTCCAGCTGTGAC-3' （配列番号１３）
GANP2-3'：5'-GGGTCGACGTGCTGCTGTGTTATGTCCT-3' （配列番号１４）
GANP3-5'：5'-GGGAATTCCATGAGCT GAGACCCTCAGC-3' （配列番号１５）
GANP3-3'：5'-GGGTCGACTGAGGATGCAGGAGGCGGCT -3' （配列番号１６）
GANP4-5'：5'-GGGAATTCTACGTTGGAGAGAGCCTGGC-3' （配列番号１７）
GANP4-3'：5'-GGGTCGACCATGCTGTCATCTCCTGTGA-3' （配列番号１８）
GANP5-5'：5'-GGGAATTCGAGAA CCTGGCCAAGGGTCT-3' （配列番号１９）
GANP5-3'：5'-GGGTCGACGAAAAACCGACGGCTGA ACT-3' （配列番号２０）
GANP6-5'：5'-GGGAATTCAAGCCCTTCCAGCCTGCCCT-3' （配列番号２１）
GANP6-3'：5'-GGGTCGACCGAGGGAACGTGGTATTTTC-3' （配列番号２２）
GANP7-5'：5'-GGCCCGGGCC CGTGGGATGACATCATCA-3' （配列番号２３）
GANP7-3'：5'-GGCTCGAGCATGTCCACCATCTC CAGCA-3' （配列番号２４） GANP1-5 ′: 5′-GGGGATCCATACCCGG TGAACCCCTT-3 ′ (SEQ ID NO: 11)
GANP1-3 ': 5'-GGGTCGACGCGCACAGACTTTCCCCTGA-3' (SEQ ID NO: 12)
GANP2-5 ′: 5′-GGGAATTCTCCCGCCTTCCAGCTGTGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 13)
GANP2-3 ': 5'-GGGTCGACGTGCTGCTGTGTTATGTCCT-3' (SEQ ID NO: 14)
GANP3-5 ′: 5′-GGGAATTCCATGAGCT GAGACCCTCAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 15)
GANP3-3 ': 5'-GGGTCGACTGAGGATGCAGGAGGCGGCT-3' (SEQ ID NO: 16)
GANP4-5 ': 5'-GGGAATTCTACGTTGGAGAGAGCCTGGC-3' (SEQ ID NO: 17)
GANP4-3 ': 5'-GGGTCGACCATGCTGTCATCTCCTGTGA-3' (SEQ ID NO: 18)
GANP5-5 ′: 5′-GGGAATTCGAGAA CCTGGCCAAGGGTCT-3 ′ (SEQ ID NO: 19)
GANP5-3 ': 5'-GGGTCGACGAAAAACCGACGGCTGA ACT-3' (SEQ ID NO: 20)
GANP6-5 ′: 5′-GGGAATTCAAGCCCTTCCAGCCTGCCCT-3 ′ (SEQ ID NO: 21)
GANP6-3 ': 5'-GGGTCGACCGAGGGAACGTGGTATTTTC-3' (SEQ ID NO: 22)
GANP7-5 ′: 5′-GGCCCGGGCC CGTGGGATGACATCATCA-3 ′ (SEQ ID NO: 23)
GANP7-3 ': 5'-GGCTCGAGCATGTCCACCATCTC CAGCA-3' (SEQ ID NO: 24)

cDNA構築物は、PCR断片をpSVEGFP pA に導入することにより緑色蛍光タンパク質(GFP)をタグしたGanp変異体として調製した（Kuwata, N. et al., (1999) J. Immunol. 163, 6355-6359）。次に、これらの構築物をpCXN2哺乳動物発現ベクター中に導入した（Niwa, H. et al., (1991) Gene 108, 193-200）。プライマー配列は、Ganpをコードするように下記の通り設計した。   The cDNA construct was prepared as a Ganp mutant tagged with green fluorescent protein (GFP) by introducing the PCR fragment into pSVEGFP pA (Kuwata, N. et al., (1999) J. Immunol. 163, 6355-6359). ). These constructs were then introduced into the pCXN2 mammalian expression vector (Niwa, H. et al., (1991) Gene 108, 193-200). The primer sequence was designed as follows to encode Ganp.

Gp-gfp-5'：
5'-GGGGATCCGAATTCCACCATGGCAGTCTTCAAACCGATA CC-3' （配列番号２５）
Gp-gfp-3'：
5'-GCAGGGGCTCCTCCTGATCT-3' （配列番号２６）
Gsac-gfp-5'：
5'-GGGGATC CGAATTCCACCATGTCCGAGGGCCTTGGTTCTTG-3' （配列番号２７）
Gsac-gfp-3'：
5'-CTGTCTT GTTTCTAAGCCGC-3' （配列番号２８）
Gmap80-gfp-5'：
5'-GGGGATCCGAATTCCACCATGGAGA ACCTGGCCAAGGGTCT-3' （配列番号２９）
Gmap80-gfp-3'：
5'-GAGGACTTGTAGATGTTTTCAC CATGG-3'（配列番号３０） Gp-gfp-5 ':
5'-GGGGATCCGAATTCCACCATGGCAGTCTTCAAACCGATA CC-3 '(SEQ ID NO: 25)
Gp-gfp-3 ':
5'-GCAGGGGCTCCTCCTGATCT-3 '(SEQ ID NO: 26)
Gsac-gfp-5 ':
5'-GGGGATC CGAATTCCACCATGTCCGAGGGCCTTGGTTCTTG-3 '(SEQ ID NO: 27)
Gsac-gfp-3 ':
5'-CTGTCTT GTTTCTAAGCCGC-3 '(SEQ ID NO: 28)
Gmap80-gfp-5 ':
5'-GGGGATCCGAATTCCACCATGGAGA ACCTGGCCAAGGGTCT-3 '(SEQ ID NO: 29)
Gmap80-gfp-3 ':
5'-GAGGACTTGTAGATGTTTTCAC CATGG-3 '(SEQ ID NO: 30)

FLAGをタグしたGanp変異体については、以下のプライマーを用いてPCRにより得たcDNA断片をpCXN2に導入した。：   For the Ganp mutant tagged with FLAG, a cDNA fragment obtained by PCR using the following primers was introduced into pCXN2. :

FLAG-Gp-5'：
5'-GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGG CAGTCTTCAA CCGATACC-3' （配列番号３１）
FLAG-Gp-3'：
5'-GGGAATTCCTCCGGGTCTCCCTCAAGTA-3' （配列番号３２）
FLAG-Gsac-5'：
5'-GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGTCCGAGGGCCTTGGTTCTTG-3' （配列番号３３）
FLAGGsac-3'：
5'-GGGAATTCGCTGTCTTGTTTCTAAGCCG-3' （配列番号３４）
FLAG-Gmap-5'：
5'-GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGG AGAACCTGGCCAAGGGTCT-3' （配列番号３５）
FLAG-Gmap-3'：
5'-GGGAATTCTGAGGACTTG TAGATGTTTT-3' （配列番号３６） FLAG-Gp-5 ':
5'-GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGG CAGTCTTCAA CCGATACC-3 '(SEQ ID NO: 31)
FLAG-Gp-3 ':
5'-GGGAATTCCTCCGGGTCTCCCTCAAGTA-3 '(SEQ ID NO: 32)
FLAG-Gsac-5 ':
5'-GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGTCCGAGGGCCTTGGTTCTTG-3 '(SEQ ID NO: 33)
FLAGGsac-3 ':
5'-GGGAATTCGCTGTCTTGTTTCTAAGCCG-3 '(SEQ ID NO: 34)
FLAG-Gmap-5 ':
5'-GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGG AGAACCTGGCCAAGGGTCT-3 '(SEQ ID NO: 35)
FLAG-Gmap-3 ':
5'-GGGAATTCTGAGGACTTG TAGATGTTTT-3 '(SEQ ID NO: 36)

内部欠失変異体GpΔNLS-GFP および I3変異体(MCMΔNLS-HA) は、文献に記述されているように調製した（Imai, Y. et al., (1991) Nucl. Acids Res. 19, 2785-2785）。全ての構築物は、ヌクレオチド配列の決定により配向が正しいこと、およびタグを付けた融合タンパク質としてコドンの読み枠が正しいことを確認し、品質を管理した。変異体RNA/DNAプライマーゼドメイン(PD) を有する発現ベクターは文献に記載されている(Ser502からAla [GpS502A]又はGlu [GpS502E]までのGp変異体)（Kuwahara, K. et al., (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283）。 Internal deletion mutants GpΔNLS-GFP and I3 mutant (MCMΔNLS-HA) were prepared as described in the literature (Imai, Y. et al., (1991) Nucl. Acids Res. 19, 2785- 2785). All constructs were controlled for quality by confirming that the orientation was correct by determining the nucleotide sequence and that the codon reading frame was correct as a tagged fusion protein. Expression vectors with mutant RNA / DNA primase domains (PD) have been described in the literature (Gp variants from Ser 502 to Ala [GpS502A] or Glu [GpS502E]) (Kuwahara, K. et al., (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283).

2.4. 導入した遺伝子産物の共焦点顕微鏡検査による検出
FuGENE 6 (Roche Diagnostics)を用いて、pCXN2-ganp-gfpおよび／またはpSRα-MCM3-HAによってNIH-3T3をトランスフェクトした。固定化の16時間前にレプトマイシンB (LMB;（Kudo, N. et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9112-9117）)を培養培地に添加した。共トランスフェクションの場合にはウサギ抗HA抗体 (Santa Cruz)およびAlexa546結合ヤギ抗ウサギIgG 抗体を用いて、そして単独トランスフェクションの場合には Alexa488結合ヤギ抗ウサギIgG 抗体 (Molecular Probes)を用いて、外因性MCM3タンパク質を染色した。核酸は、共トランスフェクション実験についてはヨウ化TOTO-3を用いて、単独トランスフェクション実験についてはヨウ化プロピジウム(PI; Sigma)を用いて対比染色した。 2.4. Detection of introduced gene products by confocal microscopy
NIH-3T3 was transfected with pCXN2-ganp-gfp and / or pSRα-MCM3-HA using FuGENE 6 (Roche Diagnostics). Leptomycin B (LMB; (Kudo, N. et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9112-9117)) was added to the culture medium 16 hours prior to immobilization. Use rabbit anti-HA antibody (Santa Cruz) and Alexa546-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody for co-transfection, and Alexa488-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (Molecular Probes) for single transfection, Exogenous MCM3 protein was stained. Nucleic acids were counterstained with TOTO-3 iodide for co-transfection experiments and propidium iodide (PI; Sigma) for single transfection experiments.

2.5. GSTプルダウンアッセイ
GST融合タンパク質を文献に記述されているように精製した（Kuwahara, K. et al., (2000) Blood 95, 2321-2328）。グルタチオン-Sepharoseビーズ(Amersham)に固定した種々のGST融合タンパク質(5 μg)を、TNEバッファー(10 mM Tris-HCl [pH 7.8]、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% Nonidet P-40、10 μgアプロチニン、1 mMフェニルメチル-スルフォニルフルオリド[PMSF])を用いて調製したBAL17溶解物と共にインキュベートした。結合タンパク質を8% SDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロースフィルターに転写し、ブロックした。次にウサギ抗マウスMCM3抗体（Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13, 4311-4320）及びペルオキシダーゼ標識プロテインA (Amersham)と共に連続的にインキュベートし、最後にECL検出キット(Amersham)を用いてシグナルを可視化した。直接結合アッセイのためには、 [35S-メチオニン] (Amersham)を用いて、in vitro転写および翻訳結合システム(Novagen)を製造者の説明書に従って使用して放射性標識化MCM3を合成し、[35S]-標識MCM3をオートラジオグラフィーで検出した。 2.5. GST pull-down assay
The GST fusion protein was purified as described in the literature (Kuwahara, K. et al., (2000) Blood 95, 2321-2328). Various GST fusion proteins (5 μg) immobilized on glutathione-Sepharose beads (Amersham) were mixed with TNE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.8], 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 10 Incubated with BAL17 lysate prepared with μg aprotinin, 1 mM phenylmethyl-sulfonyl fluoride [PMSF]). Bound proteins were separated by 8% SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose filters and blocked. It was then incubated sequentially with a rabbit anti-mouse MCM3 antibody (Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13, 4311-4320) and peroxidase labeled protein A (Amersham), and finally ECL detection kit (Amersham ) Was used to visualize the signal. For direct binding assays, [ 35 S-methionine] (Amersham) was used to synthesize radiolabeled MCM3 using the in vitro transcription and translation binding system (Novagen) according to the manufacturer's instructions, [ 35 S] -labeled MCM3 was detected by autoradiography.

2.6. 導入した遺伝子産物の免疫沈降およびウエスタンブロッティング
FuGENE 6を用いて、pCXN2-FLAG-ganpおよび／またはpSRα-MCM3-HAによってCOS7をトランスフェクトした。26時間後、TNEバッファーを用いて細胞を溶解し、得られた溶解物をプロテインA-Sepharose (Amersham)と組み合わせた抗HA抗体と共にインキュベートした。免疫沈降物を8% SDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロースフィルターに転写し、ブロットをブロックし、マウス抗FLAG M2抗体(Stratagene)と共にインキュベートし、次にペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体(Zymed) と共にインキュベートした。Gp-GFPおよびその変異体の検出のためには、ブロッティングしたフィルターをウサギ抗GFP抗体(Santa Cruz)およびペルオキシダーゼ結合プロテインA(Zymed)により釣り上げた。 2.6. Immunoprecipitation and Western blotting of introduced gene products
FuGENE 6 was used to transfect COS7 with pCXN2-FLAG-ganp and / or pSRα-MCM3-HA. After 26 hours, cells were lysed using TNE buffer and the resulting lysate was incubated with anti-HA antibody combined with protein A-Sepharose (Amersham). Immunoprecipitates were separated by 8% SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose filters, blots blocked, incubated with mouse anti-FLAG M2 antibody (Stratagene), and then peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG (H + L) Incubated with antibody (Zymed). For detection of Gp-GFP and its variants, blotted filters were picked up with rabbit anti-GFP antibody (Santa Cruz) and peroxidase-conjugated protein A (Zymed).

2.7. ヘテロカリオンアッセイ
FuGENE 6を用いて、pSRα-MCM3-HAによってHela細胞をトランスフェクトした。20時間後、トランスフェクトしたHeLa細胞およびトランスフェクトしていないマウスSwiss-3T3細胞をトリプシン処理し、1：1の比で共に培養皿に播いた。24時間後、ポリエチレングリコール1500 (Roche diagnostics)を室温で2分間用いて細胞を融合させた（Schmidt-Zachmann, M.S. et al., (1993) Cell 74, 493-504）。培養皿を培地で4回洗浄した後、シクロヘキシミド含有培地を添加し（最終濃度20 μg/ml）、細胞をCO2インキュベーター中で 37℃で5時間インキュベートした。次に、250 mM HEPES-NaOH (pH 7.4)中で4%パラホルムアルデヒドを用いて細胞を20分間固定し、PBS中で0.5% Triton X-100を30分間用いて透過性とし、PBSで洗浄した。抗HA抗体(12CA5; Covence Research Products)およびCy3結合ロバ抗マウスIg抗体(Jackson)を用いて細胞を染色した。また、PBS中で100 ng/ml Hoechst 33342 (Sigma)を用いてDNAを20分間対比染色した。100x PlanNeofluar 位相差対物レンズ (NA 1.3) およびSpotII CCDを備えたZeiss Axioplanを用いて画像を集めた。 2.7. Heterokaryon assay
FuGENE 6 was used to transfect Hela cells with pSRα-MCM3-HA. After 20 hours, transfected HeLa cells and non-transfected mouse Swiss-3T3 cells were trypsinized and seeded together in a culture dish at a 1: 1 ratio. After 24 hours, cells were fused using polyethylene glycol 1500 (Roche diagnostics) for 2 minutes at room temperature (Schmidt-Zachmann, MS et al., (1993) Cell 74, 493-504). After washing the culture dish 4 times with medium, cycloheximide-containing medium was added (final concentration 20 μg / ml) and the cells were incubated for 5 hours at 37 ° C. in a CO 2 incubator. The cells were then fixed with 4% paraformaldehyde in 250 mM HEPES-NaOH (pH 7.4) for 20 minutes, permeabilized with 0.5% Triton X-100 in PBS for 30 minutes and washed with PBS. . Cells were stained with anti-HA antibody (12CA5; Covence Research Products) and Cy3-conjugated donkey anti-mouse Ig antibody (Jackson). In addition, DNA was counterstained with 100 ng / ml Hoechst 33342 (Sigma) in PBS for 20 minutes. Images were collected using a Zeiss Axioplan equipped with a 100x PlanNeofluar phase contrast objective (NA 1.3) and SpotII CCD.

３．結果および考察
3.1. GANPとMCM3の会合
これまでに、B細胞系統におけるGANPとMCM3の相互作用が、共免疫沈降によって実証されている（Kuwahara, K. et al., (2000) Blood 95, 2321-2328）。GANPのC末端領域は全Map80タンパク質と同一であるため、GANPは同一領域でMCM3と会合すると予想される。本発明者は、どの領域がMCM3と直接会合するのかを決定するため、図32に示す種々の末端切断型GANPを有するGST融合タンパク質を用いてプルダウンアッセイを実施した。GSTを図32に示される1から7及び5-7'と称した切断型GANPのN末端に融合した。図33の下のパネルにおいて、GANP5-7'と称するMap80領域は、以前に示されたように（Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13, 4311-4320）、細胞抽出物からMCM3をプルダウンした。
驚くべきことに、GANPの部分断片であるGANP1およびGANP2もまたMCM3をプルダウンした（図33；上および下パネル）。 3. Results and Discussion
3.1. Association of GANP and MCM3 So far, the interaction of GANP and MCM3 in B cell lines has been demonstrated by coimmunoprecipitation (Kuwahara, K. et al., (2000) Blood 95, 2321-2328) . Since the C-terminal region of GANP is identical to all Map80 proteins, GANP is expected to associate with MCM3 in the same region. In order to determine which region is directly associated with MCM3, the inventor performed a pull-down assay using GST fusion proteins having various truncated GANPs as shown in FIG. GST was fused to the N-terminus of truncated GANP designated 1-7 and 5-7 ′ shown in FIG. In the lower panel of FIG. 33, the Map80 region, designated GANP5-7 ′, is the cell extract as previously shown (Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13, 4311-4320). Pulled down MCM3.
Surprisingly, the GANP partial fragments GANP1 and GANP2 also pulled down MCM3 (FIG. 33; upper and lower panels).

次に、網状赤血球溶解物系により、in vitroで合成したMCM3を用いてこの結合を調べた（図34）。GST-GANP1 およびGST-GANP2 もまたin vitro翻訳カクテルから[35S]-MCM3 をプルダウンした。
GST単独を用いた陰性対照（最初のレーン）、又は、無関係なタンパク質と融合したGSTは、シグナルを示さなかった。そして、GST-GANP1との結合はMap80 領域 (GST-GANP5-7')との結合よりも強かった。この結合は、FLAGをタグした構築物を用いたDNAトランスフェクション実験により細胞においても確認された（図35）。
COS7細胞をpSRα-MCM3-HA又はpSRa-I3-HAと組み合わせて、pCXN2-FLAG-Ganp、pCXN2-FLAG-Gp及びpCXN2-FLAG-Gmap80によって共トランスフェクトした。抗HA抗体を用いた免疫沈降の後、抗FLAGモノクローナル抗体でウエスタンブロットを行った。FLAG標識タンパク質の予想サイズを、それぞれのレーンにおいて三角で示す。左及び右のパネルは、バンドの移動度（migration）が同様であるが、ECL検出の露光時間は左のパネルが１分、及び右のパネルは３分である（図35）。 Next, this binding was examined using MCM3 synthesized in vitro in a reticulocyte lysate system (FIG. 34). GST-GANP1 and GST-GANP2 also pulled down [ 35 S] -MCM3 from the in vitro translation cocktail.
Negative controls using GST alone (first lane) or GST fused to an irrelevant protein showed no signal. And the binding with GST-GANP1 was stronger than the binding with Map80 region (GST-GANP5-7 '). This binding was also confirmed in cells by DNA transfection experiments using a FLAG-tagged construct (FIG. 35).
COS7 cells were cotransfected with pCXN2-FLAG-Ganp, pCXN2-FLAG-Gp and pCXN2-FLAG-Gmap80 in combination with pSRα-MCM3-HA or pSRa-I3-HA. After immunoprecipitation using an anti-HA antibody, Western blotting was performed using an anti-FLAG monoclonal antibody. The expected size of the FLAG-labeled protein is indicated by a triangle in each lane. The left and right panels have similar band migration, but the exposure time for ECL detection is 1 minute for the left panel and 3 minutes for the right panel (FIG. 35).

FLAG-Ganp、FLAG-Gp およびFLAG-Gmap80は野生型MCM3-HA (HAエピトープをタグしたMCM3)と結合した（図35; 左パネル）。FLAG-Gsac のみが結合しなかった。I3 変異体MCM3 (MCM3△NLS)との結合に関しては、FLAG-Gmap80 のみが陽性の結果を示した（図35;右パネル）。N末端NLSを担持するGp領域は、大量のMCM3を有する細胞において一貫してMCM3と会合している（図35；左パネル）。これらの結果は、GANPがGp領域を介してMCM3のNLS領域と会合していることを示している。   FLAG-Ganp, FLAG-Gp and FLAG-Gmap80 bound to wild type MCM3-HA (MCM3 tagged with HA epitope) (FIG. 35; left panel). Only FLAG-Gsac did not bind. Regarding binding to the I3 mutant MCM3 (MCM3ΔNLS), only FLAG-Gmap80 showed a positive result (FIG. 35; right panel). The Gp region carrying the N-terminal NLS is consistently associated with MCM3 in cells with large amounts of MCM3 (Figure 35; left panel). These results indicate that GANP is associated with the NLS region of MCM3 via the Gp region.

本発明者はさらに、Gp領域のSer502のリン酸化の状態がMCM3との結合に影響するかどうかを検討した。プライマーゼ部位を欠損したGanp変異体(Ganp△PD-GFP)、及びGanpS502A又はGanpS502Eとして調製されるSer502におけるGanp変異体を、GFPと融合した（図36A）。細胞をpCXN2-Ganp-gfpとpSRα-MCM3-HAによって共トランスフェクトし、溶解液は抗HA抗体を用いた免疫沈降に用いた。
GFPシグナルは抗GFP抗体で検出され（図36B;上パネル）、このことは、GANPがMCMに結合したことを意味する。
Ganp-GFP変異体との共トランスフェクションも同様に行った。それぞれのタンパク質の予想位置を決定するために、溶解液をSDS-PAGE上で分離し、同じように抗GFP抗体でブロットした（図36B;下パネル）。 The present inventors further examined whether the phosphorylation state of Ser 502 in the Gp region affects the binding to MCM3. The Ganp mutant lacking the primase site (GanpΔPD-GFP) and the Ganp mutant in Ser 502 prepared as GanpS502A or GanpS502E were fused with GFP (FIG. 36A). Cells were co-transfected with pCXN2-Ganp-gfp and pSRα-MCM3-HA and the lysate was used for immunoprecipitation with anti-HA antibody.
The GFP signal was detected with anti-GFP antibody (Figure 36B; upper panel), which means that GANP bound to MCM.
Co-transfection with Ganp-GFP mutant was performed in the same manner. To determine the expected position of each protein, lysates were separated on SDS-PAGE and similarly blotted with anti-GFP antibody (Figure 36B; lower panel).

非リン酸化性の変異体(GanpS502A-GFP)は、野生型Ganp-GFPまたはホスホセリンに良く似た変異体(GanpS502E-GFP)と同じくMCM3と結合した(図36B; 上パネル)。興味深いことに、Ganp△PD-GFP はMCM3-HAと共沈降しない (図36B; 上パネル)。
GANP分子全体としては、Map80領域の潜在的結合活性に関わりなく、MCM3との結合にはRNAプライマーゼ領域 (PD)が必要である。白抜き三角はGanp△PD-GFPの位置を示す。Ganp S502A-GFP およびGanp S502E-GFPのサイズと等しいGanp-GFPのサイズを黒三角で示す(図36B;下パネル)。これらの結果は、GANPのMCM3との結合はそのPD領域を介するが、Ser502 部位におけるリン酸化はこの結合に影響しないことを示している。 A non-phosphorylated mutant (GanpS502A-GFP) bound to MCM3 as well as a wild-type Ganp-GFP or a mutant similar to phosphoserine (GanpS502E-GFP) (FIG. 36B; upper panel). Interestingly, GanpΔPD-GFP does not co-precipitate with MCM3-HA (FIG. 36B; upper panel).
As a whole GANP molecule, the RNA primase region (PD) is required for binding to MCM3 regardless of the potential binding activity of the Map80 region. Open triangles indicate the position of GanpΔPD-GFP. The size of Ganp-GFP equal to that of Ganp S502A-GFP and Ganp S502E-GFP is indicated by black triangles (FIG. 36B; lower panel). These results indicate that GANP binding to MCM3 is through its PD region, but phosphorylation at the Ser 502 site does not affect this binding.

末端切断型構築物を用いた実験によってGANPとMCM3との会合が広い領域にわたって示されたが、GANPのN末端の600個のアミノ酸領域が関与する全GANPとの結合にはMCM3のNLSが必要とされる。NLSを欠くMCM3変異体は、細胞中で全GANP分子と効果的に会合できなかった。Map80領域はNLS陰性MCM3と結合し、このことはGANPのMCM3との結合が主としてMap80との相互作用に必要とされる領域以外との結合であることを示している。Map80はMCM3インポート因子であると考えられているが、GANPはMCM3と共同して異なる役割を果たすのかもしれない。GANPは可能性のあるリン酸化部位を多数有し、そして細胞中に多くの会合成分をもつように思われる（Kuwahara, K. et al., (2000) Blood 95, 2321-2328）。したがって、その領域のリン酸化の状態がGANP/MCM3会合および細胞質と核コンパートメント間の輸送の調節に影響を及ぼす領域を特定することが必要であろう。   Experiments with truncated constructs showed a wide range of associations between GANP and MCM3, but NCM of MCM3 is required for binding to all GANPs involving the N-terminal 600 amino acid region of GANP. Is done. MCM3 mutants lacking NLS failed to effectively associate with all GANP molecules in cells. The Map80 region binds to NLS-negative MCM3, indicating that the GANP binding to MCM3 is mainly binding to a region other than the region required for interaction with Map80. Although Map80 is thought to be an MCM3 import factor, GANP may play a different role in conjunction with MCM3. GANP has many potential phosphorylation sites and appears to have many associated components in the cell (Kuwahara, K. et al., (2000) Blood 95, 2321-2328). Therefore, it may be necessary to identify regions where the phosphorylation status of that region affects the regulation of GANP / MCM3 association and transport between the cytoplasm and the nuclear compartment.

3.2. トランスフェクションによって示されるMap80およびGanp変異体の細胞内局在化
GANPは2つの可能性のあるNLSを有する。1つはN末端プライマーゼ領域内にあり、もう１つはC末端Map80領域内にある。また、GANPは2つの核輸出シグナル(NES)様モチーフを有する。1つはSAC3相同領域とMap80領域との間にあり、もう1つはMap80領域内にある。
NIH-3T3細胞をpCXN2-Ganp-gfp又はpCXN2-Gmap80-gfpによってトランスフェクトし、48時間後に固定した。LMBを、固定の16時間前に添加した。核をPIで前染色し、共焦点顕微鏡を用いて画像を集積した。代表的な発現特性を図37に示す。異なる特性を持つ細胞数を計数し、パーセントとして表した（図37）。 3.2. Intracellular localization of Map80 and Ganp mutants shown by transfection
GANP has two possible NLS. One is in the N-terminal primase region and the other is in the C-terminal Map80 region. GANP also has two nuclear export signal (NES) -like motifs. One is between the SAC3 homology region and the Map80 region, and the other is in the Map80 region.
NIH-3T3 cells were transfected with pCXN2-Ganp-gfp or pCXN2-Gmap80-gfp and fixed 48 hours later. LMB was added 16 hours prior to fixation. Nuclei were prestained with PI and images were collected using a confocal microscope. Representative expression characteristics are shown in FIG. The number of cells with different characteristics was counted and expressed as a percentage (Figure 37).

Ganp-GFP（GFPでタグしたほぼ全長GANP）は、核優性発現(NおよびN>C; 38%)又は細胞質優性発現(CおよびC>N; 31%)を示す細胞の割合に変動はあったが（合計500個の細胞から任意に計算された数の％）、細胞質および核コンパートメントの両方に存在することが見いだされた (図37; Ganp-GFP, LMB -)。対照的に、Gmap80-GFP は殆ど細胞質に見出され、発明者の分類による核優性発現は示さなかった (N>C, 0%; N=C, 35%; C and C>N, 65%)(図37; Gmap80-GFP, LMB -)。Ganp-GFPの局在化は、Gmap80-GFPの局在化とは異なる。
N末端NLSモチーフが機能性であるかどうかを確かめるため、RNA/DNAプライマーゼドメインおよびN末端NLSを担持する (ただしNES様モチーフは含まない) 5' 1-kb DNA 断片をGFPと融合させた (図38, Gp-GFP)。この Gp-GFP 産物は 核にのみ存在したが (NおよびN>C, 94%)(図38)、NLSを欠く変異体Gp-GFP (Gp△NLS-GFP; 図38に示すようにアミノ酸497から500が欠失している)は細胞質性であることを示し、N末端NLSが核局在化に関与していることが確認された。 Ganp-GFP (nearly full-length GANP tagged with GFP) showed a variation in the percentage of cells with nuclear dominant expression (N and N>C; 38%) or cytoplasmic dominant expression (C and C>N; 31%). However, it was found to be present in both cytoplasmic and nuclear compartments (% of the number arbitrarily calculated from a total of 500 cells) (Figure 37; Ganp-GFP, LMB-). In contrast, Gmap80-GFP was found mostly in the cytoplasm and did not show nuclear dominant expression by the inventors' classification (N> C, 0%; N = C, 35%; C and C> N, 65% (FIG. 37; Gmap80-GFP, LMB-). The localization of Ganp-GFP is different from that of Gmap80-GFP.
To ascertain whether the N-terminal NLS motif is functional, a 5 '1-kb DNA fragment carrying the RNA / DNA primase domain and N-terminal NLS (but not including the NES-like motif) was fused to GFP. (FIG. 38, Gp-GFP). This Gp-GFP product was present only in the nucleus (N and N> C, 94%) (Figure 38), but mutant Gp-GFP lacking NLS (Gp △ NLS-GFP; amino acid 497 as shown in Figure 38) (From 500 to 500) is cytoplasmic, confirming that the N-terminal NLS is involved in nuclear localization.

本発明者は、隣接するSer502 のアラニンへの突然変異(GpS502A-GFP; 非リン酸化型) 又はグルタミン酸への突然変異(GpS502E-GFP; ホスホセリンを模倣する型)がこの局在化に影響を及ぼすかどうかを検討した（図38）。そして、本発明者は、これらの突然変異がGpの局在化を変えないことを観察した。これは、N末端NLSがSer502 のリン酸化状態に関わりなく機能性であることを示唆している（図38）。対照的に、N末端NLSもC末端NLSも持たないGac-GFPは、殆どが細胞質中に存在するように思われる(N及びN>C, 0%; N=C, 3%; C及びC>N, 97%)(図38)。
これらの結果は、N末端NLSがGanpの核への移入に機能的な役割を有することを示唆している。しかし、NLSはGANP発現を核内に維持するほど強くはないのかもしれない。なぜなら、Ganp-GFPは細胞質中にも存在するからである（図37）。この問題をさらに検討するため、Crm1によって媒介される核への輸出を抑制するため、cDNAトランスフェクション後、細胞をレプトマイシンB (LMB)で処理した（Kudo, N. et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9112-9117）。 The inventor found that the mutation of adjacent Ser 502 to alanine (GpS502A-GFP; non-phosphorylated) or glutamate (GpS502E-GFP; a form that mimics phosphoserine) affects this localization. We examined whether or not it would affect (Figure 38). The inventor then observed that these mutations did not alter the localization of Gp. This suggests that the N-terminal NLS is functional regardless of the phosphorylation state of Ser 502 (FIG. 38). In contrast, Gac-GFP without N-terminal or C-terminal NLS appears to be mostly present in the cytoplasm (N and N> C, 0%; N = C, 3%; C and C > N, 97%) (Figure 38).
These results suggest that the N-terminal NLS has a functional role in the transfer of Ganp to the nucleus. However, NLS may not be strong enough to maintain GANP expression in the nucleus. This is because Ganp-GFP is also present in the cytoplasm (FIG. 37). To further investigate this issue, cells were treated with leptomycin B (LMB) after cDNA transfection to suppress crm1-mediated export to the nucleus (Kudo, N. et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9112-9117).

LMBで処理した細胞では、殆どのトランスフェクタントにおいてGanp-GFPは核に局在化した（図37）。優性な細胞質発現を示す細胞画分は31%から4% に減少し、対照的に、核において優性な発現を示す細胞が38%から81%に増大した。従って、Ganpの細胞質への移行はLMBによって抑制されるように思われる。
Gmap80-GFPの局在化もまたLMB処理後、劇的に変化した(図37)。すなわち、細胞質発現を示す細胞画分が65%から37%に減少し、優性な核発現を示す細胞画分が0%から41% に増大した。これらの所見は、COS7およびLtk- 細胞を含む他の細胞系においても再現され、核から細胞質へのGANP輸出がCrm1依存性経路によって調節されていることを示している。従って、GANP及びMap80は核と細胞質の間をシャトリング（往復）しているように思われ、そしてそれらの局在化は他の分子と共同している核移入および輸出機構の間のバランスに依存するようである。 In cells treated with LMB, Ganp-GFP localized to the nucleus in most transfectants (FIG. 37). The fraction of cells that showed dominant cytoplasmic expression decreased from 31% to 4%, in contrast, the cells that showed dominant expression in the nucleus increased from 38% to 81%. Thus, Ganp translocation into the cytoplasm appears to be suppressed by LMB.
The localization of Gmap80-GFP also changed dramatically after LMB treatment (Figure 37). That is, the cell fraction showing cytoplasmic expression decreased from 65% to 37%, and the cell fraction showing dominant nuclear expression increased from 0% to 41%. These findings are replicated in other cell lines including COS7 and Ltk - cells, indicating that GANP export from the nucleus to the cytoplasm is regulated by a Crm1-dependent pathway. Thus, GANP and Map80 appear to shuttle between the nucleus and the cytoplasm, and their localization balances between the nuclear import and export mechanisms that are cooperating with other molecules. It seems to depend.

3.3. 共トランスフェクトした細胞におけるMCM3およびGANPの局在化
次に、本発明者はGANPの移行がMCM3発現と関連しているかどうかを検討した。哺乳動物のMCM3は、細胞周期中にクロマチンとの結合状態を変化させるが、間期の間を通して核にのみ存在する（Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13, 4311-4320）。NIH-3T3細胞を、pSRα-MCM3-HA又はpSRα-I3-HAによってトランスフェクトし、固定し、抗HA抗体(Alexa488)で免疫標識し、PIで染色した。
トランスフェクトしたMCM3-HAは、典型的なNLSの存在と合致して（Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13, 4311-4320、Takei, Y. et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 22177-22180）、核に局在化した（図39）。この核局在化はMCM3のNLSに依存した。なぜなら、このNLSを欠く変異体MCM3 (I3; MCM3△NLS-HA)は、細胞質にのみ発現されたからである (図39; 右パネル)。 3.3. Localization of MCM3 and GANP in co-transfected cells Next, the inventor examined whether GANP translocation was associated with MCM3 expression. Mammalian MCM3 changes chromatin binding during the cell cycle but is only present in the nucleus throughout the interphase (Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13, 4311-4320 ). NIH-3T3 cells were transfected with pSRα-MCM3-HA or pSRα-I3-HA, fixed, immunolabeled with anti-HA antibody (Alexa488) and stained with PI.
Transfected MCM3-HA is consistent with the presence of typical NLS (Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13, 4311-4320, Takei, Y. et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 22177-22180), localized in the nucleus (FIG. 39). This nuclear localization was dependent on the NLS of MCM3. This is because the mutant MCM3 lacking NLS (I3; MCM3ΔNLS-HA) was expressed only in the cytoplasm (FIG. 39; right panel).

細胞を、pCXN2-Ganp-gfp又はpCXN2-Gmap80-gfp及びpSRα-MCM3-HAによって共トランスフェクトし、固定し、抗HA抗体(Alexa546)で免疫標識し、核をTOTO-3で前染色した（図40）。細胞数はパネルの下に示す（図40）。
興味深いことに、Ganp-GFP を用いて共トランスフェクションした場合、細胞の17%においてMCM3の細胞質局在化がもたらされた(図40, 白い矢印で示す)。Gmap80-GFPまたはGp-GFPを用いた共トランスフェクションの場合には、そのような結果はみられなかった。
MCM3へのGanpの効果が特異的であることを証明するために、核において出現するECFP-Nucの発現を、異なるganp-gfp構築物のトランスフェクション前後で調べた。Ganp-GFPでトランスフェクトした代表画像を示す（図41）。ECFP-Nucの核への局在化は、Ganp-GFP (図41)又はGmap80-GFP又はGp-GFPを用いた共トランスフェクションのいずれによっても影響されなかった。 Cells were co-transfected with pCXN2-Ganp-gfp or pCXN2-Gmap80-gfp and pSRα-MCM3-HA, fixed, immunolabeled with anti-HA antibody (Alexa546), and nuclei prestained with TOTO-3 ( (Figure 40). Cell numbers are shown below the panel (Figure 40).
Interestingly, cotransfecting with Ganp-GFP resulted in cytoplasmic localization of MCM3 in 17% of the cells (Figure 40, indicated by white arrows). No such result was seen with co-transfection with Gmap80-GFP or Gp-GFP.
To prove that the effect of Ganp on MCM3 is specific, the expression of ECFP-Nuc appearing in the nucleus was examined before and after transfection of different ganp-gfp constructs. A representative image transfected with Ganp-GFP is shown (FIG. 41). ECFP-Nuc localization to the nucleus was not affected by either Ganp-GFP (FIG. 41) or co-transfection with Gmap80-GFP or Gp-GFP.

Ganp及びMCM3の共発現もまたGANP局在化の変更をもたらした。Ganp-GFP 単独(38%)及びGmap80-GFP単独(0%)のトランスフェクション（図37）と比較して、MCM3を用いた共トランスフェクションはGanp-GFP (74%)およびGmap80-GFP (64%) の核発現レベルを増大させた（図40）。MCM3は、GANPおよびMap80を核内に保持したが、Ganpの過剰発現のみがMCM3 の細胞質における出現を促進した（図40； Ganp-GFP発現によって17%）。他方、Gmap80 MCM3 の細胞質における出現を促進しなかった(Gmap80-GFP発現によって4%)。MCM3のNLSにおける突然変異(I3; MCM3△NLS-HA) （その結果、MCM3は細胞質に存在することになる）は、Ganp-GFPまたはGmap80-GFP の核への蓄積を引き起こさなかった(図42)。
野生型MCM3とは異なり、I3 変異体 (MCM3△NLS-HA) はGanp又はGpと会合しない(図35)という事実を考え合わせるならば、MCM3のNLSモチーフは、細胞においてGANPとの機能的会合および核と細胞質間のGANPの輸送に必要であることが示唆される。 Co-expression of Ganp and MCM3 also resulted in altered GANP localization. Compared to transfection with Ganp-GFP alone (38%) and Gmap80-GFP alone (0%) (Figure 37), co-transfection with MCM3 was performed using Ganp-GFP (74%) and Gmap80-GFP (64 %) Increased nuclear expression levels (FIG. 40). MCM3 retained GANP and Map80 in the nucleus, but only Ganp overexpression promoted the appearance of MCM3 in the cytoplasm (Figure 40; 17% with Ganp-GFP expression). On the other hand, it did not promote the appearance of Gmap80 MCM3 in the cytoplasm (4% by Gmap80-GFP expression). Mutations in the NLS of MCM3 (I3; MCM3 △ NLS-HA) (resulting in MCM3 being present in the cytoplasm) did not cause accumulation of Ganp-GFP or Gmap80-GFP in the nucleus (Figure 42). ).
Unlike the wild-type MCM3, considering the fact that the I3 mutant (MCM3 △ NLS-HA) does not associate with Ganp or Gp (Figure 35), the NCM motif of MCM3 is functionally associated with GANP in the cell. It is suggested that it is necessary for the transport of GANP between the nucleus and the cytoplasm.

DNAトランスフェクション実験は、MCM3と共に導入された場合、Ganp-GFPが核コンパートメントに蓄積することを示し、核におけるGANP/MCM3複合体の形成を示唆した。MCM3 はCrm1によって認識されうる明らかな共通NES様モチーフを含まず、したがって核からのMCM3の輸出は、恐らく、NES様モチーフを有する他の結合分子または異なる輸出機構に依存するのであろう。GANP上の2つのNES様モチーフは、LMB感受性Crm1依存性輸出経路に関与しているように思われる（図37）。GANPによって担持される2つのNES様モチーフ（これらはCrm1によって認識されるのかもしれない）は、複合体の輸送に関与している可能性がある。
最近、GANP相同領域を担持する酵母SAC3が、あるタンパク質の核輸出に関与し、そして核膜孔複合体の成分と会合することが示された（Jones, A.L. et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3224-3229）。GANPとの共発現は、MCM3の細胞質コンパートメントへの局在化を変化させた。 DNA transfection experiments showed that Ganp-GFP accumulates in the nuclear compartment when introduced with MCM3, suggesting the formation of GANP / MCM3 complex in the nucleus. MCM3 does not contain an apparent common NES-like motif that can be recognized by Crm1, so export of MCM3 from the nucleus probably depends on other binding molecules that have the NES-like motif or different export mechanisms. Two NES-like motifs on GANP appear to be involved in the LMB-sensitive Crm1-dependent export pathway (Figure 37). Two NES-like motifs carried by GANP, which may be recognized by Crm1, may be involved in the transport of the complex.
Recently, yeast SAC3 carrying the GANP homology region has been shown to be involved in nuclear export of certain proteins and to associate with components of the nuclear pore complex (Jones, AL et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3224-3229). Co-expression with GANP altered the localization of MCM3 to the cytoplasmic compartment.

細胞融合技法を用いて、MCM3の核-細胞質間シャトリング(往復)を調べた（Schmidt-Zachmann, M.S. et al., (1993) Cell 74, 493-504）。HeLa細胞を最初MCM3-HAでトランスフェクトし、次にトランスフェクトしていないマウスSwiss-3T3細胞と融合させた。タンパク質合成を抑制するためシクロヘキシミドの存在下で5時間インキュベートした後、細胞を固定し、MCM3-HA を免疫標識した。ヘキスト(Hoechst)染色によってヘテロカリオンを調べた。この染色は、「まだらの」ヘテロクロマチンを有するマウスの核（矢印）をヒトHeLa核と区別する。
図43に代表的なものを示すように、MCM3-HA はヘテロカリオン中にヒトおよびマウスの核の両方に見出された。融合されていないマウスの細胞は、そのような染色を示さない。このことは、MCM3-HAがHeLa核から細胞質へ輸出され、次にマウス核に移入されたことを示している。 Cell fusion techniques were used to investigate the nuclear-cytoplasmic shuttling of MCM3 (Schmidt-Zachmann, MS et al., (1993) Cell 74, 493-504). HeLa cells were first transfected with MCM3-HA and then fused with untransfected mouse Swiss-3T3 cells. After 5 hours of incubation in the presence of cycloheximide to suppress protein synthesis, the cells were fixed and immunolabeled with MCM3-HA. Heterokaryons were examined by Hoechst staining. This staining distinguishes mouse nuclei (arrows) with “mottled” heterochromatin from human HeLa nuclei.
As shown representative in FIG. 43, MCM3-HA was found in both human and mouse nuclei in heterokaryons. Unfused mouse cells do not show such staining. This indicates that MCM3-HA was exported from the HeLa nucleus to the cytoplasm and then transferred to the mouse nucleus.

これらの結果から、MCM3-HAはシャトリングタンパク質であると結論される。なお、トランスジーン産物と同じような感度で内因性タンパク質の核から細胞質への移行を実証することはしばしば困難である（Kimura, H., Ohtomo, T.et al., (1996) Genes Cells 1, 977-993、Mizuno, T. et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 7886-7896）。本実施例に示す結果についても、そうであった。酵母のようなより原始的な細胞で達成されたとの同じような感度で、哺乳動物細胞における内因性MCMタンパク質の核から細胞質への移行を実証することもまた困難である。
しかしながら、本発明者の結果は、（実験はDNAトランスフェクション法によって行ったが）未操作細胞においてMCMタンパク質の核-細胞質間シャトリングが恐らく重要であることを示している。細胞周期の進行中におけるMCM複合体の核-細胞質間移動の明確な理解を容易にするには、さらなる成分の発見が必要であるかもしれない。 From these results, it is concluded that MCM3-HA is a shuttling protein. It is often difficult to demonstrate the transfer of endogenous protein from the nucleus to the cytoplasm with the same sensitivity as the transgene product (Kimura, H., Ohtomo, T. et al., (1996) Genes Cells 1 977-993, Mizuno, T. et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 7886-7896). The same was true for the results shown in this example. It is also difficult to demonstrate the translocation of endogenous MCM protein from the nucleus to the cytoplasm in mammalian cells with the same sensitivity as achieved with more primitive cells such as yeast.
However, the inventor's results indicate that nuclear-cytoplasmic shuttling of MCM protein is probably important in unengineered cells (although experiments were performed by DNA transfection). To facilitate a clear understanding of the nuclear-cytoplasmic movement of the MCM complex during cell cycle progression, additional components may need to be discovered.

3.4. 細胞周期の間のGANPの局在化
RNA/DNA プライマーゼドメインのGANPに特有のエピトープ(pSer502 GANP)に特異的なモノクローナル抗体を用いて、共焦点レーザー顕微鏡検査によってNIH-3T3細胞におけるGANPの局在化を調べた（Kuwahara, K. et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283）。細胞周期の異なる時期にあるNIH-3T3細胞を、抗pSer502 GANP (Alexa488; 緑)及び抗MCM3 (Alexa546; 赤)抗体で免疫染色した。核をTOTO-3ヨウ化物（青）で前染色した。間期の間、上記モノクローナル抗体は核小体を除く核内のすべてで反応した（図44）。
抗MCM3抗体および核酸を染色するTOTO-3を用いた三重標識によって、有糸***の間のGANPの局在化を詳しく分析した。細胞が前中期から中期へ進むにつれ、GANPは濃縮クロマチンから解離されてくるように思われる（図44）。重ね合わせた画像の黄色いシグナルはGANPとMCM3との共局在化を示すが、若干の青い染色は前中期画像の中心部でGANPが単独でも見えることを表している。この段階では、GANP及びMCM3は濃縮された染色体と重なり合っていない。中期の細胞においては、GANPは紡錘体領域に検出される。そしてこのシグナルは後期に染色体が2つの娘細胞に分離する間に減少する。 3.4. Localization of GANP during the cell cycle
The localization of GANP in NIH-3T3 cells was examined by confocal laser microscopy using a monoclonal antibody specific for the epitope specific to GANP in the RNA / DNA primase domain (pSer 502 GANP) (Kuwahara, K et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283). NIH-3T3 cells at different times in the cell cycle were immunostained with anti-pSer 502 GANP (Alexa488; green) and anti-MCM3 (Alexa546; red) antibodies. Nuclei were prestained with TOTO-3 iodide (blue). During the interphase, the monoclonal antibody reacted in all nuclei except the nucleolus (FIG. 44).
The localization of GANP during mitosis was analyzed in detail by triple labeling with anti-MCM3 antibody and TOTO-3 staining nucleic acid. GANP appears to be dissociated from the concentrated chromatin as the cells progress from pre-metaphase to metaphase (FIG. 44). The yellow signal in the superimposed image indicates co-localization of GANP and MCM3, but some blue staining indicates that GANP alone can be seen in the center of the pre-metaphase image. At this stage, GANP and MCM3 do not overlap with the enriched chromosome. In metaphase cells, GANP is detected in the spindle region. This signal then decreases while the chromosome segregates into two daughter cells.

減数***後期においては、GANPの殆どは核が形成されるまで（終期）、細胞質コンパートメントに見出される。これらの結果は、GANPおよびMCM3の挙動が類似していて、これら2つは間期の間を通じて殆ど核に共局在化することを示している。このことは、これら2つの相互会合と一致している。しかし、有糸***の間に共焦点顕微鏡検査によって示されたように、GANPおよびMCM3は別々に存在することもできる（図44）。
第2型のRNA/DNAプライマーゼに関する核-細胞質間のGANPシャトリングの生物学的意味は、今後の解明を待たなければならない。それはDNA修復の最終段階におけるRNAプライマーの生成に関連するのかもしれない。正常細胞ではGANPの発現レベルは低いが、細胞が急速に増殖する胚中心においてはアップレギュレーションされる（Kuwahara, K.et al., (2000) Blood 95, 2321-2328 、Kuwahara, K. et al., (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283）。GANPはまた、速い細胞終期を有するある種の細胞においてより高レベルで発現される。このことは、MCM複合体との会合がDNA複製を刺激する可能性を示唆している（Kuwahara, K. et al., (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283）。RNA/DNAプライマーゼ活性、MCM3結合能、およびアセチルトランスフェラーゼドメイン（Takei, Y.et al., (2001) EMBO Rep. 2, 119-123を有するGANPの発現は、細胞周期進行の調節に関与しているのかもしれない。 In late meiosis, most of the GANP is found in the cytoplasmic compartment until the nucleus is formed (terminal). These results indicate that the behavior of GANP and MCM3 is similar, and these two co-localize almost to the nucleus throughout the interphase. This is consistent with these two reciprocal meetings. However, GANP and MCM3 can also exist separately, as shown by confocal microscopy during mitosis (Figure 44).
The biological implications of nuclear-cytoplasmic GANP shuttling for the second type of RNA / DNA primase must be clarified in the future. It may be related to the generation of RNA primers in the final stages of DNA repair. The expression level of GANP is low in normal cells, but is up-regulated in germinal centers where the cells grow rapidly (Kuwahara, K. et al., (2000) Blood 95, 2321-2328, Kuwahara, K. et al (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283). GANP is also expressed at higher levels in certain cells with fast cell termination. This suggests that association with the MCM complex may stimulate DNA replication (Kuwahara, K. et al., (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283 ). The expression of GANP with RNA / DNA primase activity, MCM3 binding ability, and acetyltransferase domain (Takei, Y. et al., (2001) EMBO Rep. 2, 119-123 is involved in the regulation of cell cycle progression. It may be.

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配列番号３６：プライマー Sequence number 5: Primer sequence number 6: Primer sequence number 7: Primer sequence number 8: Primer sequence number 9: Primer sequence number 10: Primer sequence number 11: Primer sequence number 12: Primer sequence number 13: Primer sequence number 14: Primer Sequence number 15: Primer sequence number 16: Primer sequence number 17: Primer sequence number 18: Primer sequence number 19: Primer sequence number 20: Primer sequence number 21: Primer sequence number 22: Primer sequence number 23: Primer sequence number 24: Primer Sequence number 25: Primer sequence number 26: Primer sequence number 27: Primer sequence number 28: Primer sequence number 29: Primer sequence number 30: Primer sequence number 31: Primer sequence number 32: Primer sequence Issue 33: Primer SEQ ID NO 34: Primer SEQ ID NO 35: Primer SEQ ID NO: 36: Primer

Claims (5)

GANP遺伝子が導入され、該遺伝子をB細胞で発現させた、高親和性抗体を産生するために用いるトランスジェニック非ヒト哺乳動物、又は、該遺伝子をB細胞で発現させた、高親和性抗体を産生するために用いる該非ヒト哺乳動物の子孫。   A transgenic non-human mammal used for producing a high-affinity antibody into which a GANP gene has been introduced and expressed in B cells, or a high-affinity antibody in which the genes are expressed in B cells The progeny of the non-human mammal used to produce. GANP遺伝子をトランスフェクトしたES細胞から発生させ、該遺伝子をB細胞で発現させたものである、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその子孫。   The transgenic non-human mammal or a progeny thereof according to claim 1, which is generated from an ES cell transfected with a GANP gene and expressed in a B cell. 哺乳動物がマウスである請求項１又は２記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその子孫。   The transgenic non-human mammal or progeny thereof according to claim 1 or 2, wherein the mammal is a mouse. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその子孫の、脾臓、胸腺、リンパ節、骨髄若しくは扁桃腺又はB細胞。 The spleen, thymus, lymph node, bone marrow, tonsil or B cell of the transgenic non-human mammal according to any one of claims 1 to 3 or a progeny thereof. 高親和性抗体を産生するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその子孫の使用。
Use of the transgenic non-human mammal or progeny thereof according to any one of claims 1 to 3 for producing a high affinity antibody.
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