JP5027502B2 - 骨粗鬆症予防または治療剤 - Google Patents

Description

本発明は、骨粗鬆症予防または治療剤として有用なクズ（葛、Pueraria属植物）の根もしくは茎の水溶性画分およびそれを含有する医薬品および飲食品に関する。

日本人の平均寿命は男女とも世界一で、近年人口に占める高齢者の割合も年々増加している。高齢化に従い、骨密度が低下し、骨がもろくなる骨粗鬆症の患者が増え大きな社会的問題となっている。骨粗鬆症は閉経後の女性に多く見られ、老人性疾患の代表的なものとして挙げられる。骨粗鬆症になると骨の湾曲や激しい痛み、骨折などの症状が見られ、これらは寝たきりの大きな要因となる。寝たきりの状態が長く続くと、痴呆を引き起こす危険性も増してくることから、高齢者のQOL（Quality of Life）をあげるためにも、骨粗鬆症の予防や早期の治療が重要な課題となっている。
骨粗鬆症の治療薬としてはカルシウム製剤、活性型ビタミンD、蛋白同化ホルモン、骨吸収抑制剤等があげられるが、有効性が高いものほど安全域と中毒域の差が狭く投与量の調整が難しい。また、長期投与した場合の安全性に問題があるものも多い。

マメ科植物が多く含有するイソフラボン類には骨粗鬆症予防および改善効果があることが知られており、大豆に関してはダイゼニン、ゲニステインといったイソフラボンが同効果の本体と同定され機能性食品素材として報告されている（特許文献１参照）。
クズ（葛、Pueraria属植物）はアジア原産の多年生マメ科のツル性植物で対荒地性が大きく成長力が旺盛で、世界の中緯度・温帯域で最も繁茂している植物資源であるが、食品としては根のデンプン以外は未利用である。クズもマメ科であり、イソフラボン類含量が多いと推定され、葛根そのものの骨粗鬆症効果に関して検証し、薬としての治療剤利用は既に報告されている（特許文献２）。しかしながら、これまでに抽出物の機能を明らかにした例はなく、また、イソフラボン類のどの物質が効果の本体であるか明らかではなかった。
特開平９−３０９９０２号公報 特開２００３−９５９７１号公報

斯かる状況下、本発明は現在使用されている骨粗鬆症の予防または治療剤、合成ホルモン製剤とは異なり、副作用が少なく、日常的に飲食物として簡単に摂取することにより骨吸収上昇を抑制することで、骨粗鬆症の予防や改善に有効な薬剤、医薬品、飲食品を提供することを目的としている。

本発明者らは上述した問題点を解決するために鋭意研究を行った結果、日本で古くから漢方薬として利用されているクズの根、茎および花の水溶性抽出物に優れた骨吸収抑制作用を見出し、さらに検討を重ね、本発明を完成した。
すなわち、本発明はクズの根、茎および花の水溶性抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防または治療剤に関する。

本発明によれば、対荒地性が大きく成長力が旺盛で、世界の中緯度・温帯域で最も繁茂している植物資源であるが、食品としては根のデンプン以外は未利用であるクズを有効利用することができる。本発明のクズの根もしくは茎もしくは花より抽出される水溶性画分は、骨吸収抑制作用があり、骨粗鬆症等、更年期障害の予防改善に効果のある飲食品、医薬品として有用である。

実施例２において根、多年生茎、一年生茎、葉の各試料のイソフラボン含量を示すHPLC分析の結果を示す図である。 実施例２において、花抽出粉末のイソフラボン含量を示すHPLC分析の結果を示す図である。 卵巣摘出骨粗鬆症モデル動物の骨吸収に対する、クズの根のエタノール抽出物の抑制作用を、骨代謝マーカーであるPyr、Dpyrの変化を量ることで検証した結果を示すグラフである。 卵巣摘出骨粗鬆症モデル動物の骨吸収に対する、クズの多年生茎のエタノール抽出物の抑制作用を、骨代謝マーカーであるPyr、Dpyrの変化を量ることで検証した結果を示すグラフである。 卵巣摘出骨粗鬆症モデル動物の骨吸収に対する、クズの根および茎の抽出物に多く存在するプエラリン（puerarin）の抑制作用を、骨代謝マーカーであるPyr、Dpyrの変化を量ることで検証した結果を示すグラフである

従って、クズ成分中のイソフラボン類の骨粗鬆症予防または治療効果作用を明らかにし、かつ活性成分の効率的調製法を確立すれば有効な食品素材として利用できると考え本発明に着手した。また根以外の、例えば現状、放置・廃棄されている自生茎をはじめ他の組織からも有効成分が調製できないかという考えの下に、クズの根、葉、一年生茎、多年生茎、花よりそれぞれ水溶性画分を抽出し、骨代謝抑制作用を調べ、根および茎抽出物に優れた骨粗鬆症予防および治療作用があることを見出した。更には、分画精製を行い、その活性本体がイソフラボン類、特にクズ特有成分のプエラリン（puerarin）にあることを明らかにし、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。

本発明の水溶性画分はクズの根もしくは茎もしくは花の生もしくは乾燥したものを裁断し、または粉砕することにより、あるいはそれらを適当な溶媒で抽出することにより製造される。抽出溶媒としては例えば水、エタノール、メタノールプロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン等の親水性溶媒が挙げられ、これらは単独でも２種類以上を混合しても良い。特に水およびエタノールを単独あるいはこれらを任意の比率で混合した混合溶媒系が安全性の点で好ましい。
抽出条件は任意に定めることが出来る。例えば、クズの茎の破砕物を３〜５倍程度の抽出溶媒に常温または加熱下に１〜５時間浸漬するだけで抽出を行うことができる。抽出液は、ろ過または遠心分離により固形物を除去した後、そのまま使用しても良いが、公知の適当な方法で抽出溶媒を留去し、抽出エキスとして使用しても良く、または乾燥して使用することもできる。
また、クズ由来の澱粉は広く知られている食品素材であるが、その製造はクズの根に、水を加え、懸濁、沈殿、分離という操作の何度繰り返しにより、澱粉を精製している。この加工過程中に、できた晒し水を抽出液として、製造することも可能である。

本発明の骨粗鬆症予防および治療作用を示す水溶性画分中の活性成分に関しては、クズが豆化植物であることからイソフラボン類であると予想される。事実、本発明者らは、水溶性画分中の重量比にして１０〜５０％がイソフラボン類であるとことを確認している。イソフラボン類の組成としては、大豆にも含まれるダイジン（daizin）、ゲニスチン（genistin）も存在するが、クズ特有成分のプエラリン（puerarin）が重量比にして３０%〜９０%存在することに特徴がある。
本発明の骨粗鬆症予防および治療作用のある水溶性画分は、広い範囲の容量に亘って投与することができ、抽出物固形換算で、通常、体重１ｋｇに対して、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜５０ｍｇであるが、投与されるものの性別、年齢、体重などを考慮して適宜決定される。

本発明のクズの水溶性画分を有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防または治療用飲食品としては、ジュース、健康茶のような飲料、乳飲料、乳酸飲料、コーヒー飲料、ヨーグルト、ゼリー、ガム、キャンディー、アイス、麺類、顆粒、カプセル、錠菓、などの菓子類、健康食品類など種々の形態が挙げられる。また、その配合量は、その製剤形、期待される骨粗鬆症予防または治療作用の程度により異なるが、素材自体の味が食品に悪影響を及ぼさない濃度で用いるのが好ましい。通常、０．０１〜１０．０重量％、好ましくは０．１〜５．０重量％配合するのが適当である。ただし、食品の呈味性に問題ない場合はこの範囲に限らない。さらには、定法に従って、潤沢剤、乳化剤、懸濁化剤、酸化防止剤、甘味剤、香味剤などを添加することができる。
次に実施例および試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

［製造例１］クズのエタノール抽出物粉末の製造
クズの乾燥根および乾燥多年生茎各５００ｇをハサミまたは包丁で裁断し、それぞれポッター型のホモジナイザーで粉砕した後、３０メッシュのふるいを通し、微粉末とした。この微粉末を、３．５倍量（Ｗ／Ｖ）の９９．５％エタノールにて２５℃で１時間撹拌、抽出後、３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行い、上清のアルコール可溶性画分を得た。この可溶性画分を減圧濃縮後凍結乾燥し、乾燥根より２５ｇ、乾燥多年生茎より１５ｇの粉末を得て、それぞれエタノール抽出粉末とした。
［製造例２］クズのメタノール抽出物粉末の製造
クズの乾燥花１５ｇを１５０ｍｌの１００％メタノール（或いは水）に浸漬し、４時間、室温で抽出し、濾過した。更に残渣をメタノール（或いは水）で２回抽出し、得られた溶液をあわせて、減圧濃縮後、凍結乾燥した。メタノールより１．４７ｇ、水より３．５８ｇの粉末を得て、それぞれメタノール抽出粉物、水抽出粉物とした。

［抽出物中のイソフラボンの含量］
実施例１［製造例１］のクズの根及び多年生茎の各エタノール抽出粉末、実施例１と同様の方法で調製した１年生茎及び葉の各エタノール抽出粉末、実施例１の９９．５％エタノールを水に代えて同様に調製した根、多年生茎、１年生茎及び葉の各抽出粉末をそれぞれ７０％エタノールに溶解、ろ過して得た溶液を下記の条件でＨＰＬＣ分析に供した。その結果を図１に示す。根には及ばないものの、多年生茎にも多量のイソフラボンが含まれていることが分かった。
また、実施例１［製造例２］のクズの花のメタノール抽出粉物、水抽出粉物をそれぞれ７０％エタノールに溶解、濾過して得た溶液を同様にＨＰＬＣ分析に供した。その結果を図２に示す。根、茎にはおよばないものの、花にもイソフラボンが含まれていることが分かった。
［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム：Inertsil ODS-3
(250mm×4.6mmI.D.、５μm、GL-Science社製)
ガードカラム（50mm×4.6mmI.D.）に取付けた。
溶離液：A−10％アセトニトリル水溶液（0.1％ギ酸含有）
B−35%アセトニトリル水溶液（0.1％ギ酸含有）
グラジエント条件：
A：B＝１００：０→１５：７５（0〜60min）
１５：７５→０：１００（60〜70min）
０：１００→０：１００（70〜85min）
カラム温度：45℃
流速：1.0ml/min
検出器：ＵＶ260nm

［製造例３］クズ澱粉さらし水からの抽出物の製造
クズ澱粉製造過程で発生する排水である「さらし水」１０００ｍｌをろ過し、スチレン系合成吸着樹脂を充填したカラムに空間速度＝１、常温で通液した。続いて純水２カラム容量以上を通液することによりカラムを洗浄後、６５％エタノールを同様に３カラム容量以上通液しポリフェノール類を溶出させた。エタノール溶液により回収した溶出液を減圧濃縮後、凍結乾燥し、プエラリン８０％以上からなるイソフラボン類を３４．１％含有する抽出乾燥物９．５６ｇが得られた。

［薬理試験例１］クズの根のエタノール抽出物粉末による骨粗鬆症モデル動物の骨吸収抑制作用
骨粗鬆症モデルマウスは、１０週齢以上の雌ddyマウスの卵巣を摘出することで作製できる（Endocrinology、vol.140、page1893-1900（1999））。また、コントロールとして擬似手術（sham）マウスを作製した。
手術後２週間馴らし飼育後、一群７〜８匹の卵巣摘出群およびコントロール群ほかのマウスを代謝ケージで一匹ずつ飼育し、尿を毎日採取した。その後、各群について尿中への骨代謝マーカであるピリジノリン（pyridinoline、Pyr）とデオキシピリジノリン（deoxypyridinoline、Dpyr）の排出量を測定した。
卵巣摘出に伴うPyrとDpyr尿中への排出が昂進した、すなわち骨粗鬆症の症状の現れたことを確認後、実施例１記載のクズの根のエタノール抽出物を蒸留水に溶解し、マウス用経口ゾンデにて１日、１回体重ｋｇ当たり５０ｍｇの用量で２週間経口投与した。食餌は、一般のマウス用試料を自由摂取させた。それらのマウスの尿を毎日集め尿中のPyrとDpyr排出量を定量した。
結果は図２に示されているとおりである。すなわち卵巣摘出後、４週間で元のレベルの約３倍に上昇したPyrとDpyrは、クズ茎のエタノール抽出物を一日に体重ｋｇ当たり５０ｍｇを経口投与した結果、投与２日目から低下し始め、１週間後には元のレベルに戻った。さらに１週間投与を続けたあと投与を停止し、さらに尿中PyrとDpyrレベルを定量した。この効果は、停止後も持続し尿中Pyrに関しては約３ヶ月効果が持続した。
その後再び尿中PyrとDpyrは増加するが、この再上昇が、元の通常レベルの３倍に達したとき、５０ｍｇ／ｋｇの用量で２回目の投与を行うと、尿中のPyrとDpyrレベルは、いずれの場合も２日目から低下し始め、４日から６日で元の正常値に戻った。従って、クズ根のエタノール抽出物の経口投与は、骨粗鬆症モデルマウスの骨吸収を正常なレベルに戻す作用を有することが証明された。
一方、卵巣摘出後、クズを投与しないマウス群では、投与したマウスと比べて、PyrとDpyrのレベルは高値のままであった。
体重、餌の摂取量はどの群もあまり変化がなかったことから、Pyr、Dpyrの変化率はクズ投与の影響に左右されないと考えられる。

［薬理試験例２］クズの多年生茎のアルコール抽出物粉末による骨粗鬆症モデル動物の骨吸収抑制作用
実施例４［薬理試験例１］に示した方法で骨粗鬆症モデルマウスを作製した。すなわち生後９８日目に卵巣摘出を行い、３週間飼育した後、３週間尿中のPyrとDpyrを測定した。卵巣摘出に伴うPyrとDpyr尿中への排出が昂進した、すなわち骨粗鬆症の症状の現れたことを確認後、２週間連続して、クズの多年生茎のエタノール抽出物を蒸留水に溶解し、マウス用経口ゾンデにて１日１回 体重ｋｇ当たり２０ｍｇ、５０ｍｇの用量で２週間与えた（２０ｍｇ／ｋｇ群７匹、５０ｍｇ／ｋｇ群８匹）。食餌は、一般のマウス用試料を自由摂取させた。それらのマウスの尿を毎日集め尿中のPyrとDpyr排出量を定量した。
同時に、コントロールとして、卵巣摘出したマウスに蒸留水のみを経口投与した群（７匹）、擬似手術マウス群（Shamマウス：7匹）の尿中PyrとDpyrの測定を行った。
結果は図３に示されているとおりである。すなわち卵巣摘出後、６週間で元のレベルの約３倍に上昇したPyrとDpyrは、実施例１記載のクズの多年生茎のエタノール抽出物を一日に、体重ｋｇ当たり２０および５０ｍｇを経口投与した結果、投与２日目から低下し始め、４日後には元のレベルに戻った。さらに１０日間投与を続けたあと投与を停止し、さらに尿中PyrおよびDpyrレベルを定量した。投与を中止するとPyrとDpyr共に少しの期間の後、上昇した。
従って、クズの多年生茎のエタノール抽出物の経口投与は、用量依存的に骨粗鬆症モデルマウスの骨吸収を正常なレベルに戻す作用を有することが証明された。一方、卵巣摘出後、クズを投与しないマウス群では、投与したマウスと比べて、PyrとDpyrのレベルは、高値のままであった。
体重、餌の摂取量は、どの群もあまり変化がなかったことから、Pyr、Dpyrの変化率はクズ投与の影響に左右されないと考えられる。

［薬理試験例３］プエラリン（puerarin）による骨粗鬆症モデル動物の骨吸収抑制作用
実施例５［薬理試験例２］で用いた、生後９８日目に卵巣摘出を行い、クズの多年生茎のエタノール抽出物の経口投与を停止したマウスを用いて、抽出物中のイソフラボンの主要成分であるプエラリン投与の効果を確認した。尿中Pyr、Dpyr量が高いレベルに達したことを確認後、生後２４０日目から連続してプエラリン（puerarin）（５ｍｇ／ｋｇ群７匹）の経口投与を行った。
結果は図４に示されているとおりである。すなわち、投与後、２日目から尿中Pyr量は有意に減少し始め、元のレベルまで戻ることが確認された。尿中Dpyr量はコントロール群にも、多少の上下が見られたが、比較するとプエラリン投与群で投与２日目から減少することが確認された。

［錠剤、カプセル剤］
実施例５で用いたクズの根のエタノール抽出物を５．５ｇ、結晶セルロース４．１ｇ、微粒二酸化ケイ素０．２ｇ、ショ糖脂肪酸エステル０．２ｇの合計１０．０ｇ上記の各重量部を均一に混合し、常法に従って錠剤、カプセル剤とした。

［果汁飲料］
実施例５で用いたクズの多年草茎のエタノール抽出物０．４５ｇ、りんご透明濃縮果汁１５．０ｇ、果糖５．０ｇ、クエン酸０．２ｇ、香料２．０ｇ、色素０．１５ｇ、アスコルビン酸ナトリウム０．０５ｇ、水７７．１５ｍｌ、上記の各成分の組成により果汁飲料を製造した。

［茶飲料］
実施例５で用いたクズの多年草茎のエタノール抽出物２ｇ、緑茶粉末１０ｇ、アスコルビン酸ナトリウム０．３ｇ、熱水１０００ｍｌ、上記の各成分の組成により茶飲料を製造した。

Claims (1)

1. クズの多年生茎をエタノールで抽出し、得られる抽出液を濃縮し、乾燥して得られたプエラリンを３０％以上含むイソフラボンを有効成分とする骨粗鬆症予防または骨粗鬆症治療剤。