JP5026268B2 - 腫瘍特異的抗体 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒト腫瘍特異的結合タンパク質およびそれらの全ての使用に関する。特に、本発明は、癌細胞上の抗原または分子に特異的な抗体または抗体フラグメントおよび本発明の結合タンパク質を含む免疫複合体、およびそれらを使用する方法に関する。
2000年には、推定2200万人の人が世界中で癌に罹患し、620万例の死亡はこのクラスの疾病に原因があった。毎年、1000万例を越える新たな症例が出現し、この推定値は次の15年で50%増加することが予想されている(WHO, World Cancer Report. Bernard W. Stewart and Paul Kleihues, eds. IARC Press, Lyon, 2003)。現在の癌治療は侵襲的手術、放射線療法および化学療法に限られており、それらは全て重症となる可能性のある副作用、非特異的毒性および/またはボディイメージおよび/または生活の質のトラウマ的変化を生ずる。癌は化学療法に不応性となり、さらなる治療の選択肢を狭め、成功の可能性を低くすることがある。一部の癌の予後は他の癌より不良であり、肺癌または膵臓癌のような一部の癌はほとんど常に致死的である。また、乳癌などの比較的治療成功率の高い一部の癌も非常に高い発現頻度を有し、従って主要な死因となっている。
本発明者らは、膀胱、***、卵巣、前立腺および子宮を含む数種類の腫瘍細胞に結合するヒト腫瘍特異的抗体を作製した。重要なことに、本発明の抗体は正常組織にあまり結合せず、それらは腫瘍治療の好適な候補となっている。本発明者らは本発明の抗体をクローニングし、配列決定し、抗体軽鎖および重鎖可変領域および相補性決定領域1、2および3の配列を決定した。従って、本発明は、それぞれ、アミノ酸配列
を含む単離軽鎖相補性決定領域1、2および3ならびにそれぞれ、アミノ酸配列
を含む単離重鎖相補性決定領域1、2および3を提供する。
を含む、軽鎖相補性決定領域1、2および/または3をコードする単離核酸配列ならびにそれぞれ、アミノ酸配列
を含む、重鎖相補性決定領域1、2および/または3をコードする単離核酸配列も提供する。
を含むタンパク質に結合する本発明の結合タンパク質を提供する。本発明はまた、CD44E;α-フェトプロテイン;47〜53 kDaの分子量および5.2〜5.5、好ましくは5.4の等電点を有するタンパク質;48〜54 kDaの分子量および5.1〜5.4、好ましくは5.2の等電点を有するタンパク質;またはAFPのアミノ酸配列107〜487(SEQ ID NO:14)、AFPの107〜590(SEQ ID NO:15)またはAFPの107〜609(SEQ ID NO:16)を含むタンパク質に結合する本発明の結合タンパク質を提供する。
(1) 結合タンパク質-抗原複合体の形成を可能にする条件下において、哺乳類から採取した試験試料と癌細胞上または癌細胞内の抗原に結合する本発明の結合タンパク質を接触させる段階;
(2)試験試料において結合タンパク質-抗原複合体の量を測定する段階;および
(3)試験試料の結合タンパク質-抗原複合体の量を対照と比較する段階
を含む方法である。
(1) 結合タンパク質-α-フェトプロテイン複合体の形成を可能にする条件下において、哺乳類から採取した試験試料とα-フェトプロテインまたはその変種に特異的に結合する本発明の結合タンパク質を接触させる段階;
(2)試験試料において結合タンパク質-α-フェトプロテイン複合体の量を測定する段階;および
(3)試験試料の結合タンパク質-α-フェトプロテイン複合体の量を対照と比較する段階
を含む方法である。
(A)定義
本明細書において使用される「全身投与する」という用語は、免疫抱合体および/または他の癌治療薬を、注射(皮下、静脈内、筋肉内等)、経口投与、吸入、経皮投与または局所適用(局所クリームまたは軟膏等など)、坐薬適用またはインプラント手段などの従来の方法で全身投与することができることを意味する。インプラントは、シアラスティック(sialastic)膜または線維などの膜を含む多孔性、非多孔性またはゼラチン性材料であってもよい。座薬は、一般に、0.5重量%〜10重量%の範囲の作用成分を含有する。
を含むタンパク質に結合する抗体または抗体フラグメントを含む。
を有する。
(i)軽鎖および重鎖相補性決定領域ならびに軽鎖および重鎖可変領域
本発明は、アミノ酸配列
を含む単離軽鎖相補性決定領域1を提供する。本発明はまた、アミノ酸配列EDTKRPS(SEQ ID NO:2)を含むアミノ酸配列を含む単離軽鎖相補性決定領域2を提供する。また、本発明は、アミノ酸配列QAWDSRTEI(SEQ ID NO:3)を含む単離軽鎖相補性決定領域3を提供する。
を含む単離軽鎖相補性決定領域1を提供する。本発明はまた、アミノ酸配列
を含む単離軽鎖相補性決定領域2を提供する。また、本発明は、アミノ酸配列
を含む単離軽鎖相補性決定領域3を提供する。
を含む軽鎖相補性決定領域1、2および/または3をコードする単離核酸配列ならびにそれぞれ、アミノ酸配列
を含む重鎖相補性決定領域1、2および/または3をコードする単離核酸配列を提供する。本発明はまた、上記に考察されているCDR配列の変種をコードする単離核酸配列を提供する。本発明のCDR配列の変種をコードする核酸配列は、少なくとも中程度ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、SEQ ID NO:1〜6に示すアミノ酸配列をコードするCDR配列にハイブリダーゼーションする核酸配列を含む。
本発明の別の局面は、本発明の少なくとも1つの軽鎖相補性決定領域(すなわち、SEQ ID NO:1〜3の1つ以上)および/または本発明の少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(すなわち、SEQ ID NO:4〜6の1つ以上)を含む、結合タンパク質、好ましくは抗体または抗体フラグメントである。このような結合タンパク質は、一般に、本発明の「結合タンパク質」または好ましくは「本発明の抗体もしくは抗体フラグメント」と本明細書においていうことができる。
を含む、軽鎖相補性決定領域1、2および3ならびにそれぞれ、アミノ酸配列
を含む重鎖相補性決定領域1、2および3を含む。本発明はまた、本発明の軽鎖可変領域および/または本発明の重鎖可変領域を含む結合タンパク質、好ましくは抗体または抗体フラグメントを提供する。
、アミノ酸SEQ ID NO:14、15もしくは16、または47〜53 kDaの分子量および5.2〜5.5の等電点を有するタンパク質;48〜54 kDaの分子量および5.1〜5.4の等電点を有するタンパク質、CD44Eまたはα-フェトプロテインもしくはその変種に結合することができる。
を含むタンパク質に結合する本発明の結合タンパク質を提供する。本発明はまた、CD44E;α-フェトプロテイン;47〜53 kDaの分子量および5.2〜5.5、好ましくは5.4の等電点を有するタンパク質;48〜54 kDaの分子量および5.1〜5.4、好ましくは5.2の等電点を有するタンパク質;またはAFPのアミノ酸配列107〜487(SEQ ID NO:14)、AFPの107〜590(SEQ ID NO:15)またはAFPの107〜609(SEQ ID NO:16)を含むタンパク質に結合する本発明の結合タンパク質を提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:38、39、40、41、42、43、44または45を含み、47〜53 kDaの分子量および5.2〜5.5の等電点を有するタンパク質;またはSEQ ID NO:46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74または75を含み、48〜54 kDaの分子量および5.1〜5.4の等電点を有するタンパク質に結合する本発明の結合タンパク質を提供する。
(式中、PI=阻害率;MF(Ab1+Ab2)=Ab1+Ab2混合物の中央蛍光値;およびMFBgd=PBS-5%FCSのバックグラウンド中央蛍光値)。
(1)一定数の腫瘍細胞と、一定数の腫瘍細胞に最大結合を生じる本発明の最小濃度の結合タンパク質、好ましくは抗体または抗体フラグメント(Ab1)をインキュベーションして、Ab1の中央蛍光値(MFAb1)を測定する段階;
(2)Ab1および腫瘍細胞に試験結合タンパク質(Ab2)を添加することによって2つ以上の濃度のAb2を試験し、中央蛍光値(MF(Ab1+Ab2))を測定する段階;
(3)バックグラウンド中央蛍光値(MFbgd)を測定する段階;
(4)PI(ここで、PI=[(MF(Ab1+Ab2)-MFBgd)/(MFAb1-MFBgd)]×100)
を算出する段階;ならびに
(5)PIと対照PI値を比較する段階
を含み;
対照PIと統計学的に有意な差を有するPIは、試験結合タンパク質が腫瘍細胞の抗原に結合できることを示す方法によって同定することができる結合タンパク質を提供する。
(1)一定数の腫瘍細胞と、一定数の腫瘍細胞に対する最大結合を生じる最小濃度の試験結合タンパク質(Ab2)をインキュベーションして、Ab2の中央蛍光値(MFAb2)を測定する段階;
(2)SEQ ID NO:28によって規定されるモル過剰量のペプチドと最小濃度の試験結合タンパク質(Ab2)をインキュベーションすることによって、ペプチドおよびAb2混合物を調製する段階;
(3)腫瘍細胞に混合物を添加して、中央蛍光値(MF(Ab2+ペプチド))を測定する段階;
(4)バックグラウンド中央蛍光値(MFbgd)を測定する段階;
(5) PI(ここで、PI=[(MF(Ab2+ペプチド)-MFBgd)/(MFAb2-MFBgd)]×100)
を算出する段階;および
(6) PIと対照PI値を比較する段階
を含み;
対照PIと統計学的に有意な差を有するPIは、試験結合タンパク質が腫瘍細胞の抗原に結合できることを示す方法によって同定することができる結合タンパク質を提供する。
本発明はまた、(2)エフェクター分子に結合している、(1)本発明の結合タンパク質、好ましくは抗体または抗体フラグメントを含む免疫抱合体を含む。一態様において、本発明の結合タンパク質は、癌細胞上または癌細胞内の抗原または分子に結合する。
軽鎖および重鎖相補性決定領域、軽鎖および重鎖可変領域、抗体および抗体フラグメントならびに免疫抱合体などの本発明のタンパク質は、いくつかの方法のいずれかにおいて作製することができるが、最も好ましくは、組換え方法を使用して作製することができることを当業者は理解している。
本発明者らは、本発明の結合タンパク質はCD44Eの細胞外ドメインに結合することおよび本発明の結合タンパク質は内部移行されることを示した。従って、本発明の結合タンパク質は、造影剤、放射性医用製剤または細胞障害剤などの生物活性剤または医学的関連剤の標的送達のために使用することができる。
本発明の結合タンパク質は、癌細胞または癌細胞によって内部移行される分子に選択的に結合するが、正常細胞にはあまり結合しない。従って、結合タンパク質を癌の診断に使用することができる。上記に陳述するように、本発明者らは、本発明の結合タンパク質はCD44Eの細胞外ドメインに結合することを示した。本発明者らはまた、本発明の結合タンパク質はAFPまたはその変種に結合することも示した。AFPは、異常増殖、細胞形質転換および癌に関連する。従って、腫瘍抗原に対する結合タンパク質の特異性により、それは癌の診断において有用になる。
(1)結合タンパク質-抗原複合体の形成を可能にする条件下において、哺乳類から採取した試験試料と癌細胞上または癌細胞内の抗原に結合する本発明の結合タンパク質を接触させる段階;
(2)試験試料において結合タンパク質-抗原複合体の量を測定する段階;および
(3)試験試料の結合タンパク質-抗原複合体の量を対照と比較する段階
を含む方法を提供する。
(1) 抗体-α-フェトプロテイン複合体と、抗体-CD44E複合体の形成を可能にする条件下においてCD44Eに結合する抗体の形成を可能にする条件下において、哺乳類の試験試料とα-フェトプロテインまたはその変種に結合する抗体を接触させる段階;
(2)試験試料において抗体-α-フェトプロテイン複合体および抗体-CD44E複合体の量を測定する段階;および
(3)試験試料の抗体-α-フェトプロテイン複合体および抗体-CD44E複合体の量を対照と比較する段階
を含む方法である。
(1)哺乳類から採取した試験試料中で本発明の抗体量を測定する段階;および
(2)試験試料中の本発明の抗体の量を対照と比較する段階
を含む方法である。
上記に記載するように、本発明者らは、本発明の結合タンパク質の抗原を同定した。従って、本発明は、本発明の結合タンパク質の1つに特異的に結合することができる単離タンパク質ならびにその核酸配列および使用を含む。
CD44に対する抗体は、CD44H(標準型、CD44sとも呼ばれる)およびCD44Eのヒアルロン酸(HA)に対するPMA-誘導性結合を遮断することが示されている(Liao et al. J Immunol 151 (11):6490-99, 1993)。CD44変種、特に変種エクソン9を含有するもののクラスタリングはHAに結合するために重要であると思われ、PMAによって誘導することができる。下流細胞内シグナリングはこのクラスタリングに関連し、その妨害は細胞機能に影響することがある(Suzuki et al., JBC 277 (10):8022-32, 2002)。HA結合に対する抗体の遮断作用はクラスタリングの妨害によって媒介されると思われる。機序にかかわらず、本発明の結合タンパク質は、細胞外分子へのCD44の結合およびクラスタリングによって生じる下流細胞シグナリングまたはHAまたは/または他の細胞外分子への結合を調節するために使用できると思われる。
実施例1:VB1-008モノクローナル抗体の作製
VB1-008モノクローナル抗体は、乳癌患者の抹消血リンパ球から作製した。TM-SH-P2は、モノクローナル抗体を作製するための融合パートナーとして使用した。VB1-008はIgG1、λモノクローナル抗体である。
γプライマー:
λプライマー:
注記:1つのプライマーを使用してできるだけ多くの種類を単離するために、混合塩基をある種のコンセンサスプライマーに使用した:
10x PCR 緩衝液 5μL
2 mM dNTP 5μL
50 mM MgCl2 2μL
5' プライマー 20 pmoL
3' プライマー 20 pmoL
Taq DNA ポリメラーゼ 2.5 U
DNA 鋳型 50 ng
2つのパネルの細胞株に対する腫瘍細胞反応性についてVB1-008をフローサイトメトリーによって試験した。第1のパネルは15の異なる種類の上皮癌を含むが、第2のパネルは5種類の正常細胞からなる。VB1-008結果を表2に要約する。VB1-008は、試験した全ての癌種に対してMF>2.0であった。MF値は、各適応部位の全ての細胞株由来の対照抗体に対する中央蛍光値の平均倍増かの合計から算出した平均を示す。最も強い適応部位は、***、肺、メラノーマおよび前立腺であったが、これに限定されない。比較として、VB1-008は、正常細胞株より腫瘍細胞株のほとんどに反応性が大きかった。2つの例外は腎臓および肺細胞株であった;しかし、それらは対応する腫瘍細胞種よりはるかに低かった。表2参照。腫瘍:正常のVB1-008反応性の倍増加は〜2から7まで変化した。
膜染色を実証するためおよび染色の最適条件を規定するために適当な組織フォーマットを評価するために、フロー陽性腫瘍細胞株SKBR-3に対してVB1-008を試験した。この抗体は、固定した包埋細胞を含む全ての実験グループにおける細胞質および細胞膜染色を実証した。VB1-008と共に終夜インキュベーションした固定細胞ペレットでは、細胞の80%は細胞質染色を示し、それらの10%は細胞膜染色を示した。ホルマリン固定細胞ペレットコアの細胞膜染色の代表的な写真を図3に示す。
腫瘍組織反応性についてVB1-008をHDホルマリン固定腫瘍TMAにおいて試験した。表5参照。VB1-008は、膀胱、***、結腸、腎臓、肝臓、卵巣、前立腺、直腸、胃および子宮を含む多種多様の適応部位に対して中程度の細胞表面反応性を示した。VB1-008細胞表面結合は、子宮頸部、肺、膵臓および皮膚の癌では低い程度で示され、低い反応性であった。細胞表面反応性VB1-008を例示するが、癌の一部に対するアイソタイプ一致の対照抗体ではない代表的な写真を図5〜7に示す。
腫瘍細胞株A-375に対して強力な反応性を実証するVB1-008および2つの対照抗体(5E9およびMA-103)を使用して、内部移行についてVB1-008を評価した。代表的な実験を表6に示す。異なる温度におけるVB1-008結合結果は内部移行する抗体5E9から異ならなかった。37℃において60分後、膜結合VB1-008は細胞表面から消失し、中央蛍光値は57.5%低下した。37℃におけるインキュベーション時間の延長は中央蛍光値のさらなる減少に関連した。120分までに、中央蛍光値は62.2%減少した。細胞表面結合を実証するフローヒストグラムを図8に例示する。細胞表面結合VB1-008がA-375細胞に内部移行したかまたは原形質膜から脱落したかどうかを確認するために、レーザー走査共焦点顕微鏡法の助けによる蛍光分布および細胞内染色の直接可視化によってさらに評価した。MA-103および5E9と同様に、4℃における60分間のA-375細胞のVB1-008とのインキュベーションは、蛍光ラベルの円周表面分布を実証した(図9A)。図9Bに示すように、VB1-008抗体結合細胞を37℃に加温すると、内部移行した抗体による細胞内染色の断続的なパターンを明らかにした。
フローサイトメトリーを使用して機能的親和性を評価した[Benedict, C.A., NacKrell, A. J. and Anderson, W. F. (1997) J. Immunol. Methods, 201:223- 231]。ある範囲の抗体濃度を一定数の腫瘍細胞(A-375)に対して2時間試験して、飽和曲線を作成した。シグマプロットを使用して、値およびグラフ分析を作成した(Jandel Scientific, San Rafael, CA)。求めた中央蛍光値の逆数を、抗体濃度の逆数の関数としてプロットして、Lineweaver-Burk方法によってKDを求めた。直線が作成され、曲線のスロープからKDを算出した。解離定数KD値を以下の等式:1/F=1/Fmax + (KD/Fmax)(1/IgGまたはIgMまたはscFv)(式中、F=バックグラウンドを引いた中央蛍光値である) によって求め、Fmaxをプロットから算出した。VB1-008の解離定数は5.88×10-8Mであることが示された。
細胞
乳癌細胞株、MDA-MB 435S、MDA-MB-231;MCF-7;メラノーマ細胞株、A-375;膵臓腫瘍細胞株、PANC-1およびT細胞株、DaudiおよびRamosを研究に使用した(表7)。これらの細胞株は、フローサイトメトリーによる腫瘍細胞株プロファイリングの結果に基づいて選択した。
研究の細胞株はATCCから購入し、ATCCのガイドラインおよび推奨により培養した。細胞は、集密度90%、生存度>90%で回収した。
予備実験による特徴データは、ドットブロットアッセイ法によるゲルに基づいた方法の実行可能性を評価するためにデザインした実験;および抗原と関連するエピトープの性質を判定するために実施した実験から得た。
免疫沈降
最小500μgの膜タンパク質をイムノアフィニティー精製に使用した。タンパク質-Gセファロース単独を使用する事前-クリーニング段階は、抗体の添加前の抗原の精製の第一段階であった。ある場合には、アッセイ法にさらにストリンジェンシーを加えるために、事前の洗浄(pre-clearing)を2回実施した。合計15〜20μgの抗体を混合物の沈殿剤として使用した。整理条件を模倣した緩衝条件を使用して、抗原-抗体混合物を4℃において終夜転頭混和した(nutated)。プロテアーゼインヒビターが抗原単離過程の全ての段階において確実に使用されるように注意を払った。
1D-PAGE
精製したタンパク質に還元および非還元条件の試料調製を供し、その後SDS-PAGE/ウェスタンブロット法によって分析した。還元条件を使用する場合には、単離抗原を、1%β-メルカプトエタノールを含有する試料緩衝液で65℃において15分処理し、非還元条件を使用する場合には、任意の還元剤を欠損している試料緩衝液と抗原を混合した。得られたブロットを必要な抗体およびHRPに結合した対応する二次抗体でプロービングして、化学発光によってイムノ精製タンパク質を可視化した。
免疫沈降したタンパク質を2次元ゲル電気泳動で分離して、1D-PAGEで生じている可能性のある任意のタンパク質スタッキングの影響を解消した。2D-ゲル電気泳動は、第一の次元において等電点(Pi)により、第二の次元において分子量に基づいてタンパク質を分離した。このように分離されたタンパク質を終夜ニトロセルロース膜に移し、1D-PAGEの場合と同様に処理した。ウェスタンブロットを適宜VB1-008、抗CD44および抗AFPでプロービングして、反応したタンパク質を化学発光によって可視化した。
タンパク質を1D-ゲルおよび2D-ゲルから切断して、分析した。生データを入手し、受容されたペプチドの数に基づいてプロービング可能なタンパク質を予測した。Thermo Finnigan社製の「QSTAR-およびLCQ-ドデカLC-MS/MSでLC-MS/MS操作を実施した。同じ施設で同定されたタンパク質のデノボシーケンシングも実施した。
抗原陽性細胞株(A-375、MDA-MB-435S)において非還元条件下において(図10A)、1D-PAGEでの分離後に、〜110 kDaの1つの特定のバンドだけを検出した。同じバンドは弱い陽性の細胞株(MCF-7)において弱く検出され、抗原陰性細胞株(Daudi)において欠損していた。試料を還元試料調製条件下においてSDS-PAGEで分離した場合には、〜50 kDaの主要なバンドおよび弱い110 kDaバンドが抗原陽性細胞株、MDA-MB-435S、A-375、MDA-MB-231において強く発現され、MCF-7において弱く発現され、DaudiおよびPanc-1などの抗原陰性細胞株において欠損していることが観察された(図10B;図10C);Ramosは上記の観察の例外であった(図11Bおよび10C)。細胞株はどれも4B5では陽性の免疫沈降を示さなかった。ウェスタンデータを表8に要約する。
等電点(Pi)を求め、1D-PAGE分析におけるタンパク質スタッキングの可能性を評価するために、VB1-008の精製抗原を、第一の次元の分離がPiに基づいており、第二の次元の分離が分子量に基づいている2次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D-PAGE)で分離した。次いで、ゲルをニトロセルロース膜に移し、標準的なウェスタンブロット処理に供した。2Dゲルにおけるタンパク質の検出に必要な量は、1Dゲルの必要量の〜4倍多いので、4回の免疫沈降反応により精製された抗原を1回の2D-PAGE分析のために一緒にしてプールした。2つの別個のゲルをウェスタンブロット分析のために同時に処理して、クーマシー染色ゲルで検出されるタンパク質がウェスタンブロットで観察されるものと同じであることを確実にした。2DウェスタンブロットをVB1-008でプロービングして、ECL(化学発光)で検出した。図11Aにおいてわかるように、2つのスポットが〜49 kDa/Pi=5.2〜5.6において検出された。
A-375およびMDA-MB-435S膜を使用して、VB1-008に特異的に結合する抗原を免疫精製した。還元ゲル分離条件下において、〜50 kDaバンドが両方の細胞株において観察され、非還元条件下において、〜110kDaバンドが観察され、MDA-MB-435S細胞から「E」と呼ぶ。これらのタンパク質バンドは、MS分析のためにクーマシー染色ゲルから切断した。
推定されるタンパク質候補の等電点(Pi)と分子量の関連は、タンパク質IDの重要なパラメーターである。同定されるペプチドの質量およびそれらのPiが、それぞれ、±3 kDa範囲以内および±0.2 Pi以内に確実になるように注意を払った。これは、ペプチドは異なる修飾状態で存在して、理論的に算出した質量およびPiから偏差する本質的な可能性のためである。許容される任意の偏差は先に規定された値を超えるべきではない。ペプチド数が非常に少なかった場合には、「デノボシーケンシング」として公知の方法によってさらなる情報を得るために追加のMS段階が必要とされた。「デノボシーケンシング」は、2回目のMS段階が、1回目のMSにおいて得られたペプチドの各々を、各々アミノ酸の電離型であるペプチドフラグメントイオン(yおよびbイオン)にフラグメントする方法である。次いで、各ペプチドの配列を得られた質量スペクトルから推定することができる。
2D-ゲルから切断したスポット「C」はα-フェトプロテイン(AFP)だけを同定したが、掲載されている他の2つのタンパク質は、研究中にタンパク質の完全性のために添加したプロテアーゼインヒビターであった。Piも、分子がAFPである可能性に一致する。MS分析は65ペプチドを明らかにしたが、ヒトAFPの54%配列範囲(sequence coverage)を構成する30の独自のペプチドだけが回収され、各ペプチドは元のタンパク質と100%相同性を示した。しかし、AFP分子は、N末端から最初の160 アミノ酸を欠損していた。ヒトAFP分子の配列分析はこれらの最初の106アミノ酸におけるリジンおよびアルギニン残基の明らかな存在を示しており、分子に存在する場合には、ペプチドとして切断されたと可能性がある。2Dスポット「C」のデノボシーケンシング情報は、N末端からの160アミノ酸の欠損を示しており、AFPのアイデンティティーを確立するとき、頻発する現象であった(図12A)。1Dゲルおよび2Dゲルからのデノボシーケンシングの合わせた結果を図12Bに示す。結果は、N末端からの106アミノ酸の欠損を示す。表11Aは同定されたペプチドを掲載する。
2D-ゲルのスポット「D」は、同時精製夾雑物、アクチンおよびアクチン結合タンパク質アクチニン以外に3つのタンパク質のアイデンティティーを明らかにした。しかし、CD44を除いて、他の2つのタンパク質のPiは2Dスポットについて観察されるものと明確に異なり、従ってタンパク質IDとして排除した。CD44アイソフォーム3の分子量は53.585±3 kDaであると求められ、スポット「D」の2D-PAGE分析で観察された分子量およびPiに完全に一致した。
先に記載するように、還元条件下において、〜110 kDaバンドをクーマシーおよびウェスタンブロット分析によって可視化した。2D-PAGE分析から、2つの成分が存在し、各々約〜50 kDaであり、CD44およびAFPと個別に同定され、非還元ゲル分離条件下において立体配座が保存されるとき、110 kDaバンドを形成するように寄与することが明らかであった。従って、立体配座について、110kDaバンドを切断し、分析してタンパク質成分を同定した。図13Aに見られる〜110 kDaバンドをMS分析のために切断した(E)。100 kDaバンドから同定されるタンパク質の詳細を表10に示す。
タンパク質バンド「E」のMS分析の結果を表10に示す。同時精製夾雑物、すなわち、アクチン、アクチニンおよびビメンチンとは別に、3つのタンパク質アイデンティティーが得られた。それらのうちには、CD44、AFPおよびヒートショックタンパク質90が存在した。ヒートショックタンパク質90は、同定された分子量が一致せず、従って可能性のある候補として排除した。CD44は膜結合型であるので、同族抗原の可能性がある。AFPはCD44と同時精製するが(図15A)、AFPは膜表面で検出されなかったことも実証された。
(1)フローサイトメトリーによる抗CD44および抗AFPの細胞表面反応性
CD44がVB1-008の同族抗原である可能性は、免疫精製、ゲルに基づいた分析およびMS分析によって明白に確立されている。膜調製は、VB1-008への抗原結合の膜局在化を明白に示唆した予備的な特徴づけ実験に基づいて、VB1-008を用いて実施した全ての研究において使用した。細胞表面の抗原の2つの成分の配向を求めるために、VB1-008、抗CD44、抗AFPおよび抗EGFRを用いて、細胞株パネルに対する反応性をフローサイトメトリーによって測定した。適当なアイソタイプ一致対照も研究に使用した。
AFPは、67 kDa組換え分子として購入することができる血清糖タンパク質である。この分子はRDI laboratoriesから購入し、0.3μgの純粋なタンパク質、AFPおよび0.3μgのBSAをSDS-PAGEで電気泳動し、ニトロセルロース膜に移し、VB1-008でプロービングした。図15Aからわかるように、陽性の反応が観察され、VB1-008によって認識されるAFPのエピトープの存在を示している。AFPは、VB1-008を用いる免疫沈降によって精製され、MS分析によって同定される2つの同定タンパク質分子の1つであったので、現在のウェスタンブロット実験は、VB1-008によって免疫精製した試料におけるAFPの存在を証明している。
MDA-MB-435S膜のVB1-008免疫沈降反応からの溶出液の2D-PAGE分離は、それぞれ、5.1〜5.4のPi範囲および51±3 kDaの分子量ならびに5.2〜5.5のPi範囲および50±3 kDaの分子量の2つの別個のスポット、「C」および「D」の存在を示した。VB1-008でプロービングすると、2つのスポットは可視化された。これら2つのスポットのLC-MS/MS分析はAFPおよびCD44のアイデンティティーを明らかにし、それらの存在は、非還元条件下において見られる110 kDaにおいても確認された。従って、次の段階として、同じ条件の免疫精製を反復し、2D-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜に移し、ウェスタンブロットを抗AFPおよび抗CD44でプロービングした。結果を図15Bおよび図15Cに示す。
CD44に対するAFPの関係を理解するために、抗CD44を使用して、全てのCD44アイソフォームを免疫沈降する実験をデザインした。選択的に精製したこれらのタンパク質をSDS-PAGEおよびWBに供した。3セットの同じ実験を同時に実施した。ウェスタンブロットを抗CD44でプロービングした。
VB1-008を用いる免疫精製実験は、非還元条件下において〜110 kDaの1つの特異的なバンドおよび1D-PAGEの還元条件下において1つの50+3 kDaバンドを示した。タンパク質スタッキングを解消し、タンパク質の等電点を求めるために、2D-PAGE分析を実施した。2D-PAGE分析からの結果は、それぞれ、Pi=5.1〜5.4および5.2〜5.5ならびに51±3 kDaおよび50±3 kDaの分子量を有する2つのスポットの存在を示した。2DスポットのMS/MS分析は32および8ペプチドを回収し、それぞれ、同定された各タンパク質の54%および28%に及ぶ。同定された2つの抗原と推定されるものはCD44アイソフォーム3および低分子量型のα-フェトプロテインであった。
タンパク質同定は、免疫沈降によって精製したVB1-008 Agのトリプシンペプチドのm/z測定により実施した。タンパク質データベースの十分な検索により、免疫精製したVB1-008 Agから同定した8つのペプチドセットに対応する1つの完璧なヒットを生じ、CD44Eまたは上皮型としても公知のCD44アイソフォームを指摘した。精製した抗原の分子量は、細胞株のVB1-008によって認識される抗原としての両方のアイソフォーム(1および2)の可能性を除外する。v1またはCD44v3、8〜10を除く全てのエクソンをコードするアイソフォーム2などの他のアイソフォームもVB1-008と反応することを予想することができるが、それらの分子量および/またはpIは、VB1-008細胞表面抗原について観察されるものと一致しない。
上記に記載するように、免疫沈降およびMS分析は、CD44E(アイソフォーム3)をVB1-008抗原と同定した。CD44Eは、保存配列、エクソン1〜5および16〜20の間にエクソンv8-v10を有する点において他のスプライス変種と異なる。次いで、VB1-008の反応性エピトープを同定するために、CD44Eの独自の領域(エクソン5-v8ジャンクションに及ぶアミノ酸配列)からペプチドを合成した。CD44EのC末端領域から取られる同じ長さのペプチドを陰性対照に使用した。
CD44Eの独自領域のペプチド:
CD44Eのエクソン5-v8ジャンクションに及ぶ合成ペプチドは、Globalペプチドサービス、LLCからオーダーした。CD44E由来のアミノ酸配列(17アミノ酸)は、エクソン5由来の6アミノ酸およびv8領域の独自のペプチド由来の11アミノ酸の長さにおよぶ。図18Aの強調部分は、3ペプチドに分割されている17アミノ酸鎖を示し、陰性対照ペプチド配列は、タンパク質のC末端領域に強調されているとおりである。
全てのペプチドはPBSに可溶性であった。溶解に困難さが観察された場合には、溶液のpHを0.01 N HClまたは0.01 N NaOHで調節した。ペプチドはストック溶液(1000 nM)で-20℃において保存した。
ペプチド溶液は、0.5%ホルムアルデヒドを含有するHankの緩衝生理食塩液(HBSS)で100倍希釈した。希釈したペプチド溶液の100μLを96ウェルプレートの各ウェルに分配した。プレートを室温において1時間インキュベーションした。上清を除去し、プレートを37℃の恒温槽に16〜18時間カバーをしないで置いた。ペプチドコーティングしたプレートをプラスチックバッグに入れ、必要時まで2〜8℃において保存した。
固定したペプチドへのVB1-008の結合は、SOP 2.1.19およびSOP 2.2.7により実施した。
ペプチドコーティングプレートを、ブロック緩衝液(1% BSAを含有するPBS)で300μL/ウェルでブロックした。プレートを室温において30〜60分インキュベーションした。インキュベーション後、ブロック緩衝液を破棄した。
75μg/mLのVB1-008に等価な分量をウェルの各々に添加し、37℃において2時間インキュベーションした。先に記載したように、洗浄緩衝液(0.5%Tween20を含有するPBS)でプレートを洗浄した。プレートを、抗ヒトIgG-HRPの6000希釈液と共に室温において1時間インキュベーションした。先に記載したように、プレートを洗浄した。100μLのTMB基質(TMBペルオキシダーゼ基質KPL cat#50-76-00)を各ウェルに添加し、暗所で5〜10分インキュベーションした。各ウェルに1Mリン酸100μLを添加することによって反応を停止した。ELISAプレートリーダーを使用して、450 nmにおいて光学密度を測定した。
CD44Eの独自の領域(すなわち、エクソン5-v8ジャンクションに及ぶアミノ酸配列)由来の合成ペプチドのスクリーニングは、ペプチド3はもっとも強力な結合を示し、次にペプチド2は、ペプチド3で観察される結合の50〜60%を実証することを明らかにした。陰性対照として使用したCD44EのC末端領域から取られる同じ長さのペプチドは、ペプチド1に見られたような任意の反応性を示さなかった。VB1-008とペプチド3の反応性は、CD44Eのこの領域はVB1-008の反応性エピトープを含有することを実証した。図18B参照。
次いで、VB1-008結合のためのペプチドの競合効果をアッセイした。
腫瘍細胞株の増殖および維持:
VB1-008陽性細胞株、すなわち、MDA-MB-435Sを培養し、ATCCガイドラインにより維持した。
全てのペプチドをPBSに溶解し、1.428 mM(2 mg/mL)および100μM溶液として-20℃において保存した。
VB1-008(75μg/mL)-0.5 μM濃度を非競合対照として使用した。モル過剰量、すなわち、20×、40×、100×および200×のペプチドをVB1-008との競合に使用した。フローによる結合前に、ペプチド/VB1-008混合物を氷上で10分インキュベーションした。4B5-IgGをアイソタイプ一致対照として使用し、抗EGFRを関連のない抗体として使用した。これら2つの抗体は、VB1-008と全く同じに処理した。
MDA-MB435S細胞に対するVB1-008ならびに抗EGFRおよび4B5-IgG抗体の結合をフローサイトメトリーによって評価し;先に記載した最適化したプロトコールにより実施した。ペプチドで処理した細胞および未処理の細胞は同様に処理した。
図19Aにおいてわかるように、ペプチド1はMDA-MB435S細胞に対するVB1-008の結合と競合せず、ペプチド2は、MDA-MB435S細胞に対するVB1-008の結合を60%の効率で競合し、ペプチド3は、MDA-MB435S細胞に対するVB1-008の結合を96%の効率で競合した。対照はVB1-008に対する競合を示さなかった。
方法および試薬
PCT/CA2005/000410および米国特許出願第11/084,080号に開示されている方法を使用して、修飾ボウガニンに結合したVB1-008を含むVB6-008構築物を構築した。
5'PvuII-QVQL
3'VB4-008-NheI
5'FurinリンカーD-bouganin
3'008-PelB
5'PelB-SalI
3'008-VL CL
5'008-VL CL
3'008 CL 停止
プライマー1および2を使用して、3'末端にPelBプロモーターの一部(820 bp)を含有するボウガニンを増幅した。第2のPCR反応において、プライマー3および4を使用して、3'末端にHisタグおよびVB6-008VLの一部(179 bp)を含有するPelBを増幅した。第3のPCR反応において、プライマー5および6を使用して、3'末端に2つの停止コドンおよびXhoI部位(666 bp)を有するVB6-008λ鎖を増幅した。
第2のPCR反応において、プライマー1および6を、各PCR産物の1μlと共に使用して、HindIII-bouganin-PelB-VB6-008λ鎖(1591 bp)を作製した。
修飾ボウガニンに結合したVB1-008を含む免疫抱合体(VB6-008)を構築した。免疫抱合体のヌクレオチド配列を図20に図示する(SEQ ID NO:11)。免疫抱合体のアミノ酸配列を図21に図示する(SEQ ID NO:12)。図22は、完全なVB6-008構築物を示す。図23は、PelB-VH-CH-Furin-De-Bouganinを含むVB6-008ユニット#1を示す。図24は、PelB-VL-CLからなるVB6-008ユニット#2を示す。
1Nは適応部位あたり試験した細胞株の数を示す。2MF:値は、各適応部位の全ての細胞株由来の対照抗体を上回る中央蛍光値の平均倍増の合計から算出した平均を示す。ゼロの値は、対照抗体と比較して測定可能な反応がないことを示す。aはAntiCancer Inc提供の同所性モデルを示す。bはGFP(緑色蛍光タンパク質)-トランスフェクション体として利用可能な細胞株を示す。c Her2/neu-, ER+。d Her2/neu-, ER-、p53wt、raswt。e Her2/neu-, ER-、p53mt、raswt。f アンドロゲン反応性。g アンドロゲン非反応性。N/A、適用なし。平均-倍増(MF)を使用して腫瘍:正常比を算出する。
*スコアリングは0〜3+スケールで評価し、0=染色なしであり、トレースは1+未満であるが、0より大きい。グレード1+〜3+は染色の強い強度を示し、3+は強く、暗褐色の染色である。一般に、6人の異なる患者の1つの検体をスクリーニングした。6人未満の患者をスクリーニングした場合には、コアは欠損していたかまたは染色される組織を表していなかったことを示す。括弧内の値は、スコアリングした範囲において染色した細胞の割合を示す。
*スコアリングは0〜3+スケールで評価し、0=染色なしであり、トレースは1+未満であるが、0より大きい。グレード1+〜3+は染色の強い強度を示し、3+は強く、暗褐色の染色である。一般に、8人の異なる患者の2つの検体をスクリーニングした。8人未満の患者をスクリーニングした場合には、コアは欠損していたかまたは染色される組織を表していなかったことを示す。括弧内の値は、スコアリングした範囲において染色した細胞の割合を示す。
*スコアリングは0〜3+スケールで評価し、0=染色なしであり、トレースは1+未満であるが、0より大きい。グレード1+〜3+は染色の強い強度を示し、3+は強く、暗褐色の染色である。一般に、8人の異なる患者の2つの検体をスクリーニングした。8人未満の患者をスクリーニングした場合には、コアは欠損していたかまたは染色される組織を表していなかったことを示す。頭頸部は咽頭、***、喉頭、口腔、扁桃腺および歯肉面の癌を含んだ。括弧内の値は、スコアリングした範囲において染色した細胞の割合を示す。
1代表的な実験を示す。2陰性対照、マウスミエローマIgGまたはヒトIgG(4B5)を上回るMF増加。3腫瘍細胞の細胞表面からのMFの減少率。4氷上で120分インキュベーションした(-)細胞。
C-同時精製夾雑物;
X-観察されるPiおよび/またはMwに一致しない
v=許容される範囲内でPiおよびMwに一致する
C-同時精製夾雑物;
X-観察されるPiおよび/またはMwに一致しない
v=許容される範囲内でPiおよびMwに一致する
Claims (23)
- CD44Eの5-v8インターフェースに結合し、SEQ ID NO: 7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域およびSEQ ID NO: 9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗体。
- 抗体の軽鎖および重鎖のそれぞれをコードする単離された核酸分子であって、
抗体の軽鎖をコードする核酸分子が、SEQ ID NO: 8の核酸配列またはSEQ ID NO: 7のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、
抗体の重鎖をコードする核酸分子が、SEQ ID NO:10の核酸配列またはSEQ ID NO: 9のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、
核酸分子。 - 請求項1記載の抗体の抗原結合フラグメントであって、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、それらのダイマー、ミニボディ(minobodies)、ダイアボディ(diabodies)、およびマルチマー、または二重特異性抗体フラグメントである、フラグメント。
- 請求項1記載の抗体または請求項3記載のフラグメントを薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤または安定剤と共に含む組成物。
- 細胞障害性であるか、細胞***抑制性であるか、または他の様式で癌細胞が***および/もしくは転移する能力を阻害するもしくは低下させる癌治療薬に結合している、癌細胞上または癌細胞内のCD44Eの5-v8インターフェースに結合する請求項1記載の抗体または請求項3記載のフラグメント、を含む免疫抱合体。
- 癌治療薬が毒素である、請求項5記載の免疫抱合体。
- 毒素がリボソーム不活性化ポリペプチドである、請求項6記載の免疫抱合体。
- 毒素が、ゲロニン、ボウガニン(bouganin)、サポリン、リシン、リシンA鎖、ブリオジン(bryodin)、ジフテリア、レストリクトシン(restrictocin)、およびシュードモナス(Pseudomonas)外毒素A、またはそれらの変種からなる群より選択される、請求項7記載の免疫抱合体。
- 毒素が修飾ボウガニンまたはその変種である、請求項7記載の免疫抱合体。
- 毒素が、アミノ酸252〜608からなるシュードモナス(Pseudomonas)外毒素Aの切断型またはその変種である、請求項7記載の免疫抱合体。
- SEQ ID NO: 11のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を含む請求項5記載の免疫抱合体。
- SEQ ID NO: 12および13のアミノ酸配列を含む請求項5記載の免疫抱合体。
- 免疫毒素が癌細胞によって内部移行される請求項5〜12のいずれか一項記載の免疫抱合体。
- 請求項5〜13のいずれか一項記載の免疫抱合体を薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤または安定剤と共に含む組成物。
- 癌を治療するための医用製剤の製造を目的とする、請求項5〜13のいずれか一項記載の免疫抱合体の有効量の使用。
- 癌を同時、別個または逐次的に治療するための医用製剤の製造を目的とする、1つ以上のさらに別の癌治療薬の使用をさらに含む請求項15記載の使用。
- 哺乳類の癌の診断薬の製造を目的とする、請求項1記載の抗体または請求項3記載のフラグメントの使用。
- 請求項1記載の抗体または請求項3記載のフラグメントおよび癌を診断するためにそれを使用するための取り扱い説明書を含む、癌を診断するためのキット。
- 検出可能なシグナルを生成するラベルに直接または間接的に結合している、請求項1記載の抗体または請求項3記載のフラグメントを含む診断薬。
- ラベルが放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、造影剤、または金属イオンである、請求項19記載の診断薬。
- 請求項19または20記載の診断薬およびそれを使用するための取り扱い説明書を含むキット。
- 請求項2記載の核酸分子を含む組換え発現ベクター。
- SEQ ID NO: 11に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクター。
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