RU2799044C2 - Antibodies against factor d and their use - Google Patents
Antibodies against factor d and their use Download PDFInfo
- Publication number
- RU2799044C2 RU2799044C2 RU2019128203A RU2019128203A RU2799044C2 RU 2799044 C2 RU2799044 C2 RU 2799044C2 RU 2019128203 A RU2019128203 A RU 2019128203A RU 2019128203 A RU2019128203 A RU 2019128203A RU 2799044 C2 RU2799044 C2 RU 2799044C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- factor
- amino acid
- human factor
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУCROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATION
По настоящей заявке испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США 62/457,477, поданной 10 февраля 2017 года, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством отсылки.This application claims priority of U.S. Provisional Application 62/457,477, filed February 10, 2017, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.
ЗАЯВЛЕНИЕ В ОТНОШЕНИИ ФИНАНСИРУЕМЫХ ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ИЛИ РАЗРАБОТОКSTATEMENT REGARDING FEDERAL-FUNDED RESEARCH OR DEVELOPMENT
Настоящее изобретение было сделано при правительственной поддержке по гранту NIH AI085596 и NIH AI117410, выданному Национальными институтами здравоохранения США (NIH). Правительство обладает некоторыми правами на изобретение.The present invention was made with government support under NIH grant AI085596 and NIH AI117410 from the US National Institutes of Health (NIH). The government has some rights to the invention.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION
Система комплемента обеспечивает первую линию иммунной защиты организма от чужеродных патогенов. Комплемент также играет патогенную роль при воспалительных заболеваниях человека. Активация системы комплемента проходит по трем различным путям: классический путь (CP), лектиновый путь (LP) и альтернативный путь (AP). CP инициируется при связывании антигена–антитела. LP включается, когда маннозосвязывающие лектины (MBL) взаимодействуют с поверхностными молекулами сахаров на микроорганизмах. Активация обоих путей приводит к сборке CP C3 конвертазы C4b2a, хотя также может происходить прямое расщепление C3 MBL–ассоциированными сериновыми протеазами. AP представляет собой самоусиливающуюся петлю, регулируемую C3 конвертазой AP, C3bBb. Активация AP может происходить вторично по отношению к активации CP или LP или инициируется независимо. В последнем случае низкий уровень спонтанной "номинальной" активности C3 генерирует первичную C3bBb, которая быстро ускоряет AP в отсутствие достаточной регуляции. Таким образом, обычно предполагают, что активация AP на чужих поверхностях с отсутствием или недостаточной негативной регуляцией считается процессом по умолчанию, тогда как аутологичные клетки обычно избегают такого результата с помощью множества мембраносвязанных и присутствующих в жидкой фазе белков, ингибирующих комплемент. При некоторых условиях измененные, поврежденные или подвергшиеся стрессу аутологичные клетки и ткани также могут активировать AP и вызывать воспалительное повреждение.The complement system provides the body's first line of defense against foreign pathogens. Complement also plays a pathogenic role in human inflammatory diseases. Activation of the complement system occurs through three distinct pathways: the classical pathway (CP), the lectin pathway (LP), and the alternative pathway (AP). CP is initiated by antigen–antibody binding. LP is turned on when mannose-binding lectins (MBLs) interact with surface sugar molecules on microorganisms. Activation of both pathways results in the assembly of CP C3 convertase C4b2a, although direct cleavage of C3 by MBL-associated serine proteases can also occur. AP is a self-enhancing loop regulated by the C3 AP convertase, C3bBb. AP activation may occur secondary to CP or LP activation, or be initiated independently. In the latter case, a low level of spontaneous "nominal" C3 activity generates primary C3bBb, which rapidly accelerates AP in the absence of sufficient regulation. Thus, it is generally assumed that AP activation on foreign surfaces with no or insufficient downregulation is considered a default process, while autologous cells usually avoid such an outcome with a variety of membrane-bound and fluid phase complement-inhibiting proteins. Under certain conditions, altered, damaged, or stressed autologous cells and tissues can also activate AP and cause inflammatory damage.
Фактор D (FD) является важным ферментом для активации AP комплемента. Он расщепляет фактор B после того, как последний связывается с C3b, с образованием активной C3 конвертазы, C3bBb. Фактор D представляет собой сериновую протеазу размером приблизительно 24 кДа и циркулирует в крови как конститутивно активный фермент после образования из про–фактора D под действием фермента маннозо-связывающей лектин–ассоциированной сериновой протеазы–3 (MASP–3). По сравнению с другими белками комплемента в крови, концентрация фактора D в крови довольно низкая (приблизительно 2 мкг/мл). Хотя последний факт может указывать на то, что терапевтическое ингибирование активности фактора D в крови возможно и может быть легко достигнуто, предыдущие исследования показали, что фактор D обладает быстрым метаболизмом, и, соответственно, консенсус в области исследований комплемента заключается в том, что может не получиться блокировать фактор D системно. В данной области существует потребность в мАт против фактора D человека, которые могут системно ингибировать АР активность комплемента и, таким образом, лечить АР комплемент–зависимые патологии, при этом существует потребность в соответствующих моделях на животных для тестирования и использования таких мАт против фактора D человека. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этих и других потребностей.Factor D (FD) is an important enzyme for AP activation of complement. It cleaves factor B after the latter binds to C3b to form the active C3 convertase, C3bBb. Factor D is a serine protease of approximately 24 kDa and circulates in the blood as a constitutively active enzyme after being formed from pro-factor D by the enzyme mannose-binding lectin-associated serine protease-3 (MASP-3). Compared to other complement proteins in the blood, the concentration of factor D in the blood is quite low (approximately 2 µg/mL). Although the latter fact may indicate that therapeutic inhibition of factor D activity in the blood is possible and can be easily achieved, previous studies have shown that factor D is a rapidly metabolizing factor and, accordingly, the consensus in complement research is that it may not to block factor D systemically. There is a need in the art for anti-human factor D mAbs that can systemically inhibit AR complement activity and thus treat AR complement dependent pathologies, and there is a need for appropriate animal models to test and use such anti-human factor D mAbs. . The present invention addresses these and other needs.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к антителам против фактора D и способам ингибирования альтернативного пути (AP) комплемента с применением антитела против фактора D.The present invention relates to anti-factor D antibodies and methods for inhibiting the complement alternative pathway (AP) using an anti-factor D antibody.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложена композиция, включающая антитела, которые специфично связываются с фактором D. В некоторых вариантах осуществления фактор D является фактором D человека. В некоторых вариантах осуществления антитела согласно изобретению являются моноклональными антителами. В некоторых вариантах осуществления антитела согласно изобретению являются гуманизированными антителами. В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению является химерным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело является полноразмерным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело является фрагментом антитела, который включает, без ограничения перечисленными, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 и scFv. В некоторых вариантах осуществления антитело является частью конструкции, например слитой конструкции, включающей антитело и направляющий фрагмент или эффекторный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело является частью конъюгированной конструкции, такой как конъюгированная конструкция антитела–лекарственного средства.In one embodiment, the invention provides a composition comprising antibodies that specifically bind to factor D. In some embodiments, factor D is human factor D. In some embodiments, the antibodies of the invention are monoclonal antibodies. In some embodiments, the antibodies of the invention are humanized antibodies. In some embodiments, an antibody of the invention is a chimeric antibody. In some embodiments, the antibody is a full length antibody. In some embodiments, the antibody is an antibody fragment that includes, but is not limited to, Fab, Fab', F(ab) 2 , F(ab') 2 , and scFv. In some embodiments, the antibody is part of a construct, such as a fusion construct, comprising an antibody and a targeting fragment or an effector fragment. In some embodiments, the antibody is part of a conjugate construct, such as an antibody-drug conjugate construct.
В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению включает по меньшей мере одну из CDR–областей, выбранных из группы, состоящей из: VH–CDR1: SEQ ID NO:3; VH–CDR2: SEQ ID NO:4; VH–CDR3: SEQ ID NO:5; VL–CDR1: SEQ ID NO:8; VL–CDR2: SEQ ID NO:9; и VL–CDR3: SEQ ID NO:10 или их варианта или вариантов. В другом варианте осуществления антитело по изобретению включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или ее вариант. В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению включает легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7 или ее вариант. В другом варианте осуществления антитело по изобретению включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, или их вариант или варианты.In one embodiment, an antibody of the invention comprises at least one of the CDR regions selected from the group consisting of: VH-CDR1: SEQ ID NO:3; VH-CDR2: SEQ ID NO:4; VH-CDR3: SEQ ID NO:5; VL-CDR1: SEQ ID NO:8; VL-CDR2: SEQ ID NO:9; and VL-CDR3: SEQ ID NO:10 or a variant or variants thereof. In another embodiment, an antibody of the invention comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 or a variant thereof. In one embodiment, an antibody of the invention comprises a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:7 or a variant thereof. In another embodiment, an antibody of the invention comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, or a variant or variants thereof.
В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению включает по меньшей мере одну из CDR–областей, выбранных из группы, состоящей из: VH–CDR1: SEQ ID NO:13; VH–CDR2: SEQ ID NO:14; VH–CDR3: SEQ ID NO:15; VL–CDR1: SEQ ID NO:18; VL–CDR2: SEQ ID NO:19; и VL–CDR3: SEQ ID NO:20, или их вариант или варианты. В другом варианте осуществления антитело по изобретению является антителом, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или ее вариант. В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению включает легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17 или ее вариант. В другом варианте осуществления антитело по изобретению является антителом, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, или их вариант или варианты.In one embodiment, an antibody of the invention comprises at least one of the CDR regions selected from the group consisting of: VH-CDR1: SEQ ID NO:13; VH-CDR2: SEQ ID NO:14; VH-CDR3: SEQ ID NO:15; VL-CDR1: SEQ ID NO:18; VL-CDR2: SEQ ID NO:19; and VL-CDR3: SEQ ID NO:20, or a variant or variants thereof. In another embodiment, an antibody of the invention is an antibody that includes a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:12 or a variant thereof. In one embodiment, an antibody of the invention comprises a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:17 or a variant thereof. In another embodiment, an antibody of the invention is an antibody that comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:12 and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:17, or a variant or variants thereof.
В одном из вариантов осуществления антителом согласно изобретению является мАт 11–8A1 или мАт 1F10–5. В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению является антителом, которое связывается с фактором D и конкурирует за связывание по меньшей мере с еще одним антителом против фактора D. В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению является антителом, которое связывается с фактором D и конкурирует за связывание по меньшей мере с одним из антител против фактора D, описанных в настоящем документе. В другом варианте осуществления антитело по изобретению является антителом, которое связывается с фактором D и конкурирует за связывание с фактором D с антителом, обозначенным как мАт 11–8A1. В другом варианте осуществления антитело по изобретению является антителом, которое связывается с фактором D и конкурирует за связывание с фактором D с антителом, обозначенным как мАт 1F10–5.In one embodiment, the antibody of the invention is mAb 11-8A1 or mAb 1F10-5. In one embodiment, an antibody of the invention is an antibody that binds to factor D and competes for binding with at least one other anti-factor D antibody. In one embodiment, an antibody of the invention is an antibody that binds to factor D and competes for binding to at least one of the anti-factor D antibodies described herein. In another embodiment, an antibody of the invention is an antibody that binds to factor D and competes for binding to factor D with an antibody designated mAb 11-8A1. In another embodiment, an antibody of the invention is an antibody that binds to factor D and competes for binding to factor D with an antibody designated mAb 1F10-5.
В другом варианте осуществления изобретения предложен способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного альтернативным путем (AP), у пациента, включающий этап введения указанному пациенту по меньшей мере одного антитела против фактора D. В различных вариантах осуществления заболевание или нарушение, опосредованное альтернативным путем (AP), по меньшей мере, выбрано из группы, состоящей из: макулодистрофии (МД), возрастной макулодистрофии (ВМД), ишемического и реперфузионного повреждения, артрита, ревматоидного артрита, астмы, аллергической астмы, синдрома пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ), атипичного гемолитико–уремического синдрома (аГУС), буллезного эпидермолиза, сепсиса, трансплантации органа, воспаления (в том числе, без ограничения перечисленным, воспаления, связанного с хирургической операцией в условиях искусственного кровообращения и гемодиализом), C3 гломерулопатии, мембранозной нефропатии, гломерулонефрита (в том числе, без ограничения перечисленным, опосредованного антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (АНЦА) гломерулонефрита, волчанки и их комбинаций), АНЦА–опосредованного васкулита, шигатоксин–индуцированного ГУС и вызванного антифосфолипидными антителами невынашивания, а также их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D ингибирует альтернативный путь, но не ингибирует активацию классического пути и лектинового пути. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D ингибирует образование белка C3bBb. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D ингибирует влияние AP на последующую сигнализацию комплемента. В некоторых вариантах осуществления опосредованным AP заболеванием является C3 гломерулопатия. В некоторых вариантах осуществления опосредованным AP заболеванием является макулодистрофия, такая как возрастная макулодистрофия.In another embodiment, the invention provides a method of treating an alternative pathway (AP) mediated disease or disorder in a patient, comprising the step of administering to said patient at least one anti-factor D antibody. In various embodiments, the alternative pathway (AP) mediated disease or disorder is at least selected from the group consisting of: macular degeneration (MD), age-related macular degeneration (AMD), ischemic and reperfusion injury, arthritis, rheumatoid arthritis, asthma, allergic asthma, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) syndrome, atypical hemolytic-uremic syndrome (aHUS), epidermolysis bullosa, sepsis, organ transplantation, inflammation (including, but not limited to, inflammation associated with cardiopulmonary bypass surgery and hemodialysis), C3 glomerulopathy, membranous nephropathy, glomerulonephritis (including without limitations to the above, antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-mediated glomerulonephritis, lupus and their combinations), ANCA-mediated vasculitis, shigatoxin-induced HUS and antiphospholipid antibody-induced miscarriage, as well as their combinations. In some embodiments, the anti-factor D antibody inhibits the alternative pathway but does not inhibit the activation of the classical pathway and the lectin pathway. In some embodiments, the anti-factor D antibody inhibits the formation of the C3bBb protein. In some embodiments, the anti-factor D antibody inhibits the effect of AP on subsequent complement signaling. In some embodiments, the AP-mediated disease is C3 glomerulopathy. In some embodiments, the AP-mediated disease is macular degeneration, such as age-related macular degeneration.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложен способ снижения активности альтернативного пути системы комплемента пациента, включающий введение антитела пациенту путем введения, включающим энтеральное введение, парентеральное введение и их комбинацию, и где антитело включает шесть определяющих комплементарность областей, имеющих следующие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, или их вариант или варианты. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.In one embodiment, the invention provides a method for reducing the activity of an alternative pathway of a patient's complement system, comprising administering an antibody to a patient by administration, including enteral administration, parenteral administration, and a combination thereof, and where the antibody comprises six complementarity-determining regions having the following amino acid sequences: SEQ ID NO :3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, and SEQ ID NO:10, or a variation or variations thereof. In another embodiment, the antibody is an antibody fragment selected from the group consisting of Fab, Fab', F(ab) 2 , F(ab') 2 , scFv, and combinations thereof.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложен способ снижения активности альтернативного пути системы комплемента пациента, включающий введение антитела пациенту путем введения, включающим энтеральное введение, парентеральное введение и их комбинацию, и где антитело включает шесть определяющих комплементарность областей, имеющие следующие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 и SEQ ID NO:20, или их вариант или варианты. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, включающим Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинации.In one embodiment, the invention provides a method for reducing the activity of an alternative pathway of a patient's complement system, comprising administering an antibody to a patient by administration, including enteral administration, parenteral administration, and a combination thereof, and where the antibody comprises six complementarity-determining regions having the following amino acid sequences: SEQ ID NO :13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, and SEQ ID NO:20, or a variation or variations thereof. In another embodiment, the antibody is an antibody fragment comprising Fab, Fab', F(ab) 2 , F(ab') 2 , scFv, and combinations thereof.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено выделенное антитело, которое связывается с фактором D человека, где антитело альтернативно связывается с любым из первого эпитопа и второго эпитопа фактора D, при этом первый эпитоп и второй эпитоп имеют части, которые принимают спиральную конформацию в своей вторичной структуре, и где часть фактора D, которая принимает конформацию бета–тяжа в своей вторичной структуре, расположена между первым эпитопом и вторым эпитопом. В другом варианте осуществления первый эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO:21, и второй эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO:22. В другом варианте осуществления первый эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO:23, и второй эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO:24. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций. В другом варианте осуществления антитело связывается с эпитопом фактора D, и где эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO:21. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.In one embodiment, the invention provides an isolated antibody that binds to human factor D, wherein the antibody alternatively binds to any of a first epitope and a second epitope of factor D, wherein the first epitope and second epitope have moieties that adopt a helical conformation in their secondary structure , and where the portion of factor D that adopts the beta-strand conformation in its secondary structure is located between the first epitope and the second epitope. In another embodiment, the first epitope has an amino acid sequence that includes SEQ ID NO:21 and the second epitope has an amino acid sequence that includes SEQ ID NO:22. In another embodiment, the first epitope has an amino acid sequence that includes SEQ ID NO:23 and the second epitope has an amino acid sequence that includes SEQ ID NO:24. In another embodiment, the antibody is an antibody fragment selected from the group consisting of Fab, Fab', F(ab) 2 , F(ab') 2 , scFv, and combinations thereof. In another embodiment, the antibody binds to a Factor D epitope, and wherein the epitope has an amino acid sequence that includes SEQ ID NO:21. In another embodiment, the antibody is an antibody fragment selected from the group consisting of Fab, Fab', F(ab) 2 , F(ab') 2 , scFv, and combinations thereof.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено выделенное антитело, которое связывается с фактором D человека, где антитело связывается с эпитопом фактора D, и где эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO:22. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.In one embodiment, the invention provides an isolated antibody that binds to human factor D, wherein the antibody binds to a factor D epitope, and wherein the epitope has an amino acid sequence that includes SEQ ID NO:22. In another embodiment, the antibody is an antibody fragment selected from the group consisting of Fab, Fab', F(ab) 2 , F(ab') 2 , scFv, and combinations thereof.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено выделенное антитело, которое связывается с фактором D человека, где антитело связывается с эпитопом фактора D, и где эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO:23. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.In one embodiment, the invention provides an isolated antibody that binds to human factor D, wherein the antibody binds to a factor D epitope, and wherein the epitope has an amino acid sequence that includes SEQ ID NO:23. In another embodiment, the antibody is an antibody fragment selected from the group consisting of Fab, Fab', F(ab) 2 , F(ab') 2 , scFv, and combinations thereof.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено выделенное антитело, которое связывается с фактором D человека, где антитело альтернативно связывается с любым из первого эпитопа и второго эпитопа фактора D, где первый эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO:21, и где второй эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO:22. В другом варианте осуществления антитело состоит из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.In one embodiment, the invention provides an isolated antibody that binds to human factor D, wherein the antibody alternatively binds to any of a first epitope and a second factor D epitope, wherein the first epitope has an amino acid sequence that includes SEQ ID NO:21, and where the second the epitope has an amino acid sequence that includes SEQ ID NO:22. In another embodiment, the antibody consists of Fab, Fab', F(ab) 2 , F(ab') 2 , scFv, and combinations thereof.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложен выделенный полипептид, который связывается с фактором D человека, где полипептид связывается с эпитопом фактора D, при этом эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:22, и полипептид включает по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, или их варианта или вариантов.In one embodiment, the invention provides an isolated polypeptide that binds to human factor D, wherein the polypeptide binds to a factor D epitope, wherein the epitope has an amino acid sequence that includes SEQ ID NO:21 or SEQ ID NO:22, and the polypeptide includes at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 and SEQ ID NO:10, or their option or options.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложен выделенный полипептид, который связывается с фактором D человека, где полипептид связывается с эпитопом фактора D, при этом эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO:24, и полипептид включает по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 и SEQ ID NO:20, или их варианта или вариантов.In one embodiment, the invention provides an isolated polypeptide that binds to human factor D, wherein the polypeptide binds to a factor D epitope, wherein the epitope has an amino acid sequence that includes SEQ ID NO:24, and the polypeptide includes at least one amino acid sequence, selected from the group consisting of SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, and SEQ ID NO:20, or a variant or variants thereof.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено антитело против фактора D человека, где антитело имеет вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая имеет аминокислотную последовательность, которая больше чем на 90% (например, больше чем на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентична SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.In one embodiment, the invention provides an anti-human Factor D antibody, wherein the antibody has a heavy chain variable region (VH) that has an amino acid sequence that is greater than 90% (e.g., greater than 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%) identical to SEQ ID NO:2. In another embodiment, the antibody is an antibody fragment selected from the group consisting of Fab, Fab', F(ab) 2 , F(ab') 2 , scFv, and combinations thereof.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено антитело против фактора D человека, где антитело имеет вариабельную область легкой цепи (VL), которая имеет аминокислотную последовательность, которая больше чем на 90% (например, больше чем на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентична SEQ ID NO:7. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.In one embodiment, the invention provides an anti-human factor D antibody, wherein the antibody has a light chain variable region (VL) that has an amino acid sequence that is greater than 90% (e.g., greater than 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%) identical to SEQ ID NO:7. In another embodiment, the antibody is an antibody fragment selected from the group consisting of Fab, Fab', F(ab) 2 , F(ab') 2 , scFv, and combinations thereof.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено антитело против фактора D человека, где антитело имеет вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH область имеет аминокислотную последовательность, которая больше чем на 90% (например, больше чем на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентична SEQ ID NO:2, и где VL область имеет аминокислотную последовательность, которая больше чем на 90% (например, больше чем на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентична SEQ ID NO:7. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.In one embodiment, the invention provides an anti-human factor D antibody, wherein the antibody has a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL), wherein the VH region has an amino acid sequence that is greater than 90% (e.g., greater than is 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%) identical to SEQ ID NO:2, and wherein the VL region has an amino acid sequence that is greater than 90% ( for example, more than 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%) identical to SEQ ID NO:7. In another embodiment, the antibody is an antibody fragment selected from the group consisting of Fab, Fab', F(ab) 2 , F(ab') 2 , scFv, and combinations thereof.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложена клетка, которая продуцирует антитело, где антитело направленно взаимодействует с фактором D. В одном из вариантов осуществления клетка является гибридомой. В другом варианте осуществления клетка является клеточной линией.In one embodiment, the invention provides a cell that produces an antibody, wherein the antibody specifically interacts with factor D. In one embodiment, the cell is a hybridoma. In another embodiment, the cell is a cell line.
В другом варианте осуществления изобретения предложено генетически модифицированное, не относящееся к человеку животное, которое экспрессирует фактор D человека. В некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное является грызуном, таким как крыса или мышь. В одном из вариантов осуществления изобретения предложена генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует фактор D человека. В одном из вариантов осуществления изобретения предложена генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует фактор D человека, но не экспрессирует фактора D мыши. В другом варианте осуществления изобретения предложена генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует фактор D человека с регуляторных элементов мыши, но не экспрессирует фактора D мыши.In another embodiment, the invention provides a genetically modified, non-human animal that expresses human factor D. In some embodiments, the non-human animal is a rodent, such as a rat or mouse. In one embodiment, the invention provides a genetically modified mouse that expresses human factor D. In one embodiment, the invention provides a genetically modified mouse that expresses human factor D but does not express mouse factor D. In another embodiment, the invention provides a genetically modified mouse that expresses human factor D from mouse regulatory elements but does not express mouse factor D.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Предыдущее краткое описание, а также последующее подробное описание примеров осуществления изобретения будет лучше понято при прочтении в сочетании с прилагаемыми чертежами. Однако следует понимать, что изобретение не ограничено точными структурами и техническими средствами вариантов осуществления, показанных на чертежах. На чертежах:The previous brief description, as well as the following detailed description of exemplary embodiments of the invention, will be better understood when read in conjunction with the accompanying drawings. However, it should be understood that the invention is not limited to the precise structures and technical means of the embodiments shown in the drawings. On the drawings:
Фигура 1 – схема путей комплемента. Система комплемента может быть активирована тремя различными путями в зависимости от инициирующего стимула: классический путь (CP), лектиновый путь (LP) и альтернативный путь (AP) (Фигура 1). CP активируется в основном иммунными комплексами, состоящими из антигена и специфичного антитела. Связывание C1q с антителом, присоединенным к антигену, активирует C1r и C1s. Активированный C1s расщепляет C4 и C2. LP активируется, когда маннозосвязывающий лектин (MBL) связывается с маннозными группами микробных углеводов, активируя MBL–ассоциированные сериновые протеазы (MASP), и снова расщепляет C4 и C2. Продукты расщепления C4 и C2 образуют CP и LP C3 конвертазу, C4bC2a, которая расщепляет С3 с образованием С3b и С3а. Вторая молекула C3b может связываться с C4bC2a с образованием C5 конвертазы CP и LP. AP активируется, когда C3 подвергается спонтанному гидролизу и образует первичную C3 конвертазу AP, C3(H2O)Bb, в присутствии факторов B и D, что приводит к дополнительному расщеплению C3 и, в конечном счете, образованию C3 конвертазы AP (C3bBb) и C5 конвертазы AP (C3bBbC3b). Пропердин способствует активации AP, стабилизируя конвертазы AP. Все три пути завершаются образованием конвертаз, которые, в свою очередь, генерируют основные эффекторы системы комплемента: анафилатоксины (C4a/C3a/C5a), мембраноатакующий комплекс (MAC) и опсонины (например, C3b). Анафилатоксины являются мощными провоспалительными молекулами и образуются в результате расщепления C4, C3 и C5, соответственно. C5b образует комплекс при последовательном связывании белков C6–C9, что ведет к образованию MAC (C5b–9), который может непосредственно лизировать служащие мишенями поверхности. C3b индуцирует фагоцитоз опсонизированных мишеней, а также служит для усиления активации комплемента по пути AP.Figure 1 is a diagram of complement pathways. The complement system can be activated in three different ways depending on the initiating stimulus: classical pathway (CP), lectin pathway (LP) and alternative pathway (AP) (Figure 1). CP is activated mainly by immune complexes consisting of an antigen and a specific antibody. Binding of C1q to an antibody attached to an antigen activates C1r and C1s. Activated C1s cleaves C4 and C2. LP is activated when the mannose-binding lectin (MBL) binds to the mannose groups of microbial carbohydrates, activating MBL-associated serine proteases (MASPs), and again cleaves C4 and C2. The cleavage products of C4 and C2 form the CP and LP C3 convertase, C4bC2a, which cleaves C3 to form C3b and C3a. The second C3b molecule can bind to C4bC2a to form C5 convertase CP and LP. AP is activated when C3 undergoes spontaneous hydrolysis to form AP's primary C3 convertase, C3(H2O)Bb, in the presence of factors B and D, leading to further cleavage of C3 and ultimately formation of AP's C3 convertase (C3bBb) and C5 convertase AP (C3bBbC3b). Properdin promotes AP activation by stabilizing AP convertases. All three pathways culminate in the formation of convertases, which, in turn, generate the main effectors of the complement system: anaphylatoxins (C4a/C3a/C5a), membrane attack complex (MAC), and opsonins (eg, C3b). Anaphylatoxins are potent pro-inflammatory molecules and are formed from the breakdown of C4, C3 and C5, respectively. C5b forms a complex upon sequential binding of C6-C9 proteins, which leads to the formation of MAC (C5b-9), which can directly lyse target surfaces. C3b induces phagocytosis of opsonized targets and also serves to enhance complement activation along the AP pathway.
На Фигуре 2 показаны результаты экспериментов, демонстрирующих дозо-зависимое ингибирование ЛПС–индуцированной активации AP комплемента мАт против фактора D человека, 11–8A1 и 1F10–5. Оба мАт эффективно ингибировали активацию AP комплемента при добавлении к 50% нормальной человеческой сыворотке (НЧС) в конечной концентрации 5 мкг/мл или выше. Образец с добавлением ЭДТА служил в качестве отрицательного контроля (ЭДТА блокирует активацию комплемента). Образец без добавления мАт (0 Ab) служил в качестве базового уровня активации AP комплемента. Эксперимент проводили в буфере GVB–ЭГТА–Mg++. Планшеты для ИФА покрывали ЛПС, 37°C, 1 час. НЧС предварительно инкубировали с мАт перед добавлением в планшет. Активацию AP комплемента обнаруживали путем измерения количества осаждаемого C3 на поверхности планшета (OD450).Figure 2 shows the results of experiments demonstrating dose-dependent inhibition of LPS-induced AP activation of complement mAbs against human factor D, 11-8A1 and 1F10-5. Both mAbs effectively inhibited AP complement activation when added to 50% normal human serum (NHS) at a final concentration of 5 μg/mL or higher. The EDTA-spiked sample served as a negative control (EDTA blocks complement activation). A sample without the addition of mAb (0 Ab) served as a baseline for complement AP activation. The experiment was carried out in GVB–EGTA–Mg++ buffer. ELISA plates were coated with LPS, 37°C, 1 hour. SNPs were preincubated with the mAb before being added to the plate. AP complement activation was detected by measuring the amount of C3 deposited on the surface of the plate (OD450).
На Фигуре 3 показана нуклеотидная и аминокислотная последовательность последовательностей вариабельных областей тяжелой (SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2) и легкой (SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7) цепей мАт 11–8A1, включая CDR–области (VH–CDR1: SEQ ID NO:3; VH–CDR2: SEQ ID NO:4; VH–CDR3: SEQ ID NO:5; VL–CDR1: SEQ ID NO:8; VL–CDR2: SEQ ID NO:9; VL–CDR3: SEQ ID NO:10) мАт 11–8A1.Figure 3 shows the nucleotide and amino acid sequences of the variable regions of the heavy (SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2) and light (SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7) mAb 11-8A1 chains, including the CDR regions (VH-CDR1: SEQ ID NO:3; VH-CDR2: SEQ ID NO:4; VH-CDR3: SEQ ID NO:5; VL-CDR1: SEQ ID NO:8; VL-CDR2: SEQ ID NO:9 ; VL-CDR3: SEQ ID NO:10) mAt 11-8A1.
На Фигуре 4 показана нуклеотидная и аминокислотная последовательность последовательностей вариабельных областей тяжелой (SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12) и легкой (SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:17) цепей мАт 1F10–5, включая CDR–области (VH–CDR1: SEQ ID NO:13; VH–CDR2: SEQ ID NO:14; VH–CDR3: SEQ ID NO:15; VL–CDR1: SEQ ID NO:18; VL–CDR2: SEQ ID NO:19; VL–CDR3: SEQ ID NO:20) мАт 1F10–5.Figure 4 shows the nucleotide and amino acid sequences of the variable regions of the heavy (SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12) and light (SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:17) mAb 1F10-5 chains, including the CDR regions (VH-CDR1: SEQ ID NO:13; VH-CDR2: SEQ ID NO:14; VH-CDR3: SEQ ID NO:15; VL-CDR1: SEQ ID NO:18; VL-CDR2: SEQ ID NO:19 ; VL-CDR3: SEQ ID NO:20) mat 1F10-5.
На Фигуре 5 показаны результаты экспериментов по оценке относительной активности мАт 11–8A1 и 1F10–5 при блокировании ЛПС–индуцированной активации AP комплемента у человека, обезьяны, морской свинки и мыши. Способность мАт 11A8–1 и 1F10–5 ингибировать активность альтернативного пути в сыворотках различных видов млекопитающих исследовали при использовании ЛПС–AP анализа. Планшеты для ИФА покрывали ЛПС, 37°C, 1 час, затем добавляли 50% нормальной сыворотки человека, обезьяны, морской свинки или мыши, разведенной в GVB–Mg++–ЭГТА и инкубировали при 37°C в течение 1 часа перед обнаружением осаждения C3 с использованием антител против С3 человека или антител против С3 мыши. Для мАт 11–8A1 концентрации 5–20 мкг/мл были достаточными для ингибирования активации AP комплемента человека, тогда как мАт 11–8A1 не могло ингибировать активацию AP комплемента мыши, морской свинки, обезьяны (резуса и циномолгуса). Для мАт 1F10–5 концентрации 5–20 мкг/мл были достаточными для ингибирования активации комплемента АР человека, тогда как мАт 1F10–5 не могло ингибировать активацию АР комплемента мыши и морской свинки. МАт 1F10–5 в концентрации 10 или 20 мкг/мл эффективно ингибировало активацию AP комплемента яванского макака. С другой стороны, 50 мкг/мл мАт 1F10–5 вызывало частичное ингибирование активации АР комплемента макака–резуса.Figure 5 shows the results of experiments evaluating the relative activity of mAbs 11-8A1 and 1F10-5 in blocking LPS-induced AP complement activation in humans, monkeys, guinea pigs and mice. The ability of mAbs 11A8-1 and 1F10-5 to inhibit the activity of the alternative pathway in the sera of various mammalian species was studied using the LPS-AP assay. ELISA plates were coated with LPS, 37°C, 1 hour, then 50% normal human, monkey, guinea pig, or mouse serum diluted in GVB-Mg++-EGTA was added and incubated at 37°C for 1 hour before detecting precipitation of C3 c using antibodies against human C3 or antibodies against mouse C3. For
На Фигуре 6 показаны результаты эксперимента, в котором сравнивали активность полученного из гибридомы мышиного 11–8A1 и рекомбинантного химерного 11–8A1 (вариабельная область 11–8A1+константная область человеческого IgG4) при блокировании ЛПС–индуцированной активации AP комплемента человека. Планшеты для ИФА покрывали ЛПС, 37°C, 1 час, затем добавляли 50% нормальную человеческую сыворотку (НЧС), разведенную в GVB–Mg++–ЭГТА, и инкубировали при 37°C в течение 1 часа перед обнаружением осаждения C3 при использовании антител против C3 человека. НЧС с добавлением ЭДТА использовали в качестве отрицательного контроля (ЭДТА). При концентрациях 1,25–10 мкг/мл обе формы мАт 11–8A1 были достаточными для ингибирования активации AP комплемента человека, при этом не наблюдали никакого различия по активности.Figure 6 shows the results of an experiment comparing the activity of hybridoma-derived mouse 11-8A1 and recombinant chimeric 11-8A1 (11-8A1 variable region + human IgG4 constant region) in blocking LPS-induced activation of human AP complement. ELISA plates were coated with LPS, 37°C, 1 hour, then 50% normal human serum (NHS) diluted in GVB-Mg++-EGTA was added and incubated at 37°C for 1 hour before C3 precipitation was detected when using antibodies against C3 person. SNPs with the addition of EDTA were used as a negative control (EDTA). At concentrations of 1.25–10 μg/mL, both forms of
На Фигуре 7 показаны результаты экспериментов, в которых сравнивали антигенсвязывающую аффинность полученных из гибридомы мышиного мАт 11–8A1 и рекомбинантного химерного мАт 11–8A1 при использовании BiaCore. Очищенный фактор D человека связывали на чипе CM4 при использовании метода аминосочетания. Анализ BiaCore выполняли на приборе BiaCore–2000. Чип регененрировали между каждым связыванием при использовании 50 мМ NaOH. Две формы мАт 11–8A1 показали аналогичную аффинность.Figure 7 shows the results of experiments comparing the antigen binding affinity of hybridoma-derived mouse mAbs 11-8A1 and recombinant chimeric mAbs 11-8A1 using BiaCore. Purified human factor D was coupled to the CM4 chip using the amino coupling method. BiaCore analysis was performed on a BiaCore-2000 instrument. The chip was regenerated between each binding using 50 mM NaOH. Two forms of mAb 11-8A1 showed similar affinity.
На Фигуре 8 показаны результаты измерения антигенсвязывающей аффинности мАт 1F10–5 при использовании BiaCore. Очищенный фактор D человека связывали на чипе CM4 при использовании метода аминосочетания. Анализ BiaCore выполняли на приборе BiaCore–2000. Чип регененрировали между каждым связыванием при использовании 50 мМ NaOH. При определении Kd 1F10–5 составило 1,5 E–10 М.Figure 8 shows the results of measuring the antigen-binding affinity of mAb 1F10-5 using BiaCore. Purified human factor D was coupled to the CM4 chip using the amino coupling method. BiaCore analysis was performed on a BiaCore-2000 instrument. The chip was regenerated between each binding using 50 mM NaOH. When determining Kd 1F10–5 was 1.5 E–10 M.
На Фигуре 9, включая Фигуры 9А–9D, показаны результаты картирования эпитопов для мАт 11–8A1 с использованием делеционных конструкций. (Фигура 9A) Показанная последовательность (228 аминокислот) является зрелой формой фактора D человека без пропептида. Аминокислоты 107–110 (SEQ ID NO:21), 130–134, 148–151 (SEQ ID NO:22) и 178–184 подчеркнуты. (Фигура 9B) Схематическая диаграмма интактного и 9 мутантов с делециями фактора D человека для картирования эпитопов. Эти белки экспрессировали в клетках CHO. (Фигура 9C) Подтверждение экспрессии белка. Рекомбинантные интактный и делеционные мутанты фактора D человека из супернатанта (Sup) или из лизата (CL) клеток CHO подвергали иммуноблоттингу с антителом козы против фактора D человека. “+” и “–” обозначают положительное и отрицательное обнаружение, соответственно. (Фигура 9D) Реактивность мАт 11–8A1 в отношении полноразмерного и делеционных мутантных белков оценивали с помощью Вестерн–блоттинга (WB) с поликлональным антителом козы против фактора D человека после иммунопреципитации (IP) с мАт 11–8A1. “+” и “–”обозначают положительное и отрицательное обнаружение, соответственно. NT – не исследовали.Figure 9, including Figures 9A-9D, shows the results of epitope mapping for mAbs 11-8A1 using deletion constructs. (Figure 9A) The sequence shown (228 amino acids) is the mature form of human factor D without the propeptide. Amino acids 107-110 (SEQ ID NO:21), 130-134, 148-151 (SEQ ID NO:22) and 178-184 are underlined. (Figure 9B) Schematic diagram of intact and 9 human factor D deletion mutants for epitope mapping. These proteins were expressed in CHO cells. (Figure 9C) Confirmation of protein expression. Recombinant intact and deletion human factor D mutants from the supernatant (Sup) or from the lysate (CL) of CHO cells were immunoblotted with goat anti-human factor D antibody. “+” and “–” denote positive and negative detection, respectively. (Figure 9D) Reactivity of mAb 11-8A1 against full-length and deletion mutant proteins was assessed by Western blotting (WB) with goat anti-human factor D polyclonal antibody after immunoprecipitation (IP) with mAb 11-8A1. “+” and “–” denote positive and negative detection, respectively. NT - not tested.
Для картирования областей или сайтов в факторе D человека, которые являются важными для связывания мАт, мАт 11–8A1 тестировали на реактивность с серией мутантов с делециями в полноразмерном (Full) факторе D человека. Вестерн–блоттинг с использованием поликлонального антитела козы против фактора D человека подтвердил экспрессию большинства мутантов с делециями при ожидаемой молекулярной массе. Однако в нескольких попытках не удалось получить рекомбинантные белкис с делецией–6 и 9. Как показано на Фигуре 9, мАт 11–8A1 распознавало Full, делецию–2 и 4, но не распознавало делецию–1, 3, 5, 7 и 8. Эти результаты подтверждают, что делеция четырех аминокислот PLPW в положениях 107–110 (SEQ ID NO:21) или VLDR в положениях 148–151 (SEQ ID NO:22) нарушала связывание с мАт 11–8A1.To map regions or sites in human factor D that are important for mAb binding, mAb 11-8A1 was tested for reactivity with a series of deletion mutants in full human factor D. Western blot analysis using a goat anti-human factor D polyclonal antibody confirmed the expression of most of the deletion mutants at the expected molecular weight. However, several attempts failed to generate deletion-6 and 9 recombinant proteins. As shown in Figure 9, mAb 11-8A1 recognized Full, deletion-2, and 4, but did not recognize deletion-1, 3, 5, 7, and 8. These results confirm that deletion of the four amino acids PLPW at positions 107-110 (SEQ ID NO:21) or VLDR at positions 148-151 (SEQ ID NO:22) disrupted mAb binding 11-8A1.
На Фигуре 10 показаны результаты картирования эпитопов для мАт 11–8A1 с помощью сайт–направленного мутагенеза. Исследования с сайт–направленным мутагенезом проводили для подтверждения двух сайтов связывания (107–110 и 148–151) в факторе D человека, которые влияют на распознавание мАт 11–8A1. Производили замену четырех аминокислот PLPW в положениях 107–110 или VLDR в положениях 148–151 на остатки аланина (AAAA). Клетки СНО трансфицировали векторами для получения мутантного белка. Экспрессию мутантного белка в супернатантах и лизатах клеток (через 48 часов после трансфекции) подтверждали с помощью Вестерн–блоттинга при использовании поликлонального антитела козы против фактора D человека. Обе мутации, как и ожидали, нарушали распознавание белка мАт 11–8A1 при IP с последующим Вестерн–блоттингом с антителами козы против фактора D человека. Результаты исследований мутантов с делециями и мутагенеза (PLPW–AAAA и VLDR–AAAA) показали, что четыре аминокислоты, расположенные в PLPW107–110 и VLDR148–151 фактора D человека, являются ключевыми для активности связывания и функционального блокирования 11–8A1.Figure 10 shows the results of epitope mapping for mAb 11-8A1 using site-directed mutagenesis. Site-directed mutagenesis studies were performed to confirm two binding sites (107-110 and 148-151) in human factor D that affect mAb 11-8A1 recognition. Four PLPW amino acids at positions 107–110 or VLDR at positions 148–151 were replaced with alanine residues (AAAA). CHO cells were transfected with vectors to obtain a mutant protein. Expression of the mutant protein in cell supernatants and lysates (48 hours after transfection) was confirmed by Western blotting using a goat anti-human factor D polyclonal antibody. Both mutations, as expected, impaired mAb 11-8A1 protein recognition at IP followed by Western blotting with goat anti-human factor D antibodies. The results of deletion mutant and mutagenesis studies (PLPW-AAAA and VLDR-AAAA) showed that four amino acids located in human factor D PLPW107-110 and VLDR148-151 are key for 11-8A1 binding and functional blocking activity.
На Фигуре 11, включая Фигуры 11А–11D, показана схема получения мышей с нокаутом фактора D человека. (Фигура 11A) Схематические диаграммы, на которых представлены конструкции, направленно воздействующие на фактор D человека, локус фактора D мыши, аллель–мишень и неоделетированный аллель (сверху вниз). кДНК фактора D человека кодирует весь белок из 253 аминокислот, включающий сигнальный пептид, пропептид и зрелый пептид. Пунктирными линиями обозначены сайты интеграции кДНК фактора D человека в ген фактора D мыши. Положение зонда для скрининга клеток ES указано внизу на диаграммах. Сокращенные обозначения: сайты рестрикции BamHI (B), HindIII (H), NotI (N) и XhoI (X). FRT, мишень, распознаваемая флиппазой. LoxP, локус кроссинговера в P1. (Фигура 11B) Кодирующая последовательность фактора D человека фланкирована 5' и 3'–некодирующими последовательностями фактора D мыши в направляющей конструкции. Последовательность нуклеиновой кислоты фактора D человека подчеркнута (SEQ ID NO:25), и сайт рестриктазы XhoI выделен жирным шрифтом, и последовательность нуклеиновой кислоты 5' и 3'–нетранслируемой области фактора D мыши показана заглавными и строчными буквами, соответственно. (Фигура 11C) Данные Саузерн–блоттинга, показывающие, что положительный клон клеток ES продуцировал два рестрикционных фрагмента BamHI (5 тому подобноен. и 4,5 тому подобноен.), тогда как репрезентативный нецелевой клон клеток ES продуцировал только полосу 5 тому подобноен. (Фигура 11D) ПЦР генотипирование мышей дикого типа (WT), мышей с нокаутом, гетерозиготных (Het) и гомозиготных (Homo) по фактору D человека, при использовании специфичных к фактору D человека (размер мишени: 450 пн) 5'–GTC AGG GTG CCA TGC AGG AG–3'(SEQ ID NO:26) и 5'–CCC AGG AGA ACC TGC ACC TTC–3' (SEQ ID NO:27), специфичных к фактору D мыши (размер мишени: 292 пн) 5'–CCTCCCACCCTTAGCTATCC–3 '(SEQ ID NO:28) и 5'–ACCCAGACTGTGTCCCTCAC–3' (SEQ ID NO:29).Figure 11, including Figures 11A-11D, shows a scheme for obtaining mice with a knockout of human factor D. (Figure 11A) Schematic diagrams showing constructs targeting human factor D, mouse factor D locus, target allele, and nondeleted allele (top to bottom). The human factor D cDNA encodes the entire 253 amino acid protein, including the signal peptide, the propeptide, and the mature peptide. The dotted lines indicate the sites of integration of the human factor D cDNA into the mouse factor D gene. The position of the ES cell screening probe is indicated at the bottom of the diagrams. Abbreviated designations: Bam HI (B), Hind III (H), Not I (N), and Xho I (X) restriction sites. FRT, target recognized by flippase. LoxP, crossover locus in P1. (Figure 11B) The human factor D coding sequence is flanked 5' and 3' by non-coding mouse factor D sequences in a guide construct. The human factor D nucleic acid sequence is underlined (SEQ ID NO:25) and the Xho I restriction enzyme site is in bold, and the nucleic acid sequence of the 5' and 3' mouse factor D untranslated region is shown in uppercase and lowercase letters, respectively. (Figure 11C) Southern blot data showing that the positive ES cell clone produced two Bam HI restriction fragments (5bb and 4.5bb) while a representative non-target ES cell clone produced only the 5bb band. (Figure 11D) PCR genotyping of wild-type (WT), knockout, heterozygous (Het) and homozygous (Homo) mice for human factor D using human factor D-specific (target size: 450 bp) 5'-GTC AGG mouse factor D-specific GTG CCA TGC AGG AG-3'(SEQ ID NO:26) and 5'-CCC AGG AGA ACC TGC ACC TTC-3' (SEQ ID NO:27) (target size: 292 bp) 5 '–CCTCCCACCCTTAGCTATCC–3' (SEQ ID NO:28) and 5'–ACCCAGACTGTGTCCCTCAC–3' (SEQ ID NO:29).
На Фигуре 12, включая Фигуры 12A и 12B, показаны результаты экспериментов по оценке экспрессии фактора D человека в сыворотке мышей с нокаутом фактора D человека. Вестерн–блоттинг и ИФА проводили для подтверждения присутствия белка фактора D человека в сыворотке мышей с нокаутом фактора D человека. Образцы сыворотки получали у мышей с 3 разными генотипами: дикого типа, гетерозиготных и гомозиготных. НЧС и сыворотку мыши с нокаутом по фактору D мыши (fDKO) использовали для контроля анализа. (Фигура 12A) С помощью Вестерн–блоттинга с использованием поликлональных антител против фактора D человека детектировали полосу белка массой 24 кДа, соответствующую фактору D человека, в нормальной человеческой сыворотке (НЧС), а также у гетерозиготных и гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека (HDKI), тогда как в сыворотке мышей дикого типа (–/–) и гетерозиготных HDKI мышей была обнаружена полоса массой приблизительно 40–45 кДа, соответствующая фактору D мыши. (Фигура 12B) Экспрессия белка фактора D человека может быть подтверждена с помощью сэндвич–ИФА у гомозиготных мышей HDKI. Планшет покрывали поликлональным антителом против фактора D человека (R&D, AF1824). После инкубирования с разведенной сывороткой (1/2 или 1/5) фактор D человека детектировали при использовании биотин–конъюгированного антитела козы против фактора D человека с последующим добавлением HRP–конъюгированного стрептавидина. Как и ожидали, фактор D человека был обнаружен в НЧС, контрольных лунках с рекомбинантным фактором D человека и в сыворотке гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека, но не обнаружен у мышей дикого типа.Figure 12, including Figures 12A and 12B, shows the results of experiments evaluating human factor D expression in the sera of human factor D knockout mice. Western blotting and ELISA were performed to confirm the presence of human factor D protein in the serum of mice with human factor D knockout. Serum samples were obtained from mice with 3 different genotypes: wild type, heterozygous and homozygous. SNPs and mouse factor D knockout (fDKO) mouse sera were used to control the assay. (Figure 12A) Western blotting with polyclonal antibodies against human Factor D detected a 24 kDa protein band corresponding to human factor D in normal human serum (HNS) and heterozygous and homozygous mice with knockout of human factor D ( HDKI), while in the sera of wild-type (–/–) and heterozygous HDKI mice, a band of approximately 40–45 kDa corresponding to mouse factor D was found. (Figure 12B) Human factor D protein expression can be confirmed by sandwich ELISA in homozygous HDKI mice. The plate was coated with a polyclonal antibody against human factor D (R&D, AF1824). After incubation with diluted serum (1/2 or 1/5), human factor D was detected using biotin-conjugated goat anti-human factor D followed by addition of HRP-conjugated streptavidin. As expected, human factor D was detected in SNPs, recombinant human factor D control wells, and in the sera of homozygous human factor D knockout mice, but was not detected in wild-type mice.
На Фигуре 13 показаны результаты экспериментов по оценке ЛПС–индуцированной активности АР комплемента в сыворотке мышей с нокаутом фактора D человека. Даже в отсутствие мышиного фактора D активность AP комплемента была обнаружена у гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека, что указывает на то, что фактор D человека, экспрессируемый у этих мышей, являлся функциональным in vivo. Как показано, анализ ЛПС–индуцированной активации AP комплемента указывает, что гомозиготные мыши с нокаутом фактора D человека, а также мыши дикого типа обладали активностью AP комплемента в сыворотке. С другой стороны, в этом анализе активность АР комплемента не была обнаружена ни в сыворотке мышей с нокаутом по фактору D, ни в сыворотке мышей WT, ни в обработанной ЭДТА сыворотке гомозиготных мышей с нокаутом. Эти наблюдения продемонстрировали, что экспрессия фактора D человека могла восстанавливать активность АР комплемента у мыши, и что мыши с нокаутом могут использоваться в качестве экспериментальной модели на животных для исследования терапии, направленной на фактор D, при заболеваниях и нарушениях, опосредованных АР комплементом.Figure 13 shows the results of experiments evaluating LPS-induced complement AR activity in serum from human Factor D knockout mice. Even in the absence of mouse factor D, complement AP activity was detected in homozygous human factor D knockout mice, indicating that human factor D expressed in these mice was functional in vivo . As shown, analysis of LPS-induced complement AP activation indicates that homozygous human factor D knockout mice as well as wild-type mice had serum complement AP activity. On the other hand, in this assay, complement AR activity was not detected in either the sera of factor D knockout mice, the sera of WT mice, or the EDTA-treated sera of homozygous knockout mice. These observations demonstrated that human factor D expression could restore complement AR activity in the mouse, and that knockout mice could be used as an animal model to investigate factor D-targeted therapy for complement AR-mediated diseases and disorders.
На Фигуре 14 показаны результаты экспериментов по оценке in vivo активности и кинетики мАт 11–81A у мышей с нокаутом фактора D человека. Гомозиготной мыши с нокаутом фактора D человека вводили 1 мг (в/б) мАт 11–8A1. Образцы сыворотки собирали до инъекции (0 часов) и затем в различные моменты времени после инъекции и исследовали на ЛПС–индуцированную активацию AP комплемента. Как показано, в сыворотке мышей с нокаутом по фактору D или в НЧС, обработанной ЭДТА, активность AP комплемента отсутствовала. Напротив, активность AP комплемента была обнаружена в НЧС и в сыворотке гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека в момент 0 часов (до введения мАт). Активность AP комплемента у гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека была ингибирована через 6 часов и в день 1–5 после введения мАт 11–8A1. Активность AP комплемента возвращалась к нормальному уровню в день 7. Эти результаты указывают, что в дозе 1 мг/мышь мАт 11–8A1 могло ингибировать активность AP комплемента in vivo до 3–5 дней.Figure 14 shows the results of experiments evaluating in vivo activity and kinetics of mAb 11-81A in human factor D knockout mice. A homozygous human factor D knockout mouse was injected with 1 mg (ip) mAb 11-8A1. Serum samples were collected before injection (0 hours) and then at various time points after injection and examined for LPS-induced complement AP activation. As shown, in the sera of factor D knockout mice or in EDTA-treated SNPs, complement AP activity was absent. In contrast, complement AP activity was detected in SNPs and in the serum of homozygous human Factor D knockout mice at 0 hours (prior to mAb administration). Complement AP activity in homozygous human factor D knockout mice was inhibited at 6 hours and on
На Фигуре 15 показаны результаты экспериментов по оценке in vivo активности и кинетики мАт 1F10–5 и нерелевантного контрольного мАт (MOPC) у мышей с нокаутом фактора D человека. Гомозиготной мыши с нокаутом фактора D человека (HDKI) вводили 1 мг (в/б) мАт 1F10–5 или мАт изотипического контроля (MOPC, мышиный IgG1). Образцы сыворотки собирали до инъекции (0 часов) и затем в различные моменты времени после инъекции и исследовали на ЛПС–индуцированную активацию AP комплемента. Изменения уровней циркулирующего фактора D человека в образцах сыворотки до и после обработки, оценивали с помощью Вестерн–блоттинга при использовании поликлонального антитела козы против фактора D человека. Как показано, в сыворотке мыши с нокаутом по фактору D (DKO) или в сыворотке WT, обработанной ЭДТА, активность AP комплемента отсутствовала. Напротив, активность AP комплемента была обнаружена в сыворотке WT и в сыворотке гомозиготной мыши HDKI в момент 0 часов (до введения мАт). После введения мАт 1F10–5, активность AP комплемента у гомозиготной мыши HDKI была ингибирована в различной степени между 6 часами и днем 5. Она возвращалась к нормальному уровню в день 7. Эти результаты указывают, что мАт 1F10–5 могло вызвать длительное ингибирование активности AP комплемента при системном введении. Данные Вестерн–блоттинга показали накопление фактора D человека в крови вследствие образования комплексов фактора D/антитела к фактору D. Свободный фактор D человека экскретировался из почки и присутствовал в моче мышей HDKI. Повышение уровней фактора D человека в крови мышей HDKI позволяет предположить, что комплексы фактора D/антитела к фактору D не могли экскретироваться через почки. мАт изотипического контроля, MOPC, не ингибировало активность AP комплемента у гомозиготной мыши HDKI и при этом это не вызывало накопления фактора D человека в крови.Figure 15 shows the results of experiments evaluating in vivo activity and kinetics of mAb 1F10-5 and an irrelevant control mAb (MOPC) in human factor D knockout mice. A homozygous human factor D knockout (HDKI) mouse was injected with 1 mg (ip) 1F10-5 mAb or isotype control mAb (MOPC, mouse IgG1). Serum samples were collected before injection (0 hours) and then at various time points after injection and examined for LPS-induced complement AP activation. Changes in circulating human factor D levels in pre- and post-treatment serum samples were assessed by Western blotting using a goat anti-human factor D polyclonal antibody. As shown, there was no complement AP activity in either Factor D knockout (DKO) mouse sera or WT sera treated with EDTA. In contrast, complement AP activity was detected in WT serum and in HDKI homozygous mouse serum at 0 hours (prior to mAb administration). Following administration of the 1F10–5 mAb, complement AP activity in a homozygous HDKI mouse was inhibited to varying degrees between 6 hours and
На Фигуре 16 показаны результаты экспериментов по оценке активности in vivo и кинетики мАт 11–8A1 у мышей с нокаутом фактора D человека во время длительного лечения. Непрерывное введение мАт 11A8–1 двум гомозиготным мышам с нокаутом фактора D человека (HDKI) (мыши #3 и #21, мАт вводили раз в 4 дня в дозе 1 мг/мышь) вызывало устойчивое ингибирование активности AP комплемента в течение 4–х недельного периода. Как и в предыдущем эксперименте с однократным введением дозы, мАт 118A–1 вызывало накопление фактора D человека в крови, однако фактор D в конечном счете достигал стационарного уровня у обеих обработанных мышей, что определяли с помощью Вестерн–блоттинга. Вместе эти данные показали, что при введении индивиду мАт против фактора D в соответствующих дозах и интервалах можно вызвать устойчивое ингибирование системной активности АР комплемента.Figure 16 shows the results of experiments evaluating in vivo activity and kinetics of mAb 11-8A1 in human factor D knockout mice during long-term treatment. Continuous administration of mAb 11A8-1 to two homozygous human factor D knockout (HDKI) mice (
На Фигуре 17, включая Фигуры 17A и 17B, показаны результаты экспериментов по оценке терапевтической эффективности мАт 11–8A1 в предотвращении IgG–индуцированного артрита у мышей K/BxN. (Фигура 17A) Восприимчивость гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека (HDKI) к артриту K/BxN. В этой модели сыворотку или очищенный IgG мышей K/BxN с артритом адоптивно переносили мышам C57BL/6 для индукции артрита высокоэффективным способом. Заболевание демонстрирует много характерных признаков ревматоидного артрита человека, включающих утолщение голеностопного сустава, опухание и прогрессирующее разрушение суставов. Как показано на панели A, как и мыши дикого типа C57BL/6, мыши HDKI также были восприимчивы к артриту K/BxN, что подтверждалось увеличением толщины голеностопного сустава и клиническим показателем после адоптивного переноса IgG мышей K/BxN. Эти данные подтверждали, что фактор D человека был полностью функционален у мышей в условиях AP комплемент–опосредованного заболевания. (Фигура 17B). Терапевтическая эффективность мАт 11–8A1 при артрите K/BxN у мышей HDKI. Введение мАт 11–8A1 (1 мг/мышь, раз в 4 дня, с началом введения до переноса IgG мышей K/BxN) значительно снижало тяжесть симптомов артрита, что подтверждалось уменьшением толщины голеностопного сустава и клиническим показателем по сравнению с мышами, получавшими контрольное мАт (MOPC). Эти результаты продемонстрировали, что можно снизить тяжесть локального повреждения, вызванного активацией комплемента, путем системного направленного воздействия на фактор D.Figure 17, including Figures 17A and 17B, shows the results of experiments evaluating the therapeutic efficacy of mAb 11-8A1 in preventing IgG-induced arthritis in K/BxN mice. (Figure 17A) Susceptibility of homozygous human factor D knockout (HDKI) mice to K/BxN arthritis. In this model, serum or purified IgG from arthritic K/BxN mice was adoptively transferred to C57BL/6 mice to induce arthritis in a highly efficient manner. The disease exhibits many of the characteristic features of human rheumatoid arthritis, including ankle thickening, swelling, and progressive joint destruction. As shown in panel A, like C57BL/6 wild-type mice, HDKI mice were also susceptible to K/BxN arthritis, as evidenced by increased ankle thickness and clinical score after adoptive IgG transfer of K/BxN mice. These data confirmed that human factor D was fully functional in mice under conditions of AP complement-mediated disease. (Figure 17B). Therapeutic efficacy of mAb 11-8A1 in K/BxN arthritis in HDKI mice. Administration of mAb 11-8A1 (1 mg/mouse, every 4 days, starting pre-IgG transfer of K/BxN mice) significantly reduced the severity of arthritis symptoms, as evidenced by a reduction in ankle thickness and clinical score compared to mAb-treated mice. (MOPC). These results demonstrate that it is possible to reduce the severity of local damage caused by complement activation by systemically targeting factor D.
На Фигуре 18 показаны результаты экспериментов по оценке терапевтической эффективности мАт 11–8A1 в предотвращении внесосудистого гемолиза (EVH) с использованием мыши с нокаутом фактора D человека в качестве модели. Гомозиготным мышам с нокаутом фактора D человека (HDKI) переливали эритроциты (Э) мышей дикого типа и мышей с тройным нокаутом Crry/DAF/C3 (TKO). Реципиентным мышам HDKI за 24 часа до переноса эритроцитов вводили мАт 118A–1 (2 мг/мышь, в/б) или PBS. Смесь 1:1 меченных DDAO–SE WT и меченных CFSE TKO эритроцитов (Эр) вводили реципиентным мышам в хвостовую вену. Через 5 минут и через 1, 2 и 3 дня после переливания эритроцитов у реципиентных мышей забирали кровь и исследовали эритроциты для определения процента перелитых эритроцитов, оставшихся в кровотоке. Количество CFSE–меченных TKO Эр у каждого реципиента нормализовали (в %) по DDAO–SE–меченным Эр WT в каждой временной точке. У реципиентных мышей HDKI без обработки мАт эритроциты TKO быстро подвергались элиминации в результате EVH, в соответствии с полученными ранее данными (Miwa et al., 2002, Blood 99: 3707–3716). Однако у реципиентных мышей HDKI, получавших мАт 11–8A1 против фактора D человека, EVH не наблюдали, при этом перелитые эритроциты TKO сохранялись. Эти результаты демонстрируют, что мАт против фактора D человека был эффективным в профилактике EVH.Figure 18 shows the results of experiments evaluating the therapeutic efficacy of mAb 11-8A1 in preventing extravascular hemolysis (EVH) using a human factor D knockout mouse as a model. Homozygous human factor D knockout (HDKI) mice were transfused with erythrocytes (E) from wild-type and Crry/DAF/C3 triple knockout (TKO) mice. Recipient HDKI mice were treated with mAb 118A-1 (2 mg/mouse, ip) or
На Фигуре 19, включая Фигуры 19A–19D, показано картирование эпитопов мАт 1F10–5 с использованием делеционной конструкции. На Фигуре 19A в зрелой последовательности фактора D человека выделены аминокислоты 132–135, 155–159 (SEQ ID NO:23), 173–176 (SEQ ID NO:24) и 202–208. На Фигуре 19B показана схематическая диаграмма четырех мутантов с делецией фактора D человека для картирования эпитопов. Эти белки были получены в клетках млекопитающих. На Фигуре 19C показаны результаты, подтверждающие экспрессию белка. Супернатант (Sup) и лизат клеток (CL) полноразмерного фактора D и мутантов с делецией подвергали иммуноблоттингу с антителами козы против фактора D человека. На Фигуре 19D показана реактивность мАт 1F10–5 по отношению к полноразмерному белку и мутантным белкам с делецией согласно оценке с помощью ИФА. Эти результаты указывают, что делеция аминокислот NRRTH в положениях 155–159 (SEQ ID NO:23) или SNRR в положениях 173–176 (SEQ ID NO:24) нарушала связывание с мАт 1F10–5.Figure 19, including Figures 19A-19D, shows mAb 1F10-5 epitope mapping using a deletion construct. In Figure 19A, amino acids 132-135, 155-159 (SEQ ID NO:23), 173-176 (SEQ ID NO:24) and 202-208 are isolated in the mature human Factor D sequence. Figure 19B shows a schematic diagram of four human factor D deletion mutants for epitope mapping. These proteins have been produced in mammalian cells. Figure 19C shows the results confirming protein expression. The cell supernatant (Sup) and cell lysate (CL) of full-length factor D and deletion mutants were immunoblotted with goat anti-human factor D antibodies. Figure 19D shows the reactivity of mAb 1F10-5 towards full length protein and deletion mutant proteins as assessed by ELISA. These results indicate that deletion of amino acids NRRTH at positions 155-159 (SEQ ID NO:23) or SNRR at positions 173-176 (SEQ ID NO:24) disrupted binding to mAb 1F10-5.
На Фигуре 20 показаны результаты примерных экспериментов по оценке активности мАт 11–8A1, 1F10–5 и 166–32 in vivo у мышей с нокаутом фактора D человека. Для оценки эффективности мАт 166–32 (см. патент США 8,124,090, Tanox), 11–8A1 и 1F10–5 при блокировании активности альтернативного пути (AP) комплемента in vivo, гуманизированных по фактору D мышей подвергали многократному введению доз (1 мг/мышь, раз в 3 дня, п/к введение). Образцы плазмы собирали до введения мАт (время 0) и через 6 часов, 1, 3, 6 и 9 дней после введения мАт и исследовали на ЛПС–индуцированную активность AP комплемента. Активность AP комплемента в различные моменты времени нормализовали относительно 100% значений, полученных в момент времени 0. Данные показали, что мАт 11–8A1 и 1F10–5 обладали превосходной фармакодинамической активностью in vivo по сравнению с мАт 166–32. В частности, мАт 11–8A1 единообразно ингибировало 80–90% активности АР комплемента во всех временных точках после введения мАт, тогда как мАт 166–32 вызывало сопоставимое ингибирование только через 6 часов и 1 день после введения мАт. мАт 1F10–5 показало 50% ингибирование АР комплемента в день 9, тогда как ингибирование активности АР комплемента под действием мАт 166–32 в день 9 почти не наблюдалось.Figure 20 shows the results of exemplary experiments evaluating mAb 11-8A1, 1F10-5 and 166-32 activity in vivo in human factor D knockout mice. To evaluate the efficacy of mAb 166-32 (see U.S. Pat. No. 8,124,090, Tanox), 11-8A1 and 1F10-5 in blocking complement alternative pathway (AP) activity in vivo , factor D humanized mice were dosed multiple times (1 mg/mouse , once every 3 days, s / c introduction). Plasma samples were collected before mAb administration (time 0) and 6 hours, 1, 3, 6 and 9 days after mAb administration and examined for LPS-induced complement AP activity. Complement AP activity at different time points was normalized to 100% of the values obtained at
На Фигуре 21 показаны результаты примерных экспериментов по оценке in vivo активности химерного мАт 11–8A1 и химерного AFD у мышей с нокаутом фактора D человека. Для оценки эффективности 11–8A1/человеческого IgG4 химерного мАт и AFD/человеческого IgG4 химерного мАт при блокировании активности альтернативного пути (AP) комплемента in vivo, гуманизированных по фактору D мышей подвергали многократному введению доз (1 мг/мышь, раз в 3 дня, п/к введение). Образцы плазмы собирали до введения мАт (время 0) и через 6 часов, 1, 3, 6, 9, 12 и 15 дней после введения мАт и исследовали ЛПС–индуцированную активность AP комплемента. Активность AP комплемента в различных временных точках нормализовало относительно 100% значений, полученных в момент времени 0. AFD представляет собой гуманизированный вариант мАт 166–32 (см. Katschke et al., J Biol Chem. 2012 Apr 13; 287:12886–12892, WO/2008/055206, патент США 8,372,403, патент США 8,273,352, заявка на патент США 2014/0212433). Данные показали, что 11–8A1/человеческое IgG4 химерное мАт было намного более активным и показало намного лучший фармакодинамический профиль, чем AFD/человеческое IgG4 химерное мАт. В частности, тогда как оба мАт вызывали 90–100% ингибирование через 6 часов и 1 день после введения мАт, 11–8A1/человеческое IgG4 химерное мАт, но не AFD/человеческое IgG4 химерное мАт, вызвало больше чем 75% ингибирование активности AP комплемента в день 6–15.Figure 21 shows the results of exemplary experiments evaluating in vivo activity of chimeric mAb 11-8A1 and chimeric AFD in human factor D knockout mice. To evaluate the efficacy of 11-8A1/human IgG4 chimeric mAb and AFD/human IgG4 chimeric mAb in blocking complement alternative pathway (AP) activity in vivo , Factor D humanized mice were subjected to multiple doses (1 mg/mouse, every 3 days, s/c introduction). Plasma samples were collected prior to mAb administration (time 0) and 6 hours, 1, 3, 6, 9, 12, and 15 days after mAb administration and examined for LPS-induced complement AP activity. Complement AP activity at various time points normalized to 100% of values obtained at
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к ингибированию альтернативного пути (AP) комплемента с применением антитела против фактора D. В различных вариантах осуществления изобретение направлено на композиции и способы лечения AP–опосредованного заболевания или AP–опосредованного нарушения у пациента путем контакта пациента с антителом против фактора D. AP–опосредованные патологии и состояния, которые можно лечить с применением композиций и способов согласно изобретению, включают, без ограничения перечисленными, макулодистрофию (МД), возрастную макулодистрофию (ВМД), ишемическое и реперфузионное повреждение, артрит, ревматоидный артрит, астму, аллергическую астму, синдром пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ), атипичный гемолитико–уремический синдром (аГУС), буллезный эпидермолиз, сепсис, трансплантацию органа, воспаление (в том числе, без ограничения перечисленным, воспаление, связанное с хирургической операцией в условиях искусственного кровообращения и гемодиализом), C3 гломерулопатию, мембранозную нефропатию, гломерулонефрит (в том числе, без ограничения перечисленным, опосредованный антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (АНЦА) гломерулонефрит, волчанку и их комбинации), АНЦА–опосредованный васкулит, шигатоксин–индуцированный ГУС и вызванное антифосфолипидными антителами невынашивание или любые их комбинации.The present invention relates to complement alternative pathway (AP) inhibition using an anti-factor D antibody. In various embodiments, the invention is directed to compositions and methods for treating an AP-mediated disease or an AP-mediated disorder in a patient by exposing the patient to an anti-factor D antibody. AP mediated pathologies and conditions that may be treated using the compositions and methods of the invention include, but are not limited to, macular degeneration (MD), age-related macular degeneration (AMD), ischemia and reperfusion injury, arthritis, rheumatoid arthritis, asthma, allergic asthma, syndrome paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH), atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS), epidermolysis bullosa, sepsis, organ transplantation, inflammation (including, but not limited to, inflammation associated with cardiopulmonary bypass surgery and hemodialysis), C3 glomerulopathy , membranous nephropathy, glomerulonephritis (including, but not limited to, antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-mediated glomerulonephritis, lupus, and combinations thereof), ANCA-mediated vasculitis, shigatoxin-induced HUS, and antiphospholipid antibody-induced miscarriage, or any combination thereof.
ОпределенияDefinitions
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, которое обычно известно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя любые материалы и методы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут использоваться при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, описаны иллюстративные материалы и методы.Unless otherwise indicated, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as generally known to a person skilled in the art to which the present invention pertains. While any materials and methods similar or equivalent to those described herein may be used in the practice or testing of the present invention, illustrative materials and methods are described.
При использовании в настоящем документе каждый из следующих терминов имеет значение, связанное с ним в данном разделе.As used in this document, each of the following terms has the meaning associated with it in this section.
Термины "ингибировать" и "ингибирование" при использовании в настоящем документе означают снижать, подавлять, уменьшать или блокировать активность или функцию по меньшей мере приблизительно на 10% относительно контрольного значения. В некоторых вариантах осуществления активность подавлена или блокирована на 50% по сравнению с контрольным значением или на 75%, или на 95%.The terms "inhibit" and "inhibition" as used herein means to reduce, suppress, reduce or block an activity or function by at least about 10% relative to a control value. In some embodiments, the activity is suppressed or blocked by 50% compared to the control value, or by 75% or 95%.
Термины "эффективное количество" и "фармацевтически эффективное количество" относятся к достаточному количеству средства, которое обеспечивает требуемый биологический результат. Такой результат может являться снижением и/или облегчением признаков, симптомов или причин заболевания или нарушения или любым другим требуемым изменением в биологической системе. Подходящее эффективное количество в любом отдельном случае может быть определено средним специалистом в данной области при использовании стандартных экспериментов.The terms "effective amount" and "pharmaceutically effective amount" refer to a sufficient amount of an agent that provides the desired biological result. Such an outcome may be a reduction and/or alleviation of the signs, symptoms, or causes of a disease or disorder, or any other desired change in the biological system. A suitable effective amount in any particular case can be determined by one of ordinary skill in the art using standard experimentation.
Термины "пациент", "индивид", "лицо" и тому подобное используются в настоящем документе попеременно и относятся к любому животному, в некоторых вариантах осуществления млекопитающему, и в некоторых вариантах осуществления человеку, имеющему систему комплемента, в том числе человеку, нуждающемуся в терапии состояния или его последствий или подверженному состоянию или его последствиям. Пациент может включать, например, собак, кошек, свиней, коров, овец, коз, лошадей, крыс, обезьян, а также мышей и людей.The terms "patient", "individual", "person", and the like are used interchangeably herein and refer to any animal, in some embodiments, a mammal, and in some embodiments, a human having a complement system, including a human in need of therapy of the condition or its consequences or the affected condition or its consequences. The patient may include, for example, dogs, cats, pigs, cows, sheep, goats, horses, rats, monkeys, as well as mice and humans.
Термин "отклоняющийся от нормы" при использовании в отношении организмов, тканей, клеток или их компонентов относится к таким организмам, тканям, клеткам или их компонентам, которые отличаются по меньшей мере одной заметной или поддающейся обнаружению характеристикой (например, возрастом, лечением, временем суток и т.д.) от тех организмов, тканей, клеток или их компонентов, которые демонстрируют "нормальную" (ожидаемую/гомеостатическую) соответствующую характеристику. Характеристики, которые являются нормальными или предполагаемыми для одной клетки, типа ткани или индивида, могут быть отклоняющимися от нормы для другой клетки или типа ткани.The term "abnormal" when used in relation to organisms, tissues, cells, or components thereof, refers to those organisms, tissues, cells, or components thereof that differ in at least one observable or detectable characteristic (e.g., age, treatment, time of day etc.) from those organisms, tissues, cells or components thereof that exhibit a "normal" (expected/homeostatic) characteristic. Characteristics that are normal or expected for one cell, tissue type, or individual may be abnormal for another cell or tissue type.
"Заболевание" является состоянием здоровья индивида, когда индивид не может поддерживать гомеостаз, и если заболевание не устраняется, то тогда состояние здоровья индивида продолжает ухудшаться.A "disease" is a state of health of an individual where the individual cannot maintain homeostasis, and if the disease is not eliminated, then the individual's health continues to deteriorate.
В отличие от этого, "нарушение" у индивида является состоянием здоровья, при котором индивид способен поддерживать гомеостаз, но при котором состояние здоровья индивида менее благоприятное, нежели в отсутствие нарушения. Без лечения нарушение не обязательно приводит к дальнейшему ухудшению состояния здоровья индивида.In contrast, a "disorder" in an individual is a state of health in which the individual is able to maintain homeostasis, but in which the individual's health is less favorable than in the absence of the impairment. Without treatment, the disorder does not necessarily lead to further deterioration in the health of the individual.
Заболевание или нарушение "облегчаются", если тяжесть признака или симптома заболевания или нарушения, частота, с которой такой признак или симптом возникают у пациента, или и то, и другое, уменьшаются.The disease or disorder is "ameliorated" if the severity of the sign or symptom of the disease or disorder, the frequency with which that sign or symptom occurs in the patient, or both, is reduced.
"Эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" соединения является таким количеством соединения, которое достаточно, чтобы произвести благоприятный эффект у индивида, которому вводят соединение.An "effective amount" or "therapeutically effective amount" of a compound is that amount of a compound that is sufficient to produce a beneficial effect in the individual to whom the compound is administered.
При использовании в настоящем документе "инструкционный материал" включает публикацию, запись, диаграмму или любое другое средство выражения, которое может использоваться для описания полезности соединения, композиции, вектора или системы доставки согласно изобретению, в наборе для облегчения различных заболеваний или нарушений, указанных в настоящем документе. Необязательно или альтернативно инструкционный материал может описывать один или более способов облегчения заболеваний или нарушений в клетке или ткани млекопитающего. Инструкционный материал в наборе согласно изобретению может, например, быть прикреплен к контейнеру, который содержит идентифицированное соединение, композицию, вектор или систему доставки согласно изобретению, или отправлен вместе с контейнером, который содержит идентифицированное соединение, композицию, вектор или систему доставки. В альтернативе инструкционный материал может быть отправлен отдельно от контейнера с намерением, чтобы инструкционный материал и соединение применялись реципиентом совместно.As used herein, "instruction material" includes a publication, record, chart, or any other means of expression that can be used to describe the usefulness of a compound, composition, vector, or delivery system of the invention in a kit for alleviating various diseases or disorders referred to herein. document. Optionally or alternatively, the instructional material may describe one or more methods of alleviating diseases or disorders in a mammalian cell or tissue. The instructional material in a kit according to the invention may, for example, be attached to a container that contains an identified compound, composition, vector, or delivery system of the invention, or shipped with a container that contains an identified compound, composition, vector, or delivery system. Alternatively, the instructional material may be shipped separately from the container, with the intent that the instructional material and the connection be used together by the recipient.
"Функционально связанный" при использовании в настоящем документе может означать, что экспрессия гена находится под контролем промотора, с которым он пространственно связан. Промотор может быть расположен 5' (перед) или 3' (после) гена, находящегося под его контролем. Расстояние между промотором и геном может быть приблизительно таким же, как расстояние между этим промотором и геном, который он контролирует в гене, из которого происходит промотор. Как известно в данной области техники, изменение этого расстояния может быть выполнено без потери функции промотора."Operably linked" as used herein may mean that the expression of a gene is under the control of the promoter to which it is spatially linked. The promoter can be located 5' (before) or 3' (after) the gene under its control. The distance between a promoter and a gene may be approximately the same as the distance between that promoter and the gene it controls in the gene from which the promoter is derived. As is known in the art, changing this distance can be done without loss of promoter function.
"Терапевтическое лечение" является лечением, назначаемым индивиду, который демонстрирует симптомы заболевания или нарушения, с целью уменьшения или устранения таких признаков."Therapeutic treatment" is a treatment administered to an individual who exhibits symptoms of a disease or disorder, with the aim of reducing or eliminating such symptoms.
При использовании в настоящем документе "лечение заболевания или нарушения" означает уменьшение частоты и/или тяжести признака и/или симптома заболевания или нарушения, испытываемого пациентом.As used herein, "treating a disease or disorder" means reducing the frequency and/or severity of a sign and/or symptom of a disease or disorder experienced by a patient.
Фраза "биологический образец", "образец" или "проба" при использовании в настоящем документе включает любой образец, содержащий клетку, ткань или физиологическую жидкость, в которой может быть обнаружена экспрессия нуклеиновой кислоты или полипептида. Биологический образец может содержать любой биологический материал, подходящий для обнаружения требуемых биомаркеров, и может содержать клеточный и/или бесклеточный материал, полученный от пациента. Примеры таких биологических образцов включают, без ограничения, кровь, лимфу, костный мозг, биоптат и мазки. Образцы, которые по своей природе являются жидкими, именуются в настоящем документе "биологическими жидкостями". Биологические образцы могут быть получены от пациента различными способами, в том числе, например, путем соскоба или смазывания участка, или с помощью иглы, для получения физиологических жидкостей. Способы взятия различных проб у пациента хорошо известны в данной области.The phrase "biological sample", "sample" or "sample" as used herein includes any sample containing a cell, tissue, or bodily fluid in which expression of a nucleic acid or polypeptide can be detected. The biological sample may contain any biological material suitable for the detection of the desired biomarkers and may contain cellular and/or acellular material obtained from the patient. Examples of such biological samples include, without limitation, blood, lymph, bone marrow, biopsy, and swabs. Samples that are liquid in nature are referred to herein as "biological fluids". Biological samples can be obtained from the patient in various ways, including, for example, by scraping or smearing the site, or using a needle to obtain bodily fluids. Methods for taking various samples from a patient are well known in the art.
Термин "антитело" при использовании в настоящем документе относится к молекуле иммуноглобулина, которая способна специфично связываться с определенным эпитопом антигена. Антитела могут быть интактными иммуноглобулинами, полученными из природных источников или из рекомбинантных источников, и могут быть иммунореактивными частями интактных иммуноглобулинов. Антитела в настоящем изобретении могут существовать во множестве форм, включающих, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, внутриклеточные антитела ("интратела"), Fv, Fab, Fab', F(ab)2 и F(ab')2, а также одноцепочечные антитела (scFv), антитела из тяжелых цепей, такие как антитела верблюдовых, и гуманизированные антитела (Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879–5883; Bird et al., 1988, Science 242:423–426).The term "antibody" as used herein refers to an immunoglobulin molecule that is capable of specifically binding to a particular antigen epitope. The antibodies may be intact immunoglobulins derived from natural sources or from recombinant sources, and may be immunoreactive portions of intact immunoglobulins. The antibodies of the present invention may exist in a variety of forms, including, for example, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, intracellular antibodies ("intrabodies"), Fv, Fab, Fab', F(ab) 2 and F(ab') 2 , and single chain antibodies (scFv), heavy chain antibodies such as camelid antibodies, and humanized antibodies (Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879–5883; Bird et al., 1988, Science 242:423–426).
Под термином "синтетическое антитело" при использовании в настоящем документе подразумевается антитело, которое получено при использовании технологии рекомбинантных ДНК, такое как, например, антитело, экспрессируемое бактериофагом. Также следует понимать, что данный термин означает антитело, которое было получено в результате синтеза молекулы ДНК, кодирующей антитело, при этом такая молекула ДНК экспрессирует белок антитела или аминокислотную последовательность, определяющую антитело, где последовательность ДНК или аминокислоты была получена при использовании технологии синтетических последовательностей ДНК или аминокислотных последовательностей, которая доступна и хорошо известна в уровне техники.The term "synthetic antibody" as used herein means an antibody that is produced using recombinant DNA technology, such as, for example, an antibody expressed by a bacteriophage. It should also be understood that this term means an antibody that was obtained as a result of the synthesis of a DNA molecule encoding an antibody, while such a DNA molecule expresses an antibody protein or an amino acid sequence that defines an antibody, where the DNA or amino acid sequence was obtained using synthetic DNA sequence technology or amino acid sequences that are available and well known in the art.
При использовании в настоящем документе термин "антитело из тяжелых цепей" или "антитела из тяжелых цепей" включает молекулы иммуноглобулинов, полученные из видов верблюдовых или путем иммунизации пептидом и последующего выделения сыворотки, или путем клонирования и экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих такие антитела. Термин "антитело из тяжелых цепей" или "антитела из тяжелых цепей" также охватывает молекулы иммуноглобулинов, выделенные у индивида с болезнью тяжелых цепей или полученные при клонировании и экспрессии генов VH (вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулинов) индивида.As used herein, the term "heavy chain antibody" or "heavy chain antibodies" includes immunoglobulin molecules derived from camelid species, either by immunization with a peptide and subsequent serum isolation, or by cloning and expression of nucleic acid sequences encoding such antibodies. The term "heavy chain antibody" or "heavy chain antibodies" also encompasses immunoglobulin molecules isolated from an individual with heavy chain disease or obtained by cloning and expression of the VH (immunoglobulin heavy chain variable region) genes of the individual.
"Химерное антитело" относится к типу сконструированного антитела, которое содержит природную вариабельную область (легкую цепь и тяжелые цепи), полученную из донорного антитела, в сочетании с константными областями легкой и тяжелой цепи, полученными из акцепторного антитела.A "chimeric antibody" refers to a type of engineered antibody that contains a native variable region (light chain and heavy chains) derived from a donor antibody in combination with light and heavy chain constant regions derived from an acceptor antibody.
"Гуманизированное антитело" относится к типу сконструированного антитела, CDR–области которого получены из нечеловеческого донорного иммуноглобулина, а остальные части молекулы иммуноглобулина получены из одного или более иммуноглобулинов человека. Кроме того, остатки каркасной области могут быть изменены с сохранением аффинности связывания (см., например, 1989, Queen et al., Proc. Natl. Acad Sci USA, 86:10029–10032; 1991, Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421). Подходящее человеческое акцепторное антитело может быть антителом, которое выбрано из общедоступной базы данных, например, из базы данных KABAT, базы данных Los Alamos и базы данных Swiss Protein, по гомологии с нуклеотидной и аминокислотной последовательностями донорного антитела. Антитело человека, отличающееся гомологией с каркасными областями донорного антитела (на основе аминокислот), может подходить для получения константной области тяжелой цепи и/или вариабельной области тяжелой цепи для вставки донорных CDR–областей. Подходящее акцепторное антитело, способное давать константные или вариабельные каркасные области легкой цепи, может быть выбрано аналогичным образом. Следует отметить, что тяжелые и легкие цепи акцепторного антитела не должны обязательно происходить из одного и того же акцепторного антитела. В предшествующем уровне техники описано несколько способов получения таких гуманизированных антител (см., например, EP–A–0239400 и EP–A–054951)."Humanized antibody" refers to a type of engineered antibody whose CDR regions are derived from a non-human donor immunoglobulin and the remaining parts of the immunoglobulin molecule are derived from one or more human immunoglobulins. In addition, framework residues can be altered while maintaining binding affinity (see, e.g., 1989, Queen et al., Proc. Natl. Acad Sci USA, 86:10029-10032; 1991, Hodgson et al., Bio/Technology 9:421). A suitable human acceptor antibody can be an antibody that is selected from a public database, such as the KABAT database, the Los Alamos database, and the Swiss Protein database, for homology with the nucleotide and amino acid sequences of the donor antibody. A human antibody that shares homology with the framework regions of the donor antibody (based on amino acids) may be suitable for obtaining a heavy chain constant region and/or a heavy chain variable region for insertion of donor CDR regions. A suitable acceptor antibody capable of conferring light chain constant or variable framework regions may be selected in a similar manner. It should be noted that the heavy and light chains of an acceptor antibody need not be derived from the same acceptor antibody. The prior art describes several methods for making such humanized antibodies (see, for example, EP-A-0239400 and EP-A-054951).
Термин "донорное антитело" относится к антителу (моноклональному и/или рекомбинантному), из которого аминокислотные последовательности его вариабельных областей, CDR–областей или других функциональных фрагментов или аналогов передают первому иммуноглобулину–партнеру, с получением измененной кодирующей области иммуноглобулина, и в результате экспрессируется измененное антитело с характеристиками антигенной специфичности и нейтрализирующей активности донорного антитела.The term "donor antibody" refers to an antibody (monoclonal and/or recombinant) from which the amino acid sequences of its variable regions, CDRs, or other functional fragments or analogs are donated to a first partner immunoglobulin to produce an altered immunoglobulin coding region, and as a result is expressed. an altered antibody with the characteristics of antigenic specificity and neutralizing activity of the donor antibody.
Термин "акцепторное антитело" относится к антителу (моноклональному и/или рекомбинантному), гетерологичному по отношению к донорному антителу, из которого все (или любую часть, но в некоторых вариантах осуществления все) аминокислотные последовательности, кодирующие его каркасные области тяжелой и/или легкой цепи, и/или его константные области тяжелой и/или легкой цепи передают первому иммуноглобулину–партнеру. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело является акцепторным антителом.The term "acceptor antibody" refers to an antibody (monoclonal and/or recombinant) heterologous to a donor antibody, of which all (or any portion, but in some embodiments all) of the amino acid sequences encoding its heavy and/or light framework regions chain, and/or its heavy and/or light chain constant regions are transferred to the first partner immunoglobulin. In some embodiments, the human antibody is an acceptor antibody.
"CDR–области" определяют как определяющие комплементарность области аминокислотных последовательностей антитела, которые представляют собой гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. См., например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). В вариабельной части иммуноглобулина содержатся три CDR (или CDR–области) тяжелой цепи и три CDR легкой цепи. Таким образом, термин "CDR" при использовании в настоящем документе относится ко всем трем CDR–областям тяжелой цепи или всем трем CDR–областям легкой цепи (или ко всем CDR тяжелой цепи и ко всем CDR легкой цепи, при необходимости). Структура и укладывание антитела могут означать, что другие остатки считаются частью антигенсвязывающей области и будут известны специалисту в данной области. См., например, Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877–883."CDR-regions" are defined as the complementarity-determining regions of the amino acid sequences of an antibody, which are the hypervariable regions of the immunoglobulin heavy and light chains. See, for example, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). The variable portion of an immunoglobulin contains three heavy chain CDRs (or CDR regions) and three light chain CDRs. Thus, the term "CDR" as used herein refers to all three heavy chain CDR regions or all three light chain CDR regions (or all heavy chain CDRs and all light chain CDRs, if appropriate). The structure and folding of an antibody may mean that other residues are considered part of the antigen-binding region and will be known to one of skill in the art. See, for example, Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, pp 877–883.
При использовании в настоящем документе "иммуноанализ" относится к любому анализу связывания, в котором антитело, способное специфично связываться с молекулой–мишенью, используется для обнаружения и количественного определения молекулы–мишени.As used herein, "immunoassay" refers to any binding assay in which an antibody capable of specifically binding to a target molecule is used to detect and quantify the target molecule.
Под термином "специфично связывается", при использовании в настоящем документе в отношении антитела, подразумевается антитело, которое распознает и связывается с определенной молекулой–мишенью, но по существу не распознает или не связывает другие молекулы в образце. В некоторых случаях термины "специфичное связывание" или "специфично связывающий" используются для обозначения, что распознавание и связывание зависят от присутствия конкретной структуры (например, антигенной детерминанты или эпитопа) на молекуле–мишени. Если, например, антитело специфично связывается с эпитопом "A", присутствие немеченой молекулы, содержащей эпитоп A (или свободный, немеченый A) в реакции, содержащей меченый "A" и антитело, будет уменьшать количество меченого "A", связавшегося с антителом.By "specifically binds", as used herein in relation to an antibody, is meant an antibody that recognizes and binds to a particular target molecule, but does not substantially recognize or bind other molecules in the sample. In some instances, the terms "specific binding" or "specific binding" are used to mean that recognition and binding depend on the presence of a particular structure (eg, antigenic determinant or epitope) on the target molecule. If, for example, an antibody specifically binds to an "A" epitope, the presence of an unlabeled molecule containing an A epitope (or a free, unlabeled A) in a reaction containing a labeled "A" and an antibody will reduce the amount of labeled "A" bound to the antibody.
Система "CRISPR/Cas" относится к широко распространенному классу бактериальных систем для защиты против чужеродной нуклеиновой кислоты. Системы CRISPR/Cas обнаружены в целом ряде эубактерий и архей. Системы CRISPR/Cas включают I, II и III подтипы. В природных системах CRISPR/Cas II типа используется РНК–опосредованная нуклеаза, Cas9, в комплексе с направляющей и активирующей РНК, для распознавания и расщепления чужеродной нуклеиновой кислоты. Гомологи Cas9 обнаружены в большом разнообразии эубактерий, включающих, без ограничения, бактерий следующих таксономических групп: Actinobacteria, Aquificae, Bacteroidetes–Chlorobi, Chlamydiae–Verrucomicrobia, Chlroflexi, Cyanobacteria, Firmicutes, Proteobacteria, Spirochaetes и Thermotogae. Примером белка Cas9 является белок Cas9 Streptococcus pyogenes. Дополнительные белки Cas9 и их гомологи описаны, например, в публикациях Chylinksi, et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10(5):726–737; Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6):467–477; Hou, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24; 110(39):15644–9; Sampson et al., Nature. 2013 May 9; 497(7448):254–7; и Jinek, et al., Science. 2012 Aug 17; 337(6096):816–21.The "CRISPR/Cas" system belongs to a widespread class of bacterial systems for protection against foreign nucleic acid. CRISPR/Cas systems have been found in a number of eubacteria and archaea. CRISPR/Cas systems include I, II and III subtypes. Natural CRISPR/Cas type II systems use an RNA-mediated nuclease, Cas9, in combination with guide and activating RNA to recognize and cleave foreign nucleic acid. Cas9 homologues are found in a wide variety of eubacteria, including but not limited to bacteria from the following taxonomic groups: Actinobacteria , Aquificae , Bacteroidetes - Chlorobi , Chlamydiae - Verrucomicrobia , Chlroflexi , Cyanobacteria , Firmicutes , Proteobacteria , Spirochaetes and Thermotogae . An example of a Cas9 protein is the Cas9 protein of Streptococcus pyogenes . Additional Cas9 proteins and their homologues are described, for example, in Chylinksi, et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10(5):726–737; Nat. Rev. microbiol. June 2011; 9(6):467–477; Hou, et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2013
"Кодирующая область" гена состоит из нуклеотидных остатков кодирующей цепи гена и нуклеотидов некодирующей цепи гена, которые являются гомологичными или комплементарными, соответственно, кодирующей области молекулы мРНК, которая образуется в результате транскрипции гена.The "coding region" of a gene consists of nucleotide residues of the coding strand of the gene and nucleotides of the non-coding strand of the gene that are homologous or complementary, respectively, to the coding region of the mRNA molecule that results from the transcription of the gene.
"Кодирующая область" молекулы мРНК также состоит из нуклеотидных остатков молекулы мРНК, которые совпадают с антикодоновой областью молекулы транспортной РНК в ходе трансляции молекулы мРНК или кодируют стоп–кодон. Кодирующая область, таким образом, может включать нуклеотидные остатки, включающие кодоны аминокислотных остатков, которые не присутствуют в зрелом белке, кодируемом молекулой мРНК (например, аминокислотных остатков в сигнальной последовательности экспорта белка).The "coding region" of the mRNA molecule also consists of nucleotide residues of the mRNA molecule that coincide with the anticodon region of the transfer RNA molecule during translation of the mRNA molecule or encode a stop codon. The coding region thus may include nucleotide residues including codons of amino acid residues that are not present in the mature protein encoded by the mRNA molecule (eg, amino acid residues in the protein export signal sequence).
"Дифференциально сниженная экспрессия" или "ингибирование" относятся к уровням продукта биомаркера, которые ниже по меньшей мере на 10% или больше, например, на 20%, 30%, 40% или 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или меньше, и/или ниже в 2,0 раза, 1,8 раза, 1,6 раза, 1,4 раза, 1,2 раза, 1,1 раза, или меньше, включая все возможные целые или дробные приращения между указанными значениями, по сравнению с контролем."Differentially reduced expression" or "inhibition" refers to levels of a biomarker product that are at least 10% lower or greater, such as 20%, 30%, 40%, or 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or less, and/or less than 2.0 times, 1.8 times, 1.6 times, 1.4 times, 1.2 times, 1.1 times, or less, including all possible integer or fractional increments between the indicated values, compared with the control.
"Дифференциально повышенная экспрессия" или "активация" относятся к уровням продукта биомаркера, которые выше по меньшей мере на 10% или больше, например, на 20%, 30%, 40% или 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше, и/или выше в 1,1 раза, 1,2 раза, 1,4 раза, 1,6 раза, 1,8 раза, 2,0 раза или больше, включая все возможные целые или дробные приращения между указанными значениями, по сравнению с контролем."Differentially overexpressed" or "activated" refers to levels of a biomarker product that are at least 10% higher or greater, such as 20%, 30%, 40%, or 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or more, and/or 1.1 times, 1.2 times, 1.4 times, 1.6 times, 1.8 times, 2.0 times or more, including all possible integer or fractional increments between indicated values compared to control.
"Комплементарный", при использовании в настоящем документе в отношении нуклеиновой кислоты, относится к широкой концепции комплементарности последовательностей между областями двух цепей нуклеиновой кислоты или между двумя областями одной и той же цепи нуклеиновой кислоты. Известно, что остаток аденина первой области нуклеиновой кислоты способен образовывать специфические водородные связи ("спаривание оснований") с остатком второй области нуклеиновой кислоты, которая антипараллельна первой области, если таким остатком является тимин или урацил. Аналогичным образом, известно, что остаток цитозина первой цепи нуклеиновой кислоты способен образовывать пару оснований с остатком второй цепи нуклеиновой кислоты, которая антипараллельна первой цепи, если таким остатком является гуанин. Первая область нуклеиновой кислоты комплементарна второй области той же или другой нуклеиновой кислоты, если в том случае, когда две области расположены антипараллельно, по меньшей мере один нуклеотидный остаток первой области способен образовывать пару оснований с остатком второй области. В некоторых вариантах осуществления первая область содержит первую часть, а вторая область содержит вторую часть, при этом, когда первая и вторая части расположены антипараллельно, по меньшей мере приблизительно 50% или по меньшей мере приблизительно 75%, или по меньшей мере приблизительно 90%, или по меньшей мере приблизительно 95% нуклеотидных остатков первой части способны образовывать пару оснований с нуклеотидными остатками во второй части. В некоторых вариантах осуществления все нуклеотидные остатки первой части способны образовывать пару оснований с нуклеотидными остатками во второй части."Complementary", as used herein in relation to a nucleic acid, refers to the broad concept of sequence complementarity between regions of two nucleic acid strands or between two regions of the same nucleic acid strand. It is known that the adenine residue of the first region of the nucleic acid is able to form specific hydrogen bonds ("base pairing") with the remainder of the second region of the nucleic acid, which is antiparallel to the first region, if such a residue is thymine or uracil. Similarly, it is known that a cytosine residue of a first nucleic acid strand is capable of base pairing with a second nucleic acid strand residue that is antiparallel to the first strand if such a residue is guanine. A first region of a nucleic acid is complementary to a second region of the same or a different nucleic acid if, when the two regions are antiparallel, at least one nucleotide residue of the first region is capable of base pairing with the remainder of the second region. In some embodiments, the first region comprises a first portion and the second region comprises a second portion, wherein when the first and second portions are anti-parallel at least about 50%, or at least about 75%, or at least about 90%, or at least about 95% of the nucleotide residues in the first part are capable of base pairing with nucleotide residues in the second part. In some embodiments, all nucleotide residues in the first part are capable of base pairing with nucleotide residues in the second part.
Термин "ДНК" при использовании в настоящем документе определен как дезоксирибонуклеиновая кислота.The term "DNA" as used herein is defined as deoxyribonucleic acid.
"Кодирующий" относится к неотъемлемому свойству определенных последовательностей нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК, служить в качестве матрицы для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющих либо определенную последовательность нуклеотидов (т.е. рРНК, тРНК и мРНК), либо определенную последовательность аминокислот, и в результате обладающих определенными биологическими свойствами. Таким образом, ген кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, соответствующей такому гену, приводят к образованию белка в клетке или другой биологической системе. Как кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно представлена в списках последовательностей, так и некодирующая цепь, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, могут быть указаны как кодирующие белок или другой продукт этого гена, или кДНК."Coding" refers to the inherent property of certain nucleotide sequences in a polynucleotide, such as a gene, cDNA, or mRNA, to serve as a template for the synthesis of other polymers and macromolecules in biological processes having either a specific nucleotide sequence (i.e., rRNA, tRNA, and mRNA ), or a certain sequence of amino acids, and as a result having certain biological properties. Thus, a gene encodes a protein if the transcription and translation of the mRNA corresponding to such a gene results in the formation of a protein in a cell or other biological system. Both a coding strand, the nucleotide sequence of which is identical to an mRNA sequence and usually presented in sequence listings, and a non-coding strand used as a template for transcription of a gene or cDNA can be listed as encoding a protein or other product of that gene, or cDNA.
Если не определено иное, "нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность" включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Фраза "нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок или РНК" также может включать интроны в такой степени, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может, в некотором варианте, содержать интрон(ы).Unless otherwise specified, "nucleotide sequence encoding an amino acid sequence" includes all nucleotide sequences that are degenerate variants of each other and that encode the same amino acid sequence. The phrase "a nucleotide sequence that codes for a protein or RNA" may also include introns, to the extent that a nucleotide sequence that codes for a protein may, in some embodiment, contain intron(s).
"Выделенный" означает измененный или удаленный из естественного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, обычно присутствующие в нормальных условиях в организме живого индивида, не являются "выделенными", но при этом та же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от сопутствующих материалов своего природного окружения, являются "выделенными". Выделенная нуклеиновая кислота или белок могут существовать по существу в очищенной форме или могут существовать в ненативном окружении, таком как, например, клетка–хозяин."Isolated" means altered or removed from its natural state. For example, a nucleic acid or peptide normally found under normal conditions in the body of a living individual is not "isolated", but the same nucleic acid or peptide, partially or completely separated from the accompanying materials of its natural environment, is "isolated". An isolated nucleic acid or protein may exist in a substantially purified form, or may exist in a non-native environment such as, for example, a host cell.
Термин "гибридома" при использовании в настоящем документе относится к клетке, полученной в результате слияния B–лимфоцита и партнера по слиянию, такого как миеломная клетка. Гибридому можно клонировать и поддерживать в клеточной культуре в течение неопределенного времени, при этом она способна продуцировать моноклональные антитела. Гибридому также можно считать гибридной клеткой.The term "hybridoma" as used herein refers to a cell resulting from the fusion of a B-lymphocyte and a fusion partner such as a myeloma cell. The hybridoma can be cloned and maintained in cell culture indefinitely and is capable of producing monoclonal antibodies. A hybridoma can also be considered a hybrid cell.
"Выделенная нуклеиновая кислота" относится к сегменту или фрагменту нуклеиновой кислоты, который был отделен от последовательностей, которые фланкируют его в естественном состоянии, т.е. фрагменту ДНК, который был удален из последовательностей, которые обычно граничат с фрагментом, т.е. последовательностей, граничащих с фрагментом в геноме, в котором он существует в естественном состоянии. Термин также относится к нуклеиновым кислотам, которые были по существу очищены от других компонентов, которые обычно сопутствуют нуклеиновой кислоте, т.е. РНК или ДНК, или белки, которые обычно сопутствуют ей в клетке. Данный термин, таким образом, включает, например, рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариота или эукариота, или которая существует как отдельная молекула (т.е. как кДНК или геномный фрагмент, или фрагмент кДНК, полученный с помощью ПЦР или при расщеплении эндонуклеазами рестрикции), независимо от других последовательностей. Он также включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительную полипептидную последовательность."Isolated nucleic acid" refers to a nucleic acid segment or fragment that has been separated from the sequences that flank it in its natural state, i.e. a DNA fragment that has been removed from sequences that normally border the fragment, ie. sequences bordering the fragment in the genome in which it exists in its natural state. The term also refers to nucleic acids that have been substantially purified from other components that normally accompany the nucleic acid, ie. RNA or DNA, or proteins that normally accompany it in a cell. The term thus includes, for example, recombinant DNA which is incorporated into a vector, into an autonomously replicating plasmid or virus, or into prokaryotic or eukaryotic genomic DNA, or which exists as a single molecule (i.e. as a cDNA or genomic fragment, or a cDNA fragment obtained by PCR or restriction endonuclease digestion), regardless of other sequences. It also includes recombinant DNA, which is part of a hybrid gene encoding an additional polypeptide sequence.
В рамках данного изобретения используются следующие сокращения для обычных оснований нуклеиновых кислот. "А" соответствует аденозину, "C" соответствует цитозину, "G" соответствует гуанозину, "T" соответствует тимидину, и "U" соответствует уридину.Within the scope of this invention, the following abbreviations are used for conventional nucleic acid bases. "A" corresponds to adenosine, "C" corresponds to cytosine, "G" corresponds to guanosine, "T" corresponds to thymidine, and "U" corresponds to uridine.
Термин "полинуклеотид" при использовании в настоящем документе определен как цепь нуклеотидов. Кроме того, нуклеиновые кислоты являются полимерами нуклеотидов. Таким образом, нуклеиновые кислоты и полинуклеотиды при использовании в настоящем документе являются взаимозаменяемыми. Специалисту в данной области известно, что нуклеиновые кислоты являются полинуклеотидами, которые могут быть гидролизованы до мономерных "нуклеотидов". Мономерные нуклеотиды могут быть гидролизованы до нуклеозидов. Используемые в настоящем документе полинуклеотиды включают, без ограничения перечисленными, все последовательности нуклеиновых кислот, которые получены любыми способами, доступными в уровне техники, в том числе, без ограничения, рекомбинантными способами, то есть при клонировании последовательностей нуклеиновых кислот из рекомбинантной библиотеки или генома клетки с применением обычной технологии клонирования и ПЦР и тому подобное, а также с помощью методов синтеза.The term "polynucleotide" as used herein is defined as a chain of nucleotides. In addition, nucleic acids are polymers of nucleotides. Thus, nucleic acids and polynucleotides are used interchangeably herein. The person skilled in the art will recognize that nucleic acids are polynucleotides that can be hydrolyzed to monomeric "nucleotides". Monomeric nucleotides can be hydrolyzed to nucleosides. The polynucleotides used herein include, without limitation, all nucleic acid sequences that are obtained by any methods available in the art, including, without limitation, recombinant methods, that is, by cloning nucleic acid sequences from a recombinant library or the genome of a cell with using conventional cloning technology and PCR and the like, as well as using synthetic methods.
При использовании в настоящем документе термины "пептид", "полипептид" и "белок" используются попеременно и относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должны содержать по меньшей мере две аминокислоты, при этом никакое ограничение не накладывается на максимальное количество аминокислот, которые может включать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, включающий две или более аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. При использовании в настоящем документе термин относится как к коротким цепям, которые также обычно называют в уровне техники пептидами, олигопептидами и олигомерами, например, так и к более длинным цепям, которые обычно называют в уровне техники белками, множество типов которых известно. "Полипептиды" включают, например, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитые белки и другие. Полипептиды включают природные пептиды, рекомбинантные пептиды, синтетические пептиды или их комбинацию.As used herein, the terms "peptide", "polypeptide" and "protein" are used interchangeably and refer to a compound consisting of amino acid residues covalently linked by peptide bonds. A protein or peptide must contain at least two amino acids, and no limitation is placed on the maximum number of amino acids that a protein or peptide sequence may contain. Polypeptides include any peptide or protein comprising two or more amino acids connected to each other by peptide bonds. As used herein, the term refers to both short chains, which are also commonly referred to in the art as peptides, oligopeptides, and oligomers, for example, and longer chains, which are commonly referred to in the art as proteins, of which many types are known. "Polypeptides" include, for example, biologically active fragments, substantially homologous polypeptides, oligopeptides, homodimers, heterodimers, polypeptide variants, modified polypeptides, derivatives, analogs, fusion proteins, and others. Polypeptides include natural peptides, recombinant peptides, synthetic peptides, or combinations thereof.
Термин "потомство" при использовании в настоящем документе относится к потомку или потомству и включает потомство млекопитающего, а также включает дифференцированную или недифференцированную дочернюю клетку, полученную из родительской клетки. В одном применении термин потомство относится к дочерней клетке, которая генетически идентична родителю. В другом применении термин потомство относится к дочерней клетке, которая генетически и фенотипически идентична родителю. В еще одном применении термин потомство относится к дочерней клетке, которая дифференцировалась из родительской клетки.The term "progeny" as used herein refers to a descendant or progeny and includes the offspring of a mammal, and also includes a differentiated or undifferentiated daughter cell derived from a parent cell. In one application, the term progeny refers to a daughter cell that is genetically identical to the parent. In another usage, the term progeny refers to a daughter cell that is genetically and phenotypically identical to the parent. In yet another application, the term progeny refers to a daughter cell that has differentiated from a parent cell.
Термин "РНК" при использовании в настоящем документе определен как рибонуклеиновая кислота.The term "RNA" as used herein is defined as ribonucleic acid.
Термин "рекомбинантная ДНК" при использовании в настоящем документе определен как ДНК, полученная в результате соединения фрагментов ДНК из разных источников.The term "recombinant DNA" as used herein is defined as DNA resulting from the combination of DNA fragments from different sources.
Термин "рекомбинантный полипептид" при использовании в настоящем документе определен как полипептид, полученный при помощи методов рекомбинантных ДНК.The term "recombinant polypeptide" as used herein is defined as a polypeptide obtained using recombinant DNA techniques.
При использовании в настоящем документе "конъюгированный" относится к ковалентному присоединению одной молекулы ко второй молекуле.As used herein, "conjugated" refers to the covalent attachment of one molecule to a second molecule.
"Вариант" в качестве термина, используемого в настоящем документе, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты или пептидную последовательность, которая отличается по последовательности от эталонной последовательности нуклеиновой кислоты или последовательности пептида соответственно, но сохраняет существенные биологические свойства эталонной молекулы. Изменения в последовательности варианта нуклеиновой кислоты могут не затрагивать аминокислотную последовательность пептида, кодируемую эталонной нуклеиновой кислотой, или могут приводить к аминокислотным заменам, вставкам, делециям, слияниям и усечениям. Изменения в последовательности вариантов пептидов обычно ограничены или являются консервативными, в результате последовательности эталонного пептида и варианта в целом очень похожи, а во многих областях идентичны. Вариант и эталонный пептид могут отличаться по аминокислотной последовательности одной или более заменами, вставками, делециями в любой комбинации. Вариант нуклеиновой кислоты или пептида может быть природным, таким как аллельный вариант, или может быть вариантом, который, как известно, не существует в природе. Не существующие в природе варианты нуклеиновых кислот и пептидов могут быть получены методами мутагенеза или путем прямого синтеза. В различных вариантах вариантная последовательность по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 85% идентична эталонной последовательности."Variant" as used herein is a nucleic acid sequence or peptide sequence that differs in sequence from a reference nucleic acid sequence or peptide sequence, respectively, but retains essential biological properties of the reference molecule. Changes in the sequence of a variant nucleic acid may not affect the amino acid sequence of the peptide encoded by the reference nucleic acid, or may result in amino acid substitutions, insertions, deletions, fusions, and truncations. Changes in the sequence of peptide variants are usually limited or conservative, resulting in the sequences of the reference peptide and the variant as a whole being very similar, and in many areas identical. The variant and the reference peptide may differ in amino acid sequence by one or more substitutions, insertions, deletions, in any combination. The nucleic acid or peptide variant may be naturally occurring, such as an allelic variant, or may be a variant not known to exist in nature. Variants of nucleic acids and peptides that do not exist in nature can be obtained by mutagenesis methods or by direct synthesis. In various embodiments, the variant sequence is at least 99%, at least 98%, at least 97%, at least 96%, at least 95%, at least 94%, at least 93%, at least 92%, at least 91%, at least 90%, at least 89%, at least 88%, at least 87%, at least 86%, at least 85% identical to the reference sequence.
Термин "регуляторный" при использовании в настоящем документе может означать любой способ изменения уровня или активности субстрата. Неограничивающие примеры регуляции в отношении белка включают в себя воздействие на экспрессию (включая транскрипцию и/или трансляцию), воздействие на укладывание, воздействие на деградацию или метаболизм белка и воздействие на локализацию белка. Неограничивающие примеры регуляции в отношении фермента дополнительно включают воздействие на ферментативную активность. "Регулятор" относится к молекуле, активность которой включает воздействие на уровень или активность субстрата. Регулятор может быть прямым или непрямым. Регулятор может функционировать, вызывая активацию или ингибирование или модуляцию своего субстрата иным образом.The term "regulatory" as used herein can refer to any method of altering the level or activity of a substrate. Non-limiting examples of protein regulation include effects on expression (including transcription and/or translation), effects on folding, effects on protein degradation or metabolism, and effects on protein localization. Non-limiting examples of enzyme regulation further include an effect on enzymatic activity. "Regulator" refers to a molecule whose activity includes affecting the level or activity of a substrate. The regulator can be direct or indirect. The regulator may function to cause activation or inhibition or otherwise modulate its substrate.
"Окно сканирования" при использовании в настоящем документе относится к сегменту ряда смежных положений, в которых последовательность может быть оценена независимо от какой–либо фланкирующей последовательности. Окно сканирования обычно перемещают с определенным шагом по оцениваемой последовательности, при этом каждый новый сегмент оценивают независимо. Шаг перемещения может включать 1 или больше одного положения."Scan window" as used herein refers to a segment of a number of contiguous positions at which a sequence can be estimated independently of any flanking sequence. The scan window is typically moved in increments along the sequence being evaluated, with each new segment being evaluated independently. A move step may include 1 or more than one position.
"Вектор" при использовании в настоящем документе может означать последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую точку начала репликации. Вектор может быть плазмидой, бактериофагом, бактериальной искусственной хромосомой или дрожжевой искусственной хромосомой. Вектор может быть ДНК или РНК вектором. Вектор может быть либо самореплицирующимся внехромосомным вектором, либо вектором, который интегрируется в геном хозяина."Vector" as used herein can mean a nucleic acid sequence containing an origin of replication. The vector may be a plasmid, a bacteriophage, a bacterial artificial chromosome, or a yeast artificial chromosome. The vector may be a DNA or RNA vector. The vector can either be a self-replicating extrachromosomal vector or a vector that integrates into the host's genome.
Термин "размножение" используется в настоящем документе для обозначения размножения биологического вида с получением в результате по меньшей мере одного потомка.The term "propagation" is used herein to refer to the propagation of a species resulting in at least one offspring.
Термин "естественное размножение" используется в настоящем документе для обозначения размножения биологического вида путем полового скрещивания.The term "natural reproduction" is used in this document to refer to the reproduction of a species by sexual interbreeding.
Термин "инбредное животное" используется в настоящем документе для обозначения животного, которое было скрещено с другими подобными животными того же вида для сохранения и закрепления некоторых признаков или для предотвращения введения других признаков в популяцию скрещиваемых особей.The term "inbred animal" is used herein to refer to an animal that has been crossed with other similar animals of the same species in order to retain and reinforce certain traits or to prevent the introduction of other traits into the population of crossed individuals.
Термин "аутбредное животное" используется в настоящем документе для обозначения животного, которое скрещивается с любым другим животным или индивидами тех же видов без учета сохранения некоторых признаков.The term "outbred animal" is used herein to refer to an animal that is crossed with any other animal or individuals of the same species without regard to the retention of certain traits.
Диапазоны: по всему тексту настоящего описания различные аспекты изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона предназначено лишь для удобства и краткости, и не должно считаться жестким ограничением объема изобретения. Таким образом, следует считать, что описание диапазона конкретно раскрывает все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в данном диапазоне. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, должно рассматриваться как прямо раскрытые поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 6 и т. д., а также отдельные числа в пределах данного диапазона, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. Это применимо независимо от ширины диапазона.Ranges: Throughout this specification, various aspects of the invention may be presented in range format. It should be understood that the description in range format is for convenience and brevity only, and should not be considered an inflexible limitation on the scope of the invention. Thus, the description of a range should be considered to specifically disclose all possible subranges as well as individual numerical values within the given range. For example, a description of a range such as 1 to 6 should be considered as expressly disclosed subranges such as 1 to 3, 1 to 4, 1 to 5, 2 to 4, 2 to 6, 3 to 6, and etc., as well as individual numbers within that range, such as 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, and 6. This applies regardless of the width of the range.
ОписаниеDescription
Данное изобретение относится к ингибированию альтернативного пути (АР) комплемента с применением антитела против фактора D человека. В одном из вариантов осуществления изобретение направлено на способы лечения и предотвращения воспаления и аутоиммунных заболеваний, опосредованных нежелательной, неконтролируемой, избыточной активацией АР комплемента. В одном из вариантов осуществления изобретение направлено на лечение AP–опосредованного заболевания или AP–опосредованного нарушения у пациента путем контакта пациента с антителом против фактора D.The present invention relates to the inhibition of the complement alternative pathway (AR) using an anti-human factor D antibody. In one embodiment, the invention is directed to methods for treating and preventing inflammation and autoimmune diseases mediated by unwanted, uncontrolled, excessive complement AR activation. In one embodiment, the invention is directed to treating an AP-mediated disease or AP-mediated disorder in a patient by exposing the patient to an anti-factor D antibody.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложен способ лечения AP–опосредованного заболевания или нарушения у пациента, включающий этап введения указанному пациенту антитела против фактора D с ингибированием, в результате, образования белкового комплекса C3bBb. Примеры опосредованных комплементом патологий, которые можно лечить с применением способов согласно изобретению, включают, без ограничения перечисленным, макулодистрофию (МД), возрастную макулодистрофию (ВМД), ишемическое и реперфузионное повреждение, артрит, ревматоидный артрит, астму, аллергическую астму, синдром пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ), атипичный гемолитико–уремический синдром (аГУС), буллезный эпидермолиз, сепсис, трансплантацию органа, воспаление (в том числе, без ограничения перечисленным, воспаление, связанное с хирургической операцией в условиях искусственного кровообращения и гемодиализом), C3 гломерулопатию, мембранозную нефропатию, гломерулонефрит (в том числе, без ограничения перечисленным, опосредованный антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (АНЦА) гломерулонефрит, волчанку и их комбинации), АНЦА–опосредованный васкулит, шигатоксин–индуцированный ГУС и вызванное антифосфолипидными антителами не вынашивание, а также их комбинации.In one embodiment, the invention provides a method of treating an AP-mediated disease or disorder in a patient, comprising the step of administering an anti-factor D antibody to said patient, thereby inhibiting the formation of the C3bBb protein complex. Examples of complement-mediated pathologies that can be treated using the methods of the invention include, but are not limited to, macular degeneration (MD), age-related macular degeneration (AMD), ischemic and reperfusion injury, arthritis, rheumatoid arthritis, asthma, allergic asthma, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria syndrome (PNH), atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS), epidermolysis bullosa, sepsis, organ transplantation, inflammation (including, but not limited to, inflammation associated with cardiopulmonary bypass surgery and hemodialysis), C3 glomerulopathy, membranous nephropathy , glomerulonephritis (including, but not limited to, antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-mediated glomerulonephritis, lupus, and combinations thereof), ANCA-mediated vasculitis, shigatoxin-induced HUS, and antiphospholipid antibody-induced miscarriage, as well as combinations thereof.
Способность иммунной системы различать "свои" и "чужие" антигены жизненно важна для функционирования иммунной системы как специфической защиты против проникших извне микроорганизмов. "Чужие" антигены являются антигенами на веществах, поступающих или присутствующих в организме, которые заметно отличаются от или являются чужеродными по отношению к собственным компонентам в организме индивида, тогда как "свои" антигены являются антигенами, которые у здорового индивида заметно не отличаются или не являются чужеродными по отношению к собственным компонентам его организма. В различных вариантах осуществления способов активация AP, которая ингибирована, является активацией, которая была инициирована по меньшей мере одним из группы, состоящей из микробного антигена, небиологической чужеродной поверхности, "измененной своей" ткани или их комбинаций. Одним из примеров небиологической чужеродной поверхности является кровопроводящие магистрали, такие как используемые в аппаратах искусственного кровообращения или гемодиализе. Примеры измененных своих тканей включают апоптотические, некротические и ишемизированные ткани и клетки или их комбинации.The ability of the immune system to distinguish between "self" and "foreign" antigens is vital for the functioning of the immune system as a specific defense against invading microorganisms. "Foreign" antigens are antigens on substances entering or present in the body that are markedly different from, or foreign to, the body's own components in the individual, while "self" antigens are antigens that are not markedly different or are not present in a healthy individual. foreign to the body's own components. In various embodiments of the methods, an AP activation that is inhibited is an activation that has been initiated by at least one of the group consisting of a microbial antigen, a non-biological foreign surface, an "altered self" tissue, or combinations thereof. One example of a non-biological foreign surface is blood lines such as those used in heart-lung machines or hemodialysis. Examples of altered self tissues include apoptotic, necrotic, and ischemic tissues and cells, or combinations thereof.
В некоторых вариантах осуществления антитела против фактора D согласно изобретению ингибируют АР, но не ингибируют активацию классического пути (СР) или лектинового пути (LP). Как правило, CP инициируют комплексы антигена–антитела, LP активируется при связывании лектинов с молекулами сахара на поверхности микробов, тогда как AP конститутивно активен на низком уровне, но может быстро усиливаться на поверхности бактериальных клеток, вирусов и паразитарных клетках при отсутствии регуляторных белков. Клетки–хозяева обычно защищены от активации АР комплемента регуляторными белками. Однако в некоторых ситуациях, например, когда регуляторные белки являются дефектными или отсутствуют, АР также может неконтролируемо активироваться на клетках–хозяевах, что приводит к комплемент–опосредованному заболеванию или нарушению. CP состоит из компонентов C1, C2, C4 и совпадает с AP на этапе активации C3. LP состоит из маннозосвязывающих лектинов (MBL) и MBL–ассоциированных сериновых протеаз (Masp) и имеет общие с CP компоненты, C4 и C2. AP состоит из компонентов C3 и нескольких факторов, таких как фактор B, фактор D и регулятор в жидкой фазе, фактор H. Активация комплемента состоит из трех этапов: (a) распознавание, (b) ферментативная активация и (c) атака мембраны, вызывающая гибель клетки. Первая фаза активации комплемента CP начинается с C1. C1 состоит из трех отдельных белков: распознающей субъединицы, C1q, и субкомпонентов сериновых протеаз, C1r и C1s, которые связываются с образованием кальций–зависимого тетрамерного комплекса, C1r2 s2. Интактный C1 комплекс необходим для физиологической активации C1. Активация происходит, когда интактный C1 комплекс связывается с иммуноглобулином, связанным в комплексе с антигеном. Это связывание активирует C1s, который затем расщепляет белки C4 и C2 с образованием C4a и C4b, а также C2a и C2b. Фрагменты C4b и C2a объединяются с образованием C3 конвертазы, C4b2a, которая, в свою очередь, расщепляет C3 с образованием C3a и C3b. Активацию LP инициирует связывание MBL с некоторыми сахарами на поверхности мишени, которое вызывает активацию Masp протеаз, которые затем расщепляют C4 и C2 способом, аналогичным активности C1s в CP, что приводит к образованию C3 конвертазы, C4b2a. Таким образом, CP и LP активируются разными механизмами, но они включают одни и те же компоненты, C4 и C2, и оба пути приводят к образованию одной и той же C3 конвертазы, C4b2a. Расщепление C3 при воздействии C4b2a с образованием C3b и C3a является главным событием пути комплемента по двум причинам. Оно инициирует петлю амплификации AP, поскольку связанный на поверхности C3b является центральным интермедиатом AP. C3a и C3b являются биологически важными. C3a является провоспалительным, и вместе с C5a их называют анафилатоксинами. C3b и его последующие продукты расщепления также связываются с рецепторами комплемента, присутствующими на нейтрофилах, эозинофилах, моноцитах и макрофагах, тем самым способствуя фагоцитозу и клиренсу C3b–опсонизированных частиц. Наконец, C3b может связываться с C4b2a с образованием C5 конвертазы CP и LP, активирующей терминальную последовательность комплемента, которая приводит к образованию C5a, мощного провоспалительного медиатора, и сборке литического мембраноатакующего комплекса (MAC), C5–С9.In some embodiments, the anti-factor D antibodies of the invention inhibit AR but do not inhibit classical pathway (CP) or lectin pathway (LP) activation. As a rule, CPs initiate antigen–antibody complexes, LP is activated when lectins bind to sugar molecules on the surface of microbes, while AP is constitutively active at a low level, but can rapidly increase on the surface of bacterial cells, viruses, and parasitic cells in the absence of regulatory proteins. Host cells are normally protected from complement AR activation by regulatory proteins. However, in some situations, such as when regulatory proteins are defective or absent, AR can also become uncontrollably activated on host cells, resulting in a complement-mediated disease or disorder. CP consists of components C1, C2, C4 and coincides with AP at the activation stage C3. LP consists of mannose-binding lectins (MBL) and MBL-associated serine proteases (Masp) and shares components, C4 and C2, with CP. AP is composed of C3 components and several factors such as factor B, factor D, and the fluid phase regulator, factor H. Complement activation consists of three steps: (a) recognition, (b) enzymatic activation, and (c) membrane attack causing cell death. The first phase of CP complement activation begins at C1. C1 consists of three separate proteins: a recognition subunit, C1q, and serine protease subcomponents, C1r and C1s, which bind to form a calcium-dependent tetramer complex, C1r2 s2. The intact C1 complex is required for the physiological activation of C1. Activation occurs when an intact C1 complex binds to an immunoglobulin complexed with an antigen. This binding activates C1s, which then cleaves the C4 and C2 proteins to form C4a and C4b, as well as C2a and C2b. The C4b and C2a fragments combine to form the C3 convertase, C4b2a, which in turn cleaves C3 to form C3a and C3b. The activation of LP is initiated by the binding of MBL to some sugars on the target surface, which causes the activation of Masp proteases, which then cleave C4 and C2 in a manner similar to the activity of C1s in CP, resulting in the formation of a C3 convertase, C4b2a. Thus, CP and LP are activated by different mechanisms, but they involve the same components, C4 and C2, and both pathways result in the same C3 convertase, C4b2a. Cleavage of C3 by C4b2a to form C3b and C3a is the main event of the complement pathway for two reasons. It initiates the AP amplification loop since surface-bound C3b is the central intermediate of AP. C3a and C3b are biologically important. C3a is pro-inflammatory and together with C5a they are called anaphylatoxins. C3b and its subsequent cleavage products also bind to complement receptors present on neutrophils, eosinophils, monocytes, and macrophages, thereby promoting phagocytosis and clearance of C3b-opsonized particles. Finally, C3b can bind to C4b2a to form the C5 convertase CP and LP, which activates the terminal complement sequence, which leads to the formation of C5a, a potent pro-inflammatory mediator, and the assembly of the lytic membrane attack complex (MAC), C5–C9.
Считается, что AP конститутивно активен на низком уровне вследствие спонтанного гидролиза C3 с образованием C3(H2O). C3(H2O) ведет себя подобно C3b, так как он может связываться с fB, что делает fB восприимчивым к расщеплению fD и активации. Образующийся в результате C3(H2O)Bb затем расщепляет C3 с образованием C3b и C3a, инициируя каскад AP при образовании C3 конвертазы AP, C3bBb. Поскольку исходная С3 конвертаза генерирует растущее количество C3b, устанавливается петля амплификации. Следует отметить, что, поскольку при CP и LP также образуется C3b, где C3b может связывать фактор B и запускать AP, цмкл амплификации AP также участвует в CP и LP при активации этих путей. Таким образом, AP состоит из двух функциональных компонентов: независимого пути активации комплемента, который не связан с CP или LP, и процесса амплификации, который уже участвует в CP и LP и способствует проявлению CP и LP в полной мере. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитела против фактора D согласно изобретению ингибируют процесс амплификации или петлю амплификации.It is believed that AP is constitutively active at a low level due to spontaneous hydrolysis of C3 to form C3(H2O). C3(H2O) behaves like C3b in that it can bind to fB making fB susceptible to fD cleavage and activation. The resulting C3(H2O)Bb then cleaves C3 to form C3b and C3a, initiating the AP cascade to form the C3 AP convertase, C3bBb. As the original C3 convertase generates increasing amounts of C3b, an amplification loop is established. It should be noted that since CP and LP also generate C3b, where C3b can bind factor B and trigger AP, AP amplification cl also participates in CP and LP when these pathways are activated. Thus, AP consists of two functional components: an independent complement activation pathway that is not associated with CP or LP, and an amplification process that is already involved in CP and LP and contributes to the full expression of CP and LP. Thus, in some embodiments, the anti-factor D antibodies of the invention inhibit the amplification process or amplification loop.
В одном из вариантов осуществления активностью АР, которая ингибируется с применением способа согласно изобретению, является активация АР, индуцированная по меньшей мере одним из группы, выбранной из липополисахарида (ЛПС), липоолигосахарида (ЛОС), патоген–ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP) и ассоциированных с опасностью молекулярных паттернов (DAMP). В другом варианте осуществления активностью АР, которая ингибируется с применением способа согласно изобретению, является образование белкового комплекса C3bBb. В другом варианте осуществления активность АР, которая ингибируется с применением способа согласно изобретению, является зависимой от фактора D.In one embodiment, the AR activity that is inhibited using the method of the invention is AR activation induced by at least one of the group selected from lipopolysaccharide (LPS), lipooligosaccharide (LOS), pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), and associated with Danger Molecular Patterns (DAMP). In another embodiment, the AP activity that is inhibited using the method of the invention is the formation of the C3bBb protein complex. In another embodiment, the AP activity that is inhibited using the method of the invention is Factor D dependent.
В некоторых вариантах осуществления способы согласно настоящему изобретению сохраняют способность пациента бороться с инфекцией посредством CP и LP. В одном из вариантов осуществления изобретения предложен способ ингибирования активации AP, индуцированной бактериальным липо-олигосахаридом (ЛОС) у пациента, включающий этап введения указанному пациенту антитела против фактора D и, таким образом, ингибирования активации AP, индуцированной бактериальным ЛОС, у пациента. В другом варианте осуществления в настоящем документе предложен способ ингибирования активации AP, индуцированной бактериальным ЛПС. В некоторых вариантах осуществления активация AP индуцирована ЛПС S.typhosa, и ингибиторы, применяемые в способах, представленных в настоящем документе, не ингибируют активность AP, индуцированную ЛПС S.minnesota или ЛПС E.coli. В различных вариантах осуществления антитела против фактора D согласно изобретению ингибируют AP, но не ингибируют CP–инициированную активацию комплемента, LP–инициированную активацию комплемента, зимозан–индуцированную активацию или индуцированную фактором яда кобры активацию.In some embodiments, the implementation of the methods according to the present invention retain the ability of the patient to fight infection through CP and LP. In one embodiment, the invention provides a method of inhibiting bacterial lipo-oligosaccharide (LOS)-induced AP activation in a patient, comprising the step of administering an anti-factor D antibody to said patient and thereby inhibiting bacterial VOC-induced AP activation in the patient. In another embodiment, provided herein is a method for inhibiting AP activation induced by bacterial LPS. In some embodiments, AP activation is induced by S. typhosa LPS and the inhibitors used in the methods provided herein do not inhibit AP activity induced by S. minnesota LPS or E. coli LPS. In various embodiments, the anti-factor D antibodies of the invention inhibit AP but do not inhibit CP-initiated complement activation, LP-initiated complement activation, zymosan-induced activation, or cobra venom factor-induced activation.
В одном из вариантов осуществления в настоящем документе предложен способ ингибирования опосредованной патоген–ассоциированным молекулярным паттерном активации AP у пациента, включающий этап введения указанному пациенту антитела против фактора D, ингибируя, таким образом, PAMP–опосредованную активацию AP у пациента. Примеры PAMP, вызванная которым активация AP может быть ингибирована способами согласно изобретению, включают, без ограничения перечисленными, мурамилдипептид (MDP), CpG мотив из бактериальной ДНК, двухцепочечные вирусные РНК, пептидогликан, липотейхоевую кислоту, поверхностный белок A Borrelia burgdorferi, синтетический микоплазменный макрофаг–активирующий липопротеин–2, трипальмитоил–цистеинил–серил–(лизил)3–лизин (P3CSK4), дипальмитоил–CSK4 (P2–CSK4), монопальмитоил–CSK4 (PCSK4), амфотерицин B, триацилированный или диацилированный бактериальный полипептид и их комбинации.In one embodiment, provided herein is a method of inhibiting pathogen-associated molecular pattern-associated AP activation in a patient, comprising the step of administering an anti-factor D antibody to said patient, thereby inhibiting PAMP-mediated AP activation in the patient. Examples of PAMPs induced by which AP activation can be inhibited by the methods of the invention include, but are not limited to, muramyl dipeptide (MDP), CpG motif from bacterial DNA, double-stranded viral RNAs, peptidoglycan, lipoteichoic acid, Borrelia burgdorferi surface protein A, synthetic mycoplasma macrophage– activating lipoprotein-2, tripalmitoyl-cysteinyl-seryl-(lysyl)3-lysine (P3CSK4), dipalmitoyl-CSK4 (P2-CSK4), monopalmitoyl-CSK4 (PCSK4), amphotericin B, triacylated or diacylated bacterial polypeptide, and combinations thereof.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложен способ ингибирования инициации активации AP у пациента, включающий этап введения указанному пациенту антитела против фактора D, ингибируя, таким образом, инициацию активации AP у пациента. В другом варианте осуществления в настоящем документе предложен способ ингибирования амплификации активации AP у пациента, включающий этап введения указанному пациенту ингибитора AP, ингибируя, таким образом, амплификацию активации AP у пациента. Примерами этих вариантов осуществления являются пациенты с ПНГ, которые страдают AP комплемент–опосредованным гемолизом, и пациенты, страдающие AP комплемент–опосредованным аГУС, астмой, ишемическим/реперфузионным повреждением, ревматоидным артритом и АНЦА–опосредованными заболеваниями почек. В различных вариантах осуществления изобретения заболевания и нарушения, которые можно лечить с применением композиций и способов согласно изобретению, включают, без ограничения, AP комплемент–опосредованный гемолиз, AP комплемент–опосредованный аГУС, астму, ишемическое/реперфузионное повреждение, ревматоидный артрит и АНЦА–опосредованные заболевания почек или нарушения функции почек.In one embodiment, the invention provides a method for inhibiting the initiation of AP activation in a patient, comprising the step of administering an anti-factor D antibody to said patient, thereby inhibiting the initiation of AP activation in the patient. In another embodiment, provided herein is a method for inhibiting amplification of AP activation in a patient, comprising the step of administering to said patient an AP inhibitor, thereby inhibiting amplification of AP activation in the patient. Examples of these embodiments are PNH patients who suffer from AP complement-mediated hemolysis and patients suffering from AP complement-mediated aHUS, asthma, ischemic/reperfusion injury, rheumatoid arthritis, and ANCA-mediated kidney disease. In various embodiments, diseases and disorders that may be treated using the compositions and methods of the invention include, without limitation, AP complement-mediated hemolysis, AP complement-mediated aHUS, asthma, ischemic/reperfusion injury, rheumatoid arthritis, and ANCA-mediated kidney disease or impaired kidney function.
В различных вариантах осуществления в настоящем документе предложены способы идентификации потенциального антитела, обладающего ингибирующим действием в отношении AP, включающие этапы: a) введение антитела против фактора D пациенту; b) определение полученного фенотипа пациента; и c) сравнение полученного фенотипа пациента с фенотипом животного с нокаутом фактора D–/–. В другом варианте осуществления антитело против фактора D, применяемое в способах, предложенных в настоящем документе, идентифицировано способом отбора потенциального терапевтического соединения с применением животного с нокаутом фактора D–/–.In various embodiments, provided herein are methods for identifying a potential AP inhibitory antibody, comprising the steps of: a) administering an anti-factor D antibody to a patient; b) determining the resulting patient phenotype; and c) comparing the resulting patient phenotype with that of a Factor D knockout –/– animal. In another embodiment, an anti-factor D antibody used in the methods provided herein is identified by a method for selecting a potential therapeutic compound using an animal with a factor D knockout -/- .
В различных других вариантах осуществления в настоящем документе предложены способы идентификации потенциального антитела против фактора D, обладающего ингибирующим действием в отношении АР. Один такой способ включает следующие этапы: a) покрытие планшета липополисахаридом (ЛПС); b) промывку планшета для удаления несвязавшегося ЛПС; c) добавление бычьего сывороточного альбумина (BSA) в фосфатно–солевом буфере (PBS); d) промывку планшета для удаления несвязавшегося BSA; e) добавление смеси кандидатного соединения антитела против фактора D, которое было предварительно инкубировано с сывороткой и смешано с нормальной человеческой сывороткой; f) промывку планшета; g) добавление HRP–конъюгированного антитела против C3 человека; h) промывку планшета для удаления несвязавшегося антитела; i) добавление реагента субстрата HRP; j) добавление серной кислоты для остановки реакции; k) измерение оптической плотности при 450 нм; l) сравнение оптической плотности планшета, содержащего кандидатное соединение антитела против фактора D, с оптической плотностью положительного сравнительного контроля и отрицательного сравнительного контроля; где при уменьшении оптической плотности по сравнению с положительным сравнительным контролем идентифицируют антитело против фактора D.In various other embodiments, provided herein are methods for identifying a potential anti-factor D antibody having an AP inhibitory effect. One such method includes the following steps: a) coating the plate with lipopolysaccharide (LPS); b) washing the plate to remove unbound LPS; c) addition of bovine serum albumin (BSA) in phosphate buffered saline (PBS); d) washing the plate to remove unbound BSA; e) adding an anti-factor D antibody candidate compound mixture that has been pre-incubated with serum and mixed with normal human serum; f) washing the plate; g) addition of HRP-conjugated anti-human C3 antibody; h) washing the plate to remove unbound antibody; i) adding the HRP substrate reagent; j) adding sulfuric acid to stop the reaction; k) absorbance measurement at 450 nm; l) comparing the optical density of the plate containing the anti-factor D antibody candidate compound with the optical density of the positive comparative control and the negative comparative control; where, with a decrease in optical density compared to a positive comparative control, an antibody against factor D is identified.
Антитела против фактора DAnti-factor D antibodies
В некоторых вариантах осуществления изобретение включает композиции, включающие антитело, которое специфично связывается с фактором D. В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D является поликлональным антителом. В еще одном варианте осуществления антитело против фактора D является моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D является химерным антителом. В других вариантах осуществления антитело против фактора D является гуманизированным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело является фрагментом антитела. В некоторых вариантах осуществления фактор D является фактором D человека.In some embodiments, the invention includes compositions comprising an antibody that specifically binds to factor D. In one embodiment, the anti-factor D antibody is a polyclonal antibody. In yet another embodiment, the anti-factor D antibody is a monoclonal antibody. In some embodiments, the anti-factor D antibody is a chimeric antibody. In other embodiments, the anti-factor D antibody is a humanized antibody. In some embodiments, the antibody is an antibody fragment. In some embodiments, the factor D is human factor D.
В некоторых вариантах осуществления связывание антитела или фрагмента антитела с фактором D человека ассоциировано со снижением образования C3bBb в пути активации комплемента в интактном организме. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен белок или полипептид, способный связываться с фактором D человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела; белок или полипептид связываются с соответствующей частью или фракцией или эпитопом фактора D человека; и связывание антитела или фрагмента антитела, или белка или полипептида с соответствующей частью фактора D человека ассоциировано со снижением образования C3bBb в интактном организме.In some embodiments, binding of an antibody or antibody fragment to human factor D is associated with a reduction in C3bBb production in the complement activation pathway in an intact organism. In some embodiments, the invention provides a protein or polypeptide capable of binding to human Factor D. In some embodiments, an antibody or antibody fragment; the protein or polypeptide binds to the appropriate portion or fraction or epitope of human factor D; and binding of the antibody or antibody fragment, or protein or polypeptide to the corresponding portion of human factor D is associated with reduced C3bBb production in the intact organism.
В некоторых вариантах осуществления связывающее антитело против фактора D или фрагмент связывающего антитела против фактора D конъюгированы с белком, пептидом или другим соединением. В некоторых вариантах осуществления белок, пептид или другое соединение, с которым конъюгировано антитело против фактора D или фрагмент такого антитела, является направляющим фрагментом (т.е. направляющий фрагмент специфично связывается с другой молекулой, отличной от фактора D). В некоторых вариантах осуществления белок, пептид или другое соединение, с которым конъюгировано антитело против фактора D или фрагмент такого антитела, является эффекторной молекулой (например, цитотоксической молекулой).In some embodiments, the anti-factor D binding antibody or anti-factor D binding antibody fragment is conjugated to a protein, peptide, or other compound. In some embodiments, the protein, peptide, or other compound to which an anti-factor D antibody, or fragment of such an antibody, is conjugated is a targeting moiety (i.e., the targeting fragment specifically binds to another molecule other than factor D). In some embodiments, the protein, peptide, or other compound to which the anti-factor D antibody, or fragment of such antibody, is conjugated is an effector molecule (eg, a cytotoxic molecule).
В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает по меньшей мере одну из CDR–областей, выбранных из группы, состоящей из: VH–CDR1: SEQ ID NO:3; VH–CDR2: SEQ ID NO:4; VH–CDR3: SEQ ID NO:5; VL–CDR1: SEQ ID NO:8; VL–CDR2: SEQ ID NO:9; и VL–CDR3: SEQ ID NO:10, или их варианта или вариантов. В другом варианте осуществления антитело против фактора D включает все CDR–области из группы, состоящей из: VH–CDR1: SEQ ID NO:3; VH–CDR2: SEQ ID NO:4; VH–CDR3: SEQ ID NO:5; VL–CDR1: SEQ ID NO:8; VL–CDR2: SEQ ID NO:9; и VL–CDR3: SEQ ID NO:10, или их варианта или вариантов.In one embodiment, the anti-factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises at least one of the CDR regions selected from the group consisting of: VH-CDR1: SEQ ID NO:3; VH-CDR2: SEQ ID NO:4; VH-CDR3: SEQ ID NO:5; VL-CDR1: SEQ ID NO:8; VL-CDR2: SEQ ID NO:9; and VL-CDR3: SEQ ID NO:10, or a variant or variants thereof. In another embodiment, the factor D antibody includes all CDR regions from the group consisting of: VH-CDR1: SEQ ID NO:3; VH-CDR2: SEQ ID NO:4; VH-CDR3: SEQ ID NO:5; VL-CDR1: SEQ ID NO:8; VL-CDR2: SEQ ID NO:9; and VL-CDR3: SEQ ID NO:10, or a variant or variants thereof.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL–CDR1: SEQ ID NO:8, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3; и VL–CDR1: SEQ ID NO:8.In some embodiments, the factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; and VL-CDR1: SEQ ID NO:8, or a variant thereof comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions. In some embodiments, the anti-factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3; and VL-CDR1: SEQ ID NO:8.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL–CDR2: SEQ ID NO:9, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4; и VL–CDR2: SEQ ID NO:9.In some embodiments, the anti-factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; and VL-CDR2: SEQ ID NO:9, or a variant thereof comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions. In some embodiments, the anti-factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4; and VL-CDR2: SEQ ID NO:9.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL–CDR3: SEQ ID NO:10, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5; и VL–CDR3: SEQ ID NO:10.In some embodiments, the factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; and VL-CDR3: SEQ ID NO:10, or a variant thereof comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions. In some embodiments, the anti-factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5; and VL-CDR3: SEQ ID NO:10.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VL–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VL–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен.In some embodiments, the factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; VH-CDR2, including the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, or its variant, including up to about 3 (for example, about 1, 2 or 3) amino acid substitutions; VH-CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, or a variant thereof comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; VL-CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:8, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; VL-CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:9, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; and VL-CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:10, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5; VL–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VL–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.In some embodiments, the factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; VH-CDR2, including the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, or its variant, including up to about 3 (for example, about 1, 2 or 3) amino acid substitutions; VH-CDR3, including the amino acid sequence of SEQ ID NO:5; VL-CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:8, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; VL-CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:9, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; and VL-CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:10.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3; VH–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4; VH–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5; VL–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8; VL–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9; и VL–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.In some embodiments, the anti-factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3; VH-CDR2, including the amino acid sequence of SEQ ID NO:4; VH-CDR3, including the amino acid sequence of SEQ ID NO:5; VL-CDR1, including the amino acid sequence of SEQ ID NO:8; VL-CDR2, including the amino acid sequence of SEQ ID NO:9; and VL-CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:10.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, или ее вариант. В других вариантах осуществления антитело против фактора D включает легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, или ее вариант. В другом варианте осуществления антитело против фактора D является моноклональным антителом, обозначенным мАт 11–8A1. Моноклональное антитело против фактора D, обозначенное мАт 11–8A1, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, или ее вариант, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело против фактора D гуманизировано. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело против фактора D, обозначенное мАт 11–8A1, является химерным антителом.In some embodiments, the anti-factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, or a variant thereof. In other embodiments, the anti-factor D antibody comprises a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, or a variant thereof. In another embodiment, the anti-factor D antibody is a monoclonal antibody designated mAb 11-8A1. The anti-factor D monoclonal antibody designated mAb 11-8A1 comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 or a variant thereof and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:7 or a variant thereof. In some embodiments, the anti-factor D monoclonal antibody is humanized. In some embodiments, the anti-factor D monoclonal antibody, designated mAb 11-8A1, is a chimeric antibody.
В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает по меньшей мере одну из CDR–областей, выбранных из группы, состоящей из: VH–CDR1: SEQ ID NO:13; VH–CDR2: SEQ ID NO:14; VH–CDR3: SEQ ID NO:15; VL–CDR1: SEQ ID NO:18; VL–CDR2: SEQ ID NO:19; и VL–CDR3: SEQ ID NO:20 или их варианта или вариантов. В другом варианте осуществления антитело против фактора D включает все CDR–области из группы, состоящей из: VH–CDR1: SEQ ID NO:13; VH–CDR2: SEQ ID NO:14; VH–CDR3: SEQ ID NO:15; VL–CDR1: SEQ ID NO:18; VL–CDR2: SEQ ID NO:19; и VL–CDR3: SEQ ID NO:20 или их варианта или вариантов.In one embodiment, the anti-factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises at least one of the CDR regions selected from the group consisting of: VH-CDR1: SEQ ID NO:13; VH-CDR2: SEQ ID NO:14; VH-CDR3: SEQ ID NO:15; VL-CDR1: SEQ ID NO:18; VL-CDR2: SEQ ID NO:19; and VL-CDR3: SEQ ID NO:20 or a variant or variants thereof. In another embodiment, the factor D antibody includes all CDR regions from the group consisting of: VH-CDR1: SEQ ID NO:13; VH-CDR2: SEQ ID NO:14; VH-CDR3: SEQ ID NO:15; VL-CDR1: SEQ ID NO:18; VL-CDR2: SEQ ID NO:19; and VL-CDR3: SEQ ID NO:20 or a variant or variants thereof.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL–CDR1: SEQ ID NO:18, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13; и VL–CDR1: SEQ ID NO:18.In some embodiments, the factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:13, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; and VL-CDR1: SEQ ID NO:18, or a variant thereof comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions. In some embodiments, the anti-factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:13; and VL-CDR1: SEQ ID NO:18.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL–CDR2: SEQ ID NO:19, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14; и VL–CDR2: SEQ ID NO:19.In some embodiments, the anti-factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:14, or a variant thereof comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; and VL-CDR2: SEQ ID NO:19, or a variant thereof comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions. In some embodiments, the anti-factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:14; and VL-CDR2: SEQ ID NO:19.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL–CDR3: SEQ ID NO:20, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15; и VL–CDR3: SEQ ID NO:20.In some embodiments, the factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:15, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; and VL-CDR3: SEQ ID NO:20, or a variant thereof comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions. In some embodiments, the anti-factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:15; and VL-CDR3: SEQ ID NO:20.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VL–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VL–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен.In some embodiments, the factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:13, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; VH-CDR2, including the amino acid sequence of SEQ ID NO:14, or its variant, including up to about 3 (for example, about 1, 2 or 3) amino acid substitutions; VH-CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:15, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; VL-CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:18, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; VL-CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:19, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; and VL-CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:20, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15; VL–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VL–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20.In some embodiments, the factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:13, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; VH-CDR2, including the amino acid sequence of SEQ ID NO:14, or its variant, including up to about 3 (for example, about 1, 2 or 3) amino acid substitutions; VH-CDR3, including the amino acid sequence of SEQ ID NO:15; VL-CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:18, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; VL-CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:19, or a variant thereof, comprising up to about 3 (eg, about 1, 2, or 3) amino acid substitutions; and VL-CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:20.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13; VH–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14; VH–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15; VL–CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18; VL–CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19; и VL–CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20.In some embodiments, the anti-factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises: VH-CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:13; VH-CDR2, including the amino acid sequence of SEQ ID NO:14; VH-CDR3, including the amino acid sequence of SEQ ID NO:15; VL-CDR1, including the amino acid sequence of SEQ ID NO:18; VL-CDR2, including the amino acid sequence of SEQ ID NO:19; and VL-CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:20.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, или ее вариант. В других вариантах осуществления антитело против фактора D включает легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, или ее вариант. В другом варианте осуществления антитело против фактора D является моноклональным антителом, обозначенным мАт 1F10–5. Моноклональное антитело против фактора D, обозначенное мАт 1F10–5, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, или ее вариант, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело против фактора D гуманизировано. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело против фактора D является химерным антителом.In some embodiments, the anti-factor D antibody comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:12, or a variant thereof. In other embodiments, the anti-factor D antibody comprises a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:17, or a variant thereof. In another embodiment, the anti-factor D antibody is a monoclonal antibody designated mAb 1F10-5. The anti-factor D monoclonal antibody, designated mAb 1F10-5, comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:12 or a variant thereof and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:17 or a variant thereof. In some embodiments, the anti-factor D monoclonal antibody is humanized. In some embodiments, the anti-factor D monoclonal antibody is a chimeric antibody.
В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело связывается с фактором D человека, где антитело альтернативно связывается с любым из первого эпитопа и второго эпитопа фактора D, где первый эпитоп и второй эпитоп имеют части, которые принимают спиральную конформацию в своей вторичной структуре, и где часть фактора D, которая принимает конформацию бета–тяжа в своей вторичной структуре, расположена между первым эпитопом и вторым эпитопом.In some embodiments, the isolated antibody binds to human factor D, where the antibody alternatively binds to any of the first epitope and second epitope of factor D, where the first epitope and second epitope have moieties that adopt a helical conformation in their secondary structure, and where the factor D portion , which adopts a beta-strand conformation in its secondary structure, is located between the first epitope and the second epitope.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D согласно изобретению является антителом, которое связывается с определенным эпитопом фактора D. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) из аминокислот в SEQ ID NO:21 находится в эпитопе антитела против фактора D. Аминокислоты SEQ ID NO:21 соответствуют аминокислотам 107–110 в аминокислотной последовательности фактора D. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) из аминокислот в SEQ ID NO:22 находится в эпитопе антитела против фактора D. Аминокислоты SEQ ID NO:22 соответствуют аминокислотам 148–151 в аминокислотной последовательности фактора D. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5) из аминокислот в SEQ ID NO:23 находится в эпитопе антитела против фактора D. Аминокислоты SEQ ID NO:23 соответствуют аминокислотам 155–159 в аминокислотной последовательности фактора D. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) из аминокислот в SEQ ID NO:24 находится в эпитопе антитела против фактора D. Аминокислоты SEQ ID NO:24 соответствуют аминокислотам 173–176 в аминокислотной последовательности фактора D.In some embodiments, an anti-factor D antibody of the invention is an antibody that binds to a specific factor D epitope. In one embodiment, at least one (e.g., at least 1, 2, 3, or 4) of the amino acids in SEQ ID NO :21 is in an epitope of an anti-factor D antibody. The amino acids of SEQ ID NO:21 correspond to amino acids 107-110 in the factor D amino acid sequence. In one embodiment, at least one (e.g., at least 1, 2, 3, or 4) of the amino acids in SEQ ID NO:22 is in an anti-factor D antibody epitope. The amino acids of SEQ ID NO:22 correspond to amino acids 148-151 in the factor D amino acid sequence. In one embodiment, at least one (e.g., at least 1, 2, 3, 4, or 5) of the amino acids in SEQ ID NO:23 is in an anti-factor D antibody epitope. The amino acids of SEQ ID NO:23 correspond to amino acids 155-159 in the factor D amino acid sequence. In one embodiment, at least one (e.g., at least 1, 2, 3, or 4) of the amino acids in SEQ ID NO:24 is in an anti-factor D antibody epitope. The amino acids of SEQ ID NO:24 correspond to amino acids 173-176 in the factor D amino acid sequence.
В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D является антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) аминокислотой в SEQ ID NO:21. В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D является антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) аминокислотой в SEQ ID NO:22. В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D является антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5) аминокислотой в SEQ ID NO:23. В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D является антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) аминокислотой в SEQ ID NO:24.In one embodiment, an anti-factor D antibody is an antibody that binds to at least one (eg, at least 1, 2, 3, or 4) amino acids in SEQ ID NO:21. In one embodiment, an anti-factor D antibody is an antibody that binds to at least one (eg, at least 1, 2, 3, or 4) amino acids in SEQ ID NO:22. In one embodiment, an anti-factor D antibody is an antibody that binds to at least one (eg, at least 1, 2, 3, 4, or 5) amino acids in SEQ ID NO:23. In one embodiment, an anti-factor D antibody is an antibody that binds to at least one (eg, at least 1, 2, 3, or 4) amino acids in SEQ ID NO:24.
В другом варианте осуществления антитело против фактора D является антителом, которое конкурирует за связывание с антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) аминокислотой в SEQ ID NO:21. В другом варианте осуществления антитело против фактора D является антителом, которое конкурирует за связывание с антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) аминокислотой в SEQ ID NO:22. В другом варианте осуществления антитело против фактора D является антителом, которое конкурирует за связывание с антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5) аминокислотой в SEQ ID NO:23. В другом варианте осуществления антитело против фактора D является антителом, которое конкурирует за связывание с антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) аминокислотой в SEQ ID NO:24.In another embodiment, an anti-factor D antibody is an antibody that competes for binding with an antibody that binds to at least one (eg, at least 1, 2, 3, or 4) amino acids in SEQ ID NO:21. In another embodiment, an anti-factor D antibody is an antibody that competes for binding with an antibody that binds to at least one (eg, at least 1, 2, 3, or 4) amino acids in SEQ ID NO:22. In another embodiment, an anti-factor D antibody is an antibody that competes for binding with an antibody that binds to at least one (eg, at least 1, 2, 3, 4, or 5) amino acids in SEQ ID NO:23. In another embodiment, an anti-factor D antibody is an antibody that competes for binding with an antibody that binds to at least one (eg, at least 1, 2, 3, or 4) amino acids in SEQ ID NO:24.
В некоторых вариантах осуществления связывание антитела против фактора D человека или его антигенсвязывающего фрагмента по меньшей мере с любой одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5) из аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:21, 22, 23 и 24, фактора D человека в живом организме ассоциировано со снижением образования C3bBb в организме. В некоторых вариантах осуществления организмом является человек. В некоторых вариантах осуществления антителом против фактора D является мАт 11–8A1 или мАт IF10–5. В некоторых вариантах осуществления системное введение терапевтически эффективного количества 11–8A1 мАт или мАт IF10–5 в организм снижает образование C3bBb в пути активации комплемента в организме. В некоторых вариантах осуществления организмом является человек. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к белку, антителу, фрагменту антитела или пептиду, которые могут связываться по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5) аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:21, 22, 23 и 24, фактора D человека, и которые при введении в терапевтически эффективной дозе в организм способны снижать образование C3bBb в альтернативном пути активации комплемента в организме. В некоторых вариантах осуществления организмом является человек. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к белку, антителу, фрагменту антитела или пептиду, которые могут связываться по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5) аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:21, 22, 23 и 24, фактора D человека, которые препятствуют каталитическому расщеплению AP фактора B с образованием Ba и Bb. В некоторых вариантах осуществления настоящая заявка охватывает антитело или его фрагмент, белок или пептид, которые могут связываться с четырьмя аминокислотами, имеющими последовательность PLPW, расположенными в положениях 107–110 фактора D человека, или четырьмя аминокислотами, имеющими последовательность VLDR, расположенными в положениях 148–151 фактора D человека, и демонстрируют блокирующую фактор D человека активность.In some embodiments, the binding of an anti-human Factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, to at least any one (e.g., at least 1, 2, 3, 4, or 5) of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 21, 22, 23 and 24, human factor D in vivo is associated with reduced production of C3bBb in the body. In some embodiments, the organism is a human. In some embodiments, the anti-factor D antibody is mAb 11-8A1 or mAb IF10-5. In some embodiments, systemic administration of a therapeutically effective amount of 11-8A1 mAb or IF10-5 mAb to the body reduces the formation of C3bBb in the complement activation pathway in the body. In some embodiments, the organism is a human. In some embodiments, the invention provides a protein, antibody, antibody fragment, or peptide that can bind to at least one (e.g., at least 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid sequence selected from SEQ ID NO:21 , 22, 23 and 24, human factor D, and which, when administered at a therapeutically effective dose to the body, are able to reduce the formation of C3bBb in an alternative pathway of complement activation in the body. In some embodiments, the organism is a human. In some embodiments, the invention provides a protein, antibody, antibody fragment, or peptide that can bind to at least one (e.g., at least 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid sequence selected from SEQ ID NO:21 , 22, 23 and 24, human factor D, which prevent the catalytic cleavage of factor B AP to form Ba and Bb. In some embodiments, the present application encompasses an antibody or fragment, protein, or peptide that can bind to four amino acids having the PLPW sequence located at positions 107-110 of human factor D, or four amino acids having the VLDR sequence located at positions 148- 151 human factor D and exhibit human factor D blocking activity.
В некоторых вариантах осуществления антитела являются химерными антителами. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D человека может включать константные области человеческой легкой цепи и человеческой тяжелой цепи в комбинации с CDR–последовательностями вариабельной области или их вариантом, описанными в другой части настоящего описания. Специалист в данной области сумеет подготовить и получить химерное антитело при использовании известных методов замены соответствующих доменов определенных антител, представляющих интерес. Такое антитело можно легко получить с помощью пересадки гетерогенных доменов антител, включающих одну или более CDR–последовательностей, описанных в настоящей заявке. При использовании известной рекомбинантной технологии можно получить рекомбинантное антитело, содержащее константные области тяжелой и легкой цепи, кодируемые последовательностями нуклеиновых кислот константных областей тяжелой и легкой цепи человека; и вариабельные области тяжелой и легкой цепи, включающие CDR–области, кодируемые последовательностями нуклеиновой кислоты, соответствующими CDR–последовательностям, представленным в описании. Специалист в данной области может получить антитело против фактора D человека, содержащее одну или более CDR–последовательностей, описанных в настоящем описании, в котором части одной легкой цепи или только части тяжелой цепи заменены областями из антитела, относящегося к другому виду, такому как человек. Человеческое антитело против фактора D человека, включающее вариабельные области, содержащие одну или более CDR–последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:3–5, 8–10, 13–15 и 18–20, или их вариант или варианты, в комбинации со структурными элементами мышиного или не мышиного антитела вне CDR–областей, могут быть получены с помощью обычных способов, известных в уровне техники. В некоторых вариантах осуществления антитела или фрагменты антител дополнительно гуманизованы при использовании известных методик из уровня техники.In some embodiments, the antibodies are chimeric antibodies. In some embodiments, an anti-human factor D antibody may include human light chain and human heavy chain constant regions in combination with the variable region CDR sequences, or a variant thereof, described elsewhere herein. One of skill in the art will be able to prepare and produce a chimeric antibody using known techniques to replace the appropriate domains of the specific antibodies of interest. Such an antibody can be easily obtained by transplantation of heterogeneous antibody domains, including one or more CDR sequences described in this application. Using known recombinant technology, a recombinant antibody can be produced comprising heavy and light chain constant regions encoded by human heavy and light chain constant region nucleic acid sequences; and variable regions of the heavy and light chains, including CDR regions encoded by nucleic acid sequences corresponding to the CDR sequences presented in the description. One skilled in the art can prepare an anti-human factor D antibody containing one or more of the CDR sequences described herein, in which portions of one light chain or only portions of the heavy chain are replaced with regions from an antibody of a different species, such as a human. A human anti-human factor D antibody comprising variable regions containing one or more CDR sequences selected from SEQ ID NOs: 3-5, 8-10, 13-15 and 18-20, or a variant or variants thereof, in combination with structural elements of mouse or non-mouse antibodies outside the CDR regions can be obtained using conventional methods known in the prior art. In some embodiments, the antibodies or antibody fragments are further humanized using known techniques in the art.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D включает антитело, обладающее по меньшей мере приблизительно 85% (например, по меньшей мере, приблизительно любой из 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) аминокислотной идентичностью с одной или более CDR–последовательностей, описанных в настоящем документе, перечисленных в SEQ ID NO:3–5, 8–10, 13–15 и 18–20.In some embodiments, the anti-factor D antibody comprises an antibody having at least about 85% (e.g., at least about any of 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) amino acid identity with one or more of the CDR sequences described herein listed in SEQ ID NOs:3-5 , 8–10, 13–15 and 18–20.
В одном из вариантов осуществления настоящее описание охватывает антитело против фактора D, имеющее CDR–последовательности, обладающие приблизительно 85% идентичностью с CDR–последовательностями, описанными в настоящем документе. Настоящее описание охватывает антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие CDR–последовательности, которые по меньшей мере приблизительно на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% и 99% идентичны CDR–последовательностям, описанным в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D человека имеет вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH область имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 85% идентична SEQ ID NO:2, и где VL область имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 85% идентична SEQ ID NO:7.In one embodiment, the present disclosure encompasses an anti-factor D antibody having CDR sequences that share approximately 85% identity with the CDR sequences described herein. The present disclosure encompasses an anti-factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, having CDR sequences that are at least about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% 94%, 95%, 96%, 97% and 99% identical to the CDR sequences described herein. In one embodiment, the anti-human Factor D antibody has a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL), wherein the VH region has an amino acid sequence that is at least about 85% identical to SEQ ID NO:2, and where the VL region has an amino acid sequence that is at least about 85% identical to SEQ ID NO:7.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела модифицированы. В некоторых вариантах осуществления модификации включают слияние антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с частями другого белка или фрагментом белка. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела согласно изобретению модифицированы с целью увеличения их полупериода циркуляции in vivo. Например, антитело или его фрагмент могут быть слиты с молекулой FcRn, который также известен как неонатальный Fc–рецептор, для повышения стабильности антитела in vivo. (Nature Reviews Immunology 7:715–725). В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конъюгированы (например, слиты) с эффекторной молекулой и/или другим направляющим фрагментом (таким как антитело или фрагмент антитела, распознающие другую молекулу, другой антиген или другой эпитоп).In some embodiments, the antibody or antibody fragment is modified. In some embodiments, the modifications include the fusion of an antibody or antigen-binding fragment thereof with portions of another protein or protein fragment. In some embodiments, an antibody or antibody fragment of the invention is modified to increase its in vivo circulating half-life. For example, an antibody or fragment thereof can be fused to an FcRn molecule, which is also known as the neonatal Fc receptor, to improve the in vivo stability of the antibody. (Nature Reviews Immunology 7:715–725). In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is conjugated (eg, fused) to an effector molecule and/or another targeting moiety (such as an antibody or antibody fragment that recognizes a different molecule, a different antigen, or a different epitope).
Специалист в данной области сумеет получить связывающий фактор D человека одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий по меньшей мере одну специфическую CDR–последовательность, выбранную из SEQ ID NO:3–5, 8–9, 13–15 и 18–20, или ее вариант или варианты. ScFv может включать последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанные в SEQ ID NO:3–5, или их вариант или варианты, и вариабельные области легкой цепи, указанные в SEQ ID NO:8–10, или их вариант или варианты. ScFv может включать последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанные в SEQ ID NO:13–15, или их вариант или варианты, и вариабельные области легкой цепи, указанные в SEQ ID NO:18–20, или их вариант или варианты. CDR–последовательности, включенные в scFv, обладающие идентичностью аминокислотной последовательности порядка, по меньшей мере, приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% с CDR–последовательностями, описанными в настоящем описании, включены в объем настоящего описания. ScFv связывается с фактором D человека, например, с эпитопом по меньшей мере в одной из аминокислотных последовательностей, перечисленных в группе, состоящей из SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 и SEQ ID NO:24.One skilled in the art will be able to generate a human D binding single chain variable fragment (scFv) containing at least one specific CDR sequence selected from SEQ ID NOS: 3-5, 8-9, 13-15 and 18-20, or its variant or variants. The ScFv may include the heavy chain variable region sequences set forth in SEQ ID NOs: 3-5, or a variant or variants thereof, and the light chain variable regions set forth in SEQ ID NOs: 8-10, or a variant or variants thereof. The ScFv may include the heavy chain variable region sequences set forth in SEQ ID NOs: 13-15, or a variant or variants thereof, and the light chain variable regions set forth in SEQ ID NOs: 18-20, or a variant or variants thereof. CDR sequences included in scFvs having an amino acid sequence identity of at least about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% and 99% with the CDR sequences described in the present description are included in the scope of the present description. The ScFv binds to human factor D, eg, an epitope in at least one of the amino acid sequences listed in the group consisting of SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, and SEQ ID NO:24.
Скрининговые анализыScreening tests
Настоящее изобретение находит применение в различных скрининговых анализах, в том числе при определении, может ли кандидатное антитело против фактора D ингибировать АР.The present invention finds use in various screening assays, including determining whether a candidate anti-factor D antibody can inhibit AR.
В некоторых вариантах осуществления уровень активности AP в присутствии кандидатного антитела против фактора D сравнивают с активностью AP, обнаруженной в положительном сравнительном контроле. Положительный сравнительный контроль включает активацию AP в отсутствие добавленного тестируемого соединения. В некоторых вариантах осуществления кандидатное антитело против фактора D идентифицируют как ингибитор AP, когда активность AP в присутствии кандидатного антитела против фактора D составляет меньше чем приблизительно 70% активности AP, обнаруженной в положительном сравнительном контроле; это соответствует больше чем приблизительно 30% ингибированию активности AP в присутствии тестируемого соединения. В других вариантах осуществления кандидатное антитело против фактора D идентифицируют как ингибитор AP, когда активность AP в присутствии кандидатного антитела против фактора D составляет меньше чем приблизительно 80% активности AP, обнаруженной в положительном сравнительном контроле; это соответствует больше чем приблизительно 20% ингибированию активности AP в присутствии тестируемого соединения. В других вариантах осуществления кандидатное антитело против фактора D идентифицируют как ингибитор AP, когда активность AP в присутствии кандидатного антитела против фактора D составляет меньше чем приблизительно 90% активности AP, обнаруженной в положительном сравнительном контроле; это соответствует больше чем приблизительно 10% ингибированию активности AP в присутствии тестируемого соединения. В некоторых вариантах осуществления уровень ингибирования AP кандидатным антителом против фактора D сравнивают с уровнем ингибирования, обнаруженным в отрицательном сравнительном контроле.In some embodiments, the level of AP activity in the presence of a candidate anti-factor D antibody is compared to the AP activity found in a positive comparative control. The positive comparative control includes AP activation in the absence of added test compound. In some embodiments, a candidate anti-factor D antibody is identified as an AP inhibitor when the AP activity in the presence of the candidate anti-factor D antibody is less than about 70% of the AP activity found in the positive comparative control; this corresponds to greater than about 30% inhibition of AP activity in the presence of the test compound. In other embodiments, a candidate anti-factor D antibody is identified as an AP inhibitor when the AP activity in the presence of the candidate anti-factor D antibody is less than about 80% of the AP activity found in the positive comparative control; this corresponds to greater than about 20% inhibition of AP activity in the presence of the test compound. In other embodiments, a candidate anti-factor D antibody is identified as an AP inhibitor when the AP activity in the presence of the candidate anti-factor D antibody is less than about 90% of the AP activity found in the positive comparative control; this corresponds to greater than about 10% inhibition of AP activity in the presence of the test compound. In some embodiments, the level of AP inhibition by a candidate anti-factor D antibody is compared to the level of inhibition found in a negative comparative control.
Различные форматы иммуноанализа, включая конкурентный и неконкурентный форматы иммуноанализа, анализы захвата антигена, сэндвич–анализы с двумя антителами и сэндвич–анализы с тремя антителами, являются полезными способами изобретения (Self et al., 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7:60–65). Изобретение не следует считать ограниченным каким–либо одним типом известного или на сегодняшний день неизвестного анализа, при условии, что анализ позволяет обнаруживать ингибирование АР.Various immunoassay formats, including competitive and non-competitive immunoassay formats, antigen capture assays, dual antibody sandwich assays, and triple antibody sandwich assays, are useful methods of the invention (Self et al., 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7:60 –65). The invention should not be considered limited to any one type of known or currently unknown assay, provided that the assay is capable of detecting AR inhibition.
Внесосудистые гемолитические анализы включены в способы согласно изобретению. В различных вариантах осуществления эритроциты (Эр) получают от нормальных (здоровых) лиц или лиц, демонстрирующих признаки или симптомы заболевания или нарушения, такого как, например, ПНГ. В различных вариантах осуществления заболевание или нарушение индуцируют в модели на животных, такой как мышь с тройным нокаутом (TKO) Crry/DAF/C3. В некоторых вариантах осуществления реципиентам перелитых Эр за 24 часа до переноса Эр вводят по меньшей мере одно антитело против фактора D или контрольный раствор, такой как PBS. Донорские Эр промывают и метят CFSE при использовании метода, такого как описанный в публикации Miwa et al., 2002, Blood 99; 3707–3716. В некоторых вариантах осуществления донорские Эр собирают у нормальных доноров, промывают и метят DDAO–SE при использовании методики, описанной производителем, или которую специалист в данной области сочтет подходящей. В некоторых вариантах осуществления смесь нормальных Эр в соотношении 1:1 с Эр TKO специалист вводит реципиенту путем внутривенного введения, который является наиболее подходящим, включая, без ограничения этим, хвостовую вену в случае реципиента мыши. В одном из вариантов осуществления образцы крови собирают в различные моменты времени после введения донорских Эр. В одном из вариантов осуществления образцы крови собирают через 5 минут, 6, 24, 48, 72, 96 и 120 часов после переливания. Собранную кровь анализируют для определения процента эритроцитов, меченных CFSE или DDAO–SE (то есть перелитых), оставшихся в кровотоке. Количество меченных CFSE TKO Эр у каждого реципиента нормализуют по меченным DDAO–SE нормальным Эр в каждый момент времени.Extravascular hemolytic assays are included in the methods of the invention. In various embodiments, erythrocytes (ER) are obtained from normal (healthy) individuals or individuals showing signs or symptoms of a disease or disorder, such as, for example, PNH. In various embodiments, the disease or disorder is induced in an animal model, such as the Crry/DAF/C3 triple knockout (TKO) mouse. In some embodiments, recipients of transfused ER are administered at least one anti-factor D antibody or control solution such as
Лечение KRN артрита является полезным способом изобретения. Артрит индуцируют у гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека путем пассивного переноса очищенных суммарных IgG от мышей K/BxN. В одном из вариантов осуществления утолщение голеностопного сустава измеряют штангенциркулем и клинические показатели регистрируют с использованием критериев, таких как критерий, ранее описанный в публикации Kimura et. al. (Kimura et al., 2010, JCI; 3545–3554). Субъектам вводят дозу антитела против фактора D человека. В некоторых вариантах осуществления индивида лечат в день 1, день 3, день 7 и 11, и день 15 после индукции артрита.The treatment of KRN arthritis is a useful method of the invention. Arthritis is induced in homozygous human factor D knockout mice by passive transfer of purified total IgG from K/BxN mice. In one embodiment, ankle thickening is measured with a caliper and clinical scores are recorded using criteria such as those previously described in Kimura et. al. (Kimura et al., 2010, JCI; 3545–3554). Subjects are dosed with an anti-human factor D antibody. In some embodiments, the individual is treated on
Иммуноферментные анализы (ИФА) могут применяться в способах согласно изобретению. Фермент, такой как, без ограничения перечисленным, пероксидаза хрена (HRP), щелочная фосфатаза, бета–галактозидаза или уреаза, может быть связан, например, с антителом против С3 или с вторичным антителом для применения в способе согласно изобретению. Система обнаружения пероксидазы хрена может использоваться, например, с хромогенным субстратом тетраметилбензидином (TMB), который дает растворимый продукт в присутствии перекиси водорода, который можно обнаруживать при 450 нм. Другие подходящие системы с использованием ферментных меток включают, например, систему обнаружения щелочной фосфатазы, которую можно использовать с хромогенным субстратом п–нитрофенилфосфатом для получения растворимого продукта, легко обнаруживаемого при 405 нм. Аналогичным образом, система обнаружения бета–галактозидазы может использоваться с хромогенным субстратом о–нитрофенил–бета–D–галактопиранозидом (ONPG) для получения растворимого продукта, обнаруживаемого при 410 нм. В альтернативе система обнаружения уреазы может использоваться с субстратом, таким как мочевина–бромкрезоловый пурпурный (Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO). Полезные первичные и вторичные антитела с ферментной меткой могут быть получены из любых коммерческих источников.Enzyme immunoassays (ELISA) can be used in the methods according to the invention. An enzyme, such as, but not limited to, horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase, beta-galactosidase, or urease, may be linked to, for example, an anti-C3 antibody or a secondary antibody for use in the method of the invention. The horseradish peroxidase detection system can be used, for example, with the chromogenic substrate tetramethylbenzidine (TMB), which gives a soluble product in the presence of hydrogen peroxide, which can be detected at 450 nm. Other suitable systems using enzyme labels include, for example, an alkaline phosphatase detection system that can be used with the chromogenic substrate p-nitrophenyl phosphate to produce a soluble product readily detectable at 405 nm. Similarly, the beta-galactosidase detection system can be used with the chromogenic substrate o-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside (ONPG) to produce a soluble product detectable at 410 nm. Alternatively, the urease detection system can be used with a substrate such as urea-bromocresol purple (Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO). Useful enzymatically labeled primary and secondary antibodies can be obtained from any commercial source.
Хемилюминесцентное обнаружение также может применяться для обнаружения ингибирования AP. Хемилюминесцентные вторичные антитела могут быть получены из любых коммерческих источников.Chemiluminescent detection can also be used to detect AP inhibition. Chemiluminescent secondary antibodies can be obtained from any commercial source.
Флуоресцентное обнаружение также может применяться для обнаружения ингибирования AP. Полезные флуорохромы включают, без ограничения, DAPI, флуоресцеин, Hoechst 33258, R–фикоцианин, B–фикоэритрин, R–фикоэритрин, родамин, техасский красный и лиссамин–флуоресцеин– или родамин–меченные антитела.Fluorescence detection can also be used to detect AP inhibition. Useful fluorochromes include, without limitation, DAPI, fluorescein, Hoechst 33258, R-phycocyanin, B-phycoerythrin, R-phycoerythrin, rhodamine, Texas red, and lyssamine-fluorescein- or rhodamine-labeled antibodies.
Радиоиммуноанализы (РИА) также могут применяться в способах согласно изобретению. Такие анализы известны в уровне техники и описаны, например, в публикациях Brophy et al. (1990, Biochem. Biophys. Res. Comm. 167:898–903) и Guechot et al. (1996, Clin. Chem. 42:558–563). Радиоиммуноанализы выполняют, например, с использованием меченного иодом–125 первичного или вторичного антитела (Harlow et al., выше, 1999).Radioimmunoassays (RIAs) can also be used in the methods of the invention. Such assays are known in the art and are described, for example, in Brophy et al. (1990, Biochem. Biophys. Res. Comm. 167:898–903) and Guechot et al. (1996, Clin. Chem. 42:558–563). Radioimmunoassays are performed, for example, using an iodine-125 labeled primary or secondary antibody (Harlow et al., supra, 1999).
Сигнал, испускаемый обнаруживаемым антителом, анализируют, например, с использованием спектрофотометра для детектирования цвета от хромогенного субстрата; индикатора излучения для обнаружения излучения, такого как счетчик гамма–излучения для детектирования иода–125; или флуорометра для обнаружения флуоресценции в присутствии света определенной длины волны. Если используется анализ с ферментной меткой, количественный анализ проводят с использованием спектрофотометра. Следует понимать, что анализы согласно изобретению могут быть выполнены вручную или, при необходимости, могут быть автоматизированы, и что сигнал, испускаемый от множества образцов, может быть обнаружен одновременно во многих системах, доступных в продаже.The signal emitted by the antibody to be detected is analyzed, for example, using a spectrophotometer to detect color from a chromogenic substrate; a radiation indicator for detecting radiation, such as a gamma counter for detecting iodine-125; or a fluorometer to detect fluorescence in the presence of light of a certain wavelength. If an enzyme-labeled assay is used, quantitative analysis is carried out using a spectrophotometer. It should be understood that the assays of the invention can be performed manually or, if necessary, can be automated, and that the signal emitted from multiple samples can be detected simultaneously in many commercially available systems.
Способы согласно изобретению также охватывают применение иммуноанализов на основе капиллярного электрофореза (CEIA), которые могут быть автоматизированы при необходимости. Иммуноанализы также могут использоваться вместе с лазерно–индуцированной флуоресценцией, как описано, например, в Schmalzing et al. (1997, Electrophoresis 18:2184–2193) и Bao (1997, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. 699:463–480). Липосомные иммуноанализы, такие как проточно–инжекционные липосомные иммуноанализы и липосомные иммуносенсоры, также могут применяться согласно способам изобретения (Rongen et al., 1997, J. Immunol. Methods 204:105–133).The methods of the invention also encompass the use of capillary electrophoresis immunoassays (CEIAs), which can be automated as needed. Immunoassays can also be used in conjunction with laser-induced fluorescence, as described, for example, in Schmalzing et al. (1997, Electrophoresis 18:2184-2193) and Bao (1997, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. 699:463-480). Liposomal immunoassays, such as flow-injection liposomal immunoassays and liposomal immunosensors, can also be used according to the methods of the invention (Rongen et al., 1997, J. Immunol. Methods 204:105-133).
Количественный вестерн–блоттинг также может использоваться для определения уровня ингибирования AP в способах согласно изобретению. Вестерн–блоты анализируют количественно при использовании известных методов, таких как сканирующая денситометрия (Parra et al., 1998, J. Vasc. Surg. 28:669–675).Quantitative Western blotting can also be used to determine the level of AP inhibition in the methods of the invention. Western blots are analyzed quantitatively using known methods such as scanning densitometry (Parra et al., 1998, J. Vasc. Surg. 28:669-675).
Способы введенияMethods of administration
Способы согласно изобретению включают введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного антитела против фактора D или его связывающего фрагмента (таких как любое из антител или их фрагментов, описанных в другой части настоящего документа) пациенту, у которого идентифицировано АР–опосредованное заболевание или нарушение. В одном из вариантов осуществления пациент является млекопитающим, имеющим систему АР. В одном из вариантов осуществления пациент является человеком. В различных вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело против фактора D или его связывающий фрагмент вводят локально, регионарно или системно. В некоторых вариантах осуществления AP–опосредованным заболеванием или нарушением является C3–гломерулопатия. В некоторых вариантах осуществления AP–опосредованным заболеванием или нарушением является макулодистрофия (такая как ВМД).The methods of the invention include administering a therapeutically effective amount of at least one anti-factor D antibody or binding fragment thereof (such as any of the antibodies or fragments thereof described elsewhere herein) to a patient identified with an AP-mediated disease or disorder. In one embodiment, the patient is a mammal having an AP system. In one embodiment, the patient is a human. In various embodiments, at least one anti-factor D antibody, or binding fragment thereof, is administered locally, regionally, or systemically. In some embodiments, the AP-mediated disease or disorder is C3-glomerulopathy. In some embodiments, the AP-mediated disease or disorder is macular degeneration (such as AMD).
Способы согласно изобретению могут включать введение по меньшей мере одного антитела против фактора D или его связывающего фрагмента, однако никоим образом не следует считать, что настоящее изобретение ограничено антителами против фактора D, описанными в настоящем документе, а скорее следует считать, что оно охватывает любое антитело против фактора D, как известное, так и неизвестное, которые уменьшают и снижают активацию AP.The methods of the invention may include administering at least one anti-factor D antibody or binding fragment thereof, however, the present invention should in no way be considered limited to the anti-factor D antibodies described herein, but rather should be considered to encompass any antibody. against factor D, both known and unknown, which decrease and reduce AP activation.
Способ согласно изобретению включает введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного антитела против фактора D или его связывающего фрагмента пациенту, где композиция согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одно антитело против фактора D или его связывающий фрагмент либо отдельно, либо в комбинации по меньшей мере с одним другим лекарственным средством. Изобретение может применяться в комбинации с другими методами лечения, такими как, например, противовоспалительная терапия и тому подобное Примеры противовоспалительной терапии, которую можно применять в комбинации со способами согласно изобретению, включают, например, терапии, в которых используются стероидные лекарственные средства, а также терапию, в которой используются нестероидные лекарственные средства.The method of the invention comprises administering a therapeutically effective amount of at least one anti-factor D antibody or binding fragment thereof to a patient, wherein the composition of the present invention comprises at least one anti-factor D antibody or binding fragment thereof, either alone or in combination with at least one other drug. The invention may be used in combination with other therapies such as, for example, anti-inflammatory therapy and the like. in which non-steroidal drugs are used.
Способ согласно изобретению включает введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против фактора D или его антигенсвязывающего фрагмента, которые способны связываться в пределах любой из последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:21, 22, 23, 24. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения заболеваний, связанных с фактором D, включающих нарушение пути активации АР комплемента, путем введения терапевтически эффективного количества антитела согласно изобретению или терапевтически эффективного количество фрагмента антитела, в результате чего у индивида происходит снижение C3bBb. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения заболеваний, связанных с фактором D, включающих нарушение пути активации АР комплемента, путем введения терапевтически эффективного количества антитела или фрагмента антитела, способных связываться с некоторым специфическим эпитопом или эпитопами в факторе D человека, таким как эпитоп, содержащийся в аминокислотных последовательностях, выбранных из SEQ ID NO:21–24. В некоторых вариантах осуществления изобретение охватывает способ лечения заболеваний, связанных с фактором D, включающих нарушение пути активации АР комплемента, путем введения индивиду эффективного количества антитела, фрагмента антитела, полипептида, пептида, конъюгированного пептида, способных связываться с некоторыми специфическими эпитопами фактора D человека, где эпитоп содержится в аминокислотных последовательностях, выбранных из SEQ ID NO:21–24, в результате чего активация пути активации АР комплемента у индивида снижается. В некоторых вариантах осуществления способ лечения включает системное введение индивиду эффективной дозы антитела или фрагмента антитела, способных связываться с аминокислотами, выбранными из последовательностей, перечисленных в SEQ ID NO:21–24, в результате чего достигается системное снижение C3bBb у индивида.The method of the invention comprises administering to an individual a therapeutically effective amount of an anti-factor D antibody, or antigen-binding fragment thereof, that is capable of binding within any of the sequences selected from SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24. In some embodiments, the invention relates to a method of treating factor D-associated diseases involving disruption of the complement AR activation pathway by administering a therapeutically effective amount of an antibody of the invention, or a therapeutically effective amount of an antibody fragment, resulting in a decrease in C3bBb in the individual. In some embodiments, the invention relates to a method of treating factor D-associated diseases, including disruption of the complement AR activation pathway, by administering a therapeutically effective amount of an antibody or antibody fragment capable of binding to some specific epitope or epitopes in human factor D, such as an epitope, contained in amino acid sequences selected from SEQ ID NOs:21-24. In some embodiments, the invention provides a method of treating factor D related diseases, including disruption of the complement AR pathway, by administering to an individual an effective amount of an antibody, antibody fragment, polypeptide, peptide, conjugated peptide capable of binding to certain specific human factor D epitopes, wherein the epitope is contained in amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 21-24, whereby activation of the complement AR activation pathway is reduced in the individual. In some embodiments, the method of treatment comprises systemically administering to an individual an effective dose of an antibody or antibody fragment capable of binding to amino acids selected from the sequences listed in SEQ ID NOs: 21-24, resulting in a systemic reduction in C3bBb in the individual.
Фармацевтические композиции и способы леченияPharmaceutical compositions and methods of treatment
Введение антитела против фактора D или его связывающего фрагмента в способе лечения согласно изобретению может быть достигнуто различными способами при использовании методов, известных в уровне техники. Терапевтические и профилактические способы согласно изобретению, таким образом, охватывают применение фармацевтических композиций, включающих антитело против фактора D.Administration of an anti-factor D antibody or binding fragment thereof in the method of treatment of the invention can be achieved in various ways using techniques known in the art. The therapeutic and prophylactic methods of the invention thus encompass the use of pharmaceutical compositions comprising an anti-factor D antibody.
Фармацевтические композиции, подходящие для осуществления изобретения, могут вводить для доставки дозы по меньшей мере приблизительно 1 нг/кг, по меньшей мере приблизительно 5 нг/кг, по меньшей мере приблизительно 10 нг/кг, по меньшей мере приблизительно 25 нг/кг, по меньшей мере приблизительно 50 нг/кг, по меньшей мере приблизительно 100 нг/кг, по меньшей мере приблизительно 500 нг/кг, по меньшей мере приблизительно 1 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 5 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 10 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 25 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 50 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 100 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 500 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 1 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 5 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 10 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 25 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 50 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 100 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 200 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 300 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 400 мг/кг и по меньшей мере приблизительно 500 мг/кг массы тела индивида. В одном из вариантов осуществления изобретения вводят дозу, которая приводит к концентрации антитела против фактора D согласно настоящему изобретению по меньшей мере приблизительно 1 пМ, по меньшей мере приблизительно 10 пМ, по меньшей мере приблизительно 100 пМ, по меньшей мере приблизительно 1 нм, по меньшей мере приблизительно 10 нм, по меньшей мере приблизительно 100 нм, по меньшей мере приблизительно 1 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2 мкМ, по меньшей мере приблизительно 3 мкМ, по меньшей мере приблизительно 4 мкМ, по меньшей мере приблизительно 5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 6 мкМ, по меньшей мере приблизительно 7 мкМ, по меньшей мере приблизительно 8 мкМ, по меньшей мере приблизительно 9 мкМ и по меньшей мере приблизительно 10 мкМ у пациента. В другом варианте осуществления изобретения предусмотрено введение дозы, которая приводит к концентрации антитела против фактора D согласно настоящему изобретению в пределах по меньшей мере приблизительно 1 пМ, по меньшей мере приблизительно 10 пМ, по меньшей мере приблизительно 100 пМ, по меньшей мере приблизительно 1 нм, по меньшей мере приблизительно 10 нм, по меньшей мере приблизительно 100 нм, по меньшей мере приблизительно 1 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2 мкМ, по меньшей мере приблизительно 3 мкМ, по меньшей мере приблизительно 4 мкМ, по меньшей мере приблизительно 5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 6 мкМ, по меньшей мере приблизительно 7 мкМ, по меньшей мере приблизительно 8 мкМ, по меньшей мере приблизительно 9 мкМ и по меньшей мере приблизительно 10 мкМ в плазме человека.Pharmaceutical compositions suitable for practicing the invention may be administered to deliver a dose of at least about 1 ng/kg, at least about 5 ng/kg, at least about 10 ng/kg, at least about 25 ng/kg, at least about 50 ng/kg, at least about 100 ng/kg, at least about 500 ng/kg, at least about 1 µg/kg, at least about 5 µg/kg, at least about 10 µg /kg, at least about 25 µg/kg, at least about 50 µg/kg, at least about 100 µg/kg, at least about 500 µg/kg, at least about 1 mg/kg, at least at least about 5 mg/kg, at least about 10 mg/kg, at least about 25 mg/kg, at least about 50 mg/kg, at least about 100 mg/kg, at least about 200 mg/kg kg, at least about 300 mg/kg, at least about 400 mg/kg, and at least about 500 mg/kg of the individual's body weight. In one embodiment, a dose is administered that results in an anti-factor D antibody concentration of the present invention of at least about 1 pM, at least about 10 pM, at least about 100 pM, at least about 1 nm, at least at least about 10 nm, at least about 100 nm, at least about 1 μM, at least about 2 μM, at least about 3 μM, at least about 4 μM, at least about 5 μM, at least about 6 μM, at least about 7 μM, at least about 8 μM, at least about 9 μM, and at least about 10 μM in a patient. In another embodiment, the invention provides for the administration of a dose that results in a concentration of an anti-factor D antibody of the present invention within the range of at least about 1 pM, at least about 10 pM, at least about 100 pM, at least about 1 nm, at least about 10 nm, at least about 100 nm, at least about 1 μM, at least about 2 μM, at least about 3 μM, at least about 4 μM, at least about 5 μM, at least about 6 μM, at least about 7 μM, at least about 8 μM, at least about 9 μM, and at least about 10 μM in human plasma.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, подходящие для осуществления изобретения, могут быть введены для доставки дозы не больше чем приблизительно 1 нг/кг, не больше чем приблизительно 5 нг/кг, не больше чем приблизительно 10 нг/кг, не больше чем приблизительно 25 нг/кг, не больше чем приблизительно 50 нг/кг, не больше чем приблизительно 100 нг/кг, не больше чем приблизительно 500 нг/кг, не больше чем приблизительно 1 мкг/кг, не больше чем приблизительно 5 мкг/кг, не больше чем приблизительно 10 мкг/кг, не больше чем приблизительно 25 мкг/кг, не больше чем приблизительно 50 мкг/кг, не больше чем приблизительно 100 мкг/кг, не больше чем приблизительно 500 мкг/кг, не больше чем приблизительно 1 мг/кг, не больше чем приблизительно 5 мг/кг, не больше чем приблизительно 10 мг/кг, не больше чем приблизительно 25 мг/кг, не больше чем приблизительно 50 мг/кг, не больше чем приблизительно 100 мг/кг, не больше чем приблизительно 200 мг/кг, не больше чем приблизительно 300 мг/кг, не больше чем приблизительно 400 мг/кг и не больше чем приблизительно 500 мг/кг массы тела индивида. В одном из вариантов осуществления изобретения вводят дозу, которая приводит к концентрации антитела против фактора D согласно настоящему изобретению не больше чем приблизительно 1 пМ, не больше чем приблизительно 10 пМ, не больше чем приблизительно 100 пМ, не больше чем приблизительно 1 нм, не больше чем приблизительно 10 нм, не больше чем приблизительно 100 нм, не больше чем приблизительно 1 мкМ, не больше чем приблизительно 2 мкМ, не больше чем приблизительно 3 мкМ, не больше чем приблизительно 4 мкМ, не больше чем приблизительно 5 мкМ, не больше чем приблизительно 6 мкМ, не больше чем приблизительно 7 мкМ, не больше чем приблизительно 8 мкМ, не больше чем приблизительно 9 мкМ и не больше чем приблизительно 10 мкМ в человеке. В другом варианте осуществления изобретения предусмотрено введение дозы, которая приводит к концентрации антитела против фактора D согласно настоящему изобретению в пределах не больше чем приблизительно 1 пМ, не больше чем приблизительно 10 пМ, не больше чем приблизительно 100 пМ, не больше чем приблизительно 1 нм, не больше чем приблизительно 10 нм, не больше чем приблизительно 100 нм, не больше чем приблизительно 1 мкМ, не больше чем приблизительно 2 мкМ, не больше чем приблизительно 3 мкМ, не больше чем приблизительно 4 мкМ, не больше чем приблизительно 5 мкМ, не больше чем приблизительно 6 мкМ, не больше чем приблизительно 7 мкМ, не больше чем приблизительно 8 мкМ, не больше чем приблизительно 9 мкМ и не больше чем приблизительно 10 мкМ в плазме человека. Также предусмотрены диапазоны доз между любыми из доз, раскрытых в настоящем документе.In some embodiments, pharmaceutical compositions suitable for carrying out the invention may be administered to deliver a dose of no more than about 1 ng/kg, no more than about 5 ng/kg, no more than about 10 ng/kg, no more than about 25 ng/kg, not more than about 50 ng/kg, not more than about 100 ng/kg, not more than about 500 ng/kg, not more than about 1 µg/kg, not more than about 5 µg/kg, not more than about 10 µg/kg, not more than about 25 µg/kg, not more than about 50 µg/kg, not more than about 100 µg/kg, not more than about 500 µg/kg, not more than about 1 mg /kg, not more than about 5 mg/kg, not more than about 10 mg/kg, not more than about 25 mg/kg, not more than about 50 mg/kg, not more than about 100 mg/kg, not more than about 200 mg/kg, not more than about 300 mg/kg, not more than about 400 mg/kg, and not more than about 500 mg/kg of the individual's body weight. In one embodiment, a dose is administered that results in an anti-factor D antibody concentration of the present invention of no more than about 1 pM, no more than about 10 pM, no more than about 100 pM, no more than about 1 nm, no more less than about 10 nm, not more than about 100 nm, not more than about 1 µM, not more than about 2 µM, not more than about 3 µM, not more than about 4 µM, not more than about 5 µM, not more than about 6 µM, not more than about 7 µM, not more than about 8 µM, not more than about 9 µM, and not more than about 10 µM in a human. In another embodiment, the invention provides for the administration of a dose that results in a concentration of an anti-factor D antibody of the present invention within the range of no more than about 1 pM, no more than about 10 pM, no more than about 100 pM, no more than about 1 nm, not greater than about 10 nm, not greater than about 100 nm, not greater than about 1 μM, not greater than about 2 μM, not greater than about 3 μM, not greater than about 4 μM, not greater than about 5 μM, not greater than about 6 μM, not greater than about 7 μM, not greater than about 8 μM, not greater than about 9 μM, and not greater than about 10 μM in human plasma. Dose ranges between any of the doses disclosed herein are also contemplated.
Как правило, дозы, которые могут вводить в способе согласно изобретению индивиду, в некоторых вариантах осуществления человеку, изменяются в количестве от 0,5 мкг до приблизительно 50 мг на килограмм массы тела индивида. Хотя точная вводимая доза будет изменяться в зависимости от различных факторов, включающих, без ограничения, тип индивида и тип подвергаемого лечению патологического состояния, возраст индивида и путь введения. В некоторых вариантах осуществления доза соединения будет изменяться от приблизительно 1 мкг до приблизительно 10 мг на килограмм массы тела индивида. В других вариантах осуществления доза будет изменяться от приблизительно 3 мкг до приблизительно 1 мг на килограмм массы тела индивида.Typically, doses that can be administered in the method of the invention to an individual, in some embodiments a human, range from 0.5 μg to about 50 mg per kilogram of the individual's body weight. Although the exact dose administered will vary depending on various factors including, without limitation, the type of individual and the type of condition being treated, the age of the individual, and the route of administration. In some embodiments, the dosage of the compound will vary from about 1 μg to about 10 mg per kilogram of an individual's body weight. In other embodiments, the implementation of the dose will vary from about 3 μg to about 1 mg per kilogram of body weight of the individual.
Соединение могут вводить индивиду с частотой несколько раз в день, или его могут вводить реже, например, один раз в день, два раза в день, три раза в день, один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, один раз в две недели, два раза в две недели, три раза в две недели, один раз в месяц, два раза в месяц, три раза в месяц, или еще реже, например, один раз в несколько месяцев или даже один раз или несколько раз в год или меньше. Частота введения дозы будет очевидна специалисту и будет зависеть от различных факторов, таких как, без ограничения перечисленным, тип и тяжесть подвергаемого лечению заболевания, тип и возраст индивида, и т.д. Лекарственные формы фармацевтических композиций могут быть изготовлены любым известным, или разработанным впоследствии, способом в области фармакологии. Как правило, такие способы получения включают этап приведения действующего вещества в ассоциацию с носителем или одним или более другими вспомогательными компонентами, а затем, в случае необходимости или потребности, формования или упаковки продукта в форме требуемой однодозовой или многодозовой единицы.The compound may be administered to the individual at a frequency of several times a day, or it may be administered less frequently, for example, once a day, twice a day, three times a day, once a week, twice a week, three times a week, one once every two weeks, twice every two weeks, three times every two weeks, once a month, twice a month, three times a month, or even less frequently, such as once every several months, or even once or several times per year or less. Dosing frequency will be apparent to those skilled in the art and will depend on various factors such as, but not limited to, the type and severity of the disease being treated, the type and age of the individual, and so forth. Dosage forms of pharmaceutical compositions can be manufactured by any known or subsequently developed method in the field of pharmacology. Typically, such preparations include the step of bringing the active ingredient into association with the carrier or one or more other accessory ingredients, and then, as needed or required, shaping or packaging the product into the desired single or multi-dose unit form.
Хотя описание фармацевтических композиций, представленное в настоящем документе, в основном направлено на фармацевтические композиции, которые подходят для рецептурного медицинского применения, специалисту в данной области будет очевидно, что такие композиции обычно подходят для введения индивидам всех типов. Модификация фармацевтических композиций, подходящих для медицинского применения, с целью получить композиции, подходящие для введения различным индивидам, хорошо известна, при этом ветеринар–фармаколог средней квалификации сможет разработать и выполнить такую модификацию с помощью простых экспериментов, если таковые потребуются. Пациенты, которым предполагается вводить фармацевтические композиции согласно изобретению, включают, без ограничения перечисленными, людей и других приматов, млекопитающих, в том числе коммерчески значимых млекопитающих, таких как приматы, не относящиеся к человеку, крупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, кошки и собаки.While the description of pharmaceutical compositions provided herein is generally directed to pharmaceutical compositions that are suitable for prescription medical use, one of skill in the art will appreciate that such compositions are generally suitable for administration to individuals of all types. Modification of pharmaceutical compositions suitable for medical use in order to obtain compositions suitable for administration to different individuals is well known, and the average veterinary pharmacologist will be able to develop and perform such modification with simple experiments, if required. Patients to whom the pharmaceutical compositions of the invention are intended to be administered include, but are not limited to, humans and other primates, mammals, including commercial mammals such as non-human primates, cattle, pigs, horses, sheep, cats and dogs.
Фармацевтические композиции, которые могут применяться в способах согласно изобретению, могут быть изготовлены, упакованы или выпущены в продажу в форме препаратов, подходящих для офтальмологического, перорального, ректального, вагинального, парентерального, наружного, ингаляционного, интраназального, буккального, внутриглазного, интравитреального, внутримышечного, внутрикожного и внутривенного путей введения. Другие предполагаемые лекарственные формы включают перспективные наночастицы, липосомные препараты, повторно закрытые эритроциты, содержащие действующее вещество, и лекарственные формы на основе иммунологических средств.Pharmaceutical compositions useful in the methods of the invention may be formulated, packaged or marketed in the form of preparations suitable for ophthalmic, oral, rectal, vaginal, parenteral, topical, inhalation, intranasal, buccal, intraocular, intravitreal, intramuscular, intradermal and intravenous routes of administration. Other proposed dosage forms include promising nanoparticles, liposome preparations, re-closed erythrocytes containing the active ingredient, and dosage forms based on immunological agents.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может быть изготовлена, упакована или выпущена в продажу в недозированном виде, в виде однократной единичной дозы или множества однократных единичных доз. Единичная доза представляет собой дискретное количество фармацевтической композиции, содержащее заданное количество действующего вещества. Количество действующего вещества, как правило, равно дозе действующего вещества, которую вводят пациенту, или подходящей части такой дозы, такой как, например, половина или треть такой дозы.The pharmaceutical composition according to the invention can be manufactured, packaged or marketed in undosed form, in the form of a single unit dose or multiple single unit doses. A unit dose is a discrete amount of a pharmaceutical composition containing a given amount of an active ingredient. The amount of active ingredient is generally equal to the dose of active ingredient that is administered to the patient, or a suitable fraction of such a dose, such as, for example, half or a third of such a dose.
Относительные количества действующего вещества, фармацевтически приемлемого носителя и любых дополнительных компонентов в фармацевтической композиции согласно изобретению будут изменяться в зависимости от идентифицирующих сведений, размера и состояния пациента, подвергаемого лечению, и, кроме того, в зависимости от пути, которым композицию требуется вводить. Например, композиция может включать 0,1–100% (в/в) действующего вещества. В различных вариантах осуществления композиция включает по меньшей мере приблизительно 1%, по меньшей мере приблизительно 2%, по меньшей мере приблизительно 3%, по меньшей мере приблизительно 4%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 6%, по меньшей мере приблизительно 7%, по меньшей мере приблизительно 8%, по меньшей мере приблизительно 9%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 11%, по меньшей мере приблизительно 12%, по меньшей мере приблизительно 13%, по меньшей мере приблизительно 14%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 16%, по меньшей мере приблизительно 17%, по меньшей мере приблизительно 18%, по меньшей мере приблизительно 19%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 21%, по меньшей мере приблизительно 22%, по меньшей мере приблизительно 23%, по меньшей мере приблизительно 24%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 26%, по меньшей мере приблизительно 27%, по меньшей мере приблизительно 28%, по меньшей мере приблизительно 29%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 31%, по меньшей мере приблизительно 32%, по меньшей мере приблизительно 33%, по меньшей мере приблизительно 34%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 36%, по меньшей мере приблизительно 37%, по меньшей мере приблизительно 38%, по меньшей мере приблизительно 39%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 41%, по меньшей мере приблизительно 42%, по меньшей мере приблизительно 43%, по меньшей мере приблизительно 44%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 46%, по меньшей мере приблизительно 47%, по меньшей мере приблизительно 48%, по меньшей мере приблизительно 49%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 51%, по меньшей мере приблизительно 52%, по меньшей мере приблизительно 53%, по меньшей мере приблизительно 54%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 56%, по меньшей мере приблизительно 57%, по меньшей мере приблизительно 58%, по меньшей мере приблизительно 59%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 61%, по меньшей мере приблизительно 62%, по меньшей мере приблизительно 63%, по меньшей мере приблизительно 64%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 66%, по меньшей мере приблизительно 67%, по меньшей мере приблизительно 68%, по меньшей мере приблизительно 69%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 71%, по меньшей мере приблизительно 72%, по меньшей мере приблизительно 73%, по меньшей мере приблизительно 74%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 76%, по меньшей мере приблизительно 77%, по меньшей мере приблизительно 78%, по меньшей мере приблизительно 79%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 81%, по меньшей мере приблизительно 82%, по меньшей мере приблизительно 83%, по меньшей мере приблизительно 84%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или по меньшей мере приблизительно 100% (в/в) действующего веществаThe relative amounts of active ingredient, pharmaceutically acceptable carrier and any additional ingredients in a pharmaceutical composition of the invention will vary depending on the identity, size and condition of the patient being treated, and further depending on the route by which the composition is to be administered. For example, the composition may include 0.1-100% (w/w) active ingredient. In various embodiments, the composition comprises at least about 1%, at least about 2%, at least about 3%, at least about 4%, at least about 5%, at least about 6%, at least at least about 7%, at least about 8%, at least about 9%, at least about 10%, at least about 11%, at least about 12%, at least about 13%, at least about 14%, at least about 15%, at least about 16%, at least about 17%, at least about 18%, at least about 19%, at least about 20%, at least about 21%, at least about 22%, at least about 23%, at least about 24%, at least about 25%, at least about 26%, at least about 27%, at least about 28 %, at least about 29%, at least about 30%, at least about 31%, at least about 32%, at least about 33%, at least about 34%, at least about 35% at least about 36%, at least about 37%, at least about 38%, at least about 39%, at least about 40%, at least about 41%, at least about 42%, at least about 43%, at least about 44%, at least about 45%, at least about 46%, at least about 47%, at least about 48%, at least about 49%, at least about 50%, at least about 51%, at least about 52%, at least about 53%, at least about 54%, at least about 55%, at least about 56%, at least at least about 57%, at least about 58%, at least about 59%, at least about 60%, at least about 61%, at least about 62%, at least about 63%, at least about 64%, at least about 65%, at least about 66%, at least about 67%, at least about 68%, at least about 69%, at least about 70%, at least about 71%, at least about 72%, at least about 73%, at least about 74%, at least about 75%, at least about 76%, at least about 77%, at least about 78 %, at least about 79%, at least about 80%, at least about 81%, at least about 82%, at least about 83%, at least about 84%, at least about 85% at least about 86%, at least about 87%, at least about 88%, at least about 89%, at least about 90%, at least about 91%, at least about 92%, at least about 93%, at least about 94%, at least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, at least about 99%, or at least about 100% (w/w) active ingredient
В дополнение к действующему веществу фармацевтическая композиция согласно изобретению может также включать один или более дополнительных фармацевтически активных компонентов.In addition to the active ingredient, the pharmaceutical composition according to the invention may also include one or more additional pharmaceutically active ingredients.
Лекарственные формы фармацевтической композиции согласно изобретению с контролируемым или замедленным высвобождением могут быть получены с применением стандартной технологии.Dosage forms of the pharmaceutical composition according to the invention with controlled or sustained release can be obtained using standard technology.
Парентеральное введение фармацевтической композиции включает любой путь введения, характеризующийся физическим проникновением через ткань пациента и введением фармацевтической композиции через отверстие в ткани. Парентеральное введение может быть локальным, регионарным или системным. Парентеральное введение, таким образом, включает, без ограничения перечисленным, введение фармацевтической композиции путем инъекции композиции, путем нанесения композиции через хирургический разрез, путем нанесения композиции через проникающую в ткань нехирургическую рану и тому подобное В частности, предусмотрено, что парентеральное введение включает, без ограничения перечисленным, внутривенное, внутриглазное, интравитреальное, подкожное, внутрибрюшинное, внутримышечное, внутрикожное, внутригрудинное и внутриопухолевое введение.Parenteral administration of a pharmaceutical composition includes any route of administration characterized by physical penetration through the patient's tissue and administration of the pharmaceutical composition through an orifice in the tissue. Parenteral administration may be local, regional or systemic. Parenteral administration thus includes, but is not limited to, administering the pharmaceutical composition by injecting the composition, by applying the composition through a surgical incision, by applying the composition through a tissue-penetrating non-surgical wound, and the like. In particular, parenteral administration is contemplated to include, without limitation listed, intravenous, intraocular, intravitreal, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, intradermal, intrasternal and intratumoral administration.
Лекарственные формы фармацевтической композиции, подходящие для парентерального введения, включают действующее вещество в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, таким как стерильная вода или стерильный изотонический раствор хлорида натрия. Такие лекарственные формы могут быть изготовлены, упакованы или выпущены в продажу в форме, подходящей для болюсного введения или для непрерывного введения. Лекарственные формы для инъекций могут быть изготовлены, упакованы или выпущены в продажу в виде стандартной лекарственной формы, такой как ампулы или многодозовые контейнеры, содержащие консервант. Лекарственные формы для парентерального введения включают, без ограничения перечисленными, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных носителях, пасты и имплантируемые лекарственные формы с замедленным высвобождением или биоразлагаемые препараты. Такие лекарственные формы могут дополнительно содержать один или более дополнительных компонентов, включающих, без ограничения перечисленными, суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие вещества. В одном из вариантов осуществления лекарственной формы для парентерального введения действующее вещество предоставлено в сухой (то есть порошковой или гранулированной) форме для восстановления подходящим растворителем (например, стерильной апирогенной водой) перед парентеральным введением восстановленной композиции.Dosage forms of a pharmaceutical composition suitable for parenteral administration include the active ingredient in combination with a pharmaceutically acceptable carrier such as sterile water or sterile isotonic sodium chloride solution. Such dosage forms may be formulated, packaged or marketed in a form suitable for bolus administration or for continuous administration. Dosage forms for injection may be prepared, packaged or marketed in unit dosage form such as ampoules or multi-dose containers containing a preservative. Dosage forms for parenteral administration include, but are not limited to, suspensions, solutions, emulsions in oily or aqueous vehicles, pastes, and implantable sustained release or biodegradable formulations. Such dosage forms may additionally contain one or more additional components, including, but not limited to, suspendresume, stabilizing or dispersing agents. In one embodiment of the parenteral formulation, the active ingredient is provided in dry (ie, powder or granular) form for reconstitution with a suitable solvent (eg, sterile, pyrogen-free water) prior to parenteral administration of the reconstituted composition.
Фармацевтические композиции могут быть изготовлены, упакованы или выпущены в продажу в форме стерильной водной или масляной суспензии или раствора для инъекций. Эта суспензия или раствор могут быть изготовлены в соответствии с известным уровнем техники и могут содержать, помимо действующего вещества, дополнительные компоненты, такие как диспергирующие вещества, смачивающие вещества или суспендирующие вещества. Такие стерильные препараты для инъекций могут быть изготовлены с применением нетоксичного, парентерально приемлемого разбавителя или растворителя, такого как, например, вода или 1,3–бутандиол. Другие приемлемые разбавители и растворители включают, без ограничения перечисленными, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия и нелетучие масла, такие как синтетические моно– или диглицериды. Другие парентерально вводимые лекарственные формы, которые являются подходящими, включают такие лекарственные формы, которые содержат действующее вещество в микрокристаллической форме, в липосомном препарате или в качестве компонента биоразлагаемых полимерных систем. Композиции для замедленного высвобождения или имплантации могут включать фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы, такие как эмульсию, ионообменную смолу, малорастворимый полимер или малорастворимую соль.Pharmaceutical compositions may be formulated, packaged or marketed in the form of a sterile aqueous or oily suspension or injectable solution. This suspension or solution may be prepared in accordance with the prior art and may contain, in addition to the active ingredient, additional components such as dispersing agents, wetting agents or suspending agents. Such sterile injectable preparations can be prepared using a non-toxic, parenterally acceptable diluent or solvent such as, for example, water or 1,3-butanediol. Other suitable diluents and solvents include, but are not limited to, Ringer's solution, isotonic sodium chloride solution, and fixed oils such as synthetic mono- or diglycerides. Other parenterally administered dosage forms that are suitable include those containing the active ingredient in microcrystalline form, in a liposome formulation, or as a component of biodegradable polymer systems. Compositions for sustained release or implantation may include pharmaceutically acceptable polymeric or hydrophobic materials such as an emulsion, an ion exchange resin, a sparingly soluble polymer, or a sparingly soluble salt.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может быть изготовлена, упакована или выпущена в продажу в лекарственной форме, подходящей для ингаляционного введения через полость рта. Такая лекарственная форма может включать сухие частицы, которые включают действующее вещество и имеют диаметр в пределах от приблизительно 0,5 до приблизительно 7 нанометров, и в некоторых вариантах осуществления от приблизительно 1 до приблизительно 6 нанометров. Такие композиции предпочтительно находятся в форме сухих порошков для введения с помощью устройства, включающего резервуар для сухого порошка, в который может быть направлен поток пропеллента для диспергирования порошка, или при использовании низкокипящего растворителя/дозатора сухого порошка, такого как устройство, включающее действующее вещество, растворенное или суспендированное в низкокипящем пропелленте в герметичном контейнере. В некоторых вариантах осуществления такие порошки включают частицы, где по меньшей мере 98% частиц в по весу имеют диаметр больше 0,5 нанометров, и по меньшей мере 95% частиц по количеству имеют диаметр меньше 7 нанометров. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 95% частиц по весу имеют диаметр больше 1 нанометра, и по меньшей мере 90% частиц по количеству имеют диаметр меньше 6 нанометров. В некоторых вариантах осуществления композиции сухого порошка включают твердый тонкодисперсный разбавитель, такой как сахар, и предпочтительно представлены в форме стандартной дозы.The pharmaceutical composition according to the invention may be formulated, packaged or marketed in a dosage form suitable for oral inhalation. Such a dosage form may include dry particles that include the active ingredient and have a diameter ranging from about 0.5 to about 7 nanometers, and in some embodiments from about 1 to about 6 nanometers. Such compositions are preferably in the form of dry powders for administration using a device comprising a dry powder reservoir into which a propellant stream can be directed to disperse the powder, or using a low boiling dry powder solvent/dispenser such as a device comprising the active ingredient dissolved or suspended in a low boiling propellant in a sealed container. In some embodiments, such powders include particles where at least 98% of the particles, by weight, have a diameter greater than 0.5 nanometers, and at least 95% of the particles, by number, have a diameter less than 7 nanometers. In some embodiments, at least 95% of the particles, by weight, have a diameter greater than 1 nanometer, and at least 90% of the particles, by number, have a diameter less than 6 nanometers. In some embodiments, dry powder compositions include a solid fine diluent such as sugar and are preferably presented in unit dose form.
Низкокипящий пропеллент обычно включает жидкие пропелленты, имеющие точку кипения ниже 65°F (~18°C) при атмосферном давлении. Обычно пропеллент может составлять 50–99,9% (в/в) композиции, и действующее вещество может составлять 0,1–20% (в/в) композиции. Пропеллент может также включать дополнительные компоненты, такие как жидкое неионогенное или твердое анионное поверхностно–активное вещество или твердый разбавитель (в некоторых вариантах осуществления имеющий размер частиц такого же порядка, как и частицы, включающие действующее вещество).Low boiling propellant typically includes liquid propellants having a boiling point below 65°F (~18°C) at atmospheric pressure. Typically, the propellant can make up 50-99.9% (w/w) of the composition and the active ingredient can make up 0.1-20% (w/w) of the composition. The propellant may also include additional components such as a liquid nonionic or solid anionic surfactant or a solid diluent (in some embodiments having a particle size of the same order of magnitude as the particles comprising the active ingredient).
Фармацевтические композиции согласно изобретению, изготовленные для доставки в легкие, также могут предоставлять действующее вещество в форме капель раствора или суспензии. Такие лекарственные формы могут быть изготовлены, упакованы или выпущены в продажу в виде водных или разбавленных спиртовых растворов или суспензий, необязательно стерильных, включающих действующее вещество, и могут быть удобно введены с помощью любого устройства для небулизации или распыления. Такие лекарственные формы могут дополнительно включать один или более дополнительных компонентов, включающих, без ограничения перечисленными, вкусовую добавку, такую как сахарин натрия, летучее масло, буферное вещество, поверхностно–активное вещество или консервант, такой как метилгидроксибензоат. В некоторых вариантах осуществления капли, вводимые таким путем введения, имеют средний диаметр в пределах от приблизительно 0,1 до приблизительно 200 нанометров.Pharmaceutical compositions according to the invention formulated for delivery to the lungs may also provide the active substance in the form of droplets of a solution or suspension. Such dosage forms may be formulated, packaged or marketed as aqueous or dilute alcoholic solutions or suspensions, optionally sterile, containing the active ingredient, and may be conveniently administered by any nebulizing or nebulizing device. Such dosage forms may further include one or more additional components including, but not limited to, a flavoring agent such as sodium saccharin, a volatile oil, a buffering agent, a surfactant, or a preservative such as methyl hydroxybenzoate. In some embodiments, droplets administered by this route of administration have an average diameter ranging from about 0.1 to about 200 nanometers.
Лекарственные формы также могут применяться для интраназальной доставки фармацевтической композиции согласно изобретению.Dosage forms can also be used for intranasal delivery of a pharmaceutical composition according to the invention.
Другая лекарственная форма, подходящая для интраназального введения, является грубым порошком, включающим действующее вещество и имеющим среднюю крупность частиц от приблизительно 0,2 до 500 микрометров. Такую лекарственную форму вводят путем быстрого вдыхания порции порошка для ингаляции через носовой ход из контейнера для порошка, удерживаемого близко к ноздре.Another dosage form suitable for intranasal administration is a coarse powder containing the active substance and having an average particle size of from about 0.2 to 500 micrometers. Such a dosage form is administered by rapidly inhaling a portion of the powder for inhalation through the nasal passage from a powder container held close to the nostril.
Лекарственные формы, подходящие для назального введения, могут, например, включать от приблизительно 0,1% (в/в) и до 100% (в/в) действующего вещества, и могут также включать один или более дополнительных компонентов.Dosage forms suitable for nasal administration may, for example, include from about 0.1% (w/w) to 100% (w/w) of the active ingredient, and may also include one or more additional components.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может быть изготовлена, упакована или выпущена в продажу в лекарственной форме, подходящей для буккального введения. Такие лекарственные формы могут быть, например, в форме таблеток или таблеток для рассасывания, изготовленных с применением стандартных способов, и могут, например, содержать от 0,1 до 20% (в/в) действующего вещества, при этом остальная часть включает растворимую в полости рта или разлагаемую композицию и, необязательно, один или более дополнительных компонентов. В альтернативе лекарственные формы, подходящие для буккального введения, могут содержать порошок или аэрозольный или распыляемый раствор, или суспензию, содержащую действующее вещество. В некоторых вариантах осуществления такие порошковые, аэрозольные или распыляемые лекарственные формы при диспергировании имеют средний размер частиц или капель в пределах от приблизительно 0,1 до приблизительно 200 нанометров и дополнительно могут включать один или более дополнительных компонентов.The pharmaceutical composition of the invention may be formulated, packaged or marketed in a dosage form suitable for buccal administration. Such dosage forms may, for example, be in the form of tablets or lozenges prepared using standard methods and may, for example, contain from 0.1 to 20% (w/w) of the active substance, with the remainder comprising soluble in oral or degradable composition; and, optionally, one or more additional components. Alternatively, dosage forms suitable for buccal administration may contain a powder or an aerosol or spray solution or suspension containing the active ingredient. In some embodiments, such powder, aerosol, or spray dosage forms, when dispersed, have an average particle or droplet size ranging from about 0.1 to about 200 nanometers, and may further include one or more additional components.
При использовании в настоящем документе "дополнительные компоненты" включают, без ограничения перечисленным, один или более из следующего: вспомогательные вещества; поверхностно–активные вещества; диспергирующие вещества; инертные разбавители; гранулирующие вещества и разрыхлители; связующие вещества; смазывающие вещества; подсластители; ароматизаторы; красители; консерванты; физиологически разлагаемые композиции, такие как желатин; водные разбавители и растворители; масляные разбавители и растворители; суспендирующие вещества; диспергирующие или смачивающие вещества; эмульгаторы, смягчающие вещества; буферы; соли; загустители; наполнители; эмульгаторы; антиоксиданты; антибиотики; противогрибковые средства; стабилизирующие вещества; и фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы. Другие "дополнительные компоненты", которые могут быть включены в фармацевтические композиции согласно изобретению, известны в уровне техники и описаны, например, в справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences (1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA), который включен в настоящий документ посредством отсылки.As used herein, "additional components" include, without limitation, one or more of the following: excipients; surfactants; dispersants; inert diluents; granulating agents and disintegrators; binders; lubricants; sweeteners; flavors; dyes; preservatives; physiologically degradable compositions such as gelatin; aqueous diluents and solvents; oil thinners and solvents; suspending agents; dispersing or wetting agents; emulsifiers, emollients; buffers; salt; thickeners; fillers; emulsifiers; antioxidants; antibiotics; antifungal agents; stabilizing agents; and pharmaceutically acceptable polymeric or hydrophobic materials. Other "additional ingredients" that may be included in the pharmaceutical compositions of the invention are known in the art and are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences (1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA), which is included to this document by reference.
Клетки, продуцирующие антитела и их антигенсвязывающие фрагментыCells that produce antibodies and their antigen-binding fragments
В некоторых вариантах осуществления изобретения предложена клетка или клеточная линия (такие как клетки–хозяева), которая продуцирует по меньшей мере одно из антител против фактора D или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления клетка или клеточная линия представляет собой генетически модифицированную клетку, которая продуцирует по меньшей мере одно из антител против фактора D или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления клетка или клеточная линия является гибридомой, которая продуцирует по меньшей мере одно из антител против фактора D или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе.In some embodiments, the invention provides a cell or cell line (such as host cells) that produces at least one of the anti-factor D antibodies or antigen-binding fragments described herein. In one embodiment, the cell or cell line is a genetically modified cell that produces at least one of the anti-factor D antibodies or antigen-binding fragments described herein. In one embodiment, the cell or cell line is a hybridoma that produces at least one of the anti-factor D antibodies or antigen-binding fragments described herein.
Гибридные клетки (гибридомы) обычно получают в результате массовых слияний мышиных спленоцитов, которые обогащены В–лимфоцитами, и миеломных "клетков–партнеров по слиянию" (Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (Garland Publishing, Inc. 1994); Harlow et al., Antibodies. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988). Клетки при слиянии затем распределяют в пулы, которые можно исследовать на продукцию антител с нужной специфичностью. Положительные пулы могут быть затем подразделены дополнительно, пока не будут идентифицированы одиночные клеточные клоны, которые продуцируют антитела с нужной специфичностью. Антитела, продуцируемые такими клонами, называются моноклональными антителами.Hybrid cells (hybridomas) are usually obtained from mass fusions of murine splenocytes, which are enriched in B-lymphocytes, and myeloma "fusion partner cells" (Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (Garland Publishing, Inc. 1994); Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988) Cells at confluence are then divided into pools that can be assayed for the production of antibodies with the desired specificity Positive pools can then be further subdivided until single cell clones will be identified that produce antibodies with the desired specificity.The antibodies produced by such clones are called monoclonal antibodies.
Также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие любое из антител или фрагментов антител, раскрытых в настоящем документе, а также векторы, содержащие нуклеиновые кислоты. Таким образом, антитела и фрагменты согласно изобретению могут быть получены при экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке или клеточной линии, такой как клеточные линии, обычно используемые для экспрессии рекомбинантных или гуманизированных иммуноглобулинов. Таким образом, антитела и фрагменты согласно изобретению также могут быть получены при клонировании нуклеиновых кислот в один или более векторов экспрессии и трансформации вектора в клеточную линию, такую как клеточные линии, обычно используемые для экспрессии рекомбинантных или гуманизированных иммуноглобулинов.Also provided are nucleic acids encoding any of the antibodies or antibody fragments disclosed herein, as well as vectors containing the nucleic acids. Thus, the antibodies and fragments of the invention can be obtained by expressing the nucleic acid in a cell or cell line, such as the cell lines commonly used for the expression of recombinant or humanized immunoglobulins. Thus, antibodies and fragments of the invention can also be obtained by cloning nucleic acids into one or more expression vectors and transforming the vector into a cell line, such as cell lines commonly used to express recombinant or humanized immunoglobulins.
Гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов или их фрагменты, могут быть сконструированы в соответствии со способами, включающими, без ограничения, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), известную в данной области (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Berger & Kimmel, Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1987; Co et al., 1992, J. Immunol. 148:1149). Например, гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи или их фрагменты, можно клонировать из геномной ДНК клетки, секретирующей антитело, или кДНК получают в результате обратной транскрипции клеточной РНК. Клонирование выполняют с помощью стандартных методов, включающих использование ПЦР праймеров, которые гибридизуются с последовательностями, фланкирующими или перекрывающимися с генами или сегментами генов, подлежащих клонированию.Genes encoding immunoglobulin heavy and light chains, or fragments thereof, can be constructed according to methods including, but not limited to, polymerase chain reaction (PCR) known in the art (see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Berger & Kimmel, Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1987; Co et al., 1992, J. Immunol. 148:1149). For example, genes encoding heavy and light chains, or fragments thereof, can be cloned from the genomic DNA of an antibody-secreting cell, or cDNA is obtained by reverse transcription of cellular RNA. Cloning is performed using standard methods, including the use of PCR primers that hybridize to sequences flanking or overlapping with the genes or gene segments to be cloned.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело по изобретению, или тяжелую цепь или легкую цепь, или их фрагменты, можно получать и применять в соответствии с технологиями рекомбинантных нуклеиновых кислот для получения специфического иммуноглобулина, цепи иммуноглобулина или их фрагмента, или варианта, в различных клетках–хозяевах или в системе трансляции in vitro. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела или их фрагменты, могут быть помещены в подходящие прокариотические или эукариотические векторы, например векторы экспрессии, и введены в подходящую клетку–хозяина подходящим способом, например путем трансформации, трансфекции, электропорации, инфицирования, при этом нуклеиновая кислота функционально связана с одним или более элементами регуляции экспрессии, например в векторе, или интегрирована в геном клетки–хозяина.Nucleic acids encoding an antibody of the invention, or a heavy chain or a light chain, or fragments thereof, can be prepared and used in accordance with recombinant nucleic acid technologies to produce a specific immunoglobulin, immunoglobulin chain, or fragment or variant thereof, in various host cells or in the in vitro translation system. For example, nucleic acids encoding antibodies or fragments thereof can be placed in suitable prokaryotic or eukaryotic vectors, e.g., expression vectors, and introduced into a suitable host cell in an appropriate manner, e.g., by transformation, transfection, electroporation, infection, wherein the nucleic acid is functionally linked to one or more expression control elements, for example in a vector, or integrated into the genome of the host cell.
В некоторых вариантах осуществления тяжелые и легкие цепи или фрагменты этого, могут быть собраны в двух разных векторах экспрессии, которые могут использоваться для котрансфекции реципиентной клетки. В некоторых вариантах осуществления каждый вектор может содержать два или более селективных генов, один для селекции в бактериальной системе и один для селекции в эукариотической системе. Эти векторы обеспечивают получение и амплификацию генов в бактериальной системе, и последующую котрансфекцию эукариотических клеток и отбор котрансфицированных клеток. Процедура отбора может использоваться для отбора по экспрессии нуклеиновых кислот антитела, введенных в двух разных ДНК векторах в эукариотическую клетку.In some embodiments, the heavy and light chains, or fragments thereof, can be assembled into two different expression vectors that can be used to co-transfect the recipient cell. In some embodiments, each vector may contain two or more selection genes, one for selection in a bacterial system and one for selection in a eukaryotic system. These vectors provide for the production and amplification of genes in the bacterial system, and the subsequent co-transfection of eukaryotic cells and the selection of co-transfected cells. A selection procedure can be used to select for expression of antibody nucleic acids introduced in two different DNA vectors into a eukaryotic cell.
В альтернативе нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелые и легкие цепи или их фрагменты, могут экспрессироваться с одного вектора. Хотя легкие и тяжелые цепи кодируются отдельными генами, их можно соединить при использовании рекомбинантных методов. Например, два полипептида можно соединить синтетическим линкером, который позволяет получать их в виде одной белковой цепи, в который VL и VH области спарены с образованием моновалентных молекул (известных как одиноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al., 1988, Science 242: 423–426; и Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879–5883).Alternatively, nucleic acids encoding heavy and light chains, or fragments thereof, may be expressed from a single vector. Although light and heavy chains are encoded by separate genes, they can be joined using recombinant methods. For example, two polypeptides can be connected by a synthetic linker that allows them to be produced as a single protein chain, in which the V L and V H regions are paired to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv); see, for example, Bird et al. , 1988, Science 242: 423-426 and Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883).
В изобретении предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь и/или легкую цепь, а также ее фрагменты. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепь или их фрагменты, может быть сконструирована так, что она содержит синтетическую сигнальную последовательность для секреции антитела или фрагмента при продукции в клетке. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты может содержать специфические ДНК линкеры, которые позволяют вводить другие последовательности антител и сохраняют трансляционную рамку считывания, чтобы не изменять аминокислоты, обычно присутствующие в последовательностях антител.The invention provides an isolated nucleic acid molecule containing a nucleic acid sequence encoding a heavy chain and/or light chain, as well as fragments thereof. A nucleic acid molecule containing the light and heavy chain coding sequences or fragments thereof can be designed to contain a synthetic signal sequence for secretion of the antibody or fragment when produced in a cell. In addition, the nucleic acid molecule may contain specific DNA linkers that allow the introduction of other antibody sequences and retain the translational reading frame so as not to alter the amino acids normally found in antibody sequences.
В соответствии с настоящим изобретением последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие антитело, могут быть встроены в соответствующий вектор экспрессии. В различных вариантах осуществления вектор экспрессии содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции нуклеиновой кислоты, кодирующей встроенное антитело, обеспечивая получение молекул рекомбинантной ДНК, которые направляют экспрессию последовательностей антитела для образования антитела или его фрагмента.In accordance with the present invention, nucleic acid sequences encoding an antibody can be inserted into an appropriate expression vector. In various embodiments, the expression vector contains the necessary elements for transcription and translation of the nucleic acid encoding the inserted antibody, producing recombinant DNA molecules that direct the expression of antibody sequences to form an antibody or fragment thereof.
Кодирующие антитело нуклеиновые кислоты или их фрагменты могут быть подвергнуты различным генно–инженерным методам, которые известны специалистам в данной области, таким как сайт–направленный мутагенез.Nucleic acids encoding an antibody, or fragments thereof, can be subjected to various genetic engineering methods known to those skilled in the art, such as site-directed mutagenesis.
Различные способы могут использоваться для экспрессии нуклеиновых кислот в клетке. Нуклеиновые кислоты можно клонировать во множество типов векторов. Однако настоящее изобретение не следует считать ограниченным каким–либо конкретным вектором. Напротив, настоящее изобретение следует рассматривать как охватывающее целый ряд векторов, которые легко доступны и/или известны в уровне техники. Например, нуклеиновую кислоту согласно изобретению можно клонировать в вектор, включающий, без ограничения перечисленным, плазмиду, фагмиду, производное фага, вирус животного и космиду. Векторы, представляющие особый интерес, включают векторы экспрессии, векторы репликации, векторы генерации зондов и секвенирующие векторы.Various methods can be used to express nucleic acids in a cell. Nucleic acids can be cloned into many types of vectors. However, the present invention should not be considered limited to any particular vector. On the contrary, the present invention should be considered as covering a number of vectors that are readily available and/or known in the art. For example, the nucleic acid of the invention can be cloned into a vector including, but not limited to, a plasmid, a phagemid, a phage derivative, an animal virus, and a cosmid. Vectors of particular interest include expression vectors, replication vectors, probe generation vectors, and sequencing vectors.
В конкретных вариантах осуществления вектор экспрессии выбран из группы, состоящей из вирусного вектора, бактериального вектора и вектора клеток млекопитающего. Существует множество векторных систем экспрессии, которые включают, по меньшей мере, часть или все композиции, обсуждаемые выше. Системы на основе прокариотических и/или эукариотических векторов можно использовать для применения в настоящем изобретении для получения полинуклеотидов или их родственных полипептидов. Многие такие системы широко доступны в продаже.In specific embodiments, the expression vector is selected from the group consisting of a viral vector, a bacterial vector, and a mammalian cell vector. There are many vector expression systems that include at least some or all of the compositions discussed above. Systems based on prokaryotic and/or eukaryotic vectors can be used for use in the present invention to obtain polynucleotides or their related polypeptides. Many such systems are widely available commercially.
Технология вирусных векторов хорошо известна в данной области и описана, например, в Sambrook et al. (2012) и в Ausubel et al. (1999), а также в других руководствах по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, которые могут использоваться в качестве векторов, включают, без ограничения перечисленными, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы и лентивирусы. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе вируса стволовых клеток мыши (MSCV) используется для экспрессии требуемой нуклеиновой кислоты. Было показано, что векторы MSCV эффективно экспрессируют требуемые нуклеиновые кислоты в клетках. Однако изобретение не должно быть ограничено применением только вектора MSCV, напротив, в изобретение включен любой способ ретровирусной экспрессии. Другими примерами вирусных векторов являются векторы на основе вируса мышиного лейкоза Молони (MoMuLV) и ВИЧ. В некоторых вариантах осуществления подходящий вектор содержит точку начала репликации, функционирующую по меньшей мере в одном организме, промоторную последовательность, удобные сайты рестрикции и один или более селективных маркеров (см., например, WO 01/96584; WO 01/29058; и патент США 6,326,193).Viral vector technology is well known in the art and is described, for example, in Sambrook et al. (2012) and Ausubel et al. (1999), as well as in other guides to virology and molecular biology. Viruses that can be used as vectors include, but are not limited to, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpesviruses, and lentiviruses. In some embodiments, a mouse stem cell virus (MSCV) vector is used to express the desired nucleic acid. MSCV vectors have been shown to efficiently express the desired nucleic acids in cells. However, the invention should not be limited to the use of the MSCV vector alone, on the contrary, any retroviral expression method is included in the invention. Other examples of viral vectors are Moloney mouse leukemia virus (MoMuLV) and HIV vectors. In some embodiments, a suitable vector comprises an origin of replication operable in at least one organism, a promoter sequence, convenient restriction sites, and one or more selectable markers (see, for example, WO 01/96584; WO 01/29058; and US Pat. 6,326,193).
Могут использоваться дополнительные регуляторные элементы, например, энхансеры, модулирующие частоту инициации транскрипции. Промотор может быть таким промотором, который обычно связан с последовательностью гена или нуклеиновой кислоты, и который может быть получен при выделении 5'–некодирующих последовательностей, расположенных перед кодирующим сегментом и/или экзоном. Такой промотор может именоваться "эндогенным". Аналогичным образом, энхансер может являться энхансером, обычно связанным с последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенным после или перед этой последовательностью. В альтернативе определенные преимущества будут получены при помещении сегмента кодирующей нуклеиновой кислоты под контроль рекомбинантного или гетерологичного промотора, который относится к промотору, который обычно не связан с последовательностью нуклеиновой кислоты в ее естественном окружении. Рекомбинантный или гетерологичный энхансер также относится к энхансеру, обычно не связанному с последовательностью нуклеиновой кислоты в ее естественном окружении. Такие промоторы или энхансеры могут включать в себя промоторы или энхансеры других генов, а также промоторы или энхансеры, выделенные из любой другой прокариотической, вирусной или эукариотической клетки, и промоторы или энхансеры, не встречающиеся в природе, например, содержащие разные элементы из различных областей регуляции транскрипции и/или мутации, которые изменяют экспрессию. В дополнение к получению последовательностей нуклеиновых кислот из промоторов и энхансеров синтетически, последовательности могут быть получены при использовании технологии рекомбинантного клонирования и/или амплификации нуклеиновых кислот, включая ПЦР, в сочетании с композициями, раскрытыми в настоящем документе (патент США 4,683,202, патент США 5,928,906). Кроме того, предполагается, что также могут использоваться контрольные последовательности, которые направляют транскрипцию и/или экспрессию последовательностей внутри неядерных органелл, таких как митохондрии, хлоропласты и тому подобноеAdditional regulatory elements may be used, such as enhancers that modulate the frequency of transcription initiation. A promoter may be one that is normally associated with a gene or nucleic acid sequence and that can be obtained by isolating 5' non-coding sequences located before the coding segment and/or exon. Such a promoter may be referred to as "endogenous". Similarly, an enhancer may be an enhancer, usually associated with a nucleic acid sequence located after or before this sequence. In the alternative, certain advantages will be obtained by placing the coding nucleic acid segment under the control of a recombinant or heterologous promoter, which refers to a promoter that is not normally associated with the nucleic acid sequence in its natural environment. Recombinant or heterologous enhancer also refers to an enhancer not normally associated with a nucleic acid sequence in its natural environment. Such promoters or enhancers may include promoters or enhancers of other genes, as well as promoters or enhancers isolated from any other prokaryotic, viral or eukaryotic cell, and promoters or enhancers not found in nature, for example, containing different elements from different regulatory regions. transcriptions and/or mutations that alter expression. In addition to obtaining nucleic acid sequences from promoters and enhancers synthetically, sequences can be obtained using recombinant cloning and/or amplification of nucleic acids, including PCR, in combination with the compositions disclosed herein (US patent 4,683,202, US patent 5,928,906) . In addition, it is contemplated that control sequences that direct transcription and/or expression of sequences within non-nuclear organelles such as mitochondria, chloroplasts, and the like can also be used.
Конечно, будет важно использовать промотор и/или энхансер, который эффективно направляет экспрессию сегмента ДНК в типе клетки, органелле и организме, выбранных для экспрессии. Специалистам в области молекулярной биологии обычно известно, как использовать промоторы, энхансеры и комбинации типов клеток для экспрессии белка, например, см. Sambrook et al. (2012). Используемые промоторы могут быть конститутивными, тканеспецифическими, индуцируемыми и/или могут применяться в соответствующих условиях для направления экспрессии введенного сегмента ДНК на высоком уровне, что является преимуществом при крупномасштабном производстве рекомбинантных белков и их фрагментов.Of course, it will be important to use a promoter and/or enhancer that effectively directs the expression of the DNA segment in the cell type, organelle and organism chosen for expression. Those skilled in the art of molecular biology are generally aware of how to use promoters, enhancers, and combinations of cell types to express a protein, see, for example, Sambrook et al. (2012). The promoters used can be constitutive, tissue-specific, inducible and/or can be used under appropriate conditions to direct the expression of the introduced DNA segment at a high level, which is an advantage in large-scale production of recombinant proteins and their fragments.
Примером промотора является последовательность предраннего промотора цитомегаловируса (ЦМВ). Эта промоторная последовательность является сильной конститутивной промоторной последовательностью, способной индуцировать высокие уровни экспрессии любой полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с ней. Впрочем, также могут использоваться другие последовательности конститутивных промоторов, включающие, без ограничения перечисленными, ранний промотор вируса обезьян 40 (SV40), вирус опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), промотор вируса Молони, промотор вируса лейкоза птиц, предранний промотор вируса Эпштейна–Барр, промотор вируса саркомы Рауса, а также промоторы генов человека, такие как, без ограничения перечисленными, промотор актина, промотор миозина, промотор гемоглобина и промотор креатина мышц. Кроме того, изобретение не должно ограничиваться применением конститутивных промоторов. Индуцируемые промоторы также рассматриваются как часть изобретения. Применение индуцируемого промотора в изобретении обеспечивает молекулярный включатель, способный включать экспрессию полинуклеотидной последовательности, с которой он функционально связан, когда такая экспрессия требуется, или отключать экспрессию, когда экспрессия нежелательна. Примеры индуцируемых промоторов включают, без ограничения перечисленными, промотор металлотионеина, глюкокортикоидный промотор, прогестероновый промотор и тетрациклиновый промотор. Кроме того, изобретение включает применение тканеспецифического промотора или промотора, специфического для типа клеток, который является промотором, который активен только в требуемой ткани или клетке. Тканеспецифические промоторы хорошо известны в данной области и включают, без ограничения перечисленными, промотор HER–2 и промоторные последовательности, связанные с PSA.An example of a promoter is the cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter sequence. This promoter sequence is a strong constitutive promoter sequence capable of inducing high levels of expression of any polynucleotide sequence operably linked to it. However, other constitutive promoter sequences may also be used, including, but not limited to, simian virus early 40 (SV40) promoter, mouse mammary tumor virus (MMTV), human immunodeficiency virus (HIV) long terminal repeat (LTR) promoter, virus promoter Moloney, avian leukemia virus promoter, Epstein-Barr virus immediate early promoter, Rous sarcoma virus promoter, and human gene promoters such as, but not limited to, actin promoter, myosin promoter, hemoglobin promoter, and muscle creatine promoter. In addition, the invention should not be limited to the use of constitutive promoters. Inducible promoters are also considered part of the invention. The use of an inducible promoter in the invention provides a molecular switch capable of turning on expression of the polynucleotide sequence to which it is operably linked when such expression is required, or turning off expression when expression is not desired. Examples of inducible promoters include, but are not limited to, the metallothionein promoter, the glucocorticoid promoter, the progesterone promoter, and the tetracycline promoter. In addition, the invention includes the use of a tissue-specific or cell-type-specific promoter, which is a promoter that is active only in the desired tissue or cell. Tissue-specific promoters are well known in the art and include, but are not limited to, the HER-2 promoter and PSA-related promoter sequences.
Для оценки экспрессии нуклеиновых кислот вектор экспрессии, который предполагается ввести в клетку, также может содержать либо селективный маркерный ген, либо репортерный ген, либо оба, для облегчения идентификации и отбора экспрессирующих клеток из популяции клеток, которые считаются трансфицированными или инфицированными посредством вирусных векторов. В других вариантах осуществления селективный маркер может находиться на отдельной нуклеиновой кислоте и использоваться в процедуре котрансфекции. Как селективные маркеры, так и репортерные гены могут быть фланкированы соответствующими регуляторными последовательностями для обеспечения экспрессии в клетках–хозяевах. Подходящие селективные маркеры известны в данной области и включают, например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как noe и тому подобноеTo assess the expression of nucleic acids, the expression vector to be introduced into the cell may also contain either a selectable marker gene or a reporter gene, or both, to facilitate the identification and selection of expressing cells from a population of cells considered to be transfected or infected with viral vectors. In other embodiments, the selectable marker may be on a single nucleic acid and used in a co-transfection procedure. Both selectable markers and reporter genes can be flanked by appropriate regulatory sequences to ensure expression in host cells. Suitable selectable markers are known in the art and include, for example, antibiotic resistance genes such as noe and the like.
Репортерные гены используются для идентификации потенциально трансфицированных клеток и для оценки функциональности регуляторных последовательностей. Репортерные гены, которые кодируют легко определяемые белки, хорошо известны в данной области. Обычно репортерный ген представляет собой ген, который не присутствует или не экспрессируется организмом или тканью реципиента, и который кодирует белок, экспрессия которого проявляется в некотором легко обнаруживаемом свойстве, например ферментативной активности. Экспрессию репортерного гена определяют в подходящее время после введения ДНК в реципиентные клетки.Reporter genes are used to identify potentially transfected cells and to assess the functionality of regulatory sequences. Reporter genes that encode easily detectable proteins are well known in the art. Typically, a reporter gene is a gene that is not present or not expressed by the host organism or tissue and which encodes a protein whose expression is manifested in some easily detectable property, such as enzymatic activity. The expression of the reporter gene is determined at the appropriate time after the introduction of the DNA into the recipient cells.
Подходящие репортерные гены могут включать гены, кодирующие люциферазу, бета–галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу, секретируемую щелочную фосфатазу, или ген зеленого флуоресцентного белка (см., например, Ui–Tei et al., 2000 FEBS Lett. 479:79–82). Подходящие системы экспрессии хорошо известны и могут быть получены при использовании хорошо известных методик или приобретены на рынке. Как правило, конструкцию с минимальной 5'–фланкирующей областью, демонстрирующую наиболее высокий уровень экспрессии репортерного гена, идентифицируют как промотор. Такие промоторные области могут быть связаны с репортерным геном и могут использоваться для оценки средств на способность модулировать направляемую промотором транскрипцию.Suitable reporter genes may include genes encoding luciferase, beta-galactosidase, chloramphenicol acetyltransferase, secreted alkaline phosphatase, or a green fluorescent protein gene (see, for example, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Lett. 479:79-82). Suitable expression systems are well known and can be obtained using well known techniques or purchased from the market. Typically, a construct with a minimal 5' flanking region that exhibits the highest level of reporter gene expression is identified as a promoter. Such promoter regions can be associated with a reporter gene and can be used to evaluate means for the ability to modulate promoter-driven transcription.
Способы введения и экспрессии нуклеиновых кислот в клетке известны в уровне техники. В отношении вектора экспрессии вектор может быть с легкостью введен в клетку–хозяина, например, клетку млекопитающего, бактериальную, дрожжевую клетку или клетку насекомого любым способом из уровня техники. Например, вектор экспрессии может быть перенесен в клетку–хозяина физическими, химическими или биологическими способами.Methods for introducing and expressing nucleic acids in a cell are known in the art. With respect to an expression vector, the vector can easily be introduced into a host cell, for example a mammalian, bacterial, yeast or insect cell, by any method in the art. For example, the expression vector can be transferred into the host cell by physical, chemical, or biological means.
Физические способы введения полинуклеотида в клетку–хозяина включают осаждение фосфатом кальция, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию, лазеропорацию и тому подобное Способы получения клеток, включающих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты, известны в уровне техники. См., например, Sambrook et al. (2012) и Ausubel et al. (1999).Physical methods for introducing a polynucleotide into a host cell include calcium phosphate precipitation, lipofection, particle bombardment, microinjection, electroporation, laser poration, and the like. Methods for producing cells comprising vectors and/or exogenous nucleic acids are known in the art. See, for example, Sambrook et al. (2012) and Ausubel et al. (1999).
Биологические способы введения представляющей интерес нуклеиновой кислоты в клетку–хозяина включают применение ДНК и РНК векторов. Вирусные векторы и особенно ретровирусные векторы стали наиболее широко применяемым методом вставки генов в клетки млекопитающих, например, клетки человека. Другие вирусные векторы могут быть получены из лентивируса, поксвирусов, вируса простого герпеса I, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов, и тому подобное См., например, патенты США 5,350,674 и 5,585,362.Biological methods for introducing a nucleic acid of interest into a host cell include the use of DNA and RNA vectors. Viral vectors, and especially retroviral vectors, have become the most widely used method for inserting genes into mammalian cells, such as human cells. Other viral vectors can be derived from lentivirus, poxviruses, herpes simplex virus I, adenoviruses and adeno-associated viruses, and the like. See, for example, US Pat. Nos. 5,350,674 and 5,585,362.
Химические способы введения нуклеиновой кислоты в клетку–хозяина включают коллоидные дисперсионные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, включая эмульсии типа масло в воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидной системой для применения в качестве носителя доставки in vitro и in vivo является липосома (например, везикула из искусственной мембраны). Получение и применение таких систем хорошо известно в уровне техники.Chemical methods for introducing a nucleic acid into a host cell include colloidal dispersion systems such as macromolecular complexes, nanocapsules, microspheres, granules, and lipid-based systems, including oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and liposomes. A preferred colloidal system for use as an in vitro and in vivo delivery vehicle is a liposome (eg, an artificial membrane vesicle). The preparation and use of such systems is well known in the art.
Независимо от способа, используемого для введения экзогенных нуклеиновых кислот в клетку–хозяина или иного воздействия на клетку нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, для подтверждения присутствия последовательности рекомбинантной ДНК в клетке–хозяине могут проводить различные анализы. Такие анализы включают, например, "молекулярно–биологические" анализы, хорошо известные специалистам в данной области, такие как Саузерн и Нозерн–блоттинг, ОТ–ПЦР и ПЦР; "биохимические" анализы, такие как обнаружение присутствия или отсутствия конкретного пептида, например, с помощью иммунологических методов (ИФА и Вестерн–блоты) или с помощью анализов, описанных в настоящем документе для идентификации средств, включенных в объем изобретения.Regardless of the method used to introduce exogenous nucleic acids into the host cell, or otherwise expose the cell to the nucleic acid of the present invention, various assays can be performed to confirm the presence of a recombinant DNA sequence in the host cell. Such assays include, for example, "molecular biological" assays well known to those skilled in the art such as Southern and Northern blotting, RT-PCR and PCR; "biochemical" assays, such as detecting the presence or absence of a particular peptide, for example, using immunological methods (ELISA and Western blots) or using the assays described herein to identify agents included in the scope of the invention.
Не относящиеся к человеку животные, экспрессирующие фактор D человекаNon-human animals expressing human factor D
Изобретение также включает генетически модифицированное животное, не относящееся к человеку, которое экспрессирует фактор D человека. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, не относящееся к человеку, которое экспрессирует фактор D человека, не экспрессирует фактор D животного, не относящегося к человеку. В одном из вариантов осуществления изобретения предложено генетически модифицированное животное, не относящееся к человеку, которое экспрессирует фактор D человека с эндогенных регуляторных элементов животного, не относящегося к человеку, но не экспрессирует фактор D животного, не относящегося к человеку. В некоторых вариантах осуществления животное, не относящееся к человеку, является млекопитающим. В некоторых вариантах осуществления животное, не относящееся к человеку, является грызуном. В некоторых вариантах осуществления животное, не относящееся к человеку, является крысой или мышью.The invention also includes a genetically modified non-human animal that expresses human factor D. In some embodiments, a genetically modified non-human animal that expresses human factor D does not express factor D from a non-human animal. In one embodiment, the invention provides a genetically modified non-human animal that expresses human factor D from endogenous regulatory elements of the non-human animal, but does not express factor D of the non-human animal. In some embodiments, the non-human animal is a mammal. In some embodiments, the non-human animal is a rodent. In some embodiments, the non-human animal is a rat or mouse.
Для создания генетически модифицированного животного, не относящегося к человеку, нуклеиновая кислота, кодирующая белок фактора D человека, может быть включена в рекомбинантный вектор экспрессии в форме, подходящей для экспрессии белка фактора D человека в клетке–хозяине. Термин "в форме, подходящей для экспрессии слитого белка в клетке–хозяине" предназначен для обозначения того, что рекомбинантный вектор экспрессии включает одну или более регуляторных последовательностей, функционально связанных с нуклеиновой кислотой, кодирующей белок фактора D человека таким способом, который обеспечивает транскрипцию нуклеиновой кислоты в мРНК и трансляцию мРНК в белок фактора D человека. Термин "регуляторная последовательность" известен в данной области техники и включает промоторы, энхансеры и другие элементы регуляции экспрессии (например, сигналы полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности известны специалистам в данной области и описаны в публикации 1990, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. Следует понимать, что конструкция вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки–хозяина для трансфекции и/или количество белка фактора D человека, которое должно быть экспрессировано.To create a genetically modified non-human animal, a nucleic acid encoding a human factor D protein can be incorporated into a recombinant expression vector in a form suitable for expression of the human factor D protein in a host cell. The term "in a form suitable for expression of the fusion protein in a host cell" is intended to mean that the recombinant expression vector comprises one or more regulatory sequences operably linked to a nucleic acid encoding a human factor D protein in a manner that allows transcription of the nucleic acid into mRNA and translation of mRNA into human factor D protein. The term "regulatory sequence" is known in the art and includes promoters, enhancers, and other expression control elements (eg, polyadenylation signals). Such regulatory sequences are known to those skilled in the art and are described in 1990, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. It should be understood that the design of the expression vector may depend on such factors as the choice of host cell for transfection and/or the amount of human factor D protein to be expressed.
Генетически модифицированное животное, не относящееся к человеку, может быть создано, например, путем введения нуклеиновой кислоты, кодирующей белок фактора D человека (обычно связанный с соответствующими регуляторными элементами, такими как конститутивный или тканеспецифический энхансер), в ооцит, например, путем микроинъекции, с последующим развитием ооцита у самки мыши–основателя. Интронные последовательности и сигналы полиаденилирования также могут быть включены в трансген для повышения эффективности экспрессии трансгена. Способы создания генетически модифицированных животных, таких как мыши, стали стандартными в данной области и описаны, например, в патентах США 4,736,866 и 4,870,009, а также в публикации 1986, Hogan et al., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory. Генетически модифицированное животное–основатель может использоваться для размножения дополнительных индивидов, несущих трансген. Генетически модифицированные животные, несущие трансген, кодирующий белок фактора D согласно изобретению, могут быть затем скрещены с другими генетически модифицированными животным, несущим другие трансгены, или другими нокаутными животными, например, нокаутной мышью, которая не экспрессирует ген фактора D мыши. Следует понимать, что в дополнение к генетически модифицированным животным система может применяться для создания других индивидов, экспрессирующих фактор D человека.A genetically modified non-human animal can be generated, for example, by introducing a nucleic acid encoding a human factor D protein (usually associated with appropriate regulatory elements such as a constitutive or tissue-specific enhancer) into an oocyte, for example, by microinjection, with subsequent development of the oocyte in the female founding mouse. Intron sequences and polyadenylation signals can also be included in the transgene to improve the efficiency of transgene expression. Methods for creating genetically modified animals, such as mice, have become standard in the art and are described, for example, in US Pat. Harbor Laboratory. The genetically modified founder animal can be used to breed additional individuals carrying the transgene. Genetically modified animals carrying a transgene encoding a factor D protein of the invention can then be bred with other genetically modified animals carrying other transgenes or other knockout animals, such as a knockout mouse that does not express the mouse factor D gene. It should be understood that, in addition to genetically modified animals, the system can be used to create other individuals expressing human factor D.
В одном из вариантов осуществления генетически модифицированное животное, не относящееся к человеку, которое экспрессирует фактор D человека с регуляторных элементов животного, не относящегося к человеку, но не экспрессирует фактор D животного, не являющегося человеком, получено с применением системы, которая заменяет последовательности экзонов (или последовательности экзонов и интронов) фактора D животного, не относящегося к человеку, последовательностями экзонов (или последовательностями экзонов и интронов) фактора D человека, но оставляет без изменений нативные последовательности одного, нескольких или всех регуляторных элементов животного, не относящегося к человеку (например, промотор, энхансеры, фланкирующие области, интроны и т.д.). Хотя может использоваться любая подходящая система, одной примерной системой, с помощью которой может быть получено генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, является система CRISPr/Cas9. Система "CRISPR/Cas" относится к широко распространенному классу бактериальных систем для защиты от чужеродной нуклеиновой кислоты. Системы CRISPR/Cas встречаются в широком спектре эубактериальных и архейных организмов. Системы CRISPR/Cas включают в себя подтипы I, II и III. В системах CRISPR/Cas II дикого типа используется РНК–опосредованная нуклеаза Cas9 в комплексе с направляющей и активирующей РНК для распознавания и расщепления чужеродной нуклеиновой кислоты. Гомологи Cas9 обнаружены в целом ряде эубактерий, включающих, без ограничения перечисленными, бактерии следующих таксономических групп: Actinobacteria, Aquificae, Bacteroidetes–Chlorobi, Chlamydiae–Verrucomicrobia, Chlroflexi, Cyanobacteria, Firmicutes, Proteobacteria, Spirochaetes и Thermototo. Примером белкаа Cas9 является белок Cas9 Streptococcus pyogenes. Дополнительные белки Cas9 и их гомологи описаны, например, в Chylinksi, et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10(5): 726–737; Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6):467–477; Hou, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24; 110(39):15644–9; Sampson et al., Nature. 2013 May 9; 497(7448):254–7; и Jinek, et al., Science. 2012 Aug 17; 337(6096):816–21.In one embodiment, a genetically modified non-human animal that expresses human factor D from non-human animal regulatory elements but does not express non-human factor D is generated using a system that replaces exon sequences ( or exon and intron sequences) of non-human animal factor D, exon sequences (or exon and intron sequences) of human factor D, but leaving intact the native sequences of one, some or all of the non-human animal regulatory elements (e.g., promoter, enhancers, flanking regions, introns, etc.). Although any suitable system may be used, one exemplary system by which a genetically modified non-human animal may be produced is the CRISPr/Cas9 system. The "CRISPR/Cas" system belongs to a widespread class of bacterial systems for protection against foreign nucleic acid. CRISPR/Cas systems are found in a wide range of eubacterial and archaeal organisms. CRISPR/Cas systems include subtypes I, II and III. Wild-type CRISPR/Cas II systems use the RNA-mediated nuclease Cas9 in combination with guide and activating RNA to recognize and cleave the foreign nucleic acid. Homologues of Cas9 have been found in a wide range of eubacteria, including, but not limited to, bacteria from the following taxonomic groups: Actinobacteria , Aquificae , Bacteroidetes - Chlorobi , Chlamydiae - Verrucomicrobia , Chlroflexi , Cyanobacteria , Firmicutes , Proteobacteria , Spirochaetes and Thermototo . An example of a Cas9 protein is the Cas9 protein of Streptococcus pyogenes . Additional Cas9 proteins and their homologues are described, for example, in Chylinksi, et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10(5): 726–737; Nat. Rev. microbiol. June 2011; 9(6):467–477; Hou, et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2013
В одном из вариантов осуществления генетически модифицированное не относящееся к человеку животное согласно настоящему изобретению экспрессирует фактор D человека с промотора β–актина курицы с энхансером CVM–IE, однако специалисту в данной области будет понятно, что генетически модифицированное не относящееся к человеку животное согласно изобретению охватывает экспрессию фактора D человека с других промоторов и энхансеров. Примеры промоторов, которые могут применяться в изобретении, включают, без ограничения перечисленными, нативный промотор мыши, промотор ДНК pol II, промотор PGK, промотор убиквитина, промотор альбумина, промотор глобина, промотор овальбумина, ранний промотор SV40, промотор вируса саркомы Рауса (RSV), ретровирусный LTR и лентивирусный LTR. Системы экспрессии промоторов и энхансеров, используемые в изобретении, также включают индуцируемые и/или тканеспецифические системы экспрессии.In one embodiment, the genetically modified non-human animal of the present invention expresses human factor D from the chicken β-actin promoter with the CVM-IE enhancer, however, one skilled in the art will appreciate that the genetically modified non-human animal of the invention encompasses human factor D expression from other promoters and enhancers. Examples of promoters that can be used in the invention include, but are not limited to, native mouse promoter, pol II DNA promoter, PGK promoter, ubiquitin promoter, albumin promoter, globin promoter, ovalbumin promoter, SV40 early promoter, Rous sarcoma virus (RSV) promoter , retroviral LTR and lentiviral LTR. The promoter and enhancer expression systems used in the invention also include inducible and/or tissue-specific expression systems.
Описанные в настоящем документе генетически модифицированные животные, не относящиеся к человеку, могут применяться в различных исследованиях и для клинических применений. В некоторых вариантах осуществления в настоящей заявке предложены способы скрининга соединения против фактора D (такого как антитело). В некоторых вариантах осуществления в настоящей заявке предложены способы проверки соединения против фактора D (такого как антитело). В некоторых вариантах осуществления в настоящей заявке предложены способы оценки терапевтической эффективности соединения против фактора D (такого как антитело) при различных комплемент–опосредованных заболеваниях и нарушениях, в том числе заболеваниях и нарушениях, которые могут быть индуцированы у гуманизированного не относящегося к человеку животного, или заболеваниях или нарушениях, которые могут самопроизвольно развиваться у не относящихся к человеку животных с двойной мутацией, которые могут быть получены при скрещивании не относящегося к человеку животного с фактором D и другого не относящегося к человеку животного, имеющего другие мутации, которые могут вызывать комплемент–ассоциированное заболевание или нарушение (см., например, Lesher, 2013, J. Am. Soc. Nephrol. 24: 53–65; Ueda et al., 2017, Blood Mar 2; 129: 1184–1196).The non-human genetically modified animals described herein can be used in a variety of research and clinical applications. In some embodiments, provided herein are methods for screening a compound against factor D (such as an antibody). In some embodiments, provided herein are methods for testing a compound against factor D (such as an antibody). In some embodiments, provided herein are methods for evaluating the therapeutic efficacy of an anti-factor D compound (such as an antibody) in various complement-mediated diseases and disorders, including diseases and disorders that can be induced in a humanized non-human animal, or diseases or disorders that can spontaneously develop in non-human animals with a double mutation, which can be obtained by crossing a non-human animal with factor D and another non-human animal with other mutations that can cause complement-associated a disease or disorder (see, for example, Lesher, 2013, J. Am. Soc. Nephrol. 24: 53–65; Ueda et al., 2017,
НаборыSets
Изобретение также включает набор, включающий антитело против фактора D или его комбинации согласно изобретению и инструкционный материал, в котором описано, например, введенние антитела против фактора D или его комбинаций пациенту в качестве терапевтического лечения или нелечебное применение, как описано в другой части настоящего документа. В варианте осуществления данный набор дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для растворения или суспендирования терапевтической композиции, включающей антитело против фактора D или его комбинации согласно изобретению, например, перед введением антитела пациенту. Набор необязательно включает аппликатор для введения антитела.The invention also includes a kit comprising an anti-factor D antibody or combinations thereof according to the invention and instructional material that describes, for example, the administration of an anti-factor D antibody or combinations thereof to a patient as a therapeutic treatment or non-therapeutic use, as described elsewhere herein. In an embodiment, the kit further comprises a pharmaceutically acceptable carrier suitable for dissolving or suspending a therapeutic composition comprising an anti-factor D antibody, or combinations thereof, of the invention, for example, prior to administering the antibody to a patient. The kit optionally includes an applicator for administering the antibody.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРИМЕРЫEXPERIMENTAL EXAMPLES
Далее изобретение будет описано со ссылкой на следующие примеры. Эти примеры приведены исключительно с целью иллюстрации, и изобретение никоим образом не следует считать ограниченным этими примерами, а скорее следует рассматривать как охватывающее любые возможные варианты, которые становятся очевидными в качестве результата описания, представленного в настоящем документе.The invention will now be described with reference to the following examples. These examples are provided for the purpose of illustration only, and the invention should in no way be considered limited to these examples, but rather should be considered as covering any possible variations that become apparent as a result of the description presented herein.
Без дополнительного описания считается, что средний специалист в данной области, при использовании предыдущего описания и следующих иллюстративных примеров, может получить и применить соединения настоящего изобретения и осуществить на практике заявленные способы. Таким образом, следующие рабочие примеры не должны быть истолкованы как ограничивающие каким–либо образом остальную часть настоящего описания.Without further description, it is believed that one of ordinary skill in the art, using the previous description and the following illustrative examples, can make and use the compounds of the present invention and practice the claimed methods. Thus, the following working examples should not be construed as limiting in any way the rest of the present description.
Пример 1Example 1
Моноклональные антитела против фактора D человека были получены при использовании метода гибридом, первоначально описанного Колером с соавт. (Kohler et al., 1975, Nature, 256:495), с некоторыми модификациями. Самок мышей Balb/c (Jackson laboratory) иммунизировали 100 мкг очищенного фактора D человека (из человеческой плазмы), эмульгированного с адъювантом. В день 21 и день 35 мышей снова иммунизировали 100 мкг очищенного фактора D человека, эмульгированного с адъювантом. Мышей стимулировали 25 мкг очищенного фактора D человека два раза перед слиянием. Затем мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков и забирали селезенку для приготовления суспензии одиночных клеток путем механического разрушения. Суспензию клеток селезенки один раз промывали средой HYB–SFM (Invitrogen) + 10% FBS, после чего клетки посчитывали и смешивали с миеломными клетками X63–Ag8.653 (ATCC) в соотношении 2:1. Смесь клеток снова промывали средой HYB–SFM и получали осадок клеток с помощью центрифугирования (1000 об/мин ×5 мин). Осадок клеток мягко перемешивали и отделяли, а затем слияние клеток вызывали путем медленного добавления полиэтиленгликоля (ПЭГ 1500) (1,5 мл ПЭГ на 3×108 клеток). Клетки оставляли на 1 мин при 37°C, затем 20 мл среды HYB–SFM добавляли к клеткам за 3 мин (1 мл в течение первой минуты, 3 мл в течение второй минуты и 16 мл в течение третьей минуты). Смесь центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин и сеяли клетки в 24–луночные планшеты в среде HAT (10 мл HAT [Sigma H0262], 5 мл пен/стреп, 500 мкл гентамицина и 10% FBS в 500 мл среды HYB–SFM). Через 2 недели супернатанты из лунок с видимыми колониями отбирали для скрининга реактивности с очищенным фактором D человека методом ИФА. Положительные клоны отбирали и сеяли в 96–луночные планшеты метод серийных разведений с получением одиночных клонов после второго раунда скрининга с помощью ИФА. Положительные клоны размножали в среде HT (10 мл HT, 5 мл пен/стреп, 500 мкл гентамицина и 10% FBS в 500 мл среды HYB–SFM). Перед сбором антитела клетки гибридомы переводили на бессывороточную среду (ΗΎΒ–SFM) на 2–3 дня. Среду культивирования клеток собирали для очистки мАт с помощью афинной хроматографии с белком G.Monoclonal antibodies against human factor D were generated using the hybridoma method originally described by Kohler et al. (Kohler et al., 1975, Nature, 256:495), with some modifications. Balb/c female mice (Jackson laboratory) were immunized with 100 μg of purified human factor D (from human plasma) emulsified with an adjuvant. On
Пример 2Example 2
Микротитровальные планшеты покрывали липополисахаридом (ЛПС) (2 мкг/лунка) в PBS (фосфатно–солевом буфере) при 37°C в течение 1 часа. После промывки планшетов PBST (фосфатно–солевым буфером и 0,05% tween) 3 раза планшет блокировали 1% BSA в PBS в течение 1 часа при КТ. 10% нормальную человеческую сыворотку (НЧС), нормальную сыворотку яванского макака, нормальную сыворотку резуса, нормальную сыворотку морской свинки, нормальную сыворотку мыши предварительно инкубировали с различными концентрациями мАт 11A8–1 или мАт 1F10–5, или химерного 11A8–1 при 4°C в течение 1 часа. 10% сыворотка в Mg++–ЭГТА GVB++ буфере служила в качестве положительного контроля, и 10% сыворотка в GVB++ ЭДТА буфере служила в качестве отрицательного контроля. Планшеты инкубировали с НЧС при 37°C в течение 1 часа, затем реакцию останавливали холодным 10 мМ ЭДТА в PBS и промывали 3 раза. Планшеты инкубировали с HRP–конъюгированным козьим поликлональным антителом против C3 человека или поликлональным антителом против C3 мыши, разведенным 1:4000 в блокирующем буфере, при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшеты 3 раза промывали и проявляли HRP субстратом в течение 6–10 минут. Реакцию останавливали 2 Н H2SO4, считывали планшет при 450 нм в микропланшетном анализаторе.Microtiter plates were coated with lipopolysaccharide (LPS) (2 µg/well) in PBS at 37°C for 1 hour. After washing the plates with PBST (phosphate buffered saline and 0.05% tween) 3 times, the plate was blocked with 1% BSA in PBS for 1 hour at RT. 10% normal human serum (HNS), normal cynomolgus serum, normal rhesus serum, normal guinea pig serum, normal mouse serum were preincubated with various concentrations of mAb 11A8-1 or mAb 1F10-5, or chimeric 11A8-1 at 4°C within 1 hour. 10% serum in Mg++-EGTA GVB++ buffer served as a positive control, and 10% serum in GVB++ EDTA buffer served as a negative control. The plates were incubated with SNPs at 37°C for 1 hour, then the reaction was stopped with cold 10 mm EDTA in PBS and washed 3 times. Plates were incubated with HRP-conjugated goat anti-human C3 polyclonal or anti-mouse polyclonal C3 diluted 1:4000 in blocking buffer at room temperature for 1 hour. The plates were washed 3 times and developed with HRP substrate for 6–10 minutes. The reaction was stopped with 2 N H2SO4, the plate was read at 450 nm in a microplate analyzer.
Пример 3Example 3
Полистирольные микротитровальные планшеты покрывали очищенным фактором D человека (50 нг/лунка) в PBS при 37°C в течение 1 часа. После аспирации раствора фактора D лунки блокировали PBS, содержащим 1% BSA в PBS, при комнатной температуре в течение 1 часа. Лунки без fD покрытия служили в качестве фонового контроля. В лунки добавляли различные концентрации мАт 11A8–1 или мАт 1F10–5, или химерного 11A8–1, 50 мкл/лунка в блокирующем растворе. После инкубирования в течение 1 часа при комнатной температуре лунки тщательно промывали PBST. Связавшееся с фактором D человека мАт детектировали при добавлении HRP–конъюгата потив IgG мыши в разведении 1:4000 в блокирующем растворе, который оставляли для инкубирования в течение 1 ч при КТ. После промывки PBST планшет проявляли HRP субстратом в течение 6–10 минут. Реакцию останавливали 2 Н H2SO4 и считывали планшет при 450 нм в микропланшетном анализаторе.Polystyrene microtiter plates were coated with purified human factor D (50 ng/well) in PBS at 37° C. for 1 hour. After aspiration of the factor D solution, the wells were blocked with PBS containing 1% BSA in PBS at room temperature for 1 hour. Wells without fD coating served as background controls. Various concentrations of mAb 11A8-1 or mAb 1F10-5 or chimeric 11A8-1 were added to wells at 50 µl/well in blocking solution. After incubation for 1 hour at room temperature, the wells were thoroughly washed with PBST. The mAb bound to human factor D was detected by adding HRP-conjugate against mouse IgG at a dilution of 1:4000 in blocking solution, which was left for incubation for 1 h at RT. After washing with PBST, the plate was developed with HRP substrate for 6–10 minutes. The reaction was stopped with 2 N H2SO4 and the plate was read at 450 nm in a microplate analyzer.
Пример 4Example 4
Анализ методом поверхностного плазмонного резонанса использовали для измерения константы скорости ассоциации и скорости диссоциации для связывания фактора D человека с иммобилизированным мАт 11A8–1, мАт 1F10–5 и химерным 11A8–1 при использовании системы BIAcore 3000 (BiaCore AB, Uppsala, Sweden), все эксперименты BiaCore проводили при 25°C. Карбоксилированную декстрановую матрицу сенсорного чипа CM5 использовали для связывания очищенного антитела, мАт 11A8–1, мАт 1F10–5 и химерного 11A8–1 методом аминосочетания с получением поверхностной плотности 400–500 RU. Человеческий fD разводили до 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56 и 0 нМ в буфере HBSET (забуференном HEPES растворе хлорида натрия с ЭДТА и Tween 20) и образцы инкубировали на поверхности с мАт 11A8–1, мАт 1F10–5 и химерным 11A8–1 при 30 мкл/мин (инъекция 60 мкл) в течение 120 с, и проводили диссоциацию связанного аналита в течение 900 с. Данные анализировали с помощью программы для оценки BIA 3.2 с использованием модели бивалентного связывания. Регенерацию поверхности выполняли инъекциями 50 мкл (50 мкл/мин) 50 мМ NaOH.Surface plasmon resonance analysis was used to measure the association rate constant and dissociation rate for human factor D binding to immobilized mAb 11A8-1, mAb 1F10-5 and chimeric 11A8-1 using the BIAcore 3000 system (BiaCore AB, Uppsala, Sweden), all BiaCore experiments were performed at 25°C. The carboxylated dextran matrix of the CM5 sensor chip was used to bind the purified antibody, mAb 11A8-1, mAb 1F10-5, and chimeric 11A8-1 by amino coupling to obtain a surface density of 400–500 RU. Human fD was diluted to 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.56 and 0 nM in HBSET buffer (HEPES buffered sodium chloride solution with EDTA and Tween 20) and samples were surface incubated with mAb 11A8-1, mAb 1F10-5, and chimeric 11A8-1 at 30 µl/min (60 µl injection) for 120 s, and the bound analyte was dissociated for 900 s. Data were analyzed with the BIA 3.2 scoring software using a bivalent binding model. Surface regeneration was performed by injections of 50 μl (50 μl/min) 50 mM NaOH.
Пример 5Example 5
Для клонирования кДНК 11A8–1 и 1F10–5, суммарную РНК выделяли из клеток гибридом с помощью реактива TRizol (Sigma). Первую цепь кДНК синтезировали с помощью обратной транскрипции при использовании олиго(dT) праймера, для амплификации кДНК тяжелой цепи (для IgG 1, IgG2a/b) в реакциях ПЦР использовали следующие праймеры: 5'–GAG GTG A AGCTG GTG G AG(T/A) C (T/A) GG–3' (SEQ ID NO:68) и 5'–GGGGCCAGTGGATAGAC–3' (SEQ ID NO:69). Для амплификации k легкой цепи использовали следующие праймеры: смесь 4 прямых праймеров: 5'–CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGACTCCA–3' (SEQ ID NO:70); 5'–CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA–3' (SEQ ID NO:71); 5'–CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA–3' (SEQ ID NO:72); 5'–CC AGTTC CG G CTC GTG ATG AC AC AGTCTCC–3' (SEQ ID NO:73); обратный праймер: 5'–GTTGGTGCAGCATCAGC–3' (SEQ ID NO:74). ПЦР ампликоны клонировали в вектор pCR TOPO TA 2.1 (Invitrogen) и секвенировали. Для получения последовательности сигнального пептида (лидерной) мАт использовали метод 5'–RACE с набором (GeneRacer) производства Invitrogen. Полные кДНК вариабельной области амплифицировали при использовании специфических праймеров, определенных на основе 5'–RACE и начальных данных секвенирования.To clone 11A8-1 and 1F10-5 cDNA, total RNA was isolated from hybridoma cells using the TRizol reagent (Sigma). The first strand cDNA was synthesized by reverse transcription using an oligo(dT) primer; the following primers were used to amplify the heavy chain cDNA (for
Пример 6Example 6
Плазмиду pND1 использовали для сборки окончательного направляющего вектора. Для гомологичной последовательности короткого плеча амплифицировали smaI–smaI фрагмент длиной 4,2 тому подобноен., содержащий 3'–область гена фактора D мыши, при использовании 5'–CCCGGGCTGGGTTTTGGTTTTTGC–3' (прямой; сайт SmaI подчеркнут) и 5'–CCCGGGTCCTTGACATGAACACTTTGC–3' (обратный; сайт SmaI подчеркнут) в качестве праймеров (сайты SmaI подчеркнуты). Этот фрагмент клонировали в вектор pND1 по сайтам KpnI, обработанным затупляющим реактивом. Для гомологичной последовательности длинного плеча амплифицировали фрагмент длиной 5,7 тому подобноен., содержащий 5'–область гена фактора D мыши, при использовании в качестве праймеров 5'–ATCGATACTCAGAAATCTGCCTGCCTC–3' (прямой; сайт ClaI подчеркнут) и 5'–GCGGCCGCTCCTAGGAGGACCAGAACTGCCAGGCGCTCCCAGCTGTGCATTCTGACAGCA–3' (обратный; сайт NotI подчеркнут). Также амплифицировали фрагмент длиной 1,2 тому подобноен., содержащий 3'–область гена фактора D мыши при использовании в качестве праймеров 5'–CTCGAGAGAGACACGTGGCTCACAATA–3' (прямой; сайт XhoI подчеркнут) и 5'–CTCGAGAATTATCGAAGTACTCCACCG–3' (обратный; сайт XhoI подчеркнут) (сайты SmaI подчеркнуты). Фрагмент 826 пн, содержащий кодирующую последовательность фактора D человека, синтезировали в Genscript Corp. и выделяли 0,75 тому подобноен. фрагмент NotI–XhoI при расщеплении NotI и XhoI. Эти три фрагмента, 5,7 тому подобноен. ClaI–NotI фрагмент, 0,75 тому подобноен. NotI–XhoI фрагмент и 1,2 тому подобноен. XhoI–XhoI фрагмент субклонировали в вышеуказанный вектор pND1 по сайтам ClaI–XhoI. Направляющую конструкцию линеаризовали, электропорировали в клетки C57BL/6 ES и отбирали по устойчивости к неомицину. Направляющие ES клоны идентифицировали с помощью Саузерн–блоттинга при использовании 3'–зонда, распознающего 5 тому подобноен. фрагмент дикого типа и 4,5 тому подобноен. фрагмент в правильно модифицированной геномной области после расщепления BamHI (Фиг. 11 c). Правильно направленные клоны ES вводили в бластоцисту с получением химерных мышей. Полученных химерных самцов скрещивали с самками мышей C57BL/6 для определения передачи целевого аллеля по зародышевой линии. Гетерозиготные мыши с нокаутом фактора D человека скрещивали с генетически модифицированными мышами FLPe (фон C57BL/6, Jackson laboratory) для удаления neo кассеты из нокин аллеля фактора D человека. Гетерозиготных мышей с нокаутом фактора D человека без neo кассеты скрещивали с получением гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека. Мышей дикого типа (WT), гетерозиготных (Het) и гомозиготных (Homo) мышей с нокаутом фактора D человека идентифицировали при ПЦР генотипировании ДНК из хвоста с использованием специфичного к фактору D человека (целевой размер: 450 пн) 5'–GTC АГГ GTG CCA ТГК АГГ AG–3' (SEQ ID NO:26) и 5'–CCC ТГК АГГ АГИ АКС АКС TTC–3' (SEQ ID NO:27), и специфичного к фактору D мыши (целевой размер: 292 пн), 5’–CCT CCC ACC CTT AGC TAT CC–3’ (SEQ ID NO:28) и 5’–ACC CAG ACT GTG TCC CTC AC–3’(SEQ ID NO:29) (Фиг. 11d).Plasmid pND1 was used to assemble the final targeting vector. For the homologous short arm sequence, a smaI–smaI fragment of 4.2 simi length containing the 3' region of the mouse factor D gene was amplified using 5'–CCCGGGCTGGGTTTTGGTTTTTGC–3' (straight; the SmaI site is underlined) and 5'–CCCGGGTCCTTGACATGAACACTTTGC– 3' (reverse; SmaI site underlined) as primers (SmaI sites underlined). This fragment was cloned into the pND1 vector at KpnI sites treated with a blunting reagent. For the long arm homologous sequence, a 5.7-bp fragment containing the 5' region of the mouse factor D gene was amplified using primers 5'-ATCGATACTCAGAAATCTGCCTGCCTC-3' (straight; ClaI site underlined) and 5'-GCGGCCCGCTCCTAGGAGGACCAGAACTGCCAGGCGCTCCCAGCTGTGCATTCTGACAGCA- 3' (reverse; NotI site underlined). A 1.2-like fragment containing the 3' region of the mouse factor D gene was also amplified using 5'-CTCGAGAGAGACACGTGGCTCACAATA-3' (forward; XhoI site underlined) and 5'-CTCGAGAATTATCGAAGTACTCCACCG-3' (reverse; XhoI site underlined) (SmaI sites underlined). An 826 bp fragment containing the human factor D coding sequence was synthesized by Genscript Corp. and isolated 0.75 the like. fragment of NotI-XhoI during cleavage of NotI and XhoI. These three fragments, 5.7 the like. ClaI-NotI fragment, 0.75 simi. NotI-XhoI fragment and 1,2 the like. The XhoI–XhoI fragment was subcloned into the above pND1 vector at the ClaI–XhoI sites. The guide construct was linearized, electroporated into C57BL/6 ES cells and selected for neomycin resistance. Targeting ES clones were identified by Southern blotting using a 3'-probe recognizing 5 like. wild-type fragment; and 4.5 the like. fragment in the correctly modified genomic region after digestion with BamHI (Fig. 11 c). Correctly targeted ES clones were introduced into the blastocyst to generate chimeric mice. The resulting chimeric males were bred with female C57BL/6 mice to determine germline transmission of the target allele. Heterozygous human factor D knockout mice were bred with genetically modified FLPe mice (background C57BL/6, Jackson laboratory) to remove the neo cassette from the human factor D knockin allele. Heterozygous human factor D knockout mice without the neo cassette were bred to produce homozygous human factor D knockout mice. Wild-type (WT), heterozygous (Het), and homozygous (Homo) human factor D knockout mice were identified by PCR genotyping DNA from the tail using human factor D-specific (target size: 450 bp) 5'-GTC AGG GTG CCA THC AGG AG-3' (SEQ ID NO:26) and 5'-CCC THC AGG AGI AKC AKC TTC-3' (SEQ ID NO:27), and mouse factor D specific (target size: 292 bp), 5 '–CCT CCC ACC CTT AGC TAT CC–3' (SEQ ID NO:28) and 5'–ACC CAG ACT GTG TCC CTC AC–3' (SEQ ID NO:29) (Fig. 11d).
Пример 7Example 7
Эксперименты проводили для изучения активности и кинетики in vivo мАт 11A8–1 и 1F10–5 у гомозиготных мышей с нокаутом фактора D. Мышам вводили 1 мг (в/б) мАт 11A8–1 или мАт 1F10–5. Образцы крови (50–75 мкл) собирали перед инъекцией (24 часа), а затем в различные моменты времени после инъекции путем забора крови из ретроорбитального синуса и приготовления сыворотки. Образцы сыворотки исследовали на ЛПС–индуцированную активацию AP комплемента. Для этого анализа ИФА планшеты (96–луночные, Nunc) покрывали 50 мкл раствора ЛПС (2 мкг/лунка в PBS, 37°C, 1 час). Планшеты промывали 3 раза PBS, содержащим 0,05% Твин–20 (PBS–T), и в каждую лунку добавляли по 50 мкл серийно разведенной (начиная с 1:10) мышиной сыворотки. Мышиную сыворотку разбавляли GVB–ЭГТА–Mg++ (содержащей 10 мМ ЭГТА и конечную концентрацию Mg++ 2,5 мМ). Планшет оставляли для инкубирования при 37°C в течение 1 часа, 3 раза промывали PBS–T и затем добавляли 50 мкл HRP–конъюгированного антитела козы против C3 мыши (1:4000, Cappel) и оставляли планшет на 1 час при комнатной температуре. Планшет три раза промывали PBS–T и затем проявляли при использовании A+B реагента BD Pharmingen. Реакцию останавливали через 6–10 минут при использовании 2 Н H2SO4. Активацию AP комплемента обнаруживали путем измерения количества осаждения C3 на планшете (OD450).Experiments were performed to study the in vivo activity and kinetics of mAb 11A8-1 and 1F10-5 in homozygous factor D knockout mice. Mice were injected with 1 mg (ip) mAb 11A8-1 or mAb 1F10-5. Blood samples (50–75 µl) were collected before injection (24 hours) and then at various time points after injection by taking blood from the retroorbital sinus and preparing serum. Serum samples were tested for LPS-induced activation of AP complement. For this assay, ELISA plates (96-well, Nunc) were coated with 50 µl of LPS solution (2 µg/well in PBS, 37°C, 1 hour). The plates were washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween-20 (PBS-T), and 50 μl of serially diluted (starting 1:10) mouse serum was added to each well. Mouse serum was diluted with GVB-EGTA-Mg++ (containing 10 mM EGTA and a final concentration of Mg++ 2.5 mM). The plate was left to incubate at 37°C for 1 hour, washed 3 times with PBS-T and then 50 μl of HRP-conjugated goat anti-mouse C3 antibody (1:4000, Cappel) was added and the plate was left for 1 hour at room temperature. The plate was washed three times with PBS-T and then developed using BD Pharmingen's A+B reagent. The reaction was stopped after 6–10 minutes using 2 N H2SO4. AP complement activation was detected by measuring the amount of C3 deposition on the plate (OD450).
Пример 8Example 8
Для создания мутантов с делециями праймеры (Таблица 1) подбирали таким образом, чтобы сайты контакта были удалены прямым и обратным праймером. Мутанты с заменами создавали при включении нужного нуклеотида в прямой праймер. 20 нг плазмиды pCMV–XL4–hfD амплифицировали с соответствующими прямыми и обратными праймерами при использовании мастер–микса Q5® Hot Start High–Fidelity. Амплифицированные продукты разгоняли на электрофорезе в агарозном геле для подтвержения чистоты. Соответствующие амплифицированные продукты вырезали из агарозного геля и выделяли ДНК при использовании набора для выделения из геля Bioneer. Очищенную ДНК лигировали ДНК–лигазой (Takara DNA ligase mix), трансформировали в компетентные клетки JM109 и 100 мкл сеяли на чашку с LB агаром с ампициллином (50 мкг/мл). Колонии отбирали и инокулировали среду LB, содержащую 75 мкг/мл ампициллина. Плазмиды выделяли и подтверждали присутствие вставки при расщеплении рестриктазой NotI. Положительные в рестрикционном анализе плазмиды секвенировали для обнаружения мутантов с делециями и заменами. Положительные мутанта плазмиды с делециями и заменами использовали для экспрессии делеционного белка при трансфекции.To generate deletion mutants, primers (Table 1) were selected such that the contact sites were removed by the forward and reverse primers. Substitution mutants were created by inserting the desired nucleotide into the forward primer. 20 ng of pCMV-XL4-hfD plasmid was amplified with the appropriate forward and reverse primers using the Q5® Hot Start High-Fidelity Master Mix. The amplified products were run on agarose gel electrophoresis to confirm purity. The corresponding amplified products were excised from the agarose gel and the DNA was isolated using the Bioneer Gel Isolation Kit. Purified DNA was ligated with DNA ligase (Takara DNA ligase mix), transformed into competent JM109 cells, and 100 μl were plated on a LB agar plate with ampicillin (50 μg/ml). Colonies were picked and inoculated with LB medium containing 75 μg/ml ampicillin. Plasmids were isolated and the presence of the insert was confirmed by NotI digestion. Restriction-positive plasmids were sequenced to detect deletion and substitution mutants. Positive plasmid mutants with deletions and substitutions were used to express the deletion protein upon transfection.
Таблица 1Table 1
Пример 9Example 9
Не содержащие эндотоксин плазмиды использовали для трансфекции. Клеткам яичника китайского хомячка (CHO) позволяли расти в 6–луночных планшетах до 85–90% конфлюэнтности. Плазмиды положительного контроля и мутантные плазмиды с делецией трансфицировали с использованием липофектамина (Invitrogen) в соотношении 1:2 в Opti–MEM (Thermo Fisher Scientific). Через 48 часов после трансфекции супернатант собирали и хранили при –20°C до применения. Клетки промывали охлажденным во льду PBS (Invitrogen), добавляли неденатурирующий буфер RIPA (для радиоиммунопреципитационного анализа) (20 мМ Трис HCl, pH 8, 137 мМ NaCl, 1% NP–40, 2 мМ ЭДТА) и выдерживали во льду в течение 30 мин с периодическим перемешиванием. Лизат клеток собирали после центрифугирования и хранили супернатант при –20°C. Супернатант клеток CHO и лизат клеток использовали в качестве отрицательного контроля.Endotoxin-free plasmids were used for transfection. Chinese hamster ovary (CHO) cells were allowed to grow in 6-well plates to 85-90% confluency. Positive control plasmids and deletion mutant plasmids were transfected with Lipofectamine (Invitrogen) at a 1:2 ratio in Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific). 48 hours after transfection, the supernatant was collected and stored at –20°C until use. Cells were washed with ice-cold PBS (Invitrogen), non-denaturing RIPA buffer (for radioimmunoprecipitation analysis) (20 mM Tris HCl,
Пример 10Example 10
Картирование эпитопов 11A8–1 выполняли методом иммунопреципитации и Вестерн–блоттинга. 300 мг CNBr–активированных гранул сефарозы 4B (номер по кат. 17–0430–1, GE healthcare) оставляли для набухания в 1 мМ HCl в течение 15 минут. Затем гранулы переносили в воронку со стеклянным фильтром и промывали 200 мл 1 мМ HCl. Гель (гранулы) промывали буфером для связывания pH 9,0 (0,1 М NaHCO3, pH 9,0, 0,5 М NaCl) и сразу переносили в пробирку, содержащую 1 мг антитела 11–8A1 в буфере для связывания, на 5 мин. Пробирку оставляли на ночь на вращающейся платформе при 40°C. Связывание антитела с CNBr гранулами проверяли с помощью измерения оптического поглощения раствора антитела до и после связывания. Избыток лиганда удаляли при промывке 3 раза буфером для связывания, и оставшиеся активные сайты блокировали блокирующим буфером (1 М Трис–основание, pH 9,0) в течение 2 часов при комнатной температуре. Для удаления избытка несвязавшегося лиганда после связывания, гранулы поочередно промывали буфером с низким pH (0,1 М уксусная кислота, 0,5 М NaCl) и высоким pH (буфер для связывания) 2 раза. 200 мкл связавшихся гранул инкубировали с супернатантами после трансфекции и лизатом клеток в течение 2 часов при комнатной температуре на вращающейся платформе. Гранулы промывали 0,5 М NaCl в PBS 5 раз. Белки элюировали буфером для элюции антитела (0,1 М глицин, pH 2,0) и нейтрализовали 1,5 М Трис, pH 9,0. 50 мкл элюированных образцов использовали для иммуноблоттинга.Mapping of 11A8-1 epitopes was performed by immunoprecipitation and Western blotting. 300 mg of CNBr-activated Sepharose 4B beads (cat. no. 17-0430-1, GE healthcare) were allowed to swell in 1 mM HCl for 15 minutes. The beads were then transferred to a glass filter funnel and washed with 200 ml of 1 mM HCl. The gel (beads) were washed with pH 9.0 binding buffer (0.1 M NaHCO3, pH 9.0, 0.5 M NaCl) and immediately transferred to a tube containing 1 mg of antibody 11-8A1 in binding buffer for 5 min. The tube was left overnight on a rotating platform at 40°C. The binding of the antibody to the CNBr beads was checked by measuring the optical absorbance of the antibody solution before and after binding. Excess ligand was removed by washing 3 times with binding buffer, and the remaining active sites were blocked with blocking buffer (1 M Tris-base, pH 9.0) for 2 hours at room temperature. To remove excess unbound ligand after binding, the beads were alternately washed with low pH buffer (0.1 M acetic acid, 0.5 M NaCl) and high pH (binding buffer) 2 times. 200 μl of bound beads were incubated with transfection supernatants and cell lysate for 2 hours at room temperature on a rotating platform. The beads were washed with 0.5 M NaCl in
Пример 11Example 11
Картирование эпитопов 1F10–5 выполняли методом ИФА. Микротитровальные планшеты покрывали 1F10–5 (2 мкг/мл) в PBS при 37°C в течение 1 часа. После аспирации раствора антитела лунки блокировали PBS, содержащим 1% BSA в PBS, при комнатной температуре в течение 1 часа. В лунки добавляли супернатанты культуры клеток транзиентных CHO трансфекантов полноразмерного или четырех мутантов с делецией (мутант 9, 10, 11 или 12) фактора D человека. Контролем служила среда клеточной культуры нетрансфицированных клеток. После инкубирования в течение 1 часа при комнатной температуре, лунки тщательно промывали. 1F10–5, связанное с фактором D человека, детектировали при использовании биотин–конъюгированного козьего антитела против фактора D человека с последующим добавлением HRP–конъюгированного стрептавидина. После промывки планшет проявляли HRP субстратом в течение 6–10 минут. Реакцию останавливали 2 Н H2SO4 и считывали планшет при 450 нм в микропланшетном анализаторе.1F10–5 epitope mapping was performed by ELISA. Microtiter plates were coated with 1F10-5 (2 μg/ml) in PBS at 37°C for 1 hour. After aspiration of the antibody solution, the wells were blocked with PBS containing 1% BSA in PBS at room temperature for 1 hour. Cell culture supernatants of transient CHO transfectants of full-length or four deletion mutants (mutant 9, 10, 11, or 12) of human factor D were added to the wells. The cell culture medium of non-transfected cells served as the control. After incubation for 1 hour at room temperature, the wells were washed thoroughly. 1F10-5 associated with human factor D was detected using a biotin-conjugated goat anti-human factor D antibody followed by the addition of HRP-conjugated streptavidin. After washing, the plate was developed with HRP substrate for 6–10 minutes. The reaction was stopped with 2 N H2SO4 and the plate was read at 450 nm in a microplate analyzer.
Для картирования эпитопов, мАт 1F10–5 тестировали на реактивность с полноразмерным и четырьмя мутантами с делецией фактора Д человека. Вестерн–блоттинг подтверждал экспрессию белка для четырех мутантов с делецией. В ИФА мАт 1F10–5 связывало полноразмерный, мутант–9 и –12, но его связывание с мутантом–10 и –11 было значительно снижено. Эти результаты, показанные на Фигуре 19, указывают, что делеция пяти аминокислот NRRTH в положениях 155–159 (SEQ ID NO:23) или четырех аминокислот SNRR в положениях 173–176 (SEQ ID NO:24) нарушала связывание мАт 1F10–5, и что эпитоп мАт 1F–10 включает аминокислоты SNRR.For epitope mapping, the 1F10–5 mAb was tested for reactivity with full-length and four human factor D deletion mutants. Western blotting confirmed protein expression for the four deletion mutants. In ELISA, mAb 1F10–5 bound the full-length, mutant–9 and –12, but its binding to the mutant–10 and –11 was significantly reduced. These results, shown in Figure 19, indicate that deletion of five NRRTH amino acids at positions 155-159 (SEQ ID NO:23) or four SNRR amino acids at positions 173-176 (SEQ ID NO:24) disrupted mAb binding 1F10-5, and that mAb 1F-10 epitope includes SNRR amino acids.
Пример 12Example 12
Гомозиготным мышам с нокаутом фактора D человека переливали эритроциты (Эр) мышей дикого типа и мышей с тройным нокаутом (TKO) Crry/DAF/C3. Реципиентным мышам (гомозиготные мыши с нокаутом фактора D человека) за 24 часа до переноса Эр вводили мАт 118A–1 (2 мг/мышь, в/б) или PBS. Донорские Эр собирали у мышей TKO, промывали в PBS и метили CFSE согласно ранее опубликованной методике (Miwa et al., 2002, Blood 99; 3707–3716). Аналогичным образом, донорские Эр также собирали у мышей дикого типа (C57BL/6J), промывали в PBS и метили DDAO–SE (Thermo Fisher Scientific) согласно инструкциям производителя. Смесь 1:1 WT и TKO Эр, эквивалентных 200 мкл крови, вводили реципиентным мышам в хвостовую вену. Через 5 минут и 6, 24, 48, 72, 96, 120 часов после переливания Эр у реципиентных мышей забирали кровь и исследовали Эр для определения процента CFSE– или DDAO–SE–меченных (т.е. перелитых) Эр, оставшихся в кровотоке. Количество CFSE–меченных TKO Эр у каждого реципиента нормализовали (в %) по DDAO–SE–меченным WT Эр в каждой временной точке.Homozygous human Factor D knockout mice were transfused with erythrocytes (Er) from wild-type and triple knockout (TKO) Crry/DAF/C3 mice. Recipient mice (homozygous human Factor D knockout mice) were treated with mAb 118A-1 (2 mg/mouse, ip) or
Пример 13Example 13
Артрит индуцировали у гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека путем пассивного переноса очищенных суммарных IgG от мышей K/BxN (2 мг/мышь, в/б в дни 0 и 2). Утолщение голеностопного сустава измеряли штангенциркулем (Mitutoyo), и клинические показатели регистрировали при использовании ранее опубликованных критериев (Kimura et al., 2010, JCI; 3545–3554). Мышам вводили 1 мг 11A8–1 в день–1, день 3, 7, 11 и 15.Arthritis was induced in homozygous human factor D knockout mice by passive transfer of purified total IgG from K/BxN mice (2 mg/mouse, ip on
Пример 14Example 14
Активность 11–8A1 мАт, 1F10–5 и 166–32 in vivo оценивали у мышей с нокаутом фактора D человека. Для оценки эффективности мАт 166–32 (см. Tanox US8124090), 11–8A1 и 1F10–5 при блокировании активности альтернативного пути (AP) комплемента in vivo, фактор D–гуманизированных мышей лечили путем многократного введения доз (1 мг/мышь, раз в 3 дня, п/к введение). Образцы плазмы собирали до лечения мАт (время 0) и через 6 ч, 1, 3, 6 и 9 дней после лечения мАт и исследовали ЛПС–индуцированную активность AP комплемента. Активность AP комплемента в различные временные точки нормализовали по 100% значениям, полученным в момент времени 0. Данные показали, что мАт 11–8A1 и 1F10–5 обладали превосходной фармакодинамической активностью in vivo по сравнению с мАт 166–32 (Фигура 20). В частности, мАт 11–8A1 стабильно ингибировало активность AP комплемента на 80–90% во все временные точки после введения мАт, тогда как мАт 166–32 достигало сопоставимого ингибирования только через 6 часов и в день 1 после введения мАт. мАт 1F10–5 показало 50% ингибирование AP комплемента в день 9, тогда как ингибирование активности AP комплемента мАт 166–32 в день 9 почти не наблюдалось (Фигура 20).The in vivo activity of 11–8A1 mAb, 1F10–5, and 166–32 was evaluated in human factor D knockout mice. To evaluate the efficacy of mAbs 166-32 (see Tanox US8124090), 11-8A1 and 1F10-5 in blocking complement alternative pathway (AP) activity in vivo , factor D humanized mice were treated with multiple doses (1 mg/mouse, times at 3 days, s / c introduction). Plasma samples were collected before mAb treatment (time 0) and 6 h, 1, 3, 6 and 9 days after mAb treatment and examined for LPS-induced complement AP activity. Complement AP activity at different time points was normalized to 100% values obtained at
Активность in vivo химерного мАт 11–8A1 и химерного AFD оценивали у мышей с нокаутом фактора D человека. Для оценки эффективности 11–8A1/человеческого IgG4 химерного мАт и AFD/человеческого IgG4 химерного мАт при блокировании активности альтернативного пути (AP) комплемента in vivo, фактор D–гуманизированных мышей лечили путем многократного введения доз (1 мг/мышь, раз в 3 дня, п/к введение). Образцы плазмы собирали до введения мАт (время 0) и через 6 часов, 1, 3, 6, 9, 12 и 15 дней после введения мАт и исследовали на ЛПС–индуцированную активность AP комплемента. Активность AP комплемента в различные временные точки нормализовали по 100% значений, полученных в момент времени 0. AFD представляет собой гуманизированный вариант мАт 166–32 (см. Katschke et al., J Biol Chem. 2012 Apr 13; 287:12886–12892, WO/2008/055206, патент США 8,372,403, патент США 8,273,352, заявка на патент США 2014/0212433). Данные показали, что 11–8A1/человеческое IgG4 химерное мАт было намного более активным и показало лучший фармакодинамический профиль по сравнению с AFD/человеческое IgG4 химерное мАт (Фигура 21). В частности, тогда как оба мАт вызывали 90–100% ингибирование через 6 часов и в день 1 после введения мАт, 11–8A1/человеческое IgG4 химерное мАт, но не AFD/человеческое IgG4 химерное мАт, вызвало более чем 75% ингибирование активности AP комплемента в день 6–15 (Фигура 21).The in vivo activity of chimeric mAb 11-8A1 and chimeric AFD was evaluated in human factor D knockout mice. To evaluate the efficacy of 11-8A1/human IgG4 chimeric mAb and AFD/human IgG4 chimeric mAb in blocking complement alternative pathway (AP) activity in vivo , factor D humanized mice were treated with multiple doses (1 mg/mouse, every 3 days). , s/c introduction). Plasma samples were collected before mAb administration (time 0) and 6 hours, 1, 3, 6, 9, 12 and 15 days after mAb administration and examined for LPS-induced complement AP activity. Complement AP activity at various time points was normalized to 100% of the values obtained at
Далее описаны материалы и методы, используемые в примере.The following describes the materials and methods used in the example.
Очистка мАт 166–32Cleaning MAT 166-32
Для получения очищенного мАт 166–32, мышиные клетки гибридомы (HB124–76), которые секретируют моноклональное антитело 166–322, которое связывается с фактором D человека, получали из ATCC (см. Tanox, патент США 8,124,090) и культивировали. Среду культивирования клеток собирали для очистки мАт с помощью афинной хроматографии с белком G.To obtain purified mAb 166-32, mouse hybridoma cells (HB124-76) that secrete the monoclonal antibody 166-322, which binds to human factor D, were obtained from ATCC (see Tanox, US Pat. No. 8,124,090) and cultured. The cell culture medium was harvested for mAb purification by protein G affinity chromatography.
Получение 11–8A1/человеческого IgG4 химерного мАтPreparation of 11-8A1/human IgG4 chimeric mAb
Для клонирования кДНК мАт 11–8A1, суммарную РНК выделяли из клеток гибридомы при использовании реактива TRizol (Sigma). кДНК первой цепи синтезировали путем обратной транскрипции с использованием олиго(dT) праймера. Для амплификации кДНК тяжелой цепи (для IgG 1, IgG2a/b) в реакциях ПЦР использовали следующие праймеры: 5'–GAGGTGAAGCTGGTGGAG(T/A)C(T/A)GG–3' SEQ ID NO:72 и 5'–GGGGCCAGTGGATAGAC–3' SEQ ID NO:73. Для амплификации каппа легкой цепи использовали следующие праймеры: смесь 4 прямых праймеров: 5'–CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGACTCCA–3' SEQ ID NO:74; 5'–CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA–3' SEQ ID NO:75; 5'–CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA–3' SEQ ID NO:76; 5'–CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA–3' SEQ ID NO:77; обратный праймер: 5'–GTTGGTGCAGCATCAGC–3' SEQ ID NO:78. ПЦР ампликоны клонировали в вектор pCR TOPO TA 2.1 (Invitrogen) и секвенировали. Для получения последовательности сигнального пептида (лидерной) мАт использовали метод 5'–RACE с набором (GeneRacer) производства Invitrogen. Полноразмерные кДНК вариабельных областей амплифицировали с использованием специфичных праймеров, определенных с помощью 5'–RACE и первоначальных данных секвенирования. кДНК, кодирующие вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи мАт 11–8A1, субклонировали в векторы pFUSE–CHIg–hG4 и pFUSE2–CLIg–hk (InVivoGen, San Diego, CA), соответственно. Для предотвращения обмена молекулами IgG4 мутацию S228P вводили в Fc домен 11–8A1/человеческого IgG4 химерного мАт. Рекомбинантное 11–8A1/человеческое IgG4 химерное антитело экспрессировали в системе экспрессии ExpiCHO (Thermo Fisher Scientific). Среду культивирования клеток собирали для очистки химерного мАт с помощью афинной хроматографии с белком G.For
Получение гуманизированного Ат 166–32 (AFD)Obtaining Humanized Ab 166-32 (AFD)
кДНК, кодирующие вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи AFD (см. Katschke et al., J Biol Chem. 2012 Apr 13; 287:12886–12892, WO/2008/055206, патент США 8,372,403, патент США 8,273,352, заявка на патент США 2014/0212433), синтезировали и клонировали в векторы pFUSE–CHIg–hG4 и pFUSE2–CLIg–hk (InVivoGen, San Diego, CA), соответственно. Для предотвращения обмена молекулами IgG4 мутацию S228P вводили в Fc домен AFD/человеческого IgG4 химерного мАт. Рекомбинантное AFD/человеческое IgG4 мАт экспрессировали в системе экспрессии ExpiCHO (Thermo Fisher Scientific). Среду культивирования клеток собирали для очистки химерного мАт с помощью афинной хроматографии с белком G.cDNAs encoding AFD heavy chain and light chain variable domains (see Katschke et al., J Biol Chem. 2012
Оценка фармакодинамики мАт у гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человекаAssessment of mAb pharmacodynamics in homozygous mice with human factor D knockout
Эксперименты проводили с целью исследования и сравнения активности in vivo мышиных мАт 11–8A1, 1F10–5, 166–32 и 11–8A1/человеческого IgG4 химерного и AFD/человеческого IgG4 химерного мАт у гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека. Мышам (10–12 недель) вводили 1 мг/мышь (п/к в PBS) мАт раз в 3 дня. Обработанные антикоагулянтом лепирудином образцы плазмы (50–75 мкл) собирали до инъекции (время 0) и затем в различные временные точки после инъекции путем забора крови из ретроорбитального синуса и приготавливали плазму. Образцы плазмы замораживали при –80°C и хранили до исследования в анализе ЛПС–индуцированной активации AP комплемента на основе ИФА. Активацию комплемента AP оценивали путем измерения количества активированных фрагментов C3, осаждаемых на планшете (OD450), как описано ранее (см. Kimura et al., 2008, Blood 111:732–40).Experiments were performed to investigate and compare the in vivo activity of mouse mAbs 11-8A1, 1F10-5, 166-32 and 11-8A1/human IgG4 chimeric and AFD/human IgG4 chimeric mAbs in homozygous human Factor D knockout mice. Mice (10–12 weeks) were injected with 1 mg/mouse (s.c. in PBS) mAb every 3 days. Anticoagulant lepirudin-treated plasma samples (50–75 μl) were collected before injection (time 0) and then at various time points after injection by retroorbital sinus blood sampling and plasma was prepared. Plasma samples were frozen at –80°C and stored until analysis in the LPS-induced AP complement activation assay based on ELISA. AP complement activation was assessed by measuring the number of activated C3 fragments deposited on the plate (OD450) as previously described (see Kimura et al., 2008, Blood 111:732-40).
Описание каждого патента, заявки на патент и публикации, процитированных в настоящем документе, полностью включено посредством отсылки.The description of each patent, patent application, and publication cited herein is incorporated by reference in its entirety.
Хотя данное изобретение было раскрыто со ссылкой на конкретные варианты осуществления, очевидно, что другие варианты осуществления и вариации настоящего изобретения могут быть предложены другими специалистами в данной области без отступления от истинной сущности и объема изобретения. Предполагается, что прилагаемая формула изобретения включает все подобные варианты осуществления и эквивалентные варианты.Although this invention has been disclosed with reference to specific embodiments, it is obvious that other embodiments and variations of the present invention can be proposed by other specialists in this field without departing from the true essence and scope of the invention. The appended claims are intended to include all such embodiments and equivalents.
--->--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
<110> ДЗЕ ТРАСТИЗ ОФ ДЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОФ ПЕНСИЛЬВАНИЯ<110> JE TRUSTEE OF JE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA
СУН, Вэньчао SUN, Wenchao
ЧЖОУ, Линь ZHOU, Lin
САТО, Саяка SATO, Sayaka
МИВА, Такаси MIWA, Takashi
ГУЛЛИПАЛЛИ, Дамодар GULLIPALLI, Damodar
ГОЛЛА, Мадху GOLLA, Madhu
<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ ФАКТОРА D И ИХ ПРИМЕНЕНИE<120> ANTIBODIES AGAINST FACTOR D AND THEIR USE
<130> 046483-6155-00-WO.607243<130> 046483-6155-00-WO.607243
<150> US 62/457,477<150> US 62/457,477
<151> 2017-02-10<151> 2017-02-10
<160> 78<160> 78
<170> PatentIn version 3.5<170>PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 449<211> 449
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 1<400> 1
ctcaaggtcc ttacaatgaa atgcagctgg gttatcgtct tcctgatggc agtggttaca ctcaaggtcc ttacaatgaa atgcagctgg gttatcgtct tcctgatggc agtggttaca
60 60
ggggtcaatt cagaggttca gctgcagcag tctggggcag accttgtgag gccaggggcc ggggtcaatt cagaggttca gctgcagcag tctggggcag accttgtgag gccaggggcc
120 120
tcagtcaagt tgtcctgcac aacttctggc ttcaacatta aagacaccta tgtgcactgg tcagtcaagt tgtcctgcac aacttctggc ttcaacatta aagacaccta tgtgcactgg
180 180
gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa tggattggaa ggattgatcc tgcgaatggt gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa tggattggaa ggattgatcc tgcgaatggt
240 240
cttactacat ttgatccgag gttccaggcc aaggccacta taacagcaga cacatcctcc cttactacat ttgatccgag gttccaggcc aaggcacta taacagcaga cacatcctcc
300 300
aataccgcct acctgcagct cagcagcctg acatctgagg acactgccgt ctattactgt aataccgcct acctgcagct cagcagcctg acatctgagg acactgccgt ctattactgt
360 360
acatatgcta tggaatattg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc agccaaaacg acatatgcta tggaatattg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc agccaaaacg
420 420
acacccccat ctgtctatcc actggcccc acacccccat ctgtctatcc actggcccc
449 449
<210> 2<210> 2
<211> 149<211> 149
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 2<400> 2
Leu Lys Val Leu Thr Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Val Phe Leu MetLeu Lys Val Leu Thr Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Val Phe Leu Met
1 5 10 151 5 10 15
Ala Val Val Thr Gly Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser GlyAla Val Val Thr Gly Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly
20 25 30 20 25 30
Ala Asp Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr ThrAla Asp Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Val His Trp Val Lys Gln ArgSer Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Val His Trp Val Lys Gln Arg
50 55 60 50 55 60
Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn GlyPro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Thr Thr Phe Asp Pro Arg Phe Gln Ala Lys Ala Thr Ile Thr AlaLeu Thr Thr Phe Asp Pro Arg Phe Gln Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr SerAsp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser
100 105 110 100 105 110
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp GlyGlu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly
115 120 125 115 120 125
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro SerGln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
130 135 140 130 135 140
Val Tyr Pro Leu AlaVal Tyr Pro Leu Ala
145145
<210> 3<210> 3
<211> 8<211> 8
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 3<400> 3
Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr ValPhe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Val
1 515
<210> 4<210> 4
<211> 14<211> 14
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 4<400> 4
Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Leu Thr Thr PheTrp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Leu Thr Thr Phe
1 5 101 5 10
<210> 5<210> 5
<211> 6<211> 6
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 5<400> 5
Thr Tyr Ala Met Glu TyrThr Tyr Ala Met Glu Tyr
1 515
<210> 6<210> 6
<211> 428<211> 428
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 6<400> 6
ggaccaaagt tcaaagacaa aatggatttt caagtgcaga ttttcagctt cctgctaatc ggaccaaagt tcaaagacaa aatggatttt caagtgcaga ttttcagctt cctgctaatc
60 60
agtgcctcag tcatgctgtc cagaggacaa attgttctca cccagtctcc agcaatcatg agtgcctcag tcatgctgtc cagaggacaa attgttctca cccagtctcc agcaatcatg
120 120
tctgcatctc caggggagag ggtcaccatg acctgcagtg ccaggtcaga tgtaagttac tctgcatctc caggggagag ggtcaccatg acctgcagtg ccaggtcaga tgtaagttac
180 180
atgtattggt atcagcagaa gccaggatcc tcccccagac tcctgattta tgacacatcc atgtattggt atcagcagaa gccaggatcc tcccccagac tcctgattta tgacacatcc
240 240
aacctggctt ctggagtccc tgttcgcttc agtgccagtg ggtctgggac ctcttactct aacctggctt ctggagtccc tgttcgcttc agtgccagtg ggtctgggac ctcttactct
300 300
ctcacaatca gccgaatgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca gcagtggagt ctcacaatca gccgaatgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca gcagtggagt
360 360
agttacccac cgtggacgtt cggtggaggc accaagctgg aaatcaaacg ggctgatgct agttacccac cgtggacgtt cggtggaggc accaagctgg aaatcaaacg ggctgatgct
420 420
gcaccaac gcaccaac
428 428
<210> 7<210> 7
<211> 142<211> 142
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 7<400> 7
Gly Pro Lys Phe Lys Asp Lys Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe SerGly Pro Lys Phe Lys Asp Lys Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser
1 5 10 151 5 10 15
Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser Val Met Leu Ser Arg Gly Gln Ile ValPhe Leu Leu Ile Ser Ala Ser Val Met Leu Ser Arg Gly Gln Ile Val
20 25 30 20 25 30
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Arg ValLeu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Arg Val
35 40 45 35 40 45
Thr Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Asp Val Ser Tyr Met Tyr Trp TyrThr Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Asp Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr
50 55 60 50 55 60
Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr SerGln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser
65 70 75 8065 70 75 80
Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser GlyAsn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly
85 90 95 85 90 95
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala AlaThr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala
100 105 110 100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Trp Thr Phe GlyThr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Trp Thr Phe Gly
115 120 125 115 120 125
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala ProGly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
130 135 140 130 135 140
<210> 8<210> 8
<211> 8<211> 8
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 8<400> 8
Arg Ser Asp Val Ser Tyr Met TyrArg Ser Asp Val Ser Tyr Met Tyr
1 515
<210> 9<210> 9
<211> 11<211> 11
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 9<400> 9
Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala SerLeu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5 101 5 10
<210> 10<210> 10
<211> 9<211> 9
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 10<400> 10
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro TrpGln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Trp
1 515
<210> 11<210> 11
<211> 431<211> 431
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 11<400> 11
gcccaagtct tagacatcat ggattggctg tggaacttgc tattcctgat ggcagctgcc gcccaagtct tagacatcat ggattggctg tggaacttgc tattcctgat ggcagctgcc
60 60
caaagtgccc aagcacagat ccagttggtg cagtctggac ctgagctgaa gaagcctgga caaagtgccc aagcacagat ccagttggtg cagtctggac ctgagctgaa gaagcctgga
120 120
gagacagtca agatctcctg caaggcttct gggtatacct tcacaaactt tgaaatgaac gagacagtca agatctcctg caaggcttct gggtatacct tcacaaactt tgaaatgaac
180 180
tgggtgaagc aggctccagg acagggttta aactggatgg gctgtataaa cacctacact tgggtgaagc aggctccagg acagggttta aactggatgg gctgtataaa cacctacact
240 240
ggagacccaa tatatgctga tgacttcagg ggacggtttg ccttctcttt ggaaacctct ggagacccaa tatatgctga tgacttcagg ggacggtttg ccttctcttt ggaaacctct
300 300
gccagcactg cctatttgca gatcaacaac ctcaaaaatg aggacatggc tacatatttc gccagcactg cctatttgca gatcaacaac ctcaaaaatg aggacatggc tacatatttc
360 360
tgttcaagag agggaggggg ggactactgg ggccagggca ccactctcac ggtctcctca tgttcaagag agggaggggg ggactactgg ggccagggca ccactctcac ggtctcctca
420 420
gccaaaacga c gccaaaacga c
431 431
<210> 12<210> 12
<211> 143<211> 143
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 12<400> 12
Ala Gln Val Leu Asp Ile Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe LeuAla Gln Val Leu Asp Ile Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu
1 5 10 151 5 10 15
Met Ala Ala Ala Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln SerMet Ala Ala Ala Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser
20 25 30 20 25 30
Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys LysGly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys
35 40 45 35 40 45
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Glu Met Asn Trp Val Lys GlnAla Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Glu Met Asn Trp Val Lys Gln
50 55 60 50 55 60
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Asn Trp Met Gly Cys Ile Asn Thr Tyr ThrAla Pro Gly Gln Gly Leu Asn Trp Met Gly Cys Ile Asn Thr Tyr Thr
65 70 75 8065 70 75 80
Gly Asp Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe SerGly Asp Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser
85 90 95 85 90 95
Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu LysLeu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys
100 105 110 100 105 110
Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Arg Glu Gly Gly Gly AspAsn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Arg Glu Gly Gly Gly Asp
115 120 125 115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys ThrTyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr
130 135 140 130 135 140
<210> 13<210> 13
<211> 10<211> 10
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 13<400> 13
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Glu Met AsnGly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Glu Met Asn
1 5 101 5 10
<210> 14<210> 14
<211> 17<211> 17
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 14<400> 14
Cys Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Asp Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Phe ArgCys Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Asp Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Phe Arg
1 5 10 151 5 10 15
Glygly
<210> 15<210> 15
<211> 6<211> 6
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 15<400> 15
Glu Gly Gly Gly Asp TyrGlu Gly Gly Gly Asp Tyr
1 515
<210> 16<210> 16
<211> 432<211> 432
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 16<400> 16
ggaaatacat caggcaggca agggcatcaa gatgaagtca cagacccagg tcttcgtatt ggaaatacat caggcaggca agggcatcaa gatgaagtca cagacccagg tcttcgtatt
60 60
tctactgctc tgtgtgtctg gtgctcatgg gagtattgtg atgacccaga ctcccaaatt tctactgctc tgtgtgtctg gtgctcatgg gagtattgtg atgacccaga ctcccaaatt
120 120
cctgcttgta tcagcaggag acagggttac cataacctgc aaggccagtc agagtgtgac cctgcttgta tcagcaggag acagggttac cataacctgc aaggccagtc agagtgtgac
180 180
taatgatgta gcttggtacc aacagaagcc agggcagtct cctagattgc tgatatacca taatgatgta gcttggtacc aacagaagcc agggcagtct cctagattgc tgatatacca
240 240
tgcatccaat cgctacactg gagtccctga gcgcttcact ggcagtggat atgggacgga tgcatccaat cgctacactg gagtccctga gcgcttcact ggcagtggat atgggacgga
300 300
tttcactttc accatcaaca ctgtgcaggc tgaagacctg gcagtttatt tctgtcagca tttcactttc accatcaaca ctgtgcaggc tgaagacctg gcagtttatt tctgtcagca
360 360
ggattatagc tctcctcgga cgttcggtgg aggcaccaag ctggaaatca aacgggctga ggattatagc tctcctcgga cgttcggtgg aggcaccaag ctggaaatca aacgggctga
420 420
tgctgcacca ac tgctgcacca ac
432 432
<210> 17<210> 17
<211> 143<211> 143
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 17<400> 17
Glu Ile His Gln Ala Gly Lys Gly Ile Lys Met Lys Ser Gln Thr GlnGlu Ile His Gln Ala Gly Lys Gly Ile Lys Met Lys Ser Gln Thr Gln
1 5 10 151 5 10 15
Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser Gly Ala His Gly Ser IleVal Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser Gly Ala His Gly Ser Ile
20 25 30 20 25 30
Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp ArgVal Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg
35 40 45 35 40 45
Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp Val AlaVal Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp Val Ala
50 55 60 50 55 60
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr HisTrp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His
65 70 75 8065 70 75 80
Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Glu Arg Phe Thr Gly Ser GlyAla Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Glu Arg Phe Thr Gly Ser Gly
85 90 95 85 90 95
Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Asn Thr Val Gln Ala Glu AspTyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Asn Thr Val Gln Ala Glu Asp
100 105 110 100 105 110
Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Arg Thr PheLeu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Arg Thr Phe
115 120 125 115 120 125
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala ProGly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
130 135 140 130 135 140
<210> 18<210> 18
<211> 11<211> 11
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 18<400> 18
Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp Val AlaLys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp Val Ala
1 5 101 5 10
<210> 19<210> 19
<211> 7<211> 7
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 19<400> 19
His Ala Ser Asn Arg Tyr ThrHis Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 515
<210> 20<210> 20
<211> 9<211> 9
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 20<400> 20
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Arg ThrGln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Arg Thr
1 515
<210> 21<210> 21
<211> 4<211> 4
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 21<400> 21
Pro Leu Pro TrpPro Leu Pro Trp
11
<210> 22<210> 22
<211> 4<211> 4
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 22<400> 22
Val Leu Asp ArgVal Leu Asp Arg
11
<210> 23<210> 23
<211> 5<211> 5
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 23<400> 23
Asn Arg Arg Thr HisAsn Arg Arg Thr His
1 515
<210> 24<210> 24
<211> 4<211> 4
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 24<400> 24
Ser Asn Arg ArgSer Asn Arg Arg
11
<210> 25<210> 25
<211> 783<211> 783
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 25<400> 25
atgcacagct gggagcgcct ggcagttctg gtcctcctag gagcggccgc ctgcggtgag atgcacagct gggagcgcct ggcagttctg gtcctcctag gagcggccgc ctgcggtgag
60 60
gaggcctggg cctgggcggc gccgccccgt ggtcggatcc tgggcggcag agaggccgag gaggcctggg cctgggcggc gccgccccgt ggtcggatcc tgggcggcag agaggccgag
120 120
gcgcacgcgc ggccctacat ggcgtcggtg cagctgaacg gcgcgcacct gtgcggcggc gcgcacgcgc ggcctacat ggcgtcggtg cagctgaacg gcgcgcacct gtgcggcggc
180 180
gtcctggtgg cggagcagtg ggtgctgagc gcggcgcact gcctggagga cgcggccgac gtcctggtgg cggagcagtg ggtgctgagc gcggcgcact gcctggagga cgcggccgac
240 240
gggaaggtgc aggttctcct gggcgcgcac tccctgtcgc agccggagcc ctccaagcgc gggaaggtgc aggttctcct gggcgcgcac tccctgtcgc agccggagcc ctccaagcgc
300 300
ctgtacgacg tgctccgcgc agtgccccac ccggacagcc agcccgacac catcgaccac ctgtacgacg tgctccgcgc agtgccccac ccggacagcc agcccgacac catcgaccac
360 360
gacctcctgc tgctacagct gtcggagaag gccacactgg gccctgctgt gcgccccctg gacctcctgc tgctacagct gtcggagaag gccacactgg gccctgctgt gcgccccctg
420 420
ccctggcagc gcgtggaccg cgacgtggca ccgggaactc tctgcgacgt ggccggctgg ccctggcagc gcgtggaccg cgacgtggca ccgggaactc tctgcgacgt ggccggctgg
480 480
ggcatagtca accacgcggg ccgccgcccg gacagcctgc agcacgtgct cttgccagtg ggcatagtca accacgcggg ccgccgcccg gacagcctgc agcacgtgct cttgccagtg
540 540
ctggaccgcg ccacctgcaa ccggcgcacg caccacgacg gcgccatcac cgagcgcttg ctggaccgcg ccacctgcaa ccggcgcacg caccacgacg gcgccatcac cgagcgcttg
600 600
atgtgcgcgg agagcaatcg ccgggacagc tgcaagggtg actccggggg cccgctggtg atgtgcgcgg agagcaatcg ccgggacagc tgcaagggtg actccggggg cccgctggtg
660 660
tgcgggggcg tgctcgaggg cgtggtcacc tcgggctcgc gcgtttgcgg caaccgcaag tgcggggggcg tgctcgaggg cgtggtcacc tcgggctcgc gcgtttgcgg caaccgcaag
720 720
aagcccggga tctacacccg cgtggcgagc tatgcggcct ggatcgacag cgtcctggcc aagcccggga tctacacccg cgtggcgagc tatgcggcct ggatcgacag cgtcctggcc
780 780
tag tag
783 783
<210> 26<210> 26
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 26<400> 26
gtcagggtgc catgcaggag gtcagggtgc catgcaggag
20 20
<210> 27<210> 27
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 27<400> 27
cccaggagaa cctgcacctt c cccaggagaa cctgcacctt c
21 21
<210> 28<210> 28
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 28<400> 28
cctcccaccc ttagctatcc ccctcccaccc ttagctatcc
20 20
<210> 29<210> 29
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 29<400> 29
acccagactg tgtccctcac acccagactg tgtccctcac
20 20
<210> 30<210> 30
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 30<400> 30
cagcgcgtgg accgcgacgt cagcgcgtgg accgcgacgt
20 20
<210> 31<210> 31
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 31<400> 31
gcgcacagca gggcccagtg gcgcacagca gggcccagtg
20 20
<210> 32<210> 32
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 32<400> 32
ggccgccgcc cggacagcct ggccgccgcc cggacagcct
20 20
<210> 33<210> 33
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 33<400> 33
gccccagccg gccacgtcgc a gcccgccg gcccgtcgc a
21 21
<210> 34<210> 34
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 34<400> 34
gccacctgca accggcgcac g gccacctgca accggcgcac g
21 21
<210> 35<210> 35
<211> 23<211> 23
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 35<400> 35
tggcaagagc acgtgctgca ggc tggcaagagc acgtgctgca ggc
23 23
<210> 36<210> 36
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 36<400> 36
ggcccgctgg tgtgcggg ggcccgctgg tgtgcgggg
18 18
<210> 37<210> 37
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 37<400> 37
gtcccggcga ttgctctccg c gtcccggcga ttgctctccg c
21 21
<210> 38<210> 38
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 38<400> 38
ggccgccgcc cggacagcct ggccgccgcc cggacagcct
20 20
<210> 39<210> 39
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 39<400> 39
gcgcacagca gggcccagtg gcgcacagca gggcccagtg
20 20
<210> 40<210> 40
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 40<400> 40
gccacctgca accggcgcac g gccacctgca accggcgcac g
21 21
<210> 41<210> 41
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 41<400> 41
gcgcacagca gggcccagtg gcgcacagca gggcccagtg
20 20
<210> 42<210> 42
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 42<400> 42
ggcccgctgg tgtgcggg ggcccgctgg tgtgcgggg
18 18
<210> 43<210> 43
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 43<400> 43
gcgcacagca gggcccagtg gcgcacagca gggcccagtg
20 20
<210> 44<210> 44
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 44<400> 44
gccacctgca accggcgcac g gccacctgca accggcgcac g
21 21
<210> 45<210> 45
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 45<400> 45
gccccagccg gccacgtcgc a gcccgccg gcccgtcgc a
21 21
<210> 46<210> 46
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 46<400> 46
ggcccgctgg tgtgcggg ggcccgctgg tgtgcgggg
18 18
<210> 47<210> 47
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 47<400> 47
gtcccggcga ttgctctccg c gtcccggcga ttgctctccg c
21 21
<210> 48<210> 48
<211> 23<211> 23
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 48<400> 48
tgctgtgcgc gccctgccct ggc tgctgtgcgc gccctgccct ggc
23 23
<210> 49<210> 49
<211> 22<211> 22
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 49<400> 49
gggcccagtg tggccttctc cg gggcccagtg tggccttctc cg
22 22
<210> 50<210> 50
<211> 24<211> 24
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 50<400> 50
tgtgcgcccc gccccctggc agcg tgtgcgcccc gccccctggc agcg
24 24
<210> 51<210> 51
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 51<400> 51
gcagggccca gtgtggcc gcagggccca gtgtggcc
18 18
<210> 52<210> 52
<211> 23<211> 23
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 52<400> 52
gcgccccctg gcctggcagc gcg gcgccccctg gcctggcagc gcg
23 23
<210> 53<210> 53
<211> 27<211> 27
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 53<400> 53
acagcagggc ccagtgtggc cttctcc acagcagggc ccagtgtggc cttctcc
27 27
<210> 54<210> 54
<211> 23<211> 23
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 54<400> 54
ccccctgccc gcccagcgcg tgg ccccctgccc gcccagcgcg tgg
23 23
<210> 55<210> 55
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 55<400> 55
cgcacagcag ggcccagt cgcacagcag ggcccagt
18 18
<210> 56<210> 56
<211> 23<211> 23
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 56<400> 56
gctcttgcca gccctggacc gcg gctcttgcca gccctggacc gcg
23 23
<210> 57<210> 57
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 57<400> 57
acgtgctgca ggctgtcc acgtgctgca ggctgtcc
18 18
<210> 58<210> 58
<211> 25<211> 25
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 58<400> 58
cttgccagtg gccgaccgcg ccacc cttgccagtg gccgaccgcg ccacc
25 25
<210> 59<210> 59
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 59<400> 59
agcacgtgct gcaggctg agcacgtgct gcaggctg
18 18
<210> 60<210> 60
<211> 23<211> 23
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 60<400> 60
gccagtgctg gcccgcgcca cct gccagtgctg gccgcgcca cct
23 23
<210> 61<210> 61
<211> 23<211> 23
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 61<400> 61
aagagcacgt gctgcaggct gtc aagagcacgt gctgcaggct gtc
23 23
<210> 62<210> 62
<211> 25<211> 25
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 62<400> 62
agtgctggac gccgccacct gcaac agtgctggac gccgccacct gcaac
25 25
<210> 63<210> 63
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 63<400> 63
ggcaagagca cgtgctgc ggcaagagca cgtgctgc
18 18
<210> 64<210> 64
<211> 24<211> 24
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 64<400> 64
gccgcccagc gcgtggaccg cgac gccgcccagc gcgtggaccg cgac
24 24
<210> 65<210> 65
<211> 24<211> 24
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 65<400> 65
ggcggcgcgc acagcagggc ccag ggcggcgcgc acagcaggggc ccag
24 24
<210> 66<210> 66
<211> 24<211> 24
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 66<400> 66
gccgccgcca cctgcaaccg gcgc gccgccgcca cctgcaaccg gcgc
24 24
<210> 67<210> 67
<211> 25<211> 25
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 67<400> 67
ggcggctggc aagagcacgt gctgc ggcggctggc aagagcacgt gctgc
25 25
<210> 68<210> 68
<211> 23<211> 23
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 68<400> 68
cctgcgcacg taccacgacg gcg cctgcgcacg taccacgacg gcg
23 23
<210> 69<210> 69
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 69<400> 69
ttgcaggtgg cgcggtccag c ttgcaggtgg cgcggtccag c
21 21
<210> 70<210> 70
<211> 23<211> 23
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 70<400> 70
caccgagcgc atgatgtgcg cgg caccgagcgc atgatgtgcg cgg
23 23
<210> 71<210> 71
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 71<400> 71
atggcgccgt cgtggtac atggcgccgt cgtggtac
18 18
<210> 72<210> 72
<211> 23<211> 23
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 72<400> 72
gaggtgaagc tggtggagac agg gaggtgaagc tggtggagac agg
23 23
<210> 73<210> 73
<211> 17<211> 17
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 73<400> 73
ggggccagtg gatagac ggggccagtggatagac
17 17
<210> 74<210> 74
<211> 32<211> 32
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 74<400> 74
ccagttccga gctccagatg acccagactc ca ccagttccga gctccagatg acccagactc ca
32 32
<210> 75<210> 75
<211> 32<211> 32
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 75<400> 75
ccagttccga gctcgtgctc acccagtctc ca ccagttccga gctcgtgctc acccagtctc ca
32 32
<210> 76<210> 76
<211> 32<211> 32
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 76<400> 76
ccagttccga gctccagatg acccagtctc ca ccagttccga gctccagatg acccagtctc ca
32 32
<210> 77<210> 77
<211> 32<211> 32
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 77<400> 77
ccagttccga gctcgtgatg acacagtctc ca ccagttccga gctcgtgatg acacagtctc ca
32 32
<210> 78<210> 78
<211> 17<211> 17
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 78<400> 78
gttggtgcag catcagc gttggtgcag catcagc
17 17
<---<---
Claims (22)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762457477P | 2017-02-10 | 2017-02-10 | |
| US62/457,477 | 2017-02-10 | ||
| PCT/US2018/017537 WO2018148486A1 (en) | 2017-02-10 | 2018-02-09 | Anti-factor d antibodies and uses thereof |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019128203A RU2019128203A (en) | 2021-03-10 |
| RU2019128203A3 RU2019128203A3 (en) | 2021-11-12 |
| RU2799044C2 true RU2799044C2 (en) | 2023-07-03 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЕГОРОВА А.А., НЕЧИПОРЕНКО П.А., Роль системы комплемента в патогенезе возрастной макулярной дегенерации. Методы медикаментозного воздействия (литературный обзор), Офтальмологические ведомости, 2012, том V, номер 2, с.77-82. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7364221B2 (en) | Anti-C5 antibody and its use | |
| US20170334980A1 (en) | Anti-properdin antibodies and uses thereof | |
| CN110461879B (en) | Anti-factor D antibodies and uses thereof | |
| JP7251792B2 (en) | Anti-C5a Antibodies and Their Uses | |
| KR20210055742A (en) | Humanized anti-C5 antibodies and uses thereof | |
| US20220204602A1 (en) | Bi-functional humanized anti-c5 antibodies and factor h fusion proteins and uses thereof | |
| RU2799044C2 (en) | Antibodies against factor d and their use | |
| EA044227B1 (en) | ANTIBODIES AGAINST FACTOR D AND THEIR APPLICATIONS | |
| RU2773779C2 (en) | ANTI-C5a ANTIBODIES AND THEIR APPLICATIONS | |
| EA043843B1 (en) | ANTI-C5A ANTIBODIES AND THEIR APPLICATIONS | |
| EA041723B1 (en) | ANTI-C5 ANTIBODIES AND THEIR USE |