JP5048668B2 - OmpFと目的タンパク質の同時発現による目的タンパク質の細胞外生産方法 - Google Patents
OmpFと目的タンパク質の同時発現による目的タンパク質の細胞外生産方法 Download PDFInfo
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Description
ここで本発明者は、大腸菌から目的タンパク質を細胞の外(培養液)で効率的に分泌生産する方法を開発しようと鋭意努力した結果、大腸菌の細胞外膜タンパク質F(OmpF)と目的タンパク質とを同時発現させた時、目的タンパク質が大腸菌から細胞培養液で効率的に分泌生産され、細胞培養液に純粋な形態の目的タンパク質のみが存在するので、所望の目的タンパク質を非常に簡単な方法で分離及び精製できることが確認され、本発明を完成するに至った。
本発明者は、大腸菌OmpFを同時発現させるために組換えプラスミドベクターpACYC-OmpFを製造した。本組換えプラスミドは大腸菌OmpF遺伝子及びプローモーターとクロラムフェニコール抵抗遺伝子を含み、p15Aオリジンを有しているので、大部分の発現ベクターにおいて使用されるColE1オリジンと容易に同時発現される。OmpF遺伝子及びプローモーターは大腸菌BL21(DE3)染色体からPCR方法を利用して得た。
大腸菌BL21(DE3)から染色体を分離した後、OmpF遺伝子及びそのプローモーター領域をクローニングするために、プライマー1(5'-CGGAATTCTGGATTATACCGACGCAG-3':配列番号1)とプライマー2(5'-GCGGATCCTTAGAACTGGTAAACGATAC-3':配列番号2)を合成した。プライマー1と2を用いてPCRを行い、2160bpのPCR産物を得た。これをHidIIIとBamHIで切断した後、pACYC184(New England Biolabsd, 米国)にクローニングした。これを大腸菌XL1-Blue[supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi relA1 lacF'(proAB+lacIqlacZΔM15Tn(tetr))]で形質転換して組換えプラスミドpACYC-OmpFを得た(図1)。
大腸菌W3110(derived from E. coli K-12, λ−, F−, prototrophic)から染色体を分離した後、アルカリ・ホスファターゼ遺伝子を確保するためにプライマー3(5'-GGACTGCAGCACGGACACCAGAAATGCCTGTT-3':配列番号3)とプライマー4(5'-GCGGGATCCTTATTATTTCAGCCCCAGAGCCGG-3':配列番号4)を合成して、これを用いてPCRを行った。PCR条件は次のようである。第一変性(denaturation)は、94℃で5分間一度して、その後第二変性(denaturation)は、94℃で45秒間、アニーリング(annealing)は、52℃で45秒間、延長(extension)は、72℃で1分10秒間ずつ行い、これを30回繰り返した。以後、72℃で7分間最後の延長(extension)を一度行なった。前記PCRによって得られたDNAをアガロース・ゲル電気泳動して、約1360bpの大きさのDNA切片を分離し、これを二つの制限酵素PstIとBamHIで切断した。これと同時に組換えプラスミドpJS101ΔP(Choi, J.H., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 53:640, 2000)を二つの制限酵素PstIとBamHIで切断してエンドキシラナーゼ遺伝子を除去した後、これを前記から得られたDNA切片と共に混合した後、T4DNAリガーゼを使用して連結させ、組換えプラスミドpTrcS1PhoAを得た。
大腸菌BL21(DE3)を組換えプラスミドpACYC-OmpFとpTrcS1PhoAで同時に形質転換した。形質転換方法としてはエレクトロポレーション(electroporation)方法を用いて、形質転換菌株は抗生剤アンピシリン(50μg/L)とクロラムフェニコール(34μg/L)が添加されたLB平板培地で選択した。このように形質転換された菌株をLB液体培地(トリプトン10g/L, yeast extract 5g/L, NaCl 5g/L)に接種して30℃で培養した後、アルカリ・ホスファターゼの細胞外分泌の程度を検査した。液体培地に接種した後、分光光度計により600nm波長において測定された光学密度(O.D.)が0.7となる時点で、0.1及び1.0mMのIPTGを添加して遺伝子発現を誘導した。誘導発現12時間後に培養液1mLずつを取り、アルカリ・ホスファターゼ活性を測定して同時に培養液1mLをSDS-PAGEゲル上で分析した(図2)。図2において、Mはタンパク質の標準分子量であり、1は0.1mMのIPTGによって誘導発現12時間後にpACYC-OmpFとpTrcS1PhoAで形質転換された大腸菌BL21(DE3)培養液をSDS-PAGEゲル上で分析した結果である。図2に示したように、約50kDaにあたるアルカリ・ホスファターゼを確認することができ、これは本システムが目的タンパク質を非常に効率的に培養液で分泌させることができるということを示したものである。すなわち、大腸菌からアルカリ・ホスファターゼの分泌があったことが分かり、その量をブラッドフォード(Bradford)方法で定量した結果、培養液からアルカリ・ホスファターゼが約0.1g/Lで水溶性形態に生産されることが確認された。
アルカリ・ホスファターゼの活性測定は次のような方法で行った(Brickman and Beckwith, J Mol. Biol., 96:307, 1975)。組換えプラスミドpACYC-OmpFとpTrcS1PhoAを有している組換え大腸菌BL21(DE3)を50mLのLB培地が入っている250mLフラスコに接種して37℃で培養した。分光光度計により600nm波長において測定された光学密度(O.D.)が0.7となる時点で、1mMのIPTGを添加して遺伝子発現を誘導し、誘導発現12時間後に培養液1mLずつを取った後、ここにクロロホルム(chlroform)0.1mLを添加した後、37℃で5分間反応させた。反応後0.4%PNPP(p-Nitrophenyl phosphate)を0.1mL添加した後、また37℃で5分間反応させた。5分間反応した後1M K2HPO4溶液を0.1mL添加して反応を停止させた。このように得られた反応液を50mMのTris-HCl溶液で適切に希釈させた後、分光光度計により420nmと550nmの二つの波長において吸光度を測定した。この時、対照試験としてプラスミドを有していない大腸菌BL21(DE3)とpTrcS1PhoAで形質転換されたBL21(DE3)培養液から同一方法で活性を測定した。活性度は次の式により求め、その結果は表1のようである。
大腸菌BL21(DE3)に組換えプラスミドpACYC-OmpFとpTrcS1PhoAを同時に導入した。形質転換方法はエレクトロポレーション方法を利用し、形質転換菌株は抗生剤アンピシリン(50μg/L)とクロラムフェニコール(34μg/L)が添加されているLB平板培地から選択された。このように形質転換された菌株を多様なNaCl2濃度を有するLB液体培地(トリプトン10g/L, yeast extract5g/L, NaCl 0, 1, 5, 10g/L)に接種して30℃で培養した後、アルカリ・ホスファターゼの細胞外分泌の程度を検査した。液体培地で接種した後、分光光度計により600nm波長において測定された光学密度(O.D.)が0.7となる時点で、0.1及び1.0mMのIPTGを添加して遺伝子発現を誘導した。誘導発現12時間後に培養液1mLずつを取ってSDS-PAGEゲル上で分析した(図4)。図4において、Mはタンパク質の標準分子量であり、1-4は0.1mMのIPTGによって誘導発現12時間後にpACYC-OmpFとpTrcS1PhoAで形質転換された大腸菌BL21(DE3)培養液をSDS-PAGEゲル上で分析した結果であって、ライン1-4はそれぞれお互いに違うNaCl2濃度を有するLB液体培地(トリプトン10g/L, yeast extract 5g/L, NaCl 0, 1, 5, 10g/L)で培養した後、得られたサンプルである。図4に示したように、約50kDaにあたるアルカリ・ホスファターゼのタンパク質を確認することができ、特にNaCl2の濃度が0から10g/Lに増加することによって培養液で分泌されるアルカリ・ホスファターゼが増加されることが確認された。
Claims (16)
- OmpFをコードする遺伝子を含む組換えベクターと目的タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記目的タンパク質を微生物の周辺細胞質に発現及び分泌させることができる組換えベクターとで、同時に形質転換され、OmpFをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子とが、各々独立的に同時に発現され、目的タンパク質を細胞外(培養液)に分泌生産できる特性を有する組換え微生物。
- OmpFをコードする遺伝子を発現させることができるようにOmpFをコードする遺伝子とそのプローモーターとを染色体に導入した組換え微生物に、目的タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記目的タンパク質を微生物の周辺細胞質に発現及び分泌させることができる組換えベクターを導入して得られ、OmpFをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子とが、各々独立的に同時発現され、目的タンパク質を細胞外(培養液)に分泌生産できる特性を有する組換え微生物。
- OmpFをコードする遺伝子を含む組換えベクターと目的タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターとが、同じ条件で発現されるオリジンを有することを特徴とする請求項1に記載の組換え微生物。
- OmpFをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターが、各々p15A及びColE1オリジンを有することを特徴とする請求項1又は3に記載の組換え微生物。
- OmpFをコードする遺伝子を含む組換えベクターが、OmpF自体のプローモーターを有することを特徴とする請求項1及び3〜4のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- OmpFをコードする遺伝子を含む組換えベクターはpACYC−OmpFであることを特徴とする請求項1及び3〜5のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- OmpFをコードする遺伝子が、大腸菌由来であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 大腸菌であることを特徴とする請求項1〜7のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 次の段階を含む目的タンパク質の細胞外分泌生産方法:
(a)請求項1〜6の何れか一項に記載の組換え微生物を培養して目的タンパク質を細胞外(培養液)に分泌させる段階;及び
(b)前記培養液から目的タンパク質を回収する段階。 - 前記(a)段階で目的タンパク質の細胞外分泌が、微生物の溶解を伴わないことを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 目的タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記目的タンパク質を微生物の周辺細胞質に発現及び分泌させることができるベクターにOmpFをコードする遺伝子を導入して作製し、発現する時、OmpFをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子とが、各々独立的に同時に発現され、目的タンパク質を細胞外(培養液)に分泌できる特性を有する組換えベクター。
- OmpFをコードする遺伝子が、大腸菌由来であることを特徴とする請求項11に記載の組換えベクター。
- 請求項11の組換えベクターで形質転換された微生物。
- 大腸菌であることを特徴とする請求項13に記載の微生物。
- 次の段階を含む目的タンパク質の細胞外分泌生産方法:
(a)請求項13または14の微生物を培養して目的タンパク質を細胞外(培養液)に分泌させる段階;及び
(b)前記培養液から目的タンパク質を回収する段階。 - 前記(a)段階で目的タンパク質の細胞外分泌が、微生物の溶解を伴わないことを特徴とする請求項15に記載の方法。
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