JP5068913B2 - 薬剤活性のあるスルホニルアミノ酸誘導体 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、薬剤活性のある化合物として使用するためのスルホニルアミノ酸誘導体、ならびにそのようなスルホニルアミノ酸誘導体を含有する薬剤調製物に関する。特に本発明は、ＪＮＫ（ジュン−キナーゼ（Jun-Kinase））機能または経路のそれぞれ実質的な調節活性、特に阻害活性を示すスルホニルジペプチド誘導体に関し、従って、これは自己免疫系および神経系の疾患の治療および／または予防に特に有用である。従って本発明は、新規スルホニルアミノ酸誘導体ならびにその調製法に関する。
【０００２】
発明の背景
アポトーシスは、プログラム化細胞死滅のプロセスを受けている細胞の膜や小器官の複雑なひずみである。該プロセスの間に、細胞は固有の自殺プログラムを活性化させ、整然として自身を破壊していく。以下のシリーズの事象が観察される：
・細胞表面に泡状突起が出はじめて、食作用前のシグナルを表す。次にアポトーシス細胞全体は、断片化して膜結合小胞になり、これは食作用により急速かつ正確に除去され、その結果、周りの組織への傷害は最小となる。
・次に細胞は、その近傍から分離する。
核はまた、遺伝子的自殺をしながら、特徴的な形態変化パターンを示し、クロマチンは凝縮し、特異的に切断されてＤＮＡの断片となる。
【０００３】
神経細胞の死滅は、神経系を正常に成長させるのに重要な役割を果たす。発達中のニューロンの死滅は、神経刺激する標的のサイズに依存する。少ないシナプスパートナーを有する細胞は、多数のシナプスを形成した細胞より死滅しやすい。これは、発達中の神経系のシナプス前からシナプス後ニューロンの相対数をバランスさせるプロセスを反映しているかも知れない。神経細胞死滅はアポトーシス性であると推定されたが、つい最近になって、発達中のげっ歯類の脳中のニューロンは、形態とＤＮＡ断片化により分類されるように、アポトーシスを受けることが最終的に証明された。発達中の細胞死滅は明らかに、病的プロセスではなく、細胞が実際に存在を停止することは意味がある。
【０００４】
神経の死滅は、神経外傷後または神経変性疾患中のアポトーシスまたは壊死プロセスを介して起きる。ニューロンのプログラム化細胞死滅を進めるのに重要な役割を果たす多くの成分が出現している。神経のアポトーシスへと誘導する成分には、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫｓ）のサブファミリーであるＳＡＰＫ／ＪＮＫのメンバーがある。
【０００５】
ＭＡＰＫ（***促進因子−活性化タンパク質キナーゼ）は、スレオニンとチロシン残基への二重リン酸化により活性化されるセリン／スレオニンキナーゼである。哺乳動物細胞では、細胞外刺激により生成する情報をＭＡＰＫへ伝搬する少なくとも３通りの異なるが並行した経路がある。この経路は、ＥＰＫ（細胞外制御キナーゼ）、ＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ）、およびｐ３８／ＣＳＢＰキナーゼの活性化に至るキナーゼカスケードからなる。ストレス型の分子外シグナルを中継するのにＪＮＫとｐ３８経路の両方が関与するが、ＥＰＫ経路は主に、***促進性／分化シグナルを細胞核に伝達するのに関与する。
【０００６】
ＳＡＰＫカスケードは、***促進因子−活性化タンパク質キナーゼのサブファミリーであり、これは、ＵＶ照射後のＤＮＡ傷害、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、セラミド、細胞ストレス、および反応性酸素種を含む異なる外部刺激により活性化され、明瞭な基質特異性を有する。ＭＫＫ３／ｐ３８のＭＫＫ４／ＪＮＫを介するシグナル伝達は、誘導性転写因子であるｃ−ＪｕｎとＡＴＦ２のリン酸化を引き起こし、これは次に、ホモダイマーまたはヘテロダイマーとして作用して、下流のエフェクターの転写を開始させる。
【０００７】
ｃ−Ｊｕｎは、ホモダイマーとヘテロダイマーを形成（例えば、ｃ−ＦｏＳと）して、炎症応答に関与する多くの遺伝子（例えば、マトリックス金属プロテアーゼ）の活性化に必要なトランス作用複合体ＡＰを産生するタンパク質である。ＪＮＫは、紫外線やＴＮＦ−αのようないくつかの異なる刺激が、タンパク質Ｎ末端の特異的セリン残基上のｃ−Ｊｕｎのリン酸化を刺激することが見いだされた時に、発見された。
【０００８】
Xie Xら（Structure 1998, 6(8);983-991）の最近の文献において、ストレス活性化シグナル伝達経路の活性化が、ラットのＰＣ−１２と上頚神頚節（ＳＣＧ）交感神経細胞中のＮＧＦ撤退により誘導される神経アポトーシスに必要であることが示唆されている。特異的キナーゼ（すなわち、ＭＡＰキナーゼ３（ＭＫＫ３）とＭＡＰキナーゼ４（ＭＫＫ４）、またはｃ−Ｊｕｎ（ＭＫＫ−４カスケードの一部））の阻害は、アポトーシスをブロックするのに充分かも知れない（Kumagae Yら、Brain Res Mol Brain Res, 1999, 67(1), 10-17およびYang DDら、Nature, 1997, 389(6653);865-870を参照）。ＳＣＧニューロン中のＮＧＦ枯渇の数時間以内に、ｃ−Ｊｕｎは高度にリン酸化され、タンパク質レベルが上昇する。同様にＮＧＦが枯渇したラットＰＣ−１２細胞では、ＪＮＫとｐ３８は、持続的活性化を受け、ＥＲＫは阻害される。このＪＮＫ３と一致して、ＫＯマウスは、海馬中の興奮毒性（excitotoxicity）誘導アポトーシスに耐性であり、さらに重要なことは、これらは、正常な動物と比較して、興奮毒性に応答しててんかん様発作が大幅に低下している（Nature 1997, 389, 865-870）。
【０００９】
さらに最近は、ＪＮＫシグナル伝達経路が、細胞増殖に関与し、Ｔ細胞活性化と増殖により仲介される自己免疫疾患において重要な役割を果たす可能性があることが報告されている（Immunity, 1998, 9, 575-585; Current Biology, 1999, 3, 116-125）。
【００１０】
ナイーブ（前駆体）ＣＤ４+ ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体を介して抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識する。ＴＣＴ−介在シグナル以外に、少なくともある程度ＡＰＣ上のＢ７タンパク質とともにＴ細胞上に発現されるＣＤ２８の結合により、同時刺激シグナルが提供される。これら２つのシグナルの組合せには、Ｔ細胞クローン性発現を含む。
【００１１】
４〜５日間増殖後、ＣＤ４+ Ｔ細胞の前駆体は、免疫系の機能を仲介する武装エフェクターＴｈ細胞に分化する。分化プロセス中に、遺伝子発現の多大な再プログラミングが起きる。
【００１２】
２つのサブセットのエフェクターＴｈ細胞が、その明瞭なサイトカイン分泌パターンと免疫調節作用に基づいて規定されている（Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮγとＬＴ（ＴＮＦ−β）を産生し、これは細胞性炎症性反応に必要である。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を分泌し、これはＢ細胞活性化と分化を仲介する）。これらの細胞は、免疫応答において中心的な役割を果たす。ＪＮＫ ＭＡＰキナーゼ経路は、抗原刺激によりＴｈ１中で誘導されるが、Ｔｈ２エフェクター細胞中では誘導されない。前駆ＣＤ４+ Ｔ細胞のＴｈ１（しかしＴｈ２ではない）細胞への分化は、ＪＮＫ２−欠損マウスで傷害されている。従って近年、ＪＮＫキナーゼ経路は、ＪＮＫ２を介するＴｈ１とＴｈ２免疫応答のバランスにおいて重要な役割を果たすことが認識されている。
【００１３】
ＪＮＫキナーゼ経路を阻害することを目的として、ＷＯ／９８４９１８８は、ヒトポリペプチド、すなわちＪＮＫ−相互作用タンパク質１（ＪＩＰ−１）（これは、生物学的産物であり、アポトーシス関連疾患を克服するために測定されている）の使用を教示している。
【００１４】
そのようなヒトポリペプチドは、ＪＮＫキナーゼ経路に阻害作用を有することが確認されているが、その使用に関連して種々の欠点がある：
・活性バイオペプチドまたはバイオタンパク質は、かなり包括的で高価な生合成によってのみ得られ、従ってこれはしばしば、得られる生成物をコストの高いものにする。
・このペプチドは、膜透過性が低いことが知られており、血液脳膜を通過することができないかも知れない。
・タンパク質インヒビターまたはアンタゴニストの使用の主要な欠点は、腸分解により生じる低い経口生物有用性である。従ってこれらは、非経口的に投与しなければならい、そして最後に、
・ペプチドインヒビターまたはアンタゴニストは、宿主体により、排除すべき侵入物質として認識され、従って自己免疫応答を開始する。
【００１５】
従って本発明の目的は、ペプチドまたはタンパク質の使用から生じる基本的にすべての上記欠点を避けるが、種々の疾患、特に神経系または自己免疫系関連疾患の治療に適した比較的小分子を提供することである。特に本発明の目的は、好ましくはＪＮＫ機能により仲介される疾患を治療する便利な方法として利用できるように、ＪＮＫ（Ｊｕｎキナーゼ）経路を調節、好ましくはダウンレギュレートまたは阻害することができる比較的小分子の化合物を提供することである。さらに、本発明の目的は、該小分子化合物を調製する方法を提供することである。さらに本発明の目的は、好ましくはＪＮＫ機能により仲介される疾患を治療するための新しい分類の医薬調製物を提供することである。最後の本発明の目的は、自己免疫系および／または神経系の障害により引き起こされる疾患の治療および／または予防方法を提供することである。
【００１６】
発明の説明
上記目的は、個々の請求項によって達成されている。従属請求項（これらは、参照することにより本明細書に組み込まれる）内で、好適な実施態様が記載される。
【００１７】
以下の段落は、本発明の化合物を構成する種々の化学残基の定義を提供し、特により広い範囲の定義をしない場合は、明細書全体と請求項を通して均一に適用されるものとする。
【００１８】
「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」とは、１〜６個の炭素原子を有する１価アルキル基を意味する。この用語の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシルなどの基がある。
【００１９】
「アリール」とは、単一の環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチル）を有する６〜１４個の炭素原子の不飽和芳香族炭素環基を意味する。好適なアリールには、フェニル、ナフチル、フェナントレニルなどがある。
【００２０】
「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」とは、ベンジル、フェネチルなどを含むアリール置換基を有するＣ1〜Ｃ6−アルキル基を意味する。
【００２１】
「ヘテロアリール」とは、単環式複素環式芳香族、または二環式、または三環式縮合環複素環式芳香族基を意味する。複素環式芳香族基の具体例には、任意的に置換されたピリジル、ピロリル、フリル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１，３，４−トリアジニル、１，２，３−トリアジニル、ベンゾフリル、［２，３−ジヒドロ］ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、イソベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、ベンズイミダゾリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、キノリジニル、キナゾリニル、フタラジニル、キノキサリニル、シンノリニル、ナフチリジニル、ピリド［３，４−ｂ］ピリジル、ピリド［３，２−ｂ］ピリジル、ピリド［４，３−ｂ］ピリジル、キノリル、イソキノリル、テトラゾリル、５，６，７，８−テトラヒドロキノリル、５，６，７，８−テトラ−ヒドロイソキノリル、プリニル、プテリジニル、カルバゾリル、キサンテニルまたはベンゾキノリルがある。
【００２２】
「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」とは、２−フリルメチル、２−チエニルメチル、２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチルなどを含むヘテロアリール置換基を有するＣ1〜Ｃ6−アルキル基を意味する。
【００２３】
「アルケニル」とは、好ましくは２〜６個の炭素原子と少なくとも１つまたは２つのアルケニル不飽和部位を有するアルケニル基を意味する。好適なアルケニル基には、エテニル（−ＣＨ＝ＣＨ2）、ｎ−２−プロペニル（アリル、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2）などがある。
【００２４】
「アルキニル」とは、好ましくは２〜６個の炭素原子と少なくとも１〜２個のアルキニル不飽和部位を有するアルキニル基を意味し、好適なアルキニル基には、エチニル（−Ｃ≡ＣＨ）、プロパルギル（−ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ）などがある。
【００２５】
「アシル」とは、基−Ｃ（Ｏ）Ｒを意味し、ここでＲは、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」を含む。
【００２６】
「アシルオキシ」とは、基−ＯＣ（Ｏ）Ｒを意味し、ここでＲは、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」を含む。
【００２７】
「アルコキシ」とは、基−Ｏ−Ｒを意味し、ここでＲは、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、または「アリール」、または「ヘテロアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」を含む。好適なアルコキシ基には、例えばメトキシ、エトキシ、フェノキシなどがある。
【００２８】
「アルコキシカルボニル」とは、基−Ｃ（Ｏ）ＯＲを意味し、ここでＲは、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、または「アリール」、または「ヘテロアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」を含む。
【００２９】
「アミノカルボニル」とは、基−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’を意味し、ここで各Ｒ、Ｒ’は、独立に水素またはＣ1〜Ｃ6−アルキル、またはアリール、またはヘテロアリール、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」を含む。
【００３０】
「アシルアミノ」とは、基−ＮＲ（ＣＯ）Ｒ’を意味し、ここで各Ｒ、Ｒ’は、独立に水素または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、または「アリール」、または「ヘテロアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」を含む。
【００３１】
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素原子を意味する。
「スルホニル」とは、基「−ＳＯ2−Ｒ」を意味し、ここでＲは、Ｈ、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、ハロゲンで置換された「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、例えば−ＳＯ2−ＣＦ3基、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」から選択される。
【００３２】
「スルホキシ」とは、基「−Ｓ（Ｏ）−Ｒ」を意味し、ここでＲは、Ｈ、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、ハロゲンで置換された「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、例えば−ＳＯ−ＣＦ3基、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」から選択される。
【００３３】
「チオアルコキシ」とは、基−Ｓ−Ｒを意味し、ここでＲは、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、または「アリール」、または「ヘテロアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」を含む。好適なチオアルコキシ基には、チオメトキシ、チオエトキシなどがある。
【００３４】
「置換もしくは非置換」：個々の置換基の定義で特に明記しない場合は、上記の基（「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」、「アリール」および「ヘテロアリール」など）は、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」、「Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル」、「Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル」、一級、二級、もしくは三級アミノ基または四級アンモニウム残基、「アシル」、「アシルオキシ」、「アシルアミノ」、「アミノカルボニル」、「アルコキシカルボニル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、ニトロ、スルホキシ、スルホニル、アルコキシ、チオアルコキシ、トリハロメチルなどよりなる群から選択される１〜５個の置換基で任意的に置換されてよい。あるいは、該置換はまた、隣接する置換基が閉環を受けた状況、特にビシナル官能基置換基が関与して、例えばラクタム、ラクトン、環状無水物、またアセタール、チオアセタール、例えば保護基を得るために閉環により形成されたアミナールを形成する時も含む。
【００３５】
「薬剤学的に許容される塩または複合体」とは、所望の生物活性を保持する以下で同定される式Ｉの化合物の塩または複合体を意味する。そのような塩の例には、特に限定されないが、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）と形成される酸付加塩、および有機酸（例えば、酢酸、オキザル酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモイック酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、およびポリガラクツロン酸）と形成される塩がある。該化合物はまた、式−ＮＲ，Ｒ’、Ｒ”+ Ｚ- の四級アンモニウム塩を含み、ここでＲ、Ｒ’、Ｒ”は独立に、水素、アルキル、またはベンジルであり、Ｚは対イオン（塩化物、臭化物、ヨウ化物、−Ｏ−アルキル、トルエンスルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、またはカルボン酸塩（例えば、安息香酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、桂皮酸塩、マンデル酸塩、およびジフェニル酢酸塩）を含む）である。
【００３６】
「薬剤学的に許容される誘導体」とは、患者に投与すると、直接または間接に、本明細書に開示の活性を提供することができる任意の化合物を意味する。
【００３７】
「エナンチオマー過剰」（ｅｅ）とは、基本的にエナンチオマー合成、またはエナンチオ選択的工程を含む合成により得られる生成物を意味し、こうして、少なくとも約５２％ｅｅのオーダーの１つのエナンチオマーが得られる。エナンチオマー合成が無いと、通常ラセミ体が得られ、これはまた、ＪｕｎＫ２および／または３インヒビターとして本発明の活性を有する。
【００３８】
驚くべきことに、式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体は、ＪＮＫ（特にＪＮＫ２と３）の作用を有効に阻害することにより、好適な薬剤活性のある物質であることがわかった。応用の便利さから、本発明で見いだされた化合物は、経口投与でも利用できるため、上記ペプチドまたはタンパク質アプローチと比較して顕著な優秀性を示す。これらは、医師が処方することができ、わずかな観察が必要なだけである。また本発明で見いだされた化合物は、ここまで記載した該ペプチド化合物と比較して低コストで入手できる。
【化１０】
Ａｒ1とＡｒ2は、互いに独立に、置換もしくは非置換アリールもしくはヘテロアリール基であり、
ＸはＯまたはＳ、好ましくはＯであり；
Ｒ1は、水素または非置換もしくは置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキル基であり、好ましくはＨである。
【００３９】
あるいはＲ1は、Ａｒ1との置換もしくは非置換５〜６−員環飽和または不飽和縮合環である。
【００４０】
さらに代替法において、Ｒ2およびＲ4は、置換もしくは非置換５〜６員環の飽和もしくは不飽和環を形成することができる。
【００４１】
Ｒ2は、水素または置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキル基であり、好ましくはＨである。
ｎは、０〜５の整数であり、好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１である。
Ｒ3とＲ4は、互いに独立して、天然のまたは合成アミノ酸残基、水素、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（例えば、トリハロメチル）、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、ＮＨ2、ＳＨ、Ｃ1〜Ｃ6−チオアルキル、アシルアミノ、アミノカルボニル、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール、１〜３個のヘテロ原子を含有していてもよい置換もしくは非置換４〜８員環状アルキル、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、アシルオキシ、スルホキシ、スルホニル、Ｃ1〜Ｃ6−チオアルコキシを含むかまたはこれらよりなる群から選択される（ただし、ここでＲ3および／またはＲ4の少なくとも１つはアミノ酸残基でなければならない）。
Ｒ5は、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキルである。
Ｒ6は、Ｈ、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−脂肪族アルキル、任意的に１〜３異項原子を含み、かつ任意的にアリールもしくはヘテロアリールと縮合した置換もしくは非置換飽和環Ｃ4〜Ｃ8−アルキルであり；Ｒ6は、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
【００４２】
ここで、Ｒ6のアリールもしくはヘテロアリール基は、任意的に置換または非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（例えばトリハロメチル）、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル、アミノ、アシルアミノ、アミノカルボニル、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシカルボニル、アリール、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、スルホニル、スルホキシ、Ｃ1〜Ｃ6−チオアルコキシで任意的に置換されている。
【００４３】
あるいは、Ｒ5とＲ6は一緒に、置換もしくは非置換４〜８員飽和環状アルキルまたはヘテロアルキル基を形成することができる。
【００４４】
本発明はまた、式Ｉの化合物の幾何異性体、光学活性型、エナンチオマー、ジアステレオ異性体を含み、そのラセミ体、およびまた式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体の薬剤学的に許容される塩ならびに薬剤活性のある誘導体を含む。
【００４５】
好適な実施態様においてＲ3および／またはＲ4の少なくとも１つは、以下の天然のアミノ酸残基よりなる群から選択される：アラニル、アルギニル、アスパラギニル、アスパルチル、システイニル、グルタミニル、グルタミル、グリシル、ヒスチジル、イソロイシル、ロイシル、リジル、メチオニル、フェニルアラニル、ピロリル、セリル、スレオニル、トリプトファニル、チロシル、バリル。
【００４６】
好適な実施態様において、Ａｒ1とＡｒ2は、フェニル、チエニル、フリル、ピリジルを含む群またはこれらよりなる群から独立に選択される。該残基は、少なくとも１つの置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（例えば、トリハロメチル）、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル、アミノ、アシルアミノ、アミノカルボニル、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシカルボニル、アリール、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、スルホキシ、スルホニル、アシルオキシ、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−チオアルコキシにより任意的に置換される。特に好適な実施態様において、Ａｒ1は、非置換もしくは置換フェニルであり、Ａｒ3はチエニル基である。
【００４７】
式Ｉの好適なスルホニルアミノ酸誘導体において、Ａｒ1は非置換もしくは置換フェニル、好ましくは４−クロロフェニル基であり、Ｘは好ましくはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は好ましくは水素であり、ｎは１であり、Ａｒ2は好ましくはチエニルであり、Ｒ5はＨまたはＣ1〜Ｃ6−アルキルである。
【００４８】
該好適な実施態様において、Ｒ6は、Ｈ、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−脂肪族アルキル、例えばアリールアミノＣ 1 〜Ｃ 6 −アルキル、ヘテロアリールアミノＣ 1 〜Ｃ 6 −アルキル、任意的に１〜３異項原子を含有し、かつ非置換もしくは置換アリールもしくはヘテロアリールと縮合した置換もしくは非置換環状Ｃ4〜Ｃ8−アルキルであるか；またはＲ6は非置換もしくは置換アリールもしくはヘテロアリールである。
【００４９】
上記アリールもしくはヘテロアリール基は、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（例えば、トリハロメチル）、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル、アミノ、アシルアミノ、アミノカルボニル、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシカルボニル、アリール、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、アシルオキシ、スルホキシ、スルホニル、Ｃ1〜Ｃ6−チオアルコキシで、任意的に置換される。
【００５０】
あるいはＲ5とＲ6は一緒に、非置換もしくは置換４〜８員飽和環状アルキルもしくはヘテロアルキル基（例えば、非置換もしくは置換ピペリジノ基）を形成することができる。
【００５１】
本発明の特に好適な実施態様は、スルホニルアミノ酸誘導体に関し、ここでＲ5はＨであり；Ｒ6は、アリール、ヘテロアリール基またはアミノアリール、アミノヘテロアリール、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシで置換されたＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、該アリールおよびヘテロアリール基は、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（例えば、トリハロメチル）、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル、アミノ、アシルアミノ、アミノカルボニル、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換アリール、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、スルホキシ、スルホニル、アシルオキシ、Ｃ1〜Ｃ6−チオアルコキシで、任意的に置換される。
【００５２】
本発明の好適な実施態様において、スルホニルアミノ酸誘導体のＲ6は、置換もしくは非置換ピリジル基である。
【００５３】
式Ｉの化合物の具体例は以下を含む：
４−クロロ−Ｎ−（｛５−［（｛２−［（２−｛［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）ピリジ−２−ニル］アミノ｝エチル）アミノ］−２−オキソエチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル）ベンズアミド
【００５４】
４−クロロ−Ｎ−［（５−｛［（２−｛［２−（｛５−ニトロピリジ−２−ニル｝アミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソエチル）アミノ］スルホニル｝チエ−２−ニル）メチル］ベンズアミド
【００５５】
４−クロロ−Ｎ−（｛５−［（｛２−オキソ−２−［（２−｛［３−（トリフルオロメチル）ピリジ−２−ニル］アミノ｝エチル）アミノ］エチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル）ベンズアミド
【００５６】
４−クロロ−Ｎ−（｛５−［（｛２−オキソ−２−［（２−｛［５−（トリフルオロメチル）ピリジ−２−ニル］アミノ｝エチル）アミノ］エチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル）ベンズアミド
【００５７】
Ｎ−（｛５−［（｛２−［４−（１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イル）ピペリジ−１−ニル］−２−オキソエチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル)−４−クロロベンズアミド
【００５８】
４−クロロ−Ｎ−［（５−｛［（２−オキソ−２−｛３−［（トリフルオロメチル）スルホニル］アニリノ｝エチル）アミノ］スルホニル｝チエ−２−イル）メチル］ベンズアミド
【００５９】
本発明のさらなる面は、ＪＮＫ機能またはシグナル伝達経路関連疾患、特に神経疾患および／または免疫系の疾患に対する、調節、特にダウンレギュレート (例えば阻害）するための医薬組成物の調製のための、式のスルホニルアミノ酸誘導体の使用、ならびに医薬組成物自体である。好適なＪＮＫ経路は、ＪＮＫ１および／またはＪＮＫ２および／またはＪＮＫ３である。
【００６０】
上記したように、式Ｉの化合物は医薬としての使用に適している。上記一般式Ｉに分類される化合物のほんのわずかのものが、本出願以前に開示されているが、これまでまだ医学的または生物学的活性を証明したものはない。従って、上記式Ｉに属する新規化合物および少ない公知の化合物の両方が、一連の疾患、例えば、哺乳動物特にヒトの自己免疫系および神経系の疾患の治療に使用するのに適していることが、本明細書において報告される。さらに詳しくは、式Ｉの化合物は単独または医薬組成物の形で、ＪＮＫ経路の調節、さらに詳しくはＪＮＫ、特にＪＮＫ１および／またはＪＮＫ２および／またはＪＮＫ３の異常な発現または活性に関連する疾患の治療または予防に有用である。該調節は通常好ましくは、ＪＮＫ経路、特にＪＮＫ１および／またはＪＮＫ２および／またはＪＮＫ３の阻害を含む。ＪＮＫのそのような異常発現または活性は、無数の刺激（例えば、ストレス、敗血症ショック、酸化的ストレス、サイトカイン）により引き起こされ、以下に記載する疾患や病状にしばしば関与する制御できないアポトーシスまたは自己免疫疾患に至ることがある。従って式Ｉの化合物は、ＪＮＫ機能またはシグナル伝達経路を調節することにより疾患の治療に使用される。ＪＮＫ機能または経路の該調節は、その活性化を含むが、好ましくはＪＮＫ経路、特にＪＮＫ１および／またはＪＮＫ２および／またはＪＮＫ３のダウンレギュレーションから阻害までを含む。式Ｉの化合物は、単独でまたはさらなる薬剤と組合せて使用される。
【００６１】
具体的には式Ｉの化合物は、ＪＮＫ１および／またはＪＮＫ２および／またはＪＮＫ３の阻害が決定的に重要な役割を果たす免疫関連および／または神経関連疾患または病状（例えば、てんかん；アルツハイマー病、ハンティントン病、パーキンソン病のような神経変性疾患；網膜疾患；脊髄損傷；頭部損傷、多発性硬化症を含む自己免疫疾患、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、リウマチ様関節炎；喘息；敗血症ショック；移植拒絶；乳癌、結腸癌、膵臓癌を含む癌、および卒中、脳虚血、動脈硬化、心筋梗塞、心筋潅流傷害を含む心血管疾患）の治療または予防に有用である。
【００６２】
驚くべきことに、本発明で見いだされた式Ｉの化合物は、ＪＮＫ１および／またはＪＮＫ２および／またはＪＮＫ３のインヒビターとして大きな活性を示す。好適な実施態様において本発明の化合物は、ＪＮＫ２および３と偶然同じファミリーに属する２つのさらなるアポトーシス調節酵素（すなわち、ｐ３８とＥＲＫ２）を考慮すると、予想外に実質的に不活性である。従って本発明の化合物は、ＪＮＫ経路に関連する疾患を選択的に治療し、ｐ３８やＥＲＫ２のような他の標的に関しては基本的に効率が低いという顕著な可能性を示し、その結果選択的インヒビターと考えられる。これらの関連酵素は一般に異なる疾患に関与しているため、これは非常に意義があり、従って異なる疾患の治療には、対応する選択的薬剤を使用することが好ましい。
【００６３】
実際、本明細書に報告され驚くべきことに見いだされた本発明の式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体以前は、ＪＮＫ経路のインヒビターとしての小分子化合物の使用について何も知られていなかった。
【００６４】
本発明のさらなる面は、実際に新規な式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体、すなわち先行技術では開示されていない式ＩのＪＮＫ阻害スルホニルアミノ酸誘導体である。実際、式Ｉの一部の少ない化合物は、Ragab A.らのIndian J. Chem., Sec. B; Org. Chem. Incl. Med. Chem., 1998, 37B(19), 1059-1062に開示されているが、薬剤についての記載はない。Ragab A.らの式Ｉの公知の化合物は、Ａｒ1が４−クロロフェニルまたは２，４−ビスクロロフェニル残基であり；Ａｒ2がフェニルであり；ｎ＝１であり；ＸがＯであるものであり、残基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ5はすべてＨであり；Ｒ4が、Ｈ、ＣＨ3、ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＯＨ−４、ＣＨ2−ＣＨ−（ＣＨ3）2であり、Ｒ6がＣＨ2−ＣＯ2ＣＨ3であるものである。
【００６５】
３つのさらなる化合物が、会社のカタログで言及されているという意味で、CEREP社（www.cerep.fr）から開示されているが、薬剤についての記載はない。
【００６６】
一般にCEREP社の式Ｉの化合物は、Ａｒ1が４−クロロフェニルであり、ＸがＯであり、Ｒ1がＨであり、Ａｒ2がチエニル基であるものであるが、２つの化合物において、残基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5およびＲ6はすべてＨであり、Ｒ4はメチルまたは（４−ヒドロキシフェニル）エチルである。第３のCEREP化合物において、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ5はＨであり、Ｒ4はメチルであり、Ｒ2はプロピルであり、Ｒ6は２−メチルフェニルである。
【００６７】
従って、式Ｉの完全に新規なスルホニルアミノ酸誘導体は、式Ｉ
【化１１】
のものであり、上記のRagab A.らとCEREPの公知の化合物は排除される。
本発明のさらなる目的は、上記の式Ｉの新規なスルホニルアミノ酸誘導体の調製法である。
【００６８】
本発明のスルホニルアミノ酸誘導体は、容易に入手できる出発物質から、以下の一般的方法と操作を使用して調製することができる。典型的なまたは好適な実験条件（すなわち、反応温度、時間、試薬のモル数、溶媒など）が与えられるが、特に明記しない場合は他の実験条件も使用できることを理解されたい。最適な反応条件は、使用される特定の反応物または溶媒で変化するが、そのような条件は、当業者がルーチンの最適化法により決定することができる。
【００６９】
好適な合成法において式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体は、まず式IIのアミン：
【化１２】
（ここで、Ａｒ2とＲ1は上記で定義したものである）を、式IIIのアシル塩化物：
【化１３】
（ここで、Ａｒ1は上記で定義したものである）と結合させて、こうして式IVのアミド：
【化１４】
を得ることにより調製される。
式IIのアミンは、公知の化合物であるか、または公知の化合物から従来法を使用して調製することができる。出発物質として好適なアミンには、チエ−２−ニル−メチルアミン、フラ−２−ニル−メチルアミン、ピリ−２−ジルメチルアミンなどがある。
【００７０】
式IIIのアシル塩化物はまた、市販されているかまたは既に記載されている化合物である。好適なアシル塩化物には、塩化４−クロロベンゾイル、塩化４−フルオロベンゾイル、塩化４−トリフルオロメチルベンゾイルなどがある。公知ではなくても、酸ハロゲン化物は、対応するカルボン酸を無機酸ハロゲン化物（例えば、塩化チオニル、三塩化リンまたは塩化オキザリル）と従来の条件下で反応させて調製することができる。
【００７１】
一般にこの反応は、約１〜５モル当量の無機酸ハロゲン化物または塩化オキザリルを使用して、そのまままたは不活性溶媒（例えば、四塩化炭素）中で、約０℃〜約８０℃の範囲の温度で約１〜約４８時間反応させて行われる。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのような触媒を、この反応に使用してもよい。
【００７２】
アシルハロゲン化物が結合反応で使用される時、これは典型的にはアミンIIと、適当な塩基の存在下で反応させて、反応中で生成する酸を除去する。例えば適当な塩基には、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリンなどがある。あるいは過剰のアミンIIを使用して、反応中で生成する酸を除去してもよい。
【００７３】
あるいは式IIIのカルボン酸は、結合反応で使用することができる。IIIのカルボン酸は通常、市販の試薬であるかまたは従来法により調製することができる。
【００７４】
IIIのカルボン酸（すなわち、アシル塩化物）の結合反応は、従来の結合試薬（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドのようなカルボジイミド）を含む）および他の促進剤（例えば、Ｎ，Ｎ−カルボニル−ジイミダゾールまたはＰｙＢＯＰ）を使用して行われる。この反応は、公知の添加剤（例えば、カルボン酸とアミンの結合を促進することが知られているＮ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトイラゾールなど）を使用してまたは使用しないで、行われる。
【００７５】
酸ハロゲン化物IIIまたはそのカルボン酸を使用する結合反応は、好ましくは約０℃〜約６℃の温度で約１〜約２４時間行われる。典型的には反応は、不活性な非プロトン性溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフランなど）中で、カルボン酸またはその酸ハロゲン化物に基づいて約１〜約５モル当量のアミンを使用して行われる。反応が完了すると、カルボキサミドIVが、従来法（沈降、クロマトグラフィー、ろ過、蒸留などを含む）を使用して回収される。
【００７６】
式Ｉのスルホニルアミノ酸の調製に必要な式Ｖのスルホニル塩化物は、市販されているかまたは従来のスルホン酸化法により調製される。
【化１５】
この反応での使用に好適なスルホン酸化試薬は、クロロスルホン酸である。典型的にはスルホン酸化反応は、式IVのカルボキサミドを不活性溶媒（例えば、ジクロロメタン）中の約５〜約１０モル当量のスルホン酸化試薬を用いて、約−７０℃〜約５０℃の温度で処理して行われる。好ましくはクロロスルホン酸の添加は、ー７０℃で起き、中間体のクロロスルホン酸が形成される。温度を２０℃に上げると、式Ｖの塩化スルホニルが形成される。
【００７７】
さらに好適な調製法において、特に式Ｖの塩化スルホニルの予備的合成に至る上記方法が適用できない場合は、本発明のスルホニルアミノ酸は以下の工程により調製される：
【００７８】
・式IIの化合物のアミン官能基の保護；
・芳香族基のクロロスルホニル化；
・スルホニルアミノ酸官能基の形成；
・保護基の脱保護；
・上記の生成した遊離のアミンのアシル化；
式IIのアミンは、アミン残基の適当な保護基で保護されて、式VIの中間体化合物を与え、ここでＰは、当業者が使用する任意の保護基を意味する。
【化１６】
アミン官能基の無数の保護基Ｐならびにその導入と除去は、T.W. GreeneとG.M. Wuts, "Protective groups in Organic Synthesis"、第３版、Wiley, New York、1999および文献はそこに引用されている文献に記載されている。安定であって、金属遷移複合体（例えば、パラジウム複合体、例えばアリルカルバメート（Alloc）またはＮ，Ｎ’−ビスアリル基）を使用して除去される酸および塩基である保護基が好ましい。さらに好適な保護基は、広範囲の実験条件下で安定なマレイミド基である。
【００７９】
該基の導入は、対応するビスアリルカーボネート無水物または臭化アリルまたは無水マレイン酸を、塩基（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリンなど）の存在下で、非プロトン性溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフランなど）中で、約０℃〜約８０℃の範囲の温度で、反応させて行われる。
【００８０】
次に式VIの化合物は、従来の非常に穏やかなスルホン酸化法を使用してスルホン酸化され、式VIIの塩化スルホニルが得られる。
【化１７】
典型的には保護されたアミンVIは、ｎ−ブチルリチウムまたはｔｅｒｔ−ブチルリチウムのような塩基と、不活性雰囲気中で、極性非プロトン性溶媒（例えば、テトラヒドロフラン、エーテル、またはジオキサン）中で、−７０℃〜０℃の範囲の温度で１５分〜４時間処理される。こうして生成した陰イオンは、次にＳＯ2Ｃｌ2、さらに好ましくはＳＯ2を用いて、ガスを反応混合物中に、−７０℃〜２０℃の範囲の温度で５分〜１時間処理される。得られたスルホン酸塩は、Ｎ−クロロスクシニミドと０℃〜７０℃の範囲の温度で接触させることにより、「in situ」で式VIIの塩化スルホニルに変換される。
【００８１】
式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体は、下記の反応工程図１または２を使用して、対応する上記塩化スルホニルＶまたはVIIから得ることができる。
【化１８】
式VIIIの保護されたアミノ酸誘導体は、市販されているかまたは公知の方法により当業者が調製することができる。
【００８２】
アミノ酸誘導体のカルボン酸官能基の無数の保護基ならびにその導入と除去は、T. W. GreeneとG.M. Wuts, Protecting groups in Organic Synthesis、第３版、Wiley、ニューヨーク、1998、およびそこに引用された文献に詳細に記載されている。アルキルエステルおよび特にｔｅｒｔ−ブチルエステルのような酸性条件を使用して、除去することができる保護基が好ましい。
【００８３】
次に式ＶまたはVIIのスルホニル誘導体のアルキル化は、これらを式VIIIの保護されたアミノ酸誘導体と、反応中に生成する酸を除去する適当な塩基の存在下で反応させることにより容易に行われる。適当な塩基には、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリンなどがある。反応は好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、エタノール、アセトニトリルのような溶媒中で、約０℃〜約１００℃の温度で行われる。
【００８４】
脱保護後に生成した中間体化合物IXまたはＸのカルボン酸官能基と、Ｒ5Ｒ4ＮＨ型のアミン（市販されているかまたは公知の調製物）との結合反応は、アミド調製の公知の方法に従って、上記の好適な条件下で、一般式Ｉの化合物を得ることにより行われる。
【００８５】
式Ｘの誘導体の使用によりスルホニルアミノ酸が得られ、これは、脱保護されアシル化されて、反応工程図２に従って式Ｉの化合物を提供する必要がある。
【００８６】
本発明の一部として考慮すべき別の調製法は、上記反応工程図３に記載されている。
【化１９】
式XIの保護されたアミノ酸誘導体は、市販されているかまたは公知の方法により当業者が調製することができる化合物である。
【００８７】
アミノ酸誘導体のアミノ官能基の無数の保護基ならびにその導入と除去は、T. W. GreeneとG.M. Wuts, Protecting groups in Organic Synthesis、第３版、Wiley、ニューヨーク、1998、およびそこに引用された文献に詳細に記載されている。塩基性または酸性条件を使用して除去することができる保護基（例えば、それぞれＦｍｏｃとＢｏｃ基）が好ましい。
【００８８】
化合物XIのカルボン酸官能基と、Ｒ5Ｒ4ＮＨ型のアミン（市販されているかまたは公知の調製物）との結合反応は、アミド調製の公知の方法に従って、上記の好適な条件下で行われる。
【００８９】
次に式Ｖのスルホニル誘導体のアルキル化は、これらを式XIIの適当な脱保護されたアミノ酸誘導体と、反応中に生成する酸を除去する適当な塩基の存在下で反応させることにより容易に行われる。適当な塩基には、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリンなどがある。反応は好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、エタノール、アセトニトリルのような溶媒中で、約０℃〜約１００℃の温度で行われる。
【００９０】
式Ｉの化合物を得るのに上記の一般的合成法が適用できないなら、当業者に公知の適当な調製法が使用される。例えば、Ａｒ2がフェニルである時、市販のシアノフェニル塩化スルホニルから出発して、当業者に公知の従来法を適用して、式Ｉのスルホンアミド誘導体を得ることができる。
【００９１】
本発明のさらなる面は、ＪＮＫ経路の調節のための式Ｉの化合物の使用、ＪＮＫ経路の調節のために医薬組成物の調製のための該化合物の使用、ならびに式Ｉの活性化合物を含有する製剤に関する。ＪＮＫ経路の該調節は、種々の疾患の治療のための適切なアプローチと考えられる。薬剤として使用される時、本発明のスルホニルアミノ酸誘導体は、典型的には医薬組成物の形で投与される。従って、式Ｉの化合物、薬剤学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物はまた、本発明の範囲内である。当業者は、医薬組成物を製剤化するのに適した種々のそのような担体、希釈剤または賦形剤化合物を理解しているであろう。また本発明は、医薬として使用される化合物を提供する。特に本発明は、哺乳動物、特にヒトの免疫系ならびに神経系の疾患を治療するための、単独のまたは他の医薬と組合せた、ＪＮＫインヒビター、特にＪＮＫ１および／またはＪＮＫ２および／またはＪＮＫ３として使用される式Ｉの化合物を提供する。
【００９２】
本発明の化合物は、従来から使用されているアジュバント、担体、希釈剤または賦形剤とともに、医薬組成物の形で、かつその単位服用量で入れられ、そのような形で、例えば錠剤、充填カプセル剤のような固形剤、溶解剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤のような液剤、またはこれらを充填したカプセル剤（すべて経口投与用）、または非経口投与（皮下使用を含む）のための無菌注射剤の形で使用される。そのような医薬組成物およびその単位投与型は、追加の活性化合物または成分有りまたは無しで、従来の比率で成分を含有してもよく、そのような単位投与型は、使用される目的の１日投与量範囲に対応する活性成分の適当な有効量を含有してもよい。
【００９３】
医薬として使用される時、本発明のスルホニルアミノ酸誘導体は、典型的には医薬組成物の形で投与される。そのような組成物は、医薬品分野で公知の方法で調製され、少なくとも１つの活性化合物を含有してもよい。一般に本発明の化合物は、薬剤学的にまたは薬理学的に有効な量で投与される。実際に投与される化合物の量は、典型的には、関連した状況（治療すべき症状、選択された投与経路、投与される実際の化合物、個々の患者の年齢、体重、および応答、患者の症状の重症度などを含む）を考慮して、医師が決定する。
【００９４】
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、および経鼻経路を含む種々の経路により投与することができる。目的とする送達経路に依存して、化合物は好ましくは、注射剤または経口投与組成物として調製される。経口投与用の組成物は、バルクの液体溶解剤または懸濁剤、またはバルクの散剤の形でもよい。しかしより一般的には、この組成物は、正確な投与を促進するために、単位投与型で提供される。「単位投与型」という用語は、各単位が、適当な薬剤の賦形剤と一緒に所望の治療効果を生み出すと計算される活性物質のあらかじめ決められた量を含有する、ヒト被験体および他の哺乳動物の単位服用量として適した物理的に分かれた単位を意味する。典型的な単位投与型は、あらかじめ充填された、あらかじめ測定されたアンプルまたはシリンジの液体組成物または丸剤、錠剤、カプセル剤などを、固体組成物の場合を含む。そのような組成物において、式Ｉのスルホニルアミノ酸化合物は、通常あまり主要ではない成分（約０．１〜約５０重量％の、好ましくは約１〜約４０重量％）であり、残りは、、所望の投与型を形成するのに有用な種々のビヒクルまたは担体および処理補助物である。
【００９５】
経口投与に適した液体型には、緩衝剤、懸濁剤および調剤物質、着色剤、香味剤など有する適当な水性または非水性ビヒクルがある。固体型には、例えば以下の任意の成分、または類似の性質を有する化合物；微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、またはトウモロコシデンプンのような崩壊剤；コロイド性二酸化ケイ素のような直打用滑沢剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ風味のような香味剤がある。
【００９６】
注射用組成物は、典型的には注射用無菌食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水または当該分野で公知の他の注射用担体に基づく。上記したように、そのような組成物中の式Ｉのスルホニルアミノ酸化合物は、典型的には非主要成分であり、しばしば０．０５％〜１０重量％の範囲で残りは注射用担体などである。
【００９７】
経口投与または注射用組成物のための上記組成物は、代表的なものを例示するのみである。さらなる物質ならびに処理法などは、レミントンの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）、第１７版、１９８５年、マックパブリシングカンパニー（Mack Publishing Company）、イーストン（Easton）、ペンシルバニア州（これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００９８】
本発明の化合物はまた、除放性製剤または除放性ドラッグデリバリーシステムで投与することができる。代表的な除放性物質の説明はまた、レミントンの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）にも記載されている。
【００９９】
以下では、いくつかの例を用いて本発明を説明するが、これらは決して本発明の範囲を限定するものではない。
【０１００】
実施例
実施例１：４−クロロ−Ｎ−（｛５−［（｛２−［（２−｛［３−クロロ−５− （トリフルオロメチル）ピリジ−２−ニル］アミノ｝エチル）アミノ］−２−オキソエチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル）ベンズアミド １４−クロロ−Ｎ−チオフェ−２−ニルメチル−ベンズアミド １ａ
５０mlの無水ＣＨ2Ｃｌ2中の塩化４−クロロベンゾイルの溶液（０．１１４mol）を、３０分かけて、０℃のＣＨ2Ｃｌ2（２００ml）中の２−アミノメチル−チオフェン（０．１３７mol）とiＰＲ2ＮＥｔ（０．２５mol）の攪拌溶液に加える。白色の固体が生成し、反応物を１時間かけて室温まで暖める。混合物を２００mlのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、ＨＣｌ水溶液（０．１Ｎ）で２回洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥する。溶媒を留去すると、２８ｇ（９８％）の標題のベンズアミドが白色の固体として得られる：mp 153-54℃、1H NMR (CDCl3) δ7.9 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.58 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.44 (dd, J=3.77, 1.13 Hz, 1H), 7.22 (d, J=5.27 Hz, 1H), 7.16 (dd, J=3.39, 5.27 Hz, 1H), 6.62 (br d, 1H), 4.98 (d, J=5.65 Hz, 2H)。
【０１０１】
５−（｛［１−（４−クロロ−フェニル）−メタノイル］−アミノ｝−メチル）−チオフェン−２−スルホニルクロリド １ｂ
ＣＨ2Ｃｌ2（８０ml）中のクロロスルホン酸（２０．１ml、１９８mmol）を、−８０℃のＣＨ2Ｃｌ2（５００ml）中の１ａの溶液（１０ｇ、４０mmol）に滴下して加える。混合物を５時間で室温まで戻す。反応混合物を氷上に注ぎ、ＣＨ2Ｃｌ2で急速に抽出する。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、溶媒を蒸発乾固して、８．８ｇ（６３％）の所望の塩化スルホニル１ｂを得る；mp 133-35℃, 1H NMR (DMSO)δ 9.21 (t, J=6.4 Hz, 1H), 7.87 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.53 (d, J=8.67 Hz, 2H), 6.91 (d, J=3.39 Hz, 1H), 6.77 (d, J=3.39 Hz, 1H), 4.53 (d, J=3.77 Hz, 2H)。
【０１０２】
［５−（｛［１−（４−クロロ−フェニル）−メタノイル］−アミノ｝−メチル）−チオフェン−２−スルホニルアミノ］−酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル １ｃ
Ｈ−Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ．ＨＣｌ（２６３mg、１．５７mmol）を、２０mlのＣＨ2Ｃｌ2に溶解する。ｉ−ＰＲ2ＮＥｔを塩基として使用してｐＨを９に調整する（５３７μｌ、３．１４mmol）。この溶液に、１０mlのＤＭＦ中の１ｂ（５００mg、１．４３ｌmmol）を滴下して加える。反応物を一晩攪拌する。３０mlのＣＨ2Ｃｌ2を加え、有機相をＨＣ（０．１Ｎ）と飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄する。ＭｇＳＯ4上で乾燥し、溶媒を蒸発乾固して１ｃ（４００mg、６３％）を白色の固体として得る。mp ℃、1H NMR (d6-DMSO) δ9.34 (t, J=6.40 Hz, 1H), 8.25 (t, J=6.40 Hz, 1H), 7.89 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.56 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.41 (d, J=3.77 Hz, 1H), 7.05 (d, J=3.77 Hz, 1H), 4.62 (d, J=6.40 Hz, 2H), 3.59 (d, J=6.40 Hz, 2H), 1.3 (s, 9H)。
【０１０３】
［５−（｛［１−（４−クロロ−フェニル）−メタノイル］−アミノ｝−メチル）−チオフェン−２−スルホニルアミノ］−酢酸 １ｄ
０℃のＣＨ2Ｃｌ2（１０ml）中の１ｃの溶液（４００mg、０．９mmol）に、ＴＦＡ（１０ml）を加え、反応物を０℃で一晩攪拌し、室温でさらに１時間攪拌する。溶媒を蒸発乾固して１ｄ（３００mg、８６％）を白色の固体として得る。1H NMR (d6-DMSO) δ9.34 (t, J=5.65 Hz, 1H), 8.20 (t, J=6.03 Hz, 1H), 7.89 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.56 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.43 (d, J=3.77 Hz, 1H), 7.05 (d, J=3.77 Hz, 1H), 4.63 (d, J=5.65 Hz, 2H), 3.59 (d, J=6.03 Hz, 2H)。
【０１０４】
４−クロロ−Ｎ−（｛５−［（｛２−［（２−｛［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）ピリジ−２−ニル］アミノ｝エチル）アミノ］−２−オキソエチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル）ベンズアミド １
ＣＨ2Ｃｌ2／ＤＭＦ ２：１（８ml）中の１ｄ（５０mg、０．１３mmol）の攪拌溶液に、ｉ−ＰＲ2ＮＥｔを加えてｐＨを７．５に調整する。ＤＩＣ（１８mg、０．１４mmol）とＨＯＢｔ（１９mg、０．１４mmol）を加え、溶液を室温で３０分攪拌する。この溶液に、ＣＨ2Ｃｌ2（３ml）中の１−（１−（３−クロロ−５−トリフルオロメチル）ピリジン−エチレンジアミン（３４mg、０．１４mmol）を加える。反応混合物を４．５時間攪拌する。４０mlのＣＨ2Ｃｌ2を加え、有機相を、ＨＣｌ（０．１Ｎ）、飽和ＮａＨＣＯ3、飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥する。粗生成物をシリカゲルのクロマトグラフィーで溶出液としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン ８：２を使用して、１７mg（２１％）の１を得る。1H NMR (d6-DMSO) δ9.34 (t, J=6.03 Hz, 1H), 8.32 (brd, 1H), 8.04-8.14 (m, 2H), 7.95 (d, J=2.26 Hz, 1H), 7.88 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.54 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.43 (d, J=3.77 Hz, 1H), 7.28 (d, J=5.65 Hz, 1H), 7.06 (d, J=3.77 Hz, 1H), 4.63 (d, J=6.03 Hz, 2H), 3.36-3.48 (m, 4H) 。
【０１０５】
実施例２：４−クロロ−Ｎ−［（５−｛［（２−｛［２−（｛５−ニトロピリジ−２−ニル｝アミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソエチル）アミノ］スルホニル｝チエ−２−ニル）メチル］ベンズアミドアミド ２
ジアリル−チオフェ−２−ニルメチルアミン ２ａ
臭化アリル（５５ml、６５．４mmol）を、ＣＨ2Ｃｌ2（２７０ml）中の２−アミノメチル−チオフェン（２４ml、２３．３mmol）とｉ−Ｐｒ2ＮＥｔ（１２０ml、７０．１mmol）の溶液に加える。穏やかに発熱性の反応物は、１時間後に自然に還流温度に達する。この反応物を、氷浴を用いて冷却して、室温で１４時間撹拌すると、望ましくない沈殿物が出現する。この沈殿物（４５ｇ）をろ過して除去する。有機層から溶媒を留去して、ＥｔＯＡｃで希釈すると、さらに沈殿物が出現（４５ｇ）するため、これをろ過により除去する。ＥｔＯＡｃ溶液をＳｉＯ2でろ過して、濃縮することにより、３６．１ｇ（８０％）の標題のジアリルアミンが淡黄色の油状物として得られる：1H NMR (CDCl3) δ7.25 (br.d, J=5.9 Hz, 1H), 6.98 (br.dd, J=5.1, 2.8 Hz, 1H), 6.94-6.92 (m, 1H), 5.99-5.86 (m, 2H), 5.29-5.18 (m, 4H), 3.85 (s, 2H), 3.16 (dd, J=6.3, 0.9 Hz, 4H)。
【０１０６】
５−ジアリルアミノメチル−チオフェン−２−スルホニルクロリド ２ｂ
Ｅｔ2Ｏ中のアリル保護チオフェン４ａ（６．２ｇ、３２．１mmol）の溶液を、アセトン／ドライアイス浴を用いて−７０℃に冷却する。ペンタン中のｔ−ＢｕＬｉの溶液（２１．３８ml、１．５Ｍ、３２．１mmol）を２分かけて加えると、内部温度は一瞬で−５０℃に上昇して、混合物は橙色に変わる。１０分後、ＳＯ2を２分間バブリングすると、粘性の沈殿物が直ちに形成される。反応物が０℃に達するのを待ち、ＴＨＦ（２０ml）中のＮＣＳ（４．６３ｇ、３２．１mmol）の懸濁液を加えると、スラリーは紫色に変わる。室温で４５分後、混合物を、ＥｔＯＡｃで溶出しながらＳｉＯ2でろ過する。溶媒の留去、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：５）での希釈及びＳｉＯ2によるろ過によって、５．０ｇ（５３％）の標題の塩化スルホニルが淡褐色の油状物として得られるが、これをさらに精製することなく使用する。
【０１０７】
２−（５−ジアリルアミノメチル−チオフェン−２−スルホニルアミノ）−［２−（５−ニトロ−ピリジ−２−ニルアミノ）−エチル］−アセトアミド ２ｃ
２ｃの調製は、前記したとおり最初にグリシンｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩を２ｂに加え、次に生じる脱保護中間体をＮ−（５−ニトロ−ピリジ−２−ニル）−１，２−エチレンジアミンと結合することにより実施される。
【０１０８】
２−（５−アミノメチル−チオフェン−２−スルホニルアミノ）−［２−（５−ニトロ−ピリジ−２−ニルアミノ）−エチル］−アセトアミド ２ｄ
ＣＨ2Ｃｌ2中のビスアリルアミン２ｃ（７．２５mmol）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルバルビツール酸（ＮＤＭＢＡ、２．８ｇ、１８．１mmol）、及びＰｄ（ＰＰｈ3）4（１４８．８mg、０．１３mmol）の溶液を、１０分間アルゴンをバブリングすることにより脱気する。反応物を室温で３時間撹拌すると、所望のアミン２ｄがそのＮＤＭＢＡ塩として沈殿する。この混合物をＥｔＯＡｃ（２００ml）とヘキサン（２００ml）で希釈して、水（３×５０ml）で洗浄する。粗化合物２ｄは、さらに精製することなく次の工程において使用するのに十分に純粋である。
【０１０９】
４−クロロ−Ｎ−［（５−｛［（２−｛［２−（｛５−ニトロピリジ−２−ニル｝アミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソエチル）アミノ］スルホニル｝チエ−２−ニル）メチル］ベンズアミド ２
ピリジン：ＣＨ2Ｃｌ2（１：４）中の２−アミノメチル−チオフェン２ｄの２０mg/ml溶液を−４０℃に冷却して、０．８当量の４−クロロフェニルスルホニルクロリドで１時間処理する。反応混合物を３０分かけて室温にする。溶媒の留去、ＣＨ3ＣＮで希釈、ＳｉＯ2パッドでろ過、及び溶媒の留去によって、所望のアミド２が得られる。MS m/z APCI: 636 (M+1), 634 (M-1)。ＨＰＬＣ分析：Ｒｔ＝１５．５１分（方法ｃ、以下を参照のこと）。
【０１１０】
上記実施例１〜２に記載される手順、及び適切な出発物質と試薬を用いることにより、下記の追加の式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体を得ることができた：
下記の表は、記載される実施例のＨＰＬＣデータ及び質量分析データを提供する1,2。
1 ＨＰＬＣ条件：Ｃ８対称性ａ−ＭｅＣＮ、０．０９％ ＴＦＡ、０〜１００％（１０分）
ＨＰＬＣ条件：Ｃ１８ ｂ−ＭｅＣＮ、０．０９％ ＴＦＡ、０〜１００％（２０分）、ｃ−ＭｅＣＮ、０．０９％ ＴＦＡ、０〜１００％（３０分）。
2 質量スペクトルＡＰＣＩ
【０１１１】
【表１】
実施例７：薬剤調製物の調製
以下の処方例は、本発明の代表的薬剤組成物を例示するものであり、これらに限定されるものではない。
【０１１２】
調製物１−錠剤
式Ｉのスルホニルアミノ酸化合物を乾燥粉末として、乾燥ゼラチン結合剤と約１：２の重量比で混合する。少量のステアリン酸マグネシウムを滑沢剤として加える。この混合物を、打錠機で２４０〜２７０mg錠（１錠当たり８０〜９０mgの活性スルホニルアミノ酸化合物）に形成する。
【０１１３】
調製物２−カプセル剤
式Ｉのスルホニルアミノ酸化合物を乾燥粉末として、デンプン希釈剤と約１：１の重量比で混合する。この混合物を２５０mgカプセルに充填する（１カプセル当たり２５mgの活性スルホニルアミノ酸化合物）。
【０１１４】
調製物３−液剤
式Ｉのスルホニルアミノ酸化合物（１２５０mg）、ショ糖（１．７５ｇ）及びキサンタンガム（４mg）を混和し、１０番メッシュＵ．Ｓ．篩を通し、次に水中の微結晶性セルロースとナトリウムカルボキシメチルセルロース（１１：８９、５０mg）の前もって調製した溶液と混合する。安息香酸ナトリウム（１０mg）、香味剤、及び着色料を水で希釈して、撹拌しながら加える。次いで十分な水を加えることによって、５mLの総容量を生成させる。
【０１１５】
調製物４−錠剤
式Ｉのスルホニルアミノ酸化合物を乾燥粉末として乾燥ゼラチン結合剤と約１：２の重量比で混合する。少量のステアリン酸マグネシウムを滑沢剤として加える。この混合物を、打錠機で４５０〜９００mg錠（１５０〜３００mgの活性スルホンアミド化合物）に形成する。
【０１１６】
調製物５−注射剤
式Ｉのスルホニルアミノ酸化合物を緩衝化滅菌食塩水の注射用水性媒体に溶解して、約５mg/mlの濃度とする。
【０１１７】
実施例８：生物学的測定法
ＪＮＫ２及び３インビトロ測定法：ＪＮＫ２及び／または３測定法は、９６ウェルＭＴＴプレートで、０．５μgの組換えのプレ活性化ＧＳＴ−ＪＮＫ３またはＧＳＴ−ＪＮＫ２を１μgの組換えのビオチン化ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ及び２μM 33γ−ＡＴＰ（２nCi/μl）と共に、スルホニルアミノ酸インヒビターの存在下または非存在下で、かつ５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１０mM ＭｇＣｌ2；１mMジチオトレイトール、及び１００μM ＮａＶＯ4を含む５０μlの反応体積でインキュベートすることにより実施する。インキュベーションは、室温で１２０分間行い、リン酸生理食塩水緩衝液中に２５０μgのストレプトアビジン被覆ＳＰＡビーズ（アマーシャム社（Amersham, Inc.））*、５mM ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ−１００及び５０μM ＡＴＰを含む２００μlの溶液の添加により停止させる。室温で６０分間インキュベーション後、１５００×ｇで５分間遠心分離してビーズを沈降させ、５mM ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ−１００及び５０μM ＡＴＰを含む２００μlのＰＢＳに再懸濁して、前記のようにビーズの沈降後、シンチレーションβカウンターで放射活性を測定する。ビオチン化ＧＳＴ−1ＡＴＦ2またはミエリン塩基性タンパク質の代わりにＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎを使用することにより、それぞれプレ活性化ｐ３８とＥＲＫ ＭＡＰキナーゼの阻害を測定するためにこの測定法を使用することができる。
【０１１８】
生物試験結果
式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体の活性を、前記の生物学的測定法を用いて評価した。代表値を、下記表に示す：
【０１１９】
【表２】
ＪＮＫ２及び３、ｐ３８並びにＥＲＫ２のそれぞれに示される値は、ＩＣ50（μM）、即ち、該標的（例えばＪＮＫ２）の５０％阻害を達成するのに必要な量を意味する。ＡＳ番号は、上記実施例において番号で記述されたその例示試験化合物を意味する。上記表から、式Ｉの該試験化合物は、ＪＮＫ２及び３の両方に顕著な作用を及ぼすが、ｐ３８及びＥＲＫ２には事実上作用を及ぼさず、従って極めて選択的な阻害作用を発揮するということがわかった。
【０１２０】
交感神経ニューロン培養及び生存活性測定法：新生ラット（ｐ４）の上頚神頚節（ＳＣＧ）からの交感神経ニューロンをディスパーゼ中で分離し、１０4細胞/cm2の密度でラット尾コラーゲンをコーティングした４８ウェルＭＴＴプレートに塗布して、５％ラット血清、０．７５μg/ml ＮＧＦ ７Ｓ（ベーリンガーマンハイム社（Boehringer Mannheim Corp.）、インディアナポリス、インディアナ州）及びアラビノシン１０5 Ｍを含むレーボヴィッツ（Leibowitz）培地で培養する。細胞死は、塗布後４日目に、培養液を抗ＮＧＦ抗体（ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、インディアナ州）を含みＮＧＦやアラビノシンを含まない培地に、スルホニルアミノ酸インヒビターの存在下または非存在下で曝露することにより誘導する。細胞死誘導の２４時間後、細胞生存活性の測定を、０．５mg/mlの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）中で３７℃で１時間の培養液をインキュベートして実施する。ＭＴＴ中でのインキュベーション後、細胞をＤＭＳＯに再懸濁し、９６ＭＴＴプレートに移して、細胞生存活性を、５９０nmの光学密度を測定することにより評価する。
【０１２１】
種々の試験化合物によるこの測定法の結果を、式Ｉの化合物が細胞死からニューロンを救っている（１０〜８０の間の生存ニューロン％）ことを証明する。
【０１２２】
ＩＬ−２放出測定法：
ジャーカット（Jurkat）細胞、ヒトＴ細胞白血病細胞株（アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）ＴＩＢ １５２号）を、１０％の熱活性化ＦＣＳ、グルタミン及びペンストレップ（Penstrep）を補足したＲＰＭＩ １６４０培地（ギブコ社（Gibco, BRL））で培養した。培地中の細胞懸濁液を希釈して２×１０6細胞/mLにする。細胞を、異なる濃度の試験化合物（化合物の最終濃度：１０、３、１、０．３、０．１μM）を含む９６ウェルプレートに塗布（２×１０5細胞／ウェル）した。この混合物を加湿ＣＯ2雰囲気で３７℃で３０分間インキュベートする。次に細胞を、陰性対照を除く全てのウェルにおいて１０ul ＰＭＡ＋イオノマイシン（Ionomycine）（０．１μM及び１μM最終濃度）で処理した。化合物を含まないウェルには、１０μlのＲＰＭＩ ２％ＤＭＳＯ（＝０．１％最終）を加える。細胞は、３７℃で２４時間インキュベートし、次に上清を回収（同日に使用しない場合は−２０℃で凍結）し、次いで上清についてＩＬ−２のＥＬＩＳＡ試験を実施する。
【０１２３】
ＩＬ−２ ＥＬＩＳＡ測定法：
試験化合物の存在下または非存在下で、ＰＭＡ＋イオノ−刺激ジャーカット細胞による培地へのＩＬ−２放出を、ＥＬＩＳＡにより測定する。後述の手順による
【０１２４】
溶液。
洗浄緩衝液：ＰＢＳ−ツイーン０．０５％
希釈液：ＰＢＳ−ツイーン０．０５％
基質液：クエン酸０．１Ｍ／Ｎａ2ＨＰＯ4 ０．１Ｍ
停止液：Ｈ2ＳＯ4 ２０％
マッチした抗体対／標準：
アールアンドディーシステムズ（R&D Systems）製
モノクローナル抗ヒトＩＬ−２抗体（ＭＡＢ６０２）（捕捉）
ビオチン化抗ヒトＩＬ−２抗体（ＢＡＦ２０２）（検出）
組換えヒトＩＬ−２（２０２−ＩＬ−０１０）（標準）
プレート調製
ＰＢＳに５μg/mLで希釈した１００μl捕捉抗体を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに移して、室温で一晩インキュベートする。
【０１２５】
各ウェルを吸引して、洗浄緩衝液で３回洗浄する。最後の洗浄後、プレートを湿らせる。
【０１２６】
１．２００μl ＰＢＳ−１０％ ＦＣＳで飽和させる。室温で１時間インキュベートする。
２．洗浄工程２を繰り返す。
【０１２７】
測定手順
１．１００μlの試料または標準（２０００、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５pg/mL）を加え、室温で２時間インキュベートする。
２．３回洗浄する。
３．１００μlのビオチン化抗ヒトＩＬ−２を１２．５ng/mLで加える。室温で２時間インキュベートする。
４．３回洗浄する。
５．１００μlストレプトアビジン−ＨＲＰ（ザイメド（Zymed）４３−４３２３番）を１：１０，０００で加える。室温で３０分インキュベートする。
６．３回洗浄する。
７．１００μlの基質液（クエン酸／Ｎａ2ＨＰＯ4（１：１）＋Ｈ2Ｏ2（１：２０００）＋ＯＰＤ）を加える。室温で２０〜３０分インキュベートする。
８．５０μlの停止液を各ウェルに加える。
９．５７０nmで補正して４５０nmに設定したマイクロタイタープレートリーダーを使用して、光学密度を測定する。
【０１２８】
この測定法の結果は、種々の試験化合物が、３０％＠３uMを超えるＩＬ−２の産生を低下させることを証明している。
【０１２９】
ｃ−Ｊｕｎレポーター測定法
細胞培養
Ｈｌｒ ｃ−Ｊｕｎ ＨｅＬａ細胞を、１０％ ＦＣＳ（シグマ（Sigma））、２mMグルタミン（ギブコ（Gibco））、Ｐ／Ｓ、ハイグロマイシンｂ １００μg/mL及びＧ４１８ ２５０μg/mLを補足したＤＭＥＭ高Ｇｌｃ中で培養する。
【０１３０】
細胞培養液調製
細胞バンク
細胞は、１０％ジメチルスルホキシドを含む培地中の１．８mL容量の細胞懸濁液として、液体窒素下でクリオチューブ（cryotubes）中で凍結保存する。
【０１３１】
細胞は、２０以下の継代数で培養液中に保持する。
細胞培養液解凍
必要なとき、細胞の凍結バイアルを、半完全解凍まで穏やかに渦流を起こすことによって、水浴中で３７℃で迅速に解凍する。次に細胞懸濁液を、１０mLの培地に加える。
【０１３２】
次に細胞懸濁液を、１２００rpmで５分間遠心分離して、上清を除去し、細胞ペレットを培地中で再構成して、２５mL培地を含む１７５cm2フラスコに加える。このフラスコを５％ ＣＯ2の雰囲気中３７℃でインキュベートする。
【０１３３】
細胞継代
細胞は、８０％コンフルエントな単層が得られるまで、連続して継代培養（継代）する。
【０１３４】
各フラスコの培地を除去して、単層を１０〜１５mLのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。
【０１３５】
トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を細胞単層に加え、３７℃でインキュベートして、時々細胞を移動させるために軽くたたく。細胞単層の完全な剥離及び分離は、顕微鏡観察して確認する。次に細胞を１０mLの完全培地に再懸濁して、１２００rpmで５分間遠心分離する。
【０１３６】
上清を廃棄し、細胞を培地に再懸濁して、１７５cm2フラスコ中で１／５希釈する。
【０１３７】
０日目の朝
トランスフェクションのために細胞を調製する
コンフルエントに近い培養液のフラスコからの細胞を、前記のようにトリプシンでの処理により剥離及び分離する。
【０１３８】
細胞を培地に再懸濁して数える。
細胞懸濁液を培地で希釈して、約３．５×１０6細胞/mLにして、１mLμlの細胞懸濁液を９mLの培地を含む２枚の１０cm培養皿に載せる。
【０１３９】
プレートを３７℃で空気中５％ ＣＯ2の加湿雰囲気でインキュベートする。
０日目の夕方
トランスフェクション
対照：０．２μg ｐＴＫウミシイタケ（Renilla）、５．８μg ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ、５００μlオプチメム（OPTIMEM）（ギブコ（GIBCO））、１８μlヒュージーン（Fugene）６
【０１４０】
誘導：０．１μg ｐＭＥＫＫ１、０．２μg ｐＴＫウミシイタケ、５．７μg ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ、５００μlオプチメム（ギブコ）、１８μlヒュージーン６ ３０’ＲＴ
【０１４１】
トランスフェクション混合物を培養細胞に加える。プレートを空気中５％ ＣＯ2の加湿雰囲気で３７℃で一晩インキュベートする。
【０１４２】
１日目
１ウェル当たり１００μlの培地を含む９６ウェルプレートを調製する。
陰性対照（ビヒクル）：２μlのＤＭＳＯを１００μlに加える（三重測定）。
化合物：２μlのヒット（Hit）化合物ストック希釈液を１００μlに加える（三重測定）。
【０１４３】
トランスフェクションした細胞をトリプシン処理して、１２mLの培地に再懸濁する。
【０１４４】
１００μlの希釈液を９６ウェルプレートのそれぞれに加える。
プレートを、空気中５％ ＣＯ2の加湿雰囲気で３７℃で一晩インキュベートする。
【０１４５】
ヒット化合物希釈
ヒット化合物ストック濃度は以下である：
１００％ ＤＭＳＯ中に３、１及び０．１mM。
２日目
試験手順
デュアル−ルシフェラーゼ（Dual-Luciferase）（商標）レポーター測定系（プロメガ（Promega））
【０１４６】
培地をプレートから除去して、細胞を１００μl ＰＢＳで２回洗浄する。
濯ぎ液を完全に除去してから、ＰＬＢ試薬を適用する。各培養ウェルに５μlの１×ＰＬＢを分配する。培養プレートを、穏やかに揺動／振盪する揺動プラットホームまたは軌道振盪装置に配置することによって、１×ＰＬＢが細胞単層に完全かつ一様に行きわたるのを確実にする。培養プレートを室温で１５分間揺り動かす。２０μlの溶解物を不透明白色の９６ウェルプレートに移す。照度計で読む。
【０１４７】
−５０μlのルシフェラーゼアッセイ試薬II（Luciferase Assay Reagent II）を注入し、５秒待ち、１０秒読む
【０１４８】
−５０μlのストップアンドグロ（Stop & Glo）（登録商標）試薬を注入し、５秒待ち、１０秒読む
【０１４９】
ＲＬＵルシフェラーゼ／ＲＬＵウミシイタケ*１０００をチェックする。
この測定法の結果は、種々の試験化合物が、ＪＮＫ＠１０uMの活性を２０％を超えて阻害することを証明している。
【０１５０】
マウスにおけるＬＰＳ誘導エンドトキシンショック
ＬＰＳ抗原刺激により誘導される炎症性サイトカインのレベルを有意に減少させる式Ｉに記述されるＪＮＫインヒビターの能力を、以下のプロトコールを用いて評価した：
【０１５１】
ＬＰＳ（Ｓ型アボルツス（S. abortus）−ガラノスラボ（Galanos Lab.）−）をオスのＣ５７ＢＬ／６に注射（２００μg/kg、静脈内）することにより、エンドトキシンショックを誘導し、ＬＰＳ抗原刺激の１５分前に化合物（０．１、１、１０mg/kg）またはＮａＣｌ（２００uM）を静脈内注射（１０mL/kg）した。ＬＰＳ抗原刺激後の異なる時点で眼窩からヘパリン化血を得て、この血液を９，０００rpmで４℃で１０分間遠心分離することにより、ＩＦＮγ（デュオセット（Duoset）アールアンドディー（R&D）参照ＤＹ４８５）のようなマウスＥＬＩＳＡキットによるサイトカイン産生の測定のための上清を回収した。
【０１５２】
試験化合物は、炎症関連サイトカインを減少させる顕著な能力を示した。
アレチネズミにおける全虚血
卒中発生における細胞死を防御する式Ｉに記述されるＪＮＫインヒビターの能力を、以下のプロトコールを用いて評価した：
【０１５３】
−１−方法
*手術
−麻酔：ハロタンまたはイソフルレン（０．５〜４％）。
−喉の剃毛及び皮膚の切開。
−総頚動脈（左及び右）を組織から取り出す。
−ブルドッグ（Bulldog）マイクロクランプを用いる５分間の動脈の閉鎖。
−手術面の消毒（ベタジン（Betadine）（登録商標））及び皮膚の縫合（オートクリップ（Autoclip）（登録商標）、マイケルズフックス（Michel's hooks））。
【０１５４】
−覚醒までの保温灯下の動物の安定化。
−動物舎内の動物の個別ケージ中の安定化。
*動物の屠殺
−虚血の７日後（断頭またはペントバルビタールの過剰投与）。
−脳の標本採取。
*組織学パラメーター
−イソペンタン中での脳の凍結（−２０℃）
−凍結ミクロトームを用いる海馬の切片作成（２０μm）。
−クレシルバイオレット及び／またはツネル（TUNEL）法による染色
−病変（海馬のＣＡ１／ＣＡ２サブフィールドにおける）の評価
−修飾したゲルハードとボウスト（Gerhard & Boast）スコア、または
−ＣＡ１／ＣＡ２における細胞計数
*生化学パラメーター
−大脳構造の顕微解剖
−測定パラメーター：ＤＮＡ断片化、乳酸塩、カルシウム浸透。
−分析法：ＥＬＩＳＡ、比色法、酵素学、放射測定法。
−２−処理
−試験品またはビヒクルの投与：再灌流の１５分後（麻酔の回復の５〜１０分後）。
【０１５５】
−標準的プロトコール
動物５０匹：１０匹ずつ５群（Ａ群：対照、Ｂ〜Ｄ群：３用量の試験品、そしてＥ群：対照化合物（ケタミン３×１２０mg/kg、腹腔内またはオロチン酸３×３００mg/kg、腹腔内）。
【０１５６】
試験化合物は、誘導された全虚血中のニューロンアポトーシスを防御する大きな能力を示した。
発明の分野
本発明は、薬剤活性のある化合物として使用するためのスルホニルアミノ酸誘導体、ならびにそのようなスルホニルアミノ酸誘導体を含有する薬剤調製物に関する。特に本発明は、ＪＮＫ（ジュン−キナーゼ（Jun-Kinase））機能または経路のそれぞれ実質的な調節活性、特に阻害活性を示すスルホニルジペプチド誘導体に関し、従って、これは自己免疫系および神経系の疾患の治療および／または予防に特に有用である。従って本発明は、新規スルホニルアミノ酸誘導体ならびにその調製法に関する。
【０００２】
発明の背景
アポトーシスは、プログラム化細胞死滅のプロセスを受けている細胞の膜や小器官の複雑なひずみである。該プロセスの間に、細胞は固有の自殺プログラムを活性化させ、整然として自身を破壊していく。以下のシリーズの事象が観察される：
・細胞表面に泡状突起が出はじめて、食作用前のシグナルを表す。次にアポトーシス細胞全体は、断片化して膜結合小胞になり、これは食作用により急速かつ正確に除去され、その結果、周りの組織への傷害は最小となる。
・次に細胞は、その近傍から分離する。
核はまた、遺伝子的自殺をしながら、特徴的な形態変化パターンを示し、クロマチンは凝縮し、特異的に切断されてＤＮＡの断片となる。
【０００３】
神経細胞の死滅は、神経系を正常に成長させるのに重要な役割を果たす。発達中のニューロンの死滅は、神経刺激する標的のサイズに依存する。少ないシナプスパートナーを有する細胞は、多数のシナプスを形成した細胞より死滅しやすい。これは、発達中の神経系のシナプス前からシナプス後ニューロンの相対数をバランスさせるプロセスを反映しているかも知れない。神経細胞死滅はアポトーシス性であると推定されたが、つい最近になって、発達中のげっ歯類の脳中のニューロンは、形態とＤＮＡ断片化により分類されるように、アポトーシスを受けることが最終的に証明された。発達中の細胞死滅は明らかに、病的プロセスではなく、細胞が実際に存在を停止することは意味がある。
【０００４】
神経の死滅は、神経外傷後または神経変性疾患中のアポトーシスまたは壊死プロセスを介して起きる。ニューロンのプログラム化細胞死滅を進めるのに重要な役割を果たす多くの成分が出現している。神経のアポトーシスへと誘導する成分には、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫｓ）のサブファミリーであるＳＡＰＫ／ＪＮＫのメンバーがある。
【０００５】
ＭＡＰＫ（***促進因子−活性化タンパク質キナーゼ）は、スレオニンとチロシン残基への二重リン酸化により活性化されるセリン／スレオニンキナーゼである。哺乳動物細胞では、細胞外刺激により生成する情報をＭＡＰＫへ伝搬する少なくとも３通りの異なるが並行した経路がある。この経路は、ＥＰＫ（細胞外制御キナーゼ）、ＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ）、およびｐ３８／ＣＳＢＰキナーゼの活性化に至るキナーゼカスケードからなる。ストレス型の分子外シグナルを中継するのにＪＮＫとｐ３８経路の両方が関与するが、ＥＰＫ経路は主に、***促進性／分化シグナルを細胞核に伝達するのに関与する。
【０００６】
ＳＡＰＫカスケードは、***促進因子−活性化タンパク質キナーゼのサブファミリーであり、これは、ＵＶ照射後のＤＮＡ傷害、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、セラミド、細胞ストレス、および反応性酸素種を含む異なる外部刺激により活性化され、明瞭な基質特異性を有する。ＭＫＫ３／ｐ３８のＭＫＫ４／ＪＮＫを介するシグナル伝達は、誘導性転写因子であるｃ−ＪｕｎとＡＴＦ２のリン酸化を引き起こし、これは次に、ホモダイマーまたはヘテロダイマーとして作用して、下流のエフェクターの転写を開始させる。
【０００７】
ｃ−Ｊｕｎは、ホモダイマーとヘテロダイマーを形成（例えば、ｃ−ＦｏＳと）して、炎症応答に関与する多くの遺伝子（例えば、マトリックス金属プロテアーゼ）の活性化に必要なトランス作用複合体ＡＰを産生するタンパク質である。ＪＮＫは、紫外線やＴＮＦ−αのようないくつかの異なる刺激が、タンパク質Ｎ末端の特異的セリン残基上のｃ−Ｊｕｎのリン酸化を刺激することが見いだされた時に、発見された。
【０００８】
Xie Xら（Structure 1998, 6(8);983-991）の最近の文献において、ストレス活性化シグナル伝達経路の活性化が、ラットのＰＣ−１２と上頚神頚節（ＳＣＧ）交感神経細胞中のＮＧＦ撤退により誘導される神経アポトーシスに必要であることが示唆されている。特異的キナーゼ（すなわち、ＭＡＰキナーゼ３（ＭＫＫ３）とＭＡＰキナーゼ４（ＭＫＫ４）、またはｃ−Ｊｕｎ（ＭＫＫ−４カスケードの一部））の阻害は、アポトーシスをブロックするのに充分かも知れない（Kumagae Yら、Brain Res Mol Brain Res, 1999, 67(1), 10-17およびYang DDら、Nature, 1997, 389(6653);865-870を参照）。ＳＣＧニューロン中のＮＧＦ枯渇の数時間以内に、ｃ−Ｊｕｎは高度にリン酸化され、タンパク質レベルが上昇する。同様にＮＧＦが枯渇したラットＰＣ−１２細胞では、ＪＮＫとｐ３８は、持続的活性化を受け、ＥＲＫは阻害される。このＪＮＫ３と一致して、ＫＯマウスは、海馬中の興奮毒性（excitotoxicity）誘導アポトーシスに耐性であり、さらに重要なことは、これらは、正常な動物と比較して、興奮毒性に応答しててんかん様発作が大幅に低下している（Nature 1997, 389, 865-870）。
【０００９】
さらに最近は、ＪＮＫシグナル伝達経路が、細胞増殖に関与し、Ｔ細胞活性化と増殖により仲介される自己免疫疾患において重要な役割を果たす可能性があることが報告されている（Immunity, 1998, 9, 575-585; Current Biology, 1999, 3, 116-125）。
【００１０】
ナイーブ（前駆体）ＣＤ４+ ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体を介して抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識する。ＴＣＴ−介在シグナル以外に、少なくともある程度ＡＰＣ上のＢ７タンパク質とともにＴ細胞上に発現されるＣＤ２８の結合により、同時刺激シグナルが提供される。これら２つのシグナルの組合せには、Ｔ細胞クローン性発現を含む。
【００１１】
４〜５日間増殖後、ＣＤ４+ Ｔ細胞の前駆体は、免疫系の機能を仲介する武装エフェクターＴｈ細胞に分化する。分化プロセス中に、遺伝子発現の多大な再プログラミングが起きる。
【００１２】
２つのサブセットのエフェクターＴｈ細胞が、その明瞭なサイトカイン分泌パターンと免疫調節作用に基づいて規定されている（Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮγとＬＴ（ＴＮＦ−β）を産生し、これは細胞性炎症性反応に必要である。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を分泌し、これはＢ細胞活性化と分化を仲介する）。これらの細胞は、免疫応答において中心的な役割を果たす。ＪＮＫ ＭＡＰキナーゼ経路は、抗原刺激によりＴｈ１中で誘導されるが、Ｔｈ２エフェクター細胞中では誘導されない。前駆ＣＤ４+ Ｔ細胞のＴｈ１（しかしＴｈ２ではない）細胞への分化は、ＪＮＫ２−欠損マウスで傷害されている。従って近年、ＪＮＫキナーゼ経路は、ＪＮＫ２を介するＴｈ１とＴｈ２免疫応答のバランスにおいて重要な役割を果たすことが認識されている。
【００１３】
ＪＮＫキナーゼ経路を阻害することを目的として、ＷＯ／９８４９１８８は、ヒトポリペプチド、すなわちＪＮＫ−相互作用タンパク質１（ＪＩＰ−１）（これは、生物学的産物であり、アポトーシス関連疾患を克服するために測定されている）の使用を教示している。
【００１４】
そのようなヒトポリペプチドは、ＪＮＫキナーゼ経路に阻害作用を有することが確認されているが、その使用に関連して種々の欠点がある：
・活性バイオペプチドまたはバイオタンパク質は、かなり包括的で高価な生合成によってのみ得られ、従ってこれはしばしば、得られる生成物をコストの高いものにする。
・このペプチドは、膜透過性が低いことが知られており、血液脳膜を通過することができないかも知れない。
・タンパク質インヒビターまたはアンタゴニストの使用の主要な欠点は、腸分解により生じる低い経口生物有用性である。従ってこれらは、非経口的に投与しなければならい、そして最後に、
・ペプチドインヒビターまたはアンタゴニストは、宿主体により、排除すべき侵入物質として認識され、従って自己免疫応答を開始する。
【００１５】
従って本発明の目的は、ペプチドまたはタンパク質の使用から生じる基本的にすべての上記欠点を避けるが、種々の疾患、特に神経系または自己免疫系関連疾患の治療に適した比較的小分子を提供することである。特に本発明の目的は、好ましくはＪＮＫ機能により仲介される疾患を治療する便利な方法として利用できるように、ＪＮＫ（Ｊｕｎキナーゼ）経路を調節、好ましくはダウンレギュレートまたは阻害することができる比較的小分子の化合物を提供することである。さらに、本発明の目的は、該小分子化合物を調製する方法を提供することである。さらに本発明の目的は、好ましくはＪＮＫ機能により仲介される疾患を治療するための新しい分類の医薬調製物を提供することである。最後の本発明の目的は、自己免疫系および／または神経系の障害により引き起こされる疾患の治療および／または予防方法を提供することである。
【００１６】
発明の説明
上記目的は、個々の請求項によって達成されている。従属請求項（これらは、参照することにより本明細書に組み込まれる）内で、好適な実施態様が記載される。
【００１７】
以下の段落は、本発明の化合物を構成する種々の化学残基の定義を提供し、特により広い範囲の定義をしない場合は、明細書全体と請求項を通して均一に適用されるものとする。
【００１８】
「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」とは、１〜６個の炭素原子を有する１価アルキル基を意味する。この用語の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシルなどの基がある。
【００１９】
「アリール」とは、単一の環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチル）を有する６〜１４個の炭素原子の不飽和芳香族炭素環基を意味する。好適なアリールには、フェニル、ナフチル、フェナントレニルなどがある。
【００２０】
「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」とは、ベンジル、フェネチルなどを含むアリール置換基を有するＣ1〜Ｃ6−アルキル基を意味する。
【００２１】
「ヘテロアリール」とは、単環式複素環式芳香族、または二環式、または三環式縮合環複素環式芳香族基を意味する。複素環式芳香族基の具体例には、任意的に置換されたピリジル、ピロリル、フリル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１，３，４−トリアジニル、１，２，３−トリアジニル、ベンゾフリル、［２，３−ジヒドロ］ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、イソベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、ベンズイミダゾリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、キノリジニル、キナゾリニル、フタラジニル、キノキサリニル、シンノリニル、ナフチリジニル、ピリド［３，４−ｂ］ピリジル、ピリド［３，２−ｂ］ピリジル、ピリド［４，３−ｂ］ピリジル、キノリル、イソキノリル、テトラゾリル、５，６，７，８−テトラヒドロキノリル、５，６，７，８−テトラ−ヒドロイソキノリル、プリニル、プテリジニル、カルバゾリル、キサンテニルまたはベンゾキノリルがある。
【００２２】
「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」とは、２−フリルメチル、２−チエニルメチル、２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチルなどを含むヘテロアリール置換基を有するＣ1〜Ｃ6−アルキル基を意味する。
【００２３】
「アルケニル」とは、好ましくは２〜６個の炭素原子と少なくとも１つまたは２つのアルケニル不飽和部位を有するアルケニル基を意味する。好適なアルケニル基には、エテニル（−ＣＨ＝ＣＨ2）、ｎ−２−プロペニル（アリル、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2）などがある。
【００２４】
「アルキニル」とは、好ましくは２〜６個の炭素原子と少なくとも１〜２個のアルキニル不飽和部位を有するアルキニル基を意味し、好適なアルキニル基には、エチニル（−Ｃ≡ＣＨ）、プロパルギル（−ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ）などがある。
【００２５】
「アシル」とは、基−Ｃ（Ｏ）Ｒを意味し、ここでＲは、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」を含む。
【００２６】
「アシルオキシ」とは、基−ＯＣ（Ｏ）Ｒを意味し、ここでＲは、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」を含む。
【００２７】
「アルコキシ」とは、基−Ｏ−Ｒを意味し、ここでＲは、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、または「アリール」、または「ヘテロアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」を含む。好適なアルコキシ基には、例えばメトキシ、エトキシ、フェノキシなどがある。
【００２８】
「アルコキシカルボニル」とは、基−Ｃ（Ｏ）ＯＲを意味し、ここでＲは、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、または「アリール」、または「ヘテロアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」を含む。
【００２９】
「アミノカルボニル」とは、基−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’を意味し、ここで各Ｒ、Ｒ’は、独立に水素またはＣ1〜Ｃ6−アルキル、またはアリール、またはヘテロアリール、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」を含む。
【００３０】
「アシルアミノ」とは、基−ＮＲ（ＣＯ）Ｒ’を意味し、ここで各Ｒ、Ｒ’は、独立に水素または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、または「アリール」、または「ヘテロアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」を含む。
【００３１】
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素原子を意味する。
「スルホニル」とは、基「−ＳＯ2−Ｒ」を意味し、ここでＲは、Ｈ、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、ハロゲンで置換された「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、例えば−ＳＯ2−ＣＦ3基、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」から選択される。
【００３２】
「スルホキシ」とは、基「−Ｓ（Ｏ）−Ｒ」を意味し、ここでＲは、Ｈ、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、ハロゲンで置換された「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、例えば−ＳＯ−ＣＦ3基、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」から選択される。
【００３３】
「チオアルコキシ」とは、基−Ｓ−Ｒを意味し、ここでＲは、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、または「アリール」、または「ヘテロアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、または「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」を含む。好適なチオアルコキシ基には、チオメトキシ、チオエトキシなどがある。
【００３４】
「置換もしくは非置換」：個々の置換基の定義で特に明記しない場合は、上記の基（「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」、「アリール」および「ヘテロアリール」など）は、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアリール」、「Ｃ1〜Ｃ6−アルキルヘテロアリール」、「Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル」、「Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル」、一級、二級、もしくは三級アミノ基または四級アンモニウム残基、「アシル」、「アシルオキシ」、「アシルアミノ」、「アミノカルボニル」、「アルコキシカルボニル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、ニトロ、スルホキシ、スルホニル、アルコキシ、チオアルコキシ、トリハロメチルなどよりなる群から選択される１〜５個の置換基で任意的に置換されてよい。あるいは、該置換はまた、隣接する置換基が閉環を受けた状況、特にビシナル官能基置換基が関与して、例えばラクタム、ラクトン、環状無水物、またアセタール、チオアセタール、例えば保護基を得るために閉環により形成されたアミナールを形成する時も含む。
【００３５】
「薬剤学的に許容される塩または複合体」とは、所望の生物活性を保持する以下で同定される式Ｉの化合物の塩または複合体を意味する。そのような塩の例には、特に限定されないが、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）と形成される酸付加塩、および有機酸（例えば、酢酸、オキザル酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモイック酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、およびポリガラクツロン酸）と形成される塩がある。該化合物はまた、式−ＮＲ，Ｒ’、Ｒ”+ Ｚ- の四級アンモニウム塩を含み、ここでＲ、Ｒ’、Ｒ”は独立に、水素、アルキル、またはベンジルであり、Ｚは対イオン（塩化物、臭化物、ヨウ化物、−Ｏ−アルキル、トルエンスルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、またはカルボン酸塩（例えば、安息香酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、桂皮酸塩、マンデル酸塩、およびジフェニル酢酸塩）を含む）である。
【００３６】
「薬剤学的に許容される誘導体」とは、患者に投与すると、直接または間接に、本明細書に開示の活性を提供することができる任意の化合物を意味する。
【００３７】
「エナンチオマー過剰」（ｅｅ）とは、基本的にエナンチオマー合成、またはエナンチオ選択的工程を含む合成により得られる生成物を意味し、こうして、少なくとも約５２％ｅｅのオーダーの１つのエナンチオマーが得られる。エナンチオマー合成が無いと、通常ラセミ体が得られ、これはまた、ＪｕｎＫ２および／または３インヒビターとして本発明の活性を有する。
【００３８】
驚くべきことに、式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体は、ＪＮＫ（特にＪＮＫ２と３）の作用を有効に阻害することにより、好適な薬剤活性のある物質であることがわかった。応用の便利さから、本発明で見いだされた化合物は、経口投与でも利用できるため、上記ペプチドまたはタンパク質アプローチと比較して顕著な優秀性を示す。これらは、医師が処方することができ、わずかな観察が必要なだけである。また本発明で見いだされた化合物は、ここまで記載した該ペプチド化合物と比較して低コストで入手できる。
【化１０】
ＸはＯまたはＳ、好ましくはＯであり；
Ｒ1は、水素または非置換もしくは置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキル基であり、好ましくはＨである。
【００３９】
あるいはＲ1は、Ａｒ1との置換もしくは非置換５〜６−員環飽和または不飽和縮合環である。
【００４０】
さらに代替法において、Ｒ2およびＲ4は、置換もしくは非置換５〜６員環の飽和もしくは不飽和環を形成することができる。
【００４１】
Ｒ2は、水素または置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキル基であり、好ましくはＨである。
ｎは、０〜５の整数であり、好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１である。
Ｒ3とＲ4は、互いに独立して、天然のまたは合成アミノ酸残基、水素、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（例えば、トリハロメチル）、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、ＮＨ2、ＳＨ、Ｃ1〜Ｃ6−チオアルキル、アシルアミノ、アミノカルボニル、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール、１〜３個のヘテロ原子を含有していてもよい置換もしくは非置換４〜８員環状アルキル、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、アシルオキシ、スルホキシ、スルホニル、Ｃ1〜Ｃ6−チオアルコキシを含むかまたはこれらよりなる群から選択される（ただし、ここでＲ3および／またはＲ4の少なくとも１つはアミノ酸残基でなければならない）。
Ｒ5は、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキルである。
Ｒ6は、Ｈ、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−脂肪族アルキル、任意的に１〜３異項原子を含み、かつ任意的にアリールもしくはヘテロアリールと縮合した置換もしくは非置換飽和環Ｃ4〜Ｃ8−アルキルであり；Ｒ6は、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
【００４２】
ここで、Ｒ6のアリールもしくはヘテロアリール基は、任意的に置換または非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（例えばトリハロメチル）、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル、アミノ、アシルアミノ、アミノカルボニル、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシカルボニル、アリール、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、スルホニル、スルホキシ、Ｃ1〜Ｃ6−チオアルコキシで任意的に置換されている。
【００４３】
あるいは、Ｒ5とＲ6は一緒に、置換もしくは非置換４〜８員飽和環状アルキルまたはヘテロアルキル基を形成することができる。
【００４４】
本発明はまた、式Ｉの化合物の幾何異性体、光学活性型、エナンチオマー、ジアステレオ異性体を含み、そのラセミ体、およびまた式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体の薬剤学的に許容される塩ならびに薬剤活性のある誘導体を含む。
【００４５】
好適な実施態様においてＲ3および／またはＲ4の少なくとも１つは、以下の天然のアミノ酸残基よりなる群から選択される：アラニル、アルギニル、アスパラギニル、アスパルチル、システイニル、グルタミニル、グルタミル、グリシル、ヒスチジル、イソロイシル、ロイシル、リジル、メチオニル、フェニルアラニル、ピロリル、セリル、スレオニル、トリプトファニル、チロシル、バリル。
【００４６】
好適な実施態様において、Ａｒ1とＡｒ2は、フェニル、チエニル、フリル、ピリジルを含む群またはこれらよりなる群から独立に選択される。該残基は、少なくとも１つの置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（例えば、トリハロメチル）、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル、アミノ、アシルアミノ、アミノカルボニル、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシカルボニル、アリール、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、スルホキシ、スルホニル、アシルオキシ、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−チオアルコキシにより任意的に置換される。特に好適な実施態様において、Ａｒ1は、非置換もしくは置換フェニルであり、Ａｒ3はチエニル基である。
【００４７】
式Ｉの好適なスルホニルアミノ酸誘導体において、Ａｒ1は非置換もしくは置換フェニル、好ましくは４−クロロフェニル基であり、Ｘは好ましくはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は好ましくは水素であり、ｎは１であり、Ａｒ2は好ましくはチエニルであり、Ｒ5はＨまたはＣ1〜Ｃ6−アルキルである。
【００４８】
該好適な実施態様において、Ｒ6は、Ｈ、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−脂肪族アルキル、例えばアリールアミノＣ 1 〜Ｃ 6 −アルキル、ヘテロアリールアミノＣ 1 〜Ｃ 6 −アルキル、任意的に１〜３異項原子を含有し、かつ非置換もしくは置換アリールもしくはヘテロアリールと縮合した置換もしくは非置換環状Ｃ4〜Ｃ8−アルキルであるか；またはＲ6は非置換もしくは置換アリールもしくはヘテロアリールである。
【００４９】
上記アリールもしくはヘテロアリール基は、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（例えば、トリハロメチル）、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル、アミノ、アシルアミノ、アミノカルボニル、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシカルボニル、アリール、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、アシルオキシ、スルホキシ、スルホニル、Ｃ1〜Ｃ6−チオアルコキシで、任意的に置換される。
【００５０】
あるいはＲ5とＲ6は一緒に、非置換もしくは置換４〜８員飽和環状アルキルもしくはヘテロアルキル基（例えば、非置換もしくは置換ピペリジノ基）を形成することができる。
【００５１】
本発明の特に好適な実施態様は、スルホニルアミノ酸誘導体に関し、ここでＲ5はＨであり；Ｒ6は、アリール、ヘテロアリール基またはアミノアリール、アミノヘテロアリール、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシで置換されたＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、該アリールおよびヘテロアリール基は、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（例えば、トリハロメチル）、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル、アミノ、アシルアミノ、アミノカルボニル、置換もしくは非置換Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換アリール、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、スルホキシ、スルホニル、アシルオキシ、Ｃ1〜Ｃ6−チオアルコキシで、任意的に置換される。
【００５２】
本発明の好適な実施態様において、スルホニルアミノ酸誘導体のＲ6は、置換もしくは非置換ピリジル基である。
【００５３】
式Ｉの化合物の具体例は以下を含む：
４−クロロ−Ｎ−（｛５−［（｛２−［（２−｛［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）ピリジ−２−ニル］アミノ｝エチル）アミノ］−２−オキソエチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル）ベンズアミド
【００５４】
４−クロロ−Ｎ−［（５−｛［（２−｛［２−（｛５−ニトロピリジ−２−ニル｝アミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソエチル）アミノ］スルホニル｝チエ−２−ニル）メチル］ベンズアミド
【００５５】
４−クロロ−Ｎ−（｛５−［（｛２−オキソ−２−［（２−｛［３−（トリフルオロメチル）ピリジ−２−ニル］アミノ｝エチル）アミノ］エチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル）ベンズアミド
【００５６】
４−クロロ−Ｎ−（｛５−［（｛２−オキソ−２−［（２−｛［５−（トリフルオロメチル）ピリジ−２−ニル］アミノ｝エチル）アミノ］エチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル）ベンズアミド
【００５７】
Ｎ−（｛５−［（｛２−［４−（１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イル）ピペリジ−１−ニル］−２−オキソエチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル)−４−クロロベンズアミド
【００５８】
４−クロロ−Ｎ−［（５−｛［（２−オキソ−２−｛３−［（トリフルオロメチル）スルホニル］アニリノ｝エチル）アミノ］スルホニル｝チエ−２−イル）メチル］ベンズアミド
【００５９】
本発明のさらなる面は、ＪＮＫ機能またはシグナル伝達経路関連疾患、特に神経疾患および／または免疫系の疾患に対する、調節、特にダウンレギュレート (例えば阻害）するための医薬組成物の調製のための、式のスルホニルアミノ酸誘導体の使用、ならびに医薬組成物自体である。好適なＪＮＫ経路は、ＪＮＫ１および／またはＪＮＫ２および／またはＪＮＫ３である。
【００６０】
上記したように、式Ｉの化合物は医薬としての使用に適している。上記一般式Ｉに分類される化合物のほんのわずかのものが、本出願以前に開示されているが、これまでまだ医学的または生物学的活性を証明したものはない。従って、上記式Ｉに属する新規化合物および少ない公知の化合物の両方が、一連の疾患、例えば、哺乳動物特にヒトの自己免疫系および神経系の疾患の治療に使用するのに適していることが、本明細書において報告される。さらに詳しくは、式Ｉの化合物は単独または医薬組成物の形で、ＪＮＫ経路の調節、さらに詳しくはＪＮＫ、特にＪＮＫ１および／またはＪＮＫ２および／またはＪＮＫ３の異常な発現または活性に関連する疾患の治療または予防に有用である。該調節は通常好ましくは、ＪＮＫ経路、特にＪＮＫ１および／またはＪＮＫ２および／またはＪＮＫ３の阻害を含む。ＪＮＫのそのような異常発現または活性は、無数の刺激（例えば、ストレス、敗血症ショック、酸化的ストレス、サイトカイン）により引き起こされ、以下に記載する疾患や病状にしばしば関与する制御できないアポトーシスまたは自己免疫疾患に至ることがある。従って式Ｉの化合物は、ＪＮＫ機能またはシグナル伝達経路を調節することにより疾患の治療に使用される。ＪＮＫ機能または経路の該調節は、その活性化を含むが、好ましくはＪＮＫ経路、特にＪＮＫ１および／またはＪＮＫ２および／またはＪＮＫ３のダウンレギュレーションから阻害までを含む。式Ｉの化合物は、単独でまたはさらなる薬剤と組合せて使用される。
【００６１】
具体的には式Ｉの化合物は、ＪＮＫ１および／またはＪＮＫ２および／またはＪＮＫ３の阻害が決定的に重要な役割を果たす免疫関連および／または神経関連疾患または病状（例えば、てんかん；アルツハイマー病、ハンティントン病、パーキンソン病のような神経変性疾患；網膜疾患；脊髄損傷；頭部損傷、多発性硬化症を含む自己免疫疾患、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、リウマチ様関節炎；喘息；敗血症ショック；移植拒絶；乳癌、結腸癌、膵臓癌を含む癌、および卒中、脳虚血、動脈硬化、心筋梗塞、心筋潅流傷害を含む心血管疾患）の治療または予防に有用である。
【００６２】
驚くべきことに、本発明で見いだされた式Ｉの化合物は、ＪＮＫ１および／またはＪＮＫ２および／またはＪＮＫ３のインヒビターとして大きな活性を示す。好適な実施態様において本発明の化合物は、ＪＮＫ２および３と偶然同じファミリーに属する２つのさらなるアポトーシス調節酵素（すなわち、ｐ３８とＥＲＫ２）を考慮すると、予想外に実質的に不活性である。従って本発明の化合物は、ＪＮＫ経路に関連する疾患を選択的に治療し、ｐ３８やＥＲＫ２のような他の標的に関しては基本的に効率が低いという顕著な可能性を示し、その結果選択的インヒビターと考えられる。これらの関連酵素は一般に異なる疾患に関与しているため、これは非常に意義があり、従って異なる疾患の治療には、対応する選択的薬剤を使用することが好ましい。
【００６３】
実際、本明細書に報告され驚くべきことに見いだされた本発明の式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体以前は、ＪＮＫ経路のインヒビターとしての小分子化合物の使用について何も知られていなかった。
【００６４】
本発明のさらなる面は、実際に新規な式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体、すなわち先行技術では開示されていない式ＩのＪＮＫ阻害スルホニルアミノ酸誘導体である。実際、式Ｉの一部の少ない化合物は、Ragab A.らのIndian J. Chem., Sec. B; Org. Chem. Incl. Med. Chem., 1998, 37B(19), 1059-1062に開示されているが、薬剤についての記載はない。Ragab A.らの式Ｉの公知の化合物は、Ａｒ1が４−クロロフェニルまたは２，４−ビスクロロフェニル残基であり；Ａｒ2がフェニルであり；ｎ＝１であり；ＸがＯであるものであり、残基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ5はすべてＨであり；Ｒ4が、Ｈ、ＣＨ3、ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＯＨ−４、ＣＨ2−ＣＨ−（ＣＨ3）2であり、Ｒ6がＣＨ2−ＣＯ2ＣＨ3であるものである。
【００６５】
３つのさらなる化合物が、会社のカタログで言及されているという意味で、CEREP社（www.cerep.fr）から開示されているが、薬剤についての記載はない。
【００６６】
一般にCEREP社の式Ｉの化合物は、Ａｒ1が４−クロロフェニルであり、ＸがＯであり、Ｒ1がＨであり、Ａｒ2がチエニル基であるものであるが、２つの化合物において、残基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5およびＲ6はすべてＨであり、Ｒ4はメチルまたは（４−ヒドロキシフェニル）エチルである。第３のCEREP化合物において、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ5はＨであり、Ｒ4はメチルであり、Ｒ2はプロピルであり、Ｒ6は２−メチルフェニルである。
【００６７】
従って、式Ｉの完全に新規なスルホニルアミノ酸誘導体は、式Ｉ
【化１１】
本発明のさらなる目的は、上記の式Ｉの新規なスルホニルアミノ酸誘導体の調製法である。
【００６８】
本発明のスルホニルアミノ酸誘導体は、容易に入手できる出発物質から、以下の一般的方法と操作を使用して調製することができる。典型的なまたは好適な実験条件（すなわち、反応温度、時間、試薬のモル数、溶媒など）が与えられるが、特に明記しない場合は他の実験条件も使用できることを理解されたい。最適な反応条件は、使用される特定の反応物または溶媒で変化するが、そのような条件は、当業者がルーチンの最適化法により決定することができる。
【００６９】
好適な合成法において式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体は、まず式IIのアミン：
【化１２】
【化１３】
【化１４】
式IIのアミンは、公知の化合物であるか、または公知の化合物から従来法を使用して調製することができる。出発物質として好適なアミンには、チエ−２−ニル−メチルアミン、フラ−２−ニル−メチルアミン、ピリ−２−ジルメチルアミンなどがある。
【００７０】
式IIIのアシル塩化物はまた、市販されているかまたは既に記載されている化合物である。好適なアシル塩化物には、塩化４−クロロベンゾイル、塩化４−フルオロベンゾイル、塩化４−トリフルオロメチルベンゾイルなどがある。公知ではなくても、酸ハロゲン化物は、対応するカルボン酸を無機酸ハロゲン化物（例えば、塩化チオニル、三塩化リンまたは塩化オキザリル）と従来の条件下で反応させて調製することができる。
【００７１】
一般にこの反応は、約１〜５モル当量の無機酸ハロゲン化物または塩化オキザリルを使用して、そのまままたは不活性溶媒（例えば、四塩化炭素）中で、約０℃〜約８０℃の範囲の温度で約１〜約４８時間反応させて行われる。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのような触媒を、この反応に使用してもよい。
【００７２】
アシルハロゲン化物が結合反応で使用される時、これは典型的にはアミンIIと、適当な塩基の存在下で反応させて、反応中で生成する酸を除去する。例えば適当な塩基には、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリンなどがある。あるいは過剰のアミンIIを使用して、反応中で生成する酸を除去してもよい。
【００７３】
あるいは式IIIのカルボン酸は、結合反応で使用することができる。IIIのカルボン酸は通常、市販の試薬であるかまたは従来法により調製することができる。
【００７４】
IIIのカルボン酸（すなわち、アシル塩化物）の結合反応は、従来の結合試薬（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドのようなカルボジイミド）を含む）および他の促進剤（例えば、Ｎ，Ｎ−カルボニル−ジイミダゾールまたはＰｙＢＯＰ）を使用して行われる。この反応は、公知の添加剤（例えば、カルボン酸とアミンの結合を促進することが知られているＮ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトイラゾールなど）を使用してまたは使用しないで、行われる。
【００７５】
酸ハロゲン化物IIIまたはそのカルボン酸を使用する結合反応は、好ましくは約０℃〜約６℃の温度で約１〜約２４時間行われる。典型的には反応は、不活性な非プロトン性溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフランなど）中で、カルボン酸またはその酸ハロゲン化物に基づいて約１〜約５モル当量のアミンを使用して行われる。反応が完了すると、カルボキサミドIVが、従来法（沈降、クロマトグラフィー、ろ過、蒸留などを含む）を使用して回収される。
【００７６】
式Ｉのスルホニルアミノ酸の調製に必要な式Ｖのスルホニル塩化物は、市販されているかまたは従来のスルホン酸化法により調製される。
【化１５】
【００７７】
さらに好適な調製法において、特に式Ｖの塩化スルホニルの予備的合成に至る上記方法が適用できない場合は、本発明のスルホニルアミノ酸は以下の工程により調製される：
【００７８】
・式IIの化合物のアミン官能基の保護；
・芳香族基のクロロスルホニル化；
・スルホニルアミノ酸官能基の形成；
・保護基の脱保護；
・上記の生成した遊離のアミンのアシル化；
式IIのアミンは、アミン残基の適当な保護基で保護されて、式VIの中間体化合物を与え、ここでＰは、当業者が使用する任意の保護基を意味する。
【化１６】
【００７９】
該基の導入は、対応するビスアリルカーボネート無水物または臭化アリルまたは無水マレイン酸を、塩基（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリンなど）の存在下で、非プロトン性溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフランなど）中で、約０℃〜約８０℃の範囲の温度で、反応させて行われる。
【００８０】
次に式VIの化合物は、従来の非常に穏やかなスルホン酸化法を使用してスルホン酸化され、式VIIの塩化スルホニルが得られる。
【化１７】
【００８１】
式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体は、下記の反応工程図１または２を使用して、対応する上記塩化スルホニルＶまたはVIIから得ることができる。
【化１８】
【００８２】
アミノ酸誘導体のカルボン酸官能基の無数の保護基ならびにその導入と除去は、T. W. GreeneとG.M. Wuts, Protecting groups in Organic Synthesis、第３版、Wiley、ニューヨーク、1998、およびそこに引用された文献に詳細に記載されている。アルキルエステルおよび特にｔｅｒｔ−ブチルエステルのような酸性条件を使用して、除去することができる保護基が好ましい。
【００８３】
次に式ＶまたはVIIのスルホニル誘導体のアルキル化は、これらを式VIIIの保護されたアミノ酸誘導体と、反応中に生成する酸を除去する適当な塩基の存在下で反応させることにより容易に行われる。適当な塩基には、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリンなどがある。反応は好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、エタノール、アセトニトリルのような溶媒中で、約０℃〜約１００℃の温度で行われる。
【００８４】
脱保護後に生成した中間体化合物IXまたはＸのカルボン酸官能基と、Ｒ5Ｒ4ＮＨ型のアミン（市販されているかまたは公知の調製物）との結合反応は、アミド調製の公知の方法に従って、上記の好適な条件下で、一般式Ｉの化合物を得ることにより行われる。
【００８５】
式Ｘの誘導体の使用によりスルホニルアミノ酸が得られ、これは、脱保護されアシル化されて、反応工程図２に従って式Ｉの化合物を提供する必要がある。
【００８６】
本発明の一部として考慮すべき別の調製法は、上記反応工程図３に記載されている。
【化１９】
【００８７】
アミノ酸誘導体のアミノ官能基の無数の保護基ならびにその導入と除去は、T. W. GreeneとG.M. Wuts, Protecting groups in Organic Synthesis、第３版、Wiley、ニューヨーク、1998、およびそこに引用された文献に詳細に記載されている。塩基性または酸性条件を使用して除去することができる保護基（例えば、それぞれＦｍｏｃとＢｏｃ基）が好ましい。
【００８８】
化合物XIのカルボン酸官能基と、Ｒ5Ｒ4ＮＨ型のアミン（市販されているかまたは公知の調製物）との結合反応は、アミド調製の公知の方法に従って、上記の好適な条件下で行われる。
【００８９】
次に式Ｖのスルホニル誘導体のアルキル化は、これらを式XIIの適当な脱保護されたアミノ酸誘導体と、反応中に生成する酸を除去する適当な塩基の存在下で反応させることにより容易に行われる。適当な塩基には、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリンなどがある。反応は好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、エタノール、アセトニトリルのような溶媒中で、約０℃〜約１００℃の温度で行われる。
【００９０】
式Ｉの化合物を得るのに上記の一般的合成法が適用できないなら、当業者に公知の適当な調製法が使用される。例えば、Ａｒ2がフェニルである時、市販のシアノフェニル塩化スルホニルから出発して、当業者に公知の従来法を適用して、式Ｉのスルホンアミド誘導体を得ることができる。
【００９１】
本発明のさらなる面は、ＪＮＫ経路の調節のための式Ｉの化合物の使用、ＪＮＫ経路の調節のために医薬組成物の調製のための該化合物の使用、ならびに式Ｉの活性化合物を含有する製剤に関する。ＪＮＫ経路の該調節は、種々の疾患の治療のための適切なアプローチと考えられる。薬剤として使用される時、本発明のスルホニルアミノ酸誘導体は、典型的には医薬組成物の形で投与される。従って、式Ｉの化合物、薬剤学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物はまた、本発明の範囲内である。当業者は、医薬組成物を製剤化するのに適した種々のそのような担体、希釈剤または賦形剤化合物を理解しているであろう。また本発明は、医薬として使用される化合物を提供する。特に本発明は、哺乳動物、特にヒトの免疫系ならびに神経系の疾患を治療するための、単独のまたは他の医薬と組合せた、ＪＮＫインヒビター、特にＪＮＫ１および／またはＪＮＫ２および／またはＪＮＫ３として使用される式Ｉの化合物を提供する。
【００９２】
本発明の化合物は、従来から使用されているアジュバント、担体、希釈剤または賦形剤とともに、医薬組成物の形で、かつその単位服用量で入れられ、そのような形で、例えば錠剤、充填カプセル剤のような固形剤、溶解剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤のような液剤、またはこれらを充填したカプセル剤（すべて経口投与用）、または非経口投与（皮下使用を含む）のための無菌注射剤の形で使用される。そのような医薬組成物およびその単位投与型は、追加の活性化合物または成分有りまたは無しで、従来の比率で成分を含有してもよく、そのような単位投与型は、使用される目的の１日投与量範囲に対応する活性成分の適当な有効量を含有してもよい。
【００９３】
医薬として使用される時、本発明のスルホニルアミノ酸誘導体は、典型的には医薬組成物の形で投与される。そのような組成物は、医薬品分野で公知の方法で調製され、少なくとも１つの活性化合物を含有してもよい。一般に本発明の化合物は、薬剤学的にまたは薬理学的に有効な量で投与される。実際に投与される化合物の量は、典型的には、関連した状況（治療すべき症状、選択された投与経路、投与される実際の化合物、個々の患者の年齢、体重、および応答、患者の症状の重症度などを含む）を考慮して、医師が決定する。
【００９４】
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、および経鼻経路を含む種々の経路により投与することができる。目的とする送達経路に依存して、化合物は好ましくは、注射剤または経口投与組成物として調製される。経口投与用の組成物は、バルクの液体溶解剤または懸濁剤、またはバルクの散剤の形でもよい。しかしより一般的には、この組成物は、正確な投与を促進するために、単位投与型で提供される。「単位投与型」という用語は、各単位が、適当な薬剤の賦形剤と一緒に所望の治療効果を生み出すと計算される活性物質のあらかじめ決められた量を含有する、ヒト被験体および他の哺乳動物の単位服用量として適した物理的に分かれた単位を意味する。典型的な単位投与型は、あらかじめ充填された、あらかじめ測定されたアンプルまたはシリンジの液体組成物または丸剤、錠剤、カプセル剤などを、固体組成物の場合を含む。そのような組成物において、式Ｉのスルホニルアミノ酸化合物は、通常あまり主要ではない成分（約０．１〜約５０重量％の、好ましくは約１〜約４０重量％）であり、残りは、、所望の投与型を形成するのに有用な種々のビヒクルまたは担体および処理補助物である。
【００９５】
経口投与に適した液体型には、緩衝剤、懸濁剤および調剤物質、着色剤、香味剤など有する適当な水性または非水性ビヒクルがある。固体型には、例えば以下の任意の成分、または類似の性質を有する化合物；微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、またはトウモロコシデンプンのような崩壊剤；コロイド性二酸化ケイ素のような直打用滑沢剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ風味のような香味剤がある。
【００９６】
注射用組成物は、典型的には注射用無菌食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水または当該分野で公知の他の注射用担体に基づく。上記したように、そのような組成物中の式Ｉのスルホニルアミノ酸化合物は、典型的には非主要成分であり、しばしば０．０５％〜１０重量％の範囲で残りは注射用担体などである。
【００９７】
経口投与または注射用組成物のための上記組成物は、代表的なものを例示するのみである。さらなる物質ならびに処理法などは、レミントンの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）、第１７版、１９８５年、マックパブリシングカンパニー（Mack Publishing Company）、イーストン（Easton）、ペンシルバニア州（これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００９８】
本発明の化合物はまた、除放性製剤または除放性ドラッグデリバリーシステムで投与することができる。代表的な除放性物質の説明はまた、レミントンの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）にも記載されている。
【００９９】
以下では、いくつかの例を用いて本発明を説明するが、これらは決して本発明の範囲を限定するものではない。
【０１００】
実施例
実施例１：４−クロロ−Ｎ−（｛５−［（｛２−［（２−｛［３−クロロ−５− （トリフルオロメチル）ピリジ−２−ニル］アミノ｝エチル）アミノ］−２−オキソエチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル）ベンズアミド １４−クロロ−Ｎ−チオフェ−２−ニルメチル−ベンズアミド １ａ
５０mlの無水ＣＨ2Ｃｌ2中の塩化４−クロロベンゾイルの溶液（０．１１４mol）を、３０分かけて、０℃のＣＨ2Ｃｌ2（２００ml）中の２−アミノメチル−チオフェン（０．１３７mol）とiＰＲ2ＮＥｔ（０．２５mol）の攪拌溶液に加える。白色の固体が生成し、反応物を１時間かけて室温まで暖める。混合物を２００mlのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、ＨＣｌ水溶液（０．１Ｎ）で２回洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥する。溶媒を留去すると、２８ｇ（９８％）の標題のベンズアミドが白色の固体として得られる：mp 153-54℃、1H NMR (CDCl3) δ7.9 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.58 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.44 (dd, J=3.77, 1.13 Hz, 1H), 7.22 (d, J=5.27 Hz, 1H), 7.16 (dd, J=3.39, 5.27 Hz, 1H), 6.62 (br d, 1H), 4.98 (d, J=5.65 Hz, 2H)。
【０１０１】
５−（｛［１−（４−クロロ−フェニル）−メタノイル］−アミノ｝−メチル）−チオフェン−２−スルホニルクロリド １ｂ
ＣＨ2Ｃｌ2（８０ml）中のクロロスルホン酸（２０．１ml、１９８mmol）を、−８０℃のＣＨ2Ｃｌ2（５００ml）中の１ａの溶液（１０ｇ、４０mmol）に滴下して加える。混合物を５時間で室温まで戻す。反応混合物を氷上に注ぎ、ＣＨ2Ｃｌ2で急速に抽出する。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、溶媒を蒸発乾固して、８．８ｇ（６３％）の所望の塩化スルホニル１ｂを得る；mp 133-35℃, 1H NMR (DMSO)δ 9.21 (t, J=6.4 Hz, 1H), 7.87 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.53 (d, J=8.67 Hz, 2H), 6.91 (d, J=3.39 Hz, 1H), 6.77 (d, J=3.39 Hz, 1H), 4.53 (d, J=3.77 Hz, 2H)。
【０１０２】
［５−（｛［１−（４−クロロ−フェニル）−メタノイル］−アミノ｝−メチル）−チオフェン−２−スルホニルアミノ］−酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル １ｃ
Ｈ−Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ．ＨＣｌ（２６３mg、１．５７mmol）を、２０mlのＣＨ2Ｃｌ2に溶解する。ｉ−ＰＲ2ＮＥｔを塩基として使用してｐＨを９に調整する（５３７μｌ、３．１４mmol）。この溶液に、１０mlのＤＭＦ中の１ｂ（５００mg、１．４３ｌmmol）を滴下して加える。反応物を一晩攪拌する。３０mlのＣＨ2Ｃｌ2を加え、有機相をＨＣ（０．１Ｎ）と飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄する。ＭｇＳＯ4上で乾燥し、溶媒を蒸発乾固して１ｃ（４００mg、６３％）を白色の固体として得る。mp ℃、1H NMR (d6-DMSO) δ9.34 (t, J=6.40 Hz, 1H), 8.25 (t, J=6.40 Hz, 1H), 7.89 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.56 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.41 (d, J=3.77 Hz, 1H), 7.05 (d, J=3.77 Hz, 1H), 4.62 (d, J=6.40 Hz, 2H), 3.59 (d, J=6.40 Hz, 2H), 1.3 (s, 9H)。
【０１０３】
［５−（｛［１−（４−クロロ−フェニル）−メタノイル］−アミノ｝−メチル）−チオフェン−２−スルホニルアミノ］−酢酸 １ｄ
０℃のＣＨ2Ｃｌ2（１０ml）中の１ｃの溶液（４００mg、０．９mmol）に、ＴＦＡ（１０ml）を加え、反応物を０℃で一晩攪拌し、室温でさらに１時間攪拌する。溶媒を蒸発乾固して１ｄ（３００mg、８６％）を白色の固体として得る。1H NMR (d6-DMSO) δ9.34 (t, J=5.65 Hz, 1H), 8.20 (t, J=6.03 Hz, 1H), 7.89 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.56 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.43 (d, J=3.77 Hz, 1H), 7.05 (d, J=3.77 Hz, 1H), 4.63 (d, J=5.65 Hz, 2H), 3.59 (d, J=6.03 Hz, 2H)。
【０１０４】
４−クロロ−Ｎ−（｛５−［（｛２−［（２−｛［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）ピリジ−２−ニル］アミノ｝エチル）アミノ］−２−オキソエチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル）ベンズアミド １
ＣＨ2Ｃｌ2／ＤＭＦ ２：１（８ml）中の１ｄ（５０mg、０．１３mmol）の攪拌溶液に、ｉ−ＰＲ2ＮＥｔを加えてｐＨを７．５に調整する。ＤＩＣ（１８mg、０．１４mmol）とＨＯＢｔ（１９mg、０．１４mmol）を加え、溶液を室温で３０分攪拌する。この溶液に、ＣＨ2Ｃｌ2（３ml）中の１−（１−（３−クロロ−５−トリフルオロメチル）ピリジン−エチレンジアミン（３４mg、０．１４mmol）を加える。反応混合物を４．５時間攪拌する。４０mlのＣＨ2Ｃｌ2を加え、有機相を、ＨＣｌ（０．１Ｎ）、飽和ＮａＨＣＯ3、飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥する。粗生成物をシリカゲルのクロマトグラフィーで溶出液としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン ８：２を使用して、１７mg（２１％）の１を得る。1H NMR (d6-DMSO) δ9.34 (t, J=6.03 Hz, 1H), 8.32 (brd, 1H), 8.04-8.14 (m, 2H), 7.95 (d, J=2.26 Hz, 1H), 7.88 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.54 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.43 (d, J=3.77 Hz, 1H), 7.28 (d, J=5.65 Hz, 1H), 7.06 (d, J=3.77 Hz, 1H), 4.63 (d, J=6.03 Hz, 2H), 3.36-3.48 (m, 4H) 。
【０１０５】
実施例２：４−クロロ−Ｎ−［（５−｛［（２−｛［２−（｛５−ニトロピリジ−２−ニル｝アミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソエチル）アミノ］スルホニル｝チエ−２−ニル）メチル］ベンズアミドアミド ２
ジアリル−チオフェ−２−ニルメチルアミン ２ａ
臭化アリル（５５ml、６５．４mmol）を、ＣＨ2Ｃｌ2（２７０ml）中の２−アミノメチル−チオフェン（２４ml、２３．３mmol）とｉ−Ｐｒ2ＮＥｔ（１２０ml、７０．１mmol）の溶液に加える。穏やかに発熱性の反応物は、１時間後に自然に還流温度に達する。この反応物を、氷浴を用いて冷却して、室温で１４時間撹拌すると、望ましくない沈殿物が出現する。この沈殿物（４５ｇ）をろ過して除去する。有機層から溶媒を留去して、ＥｔＯＡｃで希釈すると、さらに沈殿物が出現（４５ｇ）するため、これをろ過により除去する。ＥｔＯＡｃ溶液をＳｉＯ2でろ過して、濃縮することにより、３６．１ｇ（８０％）の標題のジアリルアミンが淡黄色の油状物として得られる：1H NMR (CDCl3) δ7.25 (br.d, J=5.9 Hz, 1H), 6.98 (br.dd, J=5.1, 2.8 Hz, 1H), 6.94-6.92 (m, 1H), 5.99-5.86 (m, 2H), 5.29-5.18 (m, 4H), 3.85 (s, 2H), 3.16 (dd, J=6.3, 0.9 Hz, 4H)。
【０１０６】
５−ジアリルアミノメチル−チオフェン−２−スルホニルクロリド ２ｂ
Ｅｔ2Ｏ中のアリル保護チオフェン４ａ（６．２ｇ、３２．１mmol）の溶液を、アセトン／ドライアイス浴を用いて−７０℃に冷却する。ペンタン中のｔ−ＢｕＬｉの溶液（２１．３８ml、１．５Ｍ、３２．１mmol）を２分かけて加えると、内部温度は一瞬で−５０℃に上昇して、混合物は橙色に変わる。１０分後、ＳＯ2を２分間バブリングすると、粘性の沈殿物が直ちに形成される。反応物が０℃に達するのを待ち、ＴＨＦ（２０ml）中のＮＣＳ（４．６３ｇ、３２．１mmol）の懸濁液を加えると、スラリーは紫色に変わる。室温で４５分後、混合物を、ＥｔＯＡｃで溶出しながらＳｉＯ2でろ過する。溶媒の留去、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：５）での希釈及びＳｉＯ2によるろ過によって、５．０ｇ（５３％）の標題の塩化スルホニルが淡褐色の油状物として得られるが、これをさらに精製することなく使用する。
【０１０７】
２−（５−ジアリルアミノメチル−チオフェン−２−スルホニルアミノ）−［２−（５−ニトロ−ピリジ−２−ニルアミノ）−エチル］−アセトアミド ２ｃ
２ｃの調製は、前記したとおり最初にグリシンｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩を２ｂに加え、次に生じる脱保護中間体をＮ−（５−ニトロ−ピリジ−２−ニル）−１，２−エチレンジアミンと結合することにより実施される。
【０１０８】
２−（５−アミノメチル−チオフェン−２−スルホニルアミノ）−［２−（５−ニトロ−ピリジ−２−ニルアミノ）−エチル］−アセトアミド ２ｄ
ＣＨ2Ｃｌ2中のビスアリルアミン２ｃ（７．２５mmol）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルバルビツール酸（ＮＤＭＢＡ、２．８ｇ、１８．１mmol）、及びＰｄ（ＰＰｈ3）4（１４８．８mg、０．１３mmol）の溶液を、１０分間アルゴンをバブリングすることにより脱気する。反応物を室温で３時間撹拌すると、所望のアミン２ｄがそのＮＤＭＢＡ塩として沈殿する。この混合物をＥｔＯＡｃ（２００ml）とヘキサン（２００ml）で希釈して、水（３×５０ml）で洗浄する。粗化合物２ｄは、さらに精製することなく次の工程において使用するのに十分に純粋である。
【０１０９】
４−クロロ−Ｎ−［（５−｛［（２−｛［２−（｛５−ニトロピリジ−２−ニル｝アミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソエチル）アミノ］スルホニル｝チエ−２−ニル）メチル］ベンズアミド ２
ピリジン：ＣＨ2Ｃｌ2（１：４）中の２−アミノメチル−チオフェン２ｄの２０mg/ml溶液を−４０℃に冷却して、０．８当量の４−クロロフェニルスルホニルクロリドで１時間処理する。反応混合物を３０分かけて室温にする。溶媒の留去、ＣＨ3ＣＮで希釈、ＳｉＯ2パッドでろ過、及び溶媒の留去によって、所望のアミド２が得られる。MS m/z APCI: 636 (M+1), 634 (M-1)。ＨＰＬＣ分析：Ｒｔ＝１５．５１分（方法ｃ、以下を参照のこと）。
【０１１０】
上記実施例１〜２に記載される手順、及び適切な出発物質と試薬を用いることにより、下記の追加の式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体を得ることができた：
下記の表は、記載される実施例のＨＰＬＣデータ及び質量分析データを提供する1,2。
1 ＨＰＬＣ条件：Ｃ８対称性ａ−ＭｅＣＮ、０．０９％ ＴＦＡ、０〜１００％（１０分）
ＨＰＬＣ条件：Ｃ１８ ｂ−ＭｅＣＮ、０．０９％ ＴＦＡ、０〜１００％（２０分）、ｃ−ＭｅＣＮ、０．０９％ ＴＦＡ、０〜１００％（３０分）。
2 質量スペクトルＡＰＣＩ
【０１１１】
【表１】
以下の処方例は、本発明の代表的薬剤組成物を例示するものであり、これらに限定されるものではない。
【０１１２】
調製物１−錠剤
式Ｉのスルホニルアミノ酸化合物を乾燥粉末として、乾燥ゼラチン結合剤と約１：２の重量比で混合する。少量のステアリン酸マグネシウムを滑沢剤として加える。この混合物を、打錠機で２４０〜２７０mg錠（１錠当たり８０〜９０mgの活性スルホニルアミノ酸化合物）に形成する。
【０１１３】
調製物２−カプセル剤
式Ｉのスルホニルアミノ酸化合物を乾燥粉末として、デンプン希釈剤と約１：１の重量比で混合する。この混合物を２５０mgカプセルに充填する（１カプセル当たり２５mgの活性スルホニルアミノ酸化合物）。
【０１１４】
調製物３−液剤
式Ｉのスルホニルアミノ酸化合物（１２５０mg）、ショ糖（１．７５ｇ）及びキサンタンガム（４mg）を混和し、１０番メッシュＵ．Ｓ．篩を通し、次に水中の微結晶性セルロースとナトリウムカルボキシメチルセルロース（１１：８９、５０mg）の前もって調製した溶液と混合する。安息香酸ナトリウム（１０mg）、香味剤、及び着色料を水で希釈して、撹拌しながら加える。次いで十分な水を加えることによって、５mLの総容量を生成させる。
【０１１５】
調製物４−錠剤
式Ｉのスルホニルアミノ酸化合物を乾燥粉末として乾燥ゼラチン結合剤と約１：２の重量比で混合する。少量のステアリン酸マグネシウムを滑沢剤として加える。この混合物を、打錠機で４５０〜９００mg錠（１５０〜３００mgの活性スルホンアミド化合物）に形成する。
【０１１６】
調製物５−注射剤
式Ｉのスルホニルアミノ酸化合物を緩衝化滅菌食塩水の注射用水性媒体に溶解して、約５mg/mlの濃度とする。
【０１１７】
実施例８：生物学的測定法
ＪＮＫ２及び３インビトロ測定法：ＪＮＫ２及び／または３測定法は、９６ウェルＭＴＴプレートで、０．５μgの組換えのプレ活性化ＧＳＴ−ＪＮＫ３またはＧＳＴ−ＪＮＫ２を１μgの組換えのビオチン化ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ及び２μM 33γ−ＡＴＰ（２nCi/μl）と共に、スルホニルアミノ酸インヒビターの存在下または非存在下で、かつ５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１０mM ＭｇＣｌ2；１mMジチオトレイトール、及び１００μM ＮａＶＯ4を含む５０μlの反応体積でインキュベートすることにより実施する。インキュベーションは、室温で１２０分間行い、リン酸生理食塩水緩衝液中に２５０μgのストレプトアビジン被覆ＳＰＡビーズ（アマーシャム社（Amersham, Inc.））*、５mM ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ−１００及び５０μM ＡＴＰを含む２００μlの溶液の添加により停止させる。室温で６０分間インキュベーション後、１５００×ｇで５分間遠心分離してビーズを沈降させ、５mM ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ−１００及び５０μM ＡＴＰを含む２００μlのＰＢＳに再懸濁して、前記のようにビーズの沈降後、シンチレーションβカウンターで放射活性を測定する。ビオチン化ＧＳＴ−1ＡＴＦ2またはミエリン塩基性タンパク質の代わりにＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎを使用することにより、それぞれプレ活性化ｐ３８とＥＲＫ ＭＡＰキナーゼの阻害を測定するためにこの測定法を使用することができる。
【０１１８】
生物試験結果
式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体の活性を、前記の生物学的測定法を用いて評価した。代表値を、下記表に示す：
【０１１９】
【表２】
【０１２０】
交感神経ニューロン培養及び生存活性測定法：新生ラット（ｐ４）の上頚神頚節（ＳＣＧ）からの交感神経ニューロンをディスパーゼ中で分離し、１０4細胞/cm2の密度でラット尾コラーゲンをコーティングした４８ウェルＭＴＴプレートに塗布して、５％ラット血清、０．７５μg/ml ＮＧＦ ７Ｓ（ベーリンガーマンハイム社（Boehringer Mannheim Corp.）、インディアナポリス、インディアナ州）及びアラビノシン１０5 Ｍを含むレーボヴィッツ（Leibowitz）培地で培養する。細胞死は、塗布後４日目に、培養液を抗ＮＧＦ抗体（ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、インディアナ州）を含みＮＧＦやアラビノシンを含まない培地に、スルホニルアミノ酸インヒビターの存在下または非存在下で曝露することにより誘導する。細胞死誘導の２４時間後、細胞生存活性の測定を、０．５mg/mlの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）中で３７℃で１時間の培養液をインキュベートして実施する。ＭＴＴ中でのインキュベーション後、細胞をＤＭＳＯに再懸濁し、９６ＭＴＴプレートに移して、細胞生存活性を、５９０nmの光学密度を測定することにより評価する。
【０１２１】
種々の試験化合物によるこの測定法の結果を、式Ｉの化合物が細胞死からニューロンを救っている（１０〜８０の間の生存ニューロン％）ことを証明する。
【０１２２】
ＩＬ−２放出測定法：
ジャーカット（Jurkat）細胞、ヒトＴ細胞白血病細胞株（アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）ＴＩＢ １５２号）を、１０％の熱活性化ＦＣＳ、グルタミン及びペンストレップ（Penstrep）を補足したＲＰＭＩ １６４０培地（ギブコ社（Gibco, BRL））で培養した。培地中の細胞懸濁液を希釈して２×１０6細胞/mLにする。細胞を、異なる濃度の試験化合物（化合物の最終濃度：１０、３、１、０．３、０．１μM）を含む９６ウェルプレートに塗布（２×１０5細胞／ウェル）した。この混合物を加湿ＣＯ2雰囲気で３７℃で３０分間インキュベートする。次に細胞を、陰性対照を除く全てのウェルにおいて１０ul ＰＭＡ＋イオノマイシン（Ionomycine）（０．１μM及び１μM最終濃度）で処理した。化合物を含まないウェルには、１０μlのＲＰＭＩ ２％ＤＭＳＯ（＝０．１％最終）を加える。細胞は、３７℃で２４時間インキュベートし、次に上清を回収（同日に使用しない場合は−２０℃で凍結）し、次いで上清についてＩＬ−２のＥＬＩＳＡ試験を実施する。
【０１２３】
ＩＬ−２ ＥＬＩＳＡ測定法：
試験化合物の存在下または非存在下で、ＰＭＡ＋イオノ−刺激ジャーカット細胞による培地へのＩＬ−２放出を、ＥＬＩＳＡにより測定する。後述の手順による
【０１２４】
溶液。
洗浄緩衝液：ＰＢＳ−ツイーン０．０５％
希釈液：ＰＢＳ−ツイーン０．０５％
基質液：クエン酸０．１Ｍ／Ｎａ2ＨＰＯ4 ０．１Ｍ
停止液：Ｈ2ＳＯ4 ２０％
マッチした抗体対／標準：
アールアンドディーシステムズ（R&D Systems）製
モノクローナル抗ヒトＩＬ−２抗体（ＭＡＢ６０２）（捕捉）
ビオチン化抗ヒトＩＬ−２抗体（ＢＡＦ２０２）（検出）
組換えヒトＩＬ−２（２０２−ＩＬ−０１０）（標準）
プレート調製
ＰＢＳに５μg/mLで希釈した１００μl捕捉抗体を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに移して、室温で一晩インキュベートする。
【０１２５】
各ウェルを吸引して、洗浄緩衝液で３回洗浄する。最後の洗浄後、プレートを湿らせる。
【０１２６】
１．２００μl ＰＢＳ−１０％ ＦＣＳで飽和させる。室温で１時間インキュベートする。
２．洗浄工程２を繰り返す。
【０１２７】
測定手順
１．１００μlの試料または標準（２０００、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５pg/mL）を加え、室温で２時間インキュベートする。
２．３回洗浄する。
３．１００μlのビオチン化抗ヒトＩＬ−２を１２．５ng/mLで加える。室温で２時間インキュベートする。
４．３回洗浄する。
５．１００μlストレプトアビジン−ＨＲＰ（ザイメド（Zymed）４３−４３２３番）を１：１０，０００で加える。室温で３０分インキュベートする。
６．３回洗浄する。
７．１００μlの基質液（クエン酸／Ｎａ2ＨＰＯ4（１：１）＋Ｈ2Ｏ2（１：２０００）＋ＯＰＤ）を加える。室温で２０〜３０分インキュベートする。
８．５０μlの停止液を各ウェルに加える。
９．５７０nmで補正して４５０nmに設定したマイクロタイタープレートリーダーを使用して、光学密度を測定する。
【０１２８】
この測定法の結果は、種々の試験化合物が、３０％＠３uMを超えるＩＬ−２の産生を低下させることを証明している。
【０１２９】
ｃ−Ｊｕｎレポーター測定法
細胞培養
Ｈｌｒ ｃ−Ｊｕｎ ＨｅＬａ細胞を、１０％ ＦＣＳ（シグマ（Sigma））、２mMグルタミン（ギブコ（Gibco））、Ｐ／Ｓ、ハイグロマイシンｂ １００μg/mL及びＧ４１８ ２５０μg/mLを補足したＤＭＥＭ高Ｇｌｃ中で培養する。
【０１３０】
細胞培養液調製
細胞バンク
細胞は、１０％ジメチルスルホキシドを含む培地中の１．８mL容量の細胞懸濁液として、液体窒素下でクリオチューブ（cryotubes）中で凍結保存する。
【０１３１】
細胞は、２０以下の継代数で培養液中に保持する。
細胞培養液解凍
必要なとき、細胞の凍結バイアルを、半完全解凍まで穏やかに渦流を起こすことによって、水浴中で３７℃で迅速に解凍する。次に細胞懸濁液を、１０mLの培地に加える。
【０１３２】
次に細胞懸濁液を、１２００rpmで５分間遠心分離して、上清を除去し、細胞ペレットを培地中で再構成して、２５mL培地を含む１７５cm2フラスコに加える。このフラスコを５％ ＣＯ2の雰囲気中３７℃でインキュベートする。
【０１３３】
細胞継代
細胞は、８０％コンフルエントな単層が得られるまで、連続して継代培養（継代）する。
【０１３４】
各フラスコの培地を除去して、単層を１０〜１５mLのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。
【０１３５】
トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を細胞単層に加え、３７℃でインキュベートして、時々細胞を移動させるために軽くたたく。細胞単層の完全な剥離及び分離は、顕微鏡観察して確認する。次に細胞を１０mLの完全培地に再懸濁して、１２００rpmで５分間遠心分離する。
【０１３６】
上清を廃棄し、細胞を培地に再懸濁して、１７５cm2フラスコ中で１／５希釈する。
【０１３７】
０日目の朝
トランスフェクションのために細胞を調製する
コンフルエントに近い培養液のフラスコからの細胞を、前記のようにトリプシンでの処理により剥離及び分離する。
【０１３８】
細胞を培地に再懸濁して数える。
細胞懸濁液を培地で希釈して、約３．５×１０6細胞/mLにして、１mLμlの細胞懸濁液を９mLの培地を含む２枚の１０cm培養皿に載せる。
【０１３９】
プレートを３７℃で空気中５％ ＣＯ2の加湿雰囲気でインキュベートする。
０日目の夕方
トランスフェクション
対照：０．２μg ｐＴＫウミシイタケ（Renilla）、５．８μg ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ、５００μlオプチメム（OPTIMEM）（ギブコ（GIBCO））、１８μlヒュージーン（Fugene）６
【０１４０】
誘導：０．１μg ｐＭＥＫＫ１、０．２μg ｐＴＫウミシイタケ、５．７μg ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ、５００μlオプチメム（ギブコ）、１８μlヒュージーン６ ３０’ＲＴ
【０１４１】
トランスフェクション混合物を培養細胞に加える。プレートを空気中５％ ＣＯ2の加湿雰囲気で３７℃で一晩インキュベートする。
【０１４２】
１日目
１ウェル当たり１００μlの培地を含む９６ウェルプレートを調製する。
陰性対照（ビヒクル）：２μlのＤＭＳＯを１００μlに加える（三重測定）。
化合物：２μlのヒット（Hit）化合物ストック希釈液を１００μlに加える（三重測定）。
【０１４３】
トランスフェクションした細胞をトリプシン処理して、１２mLの培地に再懸濁する。
【０１４４】
１００μlの希釈液を９６ウェルプレートのそれぞれに加える。
プレートを、空気中５％ ＣＯ2の加湿雰囲気で３７℃で一晩インキュベートする。
【０１４５】
ヒット化合物希釈
ヒット化合物ストック濃度は以下である：
１００％ ＤＭＳＯ中に３、１及び０．１mM。
２日目
試験手順
デュアル−ルシフェラーゼ（Dual-Luciferase）（商標）レポーター測定系（プロメガ（Promega））
【０１４６】
培地をプレートから除去して、細胞を１００μl ＰＢＳで２回洗浄する。
濯ぎ液を完全に除去してから、ＰＬＢ試薬を適用する。各培養ウェルに５μlの１×ＰＬＢを分配する。培養プレートを、穏やかに揺動／振盪する揺動プラットホームまたは軌道振盪装置に配置することによって、１×ＰＬＢが細胞単層に完全かつ一様に行きわたるのを確実にする。培養プレートを室温で１５分間揺り動かす。２０μlの溶解物を不透明白色の９６ウェルプレートに移す。照度計で読む。
【０１４７】
−５０μlのルシフェラーゼアッセイ試薬II（Luciferase Assay Reagent II）を注入し、５秒待ち、１０秒読む
【０１４８】
−５０μlのストップアンドグロ（Stop & Glo）（登録商標）試薬を注入し、５秒待ち、１０秒読む
【０１４９】
ＲＬＵルシフェラーゼ／ＲＬＵウミシイタケ*１０００をチェックする。
この測定法の結果は、種々の試験化合物が、ＪＮＫ＠１０uMの活性を２０％を超えて阻害することを証明している。
【０１５０】
マウスにおけるＬＰＳ誘導エンドトキシンショック
ＬＰＳ抗原刺激により誘導される炎症性サイトカインのレベルを有意に減少させる式Ｉに記述されるＪＮＫインヒビターの能力を、以下のプロトコールを用いて評価した：
【０１５１】
ＬＰＳ（Ｓ型アボルツス（S. abortus）−ガラノスラボ（Galanos Lab.）−）をオスのＣ５７ＢＬ／６に注射（２００μg/kg、静脈内）することにより、エンドトキシンショックを誘導し、ＬＰＳ抗原刺激の１５分前に化合物（０．１、１、１０mg/kg）またはＮａＣｌ（２００uM）を静脈内注射（１０mL/kg）した。ＬＰＳ抗原刺激後の異なる時点で眼窩からヘパリン化血を得て、この血液を９，０００rpmで４℃で１０分間遠心分離することにより、ＩＦＮγ（デュオセット（Duoset）アールアンドディー（R&D）参照ＤＹ４８５）のようなマウスＥＬＩＳＡキットによるサイトカイン産生の測定のための上清を回収した。
【０１５２】
試験化合物は、炎症関連サイトカインを減少させる顕著な能力を示した。
アレチネズミにおける全虚血
卒中発生における細胞死を防御する式Ｉに記述されるＪＮＫインヒビターの能力を、以下のプロトコールを用いて評価した：
【０１５３】
−１−方法
*手術
−麻酔：ハロタンまたはイソフルレン（０．５〜４％）。
−喉の剃毛及び皮膚の切開。
−総頚動脈（左及び右）を組織から取り出す。
−ブルドッグ（Bulldog）マイクロクランプを用いる５分間の動脈の閉鎖。
−手術面の消毒（ベタジン（Betadine）（登録商標））及び皮膚の縫合（オートクリップ（Autoclip）（登録商標）、マイケルズフックス（Michel's hooks））。
【０１５４】
−覚醒までの保温灯下の動物の安定化。
−動物舎内の動物の個別ケージ中の安定化。
*動物の屠殺
−虚血の７日後（断頭またはペントバルビタールの過剰投与）。
−脳の標本採取。
*組織学パラメーター
−イソペンタン中での脳の凍結（−２０℃）
−凍結ミクロトームを用いる海馬の切片作成（２０μm）。
−クレシルバイオレット及び／またはツネル（TUNEL）法による染色
−病変（海馬のＣＡ１／ＣＡ２サブフィールドにおける）の評価
−修飾したゲルハードとボウスト（Gerhard & Boast）スコア、または
−ＣＡ１／ＣＡ２における細胞計数
*生化学パラメーター
−大脳構造の顕微解剖
−測定パラメーター：ＤＮＡ断片化、乳酸塩、カルシウム浸透。
−分析法：ＥＬＩＳＡ、比色法、酵素学、放射測定法。
−２−処理
−試験品またはビヒクルの投与：再灌流の１５分後（麻酔の回復の５〜１０分後）。
【０１５５】
−標準的プロトコール
動物５０匹：１０匹ずつ５群（Ａ群：対照、Ｂ〜Ｄ群：３用量の試験品、そしてＥ群：対照化合物（ケタミン３×１２０mg/kg、腹腔内またはオロチン酸３×３００mg/kg、腹腔内）。
【０１５６】
試験化合物は、誘導された全虚血中のニューロンアポトーシスを防御する大きな能力を示した。
Claims (10)
- エナンチオマー、ジアステレオ異性体として光学活性型の、およびラセミ体型の幾何異性体を含む、式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体
Ａｒ1は４−クロロフェニルであり；
Ａｒ2はチエニルであり；
ＸはＯであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は水素であり；
ｎは１であり；
Ｒ6は、ヘテロアリールアミノＣ 1 〜Ｃ 6 −アルキルおよびアリールから選択され、ここで、前記ヘテロアリールは、ハロゲン、ニトロおよびトリハロメチルからなる群から選択された１〜５個の置換基で置換されていてもよいピリジルであり、前記アリールは、スルホニルで置換されていてもよいフェニルであり；あるいは
Ｒ5とＲ6は一緒に、ベンゾトリアゾリル基で置換されたピペリジノ基を形成することができる）。 - 以下の群から選択される、請求項１に記載のスルホニルアミノ酸誘導体：
４−クロロ−Ｎ−（｛５−［（｛２−［（２−｛［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）ピリジ−２−ニル］アミノ｝エチル）アミノ］−２−オキソエチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル）ベンズアミド
４−クロロ−Ｎ−［（５−｛［（２−｛［２−（｛５−ニトロピリジ−２−ニル｝アミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソエチル）アミノ］スルホニル｝チエ−２−ニル）メチル］ベンズアミド
４−クロロ−Ｎ−（｛５−［（｛２−オキソ−２−［（２−｛［３−（トリフルオロメチル）ピリジ−２−ニル］アミノ｝エチル）アミノ］エチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル）ベンズアミド
４−クロロ−Ｎ−（｛５−［（｛２−オキソ−２−［（２−｛［５−（トリフルオロメチル）ピリジ−２−ニル］アミノ｝エチル）アミノ］エチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル）ベンズアミド
Ｎ−（｛５−［（｛２−［４−（１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イル）ピペリジ−１−ニル］−２−オキソエチル｝アミノ）スルホニル］チエ−２−ニル｝メチル)−４−クロロベンズアミド
４−クロロ−Ｎ−［（５−｛［（２−オキソ−２−｛３−［（トリフルオロメチル）スルホニル］アニリノ｝エチル）アミノ］スルホニル｝チエ−２−イル）メチル］ベンズアミド - ＪＮＫ（Ｊｕｎキナーゼ）経路を阻害するための医薬組成物であって、エナンチオマー、ジアステレオ異性体として光学活性型の、およびラセミ体型の幾何異性体を含む、式Ｉのスルホニルアミノ酸誘導体
Ａｒ1は４−クロロフェニルであり；
Ａｒ2はチエニルであり；
ＸはＯであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は水素であり；
ｎは１であり；
Ｒ6は、ヘテロアリールアミノＣ 1 〜Ｃ 6 −アルキルおよびアリールから選択され、ここで、前記ヘテロアリールは、ハロゲン、ニトロおよびトリハロメチルからなる群から選択された１〜５個の置換基で置換されていてもよいピリジルであり、前記アリールは、スルホニルで置換されていてもよいフェニルである）
またはその薬剤学的に許容される塩を含有する前記医薬組成物。 - 請求項３記載のスルホニルアミノ酸誘導体またはその薬剤学的に許容される塩を含有する、神経変性疾患の治療のための医薬組成物。
- 前記神経変性疾患が、てんかん、アルツハイマー病、ハンティントン病、パーキンソン病、網膜疾患、脊髄損傷および頭部損傷から成る群から選択される、請求項４記載の医薬組成物。
- 請求項３記載のスルホニルアミノ酸誘導体またはその薬剤学的に許容される塩を含有する、自己免疫疾患の治療のための医薬組成物。
- 前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、リウマチ様関節炎、喘息、敗血症ショックおよび移植拒絶から成る群から選択される、請求項６記載の医薬組成物。
- 請求項３記載のスルホニルアミノ酸誘導体、およびその薬剤学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有する医薬組成物。
- 請求項１または２に記載のスルホニルアミノ酸誘導体の調製法であって、
ａ）スルホニル化合物Ｖを調製し、
こうして、化合物
を得て
ｃ）該化合物ＩＸを脱保護し、最後に
ｄ）Ｒ5Ｒ4ＮＨ（式中、Ｒ4およびＲ5は請求項１と同義である）で表されるアミンと結合させる、ことを含んでなる前記方法。 - 請求項１または２に記載のスルホニルアミノ酸誘導体の調製法であって、
ａ）スルホニル化合物ＶＩＩを調製し、
こうして、化合物
を得て
ｅ）脱保護し；
ｆ）Ｒ5Ｒ4ＮＨ（式中、Ｒ4およびＲ5は請求項１と同義である）で表されるアミンと結合させ；
ｇ）脱保護し；そして
ｈ）アシル化する、ことを含んでなる前記方法。
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