JP4963512B2 - 二重特異性抗体とともに使用される新規なペプチド型薬剤の製造及び使用 - Google Patents

二重特異性抗体とともに使用される新規なペプチド型薬剤の製造及び使用 Download PDF

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Description

発明の詳細な説明
（関連特許出願のクロスリファレンス）
本出願は米国特許出願第０９／３３７，７５６号（１９９９年６月２２日出願）（参照することにより、その全体を本明細書中に組み込むものとする）の一部継続出願である。
（発明の分野）
本発明は、例えば、放射免疫療法（ＲＡＩＴ）及び化学免疫療法において治療のために使用される免疫学的試薬、並びに例えば、放射免疫検出（ＲＡＩＤ）、超音波検査法及び磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）において検出及び／又は診断のために使用される免疫学的試薬に関する。詳細には、本発明は、むき出し状態の（ｎａｋｅｄ）抗体（非コンジュゲート型）及び直接的なコンジュゲート化抗体、並びに標的組織に対して反応し得る少なくとも１つのアームと、リンカー部分に対して反応し得る少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）及び二重特異性抗体フラグメント（ｂｓＦａｂ）に関する。さらに、本発明は、特定の免疫原に対して惹起されたモノクローナル抗体（これらは、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体及びキメラなモノクローナル抗体である）、並びに標的組織に対して反応し得る少なくとも１つのアームと、リンカー部分に対して反応し得る少なくとも１つの他のアームとを有するヒト二重特異性抗体及びヒト化二重特異性抗体及びキメラ二重特異性抗体及びそのような二重特異性抗体フラグメント、そしてそのような抗体及び抗体フラグメントをコードするＤＮＡ、そしてそのようなＤＮＡを発現させるためのベクターに関する。
本発明はまた、ヒト化抗ＣＳＡｐ抗体及びキメラ抗ＣＳＡｐ抗体及びヒト抗ＣＳＡｐ抗体、特にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、そしてヒト化抗ＣＳＡｐ抗体及びキメラ抗ＣＳＡｐ抗体及びヒト抗ＣＳＡｐ抗体の治療用及び検出／診断用のコンジュゲート体、そしてヒト化抗ＣＳＡｐ抗体及びキメラ抗ＣＳＡｐ抗体及びヒト抗ＣＳＡｐ抗体を使用して、悪性腫瘍を診断／検出又は処置する方法に関する。本発明はまた、少なくとも２つの抗ＣＳＡｐ ｍＡｂ又はそのフラグメントを含む抗体融合タンパク質又はそのフラグメント、あるいは少なくとも１つの抗ＣＳＡｐ ｍＡｂ又はそのフラグメントと、この抗ＣＳＡｐ ｍＡｂ又はそのフラグメントとは異なる少なくとも１つの第２のｍＡｂ又はそのフラグメントとを含む抗体融合タンパク質又はそのフラグメントに関する。ヒト化抗ＣＳＡｐ ｍＡｂ、キメラ抗ＣＳＡｐ ｍＡｂ及びヒト抗ＣＳＡｐ ｍＡｂ又はそれらのフラグメントあるいはそれらの抗体融合タンパク質又はそのフラグメントは、単独で、又は治療用コンジュゲート体として、又は他のむき出し状態の抗体若しくは他の治療剤との治療用免疫コンジュゲート体と組み合わせて、又は診断／検出用コンジュゲート体として投与することができる。本発明はまた、ヒト化抗ＣＳＡｐ抗体、キメラ抗ＣＳＡｐ抗体、ヒト抗ＣＳＡｐ抗体及び抗体融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、並びにそのようなＤＮＡ配列を含有するベクター及び宿主細胞、並びにヒト化抗ＣＳＡｐ抗体、キメラ抗ＣＳＡｐ抗体及びヒト抗ＣＳＡｐ抗体を作製する方法を提供する。
（背景技術）
がんの治療及び検出／診断に対する方法では、検出／診断剤又は治療剤を疾患部位をターゲットすることができる抗体又は抗体フラグメントを疾患組織に向かわせることが伴う。現在研究中であるこの方法論に対する１つの方法では、標的疾患組織に対して反応し得る少なくとも１つのアームと、低分子量ハプテンに対して反応し得る少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性のモノクローナル抗体（ｂｓＡｂ）の使用が含まれる。この方法論では、ｂｓＡｂが投与され、そのｂｓＡｂは標的組織に局在化でき、そして正常な組織からはクリアリングされる。しばらくして、放射標識された低分子量ハプテンが投与されるが、これはｂｓＡｂの第２の特異性によって認識されるので、これもまた最初の標的に集まる。同じ技術を使用して、治療用同位体、薬物及び毒素を、疾患組織に対して、特に、ｂｓＡｂがターゲッティングされるがんに対して選択的にターゲッティングすることができ、又は標的抗原を発現している病理学的病変部の改善された診断及び検出のために非放射性診断剤をターゲッティングすることができる。
ｂｓＡｂと組み合わせて使用される低分子量ハプテンは特異的な画像化及び治療において非常に多数の用途を有しているが、それぞれの可能な適用について個々のｂｓＡｂを調製することは実際的ではない。さらに、ｂｓＡｂ／低分子量ハプテンシステムの適用では、いくつかの他の問題と取り組まなければならない。第１に、低分子量ハプテンに結合するｂｓＡｂのアームは大きい親和性で結合しなければならない。これは、低分子量ハプテンは、ｂｓＡｂが結合しないときには生体系から迅速にクリアリングされるように設計されるからである。第２に、ｂｓＡｂ以外が結合した低分子量ハプテンは、実際には、非標的組織による取り込み及び非標的組織での保持を避けるために、生体系から迅速にクリアリングされる必要がある。第３に、検出剤及び／又は治療剤は、用いられたｂｓＡｂプロトコル内のその適用期間中は低分子量ハプテンとの会合状態を維持しなければならない。
この方法に関して注目されるのは、適切な二重の特異性を有するＡｂを使用してキレーター及び金属キレート錯体をがんに向かわせるｂｓＡｂである。使用されるキレーター及び金属キレート錯体は放射性であることが多く、これらには、コバルト−５７（Ｇｏｏｄｗｉｎら、米国特許第４，８６３，７１３号（特許文献１））、インジウム−１１１（Ｂａｒｂｅｔら、米国特許第５，２５６，３９５号（特許文献２）及び米国特許第５，２７４，０７６号（特許文献３）；Ｇｏｏｄｗｉｎら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３３：１３６６〜１３７２（１９９２）（非特許文献１）；及びＫｒａｎｅｎｂｏｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（ｓｕｐｐｌ．）、５５：５８６４ｓ〜５８６７ｓ（１９９５）（非特許文献２）及びＣａｎｃｅｒ（ｓｕｐｐｌ．）、８０：２３９０〜２３９７（１９９７）（非特許文献３））及びガリウム−６８（Ｂｏｄｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：３７３〜３７９（１９９５）（非特許文献４）；Ｓｃｈｕｈｍａｃｈｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１１５〜１２３（１９９５）（非特許文献５））などの放射性核種が放射免疫画像化のために使用されている。Ａｂがキレーター及び金属キレート錯体に対して生じたので、その抗体は、それに対する抗体が最初に生じた錯体に対して顕著な特異性を有している。実際、ＢｏｄｅｎらのｂｓＡｂは、キレーター及び金属キレート錯体のエナンチオマー混合物の単一エナンチオマーに対する特異性を有している。この大きい特異性は、放射免疫療法（ＲＡＩＴ）に有用なイットリウム−９０及びビスマス−２１３、そしてＭＲＩに有用なガドリニウムなどの他の核種を、代わりに使用される利用可能な試薬に容易に置き換えることができないという点で、ある意味では不都合であることが証明されている。このため、ヨウ素−１３１（非金属）が、Ｉ−１３１標識されたインジウム−金属−キレート錯体を２番目のターゲッティングステップにおいて使用することによってＲＡＩＴ目的のために採用されている。この方法論に対する別の欠点により、診断的使用又は治療的使用のために所望されるすべての薬剤に対して抗体を生じさせることが必要となっている。
従って、疾患組織を指向できる免疫学的薬剤で、治療用又は診断／検出用の金属キレート錯体あるいは治療用又は診断／検出用のキレーターに結合し、又はそれらと会合する後に投与されるリンカー部分と反応し得る免疫学的薬剤が依然として求められている。
本発明は、結腸直腸がん、膵臓がん及び卵巣がんを含む様々ながんに対する組換えにより製造されたキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体及びヒトモノクローナル抗体に関する。キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体及びヒトモノクローナル抗体は、完全なネズミ抗体よりもヒト抗マウス抗体の産生が少なくなる。さらに、これらの抗体が診断試薬又は治療試薬に対して共有結合的にコンジュゲート化されたとき、抗体はその結合特性を保持している。さらに、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体が、ＩｇＧ１の場合と同様に、患者において免疫学的に機能的であり得るヒト定常領域を有するならば、これらはまた、むき出し状態の（すなわち、非コンジュゲート型）抗体としてそのような腫瘍に対して活性にすることができ、そのため、化学療法及び放射線などの他の治療様式の抗腫瘍作用もまた強化し得る。
結腸直腸がん、膵臓がん及び卵巣がんは、依然としてがんによる死亡の重要な一因である。しかしながら、従来の化学療法及び放射線療法に対するそれらの応答は雑多なものである。さらに、これらの従来の治療形態には、それらの有用性を制限する様々な毒性副作用がある。
モノクローナル抗体の使用により、従来の化学療法及び放射線療法に対する代替法が提供される。腫瘍特異的モノクローナル抗体及び腫瘍関連モノクローナル抗体は、処置治療法において、単独（むき出し状態の抗体治療）で、又はコンジュゲート体として機能し得る。放射性核種又は他の細胞傷害性薬剤に対してコンジュゲートされた標的化モノクローナル抗体の使用により、そのような薬剤を腫瘍部位に直接的に送達し、それにより正常な組織が毒性薬剤に曝されることを制限することができるという可能性が提供される（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、Ｓｅｍｉｎ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、１９：３３２（１９８９）（非特許文献６）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＤＭ、放射免疫療法、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａｎｎｕａｌ ２００１、Ｌ．Ｆｒｅｅｍａｎ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２００１、１６７頁〜２０６頁（非特許文献７））。近年、抗体に基づいた治療の潜在的可能性及び腫瘍関連抗原の局在性におけるその正確性が研究室及び臨床の両方の研究で明らかにされている（例えば、Ｔｈｏｒｐｅ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１：４２（１９９３）（非特許文献８）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１：６４（１９９４）（非特許文献９）；Ｂａｌｄｗｉｎら、米国特許第４，９２３，９２２号（特許文献４）及び同第４，９１６，２１３号（特許文献５）；Ｙｏｕｎｇ、米国特許第４，９１８，１６３号（特許文献６）；米国特許第５，２０４，０９５号（特許文献７）；Ｉｒｉｅら、米国特許第５，１９６，３３７号（特許文献８）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、米国特許第５，１３４，０７５号（特許文献９）及び同第５，１７１，６６５号（特許文献１０）；Ｔｈｏｒｐｅら、米国特許第６，３４２，２２１号（特許文献１１）；Ｅｐｓｔｅｉｎら、米国特許第５，９６５，１３２号（特許文献１２）、同第６，００４，５５４号（特許文献１３）、同第６，０７１，４９１号（特許文献１４）、同第６，０１７，５１４号（特許文献１５）、同第５，８８２，６２６号（特許文献１６）及び同第５，０１９，３６８号（特許文献１７）を参照のこと）。腫瘍による抗体取り込みが、注射された総用量のわずかに０．０１％〜０．００１％の範囲と一般には低い（Ｖａｕｇｈａｎら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ．、６０：５６７（１９８７）（非特許文献１０））ことを理由の一部として、一般に、腫瘍の場所を突き止めるために、腫瘍関連マーカーに対する放射標識された抗体又は抗体フラグメントを使用することは、治療のためよりも成功している。腫瘍に対する投薬量を増大させるために放射標識の濃度を増大させることは、健康な組織の放射能被爆をも増大させるので、一般には逆効果である。
Ｍｕ−９は、結腸特異的抗原−ｐムチン（ＣＳＡｐ）に対するＩｇＧ１サブタイプのネズミモノクローナル抗体である。ＣＳＡｐは、膵臓がん及び卵巣がんだけでなく、結腸直腸がんにおいて高い割合で存在する腫瘍関連抗原である（Ｇｏｌｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５０：６４０５（１９９０）（非特許文献１１）、及びそれにおける引用参考文献）。前臨床試験及び臨床試験において、この抗体は優れた腫瘍ターゲッティング能を示している（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２２：２９２（１９８９）（非特許文献１２）；Ｓｈａｒｋｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ、７３（ｓｕｐｐｌ．）：８６４（１９９４）（非特許文献１３））。Ｍｕ−９は、循環に存在しないエピトープを認識するので、腫瘍抗原をターゲッティングする他の抗体を上回る利点を有している（Ｐａｎｔら、Ｃａｎｃｅｒ、５０：９１９（１９８２）（非特許文献１４））。循環している抗原は、その抗体により、循環性の免疫複合体が形成され、これにより、腫瘍のターゲッティング並びに抗体の薬物動態学及び生物分布が変化し得るので、抗体治療の送達を変化させることができる。
ほとんどの他の有望な非ヒト抗体の場合のように、ネズミＭｕ−９の臨床的使用は、抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答のヒトにおける発達によって制限されることがある。これにより、診断／検出及び治療における抗体の有用性が制限され得る。これは、潜在的なアナフィラキシー問題のためだけでなく、循環している抗体の大部分が、循環している抗マウス抗体によって複合体形成され、隔離され得るためでもある。ＨＡＭＡの産生はまた、ネズミ抗体に基づく免疫アッセイの正確性にも影響を及ぼし得る。従って、ＨＡＭＡ応答は、一般に、Ｍｕ−９抗体の最大限の診断的可能性及び治療的可能性を実現するための潜在的な障害となっている。
治療又は診断／検出における薬剤使用法としてＭｕ−９抗体の価値を最大限にするために、そして多回及び連続的な投与における薬剤使用法及び状況でのその有用性を増大させるために、本発明の目的は、Ｍｕ−９の抗原結合特異性を保持することによってＭｕ−９に関連するが、投与された被験体において低下したＨＡＭＡ応答又は他の免疫応答を誘発する、マウス−ヒトのキメラｍＡｂ（ｃＭｕ−９）、完全なヒトｍＡｂ、及びヒト化ｍＡｂ（ｈＭｕ−９）を提供することである。
本発明の別の目的は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ｃＭｕ−９ｍＡｂ及びヒトＭｕ−９ｍＡｂ及びｈＭｕ−９ｍＡｂの軽鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を提供することである。
本発明のさらなる目的は、治療剤又は診断／検出剤を含有する、ｃｈＭｕ−９ｍＡｂ及びヒトＭｕ−９ｍＡｂ及びｃＭｕ−９ｍＡｂのコンジュゲート体を提供することである。
本発明の別の目的は、様々な抗体とＣＳＡｐ抗体との組合せ、又は様々な抗体と他のがん腫ターゲッティング抗体との組合せを提供することであり、この場合、前記抗体はむき出し状態の免疫グロブリンとして使用することができ、又は薬物、毒素、同位体、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト及び他の治療増強成分とのコンジュゲート体として使用することができる。
本発明のさらに別の目的は、本発明のヒト化ＭＡｂ及びキメラＭＡｂ及び完全なヒトＭＡｂを利用する治療法及び診断／検出法を提供することである。
米国特許第４，８６３，７１３号 Ｂａｒｂｅｔら、米国特許第５，２５６，３９５号 米国特許第５，２７４，０７６号 Ｂａｌｄｗｉｎら、米国特許第４，９２３，９２２号 米国特許第４，９１６，２１３号 Ｙｏｕｎｇ、米国特許第４，９１８，１６３号 米国特許第５，２０４，０９５号 Ｉｒｉｅら、米国特許第５，１９６，３３７号 Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、米国特許第５，１３４，０７５号 米国特許第５，１７１，６６５号 Ｔｈｏｒｐｅら、米国特許第６，３４２，２２１号 Ｅｐｓｔｅｉｎら、米国特許第５，９６５，１３２号 米国特許第６，００４，５５４号 米国特許第６，０７１，４９１号 米国特許第６，０１７，５１４号 米国特許第５，８８２，６２６号 米国特許第５，０１９，３６８号
Ｇｏｏｄｗｉｎら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３３：１３６６〜１３７２（１９９２） Ｋｒａｎｅｎｂｏｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（ｓｕｐｐｌ．）、５５：５８６４ｓ〜５８６７ｓ（１９９５） Ｃａｎｃｅｒ（ｓｕｐｐｌ．）、８０：２３９０〜２３９７（１９９７） Ｂｏｄｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：３７３〜３７９（１９９５） Ｓｃｈｕｈｍａｃｈｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１１５〜１２３（１９９５） Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、Ｓｅｍｉｎ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、１９：３３２（１９８９） Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＤＭ、放射免疫療法、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａｎｎｕａｌ ２００１、Ｌ．Ｆｒｅｅｍａｎ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２００１、１６７頁〜２０６頁 Ｔｈｏｒｐｅ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１：４２（１９９３） Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１：６４（１９９４） Ｖａｕｇｈａｎら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ．、６０：５６７（１９８７） Ｇｏｌｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５０：６４０５（１９９０） Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２２：２９２（１９８９） Ｓｈａｒｋｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ、７３（ｓｕｐｐｌ．）：８６４（１９９４） Ｐａｎｔら、Ｃａｎｃｅｒ、５０：９１９（１９８２）
（発明の概要）
本発明は、結腸特異的抗原−ｐムチン（ＣＳＡｐ）抗原に結合するモノクローナル（ＭＡｂ）抗体又はそのフラグメントを提供する。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体又はそのフラグメントはＭｕ−９エピトープに結合する。さらに好ましくは、本発明のモノクローナル抗体又はそのフラグメントはヒト化され、又はキメラであり、又は完全なヒト由来である。
本発明はまた、ヒト化Ｍｕ−９（ｈＭｕ−９）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はそのフラグメントを提供する。本発明のｈＭｕ−９抗体又はフラグメントは非ヒトＭｕ−９抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有しており、それらはヒト抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域に連結され、そしてフレームワーク（ＦＲ）領域は続けてヒト抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域に連結されている。このヒト化抗体又はフラグメントは、元のＭｕ−９抗体のＣＳＡｐ抗原特異性を保持しているが、ヒト被験体における免疫原性が小さくなっている。
別の態様において、本発明は、キメラなＭｕ−９（ｃＭｕ−９）モノクローナル抗体又はそのフラグメントを提供する。本発明のｃＭｕ−９抗体又はフラグメントは非ヒトＭｕ−９抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含有しており、それらはヒト抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域に連結されている。このキメラ抗体は、元のＭｕ−９抗体のＣＳＡｐ抗原特異性を保持しているが、ヒト被験体における免疫原性が小さくなっている。
本発明ではまた、完全なヒトＭｕ−９抗体及びそのフラグメントも考えられる。
本発明ではまた、ネズミ抗ＣＳＡｐ ＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域と、ヒト抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域とを含むヒト化抗体又はそのフラグメントも考えられる。この場合、ヒト化ＣＳＡｐ ＭＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲは、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、ＫＶＳＮＲＦＳのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、ＦＱＧＳＲＶＰＹＴのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含み、そしてヒト化抗ＣＳＡｐ ＭＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲは、ＥＹＶＩＴのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、ＥＩＹＰＧＳＧＳＴＳＹＮＥＫＦＫのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、ＥＤＬのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む。
本発明はさらに、ネズミ抗ＣＳＡｐ ＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域と、ヒト抗体の重鎖定常領域とを含むＣＤＲグラフトされたヒト化重鎖を提供する。この場合、ヒト化抗ＣＳＡｐ ＭＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲは、ＥＹＶＩＴのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、ＥＩＹＰＧＳＧＳＴＳＹＮＥＫＦＫのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、ＥＤＬのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む。
関連において、本発明は、ネズミ抗ＣＳＡｐ ＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体の軽鎖可変領域のフレームワーク領域と、ヒト抗体の軽鎖定常領域とを含むＣＤＲグラフトされたヒト化軽鎖を提供する。この場合、ヒト化抗ＣＳＡｐ ＭＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲは、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、ＫＶＳＮＲＦＳのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、ＦＱＧＳＲＶＰＹＴのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む。
本発明はさらに、本明細書中に記載される抗ＣＳＡｐ抗体のいずれか１つの抗ＣＳＡｐ ＭＡｂ又はそのフラグメントあるいはそれらの抗体融合タンパク質又はそのフラグメントを含む抗体成分を含む診断／検出用免疫コンジュゲート体に関する。この場合、抗体成分は少なくとも１つの診断／検出剤に結合している。好ましくは、診断／検出用免疫コンジュゲート体は少なくとも１つの光活性な診断／検出剤を含む。より好ましくは、光活性な診断／検出剤は色素原又は色素を含む。さらに好ましくは、診断／検出剤は、２０ｋｅＶ〜２，０００ｋｅＶの間のエネルギーを有する放射性核種である。
関連において、本発明はさらに、本明細書中に記載される抗ＣＳＡｐ抗体のいずれか１つの抗ＣＳＡｐ ＭＡｂ又はそのフラグメントあるいはそれらの抗体融合タンパク質又はそのフラグメントを含む抗体成分を含む治療用免疫コンジュゲート体に関する。この場合、抗体成分は少なくとも１つの治療剤に結合している。好ましい実施形態において、治療剤は、放射性核種、ホウ素原子、ガドリニウム原子又はウラン原子、免疫調節因子、サイトカイン、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、酵素阻害剤、光活性な治療剤、細胞傷害性薬物、毒素、血管形成阻害剤、第２の異なる抗体、及びそれらの組合せである。治療用免疫コンジュゲート体が放射性核種であるとき、そのエネルギーは好ましくは２０ｋｅＶ〜１０，０００ｋｅＶの間である。
本発明はさらに、ＣＳＡｐ標的抗原に対する親和性を有する１つ以上の抗原結合部位と、ハプテン分子に対する親和性を有する１つ以上のハプテン結合部位とを含む多価かつ多重特異性の抗体又はそのフラグメントを提供する。
本発明はまた、本明細書中に記載されるように少なくとも２つの抗ＣＳＡｐ ＭＡｂ又はそのフラグメントを含む抗体融合タンパク質又はそのフラグメントに関する。同様に、本発明では、本明細書中に記載されるように少なくとも１つの第１の抗ＣＳＡｐ ＭＡｂ又はそのフラグメントと、本発明のそのような抗ＣＳＡｐ抗体とは異なる少なくとも１つの第２のＭＡｂ又はそのフラグメントとを含む抗体融合タンパク質又はそのフラグメントが考えられる。
本発明はまた、被験体における悪性腫瘍を処置する方法を提供する。この場合、この方法は、抗ＣＳＡｐ抗体又はそのフラグメントの治療有効量を、薬学的に受容可能なビヒクルに配合して前記被験体に投与する工程を含む。
同様に、本発明は、被験体における悪性腫瘍を処置又は診断／検出する方法を提供する。この場合、この方法は、（ｉ）処置又は診断／検出を必要とする被験体に本発明の抗体又はそのフラグメントを投与すること、（ｉｉ）結合していないタンパク質の量が被験体の血流から除かれるために十分な時間待つこと、そして（ｉｉｉ）抗体の結合部位に結合する、診断剤又は治療剤又はその組合せを含むキャリア分子を前記被験体に投与することを含む。
本発明はまた、
（ａ）本明細書中に記載されるような抗ＣＳＡｐ ＭＡｂ又はそのフラグメントと、
（ｂ）そのようなＭＡｂ又はそのフラグメントの少なくとも２つを含む抗体融合タンパク質又はそのフラグメントと、
（ｃ）本発明の抗ＣＳＡｐ抗体のいずれか１つの前記ＭＡｂ又はそのフラグメントを含む少なくとも１つの第１の抗ＣＳＡｐ ＭＡｂ又はそのフラグメントと、本発明のそのようなＭＡｂ又はそのフラグメントとは異なる少なくとも１つの第２のＭＡｂ又はそのフラグメントとを含む抗体融合タンパク質又はそのフラグメントと、
（ｄ）請求項１〜４７のいずれか一項に記載される前記ＭＡｂ又はそのフラグメントとを含む少なくとも１つの第１のＭＡｂ又はそのフラグメントと、請求項１〜４７のいずれか一項に記載されるＭＡｂ又はそのフラグメントとは異なる少なくとも１つの第２のＭＡｂ又はそのフラグメントとを含む抗体融合タンパク質又はそのフラグメントで、前記第２のＭＡｂが、ＣＥＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、Ａ３、ＫＳ−１、ＣＤ４０及びＶＥＧＦの抗体、及び抗体Ａ３３、並びにそれらの組合せからなる群より選択される、抗体融合タンパク質又はそのフラグメントと
からなる群より選択される抗ＣＳＡｐ又はそのフラグメントをコードする核酸を含むＤＮＡ配列を提供する。
本発明はまた、診断／検出剤又は治療剤又はそれらの組合せを標的に送達する方法に関する。この場合、この方法は、（ｉ）本発明の抗ＣＳＡｐ抗体のいずれか１つの抗体又はそのフラグメントを被験体に投与するステップと、（ｉｉ）結合していないタンパク質の量が被験体の血流から除かれるために十分な時間待つステップと、そして（ｉｉｉ）前記抗体の結合部位に結合する、診断／検出剤又は治療剤又はそれらの組合せを含むキャリア分子を前記被験体に投与するステップとを含む。
本明細書中にはまた、被験体における悪性腫瘍を治療する方法であって、抗体又はそのフラグメントの治療有効量、あるいは少なくとも２つのＭＡｂ又はそのフラグメントを含む抗体融合タンパク質又はそのフラグメントの治療有効量を、薬学的に受容可能な賦形剤に配合して前記被験体に投与するステップを含む方法が記載される。この場合、少なくとも１つの抗ＣＳＡｐ ＭＡｂ又はそのフラグメントあるいは融合タンパク質又はそのフラグメントは本明細書中に記載される通りである。
本発明はさらに、被験体におけるがん細胞を治療する方法に関する。この場合、この方法は、（ｉ）本発明の抗ＣＳＡｐ抗体のいずれか１つのむき出し状態の抗ＣＳＡｐ ＭＡｂ又はそのフラグメントあるいはむき出し状態の抗体融合タンパク質又はそのフラグメントを含む組成物の治療有効量を前記被験体に投与すること、（ｉｉ）むき出し状態の抗ＣＳＡｐ ＭＡｂ又はそのフラグメントあるいはむき出し状態の抗体融合タンパク質又はそのフラグメントを薬学的に好適な賦形剤に配合することを含む。
さらなる態様において、本発明は、ｈＭｕ−９又はヒトＭｕ−９又はｃＭｕ−９が診断／結合剤又は治療剤に結合しているコンジュゲート体を提供する。
さらなる態様において、本発明により、非コンジュゲート型（むき出し状態）のｈＭｕ−９又はヒトＭｕ−９又はｃＭｕ−９が、放射線、化学療法及び手術などの他の従来の治療様式並びに実験的な治療様式と組み合わせて、又は他の非ＣＳＡｐ抗体を伴うコンジュゲート体と一緒でさえも投与されること、そしてそのよう組合せが治療サイクルにおいて同時であってもよく、又は異なるときであってもよいことが規定される。
さらに別の態様において、本発明は、上記に記載される抗体又はコンジュゲート体の有効量を投与することを含む、悪性腫瘍を診断／検出又は処置する方法を提供する。抗体又はコンジュゲート体は薬学的に受容可能なビヒクルに配合することができる。
さらなる態様において、本発明は、ｈＭｕ−９ｍＡｂ又はヒトＭｕ−９ｍＡｂ又はｃＭｕ−９ｍＡｂの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。同様に、本発明は、ｈＭｕ−９ｍＡｂ又はヒトＭｕ−９ｍＡｂ又はｃＭｕ−９ｍＡｂの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
さらに別の態様において、本発明は、Ｍｕ−９抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列を提供する。
本発明はまた、なかでも、標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、広範囲の診断的適用及び治療的適用における使用のために修飾され得るターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性の抗体又は抗体フラグメントを提供しようとするものである。
本発明者らは、１つ以上の診断／検出剤又は治療剤を運ぶことができる表的なコンジュゲート体に対するｂｓＡｂを惹起させることは好都合であることを発見した。この技術を用いることによって、キレーター、金属キレート錯体、治療剤又は診断／検出剤の特性を、異なる様々な適用に、それぞれの新しい適用のために新しいｂｓＡｂを惹起させることなく合わせるために変化させることができる。さらに、この方法を使用することによって、２つ以上の異なるキレーター又は金属キレート錯体又は治療剤を本発明のｂｓＡｂとともに使用することができる。
本発明では、被験体における疾患組織を処置又は同定する方法が提供される。この場合、この方法は、
（Ａ）標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有し、標的組織と特異的に結合するアームがＭｕ−９抗体である二重特異性の抗体又は抗体フラグメントを被験体に投与するステップと、
（Ｂ）任意選択的に、クリアリング用組成物を被験体に投与し、前記組成物により、局在化していない抗体又は抗体フラグメントを循環からクリアリングするステップと
（Ｃ）前記二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの前記少なくとも１つの他のアームによって認識され得るエピトープを少なくとも１つ含むか、又はそのようなエピトープを少なくとも１つ有するキャリア部分と、１つ以上のコンジュゲート化された治療剤又は診断剤とを含む第１のターゲッティング可能なコンジュゲート体を被験体に投与ステップと、
（Ｄ）前記治療剤が酵素であるときには、被験体に、
１）プロドラッグ（この場合、前記酵素は標的部位において前記プロドラッグを薬物に変換することができる）又は、
２）前記被験体において解毒されて、毒性がより低い中間体を形成し得る薬物（この場合、前記酵素は前記解毒された中間体を毒性形態に再変換することができ、従って、標的部位において前記薬物の毒性を増大させることができる）、
３）天然のプロセスによって前記被験体において活性化され、そして毒性がより低い中間体への変換による解毒を受けるプロドラッグ（この場合、前記酵素は前記解毒された中間体を毒性形態に再変換することができ、従って、標的部位において前記薬物の毒性を増大させることができる）、又は
４）前記二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの前記少なくとも１つの他のアームによって認識され得るエピトープを少なくとも１つ含むか、又はそのようなエピトープを少なくとも１つ有するキャリア部分と、プロドラッグとを含む第２のターゲッティング可能なコンジュゲート体（この場合、前記酵素は標的部位において前記プロドラッグを薬物に変換することができる）
をさらに投与するステップと
を含む。
本発明はさらに、少なくとも２つのＨＳＧハプテンを含むターゲッティング可能なコンジュゲート体を提供する。
本明細書中ではまた、哺乳動物においてＣＳＡｐを発現している腫瘍を検出又は処置するための方法が考えられる。この場合、この方法は、
（Ａ）標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含み、標的組織と特異的に結合する１つのアームがＭｕ−９抗体又はそのフラグメントである二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの有効量を投与するステップと、
（Ｂ）下記のコンジュゲート体：
（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
からなる群より選択されるターゲッティング可能なコンジュゲート体を投与するステップ
とを含む。
この方法は、任意選択的に、クリアリング用組成物を被験体に投与し、そして組成物により、局在化していない抗体又は抗体フラグメントを循環からクリアリングすることを含む。
さらに、本発明は、被験体における疾患組織を処置又は同定するために有用なキットを提供する。この場合、このキットは、
（Ａ）標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有し、標的組織と特異的に結合する前記１つのアームがＭｕ−９抗体又はそのフラグメントである二重特異性の抗体又は抗体フラグメントと、
（Ｂ）前記二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの前記少なくとも１つの他のアームによって認識され得るエピトープを少なくとも１つ含むか、又はそのようなエピトープを少なくとも１つ有するキャリア部分と、１つ以上のコンジュゲート化された治療剤又は診断剤とを含む第１のターゲッティング可能なコンジュゲート体と、
（Ｃ）任意選択的に、局在化しなかった抗体及び抗体フラグメントを循環からクリアリングするために有用なクリアリング用組成物と、
（Ｄ）任意選択的に、前記第１のターゲッティング可能なコンジュゲート体にコンジュゲート化されている前記治療剤が酵素であるときには、
（１）プロドラッグ（この場合、前記酵素は標的部位において前記プロドラッグを薬物に変換することができる）、
（２）前記被験体において解毒されて、毒性がより低い中間体を形成し得る薬物（この場合、前記酵素は前記解毒された中間体を毒性形態に再変換することができ、従って、標的部位において前記薬物の毒性を増大させることができる）、
（３）天然のプロセスによって前記被験体において活性化され、そして毒性がより低い中間体への変換による解毒を受けるプロドラッグ（この場合、前記酵素は前記解毒された中間体を毒性形態に再変換することができ、従って、標的部位において前記薬物の毒性を増大させることができる）、又は
（４）前記二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの前記少なくとも１つの他のアームによって認識され得るエピトープを少なくとも１つ含むか、又はそのようなエピトープを少なくとも１つ有するキャリア部分と、プロドラッグとを含む第２のターゲッティング可能なコンジュゲート体（この場合、前記酵素は標的部位において前記プロドラッグを薬物に変換することができる）
を含む。
本明細書中に記載されるように、ターゲッティング可能なコンジュゲート体は、
（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
からなるものでよい。
本発明はまた、ターゲッティング可能なコンジュゲート体についてスクリーニングする方法に関する。この場合、この方法は、
（Ａ）前記ターゲッティング可能な構築物を、標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアーム、及び前記ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームを有し、標的組織と特異的に結合する前記１つのアームがＭｕ−９抗体又はそのフラグメントである二重特異性の抗体又は抗体フラグメントと接触させて、混合物を得るステップと、
（Ｂ）任意選択的に、前記混合物をインキュベーションするステップと、
（Ｃ）前記混合物を分析するステップと
を含む。
本発明はさらに、ＣＳＡｐを発現している哺乳動物内の悪性の組織又は細胞を画像化するための方法を提供する。この場合、この方法は、
（Ａ）標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含み、標的組織と特異的に結合する前記１つのアームがＭｕ−９抗体又はそのフラグメントである二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの有効量を投与するステップと、
（Ｂ）下記のコンジュゲート体：
（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
からなる群より選択されるターゲッティング可能なコンジュゲート体を投与するステップと
を含む。
本発明はまた、被験体においてＣＳＡｐを発現している疾患組織を手術中及び内視鏡的及び血管内で同定／明示する方法を提供する。この場合、この方法は、検出可能な量のＣＳＡｐ標識抗体（好ましくは、フラグメント又はサブフラグメント）を投与し、それにより、ターゲッティングされなかった標識抗体又はフラグメントに対するクリアリング剤を必要とすることなく前記標識ＣＳＡｐ抗体／フラグメントの投与４８時間以内に、好適なプローブ又は小型カメラによって標識が検出されることを含む。
関連において、本発明は、被験体においてＣＳＡｐを発現している疾患組織を手術中に同定／明示する方法を提供する。この場合、この方法は、
（Ａ）ＣＳＡｐを発現している標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含み、標的組織と特異的に結合する前記１つのアームがＭｕ−９抗体又はそのフラグメントである二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの有効量を投与するステップと、
（Ｂ）下記のコンジュゲート体：
（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
からなる群より選択されるターゲッティング可能なコンジュゲート体を投与するステップと
を含む。
本発明はさらに、被験体においてＣＳＡｐを発現している疾患組織を内視鏡により同定するための方法に関する。この場合、この方法は、
（Ａ）ＣＳＡｐを発現している標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含み、標的組織と特異的に結合する前記１つのアームがＭｕ−９抗体又はそのフラグメントである二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの有効量を投与するステップと、
（Ｂ）下記のコンジュゲート体：
（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
からなる群より選択されるターゲッティング可能なコンジュゲート体を投与するステップと
を含む。
本明細書中にはまた、被験体においてＣＳＡｐを発現している疾患組織を血管内で同定するための方法が提供される。この場合、この方法は、
（Ａ）ＣＳＡｐを発現している標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含み、標的組織と特異的に結合する前記１つのアームがＭｕ−９抗体又はそのフラグメントである二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの有効量を投与すること；そして
（Ｂ）下記のコンジュゲート体：
（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
からなる群より選択されるターゲッティング可能なコンジュゲート体を投与するステップと
を含む。
本発明はまた、内視鏡手法、腹腔鏡手法、血管内カテーテル手法又は手術手法のときに病巣部を検出する方法に関する。この場合、この方法は、
（Ａ）ＣＳＡｐ抗原に特異的に結合する第１の抗体結合部位と、ハプテンに特異的に結合する第２の抗体結合部位とを有する二重特異性の抗体又はＦ（ａｂ）２フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントを、そのような手法を受けることになっている被験体に注射して、抗体フラグメントを標的部位において蓄積させるステップと、
（Ｂ）任意選択的に、二重特異性フラグメントの大部分が注射後約２４時間以内に循環からクリアリングされないならば、ガラクトシル化された抗イディオタイプクリアリング剤を使用して、ターゲッティングされなかった抗体フラグメントをクリアリングし、そして標的部位において迅速に局在化し、かつ腎臓を介してクリアリングされる二価の標識されたハプテンを注射するステップと、
（Ｃ）最初の注射の４８時間以内に、検出手段を用いて、標的部位における蓄積した標識の上昇したレベルを近接範囲検出することによってハプテンの存在を検出し、そして前記手法を行うステップと（この場合、前記検出は、造影剤又は消去剤が使用されることなく行われる）
を含む。
好ましい実施形態において、ハプテンは診断用放射性同位体又はＭＲＩ画像増強剤又は蛍光標識で標識される。
本発明はさらに、手術手法、血管内手法、腹腔鏡手法又は内視鏡手法のときに病巣部を近接範囲検出するための方法に関する。この場合、この方法は、
（ａ）そのような手法に対する被験体に、Ｍｕ−９免疫コンジュゲート体又はそのフラグメントの有効量を非経口的に注射するステップと、
（ｂ）注射の４８時間以内に手法を行うステップと、
（ｃ）前記標識された抗体又はそのフラグメントの存在を検出するための検出手段を用いて近接範囲で被験体の到達内部を走査するステップと、
（ｄ）該検出手段を用いて、そのような部位における前記標識された抗体又はそのフラグメントの上昇したレベルを検出することによって、前記標識された抗体又はそのフラグメントの蓄積部位の位置を明らかにするステップと
を含む。
手術中使用及び内視鏡使用及び血管内使用の上記例において、診断化合物に結合している標識は、前記標識検出のために作製された、小型カメラを含む好適な装置又はプローブによって検出することができる（例えば、γ線放出同位体が診断／検出用コンジュゲート体であるときにはγ線検出プローブ）（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第５，７１６，５９５号、同第６，０９６，２８９号及び米国特許出願第０９／３４８，８１８号を参照のこと、これらはその全体を参照することにより、本明細書中に組み込むものとする）。
本発明はまた、なかでも、標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、広範囲の診断的適用及び治療的適用における使用のために修飾され得るターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性の抗体又は抗体フラグメントを提供しようとするものである。
さらに、本発明は、二重特異性抗体と、下記のターゲッティング可能なコンジュゲート体：
（ａ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｂ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｃ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
との組合せを使用する、診断及び治療のプレターゲッティング方法、並びに二重特異性抗体の作成方法、及びそのような方法において使用されるキットを提供する。
本発明者らは、１つ以上の診断剤又は治療剤を運ぶことができるターゲッティング可能なコンジュゲート体に対するｂｓＡｂを惹起させることは好都合であることを発見した。この技術を用いることによって、キレーター、金属キレート錯体、治療剤又は診断剤の特性を、異なる様々な適用に、それぞれの新しい適用のために新しいｂｓＡｂを惹起させることなく合わせるために変化させることができる。さらに、この方法を使用することによって、２つ以上の異なるキレーター又は金属キレート錯体又は治療剤を本発明のｂｓＡｂとともに使用することができる。
本発明は、被験体における疾患組織を処置又は同定する方法に関する。この場合、この方法は、
（Ａ）標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、少なくとも２つのＨＳＧハプテンを含むターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性の抗体又は抗体フラグメントを前記被験体に投与するステップと、
（Ｂ）任意選択的に、前記被験体にクリアリング用組成物を投与し、そして前記組成物により、局在化しなかった抗体又は抗体フラグメントを循環からクリアリングするステップと、
（Ｃ）少なくとも２つのＨＳＧハプテンを含むか、又は少なくとも２つのＨＳＧハプテンを有するキャリア部分を含み、かつ診断用カチオン若しくは治療用カチオン、及び／又は１つ以上のキレート化若しくは化学結合した治療剤若しくは診断剤若しくは酵素を含んでもよいターゲッティング可能なコンジュゲート体を前記被験体に投与するステップと、
（Ｄ）前記ターゲッティング可能なコンジュゲート体が酵素を含むときには、前記被験体に、
（１）プロドラッグ（この場合、前記酵素は標的部位において前記プロドラッグを薬物に変換することができる）、
（２）前記被験体において解毒されて、毒性がより低い中間体を形成し得る薬物（この場合、前記酵素は前記解毒された中間体を毒性形態に再変換することができ、従って、標的部位において前記薬物の毒性を増大させることができる）、又は
（３）天然のプロセスによって前記被験体において活性化され、そして毒性がより低い中間体への変換による解毒を受けるプロドラッグ（この場合、前記酵素は前記解毒された中間体を毒性形態に再変換することができ、従って、標的部位において前記薬物の毒性を増大させることができる）
をさらに投与するステップと
を含む。
本発明はさらに、哺乳動物における標的細胞又は標的組織又は標的病原体を検出又は処置するための方法に関する。この場合、この方法は、
標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含む二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの有効量を投与するステップと、
ここで、前記少なくとも１つのアームが、標的細胞又は標的組織又は標的病原体における相補的な結合性成分に、あるいは標的細胞又は標的組織又は標的病原体によって産生される分子又はそれらに関連する分子における相補的な結合性成分に結合することができ、
下記のコンジュゲート体：
（ａ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｂ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｃ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
からなる群より選択されるターゲッティング可能なコンジュゲート体を投与するステップと
を含む。
本発明はさらに、被験体における疾患組織を処置又は同定する方法に関する。この場合、この方法は、
標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性の抗体又は抗体フラグメントを前記被験体に投与するステップと、
任意選択的に、前記被験体にクリアリング用組成物を投与し、そして前記組成物により、局在化しなかった抗体又は抗体フラグメントを循環からクリアリングするステップと、
下記のコンジュゲート体：
（ａ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｂ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｃ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
からなる群より選択されるターゲッティング可能なコンジュゲート体を投与するステップと
を含む。
本発明はさらに、被験体における疾患組織を処置又は同定するために有用なキットに関する。この場合、このキットは、
（Ａ）標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性の抗体又は抗体フラグメントで、前記コンジュゲート体が、下記のコンジュゲート体：
（ａ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｂ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｃ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
からなる群より選択される、二重特異性の抗体又は抗体フラグメントと、
（Ｂ）前記二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの前記少なくとも１つの他のアームによって認識され得るエピトープを少なくとも１つ含むか、又はそのようなエピトープを少なくとも１つ有するキャリア部分と、１つ以上のコンジュゲート化された治療剤又は診断剤又は酵素とを含むターゲッティング可能なコンジュゲート体と、
（Ｃ）任意選択的に、局在化しなかった抗体又は抗体フラグメントを循環からクリアリングするために有用なクリアリング用組成物と、
（Ｄ）任意選択的に、前記第１のターゲッティング可能なコンジュゲート体が酵素であるときには、
（１）プロドラッグ（この場合、前記酵素は標的部位において前記プロドラッグを薬物に変換することができる）、
（２）前記被験体において解毒されて、毒性がより低い中間体を形成し得る薬物（この場合、前記酵素は前記解毒された中間体を毒性形態に再変換することができ、従って、標的部位において前記薬物の毒性を増大させることができる）、又は
（３）天然のプロセスによって前記被験体において活性化され、そして毒性がより低い中間体への変換による解毒を受けるプロドラッグ（この場合、前記酵素は前記解毒された中間体を毒性形態に再変換することができ、従って、標的部位において前記薬物の毒性を増大させることができる）と
を含む。
本発明はさらに、
（ａ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｂ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｃ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
からなる群より選択されるターゲッティング可能なコンジュゲート体に関する。
本発明はさらに、ターゲッティング可能なコンジュゲート体についてスクリーニングする方法に関する。この場合、この方法は、
前記ターゲッティング可能な構築物を、標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアーム、及び前記ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームを有する二重特異性の抗体又は抗体フラグメントと接触させて、混合物を得ること；
この場合、前記少なくとも１つのアームが、標的細胞又は標的組織又は標的病原体における相補的な結合性成分に、あるいは標的細胞又は標的組織又は標的病原体によって産生される分子又はそれらに関連する分子における相補的な結合性成分に結合することができる；及び
任意選択的に、前記混合物をインキュベーションすること；そして
前記混合物を分析すること
を含む。
本発明はさらに、哺乳動物において正常な組織を画像化するための方法に関する。この場合、この方法は、
標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含む二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの有効量を投与するステップと、
ここで、前記少なくとも１つのアームが、標的細胞又は標的組織又は標的病原体における相補的な結合性成分に、あるいは標的細胞又は標的組織又は標的病原体によって産生される分子又はそれらに関連する分子における相補的な結合性成分に結合することができ、
下記のコンジュゲート体：
（ａ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｂ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｃ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
からなる群より選択されるターゲッティング可能なコンジュゲート体を投与するステップと
を含む。
本発明はさらに、被験体における疾患組織を手術中に同定する方法に関する。この場合、この方法は、
標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含む二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの有効量を投与するステップと、
ここで、前記少なくとも１つのアームが、標的細胞又は標的組織又は標的病原体における相補的な結合性成分に、あるいは標的細胞又は標的組織又は標的病原体によって産生される分子又はそれらに関連する分子における相補的な結合性成分に結合することができ、
下記のコンジュゲート体：
（ａ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｂ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｃ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
からなる群より選択されるターゲッティング可能なコンジュゲート体を投与するステップと
を含む。
本発明はさらに、被験体における疾患組織を内視鏡により同定する方法に関する。この場合、この方法は、
標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含む二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの有効量を投与するステップと、
ここで、前記少なくとも１つのアームが、標的細胞又は標的組織又は標的病原体における相補的な結合性成分に、あるいは標的細胞又は標的組織又は標的病原体によって産生される分子又はそれらに関連する分子における相補的な結合性成分に結合することができ、
下記のコンジュゲート体：
（ａ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｂ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｃ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
からなる群より選択されるターゲッティング可能なコンジュゲート体を投与するステップとを含む。
本発明はさらに、被験体における疾患組織を血管内で同定する方法に関する。この場合、この方法は、
標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含む二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの有効量を投与するステップと、
ここで、前記少なくとも１つのアームが、標的細胞又は標的組織又は標的病原体における相補的な結合性成分に、あるいは標的細胞又は標的組織又は標的病原体によって産生される分子又はそれらに関連する分子における相補的な結合性成分に結合することができ、
下記のコンジュゲート体：
（ａ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｂ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｃ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
からなる群より選択されるターゲッティング可能なコンジュゲート体を投与するステップとを含む。
本発明のこれらの態様及び実施形態並びに他の態様及び実施形態は、下記の説明及び添付された請求項を参照することによって明らかになる。
［発明の詳細な説明］
Ｉ．概略
本発明は抗体及び抗体フラグメントを包含する。抗体フラグメントは、抗体の抗原結合部分であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどである。抗体フラグメントは、完全な抗体によって認識される同じ抗原に結合する。例えば、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体フラグメント又は抗ＣＳＡｐモノクローナル抗体フラグメントは、それぞれ、ＣＤ２２又はＣＳＡｐのエピトープに結合する。
用語「抗体フラグメント」にはまた、特定の抗原に結合して、複合体を形成することによって抗体のように作用する任意の合成タンパク質又は遺伝子操作タンパク質も含まれる。例えば、抗体フラグメントには、単離されたフラグメント、重鎖及び軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによってつながれている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓＦｖタンパク質」）、そして「超可変領域」を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニットが含まれる。これらのいわゆる「超可変領域」又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）の３つが軽鎖又は重鎖の各可変領域において見出されている。それぞれのＣＤＲは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）によって挟まれている。ＦＲは、可変領域の構造的一体性を維持すると考えられている。軽鎖のＣＤＲ及び対応する重鎖のＣＤＲにより、抗原結合部位が形成される。ＣＤＲの「超可変性」により、抗体の特異性の多様性が説明される。
本発明でまた、ヒト抗ＣＳＡｐ抗体、キメラ抗ＣＳＡｐ抗体、ヒト化抗ＣＳＡｐ抗体及びそれらのフラグメントが考えられる。本発明の完全なヒト抗ＣＳＡｐ抗体は、好ましくは、Ｍｕ−９抗原に対するものである。ヒト抗体は、例えば、抗原性の刺激負荷に応答して特定のヒト抗体を産生するように「操作」されている遺伝子組換えマウスから得られる抗体である。この技術では、ヒトの重鎖遺伝子座及び軽鎖遺伝子座の様々なエレメントが、内因性の重鎖遺伝子座及び軽鎖遺伝子座のターゲッティングされた様々な破壊を含有する胚幹細胞株に由来するマウス系統に導入される。遺伝子組換えマウスは、ヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、従って、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを製造するために使用することができる。遺伝子組換えマウスからヒト抗体を得るための様々な方法が、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６（１９９４）；及びＴａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）によって記載される。完全なヒト抗体はまた、遺伝子トランスフェクション法又は染色体トランスフェクション法、並びにファージディスプレー技術によって構築することができ、これらはすべて当分野では知られている。例えば、非免疫化ドナーに由来する免疫グロブリンの可変ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体又はそのフラグメントをインビボで製造することについては、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５３（１９９０）を参照のこと。この技術では、抗体可変ドメインの遺伝子が、繊維状バクテリオファージの主コートタンパク質遺伝子又は微量コートタンパク質遺伝子のいずれかに読み枠を合わせてクローニングされ、ファージ粒子の表面に機能的な抗体フラグメントとして呈示される。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的性質に基づく選択によりまた、そのような性質を示す抗体をコードする遺伝子の選択がもたらされる。このようにして、ファージはＢ細胞の性質のいくつかを模倣する。ファージディスプレーは様々な形式で行うことができ、それらの総説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＣｈｒｉｓｗｅｌｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：５５６４〜５７１（１９９３）を参照のこと。
ヒト抗体はまた、インビトロで活性化されたＢ細胞によって作製することができる。米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号（これらはその全体を参照することによって本明細書に組み込むものとする）を参照のこと。
本発明はまた、キメラな抗ＣＳＡｐモノクローナル抗体又はそのフラグメントを提供する。キメラな抗ＣＳＡｐ抗体又はそのフラグメントは非ヒト抗ＣＳＡｐ抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含有しており、これらはヒト抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域に連結されている。好ましくは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域はネズミ抗ＣＳＡｐ抗体に由来する。好ましい実施形態において、抗ＣＳＡｐ抗体はＣＳＡｐ抗原表面のＭｕ−９エピトープと結合する。従って、Ｍｕ−９抗体は、Ｍｕ−９エピトープに結合する抗ＣＳＡｐ抗体である。
ｃＭｕ−９の作製方法が下記に詳しく記載される。簡単に記載すると、Ｍｕ−９ｍＡｂのＶκ領域及びＶＨ領域をコードするｃＤＮＡが単離され、そしてヒトκ軽鎖定常領域配列及びヒトγ１鎖配列の遺伝子をそれぞれ含む哺乳動物発現ベクターに別々に組換え的にサブクローニングされた。哺乳動物細胞をこれらの２つの組換えＤＮＡで同時トランスフェクションすることにより、元のＭｕ−９ｍＡｂのように、ＣＳＡｐ抗原に強く結合するｃＭｕ−９ｍＡｂの発現がもたらされた。
好ましい実施形態において、ｃＭｕ−９抗体の軽鎖可変領域は配列番号 のアミノ酸（図２Ｂ）を含み、又はｃＭｕ−９抗体の重鎖可変領域は配列番号 のアミノ酸（図２Ａ）を含む。さらに好ましくは、ｃＭｕ−９抗体の軽鎖可変領域は配列番号 のアミノ酸（図２Ｂ）を含み、ｃＭｕ−９抗体の重鎖可変領域は配列番号 のアミノ酸（図２Ａ）を含む。
本発明はさらに、ヒト化Ｍｕ−９（ｈＭｕ−９）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はそのフラグメントを提供する。ｈＭｕ−９抗体又はフラグメントは非ヒトＭｕ−９抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有しており、これらはヒト抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域に連結され、フレームワーク（ＦＲ）領域は続いてヒト抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域に連結されている。このヒト化抗体又はフラグメントは、元のＭｕ−９抗体のＣＳＡｐ抗原特異性を保持しているが、ヒト被験体における免疫原性が小さくなっている。
ｈＭｕ−９の作製方法が下記に詳しく記載される。しかし、簡単に記載すると、ｈＭｕ−９を作製するために、ＶκＤＮＡ及びＶＨＤＮＡのＣＤＲが、上記に記載されるようにｈＭｕ−９を哺乳動物細胞において発現するように、ヒトのＶκ領域及びＶＨ領域のフレームワーク（ＦＲ）配列にそれぞれ組換え的に連結され、続いて、ヒトのκ定常領域及びγ１定常領域にそれぞれ連結される。
本発明の別の実施形態において、ｈＭｕ−９、すなわち、軽鎖可変領域のＣＤＲは、配列番号 のアミノ酸２４〜３４を含むＣＤＲ１（図２Ｂ）と、配列番号 のアミノ酸５０〜５６を含むＣＤＲ２（図２Ｂ）と、配列番号 のアミノ酸８９〜９７を含むＣＤＲ３（図２Ｂ）とを含み、そして重鎖可変領域のＣＤＲは、配列番号 のアミノ酸３１〜３５を含むＣＤＲ１（図２Ａ）と、配列番号 のアミノ酸５０〜６４を含むＣＤＲ２（図２Ａ）と、配列番号 のアミノ酸９５〜９７を含むＣＤＲ３（図２Ａ）とを含む。
本発明の他の好ましい実施形態には、配列番号 の軽鎖可変領域（図４Ｂ）及び／又は配列番号 の重鎖可変領域（図４Ａ）を含む抗ＣＳＡｐ抗体フラグメントが含まれる。
本明細書において、表現「ｃＭｕ−９」又は表現「ｃＭｕ−９ｍＡｂ」は、非ヒトＶｋ領域及び非ヒトＶＨ領域をヒトの定常的な軽鎖及び重鎖にそれぞれ連結又はサブクローニングすることによって構築されるキメラなモノクローナル抗体を示すことが意図される。表現「ｈＭｕ−９」又は表現「ｈＭｕ−９ｍＡｂ」は、ｃＭｕ−９内の非ヒトＦＲ配列をヒトフレームワーク領域の配列で置換することによる、キメラなモノクローナル抗体のヒト化を示すことが意図される。好ましくは、本発明の抗ＣＳＡｐヒト化抗体及びそのフラグメントは、対応する非ヒト軽鎖フレームワ−ク領域又は非ヒト重鎖フレームワーク領域の少なくとも１つのアミノ酸が保持されているフレームワーク領域配列を含む。好ましくは、ネズミ抗体のＦＲに由来するアミノ酸が、対応するヒト化抗体の同じ位置において保持されている。
キメラ抗体は、１つの種に由来する抗体（好ましくは、齧歯類抗体）の相補性決定基（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含有する組換えタンパク質であり、その一方で、抗体分子の定常ドメインはヒト抗体の定常ドメインに由来する。獣医学的適用のためには、キメラ抗体の定常ドメインは、ネコ又はイヌなどの他の種の定常ドメインに由来し得る。
ヒト化抗体は、１つの種に由来する抗体（例えば、齧歯類抗体）に由来するＣＤＲが、齧歯類抗体の重鎖可変鎖及び軽鎖可変鎖からヒトの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインに移されている組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインはヒト抗体の定常ドメインに由来する。
本発明ではまた、抗ＣＳＡｐ抗体フラグメントが考えられる。抗体フラグメントは、抗体の抗原結合部分であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどである。抗体フラグメントは、完全な抗体のＣＤＲを１つ以上含有しており、完全な抗体によって認識される同じ抗原に結合する。例えば、抗結腸特異的抗原−ｐ（ａｎｔｉ−ｃｏｌｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐ；ＣＳＡｐ）モノクローナル抗体フラグメントは結腸特異的抗原−ｐのエピトープに結合する。
また、本発明は、標的組織に対して反応し得る少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に対して反応し得る少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性の抗体又は抗体フラグメントを提供する。ターゲッティング可能な構築物は、キャリア部分と、少なくとも２ユニットの認識可能なハプテンとから構成される。認識可能なハプテンの例には、ヒスタミンスクシニルグリシン（ＨＳＧ）及びフルオレセインイソチオシアナートが含まれるが、これらに限定されない。ターゲッティング可能な構築物は、疾患組織を処置又は同定するために有用な様々な薬剤にコンジュゲートすることができる。コンジュゲートされた薬剤の例には、キレーター、金属キレート錯体、薬物、毒素（例えば、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌のエンドトキシンＡ、アメリカヤマゴボウの抗ウイルス性タンパク質、ゲロニン、ジフテリアトキシン、シュードモナスのエキソトキシン、シュードモナスのエンドトキシン）及び他のエフェクター分子が含まれるが、これらに限定されない。さらに、プロドラッグを活性化させるために有用な酵素、又は薬物の標的特異的な毒性を増大させるために有用な酵素をターゲッティング可能な構築物にコンジュゲートすることができる。従って、ターゲッティング可能な構築物に対して反応し得るｂｓＡｂの使用により、様々な治療的適用及び診断／検出的適用が、それぞれの適用について新しいｂｓＡｂを惹起させることなく可能になる。
さらに、本発明には、哺乳動物における標的細胞又は標的組織又は標的病原体を検出又は処置するための方法が含まれる。この場合、この方法は、標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含む二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの有効量を投与することを含む。本明細書中で使用される用語「病原体」には、菌類、ウイルス（例えば、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、シミアンウイルス４０、呼吸器合胞体ウイルス、マウス乳腫瘍ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン−バールウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イボウイルス及びブルータングウイルス）、寄生虫、及び細菌（例えば、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、Ｂ型インフルエンザ菌、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、らい菌、ウシ流産菌、結核菌及び破傷風毒素）が含まれるが、これらに限定されない。米国許第５，３３２，５６７号を参照のこと。
ＣＳＡｐ抗原をターゲッティングしない抗体を本発明において使用することができる。例えば、がん腫に関連する抗原に対する抗体、特に胃腸系のがん腫（結腸、直腸、膵臓の腫瘍）及び卵巣がんに関連する他の抗原に対する抗体を、ＣＳＡｐ抗体と組み合わせることができ、そしてＣＳＡｐ抗体との融合パートナーとしてもまた使用することができる。壊死、血管形成因子、免疫応答因子（例えば、ＣＤ４０）、並びにがん遺伝子の産物に関連する細胞内抗原及び他の抗原に対する抗体もまた、ＣＳＡｐ抗体と組み合わせて使用することができ、そしてＣＳＡｐ抗体に対する融合パートナーとして使用することができる。抗壊死抗体が、Ｅｐｓｔｅｉｎらの米国特許第６，０７１，４９１号、同第６，０１７，５１４号、同第５，０１９，３６８号及び同第５，８８２，６２６号に記載され、参照することにより本明細書に組み込まれる。
キメラ抗ＣＳＡｐ抗体及びヒト化抗ＣＳＡｐ抗体及びヒト抗ＣＳＡｐ抗体又はそれらのフラグメントと診断試薬又は治療試薬との間の免疫コンジュゲート体を、薬学的に受容可能なビヒクル（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９０を参照のこと）に配合して、調製することができる。免疫コンジュゲート体は、抗体成分と治療剤又は診断剤とのコンジュゲート体である。ランダム（非特異的）なコンジュゲート化は、結合活性が低下した生成物をもたらすことが多いので、例えば、炭水化物部分を介して、例えば、酸化された炭水化物誘導体などを介して試薬が抗体に部位特異的に結合しているコンジュゲート体を使用することが好ましい。炭水化物部分は、免疫反応性を変化させることなく、部位特異的な変異誘発によって抗体に導入することができる。そのようなコンジュゲート体の製造方法並びに診断剤及び治療剤におけるそれらの使用が、例えば、Ｓｈｉｈらの米国特許第５，０５７，３１３号；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４１：８３２（１９８８）；及びＨａｎｓｅｎらの米国特許第５，４４３，９５３号に示される（これらの内容は参照することによって本明細書中に組み込まれる）。ポリマーキャリアを使用しない、酸化された炭水化物に対する試薬の直接的な結合が、ＭｃＫｅａｒｎらの米国特許第５，１５６，８４０号に記載される（これもまた参照することにより組み込まれる）。
広範囲の診断／検出試薬及び治療試薬を本発明の抗体に都合よくコンジュゲートすることができる。これらには、種々の種類の化学治療剤、例えば、アントラサイクリン類、抗生物質、アルキル化剤、抗細胞***阻止剤、抗血管形成剤、植物アルカロイド、ＣＯＸ阻害剤、代謝拮抗剤など、例えば、ドキソルビシン、ＣＰＴ−１１、オキサリプラチン、メトトレキサート、タキソール及び他のタキサン類など；蛍光性分子などの検出可能な標識、又は重金属若しくは放射性核種などの細胞傷害性薬剤が複合体化され得るキレーター、例えば、ＤＴＰＡなど；シュードモナスのエキソトキシンなどの毒素、ＲＮＡｓｅ、ゲロニンなどが含まれるが、これらに限定されない。
治療剤は、抗体成分とは別個に、若しくは抗体成分と同時に、若しくは抗体成分と連続して投与されるか、又は抗体成分（すなわち、抗体若しくは抗体フラグメント）若しくはサブフラグメントにコンジュゲート化される、疾患の処置において有用な分子又は原子である。治療剤の例には、抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、酵素、酵素阻害剤、ヌクレアーゼ、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、免疫調節因子、キレーター、ホウ素化合物、ウラン原子、光活性な薬剤又は色素、及び放射性核種が含まれる。β粒子放出によって実質的に崩壊する、治療剤における放射性核種には、Ｐ−３２、Ｐ−３３、Ｓｃ−４７、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｓｅ−７５、Ａｓ−７７、Ｓｒ−８９、Ｙ−９０、Ｍｏ−９９、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ａｇ−１１１、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｐｒ−１４２、Ｐｒ−１４３、Ｐｍ−１４９、Ｓｍ−１５３、Ｔｂ−１６１、Ｈｏ−１６６、Ｅｒ−１６９、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８９、Ｉｒ−１９４、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｐｂ−２１１、Ｐｂ−２１２及びＢｉ−２１３が含まれるが、これらに限定されない。有用なβ粒子放出核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０ｋｅＶ〜５，０００ｋｅＶであり、より好ましくは１００ｋｅＶ〜４，０００ｋｅＶであり、最も好ましくは５００ｋｅＶ〜２，５００ｋｅＶである。オージェ放出粒子を伴って実質的に崩壊する放射性核種もまた好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ及びＩｒ−１９２。有用なオージェ粒子放出核種の崩壊エネルギーは、好ましくは１，０００ｋｅＶ未満であり、より好ましくは１００ｋｅＶ未満であり、最も好ましくは７０ｋｅＶ未満である。α粒子の生成を伴って実質的に崩壊する放射性核種もまた好ましい。そのような放射性核種には、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、Ｆｍ−２５５が含まれるが、これらに限定されない。有用なα粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００ｋｅＶ〜１０，０００ｋｅＶであり、より好ましくは３，０００ｋｅＶ〜８，０００ｋｅＶであり、最も好ましくは４，０００ｋｅＶ〜７，０００ｋｅＶである。
酵素もまた有用な治療剤である。例えば、ホスファート含有プロドラッグと組み合わせて使用されるアルカリホスファターゼ（米国特許第４，９７５，２７８号）；スルファート含有プロドラッグと組み合わせて使用されるアリールスルファターゼ（米国特許第５，２７０，１９６号）；ペプチドに基づくプロドラッグと組み合わせて使用されるペプチダーゼ及びプロテアーゼ、例えば、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、ズブチリシン、カルボキシペプチダーゼ（米国特許第５，６６０，８２９号、同第５，５８７，１６１号、同第５，４０５，９９０号）及びカテプシン類（カテプシンＢ及びＬを含む）；Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグと組み合わせて使用されるＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグと組み合わせて使用されるβ−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼなどの炭水化物切断酵素（米国特許第５，５６１，１１９号、同第５，６４６，２９８号）；β−ラクタム含有プロドラッグと組み合わせて使用されるβ−ラクタマーゼ；フェノキシアセトアミド基又はフェニルアセトアミド基によりそのアミノ窒素が誘導体化された薬物と組み合わせて使用されるペニシリンアミダーゼ、例えば、ペニシリンＶアミダーゼ（米国特許第４，９７５，２７８号）又はペニシリンＧアミダーゼなど；及び５−フルオロシトシンに基づくプロドラッグ（米国特許第４，９７５，２７８号）と組み合わせて使用されるシトシンデアミナーゼ（米国特許第５，３３８，６７８号、同第５，５４５，５４８号）が、本発明のための好適な治療剤である。
混合療法における使用又は抗体に対するコンジュゲート体形成のために好適な抗血管形成剤（又は血管形成阻害剤）には、アンギオスタチン、エンドスタチン、バスクロスタチン、カンスタチン及びマスピンが含まれる。
他の有用な治療剤には、金属（光力学的治療の一部としての金属など）及び核種（中性子捕獲法に基づく治療において有益な核種など）が含まれる。具体的には、亜鉛、アルミニウム、ガリウム、ルテチウム及びパラジウムが光力学的治療のために有用であり、Ｂ−１０、Ｇｄ−１５７及びＵ−２３５が中性子捕獲治療のために有用である。
診断／検出剤は、抗体成分（すなわち、抗体又は抗体フラグメント）又はサブフラグメントにコンジュゲートされて投与され、そして疾患関連抗原を含む細胞を突き止めることによって疾患を診断／検出することにおいて有用である分子又は原子である。有用な診断／検出剤には、放射性同位体、色素（ビオチン−ストレプアビジン複合体に関する場合など）、放射線不透過性物質（例えば、ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物及びタリウム化合物など）、造影剤、蛍光性の化合物又は分子、及び磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）用の増強剤（例えば、常磁性イオン）が含まれるが、これらに限定されない。米国特許第６，３３１，１７５号には、ＭＲＩ技術及びＭＲＩ増強剤にコンジュゲート化された抗体の調製が記載されており、この文献はその開示内容全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。好ましくは、診断剤は、核画像化、手術中検出及び内視鏡検出のための放射性同位体、磁気共鳴画像化又は超音波検査において使用される増強剤、Ｘ線写真及びコンピューター断層撮影法のための放射線不透過性薬剤及び造影剤、透視検査法（内視鏡透視検査法を含む）のための蛍光性化合物からなる群より選択される。抗体にコンジュゲート化されるか、又は二重特異性のプレターゲッティング方法において使用される蛍光性薬剤及び放射性薬剤は、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第５，７１６，５９５号、同第６，０９６，２８９号及び米国特許出願第０９／３４８，８１８号（これらの文献はその開示内容全体が参照することにより本明細書中に組み込まれる）に開示されるように、特に、γ線放射体、β線放射体及び陽電子放射体を用いて、疾患に冒された組織又は細胞塊（悪性腫瘍など）に関連するターゲッティングされた抗原を、内視鏡により、又は手術中に、又は血管内で検出するために特に有用である。陽電子放射断層撮影法に有用な放射性核種には、Ｆ−１８、Ｍｎ−５１、Ｍｎ−５２ｍ、Ｆｅ−５２、Ｃｏ−５５、Ｃｕ−６２、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６８、Ａｓ−７２、Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６、Ｒｂ−８２ｍ、Ｓｒ−８３、Ｙ−８６、Ｚｒ−８９、Ｔｃ−９４ｍ、Ｉｎ−１１０、Ｉ−１２０及びＩ−１２４が含まれるが、これらに限定されない。有用な陽電子放出放射性核種の総崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００ｋｅＶ未満であり、より好ましくは１，０００ｋｅＶ未満であり、最も好ましくは７００ｋｅＶ未満である。γ線検出を利用する診断剤として有用な放射性核種には、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｓｅ−７５、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−１１４ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｙｂ−１６９、Ｈｇ−１９７及びＴｌ−２０１が含まれるが、これらに限定されない。有用なγ線放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２０ｋｅＶ〜２０００ｋｅＶであり、より好ましくは６０ｋｅＶ〜６００ｋｅＶであり、最も好ましくは１００ｋｅＶ〜３００ｋｅＶである。
本発明のために好適な常磁性イオンには、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）及びエルビウム（ＩＩＩ）が含まれ、ガドリニウムが特に好ましい。 Ｘ線画像化などの他の関連で有用なイオンには、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）及び特にビスマス（ＩＩＩ）が含まれるが、これらに限定されない。蛍光標識には、ローダミン、フルオレセイン及びレノグラフィンが含まれる。ローダミン及びフルオレセインは、多くの場合、イソチオシアナート中間体を介して連結される。
金属は診断剤においてもまた有用であり、これには、磁気共鳴画像化技術のための金属が含まれる。これらの金属には、ガドリニウム、マンガン、鉄、クロム、銅、コバルト、ニッケル、ジスプロシウム、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウム及びネオジムが含まれるが、これらに限定されない。抗体成分を放射性金属又は常磁性イオンとともに負荷するためには、抗体を、そのようなイオンと結合するための多数のキレート化基が結合している長いテールを有する試薬と反応させることが必要となることがある。そのようなテールは、キレート化基（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン類、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシム、及びこの目的のために有用であることが知られている同様な基など）が結合し得るペンダント基を有するポリリシン又は多糖類又は他の誘導体化鎖若しくは誘導化可能な鎖などのポリマーであり得る。様々なキレートが、標準的な化学反応を使用してペプチド抗原にカップリングさせられる。キレートは、通常、免疫反応性の最小限の喪失並びに最小限の凝集及び／又は内部架橋で分子に対する結合の形成を可能にする基によって抗体に連結される。キレートを抗体にコンジュゲート化するための、より珍しい他の方法及び試薬が、米国特許第４，８２４，６５９号（Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ）（発明の名称：「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、１９８９年４月２５日発行）に開示される（その開示はその全体を参照することにより本明細書中に組み込むものとする）。特に有用な金属−キレートの組合せには、２０ｋｅＶ〜２，０００ｋｅＶの一般的なエネルギー範囲にある診断用同位体とともに使用される２−ベンジル−ＤＴＰＡ並びにそのモノメチルアナログ及びシクロヘキシルアナログが含まれる。マンガン、鉄及びガドリニウムなどの非放射性の金属と錯体形成するとき、同じようなキレートは、本発明の抗体と一緒に使用されたときにはＭＲＩのために有用である。大環状キレート、例えば、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ及びＴＥＴＡなどは、様々な金属及び放射性金属に関して有用であり、最も詳細には、ガリウム、イットリウム及び銅の放射性核種に関してそれぞれ有用である。そのような金属−キレート錯体は、目的とする金属に対して環サイズを調節することによって非常に安定にすることができる。他の環型キレート、例えば、ＲＡＩＴ用の２２３Ｒａなどの安定に結合する核種に関して注目されている大環状ポリエーテルなども本発明によって包含される。
放射線不透過性物質及び造影物質は、Ｘ線写真及びコンピューター断層撮影法を増強するために使用され、これには、ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、タリウム化合物などが含まれる。具体的な化合物には、バリウム、ジアトリゾアート、エチルヨウ化油、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、ヨーセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパノ酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメト酸、イオタスル、イオテトル酸、イオタラム酸、イオトロクス酸、イオキサグル酸、イオクソトリゾ酸、イポダート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾアート、プロピリオドン及び塩化タリウムが含まれる。
本明細書中で使用される用語「被験体」は任意の動物（すなわち、脊椎動物及び無脊椎動物）を示し、これには、ヒト及び他の霊長類、齧歯類（例えば、マウス、ラット及びモルモット）、ウサギ目（例えば、ウサギ）、ウシ類（例えば、ウシ）、ヒツジ類（例えば、ヒツジ）、ヤギ類（例えば、ヤギ）、ブタ類（例えば、ブタ）、ウマ類（例えば、ウマ）、イヌ類（例えば、イヌ）、ネコ類（例えば、ネコ）、家禽（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、他のキジ目鳥類など）、並びに野生動物又は非飼育動物（有蹄類（例えば、シカ）、クマ、魚類、ウサギ目、齧歯類、鳥類などのような動物を含むが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。この用語は特定の年齢又は性に限定されることが意図されない。従って、成体及び新生児の被験体並びに胎児が、雄性又は雌性のいずれでもあっても、この用語によって包含される。
ＩＩ．抗体の調製
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は特定の抗原に対する抗体の均質な集団であり、抗体は１種類の抗原結合部位のみを含んでおり、抗原性決定基における１つのエピトープのみに結合する。特定の抗原に対する齧歯類モノクローナル抗体を、当業者に知られている様々な方法によって得ることができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）；及びＣｏｌｉｇａｎら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第１巻、２．５．１頁〜２．６．７頁（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９１）［以下、「Ｃｏｌｉｇａｎ」］を参照のこと。簡単に記載すると、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注射し、血清サンプルを採取することにより抗体産生の存在を確認し、Ｂリンパ球を得るために脾臓を取り出し、ハイブリドーマを産生するためにＢリンパ球をミエローマ細胞と融合し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、その後、ハイブリドーマ培養物から抗体を単離することによって得ることができる。
ＭＡｂは、様々な十分に確立された技術によってハイブリドーマ培養物から単離及び精製することができる。そのような単離技術には、プロテインＡセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、２．７．１頁〜２．７．１２頁及び２．９．１頁〜２．９．３頁を参照のこと。また、Ｂａｉｎｅｓら、「Ｐｕｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）」、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、第１０巻、７９頁〜１０４頁（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９２）も参照のこと。
ペプチド骨格に対するＡｂが、Ａｂ製造について広く知られている方法によって作製される。例えば、（ペプチド）ｎ−ＫＬＨ（この場合、ＫＬＨはキーホールリンペットヘモシアニンであり、及びｎ＝１〜３０である）などの免疫原の完全フロイントアジュバントにおける注射、続く、不完全フロイントアジュバントに懸濁された同じ免疫原の免疫適格動物に対する２回続けた注射が行われた後、脾臓細胞が、抗原のｉ．ｖ．追加免疫の３日後に集められる。その後、集められた脾臓細胞をＳｐ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞と融合し、そして得られたクローンの培養上清が、直接結合ＥＬＩＳＡを使用して抗ペプチド反応性について分析される。作製されたＡｂの細かい特異性を、元の免疫原のペプチドフラグメントを使用することによって分析することができる。これらのフラグメントは、自動化されたペプチド合成機を使用して容易に調製することができる。Ａｂ製造のために、酵素欠損ハイブリドーマが、融合細胞株の選択を可能にするために単離される。この技術もまた、リンカーを含むキレートの１つ又は複数（例えば、Ｉｎ（ＩＩＩ）−ＤＴＰＡキレート）に対する抗体を惹起させるために使用することができる。Ｉｎ（ＩＩＩ）−ジＤＴＰＡに対するモノクローナルマウス抗体が知られている（Ｂａｒｂｅｔ、上掲の’３９５号特許）。
本発明において使用される抗体は、マーカー物質としての細胞表面又は細胞内の様々な腫瘍関連抗原に対して特異的である。これらのマーカーは、細胞質、核又は様々なオルガネラ若しくは細胞より小さい構造体においてであっても、あるいは腫瘍に栄養を与える血管又は腫瘍血管系によって作られた血管の内皮の一部としてさえも、腫瘍によって産生される物質であり得るか、あるいは腫瘍部位又は腫瘍細胞表面又は腫瘍細胞内に蓄積する物質であり得る。そのような腫瘍関連マーカーの中には、Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ、「がんの免疫診断」、Ｆｌｅｉｓｈｅｒ編、「Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ」、３４７頁（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ、１９７９）；及び米国特許第４，１５０，１４９号、同第４，３６１，５４４号及び同第４，４４４，７４４号に開示されるマーカーが含まれる。
腫瘍関連マーカーは、腫瘍胎児性抗原、胎盤抗原、がんウイルス関連抗原又は腫瘍ウイルス関連抗原、組織関連抗原、器官関連抗原、異所性ホルモン及び正常な抗原又はその変化体を含む多数のカテゴリーに、Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ（上掲）によって分類されている。場合により、腫瘍関連マーカーのサブユニット（例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）のβ−サブユニット又はがん胎児性抗原（ＣＥＡ）のγ領域）が、より大きい腫瘍特異性を有する抗体を惹起させるために都合よく使用され、これらは、米国特許第４，３６１，６４４号及び同第４，４４４，７４４号に開示されるように、非腫瘍物質に対する交差反応性が非常に低下した抗体の産生を刺激する。
注目される別のマーカーは膜貫通活性化因子又はＣＡＭＬ相互作用因子（ＴＡＣＩ）である。Ｙｕら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１：２５２〜２５６（２０００）を参照のこと。簡単に記載すると、ＴＡＣＩは、Ｂ細胞の悪性腫瘍（例えば、リンパ腫）に対するマーカーである。さらに、ＴＡＣＩ及びＢ細胞成熟化抗原（ＢＣＭＡ）が、腫瘍壊死因子ホモログ、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）によって結合することが知られている。ＡＰＲＩＬは一次Ｂ細胞及び一次Ｔ細胞のインビトロでの増殖を刺激し、そしてＢ細胞をインビボで蓄積させることにより脾臓重量を増大させる。ＡＰＲＩＬはまた、受容体結合についてＴＡＬＬ−Ｉ（これもまたＢＬｙＳ又はＢＡＦＦと呼ばれる）と競合する。可溶性のＢＣＭＡ及びＴＡＣＩは、ＡＰＲＩＬの結合を特異的に妨げ、一次Ｂ細胞のＡＰＲＩＬ刺激された増殖を阻止する。ＢＣＭＡ−Ｆｃはまた、マウスにおいてキーホールリンペットヘモシアニン及びニューモバクスに対する抗体の産生を阻害する。このことは、ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩを介したＡＰＲＩＬ及び／又はＴＡＬＬ−Ｉのシグナル伝達が、体液性免疫を生じさせるためには必要であることを示している。従って、ＡＰＲＩＬ−ＴＡＬＬ−Ｉ及びＢＣＭＡ−ＴＡＣＩにより、Ｂ細胞機能及びＴ細胞機能の刺激に関与する２リガンド−２受容体経路が形成される。
免疫原に対する抗体を最初に惹起させた後、抗体を配列決定し、続いて、組換え技術によって調製することができる。ネズミ抗体及び抗体フラグメントのヒト化及びキメラ化は当業者に広く知られている。例えば、ヒト化モノクローナル抗体が、マウス免疫グロブリンの重鎖可変部及び軽鎖可変部に由来するマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに移し、その後、ネズミ対応体のフレームワーク領域においてヒト残基に置換することによって製造される。好ましい実施形態において、ヒト化抗ＣＳＡｐ抗体又はそのフラグメントのフレームワーク領域におけるいくつかのヒト残基がそのネズミ対応体によって置換される。２つの異なるヒト抗体に由来するフレームワーク配列の組合せがＶＨのために使用されることもまた好ましい。さらに好ましくは、そのような２つのヒト抗体はＥＵ及びＮＥＷＭである。抗体分子の定常ドメインはヒト抗体の定常ドメインに由来する。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用により、ネズミ定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題が回避される。
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有する遺伝子組換えマウスから回収することができる。マウスの体液性免疫系は、内因性の免疫グロブリン遺伝子を不活性化し、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによってヒト化される。ヒト免疫グロブリン遺伝子座は非常に複雑であり、そしてまとめた場合にはヒトゲノムのほぼ０．２％を占める非常に多数の異なるセグメントを含む。遺伝子組換えマウスにより、十分な抗体レパートリーが産生され得ることを確実にするためには、ヒトの重鎖遺伝子座及び軽鎖遺伝子座の大きな割合をマウスのゲノムに導入しなければならない。これは、ヒトの重鎖免疫グロブリン遺伝子座又は軽鎖免疫グロブリン遺伝子座のいずれかを生殖系列配置で含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成によって始まる段階的プロセスにおいて達成される。それぞれの挿入物はサイズが約１Ｍｂであるので、ＹＡＣ構築物は、免疫グロブリン遺伝子座の重複フラグメントの相同的組換えを必要とする。２つのＹＡＣ（重鎖遺伝子座を含有するＹＡＣ及び軽鎖遺伝子座を含有するＹＡＣ）が、ＹＡＣ含有酵母のスフェロブラストをマウス胚幹細胞と融合することによってマウスに別々に導入される。その後、胚幹細胞クローンはマウスの胚盤胞に顕微注入される。得られるキメラなオスを、その生殖系列によってＹＡＣを伝えるその能力についてスクリーニングして、ネズミ抗体の産生ができないマウスと交配させる。これらの２つの遺伝子組換え系統、すなわち、ヒト重鎖遺伝子座を含有する一方と、ヒト軽鎖遺伝子座を含有するもう一方とを交配することにより、免疫化に応答してヒト抗体を産生する子孫が得られる。
再配置されていないヒト免疫グロブリン遺伝子はまた、ミクロセル媒介染色体移入（ＭＭＣＴ）によってマウス胚幹細胞に導入することができる。Ｔｏｍｉｚｕｋａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６：１３３（１９９７）を参照のこと。この方法論では、ヒト染色体を含有するミクロセルがマウス胚幹細胞と融合させられる。移入された染色体は安定に保持され、そして成体キメラ体は正しい組織特異的発現を示す。
代わりとして、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーから単離されたヒト抗体フラグメントに由来し得る。例えば、Ｂａｒｂａｓら、ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２：１１９（１９９１）；及びＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３（１９９４）を参照のこと（これらは参照することにより本明細書に組み込まれる）。Ｂ細胞の不死化によってモノクローナル抗体を作製することに関連する困難の多くは、ファージディスプレーを使用して大腸菌において抗体フラグメントを操作及び発現することよって克服することができる。高親和性のモノクローナル抗体の回収を確実にするために、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーは大きいレパートリーサイズを含有しなければならない。典型的な方法では、逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを合成するために、免疫化されたマウスのリンパ球又は脾臓細胞から得られたｍＲＮＡが使用される。重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子がＰＣＲによって別々に増幅され、ファージクローニングベクターに連結される。２つの異なるライブラリーが作製される。すなわち、１つが重鎖遺伝子を含有し、１つが軽鎖遺伝子を含有する。ファージＤＮＡをそれぞれのライブラリーから単離し、そして重鎖配列及び軽鎖配列を一緒に連結し、パッケージングして、コンビナトリアルライブラリーが得られる。それぞれのファージが重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡのランダムな対を含有しており、大腸菌に感染したとき、感染細胞において抗体鎖の発現を行わせる。目的とする抗原を認識する抗体を確認するために、ファージライブラリーは平板に播種され、そしてプラークに存在する抗体分子がフィルターに転写される。フィルターは、放射標識された抗原とインキュベーションされ、その後、過剰な非結合リガンドを除くために洗浄される。オートラジオグラムにおける放射能スポットにより、その抗原と結合する抗体を含有するプラークが同定される。ヒト免疫グロブリンのファージライブラリーを作製するために有用なクローニングベクター及び発現ベクターは、例えば、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から得ることができる。
ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的な技術が、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：３８３３（１９８９）の刊行物によって記載される（この文献はその開示内容全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）。キメラ抗体を構築するための様々な技術が当業者には広く知られている。一例として、Ｌｅｕｎｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１３：４６９（１９９４）には、ＬＬ２モノクローナル抗体（抗ＣＤ２２抗体）のＶκドメイン及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を、それぞれ、ヒトのκ定常領域ドメイン及びＩｇＧ１定常領域ドメインと組み合わせることによってＬＬ２キメラを製造する方法が記載される。この刊行物にはまた、ＬＬ２の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ、Ｖκ及びＶＨ）のヌクレオチド配列が示されている。ヒト化ＭＡｂを製造するための技術が、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４（１９８８）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；Ｓａｎｄｈｕ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１２：４３７（１９９２）；及びＳｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．、１５０：２８４４（１９９３）によって記載される（これらの文献はそれぞれが本明細書に参照することにより組み込まれる）。
キメラ抗体は、齧歯類抗体などの１つの動物種に由来するＣＤＲを含む可変ドメインを含有する組換えタンパク質であり、その一方で、抗体分子の残り、すなわち、定常ドメインはヒト抗体に由来する。従って、キメラなモノクローナル抗体はまた、キメラＭＡｂの可変領域におけるネズミＦＲの配列を１つ以上の異なるヒトＦＲで置換することによってヒト化することができる。具体的には、マウスのＣＤＲが、マウス免疫グロブリンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域からヒト抗体の対応する可変ドメインの中に移される。マウスのＣＤＲをヒトＦＲ内に単に移すことは抗体親和性の低下又はその喪失さえも生じさせることが多いので、さらなる改変が、ネズミ抗体の元の親和性を回復するためには必要であると考えられる。これは、そのエピトープに対する良好な結合親和性を有する抗体を得るためにＦＲ領域内の１つ以上のヒト残基をそのネズミ対応体で置換することによって達成することができる。例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：２６６（１９９１）；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４（１９８８）を参照のこと。さらに、特定のエピトープに対するヒト化ＭＡｂ及びキメラＭＡｂ及びヒトＭＡｂの親和性はＣＤＲの変異誘発によって増大させることができ、その結果、より少ない量の抗体が、変異誘発前のより低い親和性のＭＡｂのより大きい量と同じくらいの効果を有するようにすることができる。例えば、国際公開ＷＯ００２９５８４Ａ１を参照のこと。
本発明の抗体を製造するための別の方法は、遺伝子組換え家畜の乳汁中に産生させることによるものである。例えば、Ｃｏｌｍａｎ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．、６３：１４１〜１４７（１９９８）；米国特許第５，８２７，６９０号を参照のこと（これらの文献はともにその開示内容全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）。対になった免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡセグメントをそれぞれ含有する２つのＤＮＡ構築物が調製される。これらのＤＮＡセグメントは、乳腺上皮細胞において優先的に発現するプロモーター配列を含有する発現ベクターにクローニングされる。例には、ウサギ、ウシ及びヒツジのカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子並びにマウス乳漿酸性タンパク質遺伝子に由来するプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、挿入されたフラグメントは、乳腺特異的遺伝子に由来する同族のゲノム配列がその３’側で接する。これにより、ポリアデニル化部位及び転写物安定化配列が提供される。これらの発現カセットは哺乳動物受精卵の前核に同時注入され、その後、受精卵を、移植されるメスの子宮に着床させ、妊娠させる。出生後、子孫は、サザン分析によって両方の導入遺伝子の存在についてスクリーニングされる。抗体が存在するためには、重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の両方が、同じ細胞において同時に発現しなければならない。遺伝子組換え体のメスから得られた乳汁が、当分野で知られている標準的な免疫学的方法を使用して抗体又は抗体フラグメントの存在及び機能性について分析される。抗体は、当分野で知られている標準的な方法を使用して乳汁から精製することができる。
キメラ抗ＣＳＡｐ抗体、ヒト化抗ＣＳＡｐ抗体及びヒト抗ＣＳＡｐ抗体の調製
本発明ではまた、結腸直腸がん及び卵巣がんによって発現されるがん腫関連抗体を含む様々ながん腫関連抗体などの他のヒト抗体又は再操作（例えば、キメラ化、ヒト化）された抗体と組み合わせて使用されるヒト抗ＣＳＡｐモノクローナル抗体及びヒト化抗ＣＳＡｐモノクローナル抗体及びキメラ抗ＣＳＡｐモノクローナル抗体が考えられる。好ましい実施形態において、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ（例えば、Ｂ３抗体）、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＲＳ５（ＧＡ７３３抗原標的、例えば、ＥＧＰ−２、１７−１Ａ、ＫＳ１−４及びＥｐ−ＣＡＭの抗体などについて）、ＴＡＧ−７２、Ａ３３抗体決定基、ＫＳ−１、Ａ３及びＨＥＲ２／ｎｅｕに対する抗体が、ヒト化抗ＣＳＡｐ抗体又はキメラ抗ＣＳＡｐ抗体又はヒト抗ＣＳＡｐ抗体との混合療法のために使用される。例えば、Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５：１４６〜１５６（１９９７）；米国特許第５，６３３，４２５号を参照のこと（これらの文献はその開示内容全体を参照することにより組み込まれる）。ＢｒＥ３抗体が、Ｃｏｕｔｏ，Ｊ．、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｒ．、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．及びＣｅｒｉａｎｉ，Ｒ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９５、５５（ｓｕｐｐｌ．２３）：５９７３ｓ〜５９７７ｓに記載される。ＥＧＰ−１抗体が米国仮特許出願第６０／３６０，２２９号に記載され、ＥＧＰ−２抗体のいくつかが、本明細書の最後で言及される参考文献におけるＢｉｒｂｅｎｅｔら及びＳｔａｉｂら及びＳｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇらにおいて言及されている。ＫＳ−１抗体がＫｏｄａらにおいて言及され、Ａ３３抗体がＲｉｔｔｅｒらにおいて言及され、Ｌｅ（ｙ）抗体Ｂ３がＤｉ Ｃａｒｌｏらに記載され、Ａ３抗体がＴｏｒｄｓｓｏｎらに記載される（これらはすべて、本明細書の最後で言及される参考文献に列記されている）。好ましくは、胃腸がん及び卵巣がんのマーカー抗原又は受容体に対する抗体は、ＣＳＡｐ抗体と組合せた使用に、特にＭｕ−９抗体と組合せた使用に十分に適している。好ましい実施形態において、胃腸がんは結腸直腸がんである。
マーカー又はがん遺伝子の産物に対する抗体、あるいはＶＥＧＦなどの血管形成因子に対する抗体もまた有用である。ＶＥＧＦ抗体が、Ｔｈｏｒｐｅら、米国特許第６，３４２，２２１号、同第５，９６５，１３２号及び同第６，００４，５５４号に記載される（これらの文献は、参照することによりその開示内容全体を本明細書に組み込まれる）。ある種の免疫応答調節因子に対する抗体（ＣＤ４０に対する抗体など）が、本明細書の最後で言及される参考文献に列記されるＴｏｄｒｙｋら及びＴｕｒｎｅｒらに記載される。混合療法のために好適な他の抗体には、Ｅｐｓｔｅｉｎら（下記）に記載されるような抗壊死抗体が含まれる。
本発明において使用される細胞株及び培養培地には、Ｍｕ−９ハイブリドーマ細胞及びＳｐ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）が含まれる。Ｍｕ−９を産生するモノクローナルハイブリドーマは、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）で免疫化されたマウスから得られた脾臓をＳＰ２／０Ａｇ１４と融合することによって得られた。これらの細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）及び抗生物質が補充されたハイブリドーマ無血清培地（ＨＳＦＭ）（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）（完全培地）において培養することができる。あるいは、細胞は、１０％ＦＣＳ及び７５ｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｓｓ．）補充のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（完全ＨＳＦＭ）において、又は示された場合には、抗生物質のみを含有するＨＳＦＭにおいて培養することができる。形質転換体の選択を、５００ユニット／ｍｌのヒグロマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含有する完全ＨＳＦＭにおいて行うことができる。すべての細胞株は、好ましくは、５％ＣＯ２において３７℃で維持される。
Ｖκ遺伝子セグメント及びＶＨ遺伝子セグメントの取得
Ｖκ遺伝子セグメント及びＶＨ遺伝子セグメントの単離を、当分野で広く知られているいくつかの手段によって達成することができる。２つのそのような手段には、ＰＣＲクローニング及びｃＤＮＡライブラリースクリーニングが含まれるが、これらに限定されない。
様々なＰＣＲクローニング技術が当分野では広く知られている。しかし、簡単に記載すると、Ｖκ遺伝子フラグメント及びＶＨ遺伝子フラグメントのＰＣＲクローニングは下記のように達成することができる。ポリＡ ｍＲＮＡを、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）などの市販のキットを使用してＭｕ−９ハイブリドーマ細胞株から単離することができる。その後、第１鎖ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡサイクルキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してポリＡ ｍＲＮＡから逆転写することができる。このプロセスにおいて、ポリＡ ｍＲＮＡはネズミＩｇＧ ＣＨ１特異的プライマー又はネズミＣｋ特異的プライマーにアニーリングされる。そのようなプライマーの例には、それぞれ、ＣＨ１Ｂ（５’−ＡＣＡＧＴＣＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧ−３’）及びＣｋ３−ＢＨ１（５’−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡ−３’）が含まれる。第１鎖ｃＤＮＡは、Ｏｒｌａｎｄｉらにより記載されるように、ＰＣＲによってＶＨ配列及びＶκ配列を増幅するためのテンプレートとして使用することができる。Ｖκ領域については、ＶＫ１Ｂａｃｋ（５’−ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ−３’）及びＩｇＧＫＣ３’（５’−ＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧ−３’）などのプライマー対を使用することができる。ＶＨ領域については、ＶＨ１Ｂａｃｋ（５’−ＡＧＧＴ（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）ＣＴＧＣＡＧ（Ｃ／Ｇ）ＡＧＴＣ（Ａ／Ｔ）ＧＧ−３’）及びＣＨ１Ｂなどのプライマー対を使用することができる。増幅後、Ｖκフラグメント及びＶＨフラグメントをゲル精製して、ジデオキシターミネーション法による配列分析のためのＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのクローニングベクターにクローニングすることができる。免疫グロブリン起源であることが確認された配列は、その後、Ｌｅｕｎｇらによって記載される方法を使用してキメラな発現ベクターを構築するために使用することができる。
ＰＣＲクローニングによってＶκ遺伝子セグメント及びＶＨ遺伝子セグメントを単離することに対する好ましい代わりの方法として、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングを利用することができる。ｃＤＮＡスクリーニング法もまた当分野では広く知られている。しかし、簡単に記載すると、ｃＤＮＡライブラリーを、ｐＳＰＯＲＴベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、ネズミＭｕ−９ハイブリドーマ細胞から抽出されたｍＲＮＡから構築することができる。第１鎖ｃＤＮＡを、Ｍｕ−９ハイブリドーマから得られたポリＡ ＲＮＡをオリゴｄＴプライマー−ＮｏｔＩアダプター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で伸長させることによって合成することができる。第２鎖の合成及びＳａｌＩアダプターの結合を行った後、ｃＤＮＡプールをｃＤＮＡサイズ分画カラムによってサイズ分画することができる。分画されたｃＤＮＡは、その後、ｐＳＰＯＲＴベクターに連結され、続いて大腸菌ＤＨ５に形質転換することができる。その後、ライブラリーを平板に播種して、フィルターに転写し、増幅することができる。
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、重鎖及び軽鎖に対して特異的な標識されたプローブとのハイブリダイゼーションによって達成することができる。例えば、重鎖に対するＭＵＣＨ−１（５’−ＡＧＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＣ−３’）及び軽鎖に対するＭＵＣＫ−１（５’−ＧＡＡＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴ−３’）などの［３２−Ｐ］標識プローブ。最初のスクリーニングで陽性であるクローンを二連の平板に移し、同じプローブを用いてもう一度スクリーニングすることができる。
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成及び増幅を下記のように行うことができる。総細胞ＲＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）（この文献は参照することにより本明細書に組み込まれる）に従って、合計で約１０７個の細胞を使用してＭｕ−９ハイブリドーマ細胞株から調製することができる。第１鎖ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔプレ増幅システム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）を使用することなどによって、従来のように総ＲＮＡから逆転写することができる。簡単に記載すると、２０μｌの反応容量において、５０ｎｇのランダムヘキサープライマーを、２μｌの１０Ｘ合成緩衝液［２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５００ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ］、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ及び２００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素の存在下で、５μｇのＲＮＡにアニーリングすることができる。伸長工程は、最初、室温で１０分間進められ、続いて４２℃で５０分間のインキュベーションが可能である。反応は、反応混合物を９０℃で５分間加熱することによって停止させることができる。
スクリーニング用プローブの合成及び標識化は、周知の手段によって達成することができる。用いられる検出システムに依存して、プローブの標識化は異なる。この目的のために多くのキットが市販されている。オリゴヌクレオチドを３２−Ｐで標識する１つの方法には、［−３２Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の使用、続くカラム精製が含まれる。
キメラな抗ＣＳＡｐ抗体の調製
一般に、キメラな抗ＣＳＡｐ ＭＡｂを調製するために、ＣＳＡｐ抗体のＶＨ鎖及びＶκ鎖を、上記に記載される方法などの方法によって得ることができ、そしてＰＣＲによって増幅することができる。好ましい実施形態において、キメラな抗ＣＳＡｐ抗体はＭｕ−９抗体である。ＶκのＰＣＲ産物を、Ｌｅｕｎｇら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１３：４６９〜４７６（１９９４））によって記載されるように、ｐＢＲ３２７に基づく段階化ベクター（ＶＫｐＢＲ）にサブクローニングすることができる。ＶＨのＰＣＲ産物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づく類似する段階化ベクター（ＶＨｐＢＳ）にサブクローニングすることができる。Ｖκ配列含有フラグメント及びＶＨ配列含有フラグメントを、プロモーター配列及びシグナルペプチド配列と一緒に、これらの段階化ベクターから、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩの制限エンドヌクレアーゼを使用して切り出すことができる。Ｖκフラグメント（約６００ｂｐ）は哺乳動物発現ベクター（例えば、ｐＫｈ）に従来のようにサブクローニングすることができる。ｐＫｈは、ヒトκ定常領域のゲノム配列、Ｉｇエンハンサー、κエンハンサー及びヒグロマイシン耐性遺伝子を含有するｐＳＶｈｙｇ型の発現ベクターである。同様に、約８００ｂｐのＶＨフラグメントは、ヒトＩｇＧ１定常領域のゲノム配列、Ｉｇエンハンサー及びキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子を有するｐＳＶｇｐｔ型の発現ベクターであるｐＧ１ｇにサブクローニングすることができる。これらの２つのプラスミドは、エレクトロポレーションによってＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞などの哺乳動物細胞に同時トランスフェクションすることができ、そしてヒグロマイシン耐性について選択することができる。選択を生き延びたクローンは拡大培養され、上清液がｃＭｕ−９ｍＡｂの産生についてＥＬＩＳＡ法によってモニターされる。約１〜１０×１０６細胞のトランスフェクション効率が望まれる。０．１０μｇ／ｍｌ〜２．５μｇ／ｍｌの抗体発現レベルをこのシステムにより期待することができる。
あるいは、Ｖ発現カセット及びＶＨ発現カセットを、改変された段階化ベクターのＶＫｐＢＲ２及びＶＨｐＢＳ２において組み立てることができ、これらの発現カセットは、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞における発現について、Ｇｉｌｌｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２５：１９１（１９８９）；Ｌｏｓｍａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５：３１０１（１９９９）；及びＬｏｓｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ、８０：２６６０（１９９７）に記載されるように、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩフラグメント及びＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてそれぞれ切り出され、単一の発現ベクター（ｐｄＨＬ２など）にサブクローニングすることができる。本発明において有用な別のベクターは、Ｂａｒｎｅｓら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３２：１０９〜１２３（２０００）に記載されるようなＧＳベクターであり、これは好ましくはＮＳ０細胞株及びＣＨＯ細胞において発現する。他の適切な哺乳動物発現システムが、Ｗｅｒｎｅｒら、Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．、４８（ＩＩ）、第８号、８７０〜８８０（１９９８）に記載される。
Ｖκ配列及びＶＨ配列は、Ｏｒｌａｎｄｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：３８３３（１９８９））（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）により記載されるようにＰＣＲによって増幅することができる。Ｖｋ配列は、ＣＫ３ＢＨ及びＶκ５−３のプライマー（Ｌｅｕｎｇら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１５：２８６（１９９３）、この文献は参照することにより本明細書に組み込まれる）を使用して増幅することができ、一方、ＶＨ配列は、ネズミＩｇＧのＣＨ１領域にアニーリングするプライマーＣＨ１Ｂと、プライマーＶＨＩＢＡＣＫ（Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９、上記）とを使用して増幅することができる。１０μｌの第１鎖ｃＤＮＡ産物、９μｌの１０ＸＰＣＲ緩衝液［５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン］（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎ．）を含有するＰＣＲ反応混合物を３０サイクルのＰＣＲに供することができる。それぞれのＰＣＲサイクルは、好ましくは、９４℃で１分間の変性、５０℃で１．５分間のアニーリング、及び７２℃で１．５分間の重合化からなる。増幅されたＶｋフラグメント及びＶＨフラグメントは２％アガロース（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａｌｉｆ．）で精製することができる。
ヒト化抗ＣＳＡｐ抗体の調製
好ましい実施形態において、ヒト化抗ＣＳＡｐ抗体はヒト化Ｍｕ−９抗体である。ｈＭｕ−９Ｖκドメイン及びｈＭｕ−９ＶＨドメインに対する配列が設計されると、ＣＤＲグラフト化を、テンプレートとしての長い合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドと、プライマーとしての短いオリゴヌクレオチドとをＰＣＲ反応において使用する遺伝子合成によって達成することができる。ほとんどの場合、Ｖκドメイン又はＶＨドメインをコードするＤＮＡは約３５０ｂｐの長さである。コドン縮重性を利用することによって、１つしか存在しない制限部位を、コードされるアミノ酸を変化させることなく、Ｖ遺伝子ＤＮＡ配列の中央部に近い領域に容易に導入することができる。例えば、ｈＭｕ−９ＶＨドメインについてはＤＮＡヌクレオチド位１３２〜１３７（アミノ酸位４４〜４６）において、最初に設計されたアミノ酸配列を維持しながら、１つしか存在しないＸｂａＩ部位を挿入することができる（図１１Ａの配列を参照のこと）。ＸｂａＩ部位の上流側及び下流側の２つの長い非重複性の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（約１５０ｂｐ）を、自動化されたオリゴヌクレオチド合成機（Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ合成機、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）によって作製することができる。全長ＤＮＡオリゴヌクレオチドの収率は低いことが予想され得るので、全長ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応において２対の両端オリゴヌクレオチドによって増幅することができる。これらのプライマーは、その後の配列組み立て及びサブクローニングを容易にするために必要な制限部位を伴って設計することができる。オリゴヌクレオチドに対するプライマーは、得られるＰＣＲ産物がＸｂａＩにおいて読み枠を合わせて連結されて、ｈＭｕ−９ＶＨドメインをコードする全長のＤＮＡ配列を得ることができるように、重複する配列をＸｂａＩ部位において含有しなければならない。ＸｂａＩ部位におけるオリゴに対するＰＣＲ産物の連結、及び段階化ベクター（ＶＨｐＢＳ）のＰｓｔＩＩ／ＢｓｔＥＩＩ部位へのそれらのサブクローニングは、１回の３−フラグメント連結工程で完了させることができる。ＶＨｐＢＳへの正しい配列のサブクローニングは、制限消化分析によって最初に分析することができ、続いて、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３（１９７７）に従った配列決定反応によって確認することができる。
Ｉｇプロモーター、リーダー配列及びｈＭｕ−９ＶＨ配列を含有するＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを段階化ベクターから切り出して、ヒトＩｇＧ定常領域のゲノム配列、Ｉｇエンハンサー及びｇｐｔ選択マーカーを含有するｐＳＶｇｐｔ型ベクターのｐＧ１ｇにおける対応する部位にサブクローニングし、これにより最終的な発現ベクターｈＭｕ−９ｐＧ１ｇを形成させることができる。類似する方法を、ｈＭｕ−９Ｖκ配列を構築するために用いることができる。長いオリゴヌクレオチドに対するＰＣＲ産物を連結するために選ばれた制限部位は、この場合にはＮｒｕＩであり得る。
Ｉｇプロモーター、リーダー配列及びｈＭｕ−９Ｖκ配列を含有するＤＮＡ配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩを用いた処理によって段階化ベクターＶＫｐＢＲから切り出すことができ、その後、ヒトκ鎖定常領域のゲノム配列、ヒグロマイシン選択マーカー、Ｉｇエンハンサー及びκエンハンサーを含有するｐＳＶｈｙｇ型ベクターのｐＫｈの対応する部位にサブクローニングし、これにより最終的な発現ベクターｈＭｕ−９ｐＫｈを形成させることができる。
これらの２つのプラスミドは、適切な細胞に、例えば、メラノーマＳｐ２／０−Ａｇ１４に同時トランスフェクションし、コロニーをヒグロマイシン耐性について選択することができ、そして上清液を、下記に記載されるように、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイによってｈＭｕ−９抗体の産生についてモニターすることができる。あるいは、Ｖ発現カセット及びＶＨ発現カセットを、改変された段階化ベクターのＶＫｐＢＲ２及びＶＨｐＢＳ２において組み立てることができ、これらの発現カセットは、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞における発現について、Ｇｉｌｌｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２５：１９１（１９８９）；Ｌｏｓｍａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５：３１０１（１９９９）；及びＬｏｓｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ、８０：２６６０（１９９７）に記載されるように、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩフラグメント及びＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてそれぞれ切り出され、単一の発現ベクター（ｐｄＨＬ２など）にサブクローニングすることができる。本発明において有用な別のベクターは、Ｂａｒｎｅｓら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３２：１０９〜１２３（２０００）に記載されるようなＧＳベクターであり、これは好ましくはＮＳ０細胞株及びＣＨＯ細胞において発現する。他の適切な哺乳動物発現システムが、Ｗｅｒｎｅｒら、Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．、４８（ＩＩ）、第８号、８７０〜８８０（１９９８）に記載される。
トランスフェクション及びＥＬＩＳＡによる抗体分泌クローンに対するアッセイを下記のように行うことができる。約１０μｇのｈＭｕ−９ｐＫｈ（軽鎖発現ベクター）及び２０μｇのｈＭｕ−９ｐＧ１ｇ（重鎖発現ベクター）を、Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１１４９（１９９２）（この文献は参照することにより本明細書に組み込まれる）に従って５×１０６個のＳＰ２／０ミエローマ細胞をエレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａｌｉｆ．）によりトランスフェクションするために使用することができる。トランスフェクション後、細胞を完全ＨＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）において、３７℃及び５％ＣＯ２で、９６ウエルマイクロタイタープレートで生育させることができる。選抜プロセスを、５００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンの最終濃度でヒグロマイシン選択培地（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）を加えることによって２日後に開始することができる。コロニーが、典型的には、エレクトロポレーションの２週間後〜３週間後に出現する。その後、培養物をさらなる分析のために拡大することができる。
クローンのスクリーニング及び抗体の単離
キメラな重鎖又はヒト化された重鎖の分泌について陽性であるトランスフェクトーマコロニーをＥＬＩＳＡアッセイによって同定することができる。簡単に記載すると、トランスフェクトーマ培養物に由来する上清サンプル（１００μｌ）を、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的抗体のヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）−ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、Ｐａ．）で予備コーティングされたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに三連で加える。プレートを室温で１時間インキュベーションする。非結合のタンパク質を、洗浄緩衝液（０．０５％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄することによって除く。Ｆｃフラグメント特異的抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化ＧＡＨ−ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、Ｐａ．）をウエルに加える（１０４倍希釈された抗体ストック液の１００μｌ、これには、非コンジュゲート化抗体が１．０μｇ／ｍｌの最終濃度で補充された）。１時間のインキュベーションの後、プレートを典型的には３回洗浄する。反応溶液［１００μｌ、１６７μｇのオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、０．０２５％過酸化水素をＰＢＳに含有する］をウエルに加える。色を暗所で３０分間発色させる。反応を、５０μｌの４Ｎ ＨＣｌ溶液を各ウエルに添加することによって停止させ、その後、４９０ｎｍにおける吸光度を自動化ＥＬＩＳＡ読み取り装置（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、Ｖｔ．）で測定する。結合したキメラ抗体が、その後、非関連のキメラ抗体標準品（Ｓｃｏｔｇｅｎ，Ｌｔｄ．（Ｅｄｉｎｂｕｒｇ、スコットランド）から入手可能）に対して求められる。
抗体は下記のように培養培地から単離することができる。トランスフェクトーマの培養を無血清培地に順応させる。キメラ抗体を製造するために、細胞を、ＨＳＦＭを使用してローラーボトルにおいて５００ｍｌ培養物として生育させる。培養物を遠心分離し、上清を０．２ミクロンのメンブランでろ過する。ろ過された培地をプロテインＡカラム（１×３ｃｍ）に１ｍｌ／分の流速で通す。その後、樹脂は約１０カラム容量のＰＢＳで洗浄され、そしてプロテインＡに結合した抗体が、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．５）でカラムから溶出される。１．０ｍｌの画分が、１０μｌの３Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．６）を含有するチューブに集められ、タンパク質濃度が２８０／２６０ｎｍにおける吸光度から決定される。ピーク画分がまとめられ、ＰＢＳに対して透析され、そして抗体が、例えば、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）を用いて濃縮される。抗体濃度が、前記のように、ＥＬＩＳＡによって測定され、その濃度が、ＰＢＳを使用して約１ｍｇ／ｍｌに調節される。アジ化ナトリウム（０．０１％（ｗ／ｖ））が、好都合には、保存剤としてサンプルに添加される。
キメラ抗ＣＳＡｐ抗体又はヒト化抗ＣＳＡｐ抗体又はヒト抗ＣＳＡｐ抗体の親和性は、下記に例示されるように、直接的な結合アッセイ又は競合的結合アッセイを使用して評価することができる。
組換え抗体の改変／最適化
ヒト化は抗体親和性の低下又は喪失さえも生じさせることがあるので、元の親和性を回復するためには、さらなる改変が必要であると考えられる（例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：２６６（１９９１）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４（１９８８）を参照のこと、これらの文献は参照することにより本明細書に組み込まれる）。ｃＭｕ−９は、そのネズミ対応体の結合親和性に匹敵し得る結合親和性を示すことが知られているので、ｈＭｕ−９の最初の形態における不完全な設計体を（それらが存在する場合には）、ｃＭｕ−９の軽鎖及び重鎖を混ぜ、ヒト化形態の軽鎖及び重鎖に一致させることによって同定することができる。好ましくは、フレームワーク領域内のいくつかのヒト残基がそれらのネズミ対応体によって置換される。同様に好ましくは、２つの異なるヒト抗体（例えば、ＥＵ及びＮＥＷＭ）に由来するフレームワーク配列の組合せがＶＨのために使用される。例えば、ＦＲ１〜３をＥＵに由来させることができ、ＦＲ４をＮＥＷＭに由来させることができる。
他の改変、例えば、Ａｓｎ結合型グリコシル化部位を、オリゴヌクレオチド誘導による従来の部位特異的変異誘発によってキメラＭｕ−９抗体又はヒトＭｕ−９抗体又はヒト化Ｍｕ−９抗体に導入することができる。オリゴヌクレオチド誘導の変異誘発に関する詳細なプロトコル及びクローニングされたＤＮＡの変異誘発に対する関連技術は広く知られている。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋら及びＡｕｓｕｂｅｌらを参照のこと。
例えば、ＡｓｎをｈＭｕ−９Ｖκの１８位（図４Ｂ）に導入するために、コドン１８をＡｒｇに対するＣＧＡからＡＡＣに変えることができる。これを達成するために、抗体軽鎖配列を含有する一本鎖ＤＮＡテンプレートが、少数のウラシルをチミジンの代わりに含有する一本鎖ＤＮＡ分子を得るために好適な大腸菌株（例えば、ｄｕｔ−、ｕｎｇ−）から調製される。そのようなＤＮＡテンプレートは、Ｍ１３クローニングによって、又はＳＰ６プロモーターを使用するインビトロ転写によって得ることができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９８７）を参照のこと。変異配列を含有するオリゴヌクレオチドが従来のように合成され、これを一本鎖テンプレートにアニリーングし、生成物をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼで処理して、二本鎖ＤＮＡ分子が得られる。野生型大腸菌（ｄｕｔ＋、ｕｎｇ＋）細胞をこの二本鎖ＤＮＡで形質転換することにより、変異ＤＮＡの効率的な回収がもたらされる。
あるいは、Ａｓｎ結合型グリコシル化部位は、プライマーとして所望の変異を含有するオリゴヌクレオチドとＶｋ鎖に対する可変領域のＤＮＡクローンとを使用して、又は目的とする抗体を産生する細胞からのＲＮＡをテンプレートとして使用することによって抗体軽鎖に導入することができる。Ｈｕｓｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ（Ｂｏｅｒｒｅｂａｅｃｋ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、１０３頁〜１２０頁、１９９２）もまた参照のこと。部位特異的変異誘発を、例えば、ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＥＲ（商標）キット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）を製造者の説明書に従って使用して行うことができる。
あるいは、グリコシル化部位は、共通的にプライマー伸長するオリゴヌクレオチドを用いて抗体鎖を合成することによって導入することができる。この場合、１つのそのようなオリゴヌクレオチドが所望の変異を含有する。例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ、Ｇｅｎｅ、７１：２９（１９８８）；Ｗｏｓｎｉｃｋら、Ｇｅｎｅ、６０：１１５（１９８８）；Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）を参照のこと（これらの文献は参照することにより本明細書に組み込まれる）。
上記の一般的な記載は、抗体の軽鎖の１８位にＡｓｎグリコシル化部位を導入することを示しているが、Ａｓｎ結合型グリコシル化部位を、軽鎖内において、又は重鎖可変領域内においてさえも、そのどこにでも導入することは可能であることが当業者には理解される。
抗体結合親和性の測定
そのようにして単離された、単離されたネズミＭｕ−９抗体、ヒトＭｕ−９抗体、ヒト化Ｍｕ−９抗体及びキメラＭｕ−９抗体の比較され得る結合親和性を直接的な放射免疫アッセイによって測定することができる。Ｍｕ−９は、クロラミンＴ法を使用して１３１Ｉ又は１２５Ｉで標識することができる（例えば、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、８９：１２３（１９６３）を参照のこと、この文献は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。ヨウ素化された抗体の比活性は、典型的には、約１０μＣｉ／μｇに調節される。非標識抗体及び標識抗体は、反応培地（１％ウマ血清及び１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンが補充されたＨＳＦＭ）を使用して適切な濃度に希釈される。標識抗体及び非標識抗体の両方の適切な濃度が１００μｌの総容量で反応チューブに一緒に加えられる。ＧＷ−３９腫瘍細胞の培養物がサンプル採取され、細胞濃度が測定される。培養物を遠心分離し、集められた細胞を反応培地で１回洗浄し、その後、細胞は反応培地に約１０７細胞／ｍｌの最終濃度に再懸濁される。すべての手順は４℃の冷所で行われる。細胞懸濁物（１００μｌ）が反応チューブに加えられる。反応は、細胞を再懸濁するために反応チューブを定期的に穏やかに振とうしながら４℃で２時間行われる。反応期間後、５ｍｌの洗浄緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）が各チューブに加えられる。懸濁物を遠心分離して、細胞ペレットを別の５ｍｌの洗浄緩衝液でもう１回洗浄する。遠心分離後、細胞ペレットに残っている残留放射能の量がγカウンター（Ｍｉｎａｘ、Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖａ．）で測定される。
ＩＩＩ．抗体フラグメントの製造
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントを知られている様々な技術によって作製することができる。抗体フラグメントは抗体の抗原結合部分であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどである。他の抗体フラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって生じ得るＦ（ａｂ）’２フラグメント、及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって作製され得るＦａｂ’フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ’発現ライブラリーを、所望する特異性を有するモノクローナルＦａｂ’フラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするために構築することができる（Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７４〜１２８１）。本発明には、様々な抗体及び抗体フラグメントが含まれる。
単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）はＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む。ＶＬドメイン及びＶＨドメインは会合して、標的結合部位を形成する。これらの２つのドメインはさらに、ペプチドリンカー（Ｌ）によって共有結合的に連結される。ｓｃＦｖ分子は、ＶＬドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部分である場合にはＶＬ−Ｌ−ＶＨとして、又はＶＨドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部分である場合にはＶＨ−Ｌ−ＶＬとして、そのいずれかで示される。ｓｃＦｖ分子の作製方法及び好適なペプチドリンカーの設計方法が、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｒ．Ｒａａｇ及びＭ．Ｗｈｉｔｌｏｗ、「単鎖Ｆｖ」、ＦＡＳＥＢ、第９巻：７３〜８０（１９９５）；及びＲ．Ｅ．Ｂｉｒｄ及びＢ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ、「単鎖抗体可変領域」、ＴＩＢＴＥＣＨ、第９巻：１３２〜１３７（１９９１）に記載される。これらの参考文献は参照することにより本明細書中に組み込まれる。
高親和性のｓｃＦｖを得るために、大きいレパートリーを有するｓｃＦｖライブラリーを、すべての知られているＶＨ遺伝子ファミリー及びＶκ遺伝子ファミリー及びＶλ遺伝子ファミリーに対応するＰＣＲプライマーを使用して非免疫化ヒトドナーからＶ遺伝子を単離することによって構築することができる。例えば、Ｖａｕｇｈｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：３０９〜３１４（１９９６）を参照のこと。増幅後、Ｖκプール及びＶλプールは一緒にされて、１つのプールにされる。これらのフラグメントはファージミドベクターに連結される。その後、ｓｃＦｖリンカー（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３がＶＬフラグメントの上流においてファージミド内に連結される。ＶＨフラグメント及びリンカー−ＶＬフラグメントが増幅され、ＪＨ領域で組み立てられる。得られるＶＨ−リンカー−ＶＬフラグメントがファージミドベクター内に連結される。ファージミドライブラリーは、上記に記載されるようにフィルターを使用して、又は免疫チューブ（Ｎｕｎｃ；Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を使用してパンニングすることができる。類似する結果を、免疫化されたウサギのリンパ球又は脾臓細胞からコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリを構築することによって、そしてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてｓｃＦｖ構築物を発現させることによって達成することができる。例えば、Ｒｉｄｄｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：２５５〜２６０（１９９５）を参照のこと。さらには、適切なｓｃＦｖを単離した後、結合親和性がより大きく、かつ解離速度がより遅い抗体フラグメントを、ＣＤＲ３変異誘発及び鎖シャッフリングなどの親和性成熟化プロセスによって得ることができる。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７８：１８１〜１８８（１９９８）；Ｏｓｂｏｕｒｎら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２：１８１〜１９６（１９９６）を参照のこと。
抗体フラグメントは、全長の抗体をタンパク質分解的に加水分解することによって、又はフラグメントをコードするＤＮＡを大腸菌若しくは別の宿主で発現させることによって調製することができる。抗体フラグメントは、全長の抗体を従来の方法によりペプシン消化又はパパイン消化することによって得ることができる。例えば、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２として示される５Ｓフラグメントを得るためにペプシンで抗体を酵素切断することによって製造することができる。このフラグメントはさらに、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを製造するために、チオール還元剤と、任意選択的にジスルフィド架橋の切断から生じるスルフヒドリル基に対する遮断基とを使用して切断することができる。あるいは、パパインを使用する酵素切断により、直接、２つの一価Ｆａｂフラグメント及び１つのＦｃフラグメントが得られる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，０３６，９４５号及び同第４，３３１，６４７号並びにそれらに含まれる参考文献に記載される（そのような特許は、参照することによりその全体を本明細書中に組み込むものとする）。また、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、８９：２３０（１９６０）；Ｐｏｒｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、７３：１１９（１９５９）；Ｅｄｅｌｍａｎら、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、第１巻、４２２頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９６７）；Ｃｏｌｉｇａｎ、２．８．１頁〜２．８．１０頁及び２．１０頁〜２．１０．４頁も参照のこと。
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲは、抗体が結合するエピトープに対して構造が相補的であり、かつ可変領域の残りよりも変化が大きい、抗体の可変領域のセグメントである。従って、ＣＤＲは超可変領域と呼ばれることがある。可変領域は３つのＣＤＲを含む。ＣＤＲペプチドは、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２：１０６（１９９１）；Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ、「モノクローナル抗体の遺伝子操作」、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ（Ｒｉｔｔｅｒら（編）、１６６頁〜１７９頁、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）；及びＷａｒｄら、「抗体の遺伝子操作及び発現」、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ（Ｂｉｒｃｈら（編）、１３７頁〜１８５頁、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９５）を参照のこと。
完全な抗体によって認識される抗原にフラグメントが結合する限り、抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成させるための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、あるいは他の酵素的又は化学的又は遺伝学的な技術などもまた使用することができる。
二重特異性抗体の調製
様々なｂｓＡｂを当分野で知られている様々な技術によって調製することができる。例えば、抗ＣＥＡ Ａｂ又は抗ＣＳＡｐ Ａｂ及び抗ペプチドＡｂはともに、ペプシンでそれらのそれぞれのＦ（ａｂ’）２に個々に消化される。抗ＣＥＡ−Ａｂ−Ｆ（ａｂ’）２又は抗ＣＳＡｐ−Ａｂ−Ｆ（ａｂ’）２はシステインで還元されて、Ｆａｂ’の単量体ユニットが生じ、これはさらに架橋剤ビス（マレイミド）ヘキサンと反応して、Ｆａｂ’−マレイミド体をもたらす。抗ペプチドＡｂ−Ｆ（ａｂ’）２はシステインで還元され、そして精製され、回収された抗ペプチドＦａｂ’−ＳＨは抗ＣＥＡ−Ｆａｂ’−マレイミド又は抗ＣＳＡｐ−Ｆａｂ’−マレイミドとそれぞれ反応して、Ｆａｂ’ｘＦａｂ’の二重特異性Ａｂをもたらす。あるいは、抗ペプチドＦａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２ｘＦａｂ’構築物を得るために抗ＣＥＡＦ（ａｂ’）２又は抗ＣＳＡｐＦ（ａｂ’）２とそれぞれカップリングさせることができ、あるいはＩｇＧｘＦａｂ’の二重特異性構築物を得るために抗ＣＥＡ又はＭｕ−９ＩｇＧとカップリングさせることができる。１つの実施形態において、ＩｇＧｘＦａｂ’構築物を、過ヨウ素酸酸化され、続いて市販のヒドラジド−マレイミド架橋剤との反応によって活性化されている抗ＣＥＡ又はＭｕ−９ＩｇＧの重鎖炭水化物に抗ペプチドＦａｂ’のチオール基を結合することによって部位特異的な様式で調製することができる。使用される成分Ａｂは、知られている技術によってキメラ化又はヒト化することができる。キメラ抗体は、齧歯類抗体に由来する可変ドメイン及び相補性決定領域とを含有する組換えタンパク質であり、同時に、抗体分子の残りがヒト抗体に由来する。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体のネズミ相補性決定領域がネズミ免疫グロブリンの重鎖可変部及び軽鎖可変部からヒト可変ドメインの中に移されている組換えタンパク質である。
様々な組換え法を、二重特異性の抗体及び抗体フラグメントを製造するために使用することができる。例えば、二重特異性の抗体及び抗体フラグメントを遺伝子組換え家畜の乳汁中に産生させることができる。例えば、Ｃｏｌｍａｎ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．、６３：１４１〜１４７、１９９８；米国特許第５，８２７，６９０号を参照のこと。対になった免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡセグメントをそれそれ含有する２つのＤＮＡ構築物が調製される。これらのフラグメントは、乳腺上皮細胞において優先的に発現するプロモーター配列を含有する発現ベクターにクローニングされる。例には、ウサギ、ウシ及びヒツジのカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子並びにマウス乳漿酸性タンパク質遺伝子に由来するプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、挿入されたフラグメントは、乳腺特異的遺伝子に由来する同族のゲノム配列がその３’側で接する。これにより、ポリアデニル化部位及び転写物安定化配列が提供される。これらの発現カセットは哺乳動物受精卵の前核に同時注入され、その後、受精卵を、移植されるメスの子宮に着床させ、妊娠させる。出生後、子孫は、サザン分析によって両方の導入遺伝子の存在についてスクリーニングされる。抗体が存在するためには、重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の両方が、同じ細胞において同時に発現しなければならない。遺伝子組換え体のメスから得られた乳汁が、当分野で知られている標準的な免疫学的方法を使用して、抗体又は抗体フラグメントの存在及び機能性について分析される。抗体は、当分野で知られている標準的な方法を使用して乳汁から精製することができる。
キメラＡｂは、マウスの軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡフラグメントを、ヒト抗体に由来するＣドメインをコードするフラグメントに連結することによって構築される。Ｃドメインは抗原との結合に寄与しないので、キメラ抗体は、元のマウスＡｂと同じ抗原特異性を保持しているが、配列がヒト抗体に一層近いものになっている。しかし、キメラＡｂは一部のマウス配列を依然として含有しており、依然として免疫原性であり得る。ヒト化Ａｂは、抗原を認識するために必要なそのようなマウスアミノ酸のみを含有する。この製造物は、マウスの相補性決定領域に由来するアミノ酸をヒト抗体のフレームワーク内に組み立てることによって構築される。
ｂｓＡｂを製造するための他の最近の方法では、より共通的な免疫グロブリンイソ型よりも強く架橋するようにさらなるシステイン残基を有する操作された組換えＡｂが含まれる。例えば、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１０（１０）：１２２１〜１２２５、１９９７を参照のこと。別の方法は、必要とされる二重の特異性を有する２つ以上の異なる単鎖抗体又は抗体フラグメントのセグメントを連結している組換え融合タンパク質を操作することである。例えば、Ｃｏｌｏｍａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１５９〜１６３、１９９７を参照のこと。様々な二重特異性の融合タンパク質を、分子操作を使用して製造することができる。１つの形態において、二重特異性の融合タンパク質は一価であり、例えば、１つの抗原に対して１つの結合部位を有するｓｃＦｖと、別の抗原に対して１つの結合部位を有するＦａｂフラグメントとからなる。別の形態では、二重特異性の融合タンパク質は二価であり、例えば、１つの抗原に対して２つの結合部位を有するＩｇＧと、別の抗原に対して２つの結合部位を有する２つのｓｃＦｖとからなる。
機能的な二重特異性の単鎖抗体（ｂｓｃＡｂ）（これもまた二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）と呼ばれる）を、組換え法を使用して哺乳動物細胞において産生させることができる。例えば、Ｍａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９２：７０２１〜７０２５、１９９５を参照のこと。例えば、ｂｓｃＡｂが、組換え法を使用して、グリシン−セリンリンカーを介して２つの単鎖Ｆｖフラグメントを連結することによって製造される。目的とする２つの抗体のＶ軽鎖（ＶＬ）ドメイン及びＶ重鎖（ＶＨ）ドメインが、標準的なＰＣＲ法を使用して単離される。その後、それぞれのハイブリドーマから得られたＶＬｃＤＮＡ及びＶＨｃＤＮＡが、単鎖フラグメントを得るために、２段階の融合ＰＣＲで連結される。最初のＰＣＲ工程により、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ１）３リンカーが導入され、２番目の工程により、ＶＬアンプリコン及びＶＨアンプリコンが連結される。その後、それぞれの単鎖分子が細菌発現ベクターにクローニングされる。増幅後、単鎖分子の一方が切り出され、目的とする第２の単鎖分子を含有するもう一方のベクターにサブクローニングされる。得られるｂｓｃＡｂフラグメントが真核生物発現ベクターにサブクローニングされる。機能的なタンパク質の発現を、ベクターをチャイニーズハムスター卵巣細胞にトランスフェクションすることによって得ることができる。二重特異性の融合タンパク質が類似する様式で調製される。二重特異性の単鎖抗体及び二重特異性の融合タンパク質は本発明の範囲に含まれる。大腸菌及び酵母において製造される、二重特異性抗体及び三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）及び四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）の二重特異性融合タンパク質が、米国仮特許出願第６０／３４５，６４１号、同第６０／３２８，８３５号及び同第６０／３４２，１０３号に記載される（これらの文献は参照することにより本明細書中に組み込まれる）。
２つ以上の異なる単鎖抗体又は抗体フラグメントを連結している二重特異性の融合タンパク質が類似する様式で製造される。
多量のｂｓｃＡｂ及び融合タンパク質を、大腸菌発現システムを使用して製造することができる。例えば、Ｚｈｅｎｐｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：１９２〜１９６、１９９６を参照のこと。機能的なｂｓｃＡｂを、２つの「クロスオーバー」ｓｃＦｖフラグメントを大腸菌において同時発現させることにより製造することができる。この場合、そのような２つのフラグメントに対するＶＬドメイン及びＶＨドメインは異なるポリペプチド鎖上に存在している。目的とする２つの抗体のＶ軽鎖（ＶＬ）ドメイン及びＶ重鎖（ＶＨ）ドメインが、標準的なＰＣＲ法を使用して単離される。その後、目的とする第１の抗体のＶＬドメインのＣ末端が第２の抗体のＶＨドメインのＮ末端にリンカーを介して連結されるように、これらのｃＤＮＡが細菌発現ベクターに連結される。同様に、目的とする第２の抗体のＶＬドメインのＣ末端が第１の抗体のＶＨドメインのＮ末端にリンカーを介して連結される。得られる二シストロン性オペロンが、強力なプロモーター（例えば、リン酸塩の飢餓により誘導可能な大腸菌アルカリホスファターゼプロモーター）の転写制御下に置かれる。あるいは、単鎖融合構築物は、ｌａｃプロモーターと、２％グリセリン及び１％トリトンＸ−１００からなる培地とを使用して大腸菌において発現させることに成功している。例えば。Ｙａｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６４：２８６９〜２８７４、１９９８を参照のこと。大腸菌の熱安定性エンテロトキシンＩＩのシグナル配列が、ペプチドを細胞周辺腔に向かわせるために使用される。分泌後、２つのペプチド鎖は会合して、両方の抗原結合特異性を有する非共有結合によるヘテロダイマーを形成する。ｂｓｃＡｂは、当分野で知られている標準的な手法を使用して、例えば、ブドウ球菌プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製される。
機能的なｂｓｃＡｂ及び融合タンパク質はまた、遺伝子組換え家畜の乳汁中に産生させることができる。例えば、Ｃｏｌｍａｎ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．、６３：１４１〜１４７、１９９８；米国特許第５，８２７，６９０号を参照のこと。上記に記載されるようにして得られるｂｓｃＡｂフラグメントは、乳腺上皮細胞において優先的に発現するプロモーター配列を含有する発現ベクターにクローニングされる。例には、ウサギ、ウシ及びヒツジのカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子並びにマウス乳漿酸性タンパク質遺伝子に由来するプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、挿入されたｂｓｃＡｂは、乳腺特異的遺伝子に由来する同族のゲノム配列がその３’側で接する。これにより、ポリアデニル化部位及び転写物安定化配列が提供される。その後、発現カセットが哺乳動物受精卵の前核に同時注入され、その後、受精卵を、移植されるメスの子宮に着床させ、妊娠させる。出生後、子孫は、導入されたＤＮＡの存在についてサザン分析によりスクリーニングされる。遺伝子組換え体のメスから得られた乳汁が、当分野で知られている標準的な免疫学的方法を使用してｂｓｃＡｂの存在及び機能性について分析される。ｂｓｃＡｂは、当分野で知られている標準的な方法を使用して乳汁から精製することができる。乳汁におけるｂｓｃＡｂの遺伝子組換え製造は、多量のｂｓｃＡｂを得るための効率的な方法を提供する。
機能的なｂｓｃＡｂ及び融合タンパク質はまた、遺伝子組換え植物において製造することができる。例えば、Ｆｉｅｄｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１３：１０９０〜１０９３、１９９５；Ｆｉｅｄｌｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：２０５〜２１６、１９９７を参照のこと。そのような製造により、低コスト、大規模生産及び安定かつ長期間の貯蔵を含むいくつかの利点が提供される。上記に記載されるようにして得られたｂｓｃＡｂフラグメントは、プロモーター配列を含有し、かつ小胞体にタンパク質を向かわせるためのシグナルペプチド配列をコードする発現ベクターにクローニングされる。発現産物を植物内の特定の位置に向かわせることを可能にする様々なプロモーターを利用することができる。例えば、タバコ植物における遍在的な発現を、強力なカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを使用することによって達成することができ、これに対して、器官特異的な発現が種子特異的なレグミンＢ４プロモーターによって達成される。発現カセットが、当分野で知られている標準的な方法に従って形質転換される。形質転換はサザン分析によって確認される。遺伝子組換え植物は、当分野で知られている標準的な免疫学的方法を使用してｂｓｃＡｂの存在及び機能性について分析される。ｂｓｃＡｂは、当分野で知られている標準的な方法を使用して植物組織から精製することができる。
さらに、遺伝子組換え植物はｂｓｃＡｂ及び融合タンパク質の長期間の貯蔵を容易にする。機能的に活性なｓｃＦｖタンパク質が、室温で１週間貯蔵された後のタバコの葉から抽出されている。同様に、室温で１年間貯蔵された遺伝子組換えタバコの種子は、ｓｃＦｖタンパク質又はその抗原結合活性の喪失を全く示していない。
機能的なｂｓｃＡｂ及び融合タンパク質はまた、昆虫細胞において製造することができる。例えば、Ｍａｈｉｏｕｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１２：１４９〜１６０（１９９８）を参照のこと。昆虫に基づく発現システムにより、多量の均一かつ正しく折り畳まれたｂｓｃＡｂを製造する手段が提供される。バキュロウイルスが、昆虫細胞のために広く使用されている発現ベクターであり、組換え抗体分子への適用に成功している。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｋ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４２：１７７（１９８８）；Ｂｅｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８６：２４５（１９９５）を参照のこと。あるいは、誘導可能な発現システムを、ｂｓｃＡｂ構築物を誘導可能なプロモーターの転写制御下に含有する安定な昆虫細胞株を作製することによって利用することができる。例えば、Ｍａｈｉｏｕｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１２：１４９〜１６０（１９９８）を参照のこと。上記に記載されるようにして得られたｂｓｃＡｂフラグメントは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ）メタロチオネインプロモーター配列及びヒトＨＬＡ−Ａ２リーダー配列を含有する発現ベクターにクローニングされる。その後、構築物はキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＳＣ−２細胞にトランスフェクションされる。発現が、銅又は亜鉛又はカドミウムの上昇した量に細胞を曝すことによって誘導される。ｂｓｃＡｂの存在及び機能性が、当分野で知られている標準的な免疫学的方法を使用して測定される。精製されたｂｓｃＡｂが、当分野で知られている標準的な方法を使用して得られる。
本発明の好ましい二重特異性抗体は、ＭＡｂ Ｍｕ９のＦｖ及びＭＡｂ６７９のＦｖを含む抗体、又はＭＡｂ ＭＮ１４のＦｖ及びＭＡｂ６７９のＦｖを含む抗体、並びにそれらのヒト対応体又はキメラ化対応体又はヒト化対応体である。従って、抗ＣＳＡｐ抗体フラグメントもまた本発明では考えられる。好ましくは、抗ＣＳＡｐ抗体フラグメントはＭｕ−９抗体フラグメントである。ＭＮ１４並びにそのキメラ化対応体及びヒト化対応体が米国特許第５，８７４，５４０号に開示される。Ｍｕ９又は６７９のＣＤＲの１つ以上を含む二重特異性の抗体もまた好ましい。抗体はまた、クラスＩＩＩ抗ＣＥＡ抗体と６７９のＦｖとを含む融合タンパク質又は二重特異性の抗体であり得る。様々なクラスＩＩＩ抗体（クラスＩＩＩ抗ＣＥＡを含む）が米国特許第４，８１８，７０９号で詳しく議論されている。
ＩＶ．処置及び診断／検出のための抗体
処置及び診断／検出のためのヒト化抗ＣＳＡｐ抗体及びキメラ抗ＣＳＡｐ抗体及びヒト抗ＣＳＡｐ抗体
本発明では、ヒト化抗ＣＳＡｐ抗体、キメラ抗ＣＳＡｐ抗体、ヒト抗ＣＳＡｐ抗体及びそれらのフラグメントの治療法及び診断法における使用が考えられる。好ましくは、キメラ抗ＣＳＡｐ抗体、ヒト化抗ＣＳＡｐ抗体、ヒト抗ＣＳＡｐ抗体及びそれらのフラグメントは、キメラＭｕ−９抗体、ヒト化Ｍｕ−９抗体又はヒトＭｕ−９抗体である。さらに好ましくは、本発明のキメラＭｕ−９抗体、ヒト化Ｍｕ−９抗体、ヒトＭｕ−９抗体及びそれらのフラグメントは、悪性腫瘍を処置するための方法において使用される。例えば、本発明における特に注目される悪性腫瘍は、胃腸系のがん、より好ましくは、結腸及び直腸のがん、膵臓のがん、並びに卵巣がんである。
処置用の組成物は、少なくとも１つのむき出し状態のヒト化抗ＣＳＡｐ抗体又はキメラ抗ＣＳＡｐ抗体又はヒト抗ＣＳＡｐ抗体又はそれらのフラグメントを、単独で、又は他の抗ＣＳＡｐ抗体若しくはその抗体フラグメント（他の抗ＣＳＡｐヒト化抗体又は抗ＣＳＡｐキメラ抗体又は抗ＣＳＡｐヒト抗体など）との組合せで含有する。本発明ではまた、少なくとも１つのむき出し状態のヒト化抗ＣＳＡｐ抗体又はキメラ抗ＣＳＡｐ抗体又はヒト抗ＣＳＡｐ抗体又はそれらのフラグメントを、抗ＣＳＡｐ抗体でない他の抗体又はその抗体フラグメントとの組合せで用いる処置が考えられ、それにより、これらの他の抗体を非コンジュゲート型（むき出し状態）で投与することができ、又は治療化合物とのコンジュゲート型で投与することができる。例えば、混合療法のために好適な他の抗体には、がん腫関連抗体及びそのフラグメント、例えば、ＣＥＡ、ＥＧＰ−１、Ｇａ７３３抗原標的（例えば、ＥＧＰ−２、１７−１Ａ、ＫＳ１−４及びＥｐ−ＣＡＭの抗体などについて）、ＭＵＣ１〜ＭＵＣ−４、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、ＫＳ−１及びＡ３に対する抗体、抗壊死抗体、及びＡ３３抗体決定基などが含まれるが、これらに限定されない。好適な抗体にはまた、がん遺伝子マーカー若しくはがん遺伝子産物に対してターゲッティングされる抗体、又は腫瘍−血管系マーカー（例えば、血管形成因子、ＶＥＧＦ）に対する抗体、及びある種の免疫応答調節因子に対する抗体（ＣＤ４０に対する抗体など）を挙げることができる。さらに、処置は、少なくとも１つのヒト化抗ＣＳＡｐ免疫コンジュゲート体又はキメラ抗ＣＳＡｐ免疫コンジュゲート体又はヒト抗ＣＳＡｐ免疫コンジュゲート体又はそれらのフラグメントを、単独で、あるいは他の抗ＣＳＡｐ抗体又はその抗体フラグメント（他の抗ＣＳＡｐヒト化抗体又は抗ＣＳＡｐキメラ抗体又は抗ＣＳＡｐヒト抗体など）との組合せで用いて行うことができる。さらに好ましくは、処置用の組成物は、少なくとも１つのヒト化抗ＣＳＡｐ免疫コンジュゲート体又はキメラ抗ＣＳＡｐ免疫コンジュゲート体又はヒト抗ＣＳＡｐ免疫コンジュゲート体又はそれらのフラグメントを、抗ＣＳＡｐ抗体でない他の抗体又は抗体フラグメントと組み合わせて含有することができ、この場合、これらはむき出し状態又は治療剤に対するコンジュゲート型のいずれかである。
同様に、コンジュゲート型及びむき出し状態の抗ＣＳＡｐヒト化抗体又は抗ＣＳＡｐキメラ抗体又は抗ＣＳＡｐヒト抗体は単独で使用することができ、あるいは本明細書中に記載される様々な診断剤又は治療剤とともに、しかし非コンジュゲート型で投与することができる。また、むき出し状態の抗体、あるいは同じ又は異なるエピトープ又は抗原に対するコンジュゲート化抗体もまた、本発明の抗体の１つ以上と組み合わせることができる。
従って、本発明では、ヒト化Ｍｕ−９抗体、キメラＭｕ−９抗体、ヒトＭｕ−９抗体及びそれらのフラグメントを単独又はむき出し状態の抗体として投与すること、あるいは多モード治療として投与されるそのような抗体及びそれらのフラグメントの投与が考えられる。本発明の多モード治療はさらに、むき出し状態の抗体若しくは融合タンパク質の形態で、又は免疫コンジュゲート体として他の抗体を投与することにより補われる、むき出し状態のＣＳＡｐ抗体又はコンジュゲート化ＣＳＡｐ抗体を用いた免疫療法が含まれる。例えば、ヒト化Ｍｕ−９抗体、キメラＭｕ−９抗体又はヒトＭｕ−９抗体を、他のむき出し状態のヒト化Ｍｕ−９抗体、むき出し状態のキメラＭｕ−９抗体又はむき出し状態のヒトＭｕ−９抗体と、あるいはヒト化Ｍｕ−９免疫コンジュゲート体、キメラＭｕ−９免疫コンジュゲート体又はヒトＭｕ−９免疫コンジュゲート体（同位体、１つ以上の化学療法剤、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、ホルモン又はホルモンアンタゴニスト、金属、毒素又はそれらの組合せに対してコンジュゲート化されたヒト化Ｍｕ−９抗体又はキメラＭｕ−９抗体又はヒトＭｕ−９抗体など）と組み合わせることができる。ヒト化Ｍｕ−９抗体又はキメラＭｕ−９抗体又はヒトＭｕ−９抗体と毒素との融合タンパク質もまた本発明において使用することができる。多くの異なる抗体組合せを、むき出し状態の抗体として、あるいは一部がむき出し状態であるので、一部が治療剤又は免疫調節因子とのコンジュゲート型として、あるいは別の治療剤（細胞傷害性薬剤など）又は放射線との単なる組合せで、そのいずれかで組み立てることができる。
処置用の組成物は、少なくとも１つのヒト化モノクローナル抗ＣＳＡｐ抗体又はキメラモノクローナル抗ＣＳＡｐ抗体又はヒトモノクローナル抗ＣＳＡｐ抗体又はそれらのフラグメントを、単独で、又は他の抗体及びそのフラグメント（他のむき出し状態若しくはコンジュゲート型のヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、融合タンパク質など）若しくは治療剤との組合せで含有する。特に、完全なヒト抗体を用いた混合療法もまた考えられ、そして上記に示されるような方法によってもたらされる。
むき出し状態の抗体、あるいは同じ又は異なるエピトープ又は抗原に対するコンジュゲート化抗体、及びそれらのフラグメントもまた、本発明の抗体又はそのフラグメントの１つ以上と組み合わせることができる。例えば、ヒト化されたむき出し状態のＭｕ−９抗体又はキメラ型のむき出し状態のＭｕ−９抗体又はヒトのむき出し状態のＭｕ−９抗体を別のむき出し状態のヒト化Ｍｕ−９抗体又はむき出し状態のキメラＭｕ−９抗体又はむき出し状態のヒトＭｕ−９抗体と組み合わせることができ、あるいはヒト化されたむき出し状態のＭｕ−９抗体又はキメラ型のむき出し状態のＭｕ−９抗体又はヒトのむき出し状態のＭｕ−９抗体をＭｕ−９免疫コンジュゲート体と組み合わせることができ、あるいはむき出し状態のＭｕ−９抗体を異なる抗体放射性コンジュゲート体と組み合わせることができ、あるいは異なるむき出し状態の抗体を、同位体にコンジュゲート化されたか、又は１つ以上の化学療法剤、サイトカイン、毒素、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト若しくはそれらの組合せにコンジュゲート化されたヒト化Ｍｕ−９抗体又はキメラＭｕ−９抗体又はヒトＭｕ−９抗体と組み合わせることができる。ヒト化Ｍｕ−９抗体又はキメラＭｕ−９抗体又はヒトＭｕ−９抗体と毒素又は免疫調節因子との融合タンパク質もまた本発明において使用することができる。少なくとも２つの異なる抗原をターゲッティングする多くの異なる抗体組合せを、むき出し状態の抗体として、あるいは一部がむき出し状態で、一部が治療剤又は免疫調節因子とのコンジュゲート型として、あるいは別の治療剤（細胞傷害性薬剤など）又は放射線との単なる組合せで、そのいずれかで組み立てることができる。
本発明の多モード治療にはさら、結腸直腸がん又は卵巣がんによって発現される抗原に対する抗体を、むき出し状態の抗体、融合タンパク質、免疫コンジュゲート体及びそれらのフラグメントの形態で投与することにより補われる、むき出し状態のＭｕ−９抗体又はそのフラグメントを用いた免疫療法が含まれる。好ましい実施形態において、多モード治療用の抗体又はそのフラグメントには、ＣＥＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＫＣ４、ＰＡＭ−４、ＥＧＦＲ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、ＫＳ−１及びＡ３に対する抗体、Ａ３３抗体及びＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体及びそれらのフラグメント、並びに血管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ）に対する抗体、又はがん遺伝子マーカー若しくはがん遺伝子産物に対する抗体、並びに免疫調節因子（例えば、ＣＤ４０）に対する抗体が含まれるが、これらに限定されない。これらの抗体には、これらの抗原性決定基上の少なくとも１つのエピトープを認識するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体及びそれらのフラグメントが含まれる。
多モード治療の別の形態において、被験体には、むき出し状態の抗体若しくはそのフラグメント及び／又は免疫コンジュゲート体若しくはそのフラグメントが標準的ながん化学療法と一緒に与えられる。ホリニン酸と組み合わせた５−フルオロウラシルは、それだけで、又はイリノテカン（ＣＰＴ−１１）との組合せで、結腸直腸がんを処置するために使用される治療法である。混合化学療法による他の好適な治療法が当業者に広く知られている。例えば、オキサリプラチンを、単独で、又はこれらの他の薬物との組合せで用いた混合化学療法。卵巣がんでは、さらに別の化学療法剤、例えば、タキサン類及び白金剤、チオ−ＴＥＰＡ及び他のアルキル化剤（例えば、クロラムブチル）、並びにゲムシタビン及び他のより最近の種類の細胞傷害性薬物のいずれかの化学療法剤が好まれることがある。好ましい多モード治療において、化学療法薬物及びサイトカインの２つは、本発明による抗体又は免疫コンジュゲート体又は融合タンパク質と同時に投与される。サイトカイン、化学療法薬物、及び抗体又は免疫コンジュゲート体は、任意の順序で、又は一緒に投与することができる。
様々な他の化学療法剤を、混合処置のために、又は免疫コンジュゲート体を作製するために使用することができる。そのような化学療法剤には、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテレ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキサート、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリン、コンブレタスタチン類、ネオマイシン、ポドフィロトキシン類、ＴＮＦ−α、α２β３アンタゴニスト、カルシウムイオノホア、カルシウムフラックス誘導剤、並びにそれらの誘導体及びプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。シトシンアラビノシド、アミノプテリンなどの代謝拮抗剤；アントラサイクリン類；ビンカアルカロイド及び他のアルカロイド；抗生物質、デメコルチン；エトポシド；ミトラマイシン；及び他の抗腫瘍アルキル化剤もまた、本発明の抗体との使用のために考えられる。
さらに、本発明の治療用組成物は、ＣＳＡｐ分子上の異なる非遮蔽エピトープに対するむき出し状態のモノクローナルＭｕ−９抗体又はそのフラグメントの混合物又はハイブリッド分子を含有することができる。従って、本発明では、少なくとも２つのＣＳＡｐエピトープと結合するモノクローナルＭｕ−９抗体又はそのフラグメントの混合物を含む治療用組成物が考えられる。さらに、本明細書中に記載される治療用組成物は、様々なＣＤＲ配列を有するＭｕ−９抗体及びそのフラグメントの混合物を含有することができる。
むき出し状態の抗体による治療
むき出し状態のキメラ抗ＣＳＡｐ抗体、むき出し状態のヒト化抗ＣＳＡｐ抗体、むき出し状態のヒト抗ＣＳＡｐ抗体又はそれらのフラグメントの治療有効量を薬学的に受容可能な賦形剤に配合することができる。むき出し状態のＭｕ−９抗体の効力はまた、むき出し状態の抗体を、１つ以上の他のむき出し状態の抗体（腫瘍関連抗原に対する抗体、又は同様に免疫調節因子（ＣＤ４０抗原若しくはリガンドなど）に対するアゴニスト抗体若しくはアンタゴニスト抗体など）により、Ｍｕ−９の１つ以上の免疫コンジュゲート体により、ＣＳＡｐ以外の腫瘍関連抗原に対する抗体の免疫コンジュゲート体で、治療剤（薬物、毒素、サイトカイン、免疫調節因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、酵素阻害剤、治療用放射性核種などを含む）とコンジュゲート化された免疫コンジュゲート体の１つ以上より、１つ以上の治療剤（薬物、毒素、サイトカイン、免疫調節因子、ホルモン、酵素、酵素阻害剤、治療用放射性核種などを含む）により補うことによって高めることができ、これらは、Ｍｕ−９抗体と同時に、又はＭｕ−９抗体と連続して、又は処方された投薬法に従ってＭｕ−９抗体とともに投与される。
ヒト化抗ＣＳＡｐ免疫コンジュゲート体、キメラ抗ＣＳＡｐ免疫コンジュゲート体及びヒト抗ＣＳＡｐ免疫コンジュゲート体
あるいは、本発明のＭｕ−９抗体又はそのフラグメントのコンジュゲート体を投与することができる。治療のために、これらのコンジュゲート体は、好ましくは、細胞傷害性薬剤を含有する。より好ましくは、細胞傷害性薬剤は毒素である。本明細書中に記載される免疫コンジュゲート体は、抗体成分と、治療剤又は診断剤とを含む分子であり、これには、診断剤又は治療剤を有し得るペプチドも含まれる。免疫コンジュゲート体は抗体成分の免疫反応性を保持している。すなわち、抗体部分は、同族の抗原と結合する能力が、コンジュゲート化の後で、コンジュゲート化前とほぼ同じであるか、又はわずかに低下している。
非常に様々な診断／検出試薬及び治療試薬を本発明の抗体及びそのフラグメントに都合よくコンジュゲート化することができる。本明細書中に示される治療剤は、上記に記載されるようにむき出し状態の抗体とともに別個に投与するためにもまた有用であるそのような薬剤である。治療剤には、例えば、ビンカアルカロイド及び他のアルカロイド、アントラサイクリン類、エピドフィロトキシン類、タキサン類、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、Ｃｏｘ−２阻害剤、細胞***阻止剤、抗血管形成剤及びアポトーシス剤などの化学療法薬物が含まれ、特に、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン類、そしてこれらのクラス及び他のクラスの抗がん剤に由来する化学療法薬物などが含まれる。免疫コンジュゲート体及び抗体融合タンパク質を調製するための他の有用ながん化学療法薬物には、ナイトロジェンマスタード類、アルキルスルホナート、ニトロソウレア類、トリアゼン類、葉酸アナログ、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、白金配位錯体、ホルモン、毒素（例えば、ＲＮＡｓｅ、シュードモナスのエキソトキシン）などが含まれる。様々な好適な化学療法剤が、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（第１９版）（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、１９９５）に、そしてＧＯＯＤＭＡＮ ＡＮＤ ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ（第７版）（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、１９８５）に、並びにこれらの刊行物の改訂版に記載されている。他の好適な化学療法剤（実験中の薬物など）が当業者には知られている。
さらに、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ又はＮＯＴＡなどのキレーターあるいは好適なペプチドに対して、検出可能な標識（蛍光性分子など）又は細胞傷害性薬剤（重金属若しくは放射性核種など）をコンジュゲート化することができる。例えば、治療的に有用な免疫コンジュゲート体を、光活性な薬剤又は色素を抗体複合物にコンジュゲート化することによって得ることができる。蛍光性組成物（蛍光色素など）及び他の色素原又は色素（可視光に対する感受性を有するポルフィリン類など）を、好適な光を病変部に誘導することによって病変部を検出し、処置するために使用することができる。治療では、これは、光放射線又は光線療法又は光力学的治療と呼ばれている（Ｊｏｒｉら（編）、ＰＨＯＴＯＤＹＮＡＭＩＣ ＴＨＥＲＡＰＹ ＯＦ ＴＵＭＯＲＳ ＡＮＤ ＯＴＨＥＲ ＤＩＳＥＡＳＥＳ（Ｌｉｂｒｅｒｉａ Ｐｒｏｇｅｔｔｏ、１９８５）；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈ、Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ、２２：４３０（１９８６））。さらに、様々なモノクローナル抗体が、光線療法を達成するために光活性化型色素とカップリングされている。Ｍｅｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３０：１４７３（１９８３）；同上、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４５：４３８０（１９８５）；Ｏｓｅｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：８７４４（１９８６）；同上、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、４６：８３（１９８７）；Ｈａｓａｎら、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．、２８８：４７１（１９８９）；Ｔａｔｓｕｔａら、Ｌａｓｅｒｓ Ｓｕｒｇ．Ｍｅｄ．、９：４２２（１９８９）；Ｐｅｌｅｇｒｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ、６７：２５２９（１９９１）。しかし、これらのより初期の研究では、内視鏡治療適用の使用、特に、抗体フラグメント又はサブフラグメントの使用を伴う内視鏡治療適用の使用は含まれていなかった。従って、本発明では、光活性な薬剤又は色素を含む免疫コンジュゲート体の治療的使用が考えられる。
毒素（シュードモナスのエキソトキシンなど）もまた、免疫コンジュゲート体の治療剤部分に対して複合体化することができ、又は免疫コンジュゲート体の治療剤部分にすることができる。例えば、毒素は、本発明のＭｕ−９抗体と複合体化することができ、又はＭｕ−９抗体のコンジュゲート体のむき出し状態のＭｕ−９と組み合わせて使用されるときには、本発明において使用されるそれ以外の非ＣＳＡｐ抗体に対してもまた複合体化することができる。そのようなコンジュゲート体又は他の融合タンパク質を調製する際に好適に用いられる他の毒素には、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌のエンドトキシンＡ、アメリカヤマゴボウの抗ウイルス性タンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナスのエキソトキシン、及びシュードモナスのエンドトキシンが含まれる。例えば、Ｐａｓｔａｎら、Ｃｅｌｌ、４７：６４１（１９８６）；及びＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、ＣＡ−Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ、４４：４３（１９９４）を参照のこと。本発明における使用のために好適なさらなる毒素が当業者には知られており、米国特許第６，０７７，４９９号に開示される（この文献は、その全体を参照することにより本明細書に組み込むものとする）。これらは、例えば、動物供給源、植物供給源及び微生物供給源に由来し得る。
免疫調節因子（サイトカインなど）もまた、抗ＣＳＡｐ免疫コンジュゲート体の治療剤部分にコンジュゲート化することができ、又は抗ＣＳＡｐ免疫コンジュゲート体の治療剤部分にすることができ、又は本発明のキメラ抗ＣＳＡｐ抗体若しくはヒト化抗ＣＳＡｐ抗体若しくはヒト抗ＣＳＡｐ抗体にコンジュゲート化されずに投与することができる。本明細書中で使用される用語「免疫調節因子」には、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）、及び造血性因子（インターロイキン類（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及び顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）など）、インターフェロン類（例えば、インターフェロン−α及びβ及びγ）、「Ｓ１因子」と称される幹細胞増殖因子、エリスロポイエチン及びトロンボポイエチンなど）が含まれる。好適な免疫調節因子部分の例には、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−αなどが含まれる。あるいは、被験体には、むき出し状態のＭｕ−９抗体及び別個に投与されるサイトカインを与えることができ、この場合、サイトカインは、むき出し状態のＭｕ−９抗体が投与される前に、又はむき出し状態のＭｕ−９抗体の投与と同時に、又はむき出し状態のＭｕ−９抗体が投与された後に投与することができる。Ｍｕ−９抗体はまた、免疫調節因子にコンジュゲート化することができる。免疫調節因子はまた、異なる抗原に結合する１つ以上の抗体からなるハイブリッド抗体にコンジュゲート化することができる。そのような抗原もまた免疫調節因子であってもよい。例えば、ＣＤ４０又は他の免疫調節因子を、抗体の組合せが投与される前に、又は抗体の組合せが投与された後に、抗ＣＳＡｐ又は抗ＣＳＡｐ／非ＣＳＡｐ抗体組合せのいずれかとの組合せで一緒に投与することができる。Ｍｕ−９抗体はまた、免疫調節抗体（ＣＤ４０に対する抗体など）と組み合わせて使用することができ、又は融合タンパク質として、免疫調節抗体（ＣＤ４０に対する抗体など）にコンジュゲート化することができる。
さらに、本発明には、被験体における悪性腫瘍を診断又は検出する方法が含まれる。診断／検出は、診断用コンジュゲート体の診断有効量を、薬学的に受容可能な賦形剤に配合して投与し、そして前記標識を検出することによって達成することができる。例えば、放射性薬剤及び非放射性薬剤を診断剤として使用することができる。好適な非放射性の診断剤は、磁気共鳴画像化のために好適な造影剤、Ｘ線写真又はコンピューター断層撮影法のための放射線不透過性化合物、あるいは超音波検査のために好適な造影剤である。磁気画像化剤には、例えば、マンガン、鉄及びガドリニウムなどの非放射性の金属が含まれ、これらは、本発明の抗体と一緒に使用されたときには、２−ベンジル−ＤＴＰＡ並びにそのモノメチルアナログ及びシクロヘキシルアナログを含む様々な金属−キレート組合せにより複合体化する。米国特許出願第０９／９２１，２９０号（２００１年１０月１０日出願）を参照のこと（この文献は参照することによりその全体を本明細書に組み込むものとする）。好ましい実施形態において、造影剤は超音波増強剤である。さらに好ましくは、超音波増強剤はリポソームである。放射線不透過性物質及び造影剤物質は、Ｘ線写真及びコンピューター断層撮影法を強化するために使用され、これらには、ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物及びタリウム化合物などが含まれる。具体的な化合物には、バリウム、ジアトリゾアート、エチルヨウ化油、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、ヨーセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパノ酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメト酸、イオタスル、イオテトル酸、イオタラム酸、イオトロクス酸、イオキサグル酸、イオクソトリゾ酸、イポダート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾアート、プロピリオドン及び塩化タリウムが含まれる。
さらに、放射標識された抗体又は免疫コンジュゲート体は、診断的画像化のために有用なγ線放出放射性同位体又は陽電子放出体を含むことができる。診断／検出剤の例には、様々な標識、放射性核種、キレーター、色素、造影剤、蛍光性化合物、色素原及び他のマーカー成分が含まれる。陽電子放出断層撮影法のために有用な放射性核種には、Ｆ−１８、Ｍｎ−５１、Ｍｎ−５２ｍ、Ｆｅ−５２、Ｃｏ−５５、Ｃｕ−６２、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６８、Ａｓ−７２、Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６、Ｒｂ−８２ｍ、Ｓｒ−８３、Ｙ−８６、Ｚｒ−８９、Ｔｃ−９４ｍ、Ｉｎ−１１０、Ｉ−１２０及びＩ−１２４が含まれるが、これらに限定されない。有用な陽電子放出放射性核種の総崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００ｋｅＶ未満であり、より好ましくは１，０００ｋｅＶ未満であり、最も好ましくは７００ｋｅＶ未満である。γ線検出を利用する診断剤として有用な放射性核種には、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｓｅ−７５、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−１１４ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｙｂ−１６９、Ｈｇ−１９７及びＴｌ−２０１が含まれるが、これらに限定されない。有用なγ線放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２０ｋｅＶ〜２０００ｋｅＶであり、より好ましくは６０ｋｅＶ〜６００ｋｅＶであり、最も好ましくは１００ｋｅＶ〜３００ｋｅＶである。
さらに、疾患組織を処置するために好適な放射性核種には、Ｐ−３２、Ｐ−３３、Ｓｃ−４７、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｓｅ−７５、Ａｓ−７７、Ｓｒ−８９、Ｙ−９０、Ｍｏ−９９、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ａｇ−１１１、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｐｒ−１４２、Ｐｒ−１４３、Ｐｍ−１４９、Ｓｍ−１５３、Ｔｂ−１６１、Ｈｏ−１６６、Ｅｒ−１６９、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８９、Ｉｒ−１９４、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｐｂ−２１１、Ｐｂ−２１２、及びＢｉ−２１３、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ、Ｉｒ−１９２、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３及びＦｍ−２５５が含まれるが、これらに限定されない。
好適な診断画像化同位体は、通常、２０ｋｅＶ〜２，０００ｋｅＶの範囲であり、一方、好適な治療用放射性核種は、通常、２０ｋｅＶ〜１０，０００ｋｅＶの範囲である。例えば、「Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇａｌｌｉｕｍ−６８」と題する米国特許出願（発明者：Ｇ．Ｌ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ及びＷ．Ｊ．ＭｃＢｒｉｄｅ）を参照のこと（米国仮特許出願第６０／３４２，１０４号）。これは、画像化目的のために、１８Ｆ、６８Ｇａ、９４ｍＴｃなどの陽電子放射体を開示しており、参照することによりその開示内容全体が組み込まれる。
二重特異性抗体による治療
本発明にはまた、米国特許第６，０９６，２８９号（これは参照することにより本明細書中に組み込まれる）に記載されるように手術中及び血管内及び内視鏡での腫瘍及び病変部の検出及び生検及び治療における、上記に議論されたリンカー部分により結合しているｂｓＡｂ及び治療剤の使用が包含される。
本発明の抗体及び抗体フラグメントは、治療目的又は画像化目的のためだけではなく、インビトロでの研究を行う際の助けとしてもまた用いることができる。例えば、本発明のｂｓＡｂは、ターゲッティング可能な構築物が１つ以上のｂｓＡｂと安定な複合体を形成し得るとどうかを確認するためにインビトロで使用することができる。そのようなアッセイは、ｂｓＡｂとの安定な複合体を形成するターゲッティング可能な構築物を当業者が同定することを助ける。これにより、その後、当業者は、治療剤及び／又は画像化剤として優れていると考えられるターゲッティング可能な構築物を同定することができる。
アッセイは、好都合には、問題としているターゲッティング可能な構築物を少なくとも２モル当量のｂｓＡｂと一緒にすることによって行われる。インキュベーション後、構築物がｂｓＡｂに結合したか否かを明らかにするために、混合物がサイズ排除ＨＰＬＣによって分析される。あるいは、アッセイは、様々なｂｓＡｂの溶液が標準的な９６ウエルプレートの置かれる標準的なコンビナトリアル法を使用して行われる。それぞれのウエルには、ターゲッティング可能な構築物（１つ又は複数）の溶液が加えられる。インキュベーション及び分析を行った後、どの構築物（１つ又は複数）がどのｂｓＡｂ（１つ又は複数）に最もよく結合しているかを容易に決定することができる。
ｂｓＡｂをターゲッティング可能な構築物に加える順序は重要でないことを理解しなければならない。すなわち、ｂｓＡｂを構築物に加えることができ、逆に、構築物をｂｓＡｂに加えることができる。同様に、ｂｓＡｂ又は構築物のどちらも溶液中に存在させる必要はない。すなわち、ｂｓＡｂ又は構築物は、どちらが最も便利であるとしても、溶液又はそのままのいずれかで加えることができる。最後に、結合に対する分析方法は、結合が確立されている限り、重要ではない。従って、サイズ排除ＨＰＬＣとともに、又はその代わりに、ＦＡＢＭＳ、高磁場ＮＭＲ又は他の適切な方法（これらに限定されない）を含む標準的な分析方法を使用して結合について分析することができる。
本発明は、標的化された細胞マーカーと特異的に結合する少なくとも１つの結合領域と、ターゲッティング可能なコンジュゲート体と特異的に結合する少なくとも１つの他の結合領域とを有する二重特異性の抗体又は抗体フラグメントを提供する。ターゲッティング可能なコンジュゲート体は、二重特異性の抗体又は抗体フラグメントの少なくとも１つの結合領域によって認識されるエピトープを少なくとも１つ含むか、又はそのようなエピトープを少なくとも１つ有するキャリア部分を含む。
例えば、本明細書中に記載される、混合療法において使用される抗ＣＳＡｐ抗体及びそのフラグメント、並びに異なる特異性を有する他の抗体及びそのフラグメントもまた、多重特異性の抗体（これは、ＣＳＡｐエピトープ又は抗原に対する少なくとも１つの結合部位と、ＣＳＡｐにおける別のエピトープ又は別の抗原に対する少なくとも１つの結合部位とを含む）及び多価の抗体（これは、同じエピトープ又は抗原に対する多数の結合部位を含む）として作製することができる。
様々な組換え法を、上記に記載されるように、二重特異性の抗体及び抗体フラグメントを製造するために使用することができる。
好ましい実施形態において、多価抗体はＭｕ−９抗体である。Ｍｕ−９多価抗体もまた本発明では考えられる。この多価抗体は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを結合させることによって構築される。第１のポリペプチドは、好ましくは免疫グロブリンの軽鎖可変領域ドメインである第１の免疫グロブリン様ドメインに共有結合的に連結された第１の単鎖Ｆｖ分子を含む。第２のポリペプチドは、好ましくは免疫グロブリンの重鎖可変領域ドメインである第２の免疫グロブリン様ドメインに共有結合的に連結された第２の単鎖Ｆｖ分子を含む。第１の単鎖Ｆｖ分子及び第２の単鎖Ｆｖ分子のそれぞれが標的結合部位を形成し、そして第１の免疫グロブリン様ドメイン及び第２の免疫グロブリン様ドメインが会合して、第３の標的結合部位を形成する。
ＶＬ−Ｌ−ＶＨ形態（この場合、Ｌはリンカーである）を有する単鎖Ｆｖ分子は、ＶＨ−Ｌ−ＶＬ形態を有する別の単鎖Ｆｖ分子と会合して、二価のダイマーを形成することができる。この場合、第１のｓｃＦｖのＶＬドメイン及び第２のｓｃＦｖ分子のＶＨドメインは会合して、１つの標的結合部位を形成し、その一方で、第１のｓｃＦｖのＶＨドメイン及び第２のｓｃＦｖのＶＬドメインは会合して、それとは異なる標的結合部位を形成する。
本発明の別の実施形態は、３つの結合部位を形成させるために非共有結合的に結合させた２つの異種ポリペプチド鎖を含むＭｕ−９の二重特異性かつ三価の抗体であり、この場合、そのうちの２つが１つの標的に対して親和性を有しており、もう１つが、診断剤及び／又は治療剤のために作製され、かつ診断剤及び／又は治療剤に対するキャリアに結合され得るハプテンに対して親和性を有している。好ましくは、結合性タンパク質は２つのＣＳＡｐ結合部位と、１つの他の抗原結合部位とを有する。二重特異性かつ三価のターゲッティング剤は２つの異なるｓｃＦｖを有しており、１つのｓｃＦｖが、ある抗体に由来する２つのＶＨドメインを、別の抗体のＶＬドメインに短いリンカーにより連結されて含有し、そして第２のｓｃＦｖが、第１の抗体に由来する２つのＶＬドメインを、それ以外の抗体のＶＨドメインに短いリンカーにより連結されて含有する。多価かつ多重特異性の薬剤をＶＨドメイン及びＶＬドメインから作製する方法により、１つのＶＨ鎖を１つのＶＬ鎖と非共有結合的に結合させることによって多価及び多重特異性の任意の薬剤が製造され得るような様式で、宿主生物においてＤＮＡプラスミドから合成された個々の鎖が完全にＶＨドメインから構成され（ＶＨ鎖）、又は完全にＶＬドメインから構成される（ＶＬ鎖）ことが規定される。例えば、三価かつ三重特異性の薬剤を形成させる場合、ＶＨ鎖は、特異性が異なる抗体にそれぞれが由来する３つのＶＨドメインのアミノ酸配列から、様々な長さのペプチドリンカーにより連結されて構成され、そしてＶＬ鎖は、ＶＨ鎖のために使用されるリンカーと類似するペプチドリンカーにより連結された相補的なＶＬドメインから構成される。抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインは逆平行様式で会合するので、本発明における好ましい方法は、ＶＨ鎖内のＶＨドメインとは逆の順序で配置されたＶＬドメインをＶＬ鎖に有する。
本発明の二重特異性の抗体及びそのフラグメントは、プレターゲッティング方法において有用であり、２つの治療剤又は２つの診断／検出剤を被験体に送達するための好ましい方法を提供する。米国特許出願第０９／３８２，１８６号には、二重特異性の抗体を使用するプレターゲッティング方法が開示される。この場合、二重特異性の抗体は１２５Ｉで標識されて、被験体に送達され、その後、９９ｍＴｃで標識された二価ペプチドが送達されている。この送達により、１３１Ｉ及び９９ｍＴｃに対する優れた腫瘍／正常組織比が得られている。従って、このことは２つの診断用放射性同位体の有用性を示している。知られている治療剤又は診断剤の任意の組合せを使用して、抗体及び抗体融合タンパク質を標識することができる。ｍＡｂコンジュゲート体の抗体成分の結合特異性、治療剤又は診断剤の効力、及び抗体のＦｃ部分のエフェクター活性は、コンジュゲート体の標準的な試験によって決定することができる。
ヒト化Ｍｕ−９免疫コンジュゲート体、キメラＭｕ−９免疫コンジュゲート体及びヒトＭｕ−９免疫コンジュゲート体の調製
本発明の抗ＣＳＡｐ抗体若しくはそのフラグメント又は抗体融合タンパク質若しくはそのフラグメントはいずれも、１つ以上の治療剤又は診断剤とコンジュゲート化することができる。一般に、１つの治療剤又は診断剤がそれぞれの抗体又は抗体フラグメントに結合させられるが、２つ以上の治療剤又は診断剤を同じ抗体又は抗体フラグメントに結合させることができる。本発明の抗体融合タンパク質は２つ以上の抗体又はそのフラグメントを含み、この融合タンパク質を構成する抗体のそれぞれが治療剤又は診断剤を含有することができる。すなわち、抗体融合タンパク質又はそのフラグメントは、少なくとも１つの第１の抗ＣＳＡｐ ＭＡｂ又はそのフラグメントと、抗ＣＳＡｐ ＭＡｂでない少なくとも１つの第２のＭＡｂ又はそのフラグメントとを含むことができる。好ましくは、第２のＭＡｂはがん腫関連抗体であり、例えば、ＣＥＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、Ａ３及びＫＳ−１に対する抗体、ＶＥＧＦ抗体及び他の血管形成抗体、がん遺伝子抗体、抗壊死抗体、又は抗体Ａ３３などである。さらに、抗体融合タンパク質の抗体の１つ以上に２つ以上の治療剤又は診断／検出剤を結合させることができる。さらに、これらの治療剤は同じである必要はなく、異なる治療剤にすることができる。例えば、薬物と放射性同位体とを同じ融合タンパク質に結合させることができる。特に、ＩｇＧを１３１Ｉで放射標識し、かつ薬物に結合させることができる。１３１ＩはＩｇＧのチロシンに取り込まれ、薬物はＩｇＧリシンのε−アミノ基に結合する。治療剤及び診断剤の両方はまた、還元されたＳＨ基及び炭水化物側鎖にも結合させることができる。
同様に好ましくは、本発明の抗体融合タンパク質は少なくとも２つの抗ＣＳＡｐモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含む。これらは、ＣＳＡｐ抗原の異なるエピトープに対し得るか、又は異なるヒト免疫グロブリン骨格配列（若しくはＩｇＧ）の異なるエピトープに対し得る。
治療剤又は診断剤を、還元された抗体成分のヒンジ領域において、ジスルフィド結合の形成によって結合させることができる。代わりとして、そのようなペプチドを、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）などのヘテロ二官能性の架橋剤を使用して抗体成分に結合させることができる。Ｙｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５６：２４４（１９９４）。そのようなコンジュゲート化に対する一般的な技術が当分野では広く知られている。例えば、Ｗｏｎｇ、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、「化学的方法による抗体の修飾」、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｂｉｒｃｈら（編）、１８７頁〜２３０頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９５）；Ｐｒｉｃｅ、「合成ペプチドに由来する抗体の製造及び特徴づけ」、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ、Ｒｉｔｔｅｒら（編）、６０頁〜８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）を参照のこと。あるいは、治療剤又は診断剤は、抗体のＦｃ領域における炭水化物部分を介してコンジュゲート化することができる。炭水化物基は、チオール基に結合する同じペプチドの負荷量を増大させるために使用することができ、又は異なるペプチドと結合させるために使用することができる。
抗体の炭水化物部分を介してペプチドを抗体成分にコンジュゲート化するための様々な方法が当業者には広く知られている。例えば、Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４１：８３２（１９８８）；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４６：１１０１（１９９０）；及びＳｈｉｈら、米国特許第５，０５７，３１３号を参照のこと（これらはすべて参照することによりその開示内容全体が組み込まれる）。一般的な方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも１つのフリーアミン官能基を有し、かつ複数のペプチドが負荷されるキャリアポリマーと反応させることを伴う。この反応により、最初にシッフ塩基（イミン）結合が生じ、これは、最終的なコンジュゲート体を形成させるための二級アミンへの還元によって安定化させることができる。
Ｆｃ領域は、免疫コンジュゲート体の抗体成分として使用される抗体が抗体フラグメントである場合には存在しない。しかしながら、炭水化物部分を全長抗体又は抗体フラグメントの軽鎖可変領域に導入することは可能である。例えば、Ｌｅｕｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４：５９１９（１９９５）；Ｈａｎｓｅｎら、米国特許第５，４４３，９５３号（１９９５）；Ｌｅｕｎｇら、米国特許第６，２５４，８６８号を参照のこと（これらの文献はすべてその開示内容全体が参照することにより組み込まれる）。操作された炭水化物部分は、治療剤又は診断剤を結合させるために使用される。
Ｖ．抗体に対してターゲッティング可能な構築物
ターゲッティング可能な構築物は多様な構造が可能であるが、ターゲッティング可能な構築物は、十分な免疫応答を誘発するための免疫を誘発させることを避けるためだけではなく、ｂｓＡｂターゲッティング方法の中で使用されたときには迅速なインビボでのクリアランスのためにも選択される。疎水性の薬剤は、強い免疫応答を誘発することにおいて最も適しており、これに対して、親水性の薬剤は迅速なインビボでのクリアランスのために好ましく、従って、疎水性と親水性とのバランスを確立する必要である。これは、部分的には、多くの有機成分の固有の疎水性を補うための親水性キレート化剤の使用によることによって達成される。また、反対の溶解特性を有するターゲッティング可能な構築物のサブユニット、例えば、様々なアミノ酸を含み、そのうちのいくつかが疎水性のアミノ酸であり、いくつかが親水性のアミノ酸であるペプチドを選択することもできる。ペプチドの他に、炭水化物を使用することができる。
キレート化剤などの他の成分にもカップリングされるならば、２個も少数のアミノ酸残基を有するペプチドを使用することができ、好ましくは、２残基〜１０残基のペプチドを使用することができる。リンカーは、低分子量のコンジュゲート体であり、キレート内の金属イオンを含む分子量が、好ましくは５０，０００ダルトン未満であり、好都合には約２０，０００ダルトン未満又は約１０，０００ダルトン未満又は約５，０００ダルトン未満である低分子量のコンジュゲート体が望ましい。例えば、知られているペプチドＤＴＰＡ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＯＨ（式中、ＤＴＰＡはジエチレントリアミン五酢酸である）は、この分子のインジウム−ＤＴＰＡ部分に対する抗体を製造するために使用されている。しかし、インジウム以外を含有する分子及び適切なスクリーニング工程の使用によって、チロシルリシンジペプチドに対する新しいＡｂを作製することができる。より通常的には、抗原性ペプチドは４個以上の残基を有する。例えば、ペプチドＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２、この場合、ＤＯＴＡは１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸であり、ＨＳＧは、下記の式：
Figure 0004963512
のヒスタミンスクシニルグリシル基である。
非金属含有ペプチドを免疫原として使用することができ、得られるＡｂをＰｈｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ骨格に対する反応性についてスクリーニングすることができる。
本発明ではまた、最終的なｂｓＡｂ／リンカーシステムとともに使用されたとき、リンカー成分を認識するｂｓＡｂのアームが完全に特異的であることを確実にするために、骨格構造中に非天然アミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸）を組み込むことが考えられる。本発明ではさらに、他の骨格構造、例えば、非天然アミノ酸及びペプトイドから構築される骨格構造などが考えられる。
免疫原として使用されるペプチドは、固相担体技術並びに反復した直交型脱保護及びカップリングの標準的な技術を使用する自動化されたペプチド合成機で都合よく合成される。ペプチド中のフリーアミノ基は、キレートへのコンジュゲート化のために後で使用されることになるが、アセチル基などの標準的な保護基で都合よくブロッキングされる。そのような保護基は当業者に知られている。Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９９９（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．）を参照のこと。ペプチドが、ｂｓＡｂシステム内において後で使用されるために調製されるとき、カルボキシペプチダーゼ活性をインビボで阻害するために、ペプチドは好都合には樹脂から切断されて、対応するＣ末端アミドが得られる。
免疫原の様々なハプテンには、免疫原性の認識成分、例えば、化学的ハプテンが含まれる。化学的ハプテン（好ましくは、ＨＳＧハプテン）を使用することにより、抗体に対するリンカーの高い特異性が示される。これは、ＨＳＧハプテンに対して惹起される様々な抗体が知られており、そしてそれらを適切な二重特異性抗体の中に容易に組み込むことができるからである。従って、結合しているハプテンによりリンカーを結合することは、抗体又は抗体フラグメントに対して非常に特異的になると考えられる。
キレート成分
リンカー成分における親水性キレート成分の存在は、迅速なインビボでのクリアランスを確実にすることに役立つ。親水性に加えて、様々なキレーターがその金属結合特性のために選ばれ、そしてそれらは思い通りに変えられる。これは、ｂｓＡｂエピトープがペプチドの一部であるリンカー、又はｂｓＡｂエピトープがキレートでない化学的ハプテンであるリンカーについては少なくとも、金属キレート錯体の認識はもはや問題でないからである。
特に有用な金属キレートの組み合わせには、放射線画像化及びＲＡＩＴのために、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、１６１Ｔｂ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ及び２２５Ａｃとともに使用される場合の２−ベンジル−ＤＴＰＡ並びにそのモノメチルアナログ及びシクロヘキシルアナログが含まれる。Ｍｎ、Ｆｅ及びＧｄなどの非放射性の金属と錯体を形成するとき、これらの同じキレーターは、本発明のｂｓＡｂとともに使用されるときにはＭＲＩのために使用することができる。ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸）、ＤＯＴＡ及びＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミドベンジルテトラエチルアミン四酢酸）などの大環状キレーターは、様々な金属及び放射性金属に関して、より具体的には、それぞれ、Ｇａ、Ｙ及びＣｕの放射性核種に関して有用である。
配位子が、ハード塩基とキレート化する官能基、例えば、カルボキシラート基又はアミン基などを含むＤＴＰＡ型キレーター及びＤＯＴＡ型キレーターは、ハード酸カチオンと、特に、ＩＩａ族及びＩＩＩａ族の金属カチオンとキレート化するために最も効果的である。そのような金属−キレート錯体は、目的とする金属に合うように環サイズを調節することにより非常に安定化させることができる。大環状ポリエーテルなどの他の環型キレーターが、ＲＡＩＴのための２２３Ｒａなどの安定に結合する核種に対して注目されている。ポルフィリンキレーターは非常に多くの放射性金属とともに使用することができ、また、ｂｓＡｂにより導かれる免疫光線療法のためのいくつかの非放射性の金属複合体としても有用である。２種類以上のキレーターを、多数の金属イオン（例えば、非放射性のイオン）、診断用放射性核種及び／又は治療用放射性核種と結合させるためにキャリアにコンジュゲート化することができる。特に有用な治療用放射性核種には、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａ及び２２５Ａｃが含まれるが、これらに限定されない。特に有用な診断用放射性核種には、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４〜１５８Ｇｄ及び１７５Ｌｕが含まれるが、これらに限定されない。
米国特許第５，７５３，２０６号に開示されるキレーターなどの様々なキレーター、特に、チオセミカルバゾニルグリオキシルシステイン（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）キレーター及びチオセミカルバジニルアセチルシステイン（Ｔｓｃａ−Ｃｙｓ）キレーターは、ソフト塩基配位子（特にイオウ又はリンを含有する配位子）に対して強固に結合する、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｂｉ及び他の遷移金属（ランタニド及びアクチニド）のソフト酸カチオンと結合させるために都合よく使用される。ペプチドに対して２種類以上のキレーターを連結すること、例えば、Ｉｎ（ＩＩＩ）カチオンについては、例えば、ＤＴＰＡ又は類似するキレーターを連結し、Ｔｃカチオンについては、チオール含有キレーター、例えば、Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）を連結することは有用であり得る。ジＤＴＰＡハプテンに対する様々な抗体が知られており（Ｂａｒｂｅｔ、上掲の’３９５号特許）、それらは、ｂｓＡｂを得るためにターゲッティング抗体に容易にカップリングされるので、ペプチドハプテンを、放射性同位体をターゲッティングするためのプレターゲッティングプロトコルにおいて、放射性同位体と結合させるための非放射性のジＤＴＰＡキレーター及び別のキレーターとともに使用することが可能である。そのようなペプチドの一例として、Ａｃ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−）−ＮＨ２がある。このペプチドは、Ｉｎ（ＩＩＩ）を事前に負荷させ、その後、９９−ｍ−Ｔｃカチオンで標識化することができる。この場合、Ｉｎ（ＩＩＩ）イオンがＤＴＰＡによって優先的にキレート化され、そしてＴｃカチオンがチオール含有Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓに優先的に結合する。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡなどの他のハード酸キレーターはＤＴＰＡ基の代わりに使用することができ、従って、それらに対して特異的なＭａｂを、抗ジＤＴＰＡ Ｍａｂを作製するために使用される技術に類似する技術を使用して製造することができる。
カチオンの種々のサイズ、キレート環の幾何構造及びカチオンの好ましい錯体イオン構造により、２つの異なるハード酸カチオン又はソフト酸カチオンに優先的に結合させるために、２つの異なるハード酸キレーター又はソフト酸キレーターが、例えば、種々のキレート環サイズを有するリンカーに組み込まれ得ることが理解される。これにより、２つの異なる金属（そのうちの１つ又は両方が放射性であり得るか、あるいはＭＲＩ増強のために有用であり得る）を、事前にターゲッティングされたｂｓＡｂによって最後には捕捉されるリンカーに組み込むことが可能になる。
好ましいキレーターには、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ及びＴｓｃｇ並びにそれらの組み合わせが含まれる。これらのキレーターは、下記の構築物において例示されるようなキレーター−ペプチドコンジュゲート体モチーフの中に組み込まれている。
（ａ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｂ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｃ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0004963512
及び
Figure 0004963512
上記のキレーター−ペプチドコンジュゲート体（ｄ）及び（ｅ）は、６８Ｇａと結合することが示されており、従って、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）の適用において有用である。
キレーターは、より詳しく下記の実施例で議論される標準的な化学反応を使用して、リンカー成分にカップリングされる。簡単に記載すると、ペプチドＡｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−）−ＮＨ２の合成は、ペプチド合成機において、Ｒｉｎｋアミド樹脂にＡｌｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを最初に結合させることによって達成された。本明細書中で使用される保護基の略語「Ａｌｏｃ」及び「Ｆｍｏｃ」はアリルオキシカルボニル基及びフルオレニルメチルオキシカルボニル基を示す。その後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ及びＴｓｃＧが、標準的なＦｍｏｃ自動化合成プロトコルを使用してリシンの側鎖に付加されて、下記のペプチドが得られた。Ａｌｏｃ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）ｒｉｎｋ樹脂。その後、Ａｌｏｃ基が除去された。その後、ペプチド合成を合成機で続けて、下記のペプチドを作製した。（Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−）ｒｉｎｋ樹脂。続いて、Ｎ末端のアシル化及び側鎖Ａｌｏｃ保護基の除去が行われた。その後、カイザー試験を使用して樹脂をアミンについて試験して、陰性の試験結果が得られるまで、得られたペプチドを活性化Ｎ−トリチル−ＨＳＧ−ＯＨで処理した。Ｋａｒａｃａｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１１：８４２〜８５４（２０００）を参照のこと。Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−）−ＮＨ２の合成並びにＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２及びＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２の合成は、下記に、より詳細に記載される。
金属キレートの調製
キレーター−ペプチドコンジュゲート体は固体として長期間貯蔵することができる。それらは、金属結合反応のための単位量に計量することができ、そして固体、水溶液又は半水性溶液、あるいは凍結溶液又は凍結乾燥調製物として、そのいずれかで単位量として貯蔵することができる。それらは、広く知られている手順によって標識することができる。典型的には、ハード酸カチオンが好都合な塩の溶液として導入され、ハード酸キレーター及び場合によってはソフト酸キレーターによって取り込まれる。しかし、ソフト酸カチオンを後で添加することにより、ソフト酸キレーターによるその結合がもたらされ、これにより、その中でキレート化され得る任意のハード酸カチオンが置換される。例えば、過剰量の非放射性１１１ＩｎＣｌ３が存在するときでさえ、９９ｍ−Ｔｃ（Ｖ）グルコヘプトン酸塩を用いた標識化、又は塩化第一スズ及びＮａ９９ｍ−ＴｃＯ４によるインサイチューで作製されるＴｃカチオンを用いた標識化が、ソフト酸キレーターに対して定量的に進行する。１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１３Ｂｉなどの他のソフト酸のカチオン、並びにＭｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｂ、Ｃｕ、Ｃｄ、Ａｕ、Ｆｅ、Ａｇ（一価）、Ｚｎ及びＨｇの二価又は三価のカチオン、特に６４Ｃｕ及び６７Ｃｕなどは、そのうちのいくつかが放射性免疫診断又は放射性免疫療法のために有用であるので、類似する方法によってリンカーペプチドに負荷することができる。Ｒｅカチオンはまた、過レニウム酸塩及び第一スズイオンからインサイチューで生成させることができ、あるいは事前に還元されたグルコヘプトン酸レニウム又は他のトランスキレーターを使用することができる。過レニウム酸塩の還元には、Ｔｃを還元するために必要とされるよりも多くの第一スズイオン（典型的には、２００μｇ／ｍＬを越える最終濃度）が必要であるので、より高いレベルの第一スズイオンにより、壊れやすいジスルフィド結合、例えば、ジスルフィド環化ペプチドに存在するジスルフィド結合などが還元されないことを保証するために十分な注意を払う必要がある。レニウムを用いた放射標識化のとき、Ｔｃ−９９ｍで使用されるのと同様の手順が使用される。Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−配位子のＲｅＯ金属錯体を調製するための好ましい方法は、ペプチドをＲｅＯＣｌ３（Ｐ（Ｐｈ３）２と反応させることによるものである。しかし、ＲｅＯ（エチレンジアミン）２などの他の還元された化学種を使用することもまた可能である。
ＶＩ．投与方法
本明細書中下記に示される議論の多くは、疾患組織を処置することに関連して、本発明の二重特異性抗体及びターゲッティング可能な構築物の使用に集中していることに留意しなければならない。しかし、本発明では、米国特許第６，１２６，９１６号、同第６，０７７，４９９号、同第６，０１０，６８０号、同第５，７７６，０９５号、同第５，７７６，０９４号、同第５，７７６，０９３号、同第５，７７２，９８１号、同第５，７５３，２０６号、同第５，７４６，９９６号、同第５，６９７，９０２号、同第５，３２８，６７９号、同第５，１２８，１１９号、同第５，１０１，８２７号及び同第４，７３５，２１０号に記載される方法を使用して正常な組織及び器官を処置及び／又は画像化することにおいて本発明の二重特異性抗体及びターゲッティング可能な構築物を使用することが考えられる。本明細書中で使用される用語「組織」は、卵巣、胸腺、副甲状腺又は脾臓に由来する組織（これらに限定されない）を含む様々な組織を示す。
ｂｓＡｂ、及び上記で議論されたリンカー成分と結合する治療剤の投与は、リンカー成分と結合する治療剤の投与に先立って、そのかなり前にｂｓＡｂを投与することによって行なうことができる。試薬の量及び時期は、当業者によって容易に設定することができ、用いられる試薬の特有の性質に依存する。ｂｓＡｂ−Ｆ（ａｂ’）２誘導体が最初に投与される場合、リンカー成分を投与する前に２４時間〜７２時間の待機時間が適切であると考えられる。ＩｇＧ−Ｆａｂ’ｂｓＡｂコンジュゲート体が最初のターゲッティングベクターである場合、リンカー成分を投与する前に、より長い待機期間が、３日〜１０日の範囲内で指示される。
本明細書中で使用される用語「治療剤」には、薬物、プロドラッグ及び／又は毒素が含まれるが、これらに限定されない。用語「薬物」、用語「プロドラッグ」及び用語「毒素」は、本明細書中を通して定義されている。診断剤は、より多くの場合には、存在する疾患の種類を決定するために使用され、一方、検出剤は、より多くの場合には、位置決定及び診断のために使用される。しかし、本明細書中に記載されるように、診断剤の用語はまた、検出剤を示すためにも使用することができる。
ｂｓＡｂを疾患組織にターゲッティングするために十分な時間が経過した後、診断／検出剤が投与される。診断／検出剤の投与に続き、画像化を行うことができる。適切な波長の光を構造部に送達し、その後、光を集めて、様々な構造部を直接的又は間接的に調べることによって、腫瘍を体腔内において検出することができる。非イオン化放射線が送達され、これらの構造部から再捕獲され得る限り、任意の身体部位における病変部を調べることができる。例えば、高分解能かつ非侵襲性の画像化技術であるＰＥＴを、ヒト疾患を視覚化するために、本発明の抗体とともに使用することができる。ＰＥＴでは、陽電子消滅崩壊のときに生じる５１１ｋｅＶのγ線光子が検出される。
本発明では、一般に、２５ｋｅＶ〜６００ｋｅＶのγ線粒子及び／又は陽電子を放出する診断剤の使用が考えられる。そのような薬剤の例には、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４〜１５８Ｇｄ及び１７５Ｌｕが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の抗体又は抗体フラグメントは、米国特許第６，０９６，２８９号、同第４，３３１，６４７号、同第４，８１８，７０９号、同第４，３４８，３７６号、同第４，３６１，５４４号、同第４，４４４，７４４号及び同第５，８５１，５２７号で議論されるように、光力学的療法（ＰＤＴ）の方法において使用することができる。
ＰＤＴでは、光増感剤（例えば、ジヘマトポルフィリンエーテルなどのヘマトポルフィリン誘導体）が被験体に投与される。抗腫瘍活性は、光（例えば、６３０ｎｍ）の使用により開始される。様々な代わりの光増感剤を利用することができ、これには、皮膚が日光によって光感作されることが少ない、より長い波長で有用なものが含まれる。そのような光増感剤の例には、ベンゾポルフィリンモノ酸リングＡ（ＢＰＤ−ＭＡ）、スズエチオプルプリン（ＳｎＥＴ２）、スルホン化アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳＰｃ）及びルテチウムテキサフィリン（Ｌｕｔｅｘ）が含まれるが、これらに限定されない。
さらに、ＰＤＴでは、診断剤が、例えば全身注射によって注射され、そしてレーザーにより誘導される蛍光を内視鏡によって使用して、光活性化された薬剤が蓄積しているがん部位を検出することができる。例えば、これは、初期肺腫瘍の蛍光気管支鏡検査による明示化に適用されている。Ｄｏｉｒｏｎら、Ｃｈｅｓｔ、７６：３２（１９７９）。別の例において、抗体及び抗体フラグメントを単光子放射において使用することができる。例えば、Ｔｃ−９９ｍで標識された診断剤を、本発明の抗体又は抗体フラグメントの投与後に被験体に投与することができる。その後、被験体は、単光子放射コンピューター断層撮影画像をもたらし、病変部位又は腫瘍部位を明確に示すがんマ線カメラを用いて走査される。
治療上有用な免疫コンジュゲート体は、光活性な薬剤又は色素を抗体複合物にコンジュゲート化することによって得ることができる。蛍光性及び他の色素原、又は色素（例えば、可視光に対する感受性を有するポルフィリン類）が、好適な光を病変部に誘導することによって、病変部を検出し、かつ病変部を処置するために使用されている。治療において、これは光放射線又は光線療法又は光力学的治療と呼ばれている（Ｊｏｒｉら（編）、Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｌｉｂｒｅｒｉａ Ｐｒｏｇｅｔｔｏ、１９８５）；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈ、Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ、２２：４３０（１９８６））。さらに、モノクローナル抗体が、光線療法を達成するために光活性化色素とカップリングされている。Ｍｅｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３０：１４７３（１９８３）；同上、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４５：４３８０（１９８５）；Ｏｓｅｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：８７４４（１９８６）；同上、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、４６：８３（１９８７）；Ｈａｓａｎら、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．、２８８：４７１（１９８９）；Ｔａｔｓｕｔａら、Ｌａｓｅｒｓ Ｓｕｒｇ．Ｍｅｄ．９：４２２（１９８９）；Ｐｅｌｅｇｒｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ ６７：２５２９（１９９１）。しかし、これらのより初期の研究では、内視鏡治療適用の使用、特に、抗体フラグメント又はサブフラグメントの使用を伴なう内視鏡治療適用の使用は含まれていなかった。従って、本発明では、光活性な薬剤又は色素を含む免疫コンジュゲート体の治療的使用が考えられる。
リンカー成分はまた、標的部位においてプロドラッグを活性化することができる酵素に対して、又は身体の解毒化経路を制御することによって通常の治療剤の効力を改善することができる酵素に対してコンジュゲート化することができる。ｂｓＡｂの投与後、リンカー成分にコンジュゲート化されている酵素、すなわち、ｂｓＡｂの第２のアームによって認識される低分子量ハプテンが投与される。酵素が標的部位に予備的にターゲッティングされた後、標的部位において作用することが知られている細胞傷害性薬物が注射される。この薬物は、哺乳類の通常の解毒化プロセスにより解毒される薬物であり得る。例えば、薬物は、肝臓において、潜在的に毒性がより少ないグルクロニドに変換され得る。その後、解毒された中間体は、標的部位において予備的にターゲッティングされた酵素によってそのより毒性の形態に再び変換され得る。あるいは、投与されたプロドラッグは、予備的にターゲッティングされた酵素によって活性な薬物に変換され得る。予備的にターゲッティングされた酵素により、処置の効力が、解毒された薬物を再利用することによって改善される。この方法は、任意の酵素−薬物対を用いた使用のために取り入れることができる。
抗がん治療のために有用ないくつかの細胞傷害性薬物は血清中で比較的不溶性である。いくつかのそのような薬物は非コンジュゲート化形態で極めて毒性であり、それらの毒性はプロドラッグへの変換によってかなり軽減される。溶解性が悪い薬物をより可溶性のコンジュゲート体（例えば、グルクロニド、親水性酸のエステル又は親水性アミンのアミド）に変換することにより、血清の水相におけるその溶解性、並びに静脈、動脈又は毛細管の細胞壁を通過するその能力、及び腫瘍が浸る間質液に到達するその能力が改善される。プロドラッグの切断により、溶解性がより低い薬物が標的部位に蓄積する。プロドラッグから薬物へのそのような変換の多数の例が、Ｈａｎｓｅｎの米国特許第５，８５１，５２７号に開示されている。
芳香族又は脂環式のアルコール、チオール、フェノール及びアミンなどのある種の毒性物質が肝臓においてグルクロニドに変換されることは、それらを解毒化して、より容易に尿中に排出させるという身体の方法である。そのような基質に変換され得る抗腫瘍薬物の１つのタイプが、エピルビシン、すなわち、ドキソルビシン（アドリアマイシン）の４−エピマーであり、これはアントラサイクリングリコシドであり、ヒトβ−Ｄ−グルクロニダーゼに対する基質であることが示されている（例えば、Ａｒｃａｍｏｎｅ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４５：５９９５（１９８５）を参照のこと）。極性がより少ない基を含む他のアナログは、親油性がより大きいことが予想され、そのような方法に対して有望性が大きくなっている。芳香族又は脂環式のアルコール基又はチオール基又はアミン基を含む他の薬物又は毒素は、そのようなコンジュゲート体を形成させるための候補である。これらの薬物又はそれらの他のプロドラッグ形態は、本発明の部位特異的な増強法に対する好適な候補である。
プロドラッグＣＰＴ−１１（イリノテカン）は、インビボでカルボキシルエステラーゼによって、活性な代謝産物ＳＮ−３８に変換される。従って、本発明の１つの応用は、腫瘍及びハプテン（例えば、ジＤＴＰＡ）に対してターゲッティングされたｂｓＡｂを使用し、その後、ジＤＴＰＡ−カルボキシルエステラーゼコンジュゲート体を注射することである。好適な腫瘍対バックグラウンド局在化比が一旦達成されると、ＣＰＴ−１１が投与され、そして腫瘍に局在化したカルボキシルエステラーゼは、腫瘍においてＣＰＴ−１１をＳＮ−３８に変換するために役立つ。その溶解性が悪いために、活性なＳＮ−３８は腫瘍の近くに留まり、その結果として、ターゲッティングされている抗原について陰性である近接した腫瘍細胞に対して一定の作用をもたらす。このことは、本方法のさらなる利点である。修飾形態の様々なカルボキシルエステラーゼが記載されており、それらは本発明の範囲内である。例えば、Ｐｏｔｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２６４６〜２６５１（１９９８）；及びＰｏｔｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：３６２７〜３６３２（１９９８）を参照のこと。
エトポシドは、そのグルクロニドが形成されることによって大部分が解毒される広く使用されているがん薬物であり、本発明の範囲内である。例えば、Ｈａｎｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４８：１８２９〜１８３４（１９８８）を参照のこと。様々なグルクロニドコンジュゲート体を細胞傷害性薬物から調製することができ、これらは、ｍＡｂ−グルクロニダーゼコンジュゲート体によって予備的にターゲッティングされる腫瘍に対する治療剤として注射することができる。例えば、Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２：４４８４〜４４９１（１９９２）を参照のこと。従って、そのようなコンジュゲート体はまた、本明細書中に記載されるプレターゲッティング方法とともに使用することができる。同様に、ダウノマイシン及びドキソルビシンの誘導体に基づく設計されたプロドラッグが、カルボキシルエステラーゼ及びグルクロニダーゼとの使用について記載されている。例えば、Ｂａｋｉｎａら、Ｊ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．、４０：４０１３〜４０１８（１９９７）を参照のこと。本発明において使用することができるプロドラッグ／酵素対の他の例には、フェノールマスタード類のヒドロキシ誘導体のグルクロニドプロドラッグ及びβ−グルクロニダーゼ；フェノールマスタード類又はＣＰＴ−１１及びカルボキシペプチダーゼ；メトトレキサートで置換されたαアミノ酸及びカルボキシペプチダーゼＡ；６−メルカプトプリンそしてドキソルビシンなどの薬物のペニシリンコンジュゲート体又はセファロスポリンコンジュゲート体及びβ−ラクタマーゼ；リン酸エトポシド及びアルカリホスタファーゼが含まれるが、これらに限定されない。
標的部位においてプロドラッグを活性化することができる酵素、又は身体の解毒化経路を制御することによって通常の治療剤の効力を高めることができる酵素を、代わりに、ハプテンにコンジュゲート化することができる。酵素−ハプテンコンジュゲート体は、予備的にターゲッティングするｂｓＡｂを投与した後で被験体に投与され、酵素−ハプテンコンジュゲート体を標的部位に向かわせる。酵素が標的部位において局在化した後、標的部位において作用することが知られている細胞傷害性薬物、又は予備的にターゲッティングされた酵素によってインサイチューで薬物に変換されるそのプロドラッグ形態が注射される。上記で議論されたように、薬物は、哺乳類の通常の解毒化プロセスを使用して解毒されて、毒性がより低い中間体（最も一般的には、グルクロニド）を形成する薬物である。解毒された中間体（例えば、グルクロニド）は、予備的にターゲッティングされた酵素によってそのより毒性のある形態に再変換され、従って、増強された細胞毒性を標的部位において有する。これにより、薬物の再利用がもたらされる。同様に、投与されたプロドラッグを、正常な生物学的プロセスを介して活性な薬物に変換することができる。予備的にターゲッティングされた酵素により、処置の効力が、解毒された薬物を再利用することによって改善される。この方法は、任意の酵素−薬物対を用いた使用のために取り入れることができる。
本発明ではさらに、ホウ素中性子捕獲治療（ＢＮＣＴ）プロトコルに関連して、本発明のｂｓＡｂ及び診断剤の使用が考えられる。ＢＮＣＴは、腫瘍に局在化した１０Ｂ原子に中性子照射することによって腫瘍細胞にイオン化放射線を送達するために設計された２元システムである。ＢＮＣＴは、安定な同位体に、すなわち、同位体濃縮された１０Ｂ（１９．８％の天然存在量で存在）に熱中性子が照射されて、α粒子及び７Ｌｉ原子核が生じるときに起こる核反応に基づいている。これらの粒子は、ほぼ細胞１個分の直径の行路長を有しており、これにより、比例した大きいエネルギー転移がもたらされる。この核反応で生じるほんの一握りの短い１．７ＭｅＶのα粒子のみが、細胞の核をターゲッティングし、かつ細胞の核を破壊するために十分である。がんのＢＮＣＴによる成功には、高濃度の１０Ｂを腫瘍部位において局在化させ、同時に、非標的器官を本質的にはホウ素非含有状態にするための方法が必要である。ＢＮＣＴのためにプレターゲッティングｂｓＡｂを使用して被験体における腫瘍を処置するための組成物及び方法が、同時係属中の米国特許出願第０９／２０５，２４３号に記載されており、本発明の目的のために容易に改変することができる。
標的部位における抗原に対して特異的な少なくとも１つの結合部位と、抗体−酵素コンジュゲート体の酵素成分に対して特異的な少なくとも１つの他の結合部位とを有する二重特異性の抗体又は抗体フラグメントが、本発明の方法において使用され得ることにもまた留意しなければならない。そのような抗体は注射前に酵素と結合させることができ、それにより、酵素を抗体に共有結合的にコンジュゲート化しなければならないことを回避することができる。あるいは、そのような抗体は注射され、標的部位に局在化させることができ、そして、ターゲッティングされなかった抗体が哺乳類の循環系から実質的にクリアリングされた後、局在化した抗体又は抗体フラグメントのところに十分な量の酵素が到達し、それに結合して、抗体−酵素コンジュゲート体をインサイチューで形成させることを可能にする量及びそのような経路によって酵素を注射することができる。
本発明ではまた、米国特許出願第０９／９１１，６１０号に記載されるように少なくとも３つの異なる標的結合部位を有する多価の標的結合タンパク質の使用が考えられることにもまた留意しなければならない。様々な多価の抗体が、化学的リンカーを介して数個のＦａｂ様フラグメントを架橋することによって作製されている。米国特許第５，２６２，５２４号、同第５，０９１，５４２号；Ｌａｎｄｓｄｏｒｐら、Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６：６７９〜８３（１９８６）を参照のこと。多価の抗体はまた、数個の単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）を共有結合的に連結して、単一のポリペプチドを形成することによって作製されている。米国特許第５，８９２，０２０号を参照のこと。基本的にはｓｃＦｖ分子の集合体である多価の抗体が、米国特許第６，０２５，１６５号及び同第５，８３７，２４２号に開示されている。３つのｓｃＦｖ分子を含む三価の標的結合性タンパク質が、Ｋｒｏｔｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０（４）：４２３〜４３３（１９９７）に記載されている。
ｂｓＡｂの服用とリンカー成分の服用との間で投与されるクリアリング剤を使用することができる。本発明者らは、新しい機構による作用を有するクリアリング剤、すなわち、ｂｓＡｂの疾患ターゲッティングアームに対してターゲッティングされたグリコシル化抗イディオタイプＦａｂ’フラグメントが本発明とともに使用され得ることを発見している。抗ＣＥＡ（ＭＮ１４Ａｂ）ｘ抗ペプチドｂｓＡｂが投与され、疾患標的においてその最大限まで蓄積させられる。残留するｂｓＡｂをクリアリングするために、ＭＮ−１４に対する抗イディオタイプＡｂ（ＷＩ２と呼ばれる）が、好ましくはグリコシル化Ｆａｂ’フラグメントとして投与される。クリアリング剤は一価の様式でｂｓＡｂに結合し、同時に、結合しているグリコシル残基により、完全な複合体を肝臓に向かわせ、肝臓において迅速な代謝が行われる。その後、リンカー成分と結合する治療剤が被験体に投与される。ｂｓＡｂのＭＮ−１４アームに対するＷＩ２Ａｂは高い親和性を有しており、そのクリアランス機構は他の開示された機構とは異なる（Ｇｏｏｄｗｉｎら（同上）を参照のこと）。これは、ＷＩ２−Ｆａｂ’が一価の成分であるため、架橋を含まないからである。あるいは、抗ＣＳＡｐ（Ｍｕ−９抗体）ｘ抗ペプチドｂｓＡｂが投与され、疾患標的においてその最大限まで蓄積させられる。
ＶＩＩ．薬学的に好適な賦形剤
被験体に送達されるヒト化抗ＣＳＡｐ抗体又はキメラ抗ＣＳＡｐ抗体又はヒト抗ＣＳＡｐ抗体及びそれらのフラグメントは、抗体単独、免疫コンジュゲート体、融合タンパク質から構成され得るか、あるいは１つ以上の薬学的に好適な賦形剤、１つ以上のさらなる成分、又はこれらのいくつかの組み合わせを含むことができる。好ましくは、抗ＣＳＡｐ抗体はＭｕ−９抗体である。
本発明のＭｕ−９免疫結合物、むき出し状態の抗体、融合タンパク質及びそれらのフラグメントは、薬学的に有用な組成物を調製するための知られている様々な方法に従って配合することができ、それにより、免疫コンジュゲート体又はむき出し状態の抗体が薬学的に好適な賦形剤との混合物において一緒にされる。滅菌されたリン酸塩緩衝化生理的食塩水は、薬学的に好適な賦形剤の一例である。他の好適な賦形剤が当業者に広く知られている。例えば、Ａｎｓｅｌら、ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ（第５版）（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ、１９９０）；及びＧｅｎｎａｒｏ（編）、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（第１８版）（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０）；及びそれらの改訂版を参照のこと。
本発明の免疫コンジュゲート体、むき出し状態の抗体、融合タンパク質及びそれらのフラグメントは、例えば、ボーラス注射又は連続注入による静脈内投与のために配合することができる。注入用の配合物は、保存剤が添加されている単位投薬形態で（例えば、アンプル又は多回用量容器において）提供することができる。組成物は、油性ビヒクル又は水性ビヒクルにおける懸濁物又は溶液又はエマルションのような形態を取ることができ、そして懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの配合剤を含有することができる。あるいは、有効成分は、好適なビヒクル、例えば、滅菌されたパイロジェン非含有水を用いて使用前に構成される粉末形態にすることができる。
さらなる薬学的方法を、治療用又は診断用のコンジュゲート体又はむき出し状態の抗体の作用の持続期間を制御するために用いることができる。制御放出調製物を、免疫コンジュゲート体又はむき出し状態の抗体を複合体化又は吸着するためのポリマーの使用によっって調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーには、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニル酢酸）のマトリクス、及びステアリン酸二量体とセバシン酸とのポリ無水物コポリマーのマトリクスが含まれる。Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１４４６（１９９２）。そのようなマトリクスからの免疫コンジュゲート体又は抗体の放出速度は、免疫コンジュゲート体又は抗体の分子量、マトリクス内の免疫コンジュゲート体又は抗体の量、そして分散粒子のサイズに依存する。Ｓａｌｔｚｍａｎら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、同上。他の固体投薬形態が、Ａｎｓｅｌら、ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ（第５版）（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ、１９９０）；及びＧｅｎｎａｒｏ（編）、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（第１８版）（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０）；及びそれらの改訂版に記載されている。
免疫コンジュゲート体、抗体融合タンパク質又はネイクド抗体はまた、哺乳類の皮下に投与することができ、又は他の非経口経路によってさえも投与することができる。さらに、投与は、連続的な注入によって、あるいは単回又は多数回のボーラスによって行うことができる。一般に、ヒトに対する投与された免疫コンジュゲート体又は融合タンパク質又はむき出し状態の抗体の投薬量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の医学的状態及び過去の病歴のような要因に依存して変化する。典型的には、単回の静脈内注入として約１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の免疫コンジュゲート体又は抗体融合タンパク質又はむき出し状態の抗体の投薬量が被投与体に与えられることが望ましいが、より低い投薬量又はより高い投薬量もまた、状況に応じて投与することができる。この投薬は、必要とされる場合には、例えば、１週間に１回で４週間〜１０週間にわたって、好ましくは１週間に１回で８週間にわたって、より好ましくは１週間に１回で４週間にわたって繰り返すことができる。投薬はまた、より少ない頻度で、例えば、１週間毎に数ヶ月間にわたって行うことができる。投薬は、様々な非経口経路により、用量及びスケジュールを適切に調節して行うことができる。
治療目的のために、免疫コンジュゲート体又は融合タンパク質又はむき出し状態の抗体及びそれらのフラグメントは治療有効量で被験体に投与される。本発明に対する好適な被験体は哺乳類であり、好ましくはヒトであるが、イヌ、ネコ又はウマなどの非ヒト哺乳類もまた考えられる。抗体調製物は、投与される量が生理学的に意味を有する場合、「治療有効量」で投与されると言われる。薬剤は、薬剤が存在することにより、投与を受けた哺乳類の生理機能において検出可能な変化がもたらされる場合、生理学的に意味を有する。
診断目的のために、免疫コンジュゲート体又は融合タンパク質又はむき出し状態の抗体及びそれらのフラグメントは診断有効量で被験体に投与される。抗体調製物は、投与される量が、通常の場合には宿主に対する薬理学的作用を何ら伴うことなく、被験体における健康状態、悪性腫瘍、疾患又は障害を診断又は検出するために一般には十分である場合、「診断有効量」で投与されると言われる。
ＶＩＩＩ．発現ベクター
本発明にはまた、キメラ抗ＣＳＡｐ抗体又はヒト化抗ＣＳＡｐ抗体又はヒト抗ＣＳＡｐ抗体及び融合タンパク質及びそれらのフラグメントをコードする核酸が包含される。そのような核酸を含む発現ベクターもまた本発明に含まれる。ヒト化Ｍｕ−９抗体又はキメラＭｕ−９抗体又はヒトＭｕ−９抗体をコードするＤＮＡ配列を組換え操作して、核酸の複製をもたらす様々な知られている宿主ベクターに入れることができる。これらのベクターは、送達される細胞における核酸の転写又は翻訳又はその両方を行わせるために必要なエレメントを含有させるために、知られている方法を使用して設計することができる。知られている方法論を、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに機能的に連結されているタンパク質コード配列を有する発現構築物を作製するために使用することができる。これらの方法には、インビトロでの組換えＤＮＡ技術及び合成技術が含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９７、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。また、本発明では、ベクターに関連しないポリヌクレオチドの送達も提供される。
本発明における使用のために好適なベクターはウイルス性又は非ウイルス性であり得る。ウイルスベクターの具体的な例には、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター及びレトロウイルスベクターが含まれる。非ウイルス性ベクターの例には、プラスミドがある。好ましい実施形態において、ベクターはプラスミドである。
本明細書中に記載されるように、発現ベクターは、宿主細胞において発現される遺伝子を含むポリヌクレオチドである。典型的には、遺伝子発現は、構成的プロモーター又は誘導的プロモーターを含むいくつかの調節エレメント、組織特異的調節エレメント及びエンハンサーの制御下に置かれる。そのような遺伝子は、調節エレメントに「機能的に連結されている」と言われる。
好ましくは、本発明の発現ベクターは、重鎖及び軽鎖の可変領域及び定常領域の両方を含むヒト化Ｍｕ−９抗体又はキメラＭｕ−９抗体又はヒトＭｕ−９抗体をコードするＤＮＡ配列を含む。しかし、２つの発現ベクターを使用することもでき、この場合、一方の発現ベクターが重鎖の可変領域及び定常領域を含み、もう一方の発現ベクターが軽鎖の可変領域及び定常領域を含む。さらに好ましくは、発現ベクターはさらに、プロモーター、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をコードするゲノム配列、Ｉｇエンハンサーエレメント、及び選択マーカーをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む。
下記に記載される代表的な実施形態は、単に本発明を例示するために使用されるだけである。当業者は、本発明の物質の様々な変化が、請求される発明の広範な包括的範囲に含まれることを理解する。本明細書中で言及されるすべての参考文献の内容は、参照することにより組み込まれる。
ＩＸ．実施例
［実施例１］
Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−）−ＮＨ２（ＩＭＰ２４３）の合成
このペプチドは、Ｄ−チロシンがＬ−チロシンの代わりに使用されたこと、及びＮ−トリチル−ＨＳＧ−ＯＨがＤＴＰＡの代わりに使用されたことを除いて、Ｋａｒａｃａｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１１：８４２〜８５４（２０００）により記載されるように合成された。Ｎ−トリチル−ＨＳＧ−ＯＨの最終的なカップリングは、樹脂上のペプチドに対して１０倍過剰量のＮ−トリチル−ＨＳＧ−ＯＨを使用して行なわれた。Ｎ−トリチル−ＨＳＧ−ＯＨ（ＮＭＰにおいて０．２８Ｍ）は、（ＨＳＧに対して）１当量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、１当量のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウム・ヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）、及び２当量のジイソプロピルエチルアミンを使用して活性化された。活性化された基質を樹脂と室温で１５時間混合した。
［実施例２］
ＩＭＰ２４３を含むＴｃ−９９ｍキット配合物
２２．０９３ｇのヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、０．４５ｇの２，４−ジヒドロキシ安息香酸、０．２５７ｇの酢酸ナトリウム塩、及び１０．８８９ｇのα−Ｄ−グルコヘプトン酸ナトリウム塩を、１７０ｍＬの窒素脱気された水に溶解させて含有する配合緩衝液を調製した。溶液を、数滴の１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ５．３に調節し、その後、２２０ｍＬの総容量にさらに希釈した。第一スズ緩衝溶液を、０．２ｍＬのＳｎＣｌ２（２００ｍｇ／ｍＬ）を３．８ｍＬの配合緩衝液で希釈することによって調製した。ペプチドＡｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−）−ＮＨ２（０．００２６ｇ）を７８ｍＬの緩衝溶液に溶解し、０．５２ｍＬの第一スズ緩衝液と混合した。その後、ペプチド溶液を０．２２ｍのＭｉｌｌｅｘ ＧＶフィルターでろ過し、１．５ｍＬずつ小分けして３ｍＬの凍結乾燥バイアルに入れた。満たされたバイアルを直ちに凍結し、凍結乾燥して、真空下にて縁ひだキャップで密閉した。
１．５ｍＬの生理的食塩水における過テクネチウム酸塩溶液（２７ｍＣｉ）をキットに加えた。キットを室温で１０分間インキュベーションし、沸騰水浴で２５分間加熱した。キットは使用前に室温に冷却された。
［実施例３］
二重特異性抗体の腫瘍プレターゲッティングによって治療／画像化用放射性同位体を腫瘍に運ぶためのペプチド
ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ２３７）を、二重特異性抗体の腫瘍プレターゲッティングによって腫瘍に９０Ｙ又は１７７Ｌｕなどの治療用放射性同位体を送達するために合成した。この二重特異性抗体は、腫瘍表面の抗原に結合する部分が１つと、ＨＳＧペプチドに結合する別の部分の１つとから構成される。ＨＳＧペプチドと結合する抗体は６７９である。このシステムはまた、１１１Ｉｎ−１１１などの画像化用同位体を送達するためにも使用することができる。
ＩＭＰ２３７の合成
ＩＭＰ２３７は、下記の保護アミノ酸をその順に用いてペプチド骨格を組み立てるために、Ｆｍｏｃに基づく標準的な固相ペプチド合成を使用してＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（Ｎｏｖａ−Ｂｉｏｃｈｅｍ）上で合成された。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（これらの試薬はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈから得られた）、トリ−ｔ−ブチルＤＯＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ）。その後、側面リシンの側鎖を、Ｄａｎｇｌｅｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５２：４９８４〜４９９３（１９８７）の方法によってＰｄ［Ｐ（Ｐｈ）３］４で脱保護した。その後、ＨＳＧ配位子を、アミノ酸を結合させるために使用されたＢＯＰ／ＨＢＴＵ二重カップリング手法を使用してトリチルＨＳＧ（合成は下記に記載される）として加えた。ペプチドを樹脂から切断して、保護基をＴＦＡでの処理によって除去した。ペプチドをＨＰＬＣによって精製して、０．６０７９ｇのペプチドが１．８２３ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＮＨ−Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂から得られた。
Ｎ−トリチル−ＨＳＧ−ＯＨの合成
グリシンｔ−ブチルエステル塩酸塩（１５．２６３ｇ、９．１×１０−２モル）及び１９．７６０ｇのＮａ２ＣＯ３を混合して、５０ｍＬのＨ２Ｏに懸濁し、氷浴で冷却した。その後、無水コハク酸（９．１４２ｇ、９．１４×１０−２モル）を反応液に添え、反応液を室温にゆっくり加温して、１８時間撹拌した。クエン酸（３９．９１１ｇ）を５０ｍＬのＨ２Ｏに溶解して、反応溶液にゆっくり加え、その後、１５０ｍＬのＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機抽出液をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮して、２５．７０９ｇの白色固体が得られた。
粗生成物（２５．７０９ｇ）を１２５ｍＬのジオキサンに溶解し、室温の水浴で冷却して、１１．２４４ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドと混合した。ジイソプロピルカルボジイミド（１５．０ｍＬ）を反応液に加え、１時間撹拌した。その後、ヒスタミン二塩酸塩（１８．４０２ｇ、１．００×１０−１モル）を１００ｍＬのＤＭＦ及び３５ｍＬのジイソプロピルエチルアミンに溶解した。このヒスタミン混合液を反応液に加え、室温で２１時間撹拌した。反応を１００ｍＬの水で停止させ、ろ過して沈澱物を除いた。溶媒を高真空下においてロータリーエバポレーターで除去した。粗生成物を３００ｍＬのジクロロメタンに溶解して、１００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、３４．１９ｇの粗生成物が黄色オイルとして得られた。
粗生成物（３４．１９ｇ）を５０ｍＬのクロロホルムに溶解し、３１ｍＬのジイソプロピルエチルアミンと混合した。トリフェニルメチルクロリド（２５．４１５ｇ）を５０ｍｌのクロロホルムに溶解し、氷浴で冷却された反応液に撹拌しながら滴下して加えた。反応液を４５分間撹拌し、その後、１００ｍＬのＨ２Ｏで停止させた。層を分離し、有機溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、緑色のゴムが得られた。このゴムを１００ｍＬのＥｔ２Ｏとともに粉砕して、黄色の沈澱物を形成させ、これを５０ｍＬのＥｔ２Ｏで３回洗浄した。固体を真空乾燥して、３０．６４１ｇ（５９．５％の総収率）のＮ−トリチル−ＨＳＧ−ｔ−ブチルエステルが得られた。
Ｎ−トリチル−ＨＳＧ−ｔ−ブチルエステル（２０．６２０ｇ、３．６４×１０−２モル）を３０ｍＬのクロロホルム及び３５ｍＬの氷酢酸からなる溶液に溶解した。反応液を氷浴で冷却し、１５ｍＬのＢＦ３・Ｅｔ２Ｏを反応液にゆっくり加えた。反応液を室温にゆっくり加温し、５時間混合した。反応を、２００ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨに注ぐことによって停止させ、生成物を２００ｍＬのクロロホルムで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、不純物を含むゴムを得た。これを１００ｍＬのＥｔ２Ｏとともに粉砕し、沈澱物を形成させた。不純物を含む沈澱物を４００ｍＬの０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に注ぎ、２００ｍＬのＥｔＯＡｃで２回抽出した。水層を１Ｍ ＨＣｌでｐＨ３．５に酸性化して、２００ｍＬのクロロホルムで２回抽出した。沈澱物が得られ、これをろ過によって集めた（８．５８ｇ）。沈澱物は、以前のサンプルとのＨＰＬＣでの比較により、所望の生成物であった（ＥＳＭＳ ＭＨ＋５１１）。
放射標識
９０Ｙキット調製物
ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２を、９μｇ／ｍＬ、１８μｇ／ｍＬ、３５μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ及び１４０μｇ／ｍＬの濃度で、０．２５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ／１０％ＨＰＣＤ緩衝液に溶解した。溶液を０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ ＧＶフィルターで滅菌ろ過して、酸洗浄された凍結乾燥バイアルに１ｍＬずつ小分けして入れた。満たされたバイアルを充填時に直ちに凍結して、凍結乾燥した。凍結乾燥サイクルが完了したとき、バイアルを真空下で密封し、凍結乾燥機から取り出すときに縁ひだキャップで密封された。
９０Ｙ（約４００μＣｉ／キット）を脱イオン水で１ｍＬに希釈して、凍結乾燥されたキットに加えた。キットを沸騰水浴で１５分間加熱して、バイアルを室温に冷却し、標識されたペプチドを逆相ＨＰＬＣによって評価した（ＨＰＬＣ条件：Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａ−ＰａｋＣ−１８、８×１００ｍｍＲＣＭカラム、１００％（０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ）から１００％（９０％ＣＨ３ＣＮ、０．１％ＴＦＡ、１０％Ｈ２Ｏ）までの直線勾配を用いて３ｍＬ／分で溶出）。ＨＰＬＣ分析により、この配合物を用いた完全な標識化のために必要とされるペプチドの最低濃度は３５μｇ／ｍＬであることが明らかにされた。逆相ＨＰＬＣ図により、９０Ｙ標識ペプチドの鋭いピークが示された。標識ペプチドは、サイズ排除ＨＰＬＣにより、過剰量の６７９ＩｇＧと混合されたとき、完全に結合した。
１１１Ｉｎを用いた標識
１１１Ｉｎ（約３００μＣｉ／キット）を脱イオン水で０．５ｍＬに希釈して、凍結乾燥されたキットに添加した。キットを沸騰水浴で１５分間加熱して、バイアルを冷却し、０．５Ｍ酢酸緩衝液における２．５６×１０−５Ｍ Ｉｎの０．５ｍＬを加え、キットを再び沸騰水浴で１５分間加熱した。標識されたペプチドのバイアルを室温に冷却して、逆相ＨＰＬＣによって評価した（ＨＰＬＣ条件：Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａ−ＰａｋＣ−１８、８×１００ｍｍＲＣＭカラム、１００％（０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ）から１００％（９０％ＣＨ３ＣＮ、０．１％ＴＦＡ、１０％Ｈ２Ｏ）までの直線勾配を用いて３ｍＬ／分で溶出）。ＨＰＬＣ分析により、この配合物を用いた標識化（４．７％の遊離１１１Ｉｎ）のために必要とされるペプチドの最低濃度は３５μｇ／ｍＬであることが明らかになった。逆相ＨＰＬＣ図により、１１１Ｉｎ標識ペプチドの鋭いピークが示された。標識ペプチドは、サイズ排除ＨＰＬＣにより、過剰量の６７９ＩｇＧと混合されたとき、完全に結合した。
インビボ研究
ＧＷ−３９ヒト結腸異種移植片腫瘍（１００ｍｇ〜５００ｍｇ）を有するヌードマウスに二重特異性抗体ｈＭＮ−１４×ｍ６７９（１．５×１０−１０モル）を注射した。抗体は、１１１Ｉｎ標識ペプチド（８．８μＣｉ、１．５×１０−１１モル）が注射される２４時間前からクリアリングされた。動物は、注射の３時間後、２４時間後、４８時間後に屠殺された。
ｈＭＮ−１４×ｍ６７９で予備的にターゲッティングされたマウスにおけるペプチドの生体分布研究の結果が表１に示される。このプレターゲッティング研究におけるペプチドの腫瘍対非腫瘍比が表２に示される。
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ペプチドの標識及びＨＰＬＣ分析
ＩＭＰ２３７及びＩＭＰ２４１のペプチドを、Ｋａｒａｃａｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１１：８４２〜８５４（２０００）によって記載される手順に従って標識した。ペプチドＩＭＰ２４１（０．００１９ｇ）を５８７μｌの０．５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ（ｐＨ５．５）に溶解した。１．７μＬ量のペプチド溶液を１６５μｌの０．５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ（ｐＨ５．５）で希釈した。１０μＬの１１１Ｉｎ（１．８ｍＣｉ）をペプチド溶液に加えて、混合物を沸騰水浴で３０分間加熱した。
標識ペプチドを、Ｗａｔｅｒｓ８ｘ１００ｍｍラジアルパック、ｎｏｖａ−ｐａｋＣ１８ＲＣＭカートリッジカラムを使用してＨＰＬＣによって分析した。カラムは、０．１％ＴＦＡ／水の１００％で開始し、９０％アセトニトリル及び１０％水における０．１％ＴＦＡの１００％に向かう１０分間の直線勾配を用いて３ｍＬ／分で溶出された。この標識化では、約６％の遊離１１１Ｉｎが存在し、これはカラムの空隙容量（１．６分）において現れた。また、いくつかの１１１Ｉｎ標識ピークが５分及び６．６分〜８分で認められた。１１１Ｉｎ標識ペプチドは単一ピークとして８．８分に溶出された。１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２３７のＨＰＬＣプロフィルは、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２４１とほぼ同一であった。
血清安定性
１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２４１の一部（３０μＬ）を３００μＬの新鮮なマウス血清に入れ、３７℃のインキュベーターの中に置いた。ペプチドを、ＨＰＬＣによって上記に記載されるようにモニターした。１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２３７の一部（２４μＬ）を２３０μＬの新鮮なマウス血清に入れ、３７℃のインキュベーターの中に置いた。ペプチドを、ＨＰＬＣによって上記に記載されるようにモニターした。分析により、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２４１は、マウス血清中において３７℃で２２時間加熱された後ではわずかに（約５％）分解し得ることが示された。１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２３７は、３７℃で２２時間のインキュベーションの後では約７０％が保持時間のより短いピークに変換された。
結論
ＩＭＰ２４１ペプチド中のＤ−チロシンは、ＩＭＰ２３７と比較した場合、マウス血清中におけるペプチドの分解を遅らせる。
ＩＭＰ２３７とＩＭＰ２４１とのインビボ安定性の比較
１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２３７及び１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２４１のインビボでの安定性を、３０分及び６０分においてマウスから得られた尿サンプルを（ＨＰＬＣにより）試験することによって比較した。ＩＭＰ２４１及びＩＭＰ２３７のペプチドは、上記に記載されたように１１１Ｉｎ−１１１で標識された。
標識ペプチドをＢａｌｂ／ｃマウスに注射し、ペプチド注射の３０分後及び６０分後にマウスを屠殺した（１時点あたり１匹のマウスを使用した）。添付されたＨＰＬＣ図により、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２４１はそのままの形で排出され、一方、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２３７は新しい１１１Ｉｎ標識ペプチドにほぼ完全に代謝されたことが示される。
結論
ペプチド骨格内のＴｙｒをＤ−Ｔｙｒで置換することにより、インビボにおけるペプチドの代謝が最小限に抑えられた。
さらなるインビボ研究
ＧＷ−３９ヒト結腸異種移植片腫瘍（１００ｍｇ〜５００ｍｇ）を有するヌードマウスに二重特異性抗体ｍＭｕ９×ｍ６７９（１．５×１０−１０モル）を注射した。抗体は、１１１Ｉｎ標識ペプチド（８．８μＣｉ、１．５×１０−１１モル）が注射される４８時間前からクリアリングされた。動物は、注入の３時間後、２４時間後、４８時間後に屠殺された。
ｍＭＵ９×ｍ６７９を用いて予備的にターゲッティングされたマウスにおけるペプチドの生体分布研究の結果が表３に示される。このプレターゲッティング研究におけるペプチドの腫瘍対非腫瘍比が表４に示される。表５のデータは、二重特異性抗体で前処理されなかったマウスにおけるペプチドの生体分布を示している。
Figure 0004963512
Figure 0004963512
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［実施例４］
Ｍｕ−９可変領域のＰＣＲクローニング
ポリＡ ｍＲＮＡを、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してＭｕ−９ハイブリドーマ細胞株（３×１０７細胞）から単離した。第１鎖ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡサイクルキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してポリＡ ｍＲＮＡから逆転写した。簡単に記載すると、１ｇのポリＡ ｍＲＮＡを、ネズミＩｇＧ ＣＨ１特異的プライマーのＣＨ１Ｂ（５’ＡＣＡＧＴＣＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧ３’）又はネズミＣｋ特異的プライマーのＣｋ３−ＢＨ１（５’ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡ３’）に対して、１Ｍの最終濃度において、４２℃で６０分間、１ｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（１０Ｕ／ｌ）、４．０ｌの５×逆転写酵素緩衝液（５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．２）、２００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２及び２．５ｍＭのスペルミジン）、１ｌの１００ｍＭ ｄＮＴＰ、１ｌの８０ｍＭピロリン酸ナトリウム、及び５ＵのＡＭＶ逆転写酵素の存在下でアニーリングした。その後、ＲＮＡ−ｃＤＮＡのハイブリッドを９５℃で２分間変性した。その後、第１鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６：３８３３により記載されるようにＰＣＲによってＶＨ配列及びＶκ配列を増幅した。Ｖκ領域は、ＶＫ１ＢＡＣＫ（５’−ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ３’）及びＩｇＫＣ３’（５’−ＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧ３’）のプライマーを使用して増幅された。ＶＨ領域は、ＶＨ１ＢＡＣＫ（５’ＡＧＧＴ（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）ＣＴＧＣＡＧ（Ｃ／Ｇ）ＡＧＴＣ（Ａ／Ｔ）ＧＧ３’）及びＣＨ１Ｂのプライマーを使用して増幅された。好ましい実施形態において、ＶＨ領域は、図８に矢下線によって示されるプライマーを使用して増幅される。１０ｌの第１鎖ｃＤＮＡ産物、１０ｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（１５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）及び０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン）、１Ｍの各プライマー、１６ｌのｄＮＴＰ混合物、及び５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含有するＰＣＲ反応混合物を３０サイクルのＰＣＲに付した（９４℃で１分間の変性、４５℃で１分間のアニーリング及び７２℃で１分間の重合の５サイクルと、９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング及び７２℃で１分間の重合の２５サイクルとの組合せ）。増幅されたＶｋフラグメント及びＶＨフラグメントをゲル精製して、ジデオキシターミネーション法による配列分析のためにＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。その後、免疫グロブリン起源であることが確認された配列を、Ｌｅｕｎｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９９４、１３：４６９により記載された方法を使用してキメラな発現ベクターを構築するために使用した。
多数のクローンのヌクレオチド配列を決定することにより、１つのＶκ（ＭＵ９Ｖκ１）配列及び１つのＶＨ（Ｍｕ９ＶＨ）配列が単離されたことが確認された（図８）。このＲＴ−ＰＣＲ法によってクローニングされたＶＨ及びＶκ１から構築されたキメラＭｕ−９（ｃＭｕ−９−１）は、ＣＳＡｐ抗原に対する結合を何ら示さなかった。このことは、ＲＴ−ＰＣＲクローニング手法によって見逃されたかもしれない他の「機能的な」Ｖ領域配列が存在する可能性を示唆していた。
［実施例５］
ｃＤＮＡライブラリースクリーニングによるＭｕ−９可変領域のクローニング
ｃＤＮＡライブラリーをｐＳＰＯＲＴベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてネズミＭｕ−９ハイブリドーマから構築した。第１鎖ｃＤＮＡを、マウスＭｕ−９ハイブリドーマ由来のポリＡ ｍＲＮＡをオリゴｄＴプライマー−ＮｏｔＩアダプター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と対形成させることによって合成した。第２鎖の合成及びＳａｌＩアダプターの結合を行った後、ｃＤＮＡプールをｃＤＮＡサイズ分画カラムによりサイズ分画した。分画されたｃＤＮＡをｐＳＰＯＲＴベクターに連結し、その後、大腸菌ＤＨ５に形質転換した。ライブラリーをＬＢ−ａｍｐ（１００ｇ／ｍｌ）平板に置床し、コロニーをＮｙｔｒａｎフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）に転写して、ＬＢ−クロラムフェニコール平板において増幅した。増幅されたコロニーを、０．５Ｎ ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌで５分間、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で５分間、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／２×ＳＳＣで５分間、そして最後に２×ＳＳＣで５分間〜１０分間、連続して処理した。ＤＮＡを、８０℃で３０分間のベーキング処理によってフィルターに固定化した。フィルターを、６×ＳＳＣ、５Ｘデンハルト（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン及び０．１％ウシ血清アルブミン）、０．５％ＳＤＳ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、及び１００ｇ／ｍｌニシン***ＤＮＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するプレハイブリダイゼーション緩衝液において５０℃で２時間インキュベーションした。３２Ｐで標識されたプローブ（マウス重鎖に対して特異的なＭＵＣＨ−１（５’−ＡＧＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＣ３’）及びマウス軽鎖に対して特異的なＭＵＣｋ−１（５’−ＧＡＡＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴ３’））との１０６ｃｐｍ／ｍｌでのハイブリダイゼーションを、１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が補充されたプレハイブリダイゼーション溶液においてそれぞれのその融解温度（Ｔｍ）で一晩行なった。フィルター上の放射能が、ガイガーカウンターで測定したときに一定になるまで、フィルターは、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて、３７℃で１０分間の４回の洗浄、４２℃で１５分間の２回の洗浄、そして５０℃で１５分間の１回の洗浄が行われた。２×ＳＳＣにおける最後の洗浄の後、湿ったフィルターをＫｏｄａｋ ＸＡＲ−５フィルム（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に７０℃で感光させた。最初のスクリーニングで陽性であったクローンを二連のＬＢ−ａｍｐ平板に移した。二連のＮｙｔｒａｎフィルターを、上記に記載されたのと同じプローブにハイブリダイゼーションさせた。両方のフィルターにおいて明確にハイブリダイゼーションするクローンのみを、さらなるスクリーニングのために選び出した。３次スクリーニングのために、ＭＵＣＨ−１陽性コロニーを、ＶＨＣＤＲ３Ｍｕ９（実施例４においてＲＴ−ＰＣＲによってクローニングされたＶＨ配列に対して特異的）を用いて二連でスクリーニングし、そしてＭＵＣｋ−１陽性コロニーを、ＶＫＣＤＲ１Ｍｕ９及びＶＫＣＤＲ３Ｍｕ９（実施例４におけるＲＴ−ＰＣＲによってクローニングされたＶκ−１のＣＤＲ１コード配列及びＣＤＲ３コード配列に対して特異的）を用いてスクリーニングした。
ＭＵＣＨ−１に関して陽性であることが確認された全クローン（２５個）はまた、ＶＨＣＤＲ３Ｍｕ９に関しても陽性であった。このことは、１つのタイプの重鎖配列のみがこれらのハイブリドーマでは発現していたことを示している。ＶＨＣＤＲ３Ｍｕ９と明確にハイブリダイゼーションした１０個のクローンを配列決定して、これらが、ＲＴ−ＰＣＲによってクローニングされたＭｕ９ＶＨと同一であることが見出された。その配列が図１Ａに開示される。
一次及び二次の両方のスクリーニングでＭＵＣｋ−１に対して陽性であった３４個のクローンのうち、１４個のみが、Ｍｕ９Ｖｋ１特異的プローブのＶＫＣＤＲ１Ｍｕ９及びＶＫＣＤＲ３Ｍｕ９にハイブリダイゼーションした。配列分析により、これらのクローンはＭｕ９Ｖｋ１と同一であることが明らかにされた。Ｍｕ９Ｖｋ１特異的プローブに対して陰性であった残る２０個のクローンのうち、８個がＤＮＡ配列決定に付された。これらのクローンのうちの７個が、Ｍｕ−９Ｖκ１とは異なり、Ｍｕ−９Ｖκ２（その配列が図１Ｂに開示される）と呼ばれるＶｋドメインを有するκ軽鎖配列をコードしていた。ＶＨ及びＶｋ２から構築され、Ｓｐ２／０細胞において発現されたキメラＭｕ−９（ｃＭｕ−９−２）は、マウスＭｕ−９の結合親和性に匹敵する結合親和性をＣＳＡｐ抗原に対して示した（詳細については、実施例８〜９を参照のこと）。
［実施例６］
ｃＤＮＡライブラリースクリーニングのためのプローブの標識
様々なオリゴヌクレオチドを自動化された３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成し、次いでＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で精製した。精製されたオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して［−３２Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）で標識した。２０ｌの最終容量に含まれる典型的な反応混合物は下記の通りであった。５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド、６０Ｃｉの［−３２Ｐ］ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、及び２ｌの１０×キナーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。反応混合物を３７℃で１時間インキュベーションして、反応を２０ｌの０．１Ｍ ＥＤＴＡで停止させた。取り込まれなかった［−３２Ｐ］ＡＴＰをＴＥ−１０Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎカラム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）で標識オリゴヌクレオチドから分離した。標識されたプローブは、ハイブリダイゼーションのために１０６ｃｐｍ／ｍで使用された。
［実施例７］
ＳＰ２／０細胞のトランスフェクション
Ｍｕ−９について推定されるＶκ配列及びＶＨ配列を、Ｌｅｕｎｇら（上掲）によって記載されるように、それぞれ軽鎖発現ベクター（ｐＫｈ又はｐＫｈ＊）及び重鎖発現ベクター（ｐＧ１ｇ）にサブクローニングした。ｐＫｈ＊は、ＸｈｏＩ／ＰａｃＩリンカーがｐＫｈのＢｓｔＸＩ部位に導入されていることを除いて、本質的にはｐＫｈと同一である。ｃＤＮＡスクリーニングによって得られたＭｕ−９Ｖκ２は、内部にＢｓｔＸＩ部位を含んでいたので、ｐＫｈ＊にサブクローニングされ、これは、その後、トランスフェクションのためにＸｈｏＩ又はＰａｃＩのいずれかで線状化することができる。
約１０ｇ及び約３０ｇの線状化された軽鎖発現ベクター（Ｍｕ−９−１ｐＫｈ又はＭｕ−９−２ｐＫｈ＊）及び重鎖発現ベクター（Ｍｕ−９ｐＧ１ｇ）をエレクトロポレーションによってＳＰ２／０細胞に同時トランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を９６ウェル細胞培養プレートで完全培地において２日間増殖させ、その後、５００Ｕ／ｍｌの最終濃度でヒグロマイシンを添加することによって選択した。典型的には、コロニーがエレクトロポレーションの２週間後〜３週間後に現れ始め、コロニーは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって抗体分泌についてアッセイされた。キメラ抗体をプロテインＡ−セファロース４Ｂカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって培養上清から精製した。精製された抗体（５μｇ）を、還元条件のもとで４％〜２０％の勾配ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
［実施例８］
Ｍｕ−９の直接的な結合アッセイ
ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、セファロース４Ｂ−ＣＬカラムから溶出されたＧＷ−３９腫瘍抽出物（これはＣＳＡｐ抗原を含有する）の空隙容量画分でコーティングし、４℃で一晩放置した。翌日、非特異的な結合を、１％ＢＳＡ及び０．０５％ツィ−ン２０を含有するリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）でブロッキングした。キメラ抗体上清（１００μｌ）又は精製された抗体（０〜１μｇ／ｍｌ）を加えて、室温で１時間インキュベーションした。結合していないタンパク質を、洗浄緩衝液（０．０５％ツィ−ン２０を含有するＰＢＳ）で６回洗浄することによって除去した。精製されたネズミＭｕ−９タンパク質を標準品として使用した。結合した抗体を、Ｆｃフラグメントに特異的な抗体であるペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ ＰＡ）と、そしてＦｃフラグメントに特異的な抗体であるペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と反応させた。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄した後、１００μｌのＯＰＤ基質溶液（１０ｍｇのオルトフェニレンジアミン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む２５ｍｌの０．３２×ＰＢＳ及び０．１２％Ｈ２Ｏ２）を各ウェルに加えた。色を暗所で１時間発色させ、反応を５０μｌの４Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、そして４９０ｎｍにおける吸光度をＤｙｎａｔｅｃｈプレート読み取り装置（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｓ、Ｓｕｓｓｅｘ、英国）で測定した。
図５（ａ）に示されるように、ＣＳＡｐ抗原に対するｃＭｕ−９（ｃＭｕ−９−２）の直接的な結合が生じた。ｃＭｕ−９−２の結合プロフィルは、事実上、ネズミＭｕ−９の結合プロフィルに重ね合わせることが可能であった。これらのデータにより、ｃＭｕ−９−２の免疫反応性はマウスＭｕ−９の免疫反応性に匹敵することが明らかにされた。ｃＭｕ−９の機能的なＶκ及びＶＨのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列がそれぞれ図２Ａ及び２Ｂに示される。
［実施例９］
競合的結合アッセイ
ネズミＭｕ−９ＩｇＧを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｓｉｇｍａ）とコンジュゲート化した。ペルオキシダーゼコンジュゲート化Ｍｕ−９を、最初に、ＣＳＡｐ抗原でコーティングされたマイクロウェル表面における結合について試験して、最適濃度が０．２μｇ／ｍｌであることを決定した。ペルオキシダーゼコンジュゲート化Ｍｕ−９を様々な濃度のネズミＭｕ−９又はキメラＭｕ−９のいずれか（０〜５０μｇ／ｍｌ）と混合し、その後、抗原コーティングされたウェルに加えた。競合する抗体の存在下における抗原に対するペルオキシダーゼコンジュゲート化Ｍｕ−９の結合を、上記に記載されたように、基質を加えた後、４９０ｎｍで測定した。
図５（ｂ）には、競合的結合アッセイの結果が示される。ネズミＭｕ−９及びｃＭｕ−９−２は、同程度によく、ＣＳＡｐ抗原に対するＨＲＰコンジュゲート化Ｍｕ−９の結合と競合した。これらのデータにより、ｃＭｕ−９−２の免疫反応性がマウスＭｕ−９の免疫反応性に匹敵することが明らかにされた。
［実施例１０］
Ｍｕ９モノクローナル抗体をヒト化するためのヒトのフレームワーク及び配列設計の選択
Ｍｕ９の可変（Ｖ）領域フレームワーク（ＦＲ）配列をＫａｂａｔデータベースにおけるヒト抗体の配列と比較することによって、Ｍｕ−９のＶＨ及びＶκのＦＲが、それぞれ、ヒト抗体ＥＵのＶＨ及びヒト抗体ＷＯＬのＶのＦＲに対して最も大きい配列相同性を示すことが見出された。図３Ａ及び図３Ｂでは、Ｍｕ９のＶＨ及びＶκのアミノ酸配列がアラインメントされ、対応するヒト配列と比較される。従って、ＥＵ ＶＨ及びＷＯＬ ＶのＦＲが、Ｍｕ−９のＶＨ及びＶに対するＣＤＲがグラフト化されるヒトのフレームワークとしてそれぞれ選択された。しかし、ＥＵのＦＲ４配列ではなく、ＮＥＷＭのＦＲ４配列がＭｕ９重鎖のヒト化のために使用された（図３Ａ）。推定されるＣＤＲに近いＭｕ９のＦＲにおけるいくつかのアミノ酸残基が、以前に記載された指針（Ｑｕら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｃ．、５：３０９５ｓ〜３１００ｓ（１９９９））に基づいて、ｈＭｕ９において維持された。これらの残基は、ＶのＬ３７、Ｖ５８及びＱ１００（図３Ｂ）、並びにＶＨのＹ２７、Ｔ３０、Ｋ３８、Ｒ４０、Ｉ４８、Ｋ６６、Ａ６７、Ｋ７４、Ｔ９３、Ｒ９４及びＧ１０３（図３Ａ）である。その後、ｈＭｕ−９のＶＨ及びＶの遺伝子配列を設計した。それらの遺伝子配列が、それぞれ、図４Ａ及び図４Ｂにアミノ酸配列とともに示される。
［実施例１１］
ヒト化Ｖ遺伝子のＰＣＲ／遺伝子合成
Ｌｅｕｎｇら（Ｌｅｕｎｇら、１９９４）によって記載されるような方法が、長いオリゴヌクレオチド合成及びＰＣＲの組合わせを使用して、設計されたｈＭｕ−９のＶκ遺伝子及びＶＨ遺伝子を構築するために使用された。それぞれの可変鎖は、５’側半分及び３’側半分（それぞれ、「Ａ」及び「Ｂ」として表される）の２つ部分に分けて構築された。各半分は、Ｔａｑポリメラーゼを使用して、一本鎖の合成オリゴヌクレオチドテンプレートを２つの短い両端プライマーによりＰＣＲ増幅することによって得られた。増幅されたフラグメントを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から得られたｐＣＲ４ ＴＡクローニングベクターに最初にクローニングし、そしてＤＮＡ配列決定に付した。テンプレート及びプライマー対を下記に示す。
テンプレート プライマー ＰＣＲ産物
オリゴＧ オリゴ１４／オリゴ１５ ｈＭｕ９ＶＨＡ
オリゴＨ オリゴ１６／オリゴ１７ ｈＭｕ９ＶＨＢ
オリゴＪ オリゴ１８／オリゴ１９ ｈＭｕ９ＶｋＡ
オリゴＫ オリゴ２０／オリゴ２１ ｈＭｕ９ＶｋＢ
重鎖
ｈＭｕ９ＶＨ配列の全長ＤＮＡを構築するために、オリゴＧ（１０２ｍｅｒ）及びオリゴＨ（１７９ｍｅｒ）を自動化されたＲＮＡ／ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成した。オリゴＧの配列は、ｎｔ１９〜ｎｔ１２０に対して相補的なｈＭｕ９ＶＨドメインのマイナス鎖に対応する。
５’−ＡＧＧＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＡＣＣＣＡＧＧＴＡＡＴＡＡＣＡＴＡＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＡＴＣＣＡＧＡＡＧＣＣＴＴＧＣＡＧＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＣＴＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣ−３’。
オリゴＨの配列はｈＭｕ９ＶＨドメインのｎｔ１４７〜ｎｔ３２５に対応する。
５’−ＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＴＣＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＴＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＧＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＡＣＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＴＴＧＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧ−３’。
オリゴＧ及びオリゴＨを担体から切断し、濃水酸化アンモニウムでの処理によって脱保護した。サンプルを真空乾燥して、１００ｌの水に再懸濁した後、不完全なオリゴマー（１００ｍｅｒ未満）を、ＣｈｏｒｍａＳｐｉｎ−１００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）に通した遠心分離によって除去した。合成副産物を除去するためにＣｈｒｏｍａＳｐｉｎ−３０カラムを使用したことを除いて、すべての両端プライマーを同様に調製した。１ｌのＣｈｒｏｍａＳｐｉｎカラム精製されたオリゴＧを、１０ｌの１０×ＰＣＲ緩衝液［５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン］（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）、２５０Ｍの各ｄＮＴＰ、２００ｎＭのオリゴ１４（５’−ＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧ−３’）及びオリゴ１５（５’−ＡＣＴＣＴＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＡＣＣＣＡＧＧＴＡＡＴＡＡＣＡＴＡ−３’）、並びに５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を含有する１００ｌの反応容量でＰＣＲ増幅した。この反応混合物を、９４℃で１分間の変性、５０℃で１．５分間のアニーリング及び７２℃で１．５分間の重合からなる３０サイクルのＰＣＲ反応に付した。オリゴＨを、オリゴ１６（５’−ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＴ−３’）及びオリゴ１７（５’−ＴＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＡＴＣＣＴＣＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＡＴＡＧＡＡＣＧＣ−３’）のプライマー対によって同様の条件のもとでＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲフラグメントのＶＨＡ及びＶＨＢを２％アガロース（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）で精製した。１つしか存在しない制限部位が、ＤＮＡ連結による結合を容易にするために各フラグメントの両端において設計された。増幅されたＶＨＡフラグメントは、ＰｓｔＩ制限部位（ＣＴＧＣＡＧ）をその５’末端に、そしてＸｂａＩ制限部位（ＴＣＴＡＧＡ）をその３’末端に含有していた。増幅されたＶＨＢフラグメントは、ＸｂａＩ制限部位をその５’末端に、そしてＢｓｔＥＩＩ制限部位（ＧＧＴＣＡＣＣ）をその３’末端に含有していた。全長ＶＨ鎖の組み立てを、適切な５’酵素及び３’酵素での各フラグメントの制限酵素消化、そしてＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩで事前に消化されたＶＨｐＢＳベクター（Ｌｅｕｎｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１３：４６９（１９９４））への連結によって達成した。得られた連結産物は、ＡフラグメントをＰｓｔＩ部位に連結されて、ＢフラグメントをＢｓｔＥＩＩ部位に連結され、そしてＡフラグメント及びＢフラグメントがＸｂａＩ部位において結合して含有している（図４Ａ）。正しいオープンリーディングフレームがＤＮＡ配列決定によって確認されたとき、プロモーター及び分泌シグナルペプチドをコードする配列とともに完全なＶＨ遺伝子配列をＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩフラグメントとしてＶＨｐＢＳから取り出し、ＶＨｐＧ１ｇ発現ベクター（Ｌｅｕｎｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１３：４６９（１９９４））に連結して、ｈＭｕ９ＶＨｐＧ１ｇが得られた。
軽鎖
Ｖを構築する場合、合成された長いオリゴヌクレオチドテンプレートは、ｎｔ２１〜ｎｔ１５０に対して相補的なｈＭｕ９Ｖドメインのマイナス鎖に対応するオリゴＪ（１３０ｍｅｒ）：
５’−ＣＣＴＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＴＴＣＴＡＡＡＴＡＧＧＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＴＣＴＧＡＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴＣＧＣＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＣＣＴＧＧＧ−３’
と、ｈＭｕ９Ｖドメインのｎｔ１５１〜ｎｔ３００に対応するオリゴＫ（１５０ｍｅｒ）：
５’−ＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＣＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＴＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＴＴＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＣＧＴＧＴＴＣＣＧ−３’
とであった。
これらのオリゴを、下記に示されるようなそれぞれのそのプライマー対によってＰＣＲ増幅した。
オリゴ１８ ５’−ＧＡＴＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＴＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧ−３’
オリゴ１９ ５’−ＡＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＣＴＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡ−３’
オリゴ２０ ５’−ＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＣＣＧ−３’
オリゴ２１ ５’−ＴＴＡＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＡＣＧＧＡＡＣＡＣＧＴＧＡＡＣＣＴＴＧＡＡＡＧＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡ−３’
ＶＨに対して行なわれた方法と同じ構築方法がＶに対して行われたが、下記の改変を伴った。Ａフラグメントの５’末端制限部位がＰｖｕＩＩ（ＣＡＧＣＴＧ）であり、Ｂフラグメントの３’末端制限部位がＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）であった。これらのフラグメントは、ＶＫｐＢＲベクターに連結されたとき、共通するＰｓｔＩ部位（ＣＴＧＣＡＧ）において結合して、全長Ｖ配列（図４Ｂ）をもたらし、そしてＤＮＡ配列決定によって確認された。組み立てられたＶ遺伝子はＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限フラグメントとして軽鎖発現ベクターにサブクローニングされて、ｈＭｕ９ＶＫｐＫｈが得られた。
［実施例１２］
ｈＭｕ９に関するトランスフェクション、発現及び結合活性アッセイ
ｈＭｕ９に関する発現方法及び結合活性アッセイ方法は、ｃＭｕ９について記載された方法と同じであった。約１０ｇ及び約３０ｇの線状化されたｈＭｕ９ＶｋｐＫｈ及びｈＭｕ９ＶＨｐＧ１ｇをエレクトロポレーションによってＳＰ２／０細胞に同時トランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を９６ウェル細胞培養プレートで完全培地において２日間増殖させ、その後、５００Ｕ／ｍｌの最終濃度でヒグロマイシンを添加することによって選択した。典型的には、コロニーがエレクトロポレーションの２週間後〜３週間後に現れ始め、コロニーを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって抗体分泌についてアッセイした。キメラ抗体をプロテインＡ−セファロース４Ｂカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって培養上清から精製した。精製された抗体（５μｇ）を、還元条件のもとで４％〜２０％の勾配ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
直接的な結合アッセイにより、精製されたｈＭｕ−９がＣＳＡｐ抗原に結合することが明らかにされた。ｈＭｕ−９の結合親和性を、実施例６に記載されたような競合的結合アッセイにおいて比較した。図１３には、競合的結合アッセイの結果が示される。ｈＭｕ−９又はマウスＭｕ−９は、同程度によく、ＣＳＡｐ抗原に対するＨＲＰコンジュゲート化Ｍｕ−９の結合と競合した。これらのデータにより、ｈＭｕ−９の免疫反応性がマウスＭｕ−９の免疫反応性に匹敵することが明らかにされた。
［実施例１３］
９０Ｙ標識されたヒト化Ｍｕ−９抗体による患者の治療
３年前に切除され、そのときに放射線治療が施され、その後、５−フルオロウラシル／ホニリン酸の化学療法が施されたデュークＣ直腸がんの病歴を有する６２歳の男性が、６ヶ月前からその血漿ＣＥＡ価の上昇を示し始め、３０ｎｇ／ｍＬのレベルに達した。この患者は、腫瘍学者の診察を年に２回受けているので、この結果を聞いて知り、再発の疑いがあるために様々な診断手法を受けた。コンピューター断層撮影法により、２つの転移が肝臓に存在することが見出された。１つは直径が３ｃｍで、右葉に存在し、もう１つは少し小さく、左葉内で、葉間間膜の近くに存在した。患者は、化学療法を受けないことを選択したので、その後、患者には、２５ｍＣｉのヒト化Ｍｕ−９抗体コンジュゲート化９０Ｙが、２時間にわたる静脈内点滴によって５０ｍｇのタンパク質量で投与されて投薬された。その後、この治療は１ヶ月後に繰り返された。患者は、最後の治療点滴が行われた２週間後〜４週間後に測定されたとき、白血球及び血小板の低下が認められたが、治療後８週間目の評価では回復していた。治療後３ヶ月でのコンピューター断層撮影法の知見により、右肝葉の大きな腫瘍転移は４０％の縮小が明らかにされ、そして左葉の腫瘍では、それよりも小さい減少が明らかにされた。この時点で、患者の血中ＣＥＡは１５ｎｇ／ｍＬに低下していた。６ヶ月間の経過観察で、患者の腫瘍病変部は、２倍（ｔｗｏ−ｄｉａｍｅｔｅｒ）ＣＴ測定では約７０％減少しており、患者の血漿ＣＥＡは８ｎｇ／ｍＬであり、そして患者の全身状態は良好で、治療に関連する明らかな毒性又は有害な事象は全くなかった。患者は、現在、治療後９ヶ月であり、肝臓転移物の大きさには変化が全くなく、血清ＣＥＡ価は約５〜８ｎｇ／ｍＬで安定している。患者は、３ヶ月毎に経過観察されており、その結果、疾患が増大し始めた場合には、この放射免疫療法の別クールを受け、続いてむき出し状態のＭｕ−９抗体の１クールを、６週間にわたって毎週１回、３００ｍｇ／ｍ２の１週間用量で、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）の治療クールと同時に受けることが予定されている。
Ｘ．参考文献
引用されたすべての参考文献、並びに本明細書中に引用された参考文献により引用される参考文献は、参照することにより本明細書にその開示内容全体が組み込まれる。
注目されるさらなる参考文献並びにそれに引用される参考文献には下記が含まれ、それらは参照することによりその開示内容全体が本明細書中に組み込まれる。
Figure 0004963512
Figure 0004963512
Figure 0004963512
Figure 0004963512
５’−ＲＡＣＥによって得られ、ＤＮＡ配列決定によって決定されたネズミ６７９ＶｋのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列がヌクレオチド配列の下に一文字記号として示される。ヌクレオチド残基及びアミノ酸残基には連続して番号が付けられ、右側に示される。ＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基は太字で示され、下線が付けられている。 ＲＴ−ＰＣＲによって得られ、ＤＮＡ配列決定によって決定されたネズミ６７９ＶＨのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列がヌクレオチド配列の下に一文字記号として示される。ヌクレオチド残基及びアミノ酸残基には連続して番号が付けられ、右側に示される。ＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基は太字で示され、下線が付けられている。 ＭＡｂ６７９の単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列がヌクレオチド配列の下に一文字記号として示される。ヌクレオチド残基及びアミノ酸残基には連続して番号が付けられ、右側に示される。ＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基は太字で示され、下線が付けられている。ＶとＶＨとの間の連結として作用するアミノ酸残基もまた下線が付けられ、示されている。 ｃＤＮＡスクリーニングによって得られた機能的なＭｕ−９ＶのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸残基がヌクレオチド配列の下に一文字記号として示される。ヌクレオチド残基及びアミノ酸残基の両方には連続して番号が付けられ、右側に示される。ＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基は太字で示され、下線が付けられている。 ＲＴ−ＰＣＲによって得られたＭｕ−９ＶＨのＤＮＡ配列及びアミノ酸コード配列を示す。ＶＨコード配列のみが示される。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列がヌクレオチド配列の下に一文字記号として示される。ヌクレオチド残基及びアミノ酸残基の両方には連続して番号が付けられ、右側に示される。ＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基は太字で示され、下線が付けられている。 実施例１１に記載されるように長いオリゴヌクレオチド合成及びＰＣＲの組合せによって作製されるようなヒト化Ｍｕ−９（ｈＭｕ−９）軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列を示す。このＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基が一文字記号として示され、対応するコドンの下に示される。ＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基は太字で示され、下線が付けられている。 実施例１１に記載されるように長いオリゴヌクレオチド合成及びＰＣＲの組合せによって作製されるようなｈＭｕ−９重鎖可変領域のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。このＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基が一文字記号として示され、対応するコドンの下に示される。ＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基は太字で示され、下線が付けられている。 ＲＴ−ＰＣＲによって得られたＭｕ−９ＶＨのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。矢下線が付けられた配列は５’末端側のＰＣＲプライマー配列を表す。ＶＨ領域は、ＶＨ１ＢＡＣＫ（５’ＡＧＧＴ（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）ＣＴＧＣＡＧ（Ｃ／Ｇ）ＡＧＴＣ（Ａ／Ｔ）ＧＧ３’）及びＣＨ１Ｂのプライマーを使用して増幅された。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列がヌクレオチド配列の下に一文字記号として示される。ヌクレオチド配列の番号付けが右側に示される。ＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基は太字で示され、下線が付けられている。ＫａｂａｔのＩｇ分子番号付けが、アミノ酸残基の上の番号付けにより示されるようにアミノ酸残基に対して使用される。文字のみにより番号付けされた残基は、Ｋａｂａｔの番号付けスキームによって規定される挿入残基であり、前の数字と同じ先行する数字を有する。例えば、図８における残基８２、残基８２Ａ、残基８２Ｂ及び残基８２Ｃは、それぞれ、８２、Ａ、Ｂ及びＣとして示される。 Ｓｐ２／０細胞において発現させたキメラＭｕ−９（ｃＭｕ−９）の重鎖可変領域のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。図９Ａには、ｃＭｕ−９ＶＨのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列が示される。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列が一文字記号として示される。ＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基は太字で示され、下線が付けられている。ヌクレオチド配列の番号付けが右側に示される。アミノ酸残基の番号付けは、図８における番号付けと同じである。ｃＭｕ９を構築するために使用された制限部位は下線が付けられ、示されている。 Ｓｐ２／０細胞において発現させたキメラＭｕ−９（ｃＭｕ−９）の軽鎖可変領域のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。図９Ｂには、ｃＭｕ−９Ｖの二本鎖ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列が示される。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列が一文字記号として示される。ＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基は太字で示され、下線が付けられている。ヌクレオチド配列の番号付けが右側に示される。アミノ酸残基の番号付けは、図８における番号付けと同じである。ｃＭｕ９を構築するために使用された制限部位は下線が付けられ、示されている。 ヒト抗体並びにＭｕ−９及びｈＭｕ−９の重鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図１０Ａには、ヒト抗体のＥＵ（ＦＲ１〜３）及びＮＥＷＭ（ＦＲ４）とＭｕ−９及びｈＭｕ−９とのＶＨアミノ酸配列アラインメントが示される。ドットは、Ｍｕ−９内の残基がこれらのヒト抗体における対応する残基と同一であることを示す。四角で囲まれた領域はＣＤＲ領域を表す。ｈＭｕ−９のＮ末端残基及びＣ末端残基の両方（下線部）は、使用された設定ベクトルによって固定され、ヒト抗体と比較されていない。ＫａｂａｔのＩｇ分子番号スキームが、図８の場合のように残基に番号を付けるために使用される。 ヒト抗体並びにＭｕ−９及びｈＭｕ−９の軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図１０Ｂには、ヒト抗体ＷＯＬとＭｕ−９及びｈＭｕ−９とのＶアミノ酸配列アラインメントが示される。ドットは、Ｍｕ−９内の残基がこれらのヒト抗体における対応する残基と同一であることを示す。四角で囲まれた領域はＣＤＲ領域を表す。ｈＭｕ−９のＮ末端残基及びＣ末端残基の両方（下線部）は、使用された設定ベクトルによって固定され、ヒト抗体と比較されていない。ＫａｂａｔのＩｇ分子番号スキームが、図８の場合のように残基に番号を付けるために使用される。 Ｓｐ２／０細胞において発現させたｈＭｕ−９の重鎖可変領域のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。図１１Ａには、ｈＭｕ−９ＶＨのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列が示される。ヌクレオチド配列の番号付けが右側に示される。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列が一文字記号として示される。ＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基は太字で示され、下線が付けられている。ＫａｂａｔのＩｇ分子番号付けスキームが、図８の場合のようにアミノ酸残基に対して使用される。 Ｓｐ２／０細胞において発現させたｈＭｕ−９の軽鎖可変領域のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。図１１Ｂには、ｈＭｕ−９ＶκのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列が示される。ヌクレオチド配列の番号付けが右側に示される。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列が一文字記号として示される。ＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基は太字で示され、下線が付けられている。ＫａｂａｔのＩｇ分子番号付けスキームが、図８の場合のようにアミノ酸残基に対して使用される。 競合的結合アッセイにおけるｍＭｕ−９及びｈＭｕ−９の比較を示す。様々な濃度の競合Ａｂを、抗原被覆ウエルに対する一定量のＨＲＰ−ｍＭｕ−９の結合と競合させるために使用した。ｈＭｕ−９は、ｍＭｕ−９の阻止活性と匹敵し得る阻止活性を示した。ｍＭｕ−９及びｃＭｕ−９の比較はＫｒｉｓｈｎａｎら（Ｃａｎｃｅｒ、８０：２６６７〜２６７４（１９９７））に見出すことができる。

Claims (30)

  1. 配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、並びに
    配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及びＥＤＬで示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、を含み、
    結腸特異的抗原−ｐムチン（ＣＳＡｐ）へ結合するヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  2. フレームワーク配列中に、ネズミＭｕ−９のフレームワークのいくつかのアミノ酸残基が維持されており、
    前記アミノ酸残基が、軽鎖可変領域のＬ３７、Ｖ５８及びＱ１００、並びに重鎖可変領域のＹ２７、Ｔ３０、Ｋ３８、Ｒ４０、Ｉ４８、Ｋ６６、Ａ６７、Ｋ７４、Ｔ９３、Ｒ９４及びＧ１０３である、請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  3. 前記免疫反応性フラグメントが、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’及びＦａｂからなる群より選択される、請求項１又は２に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  4. 少なくとも１つの診断／検出剤又は少なくとも１つの治療剤に結合している、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  5. 前記診断／検出剤が、光活性な診断／検出剤である、請求項４に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  6. 前記診断／検出剤が、２０ｋｅＶ〜２，０００ｋｅＶの間のエネルギーを有する放射性核種である、請求項４に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  7. 前記放射性核種が、γ線放出同位体、β線放出同位体又は陽電子放出同位体である、請求項６に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  8. 前記放射性核種が、Ｆ−１８、Ｍｎ−５１、Ｍｎ−５２ｍ、Ｆｅ−５２、Ｃｏ−５５、Ｃｕ−６２、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６８、Ａｓ−７２、Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６、Ｒｂ−８２ｍ、Ｓｒ−８３、Ｙ−８６、Ｚｒ−８９、Ｔｃ−９４ｍ、Ｉｎ−１１０、Ｉ−１２０、Ｉ−１２４、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｓｅ−７５、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−１１４ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｙｂ−１６９、Ｈｇ−１９７及びＴｌ−２０１からなる群より選択される、請求項７に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  9. 前記診断／検出剤が、造影剤、常磁性イオン又は超音波増強剤である、請求項４に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  10. 前記常磁性イオンが、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）及びエルビウム（ＩＩＩ）からなる群より選択される、請求項９に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  11. 前記治療剤が、放射性核種、ホウ素原子、ガドリニウム原子、ウラン原子、免疫調節因子、サイトカイン、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、酵素阻害剤、光活性な治療剤、細胞傷害性薬物、毒素、血管形成阻害剤及び異なる抗体並びにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項４に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  12. 前記治療剤が、薬物又は毒素である、請求項４に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  13. 前記薬物が、細胞***阻止剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、血管形成阻害剤、アポトーシス剤、アルカロイド剤、ＣＯＸ−２阻害剤及び抗生物質並びにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１２に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  14. 前記薬物が、ナイトロジェンマスタード類、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホナート、ニトロソウレア類、トリアゼン類、葉酸アナログ、アントラサイクリン類、タキサン類、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン類、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換ウレア、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモンアンタゴニスト、酵素阻害剤、エンドスタチン、タキソール類、カンプトテシン類、ドキソルビシン類及びその誘導体並びにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１２に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  15. 前記毒素が、リシン、アブリン、αトキシン、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ Ｉ、ブドウ球菌のエンドトキシンＡ、アメリカヤマゴボウの抗ウイルス性タンパク質、ゲロニン、ジフテリアトキシン、シュードモナスのエキソトキシン及びシュードモナスのエンドトキシンからなる群より選択される、請求項１２に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  16. 前記免疫調節因子が、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血性因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン及び抗体並びにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１１に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  17. 前記リンホトキシンが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）であり、前記造血性因子がインターロイキン（ＩＬ）であり、前記コロニー刺激因子が顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり、前記インターフェロンがインターフェロン−α、β若しくはγであり、前記幹細胞増殖因子が「Ｓ１因子」と称される因子である、請求項１６に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  18. 前記サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ及びＴＮＦ−α並びにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１６に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  19. 前記免疫調節因子が、免疫因子のアゴニスト又はアンタゴニストである抗体である、請求項１１に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  20. 前記免疫因子のアゴニスト又はアンタゴニストである抗体が、ＣＤ４０に対する抗体である、請求項１９に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  21. 前記放射性核種が、オージェ放射体、β線放射体及びα線放射体からなる群より選択される、請求項１１に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  22. 前記放射性核種が、Ｐ−３２、Ｐ−３３、Ｓｃ−４７、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｓｅ−７５、Ａｓ−７７、Ｓｒ−８９、Ｙ−９０、Ｍｏ−９９、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ａｇ−１１１、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｐｒ−１４２、Ｐｒ−１４３、Ｐｍ−１４９、Ｓｍ−１５３、Ｔｂ−１６１、Ｈｏ−１６６、Ｅｒ−１６９、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８９、Ｉｒ−１９４、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｐｂ−２１１、Ｐｂ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ、Ｉｒ−１９２、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３及びＦｍ−２５５並びにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１１に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  23. 前記光活性な治療剤が、色素原又は色素である、請求項１１に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  24. 前記診断／検出剤又は治療剤が、炭水化物部分によって前記ヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメントに結合している、請求項４に記載のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント。
  25. 少なくとも２つの請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣＳＡｐへ結合するヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメントを含む抗体融合タンパク質。
  26. 少なくとも１つの請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣＳＡｐへ結合する第１のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメント及び該第１のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメントとは異なる少なくとも１つの第２のヒト化モノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメントを含む抗体融合タンパク質。
  27. 前記融合タンパク質にコンジュゲート化された診断／検出剤又は治療剤をさらに含む、請求項２５に記載の抗体融合タンパク質。
  28. 前記第２のヒト化モノクローナル抗体が、がん腫関連抗原に結合する抗体である、請求項２６に記載の抗体融合タンパク質。
  29. 前記第２のヒト化モノクローナル抗体が、ＣＥＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＰＡＭ−４が結合する抗原、ＫＣ４が結合する抗原、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、Ａ３、ＫＳ−１又はＶＥＧＦに結合する抗体、血管形成抗体、抗壊死抗体、がん遺伝子産物の抗体及び抗体Ａ３３からなる群より選択される、請求項２８に記載の抗体融合タンパク質。
  30. 前記がん腫関連抗原が、胃腸のがん又は卵巣のがんにおける抗原である、請求項２８に記載の抗体融合タンパク質。
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