JP4955548B2 - 標的化のためのＥｒｂＢ４細胞外ドメインおよびニューレグリンヘパリン結合ドメインを有するハイブリッドタンパク質 - Google Patents

標的化のためのＥｒｂＢ４細胞外ドメインおよびニューレグリンヘパリン結合ドメインを有するハイブリッドタンパク質 Download PDF

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Description

生化学、神経科学および医薬の分野における本発明は、様々な疾患（特に、癌）の処置のために、ポリペプチドをヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）が豊富な細胞表面および細胞外マトリックスに標的化する、ニューレグリンヘパリン結合ドメイン（Ｎ−ＨＢＤ）およびｅｒｂＢ４細胞外ドメインを含むハイブリッドポリペプチドに基づく組成物および方法に関する。
（背景技術の説明）
その多様な生理学的機能を果たすために、細胞は、特定の方式でその環境の細胞成分および細胞外成分に接着しなければならない。神経系において接着が必要な機能は、神経突起の伸長、シナプス形成および軸索髄鞘形成を含む。複数の環境的信号（ｃｕｅ）を認識し、そして特定の接着反応を起こす細胞の能力は、そのような複雑な細胞機能に必要不可欠である。認識および接着は、細胞接着分子（「ＣＡＭ」）によって媒介され、それは近辺の細胞に発現される、または細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）中の高分子に結合する。
３Ｄ構造が公知である、接着分子に存在する３つのモチーフは：免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリードメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ−ＩＩＩ）ドメイン、およびカドヘリンで見出されるドメインである。神経系において、Ｉｇスーパーファミリーメンバーが、Ｃａ依存性の同種親和性結合および異種親和性結合を媒介する。これらの分子の細胞外領域は、Ｉｇの可変（Ｖ）ドメインまたは定常（Ｃ）ドメインと配列類似性を有する１つ以上のドメインを含む（非特許文献１、非特許文献２）。多くのＩｇスーパーファミリー分子は、複数のコピーの２番目の基礎単位ドメイン（例えばＦｎ−ＩＩＩリピート）と連続して結合したタンデムＩｇ様ドメインからなる。検出可能な配列類似性を共有する２つの分子は、同じフォールディング位相をとることが見出されたので、研究者は、神経ＣＡＭにおけるＩｇドメインの構造の「一次」モデルとして、免疫系の研究で発見された分子の構造を使用した。Ｉｇ様ドメインおよびその位相は、非特許文献３（その全体が参考として援用される）において詳しく概説されている。ＩｇＶドメインは、ＣＡＭのＶ様ドメインの原型であり、そしてそのフォールディングの型は、抗体ＶＨおよびＶＬドメインならびにＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）α鎖およびβ鎖のＮ末端ドメインに見出され、Ｖ様ドメインは、Ｔ細胞表面分子ＣＤ４（最初および３番目のドメイン）およびＣＤ８、「免疫系ＣＡＭ」ＣＤ２、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）およびテロキン（ｔｅｌｏｋｉｎ）のＮ末端ドメイン、およびミオシン軽鎖キナーゼのＣ末端ドメインに見出される。ＩｇＣ１ドメインは、２つの逆平行シートに配置された７本のＢストランドからなる。２つのシートは、ストランド「Ｂ」および「Ｆ」の間のジスルフィド結合によって結合される。抗体において、定常ドメインは、Ｆｃ領域およびＦａｂ ＩｇフラグメントのＣ末端ドメインに見出される。定常様ドメインまたはＣ１セットドメインはまた、ＭＨＣ分子およびＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の膜近位ドメインに見出される。Ｃ２フォールディング位相およびＣ１フォールディング位相は、同様である。Ｃ２ドメインは、３つのＩｇスーパーファミリーメンバー：ＣＤ２、ＶＣＡＭ−１の２番目のドメイン、およびＣＤ４の２番目および４番目のドメインに存在する。本発明の中心である、ニューレグリンのヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）は、Ｉｇ−Ｃ２ドメインである。
細胞間連絡の重要な手段は、１つの細胞からの成長因子および分化因子の放出、ならびにその付近の細胞上の膜レセプターへの結合および膜レセプターの活性化であり、それは最終的に遺伝子発現の変化によってその性質を変化させる。多くのポリペプチド因子は、細胞間のＥＣＭに存在するヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）とさらなる結合相互作用を有する。この２重の結合相互作用は、これらの因子を、それらが必要とされる部位に濃縮するために、それらをタンパク質分解から保護するために、およびそのレセプターとのその相互作用を調節するために作用し得る（非特許文献４）。これらの細胞外相互作用が、最終的に細胞の性質を変化させる細胞内事象をどのように調節するかは、なお研究中である。
ニューレグリン（ＮＲＧ）は、（ａ）神経系および心臓の成長および発達、および（ｂ）癌（非特許文献５）において複数の機能を有する、ヘパリン結合増殖因子および分化因子のファミリーである。１つの場合において、ＮＲＧは、神経筋シナプスの運動神経末端から放出され、そしてシナプス後筋膜において、チロシンキナーゼレセプターの上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーのメンバー、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４を活性化する（非特許文献６；非特許文献７）。本明細書中で考察されるように、ＮＲＧは、多くの場合、特定の腫瘍細胞から放出される強力なマイトジェンであり、したがって、同じ腫瘍細胞上の同じファミリーのレセプターを活性化するオートクライン様式で作用し、増殖および転移活性の増強をもたらす（非特許文献８）。
全てのＮＲＧの共通の特徴は、上皮増殖因子様（ＥＧＦ様）ドメインである。それ自身で発現した場合でも、このドメインは、レセプター結合および例えばシナプス後筋膜の神経筋シナプスにおいて高度に集中しているｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、およびｅｒｂＢ４レセプターのホモダイマーおよびヘテロダイマーの活性化に十分である（非特許文献９）。これらレセプターにおけるＴｙｒ残基の迅速な自己リン酸化が、最初の結合事象をＡＣｈＲ遺伝子の誘導へ翻訳するシグナル伝達カスケードを開始する（非特許文献１０）。このシグナル伝達カスケードは、マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼおよびホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路の両方を含む、多くのシグナル伝達経路を含む（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。
ＮＲＧのほとんどのスプライシングされた形態はまた、ＥＧＦ様ドメインのＮ末端に免疫グロブリン様（ＩＧ様）ドメインを有する（図１）。このドメインはヘパリン結合ドメイン（「ＨＢＤ」）であるので、それは本明細書中でニューレグリンＨＢＤ（または「Ｎ−ＨＢＤ」）と呼ばれる。用語「ＩＧ様ドメイン」（ＮＲＧからの）および「Ｎ−ＨＢＤ」は、本明細書で交換可能に用いられる。
本発明者および他の者は、このドメインがＨＳＰＧと相互作用し、そして神経筋シナプスおよび中枢神経系内のＥＣＭにおけるＮＲＧの沈着を引き起こし得ることを示した（非特許文献６；非特許文献１４；非特許文献１５）。神経系の発達において、ＨＳＰＧは、Ｎ−ＨＢＤを含むＮＲＧ形態の、発達の重要な段階における、発達している神経筋シナプスの基底層への蓄積を「指示し」得る（非特許文献６）。
他のヘパリン結合リガンドからＮＲＧを区別する１つの特徴は、それが、糖鎖付加されたスペーサー領域によってお互いに分離された、ヘパラン硫酸結合およびレセプター結合のために別々のドメインを有することである。この事実の認識が、本発明者を、他のヘパリン結合リガンドでは容易に可能ではない、レセプター活性化および遺伝子活性化に対するＨＳＰＧ結合の直接的影響を決定するよう導いた。
非特許文献１６は、ＨＢＤに対応するヒヨコＮＲＧの２７アミノ酸ペプチドを記載した。このペプチドは、ウサギで抗血清を産生するための免疫原として使用するためだけに作製された。非特許文献１４は、ＥＣＭへのＮＲＧの固定化は、ＨＳＰＧに結合するそのＩｇ様ドメインにより得ることを推測した。これは、ヘパリンが、組換えＮＲＧによって引き起こされた結合後レセプターチロシンリン酸化を阻害したという観察から間接的に得られた。
ＮＲＧはヘパリンに結合するので、Ｍｅｉｅｒ Ｔら（非特許文献１７）は、ヒトｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた組換えＨＲＧ（＝ＮＲＧ）が、Ｌｏｅｂら、前出によって提唱されたように、負に帯電したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）側鎖によって、組換えヒヨコアグリン（ＨＳＰＧ）に直接結合するかどうかを調査した。実際に、ＮＲＧのＩｇ様ドメインがこれらのＧＡＧ鎖に対する結合を媒介した。Ｉｇ様ドメインはアグリンに結合したが、ＥＧＦ様ドメインは結合しなかった。
様々な目的のために、他のタンパク質と融合したＩｇ−Ｃ領域またはＩｇ分子の様々な部分の多くの開示が存在したが、これらの領域は、主に真のＩｇ分子由来であった。本明細書中に記載されるＮ−ＨＢＤは、これらの真のＩｇドメインと４０％未満の相同性または配列類似性しか有さず、先行技術のものとは構造的および機能的に異なる。そのような開示の例としては、以下が挙げられる。特許文献１および特許文献２は、本明細書中に記載されるＮＲＧ−ＨＢＤニューレグリンＩＧドメインとは完全に別のものであり、活性ペプチドを細胞表面へ標的化するといわれるリガンドを記載する。しかし、そのような標的化は、細胞表面のヘパラン硫酸に向けられておらず、またそれに特異的ですらない。特許文献３は、接着性（ａｄｈｅｓｏｎ）可変（Ｖ）領域を構成するポリペプチドが、そのＣ末端で、Ｉｇ Ｃ領域ポリペプチドのＮ末端と融合した融合タンパク質を含む「免疫接着（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｏｎ）」を記載する。
特許文献４、および特許文献５は、生物学的に活性なポリペプチド（およびそのコードするＤＮＡ）、そして具体的には、二量体化融合産物を記載する。この二量体化融合産物は、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含み、これらの各々が非Ｉｇポリペプチドを含み、かつ生物学的活性化のための二量体化を必要とし、異種「二量体化」タンパク質に結合されている。少なくとも１つのＩｇ Ｈ鎖Ｃ領域ドメイン（ＣＨ１〜ＣＨ４のいずれか）と結合した、非Ｉｇポリペプチド二量体のポリペプチド鎖もまた記載される。発現した、二量体化融合ポリペプチドは、非Ｉｇポリペプチド二量体に特徴的な生物学的活性を示す。
特許文献６は、少なくともＣＨ１ドメインを欠くＩｇ Ｆｃ領域および標的タンパク質配列をコードするポリヌクレオチドを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを記載する。特許文献７は、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’）２フラグメントであり、そのＩｇドメイン（またはＩｇ様ドメイン）は、ＣＨ１またはＣＬ領域のうちの少なくとも一方を含む、「目的のポリペプチド」改変体を調製する方法を開示する。特許文献８は、Ｉｇ ＣドメインまたはＩｇ様Ｃドメイン、およびＩｇドメインまたはＩｇ様Ｃドメイン内のサルベージレセプターに結合するエピトープを有する改変ポリペプチドを開示する。非改変ポリペプチドには存在しないこのエピトープは、Ｉｇ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られる。これらの文献に記載されるＩｇ様ドメインは、本発明のＮ−ＨＢＤとは明らかに異なるものである。
特許文献９は、集合的にニューレグリン（ＮＲＧ１）と呼ばれるポリペプチドのファミリーを記載し、それは、ヒト第８染色体短腕に位置決定された単一遺伝子のオルタネイティブスプライシングから生ずるようである（非特許文献１８）。ＮＲＧ３（マウスおよびヒト）は、それぞれ約７１３アミノ酸長および７２０アミノ酸長であり、そしてＥＧＦ様ドメイン、Ｎ末端疎水性部分、セリン／スレオニンリッチ部分、予測される膜貫通ドメイン、および予測される細胞内ドメインを含むことが開示された。
Ｈｏｌｍｅｓら（非特許文献１９；特許文献１０；および特許文献１１）は、ＨＥＲ２レセプターに対するポリペプチドアクチベーターファミリーの単離およびクローニングを記載し、彼らはそれらをヘレグリン−α（ＨＲＧ−α）、ヘレグリン−β１（ＨＲＧ−β１）、ヘレグリン−β２（ＨＲＧ−β２）、ヘレグリン−β２様（ＨＲＧ−β２様）、およびヘレグリン−β３（ＨＲＧ−β３）と称した。これらの文献は、（１）精製ＨＲＧ（＝ＮＲＧ）ポリペプチドの、ＭＣＦ７胸部腫瘍細胞におけるＨＥＲ２レセプターのチロシンリン酸化を活性化する能力、および（２）高レベルのＨＥＲ２レセプターを発現する腫瘍細胞に対するＨＲＧポリペプチドの***促進活性を記載する。他のＥＧＦファミリー増殖因子と同様、可溶性ＨＲＧポリペプチドは、タンパク質分解処理されて４５ｋＤａの可溶性形態を放出する、膜結合前駆体（プロ−ＨＲＧ）から得られるようである。最初の２１３アミノ酸残基において本質的に同一であるが、そのＣ末端領域において異なる２つの改変体ＥＧＦ様ドメインに基づいて、ＨＲＧは２つの主要な型、αおよびβに分類される。アミノ酸配列比較に基づいて、ＥＧＦ様ドメインの最初および６番目のシステイン間で、ＨＲＧが、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）と４５％類似性であり、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）と３５％同一であり、ＴＧＦ−αと３２％同一であり、そしてＥＧＦと２７％同一であることを見出した。
非特許文献２０は、「アセチルコリンレセプター誘導活性」（ＡＲＩＡ）ポリペプチドと名付けられた、別のヘレグリンファミリーメンバーを記載した。そのニワトリ由来のポリペプチドは、筋ＡＣｈＲの合成を刺激した。特許文献１２もまた参照のこと。ＡＲＩＡは、β型のＨＲＧであり、そしてＨＲＧα、およびＨＲＧβ１〜β３のＩｇ様ドメインおよびＥＧＦ様ドメイン間の、糖鎖付加部位が豊富なスペーサー領域全体を欠く。
非特許文献２１は、グリア増殖因子（ＧＧＦ）と名付けられたいくつかのウシ由来タンパク質を同定し、それらは上で記載した他のＮＲＧ／ＨＲＧタンパク質とＩｇ様ドメインおよびＥＧＦ様ドメインを共有するが、アミノ末端クリングルドメインも有する。特許文献１３；特許文献１４；特許文献１５；特許文献１６；および特許文献１７も参照のこと。
非特許文献２２は、感覚および運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）と呼ばれるＨＲＧファミリーの別のメンバーを記載し、それは全ての他のＨＲＧポリペプチドに特徴的なＥＧＦ様ドメインを有するが、異なるＮ末端ドメインを有する。ＳＭＤＦと他のＨＲＧポリペプチドとの間の主な構造的相違は、全ての他のＨＲＧポリペプチドに特徴的なＩｇ様ドメインおよび「グリコ」スペーサーを欠くことである。
非特許文献２３は続いて、ＥｒｂＢ３がＨＲＧのレセプターであり、そして内因性チロシン残基のリン酸化、および両方のレセプターを発現する細胞においてＥｒｂＢ２レセプターのリン酸化を媒介することを示した。ＨＲＧは、いくつかのレセプターと相互作用し得る、唯一の公知のＥＧＦ様ファミリーメンバーであった（非特許文献２４）。
ＮＲＧ／ＨＲＧタンパク質の多くの生物学的活性が記載された：
（１）シナプス後筋において神経伝達物質レセプターの合成および濃縮に作用することによる、筋管の分化（非特許文献２０）；
（２）ヒヨコ筋におけるナトリウムチャネル数の増加（非特許文献２５）；
（３）より多くの筋管を産生する、サブコンフルエントな（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）休止ヒト筋芽細胞の***促進刺激およびその分化（Ｓｋｌａｒら、特許文献１８）；ならびに
（４）心内膜に発現するＮＲＧ１による、心筋ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４レセプターの活性化（非特許文献２６；非特許文献２７）。
本明細書中に記載され、そして本発明者らの初期の出願において考察されるように（非特許文献２８を参照のこと）、Ｎ−ＨＢＤは、アグリンおよびＥＣＭ中の他のＨＳＰＧと相互作用することによって細胞表面に対してＮＲＧタンパク質を標的化する（非特許文献２９）。ＮＲＧとＨＳＰＧとの間のこの相互作用は、ＮＲＧタンパク質をそのｅｒｂＢレセプターの近傍に濃縮するだけでなく、生物学的活性（この場合において、ＡＣｈＲ遺伝子発現）を誘導するのに十分に長い時間ＮＲＧタンパク質をそのｅｒｂＢレセプターの近傍に保持する。本明細書中に提示される結果は、乳癌および卵巣癌におけるＮＲＧの転移効果を実証する他の報告によって支持され（非特許文献３０、非特許文献３１）、これらの結果は、ＮＲＧ活性のブロックが、癌のこれらの形態を処置する重要で新規の方法であることを示す。例えば、ヒトｐ８５ ｅｒｂＢ３レセプターの天然に存在する分泌された形態は、ＮＲＧ誘導性の乳癌細胞増殖を負に制御する（非特許文献３２）。ＩｇＢ４と名付けられた１２０ｋＤａの融合ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）にインフレームで融合されるｅｒｂＢ４レセプターのＥＣＤを含むＮＲＧアンタゴニストである（非特許文献３３）。ＩｇＢ４は、２つのＩｇγ鎖の間の鎖間のジスルフィド結合に起因して、二量体である。可溶性ｅｒｂＢ３およびＩｇＢ４アンタゴニストはいずれも、ＮＲＧ結合について内因性ｅｒｂＢレセプターと競合することによって、ドミナントネガティブなＮＲＧレセプターとして働く。ドミナントネガティブなレセプターはいずれも、ＥＧＦ様ドメインのみを含むＮＲＧ構築物をブロックすることが報告された一方で、本発明者および他の者は、ＮＲＧのＩｇ−ＥＧＦ形態の活性（ｅｒｂＢのリン酸化として測定される）を効率的に阻害できなかった。例えば、非特許文献３４を参照のこと。本発明によって、この失敗は、ＮＲＧのＩｇ−ＥＧＦ形態がＨＢＤ／ＨＳＰＧ相互作用によって細胞表面に蓄積し、それらの天然のｅｒｂＢレセプター近傍にて高濃度を達成するという事実によって説明される。このような状況において、可溶性アンタゴニストは、実際には達成できない非常に高い濃度を除いてはＮＲＧ活性をブロックできない。本発明の１つの目的は、この欠陥を克服することであった。
（ヘパラン硫酸およびＨＳＰＧ）
ヘパラン硫酸（ＨＳ）は、プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）の一部としてほとんどの細胞の表面上、およびＥＣＭに見出される硫酸化多糖類である。この多糖類は、多くの異なるタンパク質の間の相互作用を媒介する。ＨＳは、交互のヘキサウロン酸とグルコサミン単位から構成される。ヘキサウロン酸は、Ｄ−グルクロネート（ＧｌｃＡ）またはＬ−イズロネート（ＩｄｏＡ）のいずれかであり得る。グルコサミンのアミンは、通常、アセチル化（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＧｌｃＮＡｃ）されるか、または硫酸化（Ｎ−スルホグルコサミンまたはＧｌｃＮＳＯ３）されるが、それはまた、非置換型であり得る。潜在的な硫酸化部位は、アミノ基または各糖分子の２位、３位、および６位に位置した（非特許文献３５）。ときとして、ＧｌｃＮＳＯ３単位にある３−Ｏ−硫酸基にも存在する。ＨＳエピトープの発現は、異なる器官および組織内で時間的および空間的に制御され得る（非特許文献３６；非特許文献３７）。したがって、ＨＳＰＧ特異性は、ＧＡＧ鎖の糖組成および硫酸化パターンの違いによってもたらされる多様性によってコードされ得る（非特許文献３８；非特許文献３９）。例えば、２種の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦｌおよびＦＧＦ２）は、最適な結合のためにＮ−硫酸化の五糖配列を必要とするが、Ｏ−硫酸化のための必要条件と異なる（非特許文献４０）。肝細胞成長因子、血小板由来増殖因子およびリポタンパク質リパーゼは、全て、１つ以上のＧｌｃＮ ６Ｏ−硫酸基の存在に依存する（非特許文献４１；非特許文献４２；非特許文献４３）。アンチトロンビンＩＩＩは、３Ｏ−硫酸化ＧｌｃＮＳ単位を必要とする（非特許文献４４）。ＦＧＦシグナル伝達系におけるさらなる特異性はまた、ＨＳおよびＦＧＦとそのレセプターとの間の、同時かまたは連続的な相互作用のいずれかによってもたらされ得る（非特許文献４５；非特許文献４６）。
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（発明の要旨）
本明細書中で使用される略語のいくつかとしては、以下が挙げられる：ＮＲＧ、ニューレグリン；ＨＲＧ、ヘレグリン；ＨＢＤ、ヘパリン結合ドメイン；Ｎ−ＨＢＤ、ニューレグリンヘパリン結合ドメイン；ＡＣｈＲ、アセチルコリンレセプター；Ｂ４またはＢ４Ｄ、ｅｒｂＢ４レセプターの細胞外ドメイン；ＨＳＰＧ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン；ＥＧＦ、上皮増殖因子；ＩＧまたはＩｇ、免疫グロブリン；ＭＡＰＫ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ；ＰＩ３−Ｋ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ＭＥＭ、最少必須培地；ＣＥＥ、ヒヨコ胚抽出物；α−ＢＴＸ、α−ブンガロトキシン；ＦＧＦ、線維芽細胞増殖因子；ＥＣＤ、細胞外ドメイン；ＥＣＭ、細胞外マトリックス；ＴＧＦ−β、トランスフォーミング増殖因子−β；ＣＲＥＢ、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質。
本発明者は、Ｎ−ＨＢＤ（ニューレグリンＩＧ様ドメインとも呼ばれる）が、ｅｒｂＢレセプター付近で、ＡＣｈＲ遺伝子発現のようなレセプター結合から下流の事象を誘導するために必要な十分に長い時間、ＥＧＦ様ドメインを十分に高い濃度に保つために機能することに着目した。ＷＯ０３／０１２０４５において、本発明者は、ＮＲＧ−ＨＳＰＧ相互作用がどのようにＮＲＧ−ｅｒｂＢレセプター結合、ｅｒｂＢレセプター自己リン酸化、および下流のＡＣｈＲ遺伝子の活性化および新規合成されたタンパク質に影響するかを記載した。ＨＢＤを有するかまたは有さない組換えＮＲＧ β１アイソフォームを使用して、Ｎ−ＨＢＤは、内因性ＨＳＰＧと相互作用することによって、レセプターリン酸化に対するＥＧＦ様ドメインの作用を増強したことが示された。これらのＨＳＰＧ相互作用を通して、Ｎ−ＨＢＤは、ＮＲＧ−ｅｒｂＢレセプターリン酸化の維持を誘導する。これらの結果は、神経筋シナプスのＥＣＭにおけるＮＲＧの高濃度に関する分子的原理を提供する。
Ｎ−ＨＢＤは、最初のＣｙｓから１３残基に位置するＴｒｐを有する、５５アミノ酸離れた２つのＣｙｓ残基を有する。これは、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーのＩｇ Ｃ２サブファミリーに特徴的である。例えば、ネイティブのヒトＮ−ＨＢＤ配列は、ＣＤ４で見出される、より「慣習的な」Ｉｇ Ｃ２ Ｉｇドメインと３２％の同一性しか有さない。本発明のＮ−ＨＢＤ、ホモログまたは機能的誘導体は、好ましくは上記の配列特徴を有し、そして同じ動物種由来のＩｇ Ｈ鎖またはＩｇ Ｌ鎖のＩｇ Ｃ２ドメインと約４０％より低い同一性を有する。
本発明は、特に、少なくとも２つのドメインまたはペプチド構造：（１）最初の「標的化」ポリペプチドドメインであって、その役割は融合ポリペプチドを標的化することである、ポリペプチドドメイン、および（２）本明細書中で「標的化された」ポリペプチドまたは「Ｐｔｒｇ」と呼ばれる融合パートナーを含む、新規ハイブリッドまたは融合ポリペプチド（およびこのポリペプチドをコードする核酸および発現ベクター）に関する。標的化ドメインは、好ましくは動物Ｎ−ＨＢＤ、より好ましくは哺乳動物Ｎ−ＨＢＤ、最も好ましくはヒトＮ−ＨＢＤである。上記Ｐｔｒｇの作用によってこの融合タンパク質は、ネイティブのＰｔｒｇまたは標的化ポリペプチドに融合されないＰｔｒｇと比較して、標的レセプターをブロックするアンタゴニストとしての生物学的活性を増強させた。
本発明はまた、Ｎ−ＨＢＤ融合ポリペプチドをコードする組換えハイブリッド核酸分子であって、上記分子は、以下：
（ａ）動物Ｎ−ＨＢＤポリペプチド、または上記ポリペプチドのホモログもしくは機能的誘導体をコードする約１００ヌクレオチドより長くない第１の核酸配列であって、上記ポリペプチド、上記ホモログまたは上記機能的誘導体が、以下：
（ｉ）免疫グロブリンスーパーファミリーのＣ２サブファミリーのメンバーであるが、同じ動物種由来の免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖のＣ２ドメインに対して約４０％未満の配列同一性を有し；そして
（ｉｉ）従来のヘパリン結合アッセイまたはヘパラン硫酸結合アッセイにおいて測定される場合、１０−５Ｍ以下のＫｄでヘパリンおよびヘパラン硫酸のプロテオグリカンに結合する；
ことにおいて特徴付けられる、第１の核酸配列；
（ｂ）必要に応じて（そして好ましくは）、上記第１の核酸配列とインフレームで融合される、リンカーペプチドをコードするリンカー核酸配列；および
（ｃ）第２の核酸配列であって、上記第２の核酸配列が、（ｉ）上記第１の核酸配列または上記リンカー核酸配列にインフレームで連結され、そして（ｉｉ）第２のポリペプチドＰｔｒｇをコードし、上記第２の核酸配列がｅｒｂＢ４レセプター（Ｂ４）ＥＣＤをコードする、第２の核酸配列、
を含み、上記コードされた融合ポリペプチドは、ニューレグリンアンタゴニストである。
上記核酸分子において、上記Ｎ−ＨＢＤポリペプチドは、以下：
（ａ）ヒトＮＲＧ由来の、ＧＳＫＬＶＬＲＣＥＴ ＳＳＥＹＳＳＬＲＦＫ ＷＦＫＮＧＮＥＬＮＲ ＫＮＫＰＱＮＩＫＩＱ ＫＫＰＧＫＳＥＬＲＩ ＮＫＡＳＬＡＤＳＧＥ ＹＭＣＫＶＩＳＫＬＧ（配列番号１）；
（ｂ）ラットＮＲＧ由来の、ＧＳＫＬＶＬＲＣＥＴ ＳＳＥＹＳＳＬＲＦＫ ＷＦＫＮＧＮＥＬＮＲ ＫＮＫＰＥＮＩＫＩＱ ＫＫＰＧＫＳＥＬＲＩ ＮＫＡＳＬＡＤＳＧＥ ＹＭＣＫＶＩＳＫＬＧ（配列番号２）；
（ｃ）鳥類ＮＲＧ由来の、ＧＱＫＬＶＬＲＣＥＴ ＴＳＥＹＰＡＬＲＫＷ ＬＫＮＧＫＥＩＴＫＫ ＮＲＰＥＮＶＫＩＰＫ ＫＱＫＫＹＳＥＬＨＩ ＹＲＡＴＬＡＤＡＧＥ ＹＡＣＲＶＳＳＫＬＧ（配列番号３）；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の機能的誘導体またはホモログ、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。上記核酸分子は、配列番号４、配列番号５または（配列番号６）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み得る。
別の実施形態において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記の核酸分子のいずれかにハイブリダイズする、約１００ヌクレオチドより長くない単離核酸分子である。
本発明は、融合ポリペプチドをコードするハイブリッド核酸分子に関し、その分子は以下のものを含む：
（ａ）第１の核酸配列として、上記の核酸分子のいずれか；
（ｂ）必要に応じて、第１の核酸配列とインフレームで融合される、リンカーペプチドをコードするリンカー核酸配列；および
（ｃ）（ｉ）第１の核酸配列またはリンカー核酸配列にインフレームで連結され、そして（ｉｉ）第２のポリペプチドＰｔｒｇをコードする第２の核酸配列であって、Ｐｔｒｇは、好ましくはｅｒｂＢ４レセプターのＥＣＤを含み、そして融合ポリペプチドは、ＮＲＧアンタゴニストである、第２の核酸配列。
この融合ポリペプチドがＮ−ＨＢＤとＢ４Ｄとの間にリンカーまたはスペーサー配列Ｓをさらに含む場合、好ましいスペーサーは、配列番号１４の残基１３１〜１９５アミノ酸配列またはそれと相同な配列を有する、ニューレグリンの天然のアミノ酸スペーサーである。上記ポリペプチドと同じ物理学的特徴を提供することが当該分野において公知である他のスペーサー配列が、使用され得る。
（ａ）プロモーターおよび（ｂ）必要に応じて、真核生物細胞における上記核酸の発現を調節する、さらなる調節配列に作動可能に連結される上記核酸分子を含む、発現ベクターもまた、提供され、このベクターは、細胞へのインビトロまたはインビボでの送達の後に、その細胞中で発現され得る。好ましいベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである。
関連する実施形態は、ベクター組成物であり、この組成物は、以下：
（ａ）第１の組換え発現ベクターであって、該第１の組換え発現ベクターは、その核酸中に、Ｎ−ＨＢＤポリペプチドまたは該Ｎ−ＨＢＤの生物学的に活性なフラグメント、ホモログ、もしくは他の機能的誘導体をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を組み込んでいる、第１の組換え発現ベクター；および
（ｂ）第２の組換え発現ベクターであって、該第２の組換え発現ベクターは、その核酸中に、Ｂ４ ＥＣＤであるポリペプチドＰｔｒｇをコードするヌクレオチド配列を組み込んでいる、第２の組換え発現ベクター、
を含み、該発現ベクターは、宿主細胞を同時感染または同時トランスフェクトして、ＰｔｒｇおよびＮ−ＨＢＤポリペプチド、Ｎ−ＨＢＤフラグメント、Ｎ−ＨＢＤホモログ、またはＮ−ＨＢＤ誘導体の同時発現をもたらし得る。
ベクター組成物において、第１のベクターは、好ましくは配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６、またはそれらのホモログ、フラグメントもしくは機能的誘導体を含む。
本発明は、上記の核酸分子またはベクターのいずれかで形質転換された、またはトランスフェクトされた細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞を提供する。好ましい実施形態は、哺乳動物Ｎ−ＨＢＤポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体をコードする外来性核酸分子でトランスフェクトされ、そのポリペプチド、フラグメント、ホモログ、または誘導体が細胞によって発現される、単離哺乳動物細胞である。
上記の細胞において、外来性核酸分子は、好ましくは配列番号４、配列番号５、または配列番号６、またはそれらのホモログ、フラグメントもしくは機能的誘導体を含む。
上記の通り、本発明はまた、ハイブリッドポリペプチドまたは融合ポリペプチドに関し、第２の標的化されるポリペプチドＰｔｒｇは、好ましくはＢ４Ｄを含み、そして上記融合ポリペプチドは、ＮＲＧアンタゴニストである。この融合ポリペプチドは、Ｎ−ＨＢＤとＢ４Ｄとの間にリンカーまたはスペーサー配列Ｓをさらに含み、好ましいスペーサーは、配列番号１４の残基１３１〜１９５のアミノ酸配列、またはそれと相同な配列を有するＮＧＲの天然のアミノ酸スペーサーである。上記ポリペプチドと同じ物理学的特徴を提供することが当該分野において公知である他のスペーサー配列が、使用され得る。
上記の融合ポリペプチドまたはそのポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント、ホモログ、もしくは他の機能的誘導体は、好ましくは上記の発現ベクターまたはベクター組成物の組換え発現によって産生される。
上記の融合ポリペプチドにおいて、標的化ポリペプチドは、好ましくは配列番号１、配列番号２、または配列番号３、あるいはそのヘパリン結合機能的誘導体またはホモログのアミノ酸配列を有する。好ましい機能的誘導体は、配列ＫＷＦＫＮＧＮＥＬＮＲＫＮＫＰＱＮＩＫＩＱＫＫＰＧＫ（配列番号７）、ＫＷＦＫＮＧＮＥＬＮＲＫＮＫＰＥＮＩＫＩＱＫＫＰＧＫ（配列番号８）、またはＫＷＬＫＮＧＫＥＩＴＫＫＮＲＰＥＮＶＫＩＰＫＫＱＫＫ（配列番号９）を有するフラグメントである。
本発明の融合ポリペプチドは、好ましくはそのＣ末端にタグ配列をさらに含み得；好ましい例は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）配列である。
この融合ポリペプチドにおいてヘパラン硫酸結合領域、またはＮ−ＨＢＤの全てもしくは一部、またはホモログもしくは機能的誘導体は、好ましくは上記Ｂ４Ｄに対してＮ−末端に配置される。最も好ましい融合ポリペプチドは、以下の模式的構造（Ｎ−末端からＣ−末端まで）を有する：ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４Ｄ−ＨＡ（ここでＳは、スペーサー／リンカーであり、そしてＨＡは、タグである）。好ましくは、上記ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４Ｄ領域は、配列番号１３の配列を有する核酸分子によってコードされる。好ましい融合ポリペプチドにおいて、上記ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４Ｄ領域は、配列番号１４の配列を有する。
標的化されるポリペプチドを細胞または組織表面に送達するため、および該標的化されるポリペプチドの生物学的活性を増強するために有用な薬学的組成物もまた、提供され、上記薬学的組成物は、以下を含有する：（ａ）上記のＢ４Ｄ融合ポリペプチド；および（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリア。
別の実施形態において、本発明は、ＥＧＦ−レセプターのＮＲＧによる活性化および／またはＮＲＧによるこのようなレセプターを有する細胞の増殖の刺激を阻害する方法に関し、該方法は、ＮＲＧの結合および該レセプターの活性化を阻害する、上記のＢ４Ｄ融合ポリペプチドの有効量を、該レセプターまたは該細胞に提供する工程を包含する。
ＮＲＧシグナル伝達の阻害によって、処置可能な被験体における疾患または状態を処置するための方法もまた包含し、上記方法は、上記の薬学的組成物の有効量を該被験体に投与する工程を包含し、それによって、前記融合ポリペプチドのＢ４の生物学的活性は、ネイティブのＢ４Ｄまたは標的化ポリペプチドに融合されないＢ４Ｄの活性と比較して増加される。本発明は、腫瘍または癌を処置するのに特に有用である。
本発明の処置に対して特に影響を受け易い腫瘍または癌は、腫瘍の増殖または転移がＮＲＧ刺激のオートクライン「ループ」に依存するものであり、このオートクライン「ループ」は、代表的に、ＮＲＧを産生し、分泌し、そして同時に、このタンパク質に対して活性化されるレセプターを有する細胞において、持続されかつ連続的である。本発明の組成物に対して最も感受性であると考えられる腫瘍は、Ｎ−硫酸化、ならびに２Ｏ−硫酸化および６Ｏ−硫酸化されるＨＳを有する腫瘍である。例えば、Ｐａｎｋｏｎｉｎ ＭＳら、（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５ ２８０：３８３−８を参照のこと。
本開示および文献（以下を参照のこと）に基づいて、広範な種々の腫瘍細胞は、阻害され得、そして癌は、本発明によって処置され得る。これらの癌としては、いくつか例を挙げると、乳癌および卵巣癌、胃癌、食道癌および結腸癌、膵臓癌、神経膠腫および髄芽腫が挙げられる。
上記の融合ポリペプチドにおいて、存在する場合、上記リンカーは、プロテアーゼ（例えば、ＶＰＲＧＳＤ（配列番号１１）またはＤＤＫＤＷＨ（配列番号１２））によって切断可能なリンカーであり得る。
その融合ポリペプチドは、（ｉ）直接的に、または（ｉｉ）単量体リピート間に存在するリンカー配列によって、端と端とが連結された、第１の標的化ポリペプチドの単量体の２つ以上のリピートの直線状多量体であり得る。１つの例は、第２の標的化されるポリペプチドに融合した、第１の標的化ポリペプチドのタンデムに結合した二量体または三量体を含む。第２の「標的化される」ポリペプチドＰｔｒｇは、好ましくは、以下である：
（ａ）融合ポリペプチドの一部として、レセプターのリガンドに結合し、それによってレセプターのリガンド活性化のアンタゴニストとして作用し得る、細胞表面レセプターの可溶性形態；
（ｂ）融合ポリペプチドの一部として、レセプターに結合し、そしてそれによってレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用し得る、細胞表面レセプターのリガンド。
本発明はまた、標的化されるポリペプチドを細胞または組織表面に送達し、そして標的化されるポリペプチドの生物学的活性を増強するのに有用な薬学的組成物を提供し、該薬学的組成物は、以下を含有する：（ａ）上に記載される融合ポリペプチド；および（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリア。
上記の融合ポリペプチドをその表面に発現するか、または分泌する哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞もまた、提供される。
組換え細胞の表面に発現されるか、または組換え細胞によって分泌される形態である標的化されるポリペプチドを送達するのに有用な別の薬学的組成物は、（ａ）上に記載されるような細胞、および（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアを含有する。
本発明はさらに、標的化されるポリペプチドを、ヘパラン硫酸が豊富な細胞または組織表面に局在化し、そしてそれによって表面におけるその生物学的活性を増強する方法に関し、この方法は、上記の融合ポリペプチドを表面に提供する工程を包含し、それによって融合ポリペプチドのＰｔｒｇが表面に局在化され、その結果、Ｐｔｒｇの生物学的活性が、ネイティブのＰｔｒｇまたは標的化ポリペプチドと融合されないＰｔｒｇの活性と比較して増加される。上記ポリペプチドは、好ましくはインビボで提供される。優先的に標的化される細胞表面は、Ｎ−硫酸化ＨＳＰＧ、ならびに２Ｏ−硫酸化ＨＳＰＧおよび６Ｏ−硫酸化ＨＳＰＧが豊富な細胞表面である。
Ｐｔｒｇの作用によって処置可能な被験体における疾患または状態を処置する方法もまた、包含され、この方法は上記薬学的組成物の有効量を被験体に投与する工程を包含し、それによって融合ポリペプチドのＰｔｒｇの生物学的活性が、ネイティブのＰｔｒｇまたは標的化ポリペプチドと融合されないＰｔｒｇの活性と比較して増加され、それによって、上記疾患または上記状態を処置する。
Ｐｔｒｇの作用によって処置可能な被験体における疾患または状態を処置する方法は、上記の細胞の薬学的組成物の有効量を被験体に投与する工程を包含し得、それによってＰｔｒｇを有するかまたは分泌する細胞が細胞または組織表面で利用可能になり、そしてここで、Ｐｔｒｇの生物学的活性が、ネイティブのＰｔｒｇまたは標的化ポリペプチドと融合されないＰｔｒｇの活性と比較して増加され、それによって上記疾患または上記状態を処置する。
上記の通り、好ましい実施形態において、疾患または状態は、腫瘍または癌であり得る。別の実施形態において、疾患または状態は、神経学的障害（例えば、神経変性性疾患、多発性硬化症、脳卒中、てんかん、または外傷性脳、脊髄もしくは末梢神経の損傷）である。この方法によって処置可能な神経変性性疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症が挙げられる。
本発明者らは、ｅｒｂＢ４レセプターのＥＣＤの前（ＥＣＤのＮ末端）または後（ＥＣＤのＣ末端）のいずれかにＮＲＧのＨＢＤを有し、そしてその構築物を追跡し、そして精製するために赤血球凝集素（ＨＡ）タグを組み込まれた一連の４つの構築物を産生した。これらの４つのアンタゴニストに共通して、高い親和性でヘパリンに結合した組換えタンパク質は、ＮＲＧシグナル伝達のブロックに関して、最も強力なＮＲＧアンタゴニストであった。好ましいアンタゴニストは、ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡのように記載される融合ポリペプチドであり、これは、ＮＲＧのＨＢＤ、スペーサーＳ、ｅｒｂＢ４ ＥＣＤ（「Ｂ４」）、および必要に応じて、精製を容易にするためのインフルエンザＨＡ配列を融合する。好ましくは、この分子は、配列番号１３の配列を有する核酸分子によってコードされる。好ましくは、上記融合ポリペプチドは、配列番号１４の配列を有する。より一般的に、これらの結果は、ＮＲＧのＨＢＤドメインが、その組換えタンパク質をヘパラン硫酸が豊富なＥＣＭに対して標的化するための有用な手段として、他の組換えタンパク質に融合され得ることを示す。この概念は、特定の組織に対するタンパク質薬物の送達の新規な方法を提供し、この方法は、生物学的効果の顕著な強化、およびヘパリン非含有細胞に対する低い全体的な毒性を伴う。
（好ましい実施形態の説明）
ニューレグリン（ＮＲＧ）は、チロシンキナーゼのＥＧＦレセプターファミリーメンバーに結合し、そしてこれらを活性化し、それによってシグナル伝達カスケードを開始する。標的が神経筋シナプスのシナプス後膜である場合、この活性化の１つの結果はＡＣｈＲ合成の誘導である。レセプター結合およびチロシン自己リン酸化の原因であり、そしてそれに十分なＥＧＦ様ドメインに加えて、ＮＲＧの多くのスプライシングされた形態は、ＨＳＰＧに結合し、そしてシナプスでＮＲＧの高濃度を維持するＩＧ様ドメイン（＝Ｎ−ＨＢＤ）も有する。
本発明者は、Ｎ−ＨＢＤが、モデルシステムとして一次ヒヨコ筋管において、ＡＣｈＲ遺伝子発現の誘導を可能にするために、ＥＧＦ様ドメインを十分高濃度に十分長い間隔をおいて維持するように機能することを発見した。Ｎ−ＨＢＤありまたはなしの組換えＮＲＧを用いて、内因性ＨＳＰＧへのＮ−ＨＢＤの結合は、レセプターリン酸化の４倍増加を引き起こすことが発見され、その効果は可溶性ヘパリンによって、または酵素ヘパリチナーゼによる筋細胞の前処理によってブロックされた。少なくとも１２〜２４時間のＮＲＧ曝露が、実質的なＡｃｈＲ遺伝子発現を開始させるために必要であり、そしてｅｒｂＢレセプターがこの時間にリン酸化され続けていることが重要であることが見出された。持続するｅｒｂＢレセプター活性の必要性が、なぜＮＲＧがシナプスのＥＣＭでそれほど高度に集中しているのかを説明する。
これらの観察に基づいて、本発明者は、現在公知であるか、または後に発見されるかにかかわらず、そのドメインが融合しているあらゆるタンパク質またはポリペプチドを、そのドメインのあらゆる結合パートナーが豊富な部位へ標的化する、ＮＲＧのＮ−ＨＢＤのより広い有用性を考えた。主にそのような部位は、ＨＳＰＧが発現される細胞表面およびＥＣＭであることが公知である。
（一般的な参考文献）
他に示さない限り、本発明の多くの局面の実施は、分子生物学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来の技術を採用し、それは当該分野の技術の範囲内である。そのような技術は、科学的文献、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、最新巻；Ａｌｂｅｒｓ，Ｂ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第２版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８９）；Ｌｅｗｉｎ，ＢＭ、Ｇｅｎｅｓ ＩＶ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９０）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、第２版、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２；Ｄａｒｎｅｌｌ，ＪＥら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８６）；Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．ら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ（１９８１）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ＆ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、最新版）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、最新版）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、最新版）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ編、１９８７）；Ｈａｒｔｌｏｗ，Ｅ．ら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８８）；Ｃｏｌｉｇａｎ，ＪＥら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１においてより詳細に記載されている。タンパク質の構造および機能が、Ｓｃｈｕｌｚ，ＧＥら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，ＴＥ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９８３において議論されている。
１つの実施形態において、ヒトまたは他の哺乳動物由来のＮ−ＨＢＤに対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが使用される。好ましいＤＮＡ配列は、以下のものである：
Figure 0004955548
 好ましくは、これは、ＰＣＲを用いて、（細胞表面またはＥＣＭへ）標的化されるポリペプチドまたはペプチド（「Ｐｔｒｇ」）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに結合しており、Ｎ−ＨＢＤ−Ｐｔｒｇ融合ポリペプチドとして発現される構築物を形成する。オリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ、細胞の形質転換、ベクターの構築、発現システム等の、Ｎ−ＨＢＤ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡの構築および発現のための技術は、当該分野で十分に確立されている。当業者は、標準的な資源材料、特定の条件および手順を熟知している。
ＮＲＧ ＨＢＤ（その天然の「スペーサー」を含む）とＰｔｒｇとしてのｅｒｂＢ４ ＥＣＤ（Ｂ４）とを組み合わせる構築物をコードする核酸配列が、下に配列番号１３として示される。これは、（コードされるドメインなどに関して）以下のような注釈が付けられる：シグナル配列：小文字、下線付き、ＨＢＤ：二重下線を引かれた太字のイタリック体であるスペーサー（ヌクレオチドの３８５〜５７９）を含む太字（これはＮＲＧの「天然の」スペーサーである）、ＨＢＤの後；クローニングに由来する外部配列（小文字のイタリック体）；ｅｒｂＢ４ ＥＣＤ（太字、残基２００〜８２２；Ｂ４：強調されている（大文字、イタリック体ではない、下線を引いていない）。
Figure 0004955548
 上記の配列番号１３の翻訳されたアミノ酸配列は、配列番号１４として下に示される。これは、以下のように注釈を付けられるシグナル配列、ＨＢＤ、スペーサー（Ｓ）およびｅｒｂＢ４ ＥＣＤ（Ｂ４）を含む：シグナル配列：イタリック体（残基３〜２７）；ＨＢＤ−下線付き（残基３１〜１９５）、特に、形態が２つのＣｙｓ残基の間のある形態のループ（Ｃ７５〜Ｃ１５０に太字および下線付きで示される）；二重下線を引かれた太字のイタリック体であるスペーサー（残基１３１〜１９５）−これは、まさにＨＢＤに対するネイティブのＮＲＧのＣ−末端に見出される「ネイティブのスペーサー」である；アミノ酸１９６〜１９９のクローニングに由来する外部配列（小文字）；ｅｒｂＢ４ ＥＣＤ残基２００〜８２２。
Figure 0004955548
 （発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明は、少なくとも１つの調節配列と作動可能に連結された、ＩＧドメイン融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む。「作動可能に連結された」は、コード配列が、コード配列の発現を可能にする様式で調節配列に結合していることを意味する。公知の調節配列が、適切な宿主細胞における所望のタンパク質の発現を指示するために選択される。従って、用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、（１９９０）において記載されている。当業者は、本発明の発現ベクターの特定の設計が、トランスフェクトされる宿主細胞および／または発現されるタンパク質の型のような考慮すべき事柄に依存することを理解する。
本発明の発現ベクターは、融合タンパク質に含まれる場合に、Ｎ−ＨＢＤの様々な実施形態をコードする核酸分子の全範囲：全長ドメイン、およびより短いポリペプチドフラグメント、変異体などを含むその機能的誘導体（本明細書中で定義される）を含む。従って、１つの実施形態において、発現ベクターは、少なくとも単独または別のポリペプチドに融合したＮ−ＨＢＤの一部をコードする核酸を含む。
そのような発現ベクターが使用されて、ＤＮＡの発現および融合ポリペプチドを含むコードされたタンパク質の産生のために、宿主細胞がトランスフェクトされる。Ｎ−ＨＢＤポリペプチドを発現する遺伝的に改変された細胞は、細胞がその述べられた目的のために有用であるために十分な時間、外来性ＤＮＡを一時的に発現し得ることが理解される。従って、その細胞がインビボで融合ポリペプチドの産生供給源または送達媒体として作用する場合、発現の持続時間、または細胞が生存したままである時間は、細胞がその産生／送達機能を発揮するのに必要な時間である。例えば、Ｎ−ＨＢＤ融合ポリペプチドの発現は、６時間の短さ、好ましくは２４時間、より好ましくは少なくとも２〜４日間であり得る。当然に、発現はまた、安定であり得る（すなわち、細胞の寿命の間）。本明細書中で議論される適切な発現ベクターおよび調節エレメント（例えば、誘導的または構成的プロモーター）は、発現の望ましい持続時間に従って選択される。
Ｎ−ＨＢＤポリペプチドおよび機能的誘導体を産生する方法もまた、提供される。例えば、少なくともＮ−ＨＢＤポリペプチドの一部を含む発現可能な融合ポリペプチドをコードする核酸ベクターでトランスフェクトした宿主細胞は、適切な条件下で培養されて、融合ポリペプチドの発現を可能にする。
宿主細胞はまた、宿主細胞が両方の部分を含む融合ポリペプチドを産生するように、少なくともＮ−ＨＢＤタンパク質の一部をコードするＤＮＡおよび少なくとも２番目のタンパク質（Ｐｔｒｇ）の一部をコードするＤＮＡを、単独でまたは組み合せて含む、１つ以上の発現ベクターでトランスフェクトされ得る。組換え発現ベクターが、Ｎ−ＨＢＤの一部をコードするＤＮＡおよびＰｔｒｇをコードするＤＮＡを含む場合、得られる融合ポリペプチドは、変化した可溶性、結合親和性および／または結合価を有し得る。Ｎ−ＨＢＤ融合ポリペプチドは、好ましくは培養物中のトランスフェクトされた宿主細胞によって分泌され、そしてそのために培養培地から単離される。あるいは、タンパク質が細胞質に保持される場合、その細胞は、溶解され得、そしてタンパク質がこの溶解物から単離され得る。
培養は、代表的には宿主細胞、適切な増殖培地、および他の副産物を含む。適切な培養培地は、当該分野で周知である。Ｎ−ＨＢＤタンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、分画カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィーなど）および／または電気泳動を含む、タンパク質およびペプチドを精製する従来の技術を用いて、培地または細胞溶解物から単離され得る。一般的に、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２２：２３３−５７７（１９７１）を参照のこと。一旦部分的にまたは均一にまで精製されると、本発明の組換えＮ−ＨＢＤ融合ポリペプチドは、本明細書中でより詳細に記載されるように、薬学的組成物において利用され得る。
Ｎ−ＨＢＤまたはその機能的誘導体、好ましくは融合ポリペプチドを発現するように形質転換またはトランスフェクトされた原核または真核の宿主細胞は、本発明の範囲内である。例えば、Ｎ−ＨＢＤは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを使用する）、酵母、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞のような哺乳動物細胞で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、前出において見出され得るか、またはそうでなければ当業者に公知である。真核細胞における発現は、組換えタンパク質の部分的または完全な糖鎖付加および／または関連する鎖間または鎖内ジスルフィド結合の形成を引き起こす。
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、およびｐＹＥＳ２が挙げられる。培養昆虫細胞（ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現のためのバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ、およびｐＶＬシリーズが挙げられる。一般的に、ＣＯＳ細胞は、ｐＣＤＭ８のようなベクターと組み合せて、哺乳動物細胞における一時的な増幅／発現のために使用され、一方ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−陰性ＣＨＯ）細胞は、ｐＭＴ２ＰＣのようなベクターと共に、哺乳動物細胞における安定な増幅／発現のために使用される。ＮＳ０骨髄腫細胞株（グルタミンシンセターゼ発現系）が、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｔｄ．から入手可能である。
融合発現ベクターにおいて、融合パートナー（例えば、レポーターグループおよび標的タンパク質の場合において）の精製に続いて、融合パートナーの分離を可能にするために、タンパク質分解切断部位を、融合パートナー配列の結合部に導入する。そのような切断のためのタンパク質分解酵素およびそれらの認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。これらは下記でより議論される。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、標的組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が挙げられる。誘導性非誘導発現ベクターとしては、ｐＴｒｃおよびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８５：６０−８９）。
本発明の１つの実施形態は、新規Ｎ−ＨＢＤ融合ポリペプチドをデノボで発現する、トランスフェクトされた細胞である。Ｎ−ＨＢＤを既に発現している細胞の場合、本発明は、増加した量のＮ−ＨＢＤポリペプチドまたは機能的誘導体（下記で定義する）を発現する、トランスフェクトされた細胞を提供する。本発明の核酸構築物を、パラクリン放出および発現細胞自身へのまたは標的化される他の付近の細胞に結合する目的のために、細胞（またはインビボで増殖する腫瘍）で発現し得る。例えば、肉腫、黒色腫、白血病、リンパ腫、癌腫または神経芽腫のような腫瘍細胞を、腫瘍細胞表面でＮ−ＨＢＤまたは融合ポリペプチドの発現を指示する発現ベクターでトランスフェクトする。そのようなトランスフェクトされた腫瘍細胞を、ＨＳＰＧが豊富な部位へ向け得る。さらに、その表面にＮ−ＨＢＤおよび免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦなど）を同時発現する細胞は、腫瘍部位でのサイトカインの作用を増強し得る。
腫瘍細胞は、その転移可能性と関連する、異なる量のＨＳＰＧを発現することが知られている。ＨＳＰＧ発現とＨＳＰＧを分解する酵素との間のバランスが、その増殖および転移に大きく影響を与え得る。例えば、ＭＣＦ−７細胞のへパラナ−ゼによる前処理は、ＦＧＦ誘導細胞増殖をブロックし、一方、通常２倍量の細胞表面ＨＳＰＧを産生するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の塩素酸塩処理は、ＦＧＦに対するその反応性を促進する（Ｄｅｌｅｈｅｄｄｅ，Ｍら、１９９６、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２２９：３９８−４０６）。ＦＧＦはヘパリンに結合し、そしてＨＳＰＧによって密接に調節されることが知られているので、これは、ＦＧＦ反応性とＨＳＰＧ発現レベルとの間に密接な関連を示唆する。さらに、最近腫瘍細胞の転移可能性を、内因性へパラナ−ゼの発現によって大きく増強し得ること（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ，Ｉ．ら、１９９９、Ｎａｔ Ｍｅｄ ５：７９３−８０２）、転移腫瘍において顕著なＨＳＰＧ，シンデカン−１のレベルが抑制されること（Ｓｔａｎｌｅｙ，ＭＪら、１９９９、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １１２：３７７−３８３）、および低分子量ヘパリン化合物が実際内因性へパラナ−ゼをブロックすることによって黒色腫細胞の転移可能性を抑制し得ること（Ｍｉａｏ，ＨＱら、１９９９、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３：４２４−４３１）が示された。前述のことを考慮して、本発明は、ペプチドまたはポリペプチドをＨＳＰＧに差次的に標的化するために使用される。
（ベクター構築物）
所望のコード配列および制御配列を含む適切なベクターの構築は、当該分野で慣習的な標準的な連結および制限酵素技術を採用する。単離プラスミド、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドは、望ましい形態に切断、調整、および再連結される。ベクターを形成するＤＮＡ配列は、多くの供給源から入手可能である。土台のベクターおよび制御システムは、一般的に構築物中の配列の大部分に使用される、利用可能な「宿主」ベクターに見出される。適切なコード配列のために、最初の構築は、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーから適切な配列を回収する問題であり得、そして通常そうである。しかし、配列が一旦開示されると、個々のヌクレオチド誘導体から始めて、インビトロでその配列を合成することが可能である。かなり長い、例えば５００〜１０００ｂｐの遺伝子の遺伝子配列全体を含む核酸は、個々の重複する相補的オリゴヌクレオチドを合成し、そしてｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いて一本鎖の重複していない部分を埋めることによって調製され得る。このアプローチを、公知の配列のいくつかの遺伝子の構築に首尾よく使用した。例えば、Ｅｄｇｅ，ＭＤ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ，Ｋ．Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；およびＪａｙ，Ｅ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８４）２５９：６３１１を参照のこと。
合成オリゴヌクレオチドは、上記で引用した参考文献によって記載されたようなホスホトリエステル法、またはＢｅａｕｃａｇｅ，ＳＬら、（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９；およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ，ＭＤら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ（１９８１）１０３：３１８５によって記載されたようなホスホルアミダイド法のいずれかによって調製され、そして市販で入手可能な自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製され得る。アニーリング前または標識化のための、一本鎖のキナーゼ処理は、過剰なポリヌクレオチドキナーゼを用いて達成される。望ましいベクターの構成成分が一旦このように利用可能になれば、それらは標準的な制限および連結手順を用いて切除および連結され得る。部位特異的ＤＮＡ切断は、当該分野で一般的に理解される条件下で適当な制限酵素（または複数の酵素）で処理することによって行われ、その詳細は、これらの市販で入手可能な制限酵素の製造会社によって明細に述べられる。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃａｔａｌｏｇを参照のこと。一般的に、約１ｍｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列は、約２０ｍｌの緩衝溶液中１ユニットの酵素によって切断される；本明細書中の実施例において、代表的には、過剰の制限酵素を用いて、ＤＮＡ基質の完全な消化が、保証される。約３７℃で約１時間から２時間のインキュベーション時間が実行可能であるが、変動が許容され得る。各インキュベーションの後に、フェノール／クロロホルムによる抽出によってタンパク質が除去され、そして次にエーテル抽出を行われ得、そして核酸は、エタノールによる沈殿によって水性画分から回収される。所望される場合、切断フラグメントのサイズ分離が、標準的な技術を用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動またはアガロースゲル電気泳動によって行われ得る。サイズ分離の一般的な記載は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）６５：４９９−５６０において見出され得る。制限切断フラグメントは、公知のインキュベーション時間ならびにｄＮＴＰ、塩および緩衝液の濃度を用いて、４つのｄＮＴＰの存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメント（クレノウ）で処理することによって、平滑末端であり得る。所望される場合、突出部の性質によって規定される制限内で、１つだけの、または選択されたｄＮＴＰを供給することによって、選択的な修復が行われ得る。クレノウによる処理の後、混合物が抽出され、そしてエタノール沈殿される。Ｓ１ヌクレアーゼまたはＢＡＬ−３１による適当な条件下での処理は、あらゆる一本鎖部分の加水分解を引き起こす。連結は、標準的な条件および温度下で行われる。分子間「付着末端」連結を、通常３３〜１００μｇ／ｍｌの全ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭの全最終濃度）で行なう。分子間平滑末端連結は、１ｍＭの全最終濃度で行われ得る。「ベクターフラグメント」を採用するベクター構築において、５’リン酸を除去し、そして自己連結を防ぐために、フラグメントは、通常、細菌アルカリホスファターゼまたは子牛腸アルカリホスファターゼで処理される。消化は、ｐＨ８で行われ、そして調製物は、フェノール／クロロホルムで抽出され、そしてエタノール沈殿される。
多くの方法のいずれかが使用されて、コード配列に変異が導入され、本発明の望ましいアミノ酸配列改変体を産生する。これらの変異としては、単純な欠失または挿入、合成的欠失、塩基の集団の挿入または置換、あるいは単一塩基の置換が挙げられる。例えば、Ｎ−ＨＢＤ ＤＮＡ配列（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）の改変は、部位特異的突然変異生成、プロトコールおよび試薬が市販されている周知の技術によって作成する（Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪら、（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １０：６４８７−６５００およびＡｄｅｌｍａｎ，ＪＰら、（１９８３）ＤＮＡ ２：１８３−１９３）。従来の方法を用いて、プラスミド構築の方法に依存して、抗生物質（例えば、アンピシリン、テトラサイクリンなど）耐性遺伝子のような選択マーカーの存在に基づいて形質転換体が選択される。次いで任意のクロラムフェニコール増幅を用いて、プラスミドが形質転換体から調製される（Ｃｌｅｗｅｌｌ，ＤＢら、（１９６９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６２：１１５９；Ｃｌｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｂ．、（１９７２）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １１０：６６７）。いくつかのミニＤＮＡプレップが通常使用される。例えば、Ｈｏｌｍｅｓ，ＤＳら、（１９８１）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１４：１９３−１９７；Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，ＨＣら、（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ７：１５１３−１５２３を参照のこと。単離ＤＮＡを、制限によって分析し、そして／またはジデオキシヌクレオチド法（Ｓａｎｇｅｒ、（１９７７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４：５４６３；Ｍｅｓｓｉｎｇら、（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ９：３０９）によってか、またはＭａｘａｍら、（１９８０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５：４９９の方法によって配列決定する。
ベクターＤＮＡは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションのような従来の技術によって、哺乳動物細胞に導入され得る。宿主細胞を形質転換する適当な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出および他の標準的な教科書において見出され得る。
（プロモーターおよびエンハンサー）
ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして「作動可能に連結された」核酸配列の転写を促進する。本明細書中で使用される「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるＤＮＡまたはＲＮＡのその鎖に見出されるプロモーターのヌクレオチド配列である。プロモーターおよびコード配列のような、核酸分子の２つの配列は、それらが、両方の配列が同じＲＮＡ転写物に転写されることを可能にする、または１つの配列から始まったＲＮＡ転写物が２番目の配列に延長されることを可能にする方式でお互いに連結している場合に、「作動可能に連結」される。従って、ＤＮＡまたはＲＮＡのプロモーター配列およびコード配列のような２つの配列は、プロモーター配列における転写開始が、作動可能に連結したコード配列のＲＮＡ転写物を産生する場合、作動可能に連結されてる。「作動可能に連結」されるために、２つの配列が直線状の配列でお互いにすぐに隣接している必要はない。
本発明の好ましいプロモーター配列は、哺乳動物細胞で作動可能でなければならず、そして真核生物プロモーターまたはウイルスプロモーターのいずれかであり得る。適当なプロモーターは、誘導的、抑制的または構成的であり得る。構成的プロモーターの例は、ウイルスプロモーターＭＳＶ−ＬＴＲであり、それは様々な細胞型で有効および活性であり、そしてほとんどの他のプロモーターと対照的に、休止細胞および増殖細胞で同じ増強活性を有する。他の好ましいウイルスプロモーターとしては、ＣＭＶ−ＬＴＲ（サイトメガロウイルス由来）（Ｂａｓｈａｒｔ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１（１９８５））、またはＲＳＶ−ＬＴＲ（ラウス肉腫ウイルス由来）（Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６７７７（１９８２））に存在するものが挙げられる。マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８（１９８２））；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．、Ｃｅｌｌ ３１：３５５−３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０（１９８１））；および酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＳＡ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５（１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５（１９８４））も有用である。転写因子のプロモーター領域との関連した転写因子ならびにそれらの分離した活性化およびＤＮＡ結合の、他の実例となる記載は、Ｋｅｅｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）２３１：６９９；Ｆｉｅｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４０：２４５；Ｊｏｎｅｓ、Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：９；Ｌｅｗｉｎ、Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：１１６１；Ｐｔａｓｈｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４６：３２９；Ａｄａｍｓら、Ｃｅｌｌ（１９９３）７２：３０６を含む。これら上記で列挙した参考文献の全ての開示は、本明細書中に参考として援用される。
プロモーター領域は、特定の組織において見出される特定のタンパク質と相互作用することによって、組織特異的エンハンサーとしても機能し得る８量体領域をさらに含み得る。本発明のＤＮＡ構築物のエンハンサードメインは、トランスフェクトされる標的細胞に特異的なものであるか、またはそのような標的細胞の細胞因子によって高度に活性化される。ベクター（プラスミドまたはレトロウイルス）の例は、Ｒｏｙ−Ｂｕｒｍａｎら、米国特許第５，１１２，７６７号において開示される。エンハンサーおよびその転写における作用の一般的な議論に関しては、Ｌｅｗｉｎ，ＢＭ、Ｇｅｎｅｓ ＩＶ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９０）、５５２−５７６頁を参照のこと。レトロウイルスエンハンサー（例えば、ウイルスＬＴＲ）が特に有用である。エンハンサーは、好ましくは、それが相互作用して遺伝子発現を刺激するプロモーターから上流に位置する。レトロウイルスベクターと使用するために、内因性ウイルスＬＴＲは、エンハンサーをなくされ、そして組織特異性または本発明のＤＮＡ分子に対する転写効率のような他の望ましい性質を与える他の望ましいエンハンサー配列で置換され得る。
本発明の核酸配列はまた、標準的な技術を用いて化学的に合成され得る。ペプチド合成のように、市販されているＤＮＡ合成機で完全に自動化された、固相合成を含む、ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する様々な方法が公知である（例えば本明細書中で参考として援用される、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，５９８，０４９号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４，４５８，０６６号；およびＩｔａｋｕｒａ、米国特許第４，４０１，７９６および４，３７３，０７１号を参照のこと）。
ハイブリダイゼーションは、好ましくは「ストリンジェントな条件」下で行われ、それは（１）洗浄のために低いイオン強度および高い温度、例えば５０℃で０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを採用すること、または（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドのような変性剤、例えば、４２℃で０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、ｐＨ６．５の５０ｎＭのリン酸ナトリウム緩衝液を含む、５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のホルムアミドを採用することを意味する。別の例は、４２℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中の洗浄を伴う、４２℃で５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６／８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理サケ***ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストランの使用である。さらに別の例は、５５℃で１０％の硫酸デキストラン、２×ＳＳＣおよび５０％のホルムアミドの緩衝液を用いたハイブリダイゼーション、続いて５５℃でＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェントな洗浄である。
（タンパク質およびポリペプチド）
本発明は、以下の配列：
Figure 0004955548
 を有するヒトＮＲＧ由来の「単離」Ｎ−ＨＢＤポリペプチド、または好ましくはこの配列を含む融合ポリペプチドを含み、この融合ポリペプチドは、ネイティブのＮＲＧタンパク質として解釈されるべきではない。
配列番号１の好ましいサブフラグメントは、塩基性アミノ酸が豊富なフラグメント：ＫＷＦＫＮＧＮＥＬＮＲＫＮＫＰＱＮＩＫＩＱＫＫＰＧＫ（配列番号７）であり、それは、その電荷に起因して、配列番号７を含むポリペプチドまたは融合ポリペプチドが、標的化されることを意図する、酸性ヘパラン硫酸に対して比較的高い親和性を有する。
ラットＮＲＧ中のラットＮ−ＨＢＤホモログのアミノ酸配列は、以下：
Figure 0004955548
 である。
上記配列の好ましいフラグメントは、塩基性アミノ酸が豊富なフラグメント：ＫＷＦＫＮＧＮＥＬＮＲＫＮＫＰＥＮＩＫＩＱＫＫＰＧＫ（配列番号８）であり、それは配列が、標的化されることを意図する、塩基性ヘパラン硫酸に対して比較的高い親和性を有する。
相同的ニワトリ配列が、本明細書中の実施例において本発明者によって使用された。ニワトリＮＲＧのＮ−ＨＢＤは、以下：
Figure 0004955548
 である。
ヒト配列およびラット配列と同様に、上記配列の好ましいフラグメントは、塩基性アミノ酸が豊富なフラグメント：ＫＷＬＫＮＧＫＥＩＴＫＫＮＲＰＥＮＶＫＩＰＫＫＱＫＫ（配列番号９）である。
別の好ましい機能的誘導体は、配列Ｋ−ｘ−ｘ−Ｋ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−Ｋ−ｘ−Ｋ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｋ−ｘ−ｘ−Ｋ−Ｋ−ｘ−ｘ−Ｋ（配列番号１０）を有するポリペプチドであり、ここでｘはあらゆるアミノ酸であるか、または少なくとも４つ、好ましくは少なくとも６つのＬｙｓ残基および／またはＡｒｇ残基を含む配列番号１０のフラグメントである。
本開示は、タンパク質レベルおよびＤＮＡレベルにおける、全長ニワトリＮＲＧのフラグメント、すなわちＮ−ＨＢＤおよびＥＧＦ様ドメインの使用を例示するが、ニワトリ配列のヒトホモログ（例えば配列番号１および７、ならびに他の哺乳動物種由来のＮ−ＨＢＤおよび本明細書中で開示される特徴を有するその変異体）は、本発明の範囲内であると意図されることが理解される。
Ｎ−ＨＢＤの「機能的誘導体」も含まれ、それはＮ−ＨＢＤのアミノ酸置換改変体（＝変異体）、「フラグメント」または「化学的誘導体」を意味し、その用語は下記で定義される。機能的誘導体は、測定可能なＮ−ＨＢＤ活性、好ましくは溶液中のヘパリン、ヘパラン硫酸またはＨＳＰＧ、あるいは細胞表面上またはＥＣＭ調製物中のＨＳＰＧに結合する活性を保持し、それは本発明による誘導体の有用性を可能にする。
「機能的誘導体」は、その用語が本明細書中で接合的にまたは代替的に使用されるかどうかに関わらず、変異体、「改変体」および「フラグメント」を包含する。
機能的ホモログは、上記の生化学的活性および生物学的活性を有していなければならない。この機能的特徴付けを考慮して、まだ発見されていないポリペプチドを含む、他の種由来の相同的Ｎ−ＨＢＤポリペプチドを使用することは、これらのポリペプチドが配列類似性ならびに列挙した生化学的活性および生物学的活性を有する場合、本発明の範囲内に含まれる。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、最適な整列のために、１番目および２番目のアミノ酸もしくは核酸配列の１つまたは両方にギャップを導入し得、そして非相同的配列を比較目的のために無視し得る）。整列の好ましい方法において、Ｃｙｓ残基を整列させる。
好ましい実施形態において、比較する配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％である。例えば、２７６アミノ酸残基を有するヒトＮ−ＨＢＤアミノ酸配列（配列番号２）に対して２番目の配列を整列させる場合、少なくとも８３アミノ酸残基、好ましくは少なくとも１１０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１３８アミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも１６６アミノ酸残基、そしてさらにより好ましくは少なくとも１９３アミノ酸残基、２２１アミノ酸残基、または２４８アミノ酸残基を整列させる。次いで対応するアミノ酸位置（またはヌクレオチド位置）のアミノ酸残基（またはヌクレオチド）を比較する。１番目の配列における位置が、２番目の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基（またはヌクレオチド）によって占められている場合、その分子はその位置において同一である（本明細書中で使用されるアミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性パーセントは、その２つの配列の最適な整列のために導入する必要のある、ギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れて、その配列によって共有される同一な位置の数の関数である。
配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ加重、および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを用いて決定される。さらに別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ加重および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）のＧＡＰプログラムを用いて決定される。別の実施形態において、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれた、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを用いて決定される。
本発明のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はさらに、「質問配列」として使用されて、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定するために、公共のデータベースに対して検索を行われ得る。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行われ得る。例えば、ヒトまたはニワトリＨ−ＮＢＤ核酸分子に対して相同的なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行われ得る。本発明のヒトまたはマウスＮ−ＨＢＤタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行われ得る。比較目的のためにギャップを導入した整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２で記載されたように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。ワールドワイドウェブサイトｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
このように、上で記載したＮ−ＨＢＤタンパク質のホモログは、（ａ）参照Ｎ−ＨＢＤポリペプチドの機能的活性、および（ｂ）上記で決定された場合に、少なくとも約３０％（アミノ酸レベルで）、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の、参照Ｎ−ＨＢＤポリペプチド（例えば、配列番号１）に対する配列類似性を有するとして特徴付けられる。
Ｎ−ＨＢＤの開示された配列および隣接のヌクレオチド配列を含む公開されたＮＲＧの全長配列に基づくＤＮＡプローブを用いて、そのようなポリペプチドを得ること、および発現することは、当該分野の技術の範囲内である。次いで、そのポリペプチドの生化学的活性および生物学的活性は、本明細書中で記載されたもののような、当該分野で認識された方法、例えば、細胞表面およびＥＣＭに結合しているＨＳＰＧのヘパラン硫酸成分の認識による細胞またはＥＣＭへの結合を用いて、容易に試験され得る。そのような結合は、そのホモログが「機能的」ホモログとして適格であるために必要な活性を有するかどうかを示す。
好ましいアッセイは、合成リガンドヘパリンへの結合によって「模擬」され得るか、またはその「天然」リガンドヘパラン硫酸への結合を測定することによって評価され得る、Ｎ−ＨＢＤの機能的特徴を測定する。本明細書中で例示されるように、Ｎ−ＨＢＤ（またはその融合ポリペプチド）の、例えば、筋細胞上におけるその天然リガンドへの結合は、結合しているポリペプチド、すなわちＮＲＧのＥＧＦ様ドメインが、チロシンキナーゼレセプター（ｅｒｂＢ４）によってシグナルを伝達することを可能にする。あらゆる関連する下流の事象は、生化学的手法（例えばリン酸化）によってか、または細胞アッセイによってか、あるいは生理学的アッセイまたは薬理学的アッセイのいずれかによって測定され得る。上記で述べたように、そのような筋細胞への結合は、α−ＡＣｈＲサブユニットへの切り換えおよび電位依存性ナトリウムチャネルの発現を誘導することによって、ＡＣｈＲの胎児形態から成人形態への変化を促進する。さらに、Ｎ−ＨＢＤまたは機能的誘導体を含む本発明の遺伝子操作した融合タンパク質に関して、融合パートナー（本明細書中で定義されるＰｔｒｇ）の作用を測定するために適当なあらゆるアッセイが、使用され得る。
本明細書中で記載された、全てのポリペプチド、融合ポリペプチド、またはペプチド模倣物および多量体ペプチドを含む他の機能的誘導体および化学的誘導体は、好ましくはインビトロアッセイでネイティブのＮ−ＨＢＤの少なくとも約２０％の活性を有する。あるいは、またはそれに加えて、これらの誘導体は、細胞全体、細胞画分、単離標的分子またはヘパリンを用いた結合アッセイで試験される場合に、リガンドまたは結合パートナー（好ましくは、ヘパリンまたはＨＳまたはＨＳＰＧ）への結合に関して、標識Ｎ−ＨＢＤポリペプチドと競合するべきである（ＩＣ５０≦１０μＭ、より好ましくは≦１μＭで）。
Ｎ−ＨＢＤの変異体または「改変体」は、全タンパク質またはそのフラグメントのいずれかに対して本質的に同一の分子を指し、それにおいて１つ以上のアミノ酸残基が置換されている（置換改変体）か、またはそれは１つまたはいくつかの残基が欠失（欠失改変体）もしくは付加している（付加改変体）。Ｎ−ＨＢＤの「フラグメント」は、分子のあらゆるサブセット、好ましくはＥＣＤを含むもの、すなわち全長タンパク質のより短いポリペプチドを指す。
多くの処理が使用されて、単離ＤＮＡ配列のフラグメント、変異体および改変体を産生し得る。例えば、１〜３０塩基長の、Ｎ−ＨＢＤタンパク質をコードする核酸の小さなサブ領域またはフラグメントは、標準的な化学的合成によって調製され得る。
（融合ポリペプチドおよびリンカーまたはスペーサー）
上記で述べたように、好ましい機能的誘導体は、融合タンパク質、Ｐｔｒｇに融合または結合したＮ−ＨＢＤの機能的フラグメントを含む融合ポリペプチドである。
Ｎ−ＨＢＤまたは誘導体を、当該分野で公知のあらゆる型のリンカー部分、例えば一連のＧｌｙ残基、様々なアミノ酸を含むペプチドリンカー、または化学的架橋部分によって、Ｐｔｒｇに結合し得る。好ましいリンカーは、Ｐｔｒｇが標的化される細胞表面またはＥＣＭの付近、例えば腫瘍部位において存在し、そして活性な酵素によって切断可能なものである。その酵素が融合ポリペプチドに作用した場合、治療的ＰｔｒｇからＮ−ＨＢＤが放出される。好ましい酵素は、マトリックスメタロプロテアーゼ、ウロキナーゼ、カテプシン、プラスミン、またはトロンビンであり、それらは腫瘍環境において作用してインビボ（またはインサイチュ）でＰｔｒｇを放出し得る。この型の好ましいリンカーは、配列ＶＰＲＧＳＤ（配列番号１１）またはＤＤＫＤＷＨ（配列番号１２）を有するペプチドである。
好ましいスペーサーは、Ｎ−ＨＢＤのＣ末端にある天然のＮＲＧスペーサー（例えば、配列番号１４のアミノ酸残基１３１〜１９５）、またはそのホモログもしくは機能的誘導体である。
（マルチドメインおよび多量体ペプチド融合タンパク質）
本発明はまた、Ｎ−ＨＢＤまたはその改変体の配列から得られた「ユニット」ペプチド配列が、介在するスペーサーまたはリンカーありまたはなしで、約２回から約１００回反復する、より長いポリペプチドを含む。
この項でＨＢＤと記号的に呼ばれるペプチドの多量体を、以下の式によって示す：
（ＨＢＤ−Ｘｍ）ｎ−ＨＢＤ ここでｍ＝０または１、ｎ＝１〜１００。Ｘは１〜２０個のグリジン残基からなるスペーサーグループであり、上記で記載されたようなペプチドリンカー、または化学的架橋分子である。
そのような多量体の好ましいＨＢＤユニットは、ＫＷＦＫＮＧＮＥＬＮＲＫＮＫＰＱＮＩＫＩＱＫＫＰＧＫ 配列番号７、またはその機能的フラグメントである。
別の好ましい機能的誘導体は、配列Ｋ−ｘ−ｘ−Ｋ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−Ｋ−ｘ−Ｋ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｋ−ｘ−ｘ−Ｋ−Ｋ−ｘ−ｘ−Ｋ（配列番号１０）を有するポリペプチドであり、ここでｘはあらゆるアミノ酸であり、または少なくとも６つのＬｙｓ残基またはＡｒｇ残基を含む配列番号１０のフラグメントである。上記のポリペプチドのより一般的なバージョンにおいて、あらゆる塩基性アミノ酸残基が、配列番号１０のＬｙｓまたはＡｒｇによって占められる位置で置換し得る。
多量体の基礎のサブユニットが比較的低いヘパリン結合親和性を有する場合、その多量体は、標的構造に対して増加した親和性および／または親和力を有し、それによって本発明によるその多量体の使用を可能にすることが理解される。
そのような多量体は、本明細書中で定義されるあらゆるペプチド変異体から作成され得ることも理解される。さらに、ペプチド多量体は、同一ではないペプチド単量体およびその開示された置換改変体の異なる組み合わせを含み得る。そのようなオリゴマーまたは多量体ペプチドは、化学的合成または組換えＤＮＡ技術によって、本明細書中で議論されたように作成され得る。化学的に産生される場合、オリゴマーは、好ましくは単量体配列の２〜８個のリピートを有する。組換え的に産生される場合、多量体は、発現システムが許す限り多くの反復（例えば、２回から約１００回の反復）を有し得る。
Ｎ−ＨＢＤペプチドまたはポリペプチドのタンデムの多量体、好ましくは二量体および三量体において、ペプチドユニットが「端と端を接して」よりも「並んで」いるように、鎖間ジスルフィド結合または他の鎖間「人工的」共有結合によって、鎖が結合している。
多量体はまた、１つを超えるＰｔｒｇ、またはＰｔｒｇのものと同様の生物学的活性および薬理学的活性を有するその機能的誘導体の１つより多い反復を含み得る。１つを超える型のＰｔｒｇは、単一の融合ポリペプチド中で組合され得る。これに関して、抗体（Ａｂ）分子の抗原結合ドメインは、Ｎ−ＨＢＤおよび別のＰｔｒｇと融合されて、Ａｂ：Ｎ−ＨＢＤ：Ｐｔｒｇ融合産物を生じ得る。そのようなポリペプチドは、Ｎ−ＨＢＤによって媒介される送達およびＰｔｒｇによって提供される望ましい生物学的活性に、Ａｂの選択性を加える。従って、例えば、Ａｂは腫瘍細胞表面抗原に特異的であり得（癌治療で使用されるＨｅｒ２／Ｎｅｕ ｍＡｂの場合のように）、一旦融合構築物がＮ−ＨＢＤによってＥＣＭに濃縮されると、その環境中の腫瘍細胞に活性が集中し得る。Ａｂドメインは、好ましくはＡｂ Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント（Ｈｏｃｈｍａｎ，Ｊ．ら、（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：１１３０−１１３５；Ｓｈａｒｏｎ，Ｊら、（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５：１５９１−１５９４）、「単鎖抗体」（ｓｃＦｖ；「ｓｃＡｂ」とも呼ばれる）をコードする核酸の使用によって、ＤＮＡレベルで融合構築物に導入される。後者は、Ｉｇ ＶＨドメインおよびＩｇ ＶＬドメインが、ｓｃＦｖが、元の抗体（これからＶＨドメインおよびＶＬドメインを得る）が特異的であった抗原（またはエピトープ）に関する特異性および結合能力を保持するコンフォメーションを取ることを可能にする、短いペプチドリンカーによって人工的に結合された、一本鎖ポリペプチド分子である。例えば、Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４１；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ら、（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７−５１５；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９；Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９；米国特許第４，７０４，６９２号、同第４，８５３，８７１号、同第４，９４６，７７８号、同第５，２６０，２０３号、同第５，４５５，０３０号を参照のこと。
「可溶性Ｎ−ＨＢＤ」は、産生細胞から発散され（ｓｈｅｄ）得るか、分泌され得るか、または他の方法で抽出され得る、Ｎ−ＨＢＤの細胞を含まない形態である。可溶性Ｎ−ＨＢＤは、好ましくは可溶性融合ポリペプチドを含み、ここでＮ−ＨＢＤは、Ｐｔｒｇのような生物学的に活性な分子に遺伝的に融合されるか、または化学的に結合体化される。
上記の通り、Ｎ−ＨＢＤ改変体の好ましいグループは、少なくとも１つのアミノ酸残基、および好ましくは１つのみが、異なる残基で置換されたものである。タンパク質化学およびタンパク質構造の詳細な説明に関しては、本明細書中に参考として援用される、Ｓｃｈｕｌｚ，ＧＥら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９８３を参照のこと。タンパク質分子内で行なわれ得る置換の型は、Ｓｃｈｕｌｚら（前出）の表１〜２およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（前出）の図３〜９で示されるような、異なる種の相同的タンパク質間のアミノ酸変化の頻度分析に基づき得る。そのような分析に基づいて、本明細書中において保存的置換は、以下の５つのグループの１つ内での交換として定義される：
Figure 0004955548
 上記のカッコ内の３つのアミノ酸残基は、タンパク質の構築において特別の役割を有する。Ｇｌｙは、側鎖を欠く唯一の残基であり、従って鎖に柔軟性を与える。Ｐｒｏは、その異常なジオメトリーのために、鎖をきつく束縛する。Ｃｙｓは、タンパク質のフォールディングに重要なジスルフィド結合形成に関与し得る。
上記５グループ内ではなくその間のような、より保存的でない置換を選択することによって、生化学的、機能的（または免疫学的）な性質により本質的な変化が産生される。そのような変化は、（ａ）置換の領域におけるペプチドバックボーンの、例えば、シートまたはヘリックスコンフォメーションとしての構造、（ｂ）標的部位における分子の荷電または疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさの維持に対するその影響において、より有意に異なる。そのような置換の例は、（ｉ）Ｇｌｙおよび／もしくはＰｒｏの別のアミノ酸による置換、あるいはＧｌｙもしくはＰｒｏの欠失または挿入；（ｉｉ）親水性残基、例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒの、疎水性残基（例えば、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＶａｌまたはＡｌａ）の（またはそれによる）置換；（ｉｉｉ）Ｃｙｓ残基の、あらゆる他の残基（またはそれによる）の置換；（ｉｖ）陽性側鎖を有する残基（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＨｉｓ）の、陰性荷電を有する残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）（またはそれによる）の置換；または（ｖ）大きな側鎖を有する残基（例えば、Ｐｈｅ）の、そのような側鎖を有さない残基（例えば、Ｇｌｙ）（またはそれによる）の置換である。
本発明による最も好ましい欠失、挿入、および置換は、Ｎ−ＨＢＤタンパク質の特徴に過激な変化を引き起こさず、そのＴ細胞同時刺激活性を維持するものである。しかし、置換、欠失、または挿入の正確な影響を、行なう前に予測することが難しい場合、当業者は、過度の実験を必要とせず、本明細書中で記載されたもののような日常的なスクリーニングアッセイによって、その影響を評価し得ることを認識する。
より短い鎖の変異体が、化学的合成によって作製され得るのに対して、本発明に関して、より長い好ましい鎖の変異体は、Ｎ−ＨＢＤポリペプチドをコードする核酸の部位特異的突然変異生成、細胞培養における改変体核酸の発現、および必要に応じて、例えばカラムに固定化した特異的抗体を用いた（少なくとも１つのエピトープに対する結合によって改変体を吸着するために）、イムノアフィニティークロマトグラフィーによる細胞培養物からのポリペプチドの精製によって作製される。
（Ｎ−ＨＢＤの化学的誘導体）
Ｎ−ＨＢＤの「化学的誘導体」は、通常そのタンパク質の一部ではない、さらなる化学的部分を含む。ポリペプチドの共有結合的改変が、本発明の範囲内に含まれる。そのような誘導体化部分は、可溶性、吸収、生物学的半減期などを改善し得る。そのような効果を媒介し得る部分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８０）に開示されている。ポリペプチドの標的化されるアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることによって、そのような改変は分子に導入され得る。別の改変は、タンパク質の環状化である。ポリペプチドの化学的誘導体の例は、下に提供される。リシニル（ｌｙｓｉｎｙｌ）およびアミノ末端残基は、コハク酸、または他のカルボン酸の無水物で誘導体化される。環状カルボキシル無水物による誘導体化は、リシニル残基の荷電を逆転させる効果を有する。アミノ基を含む残基を誘導体化する、他の適当な試薬は、メチルピコリンイミデート（ｐｉｃｏｌｉｎｉｍｉｄａｔｅ）；リン酸ピリドキサル；ピリドキサル；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４ペンタンジオン；およびグリオキシル酸によるトランスアミナーゼ触媒反応のような、イミドエステルを含む。カルボキシル側鎖グループ、アスパルチルまたはグルタミルは、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホロニル−（４−エチル））カルボジイミド、または１−エチル−３−（４−アゾニア（ａｚｏｎｉａ）−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのような、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）による反応によって選択的に改変され得る。さらに、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基は、アンモニアによる反応によって、アスパラギン残基およびグルタミン残基に変換され得る。他の改変としては、プロリンおよびリジンの水酸化、セリン残基またはスレオニン残基の水酸基のリン酸化、リジンのアミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、前出、７９〜８６頁）、Ｎ末端アミンのアセチル化、およびＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。１つ以上のＤ−アミノ酸が、１つまたはそれ以上のＬ−アミノ酸を置換したペプチドもまた含まれる。
（ペプチド模倣物）
これに関して有用な化合物の別の種類は、Ｎ−ＨＢＤポリペプチドの活性を模倣する、低分子量ペプチド模倣物化合物である。そのようなペプチド模倣物の構造は、自由なＮ−ＨＢＤまたはそのリガンド（例えばヘパラン硫酸）に結合するＮ−ＨＢＤいずれかの構造から得ることができる。Ｎ−ＨＢＤのペプチド模倣物は、Ｎ−ＨＢＤペプチドの生物学的効果を模倣し、そしてＮ−ＨＢＤペプチドの立体化学的特徴を有し、そのペプチドの結合活性または生物学的活性を有するような、非天然ペプチドまたは非ペプチド薬剤であり得る。従って、本発明は、ペプチド模倣物化合物が、別のペプチドに結合された化合物を含む。
ペプチド模倣物薬剤は、Ｎ−ＨＢＤの結合エレメントの立体空間的な（ｓｔｅｒｅｏｓｐａｔｉａｌ）性質を再現し、それがＮ−ＨＢＤの結合活性または生物学的活性を有するような、非天然ペプチドまたは非ペプチド薬剤であり得る。Ｎ−ＨＢＤに対応する直線状ペプチドと同様に、ペプチド模倣物は結合面（これはヘパラン硫酸と相互作用する）および非結合面を有する。再び、Ｎ−ＨＢＤの直線状ペプチドと同様に、ペプチド模倣物の非結合面は、ペプチド模倣物の結合面を改変することなく、様々な治療的分子によって改変され得る官能基を含む。ペプチド模倣物の好ましい実施形態は、分子の非結合面にアニリンを含む。アニリンのＮＨ２−基は、ｐＫａ約４．５を有し、従って、ペプチド模倣物の結合面のどのＮＨ２官能基も改変することなく、あらゆるＮＨ２選択的試薬によって改変され得る。他のペプチド模倣物は、その結合面にいかなるＮＨ２官能基も有さないかもしれず、従ってｐＫａに関わらず、あらゆるＮＨ２を、結合体化部位として非結合体化面に表示し得る。それに加えて、−ＳＨおよび−ＣＯＯＨのような他の改変可能な官能基を、結合部位としてペプチド模倣物の非結合面に取り込まれ得る。治療的部分はまた、ペプチド模倣物の合成の間に直接取り込まれて、そして優先的に分子の非結合面に表示され得る。
本発明はまた、部分的なペプチド特徴を維持する化合物を含む。例えば、分子の休止はそのペプチド特徴を維持しながら、本発明のペプチド内のあらゆるタンパク質分解に不安定な結合を、等配電子体（Ｎ−メチル化；特定の部位におけるＤ−アミノ酸）のような非ペプチドエレメント、または還元ペプチド結合によって選択的に置換し得る。
アゴニスト、基質またはインヒビターいずれかの、ペプチド模倣化合物が、オピオイドペプチド、ＶＩＰ、トロンビン、ＨＩＶプロテアーゼなどのような、多くの生物活性ペプチドに関して記載された。ペプチド模倣化合物の設計および調製方法は、当該分野で公知である（Ｈｒｕｂｙ，ＶＪ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３３：１０７３−１０８２（１９９３）；Ｗｉｌｅｙ，Ｒ．Ａ．ら、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１３：３２７−３８４（１９９３）；Ｍｏｏｒｅら、Ａｄｖ．ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３３：９１−１４１（１９９５）；Ｇｉａｎｎｉｓら、Ａｄｖ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．２９：１−７８（１９９７）、その参考文献はその全体が参考として援用される）。これらの方法を使用して、少なくともＮ−ＨＢＤペプチドの結合能力および特異性を有する、そして好ましくは生物学的活性も有するペプチド模倣物が作製される。当業者に利用可能なペプチド化学および一般的な有機化学の知識が、本開示を考慮して、そのような化合物の設計および合成のために十分である。
例えば、そのようなペプチド模倣物は、自由であるか、または複合体に結合したいずれかの、本発明のペプチドの結晶学または核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光学よって決定される３次元構造の観察によって同定され得る。ペプチドとそのリガンドとの相互作用の立体化学的なよりよい知識が、そのようなペプチド模倣薬剤の合理的な設計に寄与する。
（改善した特異性および親和性を有するポリペプチドの操作）
ポリペプチド、融合ポリペプチド、多量体などの形態のいずれにせよ、標的ＨＳ、ＨＳＰＧまたは他の糖に対して増加した結合活性を有する（特異性、親和性または両方の増加として定義される）変異体または改変体ＨＢＤ配列は、本明細書中で記載される方法および当該分野で公知の他の方法を用いて産生および試験され得る。従って、候補改変体または変異体ＨＢＤの、オリゴサッカライドアレイに対する結合特異性または親和性をスクリーニングして、そのＨＢＤに結合する最適な糖構造を決定する。その情報を持って、ＨＢＤのペプチドライブラリーは、スクリーニングされ得るか、または指向性の方式で、ＨＢＤの選択された残基が変異され得、そしてこれらの変異体を、例えば、組織アレイに対する結合に関してスクリーニングし得る。これは、特定の組織または細胞に発現される特定のサッカライド部分に対して結合すると特徴付けられるＨＢＤモジュールを産生する。この方法において、特定の標的（例えば腫瘍）に対して改善した結合活性を有する改変体ＨＢＤが同定され得、そしてその改変体ＨＢＤは、その特定の標的に関してはＨＢＤ含有融合ポリペプチドのような、よりよいアンタゴニストを操作するために使用され得る。組織アレイの調製および使用の方法は、Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｊら、２０００、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５７：７８７−７９４；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＰＬら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ ４３８：５９１−５９４；およびＳｉｍｏｎ Ｒら、２００１、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：４５１４−４５１９によって記載される。ヘパリン結合タンパク質の組織結合研究は、Ａｌｌｅｎ ＢＬら、２００１、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５５：８４５−８５８；Ｆｒｉｅｄｌ Ａら、２００１、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １７１：５３５−５４６；Ｒａｐｒａｅｇｅｒ ＡＣ、２００２、Ｍｅｔｈ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６９：８３−１０９に、記載される。従って、本発明は、最適な組織特異性を有するＨＢＤを同定するため、および選択された生物学的機能のアンタゴニストであり得る組織特異的標的化ベクターを作製するための方法を含む。適当な組織培養システムまたは動物モデルにおける試験が、操作したＨＢＤの標的化の効率、毒性および生物学的機能のために行われる。
ヘパリンに対するＨＢＤの結合に必要とされる構造的特異性は、下の実施例３において例示され、そして記載され、そして実施例２にあるように、それらの独特なＨＳパターンに基づく特定の細胞表面を標的化する実施形態を支持する。Ｎ−硫酸基、次いで２−Ｏ硫酸基および６−Ｏ硫酸基は、（ゲルシフト実験および活性ブロッキングアッセイにおいて例示されるように）ＨＢＤ結合のために重要である。これらの硫酸基（特に、Ｎ−硫酸）の重要性は、Ｎ−硫酸化を触媒する酵素を特異的にブロックすることによって、培養細胞において確認された。それによって、顕著なＮ−硫酸化パターンを有するＨＳ含有組織に対して生物薬剤／微粒子薬物（例えば、タンパク質、ウイルス、ナノ粒子およびオリゴヌクレオチド）の広い範囲を標的化することが、可能である。
配列番号１（または配列番号２および３）の重要なアミノ酸のいくつかの改変は、Ｎ−硫酸基、２−Ｏ硫酸基および６−Ｏ硫酸基に対するＨＢＤの親和性を変化させ、そして異なる硫酸化パターンを発現する異なる細胞表面に対してＨＢＤを標的化するための基礎として働く変化した特異性をもたらす。これは、身体の１つの細胞型 対 身体の別の細胞型（例えば、脳 対 腎臓）を差次的に標的化し得る。
したがって、その後、特定の硫酸パターンを有するＨＳに対して優先的に結合する改変ＨＢＤは、身体の異なる組織に対して標的化するために種々の生物薬剤に連結され得る。
前述に基づいて、本発明は、選択手段として硫酸化表面を使用することによって、ＨＢＤが特定の硫酸化パターンを有する特定の組織に対して選択的であるライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）から改変ＨＢＤを選択する方法を包含する。
組織特異的な標的化ＨＢＤの産生に加えて、この方法はまた、病理学的組織（例えば、ヒトの癌の生検）を標的かするために使用され得る。ライブラリーメンバーを選択するための選択スキームは、身体における類似の正常細胞（または任意の他の望ましい正常細胞）に対してより高い親和性で任意の望ましい型の癌細胞に対して結合するＨＢＤを選択するために、例えば、癌細胞および正常細胞を利用する。
その後、ＨＳパターン特異的なＨＢＤのこのような選択されたセットは、癌細胞の増殖を阻害し、そして選択的標的化に基づいて、同じＨＳパターンを発現しない正常細胞に対する効果をほとんど有さないか、全く有さない生物薬剤に連結され得る。
（治療的組成物およびその投与）
Ｎ−ＨＢＤ融合ポリペプチドまたはこのポリペプチドを発現する細胞は、哺乳動物被験体、好ましくはヒトに投与される。本明細書中で記載されたようなＮ−ＨＢＤの活性を有する組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中で、生物学的有効量、または治療有効量で投与される。Ｎ−ＨＢＤ融合ポリペプチド（またはそのポリペプチドを発現する細胞）は、単独で、または別のタンパク質、ペプチド、または他の薬物と組み合せて与えられ得る。
本発明の薬学的組成物で採用され得るＮ−ＨＢＤ融合ポリペプチドは、上記で記載されたそれらの化合物の全て、およびこれら化合物の薬学的に受容可能な塩を含む。塩基性基を含む本発明の化合物の薬学的に受容可能な酸付加塩が、当該分野で公知の方法によって、適当な場合に強力かもしくは中程度に強力な、非毒性、有機酸または無機酸で形成される。本発明に含まれる酸付加塩の例は、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、蓚酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩および硝酸塩である。
酸性基を含む本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩基付加塩は、有機塩基および無機塩基から公知の方法によって調製され、そしてこれらの塩基としては、例えば、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化アンモニウムのような非毒性アルカリ金属およびアルカリ土類塩基；およびトリエチルアミン、ブチルアミン、ピペラジン、およびトリ（ヒドロキシメチル）メチルアミンのような非毒性有機塩基が挙げられる。
本発明の組成物は、それ自体が活性であり得るか、またはインビボで活性な形態に変換される「プロドラッグ」として作用し得る。
本発明の範囲内の組成物は、Ｎ−ＨＢＤ融合ポリペプチド、機能的誘導体等が、下記で定義されるように、その意図される目的を達成するために有効量で含まれる、全ての組成物を含む。以下の用量および量はまた、被験体に投与される場合に、本発明の抗体にも適している。治療的に有効な量は、有効な時間与えられた場合、望ましい薬理学的または臨床的効果を達成する用量である。
Ｎ−ＨＢＤ活性を有するポリペプチドの治療的に活性な量は、疾患の状態、個体の年齢、性別、および体重、ならびにそのポリペプチドのその個体において望ましい反応を誘発する能力のような因子によって変化し得る。投薬レジメは、最適な治療応答を提供するために調整され得る。例えば、いくつかの分割した用量が、毎日投与され得るか、または用量は、治療的状況の緊急性によって示されるものと比例して減少され得る。細胞に結合した形態での、タンパク質の治療有効量は、タンパク質等価物または細胞等価物に関して述べ得る。
従って、本発明の融合ポリペプチドのいずれかの有効量は、レシピエントの体重１ｋｇあたり約１ｎｇと約１ｇとの間、より好ましくは約１μｇと１００ｍｇ／ｋｇとの間、より好ましくは約１００μｇ／ｋｇと約１００ｍｇ／ｋｇとの間である。内科的投与に適切な用量形態は、好ましくはユニットあたり約０．１ｍｇから５００ｍｇの活性成分を含む（後者の用量範囲に関して）。活性成分は、組成物の全重量に基づいて、重量で０．５％から９５％まで変化し得る。あるいは、形質導入細胞のような、Ｎ−ＨＢＤを発現する細胞の有効な用量は、好ましくは分割用量で、被験体あたり約１０４個と１０９個との間の細胞、より好ましくは約１０６個と１０８個との間の細胞である。関連する治療の当業者は、過度の実験なしにこれらの用量を調整し得る。
活性化合物（例えば、Ｎ−ＨＢＤ融合ポリペプチドまたはＮ−ＨＢＤ ＤＮＡで形質導入した細胞）を、簡便な様式（例えば、注射または注入）で、簡便かつ有効な経路で投与し得る。好ましい経路は、皮下経路、皮内経路、静脈内経路、および筋肉内経路を含む。他の可能な経路としては、経口投与、脳室内、クモ膜下腔内、吸入、経皮適用、または直腸投与が挙げられる。完全に切除されなかった腫瘍の治療のために、直接腫瘍内注入もまた意図される。
投与経路に依存して、化合物を不活性化し得る酵素、酸、および他の自然条件の作用から化合物を保護する物質で活性化合物は、コーティングされ得る。従って、経腸経路によってＮ−ＨＢＤ活性を有するポリペプチドまたはペプチドを投与するために、その不活性化を防ぐ物質で組成物をコーティングする、または組成物と同時投与する必要があり得る。例えば、ペプチドは、個体に、適切なキャリア、希釈剤またはアジュバント中で投与し得、酵素阻害剤（例えば膵トリプシン阻害剤、フルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＦＰ）およびトラジロール）と同時投与され得るか、またはリポソーム（水中油中水型エマルションおよび伝統的なリポソームを含む（Ｓｔｒｅｊａｎら、（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ７：２７））のような適切なキャリア中で投与され得る。
本明細書中で使用される「薬学的に受容可能なキャリア」としては、あらゆるおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質のための、そのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。あらゆる従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である限り以外は、治療的組成物におけるそれらの使用が企図される。補足の活性化合物もまた、組成物に組み込まれ得る。
好ましい薬学的に受容可能な希釈剤としては、生理的食塩水および水性緩衝溶液が挙げられる。注射に対して適切な薬学的組成物は、滅菌した水性溶液（水溶性の場合）または滅菌した分散剤および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散剤の即時調製のための滅菌粉末を含む。等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムは、薬学的組成物に含まれ得る。全ての場合において、組成物は、無菌および流動性であるべきである。それは製造および保存の条件下で安定であり、そして細菌および真菌のような微生物の混入を防ぐために保存剤を含まなければならない。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物中で、および油中で、分散剤はまた調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐ保存剤を含み得る。
キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合には、必要な粒子サイズの維持および界面活性剤の使用によって、適当な流動性が維持され得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等）によって達成され得る。
非経口組成物は、好ましくは投与の容易さおよび用量の均一性のために、投薬単位形態で処方される。投薬単位形態は、哺乳動物被験体のための単位投薬量として適当な、物理的に分離したユニットを指す；各ユニットは、必要な薬学的キャリアと結合して望ましい治療効果をもたらすように計算された、予め決定した量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態の詳細は、（ａ）活性化合物の独特な特徴および達成される特定の治療効果、および（ｂ）個体における感受性の処置のために、そのような活性化合物を混合する分野に内在する制限によって指向され、そして直接依存する。
肺滴下のために、エアロゾル化溶液が、使用される。スプレー可能なエアロゾル調製物において、活性タンパク質は、固体または液体の不活性キャリア物質と組み合わせられ得る。これはまた、スクイーズボトル（ｓｑｕｅｅｚｅ ｂｏｔｔｌｅ）にパッケージングされ得るか、または加圧した揮発性物質、通常ガス性の噴霧剤との混合物中で、パッケージングされ得る。エアロゾル調製物は、本発明のタンパク質に加えて、溶媒、緩衝液、界面活性剤、および抗酸化剤を含み得る。
局所適用のために、本発明のタンパク質は、皮膚への平滑化効果、および影響される領域へ活性成分を直接投与する手段の両方を有する、膏薬または軟膏のような、局所に適用されるビヒクルに取り込まれ得る。
活性成分のためのキャリアは、スプレー可能かまたはスプレー可能でない形態であり得る。スプレー可能でない形態は、局所適用に固有のキャリアを含み、そして好ましくは水のものより大きな動的な粘性を有する、半固体形態または固体形態であり得る。適当な処方は、溶液、懸濁液、エマルション、クリーム、軟膏、粉末、リニメント剤、膏薬などが挙げられるが、これらに限らない。所望される場合、これらは、滅菌されてもアジュバント（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝液、または浸透圧に影響を与える塩など）と混合されてもよい。スプレー可能でない局所調製物に好ましいビヒクルの例としては、軟膏基材（例えば、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）；ＨＥＢクリームのような伝統的なクリーム；ゲル；およびワセリンなど）が挙げられる。
本発明によるＮ−ＨＢＤ融合ポリペプチドのための、他の薬学的に受容可能なキャリアは、リポソーム、活性タンパク質が脂質層に付着する水性同心層からなる微粒子に、分散されるか、または様々に存在するかの、いずれかで含まれる薬学的組成物である。活性タンパク質は、好ましくは水性層および脂質層（内側または外側）、またはとにかくリポソーム懸濁液として一般的に知られる非均一性のシステムに存在する。疎水性層、または脂質層は、一般的に、レシチンおよびスフィンゴミエリンのようなリン脂質、コレステロールのようなステロイド、ジアセチルホスフェート（ｄｉｃｅｔｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ステアリルアミン、もしくはホスファチジン酸のような多少イオン性の界面活性物質、ならびに／または疎水性性質の他の物質を含むが、独占的にそうではない。
（Ｎ−ＨＢＤ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡの伝達）
例えば、一般的に、「遺伝子治療」として知られるものを実施するための動物に対するＤＮＡ伝達、またはエキソビボで細胞に対するＤＮＡ伝達は、細胞および最終的には生きた動物への、「外来性」ＤＮＡの導入を含む。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子治療」は、インビボにおいて欠損遺伝子の補正または置換に限定されることを意図せず、むしろ本発明のポリヌクレオチド（好ましくは、ＤＮＡ分子）（「遺伝子」である必要はない）の、発現およびそれによって記載されたような有用性を可能にする方式での伝達である。遺伝子治療のいくつかの一般的なストラテジーが研究され、そして広範囲に概説された（Ｙａｎｇ，Ｎ−Ｓ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：３３５−３５６（１９９２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｍｉｌｌｅｒ，ＡＳ、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｃｒｙｓｔａｌ，ＲＧ、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．９２（補遺６Ａ）：４４Ｓ−５２Ｓ（１９９２）；Ｚｗｉｅｂｅｌ，ＪＡら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６１８：３９４−４０４（１９９１）；ＭｃＬａｃｈｌｉｎ，ＪＲら、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３８：９１−１３５（１９９０）；Ｋｏｈｎ，ＤＢら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．７：１７９−１９２（１９８９）（これらの参考文献は、本明細書中でそのが参考として援用される））。１つのアプローチは、培養中の一次細胞への核酸転移、続いて全身性か、または特定の臓器もしくは組織のいずれかでの、エキソビボで形質転換した細胞の宿主への自己移植を含む。
本発明の目的を達成するために、機能的に活性で発現可能なＤＮＡを、哺乳動物の身体組織または臓器にインビボで直接転移させることによって、核酸治療は達成される。ＤＮＡ転移は、下記で記載する多くのアプローチを用いて達成され得る。これらのシステムは、選択マーカー（例えばＧ４１８抵抗性）の使用によって、インビトロで成功した発現に関して試験され、そのＤＮＡを発現するトランスフェクトされたクローンが選択され得、次いで適切なイムノアッセイにおいてその産物に対する抗体を用いて、Ｎ−ＨＢＤ発現産物の存在が検出される（誘導性システムの場合には誘導剤による処理後）。ＤＮＡの取り込み、プラスミドの組み込み、および組み込まれたプラスミドの安定性を含む、手順の効率は、公知の方法を用いてプラスミドＤＮＡを直線状にすること、および「キャリア」として高分子量哺乳動物ＤＮＡを用いたコトランスフェクションによって改善され得る。
当該分野で報告された、成功した転移の例としては、以下が挙げられる：（ａ）無期限のマーカー遺伝子の発現を引き起こした、マウス筋組織に対するプラスミドＤＮＡの直接注入（Ｗｏｌｆｆ，ＪＡら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５（１９９０））；（ｂ）レトロウイルスベクターが、血管組織のインビボおよびインサイチュ感染に有効であること；（ｃ）肝臓に対するレトロウイルス調製物の門脈注射および直接注射が、インビボで遺伝子転移および発現を達成したこと（Ｈｏｒｚａｇｌｏｕ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７２８５（１９９０）；Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３８７（１９９１））；（ｄ）肺組織に対する組換えアデノウイルスの気管内注入が、インビボ転移および肺呼吸上皮における外来遺伝子の延長した発現に有効であったこと（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ＭＡら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１（１９９１）；（ｅ）単純ヘルペスウイルスベクターが、脳組織に対するインビボ遺伝子転移を達成したこと（Ａｈｍａｄ，Ｆ．ら編、Ｍｉａｍｉ Ｓｈｏｒｔ Ｒｅｐｏｒｔｓ−Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ、第１巻、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＵＳＡ、１９９１）。
レトロウイルス媒介性のヒト治療は、広宿主性の複製欠損レトロウイルスシステムを利用する（Ｔｅｍｉｎ，ＨＭ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１１１（１９９０）；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，９８０，２８９号；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第５，１２４，２６３号；Ｗｉｌｌｓ，ＪＷ、米国特許第５，１７５，０９９号；Ｍｉｌｌｅｒ，ＡＤ、米国特許第４，８６１，７１９号）。機能的ＤＮＡをヒト細胞またはヒト組織へ（例えばアデノシンデアミナーゼ遺伝子をリンパ球へ、ＮＰＴ−ＩＩ遺伝子およびＴＮＦ−αの遺伝子を腫瘍浸透リンパ球へ）導入するために、そのようなベクターが使用された。レトロウイルス媒介性の遺伝子伝達は、一般的に、遺伝子転移のために標的細胞の増殖を必要とする（Ｍｉｌｌｅｒ，ＤＧら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４２３９（１９９０））。この条件は、本発明ＤＮＡ分子が導入される本明細書中の特定の好ましい標的細胞（すなわち、活発に増殖している腫瘍細胞）によって満たされる。多くの方法のいずれかを使用するプラスミド、またはレトロウイルスベクターによるトランスフェクションを用いた嚢胞性線維症の遺伝子治療が、Ｃｏｌｌｉｎｓら、米国特許第５，２４０，８４６号によって記載された。
Ｎ−ＨＢＤ配列をコードするＤＮＡ分子は、当該分野で周知なように、複製欠損レトロウイルスを産生する、パッケージング細胞株を用いてレトロウイルスベクターにパッケージングされ得る（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，ＡＤら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１−４３７（１９８５）を参照のこと）。遺伝子転移に有効および安全である、より新しいパッケージング細胞株が、記載された（Ｂａｎｋら、米国特許第５，２７８，０５６号）。
このアプローチを部位特異的な方式で利用して、レトロウイルスベクターが、選択した組織または臓器に送達され得る。従って、例えば、カテーテル送達システムが使用し得る（Ｎａｂｅｌ，ＥＧら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１３４２（１９８９））。レトロウイルスベクターまたはリポソームベクターのいずれかを使用するそのような方法は、発現される核酸を血管壁へ、または腫瘍の血液循環中に送達するのに特に有用である。
組換えアデノウイルス（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮら編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０、１６７９頁；Ｂｅｒｋｎｅｒ，ＫＬ、（１９９２）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８：３９−６６；Ｓｔｒａｕｓｓ，ＳＥ、Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，ＨＳ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８４、第１１章）、またはニューロン特異的伝達および残存のためのヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）を含む、他のウイルスベクターがまた使用され得る。ヒト遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの利点は、組換えが稀であり、そのようなウイルスに関連するヒト悪性腫瘍が未知であり、アデノウイルスゲノムは大きさが７．５ｋｂまでの外来遺伝子を受け入れるよう操作し得る二本鎖ＤＮＡであり、そして生きたアデノウイルスは安全なヒトワクチン生物体であるという事実を含む。アデノ随伴ウイルスも、本発明によるヒト治療に有用である（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ＲＪら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３９４１（１９９１））。
本発明のＤＮＡ分子を発現し得、そして特にヒトにおける本治療的設定で有用な、別のベクターは、非複製にし得るワクシニアウイルスである（米国特許第５，２２５，３３６号；同第５，２０４，２４３号；同第５，１５５，０２０号；同第４，７６９，３３０号；Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１０８４７−１０８５１；Ｆｕｅｒｓｔ，ＴＲら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（１９８９）８６：２５４９−２５５３；Ｆａｌｋｎｅｒ，ＦＧら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８７）１５：７１９２；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８５）５：３４０３−３４０９）。組換えワクシニアウイルスおよび異種のＤＮＡを含む他のウイルス、ならびに免疫化およびＤＮＡ治療におけるそれらの使用の記載は、以下で概説される：Ｍｏｓｓ，Ｂ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．（１９９３）３：８６−９０；Ｍｏｓｓ，Ｂ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）２０：３４５−３６２；Ｍｏｓｓ，Ｂ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１５８：２５−３８；Ｍｏｓｓ，Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５２：１６６２−１６６７；Ｐｉｃｃｉｎｉ，Ａら、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．（１９８８）３４：４３−６４；Ｍｏｓｓ，Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆ Ａｎａｌ（１９８３）３：２０１−２１３。
裸のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはウイルスベクターに加えて、遺伝子操作した細菌は、ベクターとして使用され得る（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＢＣＧおよびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＬＭ）を含む多くの細菌株）（Ｈｏｉｓｅｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ ２９１、２３８−２３９（１９８１）；Ｐｏｉｒｉｅｒ，ＴＰら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８、２５−３２（１９８８）；Ｓａｄｏｆｆ，ＪＣら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、３３６−３３８（１９８８）；Ｓｔｏｖｅｒ，ＣＫら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１、４５６−４６０（１９９１）；Ａｌｄｏｖｉｎｉ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１、４７９−４８２（１９９１）；Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．１４９、５３−５９（１９９２）；Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０、２２０９−２２１８（１９９４））。これらの生物体の感染の腸内経路は、それらが経口的に送達され得ることに起因して、それらの使用ついての有望な特徴である。
インビボのウイルス媒介性の遺伝子転移に加えて、プラスミドＤＮＡの投与（Ｗｏｌｆｆら、１９９０、前出）および微粒子銃媒介性の遺伝子転移（Ｙａｎｇ，Ｎ−Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５６８（１９９０）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＲＳら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６（１９９１）；Ｚｅｌｅｎｉｎ，ＡＶら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２４４：６５（１９８９）；Ｚｅｌｅｎｉｎ，ＡＶら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８０：９４（１９９１）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＳＡら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７：１１（１９９１））を含む、当該分野で周知の物理的手段が、ＤＮＡの直接転移に使用され得る。さらに、インビトロで遺伝子を細胞へ転移させる周知の手段である、エレクトロポレーションが使用されて、本発明によるＤＮＡ分子をインビボで組織に転移し得る（Ｔｉｔｏｍｉｒｏｖ，ＡＶら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０８８：１３１（１９９１））。
「キャリア媒介性」の遺伝子転移（またはＤＮＡ送達）も記載された（Ｗｕ，ＣＨら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５（１９８９）；Ｗｕ，ＧＹら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１（１９８８）；Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７１２８（１９８３）；Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１（１９８２）；Ｗｉｌｓｏｎ，ＪＭら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３（１９９２））。好ましいキャリアは、アシル化ｍＡｂを脂質二重層に含み得るイムノリポソーム（Ｗａｎｇら、前出）のような標的化されたリポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１０６８（１９８３）；Ｓｏｒｉａｎｏら、前出）である。アシアログリコプロテイン／ポリリジン（Ｗｕら、１９８９、前出）のようなポリカチオンが使用され得、ここで結合体は標的組織を認識する分子（例えば、肝臓に関してはアシアロオロソムコイド）およびトランスフェクトされるＤＮＡに結合するＤＮＡ結合化合物を含む。ポリリジンは、ＤＮＡを損傷することなくそれに結合するＤＮＡ結合分子の例である。次いでこの結合体は、転移のために本発明によるプラスミドＤＮＡと複合体化される。
トランスフェクションまたはマイクロインジェクションのために使用するプラスミドＤＮＡは、当該分野で周知の方法（例えば、Ｑｕｉａｇｅｎ処置（Ｑｕｉａｇｅｎ）、続いて本明細書中で例示される方法のような公知の方法を用いたＤＮＡ精製）を用いて、調製され得る。
再び、上記で記載されたように、本発明による形質導入されたＮ−ＨＢＤ分子の有用性は、安定か、または延長された発現を必要としない可能性がある。むしろ、ポリペプチドの一過性の発現が、形質導入細胞がその「産生」機能または「伝達」機能を実施するために十分であり得る。
（他の治療的組成物）
別の実施形態において、本発明のＮ−ＨＢＤポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、「治療的に結合体化され」、そして治療薬を、化合物が目指しそして結合する部位、すなわち腫瘍部位、腫瘍転移、または感染／炎症の中心のような、ＨＳが豊富な組織または領域へ送達するために使用される。「治療的に結合体化された」という用語は、改変Ｎ−ＨＢＤポリペプチドが、疾患の根底にある原因に対して作用する別の治療剤、または炎症、腫瘍の侵入、もしくは新脈管形成の「成分」もしくはプロセスの工程に結合体化されることを意味する。
有用である治療的放射性同位体の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｂｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、および１０９Ｐｄが挙げられる。これらの原子は、Ｎ−ＨＢＤポリペプチド化合物に直接的か、キレートの一部として間接的か、またはヨウ素の場合はヨウ素化ボルトン−ハンターグループの一部として間接的に結合体化され得る（それによって、このヨウ素は、このグループをポリペプチドに結合させる前または後のいずれかに導入され得る）。
放射性核種結合体の好ましい用量は、標的部位に送達される特定の放射活性の関数であり、それは、腫瘍の場合、腫瘍の型、腫瘍の位置および血管新生、Ｎ−ＨＢＤポリペプチド「キャリア」の動態および体内分布、その核種による放射活性放出のエネルギーなどによって変化する。放射線療法の当業者は、過度の実験なしに、望ましい治療的有用性を実施するために、特定の核種の用量と共にポリペプチドの用量を容易に調整し得る。例えば、１３１Ｉ−Ｎ−ＨＢＤポリペプチドの有効用量は、頭蓋外の腫瘍に関して、腫瘍１グラムあたり約１と１０００μＣｉとの間である。
本明細書中に含まれる別の治療的アプローチは、ホウ素中性子捕獲治療の使用であり、ここでホウ素化ポリペプチドは、腫瘍（最も好ましくは、頭蓋内の腫瘍）のような、望ましい標的部位へ伝達される（Ｂａｒｔｈ，ＲＦ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．１４：５３４−５５０（１９９６）；Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｙ．（編）、Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｕｔｒｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．、１９９６；Ｓｏｌｏｗａｙ，ＡＨら（編）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌ．３３：１−１８８（１９９７））。安定な同位体１０Ｂは、低エネルギー（＜０．０２５ｅＶ）の熱中性子で照射され、そして起こる中性子捕獲は、高い一次エネルギー転移およびそれぞれ約９および５μｍの路程（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈｓ）を有する、α粒子および７Ｌｉ原子核を生ずる。この方法は、血液、内皮細胞および正常組織（例えば脳）における低レベルである、腫瘍における選択的な１０Ｂの蓄積に基づく。そのような送達は、ＥＧＦを用いて達成された（Ｙａｎｇ，Ｗ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５７：４３３３−４３３９（１９９７））。
本発明の方法によるＮ−ＨＢＤポリペプチドと結合され得る他の治療剤は、化学療法薬、プロドラッグ、プロドラッグを活性化する酵素、光感作薬剤、核酸治療剤、アンチセンスベクター、ウイルスベクター、レクチンおよび他の毒素である。
本発明の組成物は、神経系、筋肉組織、および上皮に影響する広い範囲の疾患および障害を処置するのに有用である。それに加えて、これらの組成物は、癌の処置において使用され得る。本明細書中で使用される場合、「処置」は、存在する疾患または状態の処置、および疾患または状態の検出または発現より前の予防的投与を包含する。
したがって、本発明は、様々な疾患または障害のいずれかを処置するのに有用なＮ−ＨＢＤ融合ポリペプチドを含有する薬学的組成物を提供する。１つの実施形態において、薬学的Ｎ−ＨＢＤ融合ポリペプチド組成物は、哺乳動物を治療するために採用される。特に、その組成物はヒト、農場の動物（例えば、ウシおよびヒツジ）、動物園の動物、スポーツにおいて使用される動物（例えば、競走馬）、およびペットを処置するのに有用である。好ましい実施形態において、その組成物は、ヒトを治療するために使用される。
ＮＲＧおよびそれらのアンタゴニストの効果の知見に基づいて、２つの種類の疾患または障害が、特に本発明の方法に影響されやすい。広く記載すると、これらは、癌および神経系の疾患を含む。その化合物は、腫瘍細胞の侵入および転移を阻害するのに有用である。神経系疾患は、好ましくは神経変性性疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ））、脳卒中、てんかん、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、ハンティングトン舞踏病、ダウン症候群、感音難聴、およびメニエール病である。糖尿病におけるような末梢性ニューロパシー、脳または脊髄への外傷的損傷後の修復も含まれる。
本組成物は、最も多くの場合に、運動、感覚、感覚運動、または自律神経の機能不全の１つまたは組み合わせとして明らかになる、末梢神経系に影響を与える障害である、末梢性ニューロパシーを含むニューロパシーを処置するために使用される。例としては、減少した胃腸運動性または尿膀胱の無緊張のような、遠位感覚運動ニューロパシーおよび自律神経ニューロパシーが挙げられる。本組成物による治療に敏感に反応する末梢性ニューロパシーは、（ａ）遺伝性、（ｂ）全身性疾患の結果、または（ｃ）毒性薬剤によって誘導されるものであり得る。遺伝性ニューロパシーの例は、シャルコー−マリー−ツース病、レフサム病、無βリポタンパク血症、タンジアー病、クラッベ病、異染性白質萎縮症、ファブリー病、およびドゥジュリーヌ‐ソッタ症候群である。全身性疾患から生ずるニューロパシーの例としては、ポリオ後（ｐｏｓｔ−ｐｏｌｉｏ）症候群が挙げられる。毒性ニューロパシーとしては、癌化学療法の副作用であるものが挙げられる。
本発明のハイブリッドＨＢＤ−Ｂ４Ｄポリペプチドは、主に、アンタゴニストとして本明細書中で特徴付けられた。しかし、これらの分子はまた、つい最近記載されたシグナル伝達経路（特に、ニューロンにおいて）のアゴニストとして作用し得る。このようなシグナル伝達は、「バック（ｂａｃｋ）シグナル伝達」または「逆行性」シグナル伝達と称され、そして機能未知の高度に保存されたＣｙｓが豊富な細胞内ドメインを含むＮＲＧ−１の膜貫通アイソフォームの存在に基づく。Ｂａｏ，Ｊら、（２００３）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６１：１１３３−４１は、ニューロンにおいて双方向性シグナル伝達分子として作用し得る、このようなアイソフォームを開示した。ＮＲＧバックシグナル伝達についての刺激は、ＮＲＧのＥＣＤに対するｅｒｂＢレセプター二量体の結合およびニューロンの脱分極を含む。これらの刺激は、タンパク質分解性の放出および核へのＮＲＧ−１の細胞内ドメインのトランスロケーションを誘発する。一旦、核において、この分子がアポトーシスのいくつかの調節の発現を抑制する能力を有すると、例えば、減少した神経細胞の死をもたらす。Ｂａｏら、前出は、ＮＲＧの制御されたタンパク質分解性のプロセシングが、少なくともＮＲＧ−１を発現するニューロンの、接触依存性の生存および活性依存性の生存を媒介するようである逆行性シグナル伝達をもたらすと結論付けた。本発明に従って、本発明の融合ポリペプチドは、このようなバックシグナル伝達のアゴニストであり、そしてアポトーシスを阻害するために使用され、それによって（可溶性に対して）膜に結合したＮＲＧの適切な形態を発現する細胞の生存を促す。
高レベルのｅｒｂＢ２発現は、促進的な腫瘍の進行および転移活性に関連し、そしてｅｒｂＢ２発現レベルは、乳癌を有する患者における予後の十分に特徴付けられた指標であると見なされる（Ｒｕｂｉｎ Ｉら、（２００２）Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ １２（第１補遺）：３−８）。さらに、ここでｅｒｂＢ２は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））（ｅｒｂＢ２に対するｍＡｂ）による乳癌の新しい処置の標的である。ヒトの悪性組織において、ｅｒｂＢレセプターの過剰発現および／またはそれらの遺伝子の増幅は、頻繁に起こる。それらに共通して、ＥＧＦレセプターは、胃腸の上皮全体にわたって広範に分布する。トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子およびアンフィレギュリンを含むＥＧＦペプチドは、ＥＧＦレセプターのチロシンキナーゼを活性化する。これらのペプチドは、胃腸管上のＥＧＦレセプターを介して種々の効果を発揮することが公知である。ｅｒｂＢ２の発現はまた、腸および結腸の上皮癌ならびに胃腸の癌において検出されている（Ｑｕｉｒｋｅ Ｐら、（１９８９）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６０：６４−６９；Ｔｓｕｊｉｎｏ Ｔら、（１９９０）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６２：２２６−３０；Ｊａｎｋｏｗｓｋｉ Ｊら、（１９９２）Ｇｕｔ ３３：０３３−１０３８）。ｅｒｂＢ２遺伝子の増幅またはｅｒｂＢ２タンパク質の過剰発現は、胃腺癌において発生し、転移および生存と相関する（Ｒｏｓｓ ＪＳら、（２００１）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ １９：５５４−６８）。結腸癌において、ｅｒｂＢ２発現レベルおよびｅｒｂＢ３発現レベルはいずれも、正常粘膜より高い（Ｍａｕｒｅｒ ＣＡら、（１９９８）Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ ２９：７７１−７７）。蓄積した証拠により、ＨＲＧ／ｅｒｂＢ２／ｅｒｂＢ３経路の制御が結腸の腫瘍増殖において重要な役割を果たし得ることが示唆される（Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ Ｓら、（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１：７８−８６）。いくつかの研究は、ｅｒｂＢ４が胃癌の増殖に寄与し得ることを示唆する（Ｋａｔａｏｋａ Ｈら、（１９９８）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６３：５５３−６４）。つい最近、ｅｒＢ２（およびＥＧＦ）レセプター発現と食道腺癌（バレット食道関連性の腺癌を含む）との間に、関連性が見出された（Ｃｈｉｂａ，Ｔ、（２００４）Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ７０：９３−９４）。Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔら、Ｃａｎｃｅｒ ７３：１７８５−９４は、ｅｒｂＢ２過剰発現と、浸潤の深さの増加、リンパ節転移、および遠位器官への転移との間に顕著な相関関係を見出した。
Ｄａｙ ＪＤら、（１９９６）Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ．２７：１１９−２４は、ｅｒｂＢ２が膵管病変における増殖因子関連性のシグナル伝達の強力なメディエーターであることを示す膵臓組織の組織病理学的所見を示し、そして一旦種々の悪性度の過形成と見なされた病変が、ある程度、その後の浸潤および転移についての可能性を有する上皮内新生物を示し得るという仮説に対するさらなる支持を提供した。正常な膵管および膵小管（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔｕｌｅ）において、ｅｒｂＢ２発現は、１例を除いて全く存在しなかった。対照的に、ｅｒｂＢ２は、平坦状（ｆｌａｔ）粘液性過形成を有する管の８２％、非定型性を伴わない乳頭粘液性過形成を有する管の８６％、非定型の乳頭粘液性過形成を有する管の９２％、およびインサイチュの癌腫を有する全ての標本において発現された。ｅｒｂＢ２発現は、中程度に分化型の浸潤性癌腫の６９％において観察され、そしてどのような低い分化型の浸潤性癌腫においても観察された。
神経膠腫は、最も頻繁に診断される成人の脳の原発性悪性腫瘍であり、周囲の健康な脳組織に拡散性に浸潤し、それによってそれらの上首尾の外科的除去を不可能にする傾向を有する。ＮＲＧ−１は、神経膠腫細胞の浸潤において重要な調節性の役割を果たす（Ｒｉｔｃｈ ＰＡら、（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８：２０９７１−７８）。ｅｒｂＢ２は、ＮＲＧ−１によるヒト神経膠腫生検のレセプター活性化において過剰発現され、二次元スクラッチ運動性（ｓｃｒａｔｃｈ ｍｏｔｉｌｉｔｙ）アッセイにおいて細胞運動性を増強し、そして三次元Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ移動アッセイにおいて細胞浸潤を刺激した。
ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−４は、同時発現され、ヘテロダイマー化され、そして小児髄芽腫（小脳の外部顆粒細胞層の胚芽腫）における予後に有意であることが報告された（Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ ＲＪら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：３９３２−４１）。ＮＲＧ駆動型ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４オートクラインループは、髄芽腫の腫瘍形成における重要な因子である。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＥｒｂＢ−２レセプターおよびＥｒｂＢ−４レセプターの発現（ＥｒｂＢ−１またはＥｒｂＢ−３ではない）が正常に発達する小脳と比較した骨芽腫において調節解除されたことを示した。そして、ＮＲＧ１−βは、髄芽腫の原発性腫瘍の８７％において発現され、ＥｒｂＢ−２レセプターおよびＥｒｂＢ−４レセプターの高い同時発現を伴う腫瘍において生じる最も大きな発現レベルを有した。提唱されたオートクラインループの全３種の成分（すなわち、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−４、およびＮＲＧ１−β）の発現は、診断において、転移の存在に極めて関連していた。
したがって、本開示および文献に基づいて、広範な種々の腫瘍細胞は、阻害され得、そして癌は、本発明によって処置され得、これらの癌としては、いくつか例を挙げると、乳癌および卵巣癌、胃癌、食道癌および結腸癌、膵臓癌、神経膠腫および髄芽腫が挙げられる。
（腫瘍系）
本発明の組成物は、ヒト腫瘍の代理であると見なされる十分に確立されたげっ歯類モデルにおいて、治療上の有効性について試験される。全体的なアプローチは、以下：
Figure 0004955548
 に詳細に記載される。これらの参考文献は両方とも、その全体が本明細書によって参考として援用される。
（ヒト異種移植片モデル）
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）によって実施されるような抗癌薬の前臨床における発見および開発は、一連の試験手順、データの精査、および判断工程からなる（Ｇｒｅｖｅｒ，ＭＲ、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ，７９：６２２−６３８（１９９２））。試験手順は、比較定量的なデータを提供し、次に、所定の化学的分類または生物学的分類からの最良の候補薬剤の選択を可能にするように設計される。１９７５年以来、ＮＣＩは、ｉ．ｐ．移植型のマウスＰ３８８白血病モデルにおける化合物のプレスクリーニングを含んだ薬物の発見を行い、次いでヒト固形腫瘍を含む移植可能な癌（Ｖｅｎｄｉｔｔｉ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｉｎ：Ｇａｒｒａｔｔｉｎｉ Ｓら編、Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ２：１−２０（１９８４））のパネルにおいて選択した化合物を評価することに取り組んでいる。後者は、免疫不全の胸腺欠損ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスの開発およびこれらのマウスへのヒト腫瘍異種移植片の移植によって可能になった（Ｒｙｇａａｒｄ，Ｊ．ら、Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｃａｎｄ．７７：７５８−７６０（１９６９）；Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａ，Ｇ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．５７：６１５−６１９（１９７３））。選択したマウスおよびヒト腫瘍細胞株（Ｂ １６黒色腫、Ａ−３７５黒色腫、ＬＯＸ−ＩＭＶＩ黒色腫、およびＰＣ−３前立腺癌）の転移の可能性を評価する研究、ならびに実験的薬物評価に対するそれらの適合性は、解剖学的に適切な宿主組織における腫瘍材料の移植から得られるインビボモデルの重要性を支持した；このようなモデルは、特定の腫瘍型に対して活性を阻害する化合物の詳細な評価に良く適している。１９９０年の初め頃、ＮＣＩは、大規模な薬物スクリーニングのためにヒト腫瘍細胞株を利用し始めた（Ｂｏｙｄ，ＭＲ，Ｉｎ：ＤｅＶｉｔａ，ＶＴら、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｕｐｄａｔｅｓ，第３巻，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，１９８９，ｐｐ．１−１２；Ｂ．Ｔｅｉｃｈｅｒ編，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ：Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｒｏｖａｌ ｃｈａｐｔｅｒ ２）。７種の癌型（脳、結腸、白血病、肺、黒色腫、卵巣、および腎臓）に由来する細胞株は、広い範囲の供給源から取得され、凍結され、そして一連のインビトロおよびインビボでの特徴付けに供された。このアプローチは、スクリーニングストラテジーを「化合物指向性」から「疾患指向性」である薬物の発見にシフトさせた（Ｂｏｙｄ，前出）。疾患特異的である差次的な毒性（例えば、本明細書中に記載される化合物の抗黒色腫活性）を示すスクリーニングによって同定された化合物は、さらなる前臨床の評価のための「リード」と見なされた。一連のヒト腫瘍異種移植片モデルは、このような要求に対処するために作製された。ヒト腫瘍細胞培養株からｓ．ｃ．異種移植片を確立するために使用されるアプローチは、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭａｒｙｌａｎｄにあるＮＣＩの腫瘍貯蔵所から得られるものである。冷凍保存された細胞株は、解凍され、１０％の熱失活した胎仔ウシ血清を補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養し、そしてその集団が１０８個以上の細胞を得るのに十分な量になるまで増やした。細胞は、収穫され、次いで１０匹の胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスの腋窩部にｓ．ｃ．で移植される（マウス１匹につき０．５ｍｌあたり１０７個の細胞）。これらのマウスに対する好ましい飼育条件は、１２時間の明／暗サイクルにおいて柵施設中に維持した滅菌ポリカーボネートフィルターで蓋をしたマイクロアイソレーターケージ、ならびに滅菌した食物および適宜な水の供給を含む。移植された動物は、腫瘍の出現について１週間に２回観察される。固形腫瘍の増殖は、腫瘍塊を測定するインサイチュのキャリパー測定を使用してモニタリングされる。重量（ｍｇ）は、長球面についての式を使用し、そして１．０ｇ／ｃｍ３の特定の重力であると仮定して、２つの垂線の寸法（長さおよび幅）の測定値（ｍｍ）から算出される（Ｇｅｒａｎら、前出）。これらの腫瘍のフラグメントは、インビボ材料の特徴をモニタリングし、それらをインビトロ株の特徴と比較し、可能な場合には最初の患者の腫瘍について報告された特徴と比較するために、組織学的な分析、細胞化学的な分析、および超微細構造的な分析に供され得る（Ｓｔｉｎｓｏｎ ＳＦら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２：１０３５−１０５４（１９９２）。インビトロ腫瘍材料およびインビボ腫瘍材料の両方は、組織型および起源の腫瘍と一致する特徴を示すべきであるが、いくつかの培養細胞株と対応する異種移植片材料との間の分化の程度における違いは、異常なことではない。
異種移植片のインビボ増殖特徴は、特に、その異種移植片が初期ｓ．ｃ．モデルとして利用される場合、試験薬剤の抗腫瘍活性の評価における使用についての適合性を決定する。本明細書中で使用される場合、初期ｓ．ｃ．モデルは、腫瘍が、処置の開始前に６３〜２００ｍｇにされるモデルとして定義される。腫瘍の評定において考慮される増殖特徴としては、取り込み率（ｔａｋｅ−ｒａｔｅ）、２００ｍｇに達するまでの時間、倍加時間、自発的な退行への陥り易さが挙げられる。
（実験的転移）
好ましいモデルは、本明細書中で実施例２に記載される一連の乳腺腫瘍細胞株を利用する。好ましくは、これらの腫瘍は、実験的転移モデルにおいて試験され、このモデルにおいて、適切な数の腫瘍細胞が免疫無防備状態のマウスに静脈内（ｉｖ）注射され、その後、種々の時間においてその肺が微視的な転移または巨視的な転移を数えるために取り出される。本発明の組成物は、腫瘍細胞の前、腫瘍細胞と一緒、または腫瘍細胞の後（またはこれらの任意の組み合わせ）に与えられ得る。このことによって、その組成物の予防的活性と治療的活性との間の区別が可能になる。
他のモデルが、以下に簡単に記載される。
（皮下（ｓ．ｃ．）腫瘍増殖の異種移植片モデル）
例示的なモデル系において、ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスは、その動物の右側のｓ．ｃ．にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳癌）（０．２ｍｌ中に１０６個の細胞）を接種される。これらの腫瘍は、２００ｍｍ３にされ、その後、試験組成物による処置が開始される（１日１回のＩＰで、１日につき動物１匹あたり１００μｇ）。腫瘍体積は、１日おきに取得され、そしてその動物は、処置の２週間後に屠殺される。これらの腫瘍は、切除され、秤量され、パラフィン包理される。．腫瘍の組織学的切片は、例えば、Ｈ染色およびＥ染色、抗ＣＤ３１染色、Ｋｉ−６７染色、ＴＵＮＥＬ染色、ならびにＣＤ６８染色によって分析される。
（転移の異種移植片モデル）
本発明の化合物はまた、実験的転移モデルを使用して後期の転移の阻害について試験される（Ｃｒｏｗｌｅｙ，ＣＷら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０ ５０２１−５０２５（１９９３））。後期の転移は、腫瘍細胞の接着および血管外遊出、局所浸潤、播種、増殖および新脈管形成の工程を含む。レポーター遺伝子（好ましくは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子であるが、酵素クロラムフェニコールアセチル−トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼまたはＬａｃＺをコードする遺伝子によって代替される）によってトランスフェクトされたヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）が、ヌードマウスに接種される。このアプローチは、これらの細胞の運命を追跡するための、これらのマーカーのいずれかの利用（ＧＦＰの蛍光検出または酵素活性の組織学的な比色定量検出）を可能にする。細胞は、好ましくはｉｖに注射され、そして転移は、特に、肺においてであるが、所属リンパ節、大腿および脳においても、約１４日後に同定された。これは、ヒト前立腺癌において天然に存在する転移の器官親和性を模倣する。例えば、ＧＦＰを発現するＰＣ−３細胞（マウス１匹あたり１０６個の細胞）は、ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスの尾静脈にｉｖで注射される。動物は、１日１回のＩＰで、１日につき動物１匹あたり１００μｇにて試験化合物によって処置される。単一の転移細胞および病巣は、蛍光顕微鏡もしくは光学顕微鏡の組織化学によってか、またはその組織を削ることおよび検出可能な標識の定量的比色アッセイによって、可視化され、そして定量化される。
（げっ歯類モデルにおけるインビボの自発的転移の阻害）
ラット同系乳癌系（Ｘｉｎｇら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６７：４２３−４２９（１９９６））は、Ｍａｔ ＢＩＩＩラット乳癌細胞を利用する。腫瘍細胞細胞（例えば、０．１ｍｌ ＰＢＳ中に約１０６個）は、雌Ｆｉｓｈｅｒラットの***の脂肪パッドに接種される。接種と同時に、１４日Ａｌｚａ浸透圧性小型ポンプが、試験化合物の分配のために、腹腔内に移植される。この化合物は、ＰＢＳ（例えば、２００ｍＭストック）中に溶解され、濾過滅菌され、そして約４ｍｇ／ｋｇ／日の放出速度を達成する小型ポンプ中に配置される。コントロール動物は、小型ポンプ中の、ビヒクル（ＰＢＳ）のみか、またはビヒクルコントロールペプチドを受容する。動物は、約１４日目に屠殺される。本発明の活性化合物によって処置されたラットにおいて、原発腫瘍のサイズ、ならびに脾臓、肺、腎臓、およびリンパ節における転移の数（分散した病変として数えられる）の有意な減少が、観察される。組織学的分析および免疫組織化学的分析は、処置した動物中の腫瘍において、壊死およびアポトーシスの徴候の増加を示す。広い壊死領域が、新生血管形成を欠く腫瘍領域において認められる。ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４ベースの融合ポリペプチド（「ＧｌｙＢ４」）（例えば、ＨＡまたはＨｉｓタグを有する）およびそれらの誘導体が、有効であり、そしてこれらは、関連するコントロールポリペプチドより、少なくとも２倍強力であることが見出される対照的に、コントロールポリペプチドによる処置は、腫瘍のサイズまたは転移の有意な変化を引き起こさない。
本発明に従う有用な抗癌剤である化合物に関して、それは、少なくとも１つの、当該分野において認識されるインビトロアッセイ系またはインビボアッセイ系（例えば、上に記載されるもの）において、有意な抗腫瘍活性（例えば、原発腫瘍または転移腫瘍の増殖、腫瘍の転移、腫瘍の新脈管形成などの阻害）を示すべきである。
チロシンキナーゼレセプターアンタゴニストとして作用する本融合ポリペプチドの適用は広く、そして異常かもしくは望ましくない新脈管形成または細胞遊走もしくは侵入に関連する状態を含む。これらの状態の非限定的な列挙としては、原発性および転移固形腫瘍、良性の過形成、動脈硬化症、心筋血管新生、バルーン血管形成術後の血管再狭窄、血管外傷後の新生内膜形成、血管移植再狭窄、冠副側枝形成、深部静脈血栓症、虚血性四肢新脈管形成、毛細血管拡張症、化膿性肉芽種、角膜疾患、ルベオーシス、血管新生緑内障、糖尿病または他の網膜症、水晶体後線維増殖症、糖尿病性新生血管形成、黄斑変性症、子宮内膜症、関節炎、慢性炎症性状態に関連する線維症（乾癬および強皮症を含む）、肺線維症、化学療法誘発線維症、瘢痕および線維症を伴う創傷治癒、消化性潰瘍、骨折、ケロイド、および脈管形成、造血、***、月経、妊娠および胎盤形成の異常、または新生血管形成が病原性または望ましくない、あらゆる他の疾患または状況が挙げられる。
ＮＲＧの活性なＥＧＦ様ドメイン（アゴニストとして）およびｅｒｂＢレセプターの細胞外ドメイン（アンタゴニストとして）に加えて、他の活性な増殖因子および分化因子およびそのそれぞれのレセプターも、本融合ポリペプチドのＰｔｒｇ成分であり得、従ってアゴニスト（Ｐｔｒｇとして増殖／分化因子ドメイン）またはアンタゴニスト（ＰｔｒｇとしてレセプターＥＣＤ）として細胞表面に標的化され得る。これとしては、ＥＧＦ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ニューロトロフィン（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＮＴ４など）、ＶＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ならびにトランスフォーミング増殖因子αおよびβ（ＴＧＦαおよびＴＧＦβ）、ネトリン、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ）を含むがこれらに限定されないサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の神経学的疾患において使用するために選択された神経成長因子（ＮＧＦ）の非限定的な例は、以下のとおりである。ＡＬＳにおいて、好ましいＰｔｒｇはＢＤＮＦまたはＮＴ４であり、それはＨＳＰＧリッチな細胞表面へ伝達されて神経保護を提供する。アルツハイマー病において、好ましいＰｔｒｇは、ニューロン、例えば中枢コリン作動性ニューロンの生存または増殖を刺激する任意の神経栄養因子である。パーキンソン病に関しては、好ましいＰｔｒｇは、黒質線条体ドパミン作動性ニューロン（または同じ部位へ移植された他のドパミン作動性細胞）の生存または増殖を促進する任意の神経栄養因子である。重症筋無力症において、好ましいＰｔｒｇは、ニューレグリンまたはコリン作動性神経筋接合部に伝達される、シナプス後ＡＣｈＲの他の刺激剤である。糖尿病性ニューロパシーに関しては、好ましいＰｔｒｇは、網膜または腎臓のような、任意の適当な標的臓器に伝達されるＮＧＦである。
ここで本発明を一般的に記載したので、説明のために提供され、そして明記されなければ本発明を制限することを意図しない、以下の実施例を参照することによって、本発明がより容易に理解される。
（実施例１）
（ＮＲＧのヘパリン結合ドメインによるＥＣＭに対する標的化組換えＮＲＧアンタゴニスト）
（材料および方法）
アミノ酸１４〜２７６に対応するＮＲＧ β１組換えタンパク質ＩＧ−ＥＧＦは、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）によって提供された。このＮＲＧアンタゴニストＩｇＢ４構築物は、Ｄｒ．Ｙ．Ｙａｒｄｅｎ（Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔ．，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）からの寄贈品であった。細胞培養のための全ての培地、緩衝液および材料ならびにトランスフェクション試薬を、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。ヘパリンカラムを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製であった。ホスホチロシン抗体４Ｇ１０を、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）から購入し；抗ＨＡモノクローナルの未加工腹水ＨＡ．１１は、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）製であり；抗ＨＡ親和性マトリックス（３Ｆ１０）は、Ｒｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）製であり；ヤギ抗マウス二次抗体は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）であった。Ｇｅｌｃｏｄｅ ＳｉｌｖｅｒＳＮＡＰ Ｓｔａｉｎキットを、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入した。
（２．Ｂ４−ＨＡ構築物およびＢ４−Ｆｃ−ＨＡ構築物の調製）
ｅｒｂＢ４レセプターのＥＣＤは、ヒトｅｒｂＢ４ＮＭ＿００５２３５ ｍＲＮＡ［配列番号１３を参照のこと］の残基２８〜１９７８ｂｐに対応し、そして３４〜１０８ｂｐは、成熟タンパク質の局在化のための２５アミノ酸のシグナル配列へと翻訳される。ＮＲＧのＨＢＤドメインおよびＨＢＤ−Ｓドメインを、ヒトＮＲＧ１ ＮＭ＿０１３９６４から得た。ヒトＮＲＧ１ ＮＭ＿０１３９６４において、ＨＢＤドメインは、そのＤＮＡ配列の１７２〜４８９ｂｐに対応する一方で、ＨＢＤ−Ｓ（スペーサードメインを含む）は、１７２ｂｐ〜６６３ｂｐに伸びていた。マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）がＨＡタグのＮＨ２末端に配置されるプラスミドｐＭＨ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、プラスミドｐｃＤＭ７中のＮＲＧアンタゴニストＩｇＢ４（Ｃｈｅｎ，Ｘ，１９９６．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：７６２０−９）からＢ４−ＨＡ構築物およびＢ４−Ｆｃ構築物を産生した。ＩｇＢ４のＰＣＲを行って、ｅｒｂＢ４（Ｂ４ＨＡ）単独のＥＣＤおよびｅｒｂＢ４−Ｆｃ（Ｂ４ＦｃＨＡ）のＥＣＤの両方に制限酵素認識部位Ｋｐｎ ＩおよびＥｃｏＲＩを付加した。
Ｂ４ＨＡに対するプライマー対は、以下：
順方向 ５’−Ｃ ＴＴＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＣＡＡ ＡＡＡ ＡＴＧ ＡＡＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＡＣＡ Ｇ−３’ ［配列番号１５］；
逆方向 ５’−ＣＧ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＴＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＴＴＧ ＴＧＧ ＴＡＡ ＡＧＴ ＧＧ−３−’［配列番号１６］
であった。
Ｂ４ＦｃＨＡに対するプライマー対は、以下：
順方向 ５’−Ｃ ＴＴＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＣＡＡ ＡＡＡ ＡＴＧ ＡＡＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＡＣＡ Ｇ−３’ ［配列番号１７］
逆方向 ５’−ＣＣＧ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＡＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＧ−３’ ［配列番号１８］。
ＰＣＲのための条件は、以下の通りであった：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５ｍＭの各プライマーおよび１．２５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。プラスミドおよびＰＣＲ産物の両方を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩによって消化した。このフラグメントを、Ｑｕｉａｘゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって「浄化（ｃｌｅａｎ ｕｐ）」し、その後、短時間ＤＮＡライゲーションキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して室温にて５分間ライゲーションした。完全コード領域を、ＰＣＲフラグメントの検証およびライゲーションのために配列決定した。
（３．Ｂ４−ＨＢＤ−ＨＡ構築物、ＨＢＤ−Ｂ４−ＨＡ構築物およびＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡ構築物の調製）
Ｂ４−ＨＢＤ−ＨＡを、Ｂ４−Ｆｃ−ＨＡ構築物からサブクローニングした。ＮＲＧβ１形態のヒトＨＢＤドメインを、プラスミドＨＡＲＩＡ ＰＡＴＨ２（Ｓ．Ｔｅｊｖｉｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａから得た）から増幅し、以下のプライマー対：
順方向 ５’−ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＣＧＡ ＧＧＣ ＣＴＣ Ｃ−３’；［配列番号１９］
逆方向 ５’−Ｇ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＣＣ ＴＡＡ ＴＴＴ ＧＣＴ ＧＡＴ ＣＡＣ ＴＴＴ ＧＣ−３’ ［配列番号２０］
を使用してＢａｍＨＩ制限酵素部位およびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を付加した。ＨＢＤ ＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによって消化し、そしてＦｃ部分をＢ４ＦｃＨＡ構築物から切り出した後にＭＣＳ部位に挿入した。
ＨＢＤ−Ｂ４−ＨＡおよびＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡを３工程で作製した。
（１）ＳＳ−ＨＡ構築物を、以下のプライマー対：
順方向 ５’−Ｇ ＣＣＡ ＡＧＣ ＴＴＧ ＣＡＡ ＡＡＡ ＡＴＧ ＡＡＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＡＣＡ Ｇ−３’；［配列番号２１］
逆方向 ５’−ＧＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＣＴＧ ＡＧＡ ＡＴＣ ＧＣＴ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＡＣ Ｇ−３’ ［配列番号２２］
を使用してＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＫｐｎ Ｉを付加することによって、ｅｒｂＢ４のシグナル配列（ＳＳ）をｐＭＨのＭＣＳ部位にサブクローニングすることにより作製した。
（２）次いでＳＳ−ｅｒｂＢ４−ＨＡ構築物を、以下のプライマー対：
順方向 ５’−ＴＴＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＡ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＣＡ ＧＧＡ ＡＣＧ−３’ ［配列番号２３］；
逆方向 ５’−ＣＧ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＴＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＴＴＧ ＴＧＧ ＴＡＡ ＡＧＴ ＧＧ−３’ ［配列番号２４］
を使用することによって、シグナル配列を有さないｅｒｂＢ４ＥＣＤを上記ＳＳ−ＨＡ構築物の制限酵素部位Ｋｐｎ ＩとＥｃｏＲＩとの間に挿入することによりサブクローニングした。
（３）ＰＣＲを、両側にＫｐｎ Ｉ部位を有する、ＨＢＤドメインおよびＨＢＤ−Ｓドメインを得るために行った。ＨＢＤドメインのために使用したプライマー対は、以下：
順方向 ５’−ＴＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＣＧＡ ＧＧＣ ＴＣＣ Ｇ−３’ ［配列番号２５］；
逆方向 ５’−ＧＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＴＣＣ ＴＡＡ ＴＴＴ ＧＣＴ ＴＡＴ ＣＡＣ ＴＴＴ ＧＣ−３’ ［配列番号２６］
であった。ＨＢＤ−Ｓドメインのために使用したプライマー対は、以下：
順方向 ５’−ＴＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＣＧＡ ＧＧＣ ＴＣＣ Ｇ−３’ ［配列番号２７］；
逆方向 ５’−ＧＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＣＴ ＴＧＴ ＣＣＣ ＡＧＴ ＧＧＴ ＧＧＡ ＴＧＴ ＡＧ−３’ ［配列番号２８］
であった。
ＨＢＤのＰＣＲ産物またはＨＢＤ−ＳのＰＣＲ産物を、ＳＳ−ｅｒｂＢ４−ＨＡ構築物のＳＳ配列とｅｒｂＢ４配列との間に挿入して、ＨＢＤ−Ｂ４−ＨＡ構築物およびＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡ構築物を、最終的に作製した。ＤＮＡ配列決定を適用して、融合構築物の配列およびフレーム中の適切な方向を検証した。
（４．細胞培養）
Ｌ６細胞を、１０％ＣＯ２インキュベーターにおいて、および１０００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で３７℃にて培養した。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＣＯ２インキュベーターにおいて、１０％のウシ胎仔血清、１ｍＭのＬ−グルタミン、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．ｌｍＭ非必須アミノ酸、１０００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で３７℃にて培養した。選択的抗生物質ジェネテシン２００μｇ／ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＮＲＧアンタゴニストを有する安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞培養物に添加した。
（５．ＨＥＫ２９３における細胞ＮＲＧアンタゴニストの安定な発現）
ＨＥＫ２９３細胞を、２５ｍｍフラスコ中で８０％コンフルーエンスまで培養し、そして指示される通りリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して４種のＮＲＧアンタゴニスト構築物を用いてトランスフェクトした。次いで抗生物質ジェネテシンを、４００μｇ／ｍｌでトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞に添加して、ポジティブなアンタゴニストのトランスフェクト細胞を選択した。ジェネテシン選択の３週間後、このトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞を、希釈し、そして９６ウェルプレートにプレートして、単一のポジティブクローンを得た。次いで、最も高いレベル（ＨＡ抗体を使用したウェスタンブロットによって確認した）のアンタゴニストを発現した単一のクローンを、２００μｇ／ｍｌのジェネテシンを含む培養培地中に維持した。Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、安定にトランスフェクトしたＮＲＧアンタゴニスト細胞株に、１０％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて２日間適用した。次いで、調製済みＯｐｔｉｍｅｍ Ｉ培地を、以下の実験において使用した。
（６．ヘパリンカラム結合）
上記４種のＮＲＧアンタゴニストを含む調製済み培地を、ヘパリンカラムに通して、ヘパリンに結合させた。過剰に結合したアンタゴニストタンパク質を、１×ＰＢＳによって２回洗浄した。次いで上記アンタゴニストタンパク質を、ＮａＣｌの濃度を増加（０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍおよび１Ｍ）させて溶出させた。各工程からの流出（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）溶液を、後で記載されるように抗ＨＡウェスタンブロットによって調べて、アンタゴニストのヘパリン結合能力を決定した。
（７．組換えタンパク質の精製および定量化）
ＮＲＧアンタゴニストを、製造業者の説明書に従い、抗ＨＡ親和性マトリックス（３Ｆ１０）（ラットｍＡｂ）によって精製した。簡単にいうと、このカラムを、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＥＤＴＡを含む緩衝液によって平衡化した、そして調整済み培地中の各アンタゴニストを、上記抗ＨＡ親和性マトリックスに個別に適用した。過剰な結合していないアンタゴニストタンパク質を、２０容量の洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＥＤＴＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０）によって洗浄した。結合したＮＲＧアンタゴニストを、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２）によって溶出させた。次いで精製した組換えタンパク質を、ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して定量化した。
（８．銀染色）
調製済み培地および精製したＮＲＧアンタゴニストの両方を、７．５％還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離した。このゲルを、３０％のエタノールおよび１０％の酢酸によって３０分間固定した。その後１０％のエタノールおよび超純水を使用してそのゲルを洗浄し、その後増感剤を含むＳｉｌｖｅｒＳＮＡＰ染色溶液によって３０分間染色した。次いでそのゲルを、エンハンサーを含むＳｉｌｖｅｒＳＮＡＰ現像溶液を使用して現像した。５％の酢酸を使用して、所望のバンド強度に達したときにその反応を止めた。そのゲルを、真空ゲル染色機を使用して濾紙上で乾燥した。
（９．Ｌ６アッセイ）
５０ｐＭのＮＲＧと組み合わせた比較可能な量のＮＲＧアンタゴニストを、細胞のプレート後８日目にＬ６細胞に適用し、そして１０％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃にて４５分間インキュベートした。ポジティブコントロールのＬ６細胞を、５０ｐＭのＮＲＧのみによって処理した。Ｌ６細胞溶解物を、調製し、そして５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。ｅｒｂＢレセプターリン酸化のウェスタンブロットを、４Ｇ１０抗体を使用して行った。
（１０．ウェスタンブロット）
ウェスタンブロットを、調製済みＮＲＧアンタゴニスト培地およびアンタゴニスト処理Ｌ６細胞の両方について行った。アンタゴニストタンパク質およびＬ６細胞を、上に記載されるように、ＳＤＳサンプル緩衝液中で可溶化し、そして５分間煮沸した（Ｌｉら，前出も参照のこと）。７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動したＮＲＧアンタゴニストを、抗ＨＡ ｍＡｂ ＨＡ．１１によって検出した。ホスホチロシンｍＡｂ ４Ｇ１０を使用して、オーバーラン５％還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での分離後、Ｌ６細胞ウェスタンブロット分析においてリン酸化ｅｒｂＢレセプター（ｐ１８５）を検出した。次いでそのフィルターを、ペルオキシダーゼと結合したヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を用いてプローブし、化学発光試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）によって処理し、そしてＸ−ブルーフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．）に曝露した。
（結果）
これらの研究の目的は、付加した「標的化」ＨＢＤドメインを有するｅｒｂＢ４レセプターの細胞外リガンド結合ドメインを使用して強力なＮＲＧアンタゴニストを作製することであった。発現を追跡し、そしてそのアンタゴニスト構築物を精製するために、９アミノ酸のＨＡタグを、ｅｒｂＢ４ドメインおよびＨＢＤが異なる関連した位置において試験されたｅｒｂＢ４構築物のＣ末端に導入した（図２Ａ）。コントロールとして、ｅｒｂＢ４のＥＣＤを、ＨＢＤドメイン（Ｂ４−ＨＡ）を含まずに単独で発現させた。他の３種のアンタゴニストを、ドミナントネガティブなｅｒｂＢ４レセプター（Ｂ４−ＨＡ）のＮ末端（ＨＢＤ−Ｂ４−ＨＡおよびＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡ）またはＣ末端（Ｂ４−ＨＢＤ−ＨＡ）のいずれかにＨＢＤドメインを付加することによって構築した。ｅｒｂＢ４レセプターの２５アミノ酸のシグナル配列を、各組換えタンパク質のＮ−末端に維持した。なぜなら翻訳後修飾の間に短縮されることが知られていたからである。ＨＢＤ−Ｂ４−ＨＡ構築物およびＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡ構築物は、ＨＢＤとｅｒｂＢ４レセプターとの間に天然に存在するグリコシル化スペーサードメイン（Ｓ）を挿入することによって異なる。全てのＮＲＧアンタゴニストを、配列決定によって検証した。
上記４種のＮＲＧアンタゴニスト構築物を、ＨＥＫ２９３細胞において安定に発現させ、そしてＨＡ抗体を使用する培養培地のウェスタンブロットによって検出した（図２Ｂ）。予想通り、ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡは、１６０〜１８０ｋＤａのより高分子量側に動いたが、他の３種のアンタゴニストタンパク質は、約１２０〜１４０ｋＤａであった。より大きい分子量のＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡは、Ｎ−ＨＢＤのスペーサー領域におけるさらなるＯ−結合型およびＮ−結合型のグリコシル化に起因していた（Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ，ＧＤら、（１９９７） Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０：４２９−４５８）。
組換え構築物のヘパリンに結合する能力を、培養培地中のＨＢＤ／ヘパリン相互作用によって試験した。各構築物を、小さいヘパリンカラムに適用した。流出および（増加性の塩濃度による溶出）を、図３に示されるように、ＨＡウェスタンブロットによって分析した。Ｂ４−ＨＢＤ−ＨＡタンパク質およびＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡタンパク質が、ヘパリンカラムに結合した一方で、Ｂ４−ＨＡ融合ポリペプチドおよびＨＢＤ−Ｂ４−ＨＡ融合ポリペプチドは、結合しなかった。後者は、ｅｒｂＢ４ドメインとＨＢＤとの近い接近が三次構造に干渉するか、またはＨＢＤドメインの正に荷電したＬｙｓ残基およびＡｒｇ残基をブロックするという事実から生じる。
ヘパリンに結合した２種のＨＢＤ融合ポリペプチドの比較すると、ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡが、Ｂ４−ＨＢＤ−ＨＡより高い結合親和性を有することが明らかとなった。より高い塩濃度（＞１Ｍ）が、ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡの結合相互作用を崩壊させるのに必要とされた一方で、０．４〜０．５Ｍ程度の低さのＮａＣｌが、ヘパリンカラムからＢ４−ＨＢＤ−ＨＡを溶出させた。この親和性の違いについての１つの説明は、Ｂ４−ＨＢＤ−ＨＡ中のＨＡタグは、９アミノ酸のみからなるにもかかわらず、ＨＢＤのコンホメーションに対して小さい効果を発揮し得ることである。より適当な説明は、スペーサードメインがｅｒｂＢ４からＨＢＤを最適に引き離して、ヘパリン結合に必要なタンパク質の適切なフォールディングを達成したことである。つまり、ネイティブのＮＲＧにおいて、このスペーサードメインは、常に、ネイティブのＨＢＤドメインとＥＧＦ様ドメインとの間に存在し、したがってそれらの機能を支持するための、これらのドメインの適切な空間的な分離に重要であり得る（Ｆｉｓｃｈｂａｃｈら、前出）。
ウェスタンブロット測定に基づいて、比較可能な量のＮＲＧアンタゴニスト融合ポリペプチドを、Ｌ６細胞において、ＮＲＧ（ｐ１８５）のＩＧ−ＥＧＦ形態によってｅｒｂＢレセプターリン酸化をブロックする、融合ポリペプチドの能力についてアッセイした（図４）。Ｂ４−ＨＡおよびＨＢＤ−Ｂ４−ＨＡはｐ１８５レセプターリン酸化に対してほとんど効果を有さなかった一方で、ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡおよびＢ４−ＨＢＤ−ＨＡの両方は、ｅｒｂＢレセプター活性化を劇的に減少させた。ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡ構築物は、もっとも大きい効果を有した。有効性のこのオーダーは、上記組換えタンパク質のヘパリン結合活性と正確に相関した。より強いヘパリン結合性能は、より多くの上記組換えアンタゴニストをＨＳＰＧに富むＬ６細胞表面に局在化させると考えられ、組換えアンタゴニストは、内因性ｅｒｂＢレセプターと競合し得、最も大きなＮＲＧ拮抗作用を生じる。
より多くの定量的結果を得るため、およびインビボでの強力な癌薬物としてこれらのタンパク質を試験するために、Ｎ末端においてＨＡタグの代わりにＨＩＳタグを有し、ニッケル親和性マトリックス上での精製が容易な組換えＮＲＧアンタゴニストを調製した。図５Ａに示される銀染色は、左に精製ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＩＳ（ＧｌｙＢ４と称される）を示し、そして右にＢ４−ＨＩＳ（Ｂ４）を示す。ヘパリンカラムをまた使用して、またヘパリンに結合するＧｌｙＢ４アンタゴニストを精製した。図５Ｂは、ＧｌｙＢ４との事前のインキュベーション後の洗浄が、ｐ１８５のリン酸化として測定されるニューレグリンシグナル伝達の持続性の途絶をもたらしたことを示す。ＧｌｙＢ４およびＢ４を、Ｌ６筋肉細胞と一緒に事前に１時間インキュベートし、次いで十分に洗浄した後に組換えニューレグリンを添加した。ＧｌｙＢ４による前処理が、ニューレグリンシグナル伝達の完全かつ持続性の遮断をもたらしたのに対して、Ｂ４（ＨＢＤを欠く）は、ニューレグリン負荷（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対する持続性の効果を有さなかった。図５Ｃは、ＧｌｙＢ４が、０日目、３日目および６日目に薬物無し（コントロール）、ＧｌｙＢ４、Ｂ４、またはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）のいずれかによって処置したＭＣＦ１０ＣＡ１ヒト乳癌の増殖のブロックにおいて、Ｂ４より有効であったことを示す。ＧｌｙＢ４は、比較的（少なくともよりわずかに）、かなり高い濃度のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（１００μｇ／ｍｌ）より有効であった（これらのヒト乳癌細胞株を用いたさらなる研究についての図６〜１１を参照のこと）。図５Ｄは、増殖が図５Ｃにグラフで記載される細胞の４つの顕微鏡写真を示す。ＧｌｙＢ４は、培地のみ（コントロール）、Ｂ４、ＧｌｙＢ４およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の存在下において６日間増殖させたＭＣＦ１０ＣＡ１細胞のこれらの顕微鏡写真に認められ得るように、接触阻害を促すことによって部分的に増殖をブロックする。（このヒト癌細胞株による作業についての実験の詳細を、実施例２に記載する）。
ヒトの疾患の処置における最も重要な問題の１つは、標的化される疾患組織に対する薬剤の選択的（可能な場合）な送達である。この選択性は、有効性について薬物の十分なレベルを達成するためだけでなく、他の部位における望ましくない副作用を最小化するためにも重要である。これは、癌の処置において特に重要である。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置における外来性タンパク質（脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ））の最近の試みは、所望の作用部位に対する不適切な標的化に起因して、失敗してきた。本発明は、ＮＲＧのＨＢＤを使用して、ＨＳＰＧに富む細胞表面に対してタンパク質を標的化する手段を提供する。これはまた、これらおよび他のタンパク質を、それらのタンパク質が必要され、そしてそれらの安定性および有効性を増加する場所の近くに運ぶ手段を提供するべきである。
まとめると、本発明の研究は、４種の組換えＮＲＧアンタゴニストの生化学的特徴および生物学的特徴を規定し、そしてＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡ（「ＧｌｙＢ４」（「タグ」としてＨＩＳを使用するかまたはＨＡを使用するかにかかわらず）が、ＥＣＭにおけるＨＳＰＧとの相互作用によって細胞表面上のヘパリンの濃縮をもたらす、高いヘパリン結合親和性に部分的に起因して最も強力なアンタゴニストであったことを示した。ＨＢＤ含有ＮＲＧアンタゴニストは、オートクラインＮＲＧループをブロックするための理想的な候補である。このような性能を有する薬剤は、有効な乳癌および卵巣癌の治療であることが予想される。
（実施例２）
（ヒト乳腺細胞の悪性転換によるオートクラインニューレグリンシグナル伝達ループの発生）
使用される略語：ＮＲＧ、ニューレグリン；ＰＢＳ、リン酸緩衝化生理食塩水；ｐ１８５、リン酸化ｅｒｂＢレセプター；ＩｇＢ４、可溶性ｅｒｂＢ４免疫グロブリンＦｃ融合アンタゴニスト、ＥＧＦ、上皮増殖因子。
この実施例は、オートクラインニューレグリンシグナル伝達の途絶がヒト乳癌細胞の増殖速度を減少させ得ることを示すので、標的化されるＮＲＧアンタゴニストに対する必要性を定義するのに役立つ。ＭＣＦ１０シリーズの細胞を使用して、どのようにしてＮＲＧが乳腺上皮細胞増殖に影響するのかを調査した。ｃＤＮＡマイクロアレイ分析を使用することで、ＮＲＧが、ＮＲＧ応答遺伝子の群の顕著なダウンレギュレーションと相関するＭＣＦ１０ＡＴ細胞の増殖速度を減少させることを示した。ＮＲＧ応答遺伝子の群の多くは、細胞増殖の間にアップレギュレートされることが示されている。ここで、ＭＣＦ１０シリーズにおける細胞が漸進的に悪性になる場合、これらの細胞の外来性ＮＲＧ処置が、これらの遺伝子をダウンレギュレートするＮＲＧの随伴性の不全を伴って抗増殖性効果から増殖性効果への変化をもたらすことを示す。数種の異なるＮＲＧおよびＮＲＧシグナル伝達 アンタゴニストを使用することで、悪性の進行が、ｅｒｂＢ３発現の減少ならびにｅｒｂＢ２およびＮＲＧの両方の過剰発現に関連する、増殖性のオートクラインＮＲＧシグナル伝達ループの発生に関連することを示す。
（材料および方法）
試薬および細胞株：インスリンおよびヒドロコルチゾンを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した；上皮増殖因子を、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）から得た；これら毒素およびＡＧ１４７８を、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入した。細胞培養のための全ての他の培地、緩衝液、および材料を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。アミノ酸１４〜２７６に対応するニューレグリンβ１組換えタンパク質ＩＧ−ＥＧＦ形態は、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）によって提供された。トラスツズマブは、Ｄｒ．Ｗｅｉ−Ｚｅｎ Ｗｅｉ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗａｙｎｅ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）からの惜しみのない寄贈品であった。ホスホチロシン抗体４Ｇ１０を、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）から購入した；ｅｒｂＢ２抗体およびｅｒｂＢ３抗体を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から得た；ヤギ抗マウス抗体およびヤギ抗ウサギ抗体を、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から得た。正常乳腺上皮ＭＣＦ１０Ａ細胞、前悪性ＭＣＦ１０ＡＴ細胞および悪性ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞は、Ｂａｒｂａｒａ Ａｎｎ Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｏｒｅ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｗａｙｎｅ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって提供された。ＮＲＧアンタゴニストＩｇＢ４によって安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞は、Ｄｒ．Ｃｏｒｆａｓ（Ｈａｒｖａｒｄ）からの寄贈品であり、そしてこのプラスミドは、本来は、Ｄｒ．Ｙａｒｄｅｎ（Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｓｒａｅｌ）からのものであった。
細胞培養：ＭＣＦ１０Ａ細胞およびＭＣＦ１０ＡＴ細胞を、５％ ＣＯ２インキュベーターにおいて、５％のウマ血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１０ｎｇ／ｍｌのインスリン、２０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子、１００ｎｇ／ｍｌのコレラ毒素および０．５ｍｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で３７℃にて培養した。ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞を、５％ ＣＯ２インキュベーターにおいて、５％のウマ血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地だけで培養した。細胞を、週に２回供給し、そして１週間ベースで継代した。Ｌ６細胞を、先に記載したように、１０％ＣＯ２インキュベーターにおいて、１０％のウシ胎仔血清、１ｍＭのＬ−グルタミン、１０００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で３７℃にて培養した。ＮＲＧアンタゴニスト ＩｇＢ４によって安定にトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３細胞を、１０％ＣＯ２インキュベーターにおいて、１０％のウシ胎仔血清、１ｍＭのＬ−グルタミン、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１０００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび選択的抗生物質ジェネテシン２００μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ中で培養した
細胞増殖アッセイ：全３種の乳腺上皮細胞株を、ウェル１つあたり５０００個の細胞で４８ウェルプレートにおいて通常のＭＣＦ１０Ａ／ＡＴ培地またはＭＣＦ１０ＣＡ１培地にプレートした。３日間インキュベートした後、ＭＣＦ１０Ａ／ＡＴ培地中に１ｎＭのＮＲＧ またはただＭＣＦ１０Ａ／ＡＴ培地単独を、それらの細胞にさらに２４時間適用し、次いでそれらを、培養培地によって洗浄し、その後、４日目、５日目、６日目、７日目、および８日目に血球計を使用して、細胞数を計測した。
ＲＮＡ調製およびノーザンブロッティング：ＭＣＦ１０Ａ細胞、ＭＣＦ１０ＡＴ細胞およびＭＣＦＣＡｌ細胞を、２５ｃｍフラスコ中で約６０％コンフルーエンスまで培養した。これらの細胞を、ＭＣＦ１０Ａ／ＡＴ培地中の１ｎＭ ＮＲＧによって２４時間処理した。次いでこれらの細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）によって１回洗浄し、そして収穫した。全ＲＮＡを、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ（Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して細胞から抽出し、Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）によって「浄化し」、その後、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）と称される蛍光色素結合法を使用して定量化した。ノーザンブロットを、先に記載されるように行った（Ｌｉ ＆ Ｌｏｅｂ、前出）。ＭＣＦ１０Ａ／ＡＴ培地におけるＮＲＧ処置 対 コントロールＭＣＦ１０Ａ／ＡＴ培地の後に、上記３種の乳腺上皮細胞株から抽出したＲＮＡに対して行った。プローブを、ＰＣＲによって作製し、次いで記載されるように、Ａｌｐｈａｇｅｎｅ Ｉｎｃによって提供されるクローン由来の全長ｃＤＮＡクローンに対してランダムプライミングすることによって調製した。そのメンブレンを、正規化のために、３２Ｐ標識ＧＡＰＤＨプローブによって再度プローブした。
ウェスタンブロットおよびＬ６筋アッセイ：上記３種の細胞株のＰ１８５レセプターリン酸化を、ＷＯ ０３／０１２０４５およびＬｉ Ｑ ＆ Ｌｏｅｂ ＪＡ（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ；２７６：３８０６８−７５に記載されるように、３日齢の培養物に対する３０分間のＮＲＧ処置後にホスホチロシンウェスタンブロットによって測定した。ＮＲＧ誘導性レセプター活性化をブロックする実験において、ブロッキング試薬（ＩｇＢ４、１０μＭのＡＧ１４７８または１００μｇ／ｍｌのトラスツズマブ）を伴うか、または伴わずに１ｎＭのＮＲＧを、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、３日齢のＭＣＦ１０ＣＡ１細胞に対して３７℃にて３０分間適用した。その培地を廃棄し、そしてホスホチロシンウェスタンブロットを、上記の通りに行った。そのメンブレンを、ストリップし、そして定量化に使用した全部のｅｒｂＢ２タンパク質を検出するために、ポリクローナルウサギｅｒｂＢ２によって再度プローブした。
各細胞株由来のＮＲＧについてアッセイするための濃縮した培養培地を、Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にさらに２日間配置した３日齢の培養物において調製した。調製済み培地を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎデバイス（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｈａｎｏｖｅｒ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を４℃にて使用して濃縮した。同時に、上記３種の細胞株の細胞数を計測し、そしてそれを使用して、その培地中に放出されたＮＲＧの量を定量化するために、Ｌ６バイオアッセイに添加した１細胞あたりの調整済み培地の量を正規化した。
ＲＴ−ＰＣＲ：ＭＣＦ１０Ａ細胞、ＭＣＦ１０ＡＴ細胞、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞のいずれかから単離した１μｇの全ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲに使用した。ＲＴ−ＰＣＲを、ヒト ＮＲＧ β１形態のヘパリン結合ドメインに対応する以下のプライマーと共にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った：順方向 ５’−ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＣＧＡ ＧＧＣ ＴＣＣ−３’ ［配列番号２９］；逆方向 ５’−Ｃ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＣ ＴＡＡ ＴＴＴ ＧＣＴ ＧＡＴ ＣＡＣ ＴＴＴ ＧＣ−３’ ［配列番号３０］。ｃＤＮＡｓを、１％アガロースゲル上で分離し、そしてＰｏｌａｒｏｉｄ ６６７フィルムを備えるＰｏｌａｒｏｉｄ ＧｅｌＣａｍ （ＶＷＲ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を使用して写真撮影した。
ＩｇＢ４処理、ＡＧ１４７８処理およびトラスツズマブ処理：ＮＲＧアンタゴニスト ＩｇＢ４によって安定にトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３細胞を、Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉをその細胞に適用する前に、８０％コンフルエントになるまで培養した。２日後、Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ調整済み培地を、４℃においてＣｅｎｔｒｉｃｏｎによって濃縮した。４０μｌのＩｇＢ４調整済み培地または１０μＭのチロシンキナーゼインヒビターＡＧ１４７８を、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞に添加して３０分間処理する前に、ＭＣＦ１０Ａ／ＡＴ培地中の１５０ｍｌの１ｎＭ ＮＲＧと室温にて１５分間混合した、トラスツズマブ実験に関して、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞を、その細胞を、ＭＣＦ１０Ａ／ＡＴ培地中の１００μｇ／ｍｌトラスツズマブの存在下において、１ｎＭ ＮＲＧで３０分間処理する前に、ＭＣＦ１０ＣＡ１培地中の１００μｇ／ｍｌトラスツズマブによって２４時間前処理した。各アンタゴニストの量を、Ｌ６細胞のＮＲＧ誘導性の活性化をブロックするその能力に基づいて実験的に決定した。
（結果）
（ＮＲＧは、ＭＣＦ１０シリーズにおいて、抗増殖性因子から増殖性因子に変化し、そして細胞増殖遺伝子をダウンレギュレートするその能力を失う）
ＭＣＦ１０シリーズの細胞株の増殖速度に対するＮＲＧの効果を、血清含有培地中で増殖させたＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ１０ＡＴおよびＭＣＦ１０ＣＡ１を用いて調べた（図６Ａ〜６Ｃ）。プレートした３日後、２４時間の１ｎＭ ＮＲＧ処理は、ＭＣＦ１０Ａ細胞の増殖速度の持続性の減少をもたらした。対照的に、ＮＲＧ処理は、より悪性のＭＣＦ１０ＣＡ１細胞の初期の増殖速度を増加させた。ＭＣＦ１０ＡＴ細胞のＮＲＧ処理は、これらの中間であり、増殖速度の、小さい初期の減少のみであった。これらの結果は、細胞が、より悪性になるにつれて、抗増殖性効果から増殖性効果に切り換わるＭＣＦ１０細胞の増殖に対するＮＲＧの効果における漸進的な移行を示す。
細胞増殖は、多くの遺伝子が関与する複雑なプロセスである。最近、本発明者のグループは、最初の２４時間のＭＣＦ１０ＡＴ細胞３のＮＲＧ処理において協調的にダウンレギュレートされたＮＲＧ応答遺伝子の群を同定するために、ノーザンブロットによる確認を伴うｃＤＮＡマイクロアレイを使用した。これらの遺伝子の多くは、「増殖」遺伝子と見なされ得、そして数種のオンコジーン、細胞周期制御遺伝子、および細胞増殖遺伝子を含む。ＮＲＧ処理に応答して変化したこれらのＮＲＧ応答遺伝子のうち８個の代表的な群を、３種のＭＣＦ１０細胞株の各々による試験のために選択した（図７Ａ−７Ｂ）。ノーザンブロットを、１ｎＭ ＮＲＧを伴うか、または伴わずに２４時間処理した各細胞株から単離した全ＲＮＡに対して行った。ＮＲＧ処理しない場合、最も悪性の細胞株ＭＣＦ１０ＣＡ１は、これらのＭＣＦ１０Ａ細胞と比較して最も高いベースラインのレベルにてこれらの遺伝子を発現したが、ＭＣＦ１０ＡＴ細胞は、最も低いレベルにてそれらの遺伝子を発現し、したがって、より長い曝露を必要とした（図７Ａの右側において示される）。ＮＲＧ処理は、ＭＣＦ１０Ａ細胞およびＭＣＦ１０ＡＴ細胞の両方において種々の程度まで、これらの遺伝子のうちの８個全ての迅速なダウンレギュレーションをもたらした。しかし、図７Ｂに示す通り、その効果は、ＭＣＦ１０ＡＴ細胞に対するものより、ＭＣＦ１０Ａ細胞に対するものの方が有意に大きかった。これは、ＮＲＧがＭＣＦ１０ＡＴ細胞に対して一時的な効果のみを有する、上記の、細胞増殖に対するＮＲＧの効果と一致する。対照的に、ＮＲＧ処置によってそれらの増殖速度を増加させたＭＣＦ１０ＣＡ１細胞において、これらの遺伝子のうちのわずかばかりの非常に小さいダウンレギュレーションが存在した。したがって、増殖遺伝子は、より悪性のＭＣＦ１０ＣＡ１細胞において、他の細胞株と同様の速度で増殖するのにもかかわらず、基本的にアップレギュレートされ、そしてもはやＮＲＧによって効率的にダウンレギュレートされない（図６Ａ〜６Ｃを参照のこと）。これらの結果は、同じ増殖因子によるシグナル伝達がどのようにしてＭＣＦ１０細胞株シリーズにおける細胞増殖に対してこのような異なる効果を生じるのかに関する重要な機構の疑問をもたらす。
（ＮＲＧ増殖応答は、ｅｒｂＢ２の増加した発現、ｅｒｂＢ３の減少した発現、および内因性ＮＲＧの増加した分泌と相関する）
１つの可能性は、差次的なｅｒｂＢレセプターの発現および／または活性化が、ＭＣＦ１０細胞株シリーズにおいてＮＲＧに対する異なる応答に寄与し得ることである。実際に、ｅｒｂＢ２を過剰発現するＭＣＦ１０Ａ細胞は、ＮＲＧの***促進効果に、より感受性である（Ｒａｍ ＴＧら、（１９９５）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ；ｌ６３：５８９−５９６）。したがって、ＮＲＧ誘導性レセプターチロシンリン酸化（ｐ１８５）の程度を、ホスホチロシン抗体、ならびにＭＣＦ１０Ａ細胞、ＭＣＦ１０ＡＴ細胞およびＭＣＦ１０ＣＡ１細胞において活性レセプターのヘテロダイマーを形成し得るｅｒｂＢ２およびｅｒｂＢ３の相対的な存在量を使用して測定した。ｐ１８５は、複数のｅｒｂＢレセプターから構成され得るので、図８Ａにおけるホスホチロシンのウェスタンブロットを、ｅｒｂＢ２（図８Ｂ）およびｅｒｂＢ３（図８Ｃ）に対して特異的な抗体を用いて再度プローブした。上のバンド（ｐ１８５）は、主に、ｅｒｂＢ２およびｅｒｂＢ３から構成される。より下のバンドはより小量のｅｒｂＢ３免疫反応性を含んだが、その主な構成成分は、ＮＲＧ処置の非存在下において３種全ての細胞株中でリン酸化され続けるｅｒｂＢｌ（ＥＧＦレセプター；示さず）である。ｅｒｂＢレセプターが互いにヘテロダイマー化すると考えると、個々のレセプターサブタイプの免疫沈降は、他のサブタイプを沈めることなくしては不可能である。
３種全ての細胞株は、ｐ１８５リン酸化を誘導することによってＮＲＧに応答した。しかし、ＭＣＦ１０ＡＴおよびＭＣＦ１０ＣＡ１中のｅｒｂＢレセプターは、外来性ＮＲＧ処理を行わなくてもリン酸化された。さらに、外来性ＮＲＧ処理は、ＭＣＦ１０Ａ細胞およびＭＣＦ１０ＡＴ細胞の両方において強力なｅｒｂＢレセプターリン酸化を誘導したが、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞においては、リン酸化の小さく増加し続けるのみの量が、高い基礎レベルを上回って検出され得る（図８Ａ；ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞に対するＮＲＧの小さい効果を、より明確に示す図１０Ａ〜１０Ｃおよび図１２Ａ〜１２Ｃも参照のこと）。ｅｒｂＢ２抗体によって再度プローブした場合、ｅｒｂＢ２のレベルの増加が、正常乳腺上皮 ＭＣＦ１０Ａ細胞から前悪性ＭＣＦ１０ＡＴ細胞への移行の間および前悪性ＭＣＦ１０ＡＴ細胞から悪性ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞への移行の間に認められた（図８Ｂ）。ｅｒｂＢ２発現が増加すると同時に、ｅｒｂＢ３発現は、ＭＣＦ１０ＡＴ細胞およびＭＣＦ１０ＣＡ１細胞において低下した（図８Ｃ）。具体的には、ＭＣＦ１０Ａ中のｅｒｂＢ２／ｅｒｂＢ３の比は、ＭＣＦ１０ＣＡ細胞と比較して、０．２９±０．０８から２．７±０．４５まで変化した。ｅｒｂＢ４レセプターを、これらの細胞株において、上記で試験した抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ製）を使用して検出できなかった
悪性の細胞株における外来性ＮＲＧの非存在下でのｐ１８５レセプターリン酸化の高い基礎レベルの存在は、これらの細胞がＮＲＧを分泌し、次に、オートクライン経路においてｅｒｂＢ２レセプターおよびｅｒｂＢ３レセプターを活性化する可能性を生じる。ＮＲＧの存在について試験するために、ＭＣＦ１０Ａ細胞、ＭＣＦ１０ＡＴ細胞およびＭＣＦ１０ＣＡ１細胞のＲＴ−ＰＣＲを、ヒトＮＲＧのヘパリン結合ドメインに対して特異的なプライマー対を使用して行った（図９Ａ）。このドメインは、ＮＲＧの全ての可溶性形態において発現される（Ｆａｌｌｓ ＤＬ、（２００３）Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２８４：１４−３０）。定量的ではないが、これらの結果は、上記乳腺上皮細胞がより悪性の癌細胞になるにつれて、増加するレベルのＮＲＧが発現されることを示唆する。同じ数の上記３種の細胞株の各々から上記調整済み培地中に放出されるＮＲＧ活性の量を、ｐ１８５レセプターリン酸化によって、可溶性のＮＲＧ活性を測定する感度のよい手段として、Ｌ６筋細胞株を使用して測定した（Ｃｏｒｆａｓら、前出）。図９Ｂは、上記３種の細胞株の各々に由来する調整済み培地中のＮＲＧ活性の量が、細胞がより悪性になるにつれて有意に増加したことを示す。これは、それらの基礎ｐ１８５リン酸化の程度を平行して増加させ、このことは、内因性ＮＲＧ産生が、より悪性の細胞におけるｅｒｂＢレセプターリン酸化の高い基礎レベルの原因であることを示唆する。
（オートクラインループの存在は、ＮＲＧアンタゴニストによって示され得る）
上で報告した結果は、ＭＣＦ１０細胞がより悪性になるにつれて、それらが、細胞増殖を促進するオートクラインＮＲＧシグナル伝達ループを発生するという概念と一致する。したがって、高度に悪性のＭＣＦ１０ＣＡ１細胞におけるこのオートクラインループの遮断は、細胞の増殖速度を減少させると予想された。ＮＲＧシグナル伝達を、以下の３つの相補的なアプローチを使用してブロックした：（Ａ）培養培地中に放出される可溶性ＮＲＧに対する細胞表面レセプターと競合することによって作用するアンタゴニストを産生するＩｇ Ｆｃドメインに融合されるｅｒｂＢ４のＥＣＤを含んだ、ＩｇＢ４と称される可溶性ｅｒｂＢ４レセプターアンタゴニスト使用して、細胞特異的ｅｒｂＢレセプターの活性化から内因性ＮＲＧをブロックすることによる；（Ｂ）ｅｒｂＢレセプター特異的チロシンキナーゼインヒビターＡＧ１４７８（Ｌｅｖｉｔｚｋｉ Ａら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１７８２−８８）を使用して薬理学的にｅｒｂＢレセプターシグナル伝達をブロックすることによる；および（Ｃ）ｅｒｂＢ２レセプターを特定のｍＡｂ（例えば、市販されているｍＡｂ（トラスツズマブ、すなわちＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（現在、臨床上で使用中）））を用いてダウンレギュレートすることによる。
ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞において、ＩｇＢ４は、高い基礎レベルおよび外来性ＮＲＧ誘導性のｐ１８５レセプターリン酸化の両方を効率的にブロックした（図１０Ａ〜１０Ｂ）。ＩｇＢ４は、外来性ＮＲＧ処理によって誘導されるＭＣＦ１０ＣＡ１細胞増殖をブロックしただけでなく、（ＮＲＧ処理しなかった）これらの細胞のベースラインの増殖速度を有意に減少させた（図１０Ｃ）。したがって、内因性ＮＲＧ産生はｅｒｂＢレセプターリン酸化の基礎レベルを活性化するばかりでなく、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞増殖を直接誘導する。チロシンキナーゼインヒビターＡＧ１４７８は、用量依存性の様式で、ＮＲＧ誘導性のｅｒｂＢシグナル伝達をブロックし、ｐ１８５（ｅｒｂＢ２／３、上のバンド）およびＥＧＦレセプターリン酸化（下のバンド）の両方を減少させた（図１１Ａおよび１１Ｂ）。ＩｇＢ４と同様に、１０μＭの有効濃度にて、ＡＧ１４７８は、外来性ＮＲＧの有りと無しの両方において、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞の増殖速度を減少させた（図１１Ｃ）。最後に、トラスツズマブによって前処理した場合、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞におけるｅｒｂＢレセプターリン酸化の基礎レベルは、影響を受けなかった。しかし、外来性ＮＲＧに対する応答は、減少した（図１２Ａ〜１２Ｂ）。一貫して、トラスツズマブは、外来性ＮＲＧの応答において細胞増殖を減少させるが、外来性ＮＲＧの非存在下での増殖に対して効果を有さなかった（図１２Ｃ）。
総合すると、これらの結果は、ＮＲＧシグナル伝達および増殖促進の両方をブロックする最も有効な方法は、可溶性アンタゴニスト（例えば、本発明のハイブリッド融合ポリペプチド）に用いて細胞外ＮＲＧを減少させることによってオートクラインループを途絶させることによるが、下流の事象（ｅｒｂＢレセプターリン酸化またはｅｒｂＢ２の細胞表面発現）をブロックすることもまた、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞増殖を減少させる。
（実施例２の考察）
この実施例は、ＭＣＦ１０細胞株の漸進的な悪性転換が、ＮＲＧの通常の抗増殖性効果の喪失および細胞増殖を刺激するオートクラインＮＲＧシグナル伝達ループの発生に関連することを示す。ＭＣＦ１０細胞シリーズは、単一の、同系シリーズにおいて、全く正常なＭＣＦ１０Ａ細胞から前悪性のＭＣＦ１０ＡＴ細胞まで、前悪性のＭＣＦ１０ＡＴ細胞から高度に悪性のＭＣＦ１０ＣＡ１細胞までの腫瘍形成のスペクトル全体を網羅する。このシリーズの細胞株に対する外来性ＮＲＧの効果は、この細胞が正常から悪性へと変化するにつれて、抗増殖性から増殖性へと「切り換わった」。これは、相対的なｅｒｂＢ２の増加およびｅｒｂＢ３発現の減少と関連していた。ｅｒｂＢ２はＮＲＧを結合できず、そしてｅｒｂＢ３は不活性なチロシンキナーゼドメインを有するので、ｅｒｂＢ２／３の比率の変化は、ｅｒｂＢ３に対するＮＲＧの結合およびｅｒｂＢ２によるシグナル伝達を著しく変更し得る。ＮＲＧの応答性のこの変化についての機構がｅｒｂＢレセプターサブタイプの発現の変化に起因し得るが、それはまたオートクラインシグナル伝達ループを介するｅｒｂＢレセプター活性化の高い基礎レベルをもたらす内因性ＮＲＧ分泌の著しくより高いレベルから生じ得る（図１３）。一貫して、数種の異なるアプローチによるこのオートクラインループの途絶は、持続性のｅｒｂＢレセプター活性化および細胞増殖の速度の両方を効率的に減少させる。
厳密に、これらの細胞がより悪性になるにつれて、ＮＲＧ抗増殖性因子から増殖性因子へのこの「切り換え」を引き起こすものは、はっきりとしていない。ＭＣＦ１０ＡＴ細胞は、ＭＣＦ１０Ａ細胞のラット形質転換によって得られたので、そのラットオンコジーンの活性化が必要であり得るが、新生物発生前の表現型については十分でない（Ｗａｎｇ Ｂら、（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：４３８７−９４；Ｍｉｌｌｅｒ ＦＲら、（１９９６）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １６：１７６５−６９）。ｅｒｂＢ３に対するｅｒｂＢ２の比の増加は、細胞増殖を促進し得、そして／またはＮＲＧの通常の抗増殖性効果を抑制し得る、シグナル伝達経路の変化を生じる変化したレセプターリン酸化反応をもたらし得る。この後者の可能性と一致して、細胞増殖の期間の間に正常に増加した「ＮＲＧ応答」遺伝子は、ＭＣＦ１０Ａ細胞およびＭＣＦ１０ＡＴ細胞おいてＮＲＧによりダウンレギュレートされるが、高い基礎レベルにおいて発現され、そしてより悪性のＭＣＦ１０ＣＡ１細胞においてＮＲＧに対して抵抗性である。最近、これらの遺伝子は、ＮＲＧによって２４時間処理したのマイクロアレイスクリーニングにおいて同定された。それらの遺伝子としては、悪性の急速に増殖する細胞において高度に発現されることがしばしば認められる、熱ショック遺伝子、オンコジーンおよび細胞周期制御遺伝子が挙げられる。これらの「増殖」遺伝子の基礎のアップレギュレーションにもかかわらず、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞は、ＭＣＦ１０Ａ細胞およびＭＣＦ１０ＡＴ細胞より、あまり速く増殖しない。
悪性ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞の増殖に対するＮＲＧの効果の違いはまた、持続性で基礎のｅｒｂＢレセプターリン酸化レベルをもたらす内因性ＮＲＧ分泌の顕著な上昇に起因し得る。持続性のレセプター活性化は、一部、ＥＣＭにおける分泌されたＮＲＧの蓄積によって生じ得る。ＲＴ−ＰＣＲを使用することで、ＭＣＦ１０細胞シリーズが、ＨＢＤを含むＮＲＧアイソフォームを発現することが、見出された（Ｆａｌｌｓ、前出．Ｌｏｅｂ ＪＡ．（２００３）Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ ３２：６４９−６４）。このＨＢＤは、発生の間に種々の細胞のＥＣＭに対してＮＲＧを制限し、そしてその生物学的活性を顕著に増強することが示されている（Ｌｏｅｂ ＪＡら．、１９９５、前出；ＬｉおよびＬｏｅｂ、前出；Ｌｏｅｂ ＪＡら、１９９９、前出）。ほとんどの先の研究は、このＨＢＤを欠く組換えＮＲＧ形態を使用した。対照的に、本研究は、ＮＲＧの天然に存在する形態を使用し、この形態は、ＪＢＤを含み、したがって、より持続性のシグナル伝達応答をマトリックスの相互作用によってもたらすことが予想される。これは、他のものがＭＣＦ１０Ａ細胞に対するＮＲＧの、観察される増殖性効果を有する理由であり得るのに対して、明白な抗増殖性効果が、ここに見出された（Ｒａｍら、前出；Ｍｉｎｃｉｏｎｅ Ｇら、（１９９６）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９６；６０：４３７−４６）。この研究と、増殖因子依存性に集中した初期の研究との間の別の重要な違いは、それらの研究が、無血清の、規定された培地を使用したのに対して、本研究が、ＮＲＧの増殖効果を測定するために、より生理学的な基礎環境を提供する試みにおいて、血清ならびにＥＧＦおよびインスリンを含んだ培地で行われたことである。
持続性のシグナル伝達は、細胞が、それらの細胞が所定の増殖因子に曝される時間の長さに基づいて、増殖するか、または分化するかを決定し得る１つの方法であり得る。本発明者らは、先に筋細胞において、最低で８時間の一定なレセプター活性化が、ＡＣｈＲのＮＲＧ誘導性の発現に必要とされることを示した（Ｌｉ ＆ Ｌｏｅｂ、前出）。他の系において、持続性のレセプター活性化は、一時的なレセプター活性化によってもたらされる効果とは異なる生物学的効果を生じる異なるシグナル伝達経路を利用する（Ｆｒｏｈｎｅｒｔ ＰＷら、（２００３）．Ｇｌｉａ ４３：１０４−１８；Ｓｈａｈ ＢＨら、（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：１９１１８−２６；Ｌｉｕ ＦＣら、（１９９６）Ｎｅｕｒｏｎ １７：１１３３−４４）。したがって、ＭＣＦ１０Ａシリーズの細胞において、持続性のｅｒｂＢレセプター活性化は、分化から増殖までの、ＮＲＧ効果の切り換え（本明細書中に開示される組成物を使用して最も悪性の細胞株におけるＮＲＧ シグナル伝達を途絶させることによって、ブロックされ得る活性）に対して重要であり得る。
ＮＲＧシグナル伝達に対するオートクラインループは、先に乳癌細胞株（Ｐｅｌｅｓ Ｅら、（１９９２）Ｃｅｌｌ ６９：２０５−１６；Ｌｕｐｕ Ｒら、（１９９６）Ｂｒｅａｓｔ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ ３８：５７−６６；Ｍｉｎｃｉｏｎｅ Ｇら、前出）、および他の上皮組織が起源である癌細胞において記載されている。例えば、内因性ＮＲＧ産生は、ＮＲＧ抗体またはｅｒｂＢレセプター抗体によってブロックされ得るアポトーシスおよび細胞増殖の両方の阻害と一緒に、多数の卵巣癌および結腸癌細胞において見出された（Ｇｉｌｍｏｕｒら．、前出；Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ Ｓら、（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１：７８−８６）。ＭＣＦ１０シリーズにおける増殖性のＮＲＧオートクラインシグナル伝達ループの発生は、癌の有効な療法のためにこのオートクラインループを特異的に途絶させる薬剤（例えば、本発明の組成物）を利用する機会を開く。異なる型の薬剤（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において内因性ＮＲＧ発現をブロックするＮＲＧアンチセンスｃＤＮＡ）は、これらの癌細胞の、攻撃的な表現型および浸潤性の表現型を首尾よく抑制した（Ｔｓａｉ ＭＳら、（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００３；２２：７６１−６８）。
多くの特定のレセプターチロシンキナーゼインヒビター（および上で使用したｅｒｂＢ特異的チロシンキナーゼアンタゴニストＡＧ１４７８）の１つの問題は、ＮＲＧリガンドに対する特異性の欠如である。
ＡＧ１４７８は、ｅｒｂＢ２レセプターおよびｅｒｂＢ３レセプターのチロシンリン酸化をブロックするだけでなく、ＥＧＦレセプターのチロシンリン酸化もブロックする。トラスツズマブは、ｅｒｂＢ２に結合するヒト化ｍＡｂであり、そして現在、ｅｒｂＢ２を過剰発現する患者において、臨床上で使用される。トラスツズマブは、（ａ）前処置の２４時間後でさえもＭＣＦ１０ＣＡ１細胞の外来性ＮＲＧ誘導性のｐ１８５レセプターリン酸化をブロックすること、および（ｂ）増殖を減少させることに対する最小限の効果を有した。別のｍＡｂ（ｅｒｂＢ２およびｅｒｂＢ３の会合をブロックすることによって機能する２Ｃ４）は、リガンドによって活性化されるｅｒｂＢ２シグナル伝達およびｅｒｂＢ２タンパク質の発現レベルにかかわらない細胞増殖を阻害するが、外来性リガンドの刺激を伴わない増殖阻害を有さない（Ａｇｕｓ ＤＢら、（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２：１２７−３７）。
まとめると、本発明の結果は、ＮＲＧのオートクライン効果による持続性のｅｒｂＢレセプター活性化は、細胞増殖の重要なプロモーターであり、そして増殖遺伝子が慢性的にアップレギュレートされる悪性の表現型をもたらす、乳腺上皮細胞中の発生的なプログラムの一部であり得ることを示唆する。したがって、本発明の結果は、ＨＳＰＧ標的性ドメインとしてＮ−ＨＢＤおよび標的化されるドメインとしてＢ４Ｄを含む本発明の融合ポリペプチド使用することによるような、ＮＲＧシグナル伝達を特異的に途絶させる集中的なアプローチが、ＮＲＧオートクラインシグナル伝達の中断が抑制的である種々の分類の癌細胞に対して有用であることを示す。本発明の薬学的組成物を用いた処置は、腫瘍の増殖および転移を阻害することが予想される。
（実施例３）
（ヘパラン硫酸プロテオグリカンの特定の構造的特徴は、ニューレグリン−１シグナル伝達を増強する）
この実施例は、ＮＲＧ１とヘパリンとの相互作用に必要とされる特定の構造的特徴を定義し、そしてインビトロでのこれらの特徴の生理学的重要性を示す。特定の硫酸基についての重要性の明確な上下関係が示され、Ｎ−硫酸基が、ＮＲＧ１に結合しそしてｅｒｂＢレセプターリン酸化をブロックするために最も重要であり、次いで２Ｏ−硫酸基および６Ｏ−硫酸基が重要である。一貫して、塩素酸塩による全ての内因性硫酸基の除去、またｈＮ−硫酸化を促す酵素を指向するｓｉＲＮＡによるＮ−硫酸化の選択的遮断は、ＮＲＧ１誘導性のｅｒｂＢレセプター活性化の低下を生じた。この特異性は、組織が、ＧＡＧ組成物における改変によってＮＲＧ１シグナル伝達を局在化し得、そして増強し得る手段を提供する。
（実験手順）
試薬：組換えヒトＮＲＧ１ β１ポリペプチドを、Ｒ＆Ｄ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）から得た。単離ＥＧＦ様ドメインは、アミノ酸１７７〜２４６に対応し、そしてＮＲＧ１のインタクトなＩｇＥＧＦ形態は、アミノ酸１４〜２４６に対応する。塩素酸ナトリウムを、Ｓｉｇｍａから購入した。ヘパラン硫酸抗体（１０ｅ４）を、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ（Ｊａｐａｎ）から得た。脱−Ｎ硫酸化ヘパリン、脱−２Ｏ硫酸化ヘパリン、および脱−６Ｏ硫酸化ヘパリンを、先に記載されるように調製した（Ｏｓｔｒｏｖｓｋｙ、Ｏら、（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｌｉｅｍ ２７７；２４４４−５３）。長さが１２個〜２個の二糖類の異なるサイズのヘパリンフラグメントを、先に記載されるように、低分子量ヘパリンの高分解能ゲルクロマトグラフィーによって調製した（Ｇｏｇｅｒ、Ｂら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７：１６４０−４６）。全ての実験について、上記ヘパリンを、等しい重量／容量（μｇ／ｍｌ）の濃度にて使用した。
ｐ１８５リン酸化についての細胞培養およびウェスタンブロット：記載されるように、Ｌ６細胞を使用して、ｅｒｂＢレセプターホスホチロシン（ｐ１８５）を定量化した（ＷＯ ０３／０１２０４５；Ｌｉ ＆ Ｌｏｅｂ、前出）。細胞を、ウェル１つあたり５０，０００個の細胞でプレートし、そして８日間増殖させた。塩素酸塩を、濾過滅菌し、そしてアッセイの前に２日間、Ｌ６細胞とインキュベートした。ｐ１８５の阻害アッセイを、７５ｐＭのＩｇＥＧＦＮＲＧ１および種々の濃度の上記ヘパリンを室温にて２０分間、事前にインキュベートすることによって行った。次いで１５０μＬのこの混合物を８日齢のＬ６細胞に、１０％ＣＯ２において３７℃で４５分間適用した。培地を吸引し、そして上記細胞を、先に記載されるように、５０μＬのサンプル緩衝液に可溶化し、そして５分間煮沸した（ＷＯ ０３／０１２０４５；Ｌｉ ＆ Ｌｏｅｂ、前出）。これのうちの１５μＬを、５％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ｅｒｂＢレセプター（ｐ１８５）のリン酸化形態を、ホスホチロシンモノクローナル抗体４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ）を使用したウェスタンブロット分析によって検出し、次いで検証し、そしてｅｒｂＢ２（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ Ａｂ−１７）およびｅｒｂＢ３（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ Ａｂ−６）に対する抗体の混合物によって再度プローブすることによって定量化した。定量化を、記載されるように、にじみのない画像においてＭｅｔａｍｏｒｐｈ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ）を使用してｐ１８５／（ｅｒｂＢ２＋ｅｒｂＢ３）の比を決定することによって行った（Ｅｓｐｅｒ、ＲＭ ＆ Ｌｏｅｂ、ＪＡ（２００４）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４：６２１８−２７）。
ゲル易動度シフトアッセイ（ＧＭＳＡ）：ＮＲＧ１単独、またはＮＲＧ１＋種々の濃度の種々のヘパリンを、結合緩衝液（２．７ｍＭのＫＣｌ、４．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１．４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１２％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ）と一緒に２０分間インキュベートし、そして記載されるように、６％（２９：１ アクリルアミド：ビス）非変性ゲル（１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ）上で２００Ｖにて２０分間、電気泳動した（Ｗｕ、ＺＬら、（２００２）ＦＡＳＥＢ Ｊ １６、５３９−４５；Ｗｕ、ＺＬら、（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：１７１２１−２９）。一方、電気泳動緩衝液は、４０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．０）、４０ｍＭの酢酸、１ｍＭのＥＤＴＡから構成され、この緩衝液を、ＮＲＧ１（ｐＩ８．８）の等電点を上回るｐＨ９．０に変え、この変化は、ヘパリンを添加したかまたはしていないＮＲＧ１の易動度をほとんど変えなかった。しかし、バンド分解能は、ｐＨ８．０においてよりはっきりしており、したがって、本発明者らの研究に使用された。タンパク質を、１００Ｖにて１時間、フッ化ビニリデンメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｃｏｒｐ．）に移した。ＮＲＧ１バンドを、ＩｇＥＧＦポリペプチド（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ Ｉｎｃ．）に対して開発したポリクローナルウサギ抗血清（ＡＤ０３）を使用したウェスタンブロット分析によって検出した。次いで、フィルターを、ペルオキシダーゼ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と結合させたヤギ抗ウサギ抗体によってプローブし、化学発光試薬による処理後、Ｘ−ブルーフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．）に露出し、そしてバンドを、上のように定量化した。
ｓｉＲＮＡサイレンシング：ｓｉＲＮＡ分子を、完全なラットＮＤＳＴ−１ ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ＃ Ｍ９２０４２）を使用して、Ｑｉａｇｅｎ製のオンラインソフトウェアによって設計した。１４０６〜１４２７の標的配列を、ＮＤＳＴ−２に対する１９〜２１塩基対の同一性に起因して選択した。プレートした２４時間後、Ｌ６細胞を、２μｇ ＮＤＳＴ ｓｉＲＮＡまたはランダムな非サイレンシングｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）のいずれかと一緒に、２００μＬのＬ６培地に対して希釈した１２μＬの懸濁緩衝液中でインキュベートした。次いでその細胞を、３７℃にて３日間インキュベートし、そしていずれもＮＲＧ１によって４５分間処理し、次いで上記のようにホスホチロシンウェスタンブロットを行った。平衡のｓｉＲＮＡ処理培養物を使用して、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、減少したＮＤＳＴ ｍＲＮＡレベルを、そしてＮ−硫酸特異的抗体を用いて免疫染色することによって硫酸化活性を実証した。全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙキットを使用して単離した。ゲノムＤＮＡによる汚染を減少させるために、このカラムを、ＤＮａｓｅ（１３７．５μｇ／ｍｌ）によって１５分間処理した。．カラムから溶出したｍＲＮＡの濃度を、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して測定し、そして各サンプルからの１μｇのＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。以下のプライマーを、ＮＤＳＴ−１に対してＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して設計した：
Figure 0004955548
 これらのプライマーセットの各々は、約１００ｂｐの正しいサイズの単一バンドを生成した。Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、以下の循環パラメータと共に使用した：９５℃で１０分間、次いで９５℃で１５秒、６０℃で１０秒、および７２℃で５０秒を４０サイクル。リアルタイム定量的ＰＣＲに関して、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（登録商標）システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｍａｃｈｉｎｅ上で使用し、そして記載されるように、各サンプルからのＧＡＰＤＨの対する遺伝子発現の変化を算出した（Ｅｓｐｅｒ ＆ Ｌｏｅｂ、前出）。免疫染色を、８ウェルＦｌｅｘｉｐｅｒｍ（登録商標）チャンバーにウェル１つあたり５０，０００個の細胞でプレートしたＬ６細胞に対して行い、そして４％のパラホルムアルデヒドを用いて室温にて１５分間固定した。ＰＢＳによって３回洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ中で、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、２％のヤギ血清によって４０分間ブロックし、次いでブロック緩衝液中の１：３０希釈において１０ｅ４抗体と一緒に４℃にて一晩インキュベートし、ＰＢＳ中で、５分間で３回洗浄し、次いで室温で２時間、１：３００にてＡｌｅｘａ ５４６ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用い、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｍａｘ冷却型ＣＣＤカメラを備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ６００エピ蛍光顕微鏡を使用して可視化した。蛍光の定量を、先に記載されたもの（Ｅｓｐｅｒら、前出）と同様の様式で、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ）を使用して行った。８ウェルＦｌｅｘｉｐｅｒｍ（登録商標）チャンバーから得たＮＤＳＴ−１ ｓｉＲＮＡとコントロールｓｉＲＮＡ処理細胞との３つの別々の対の全視野を、細胞を含まない領域の近傍のバックグラウンドを減算した後に比較した。ｓｉＲＮＡ処理細胞は、コントロール処理細胞から得た値の３９％、４３％、および６０％に減少した。これは、コントロールと比較して平均４７±１１％の減少を与えた（誤差は、標準偏差を表す）。
（結果）
（特定のヘパリン硫酸基が、ＮＲＧ１の結合に必要とされる）
全ての硫酸基（完全に脱硫酸化）、Ｎ−硫酸基（脱−Ｎ硫酸化）、２Ｏ−硫酸基（脱−２Ｏ硫酸化）、または６Ｏ−硫酸基（脱−６Ｏ硫酸化）のいずれかを欠く、化学的に改変したヘパリンのセットを、ヘパリンとＮＲＧ１との相互作用における硫酸基の重要性を、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（Ｗｕら、前出）によって記載される後のＧＭＳＡモデルを使用して評価するために調製した。ヘパリンオリゴ糖類を、選択した。なぜならそれらは、より高度かつ均一に硫酸化されるが、内因性の細胞表面ヘパラン硫酸に対する高度の構造類似性を有するからである（Ｈｏｎｋｅ、Ｋら、（２００２）Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｒｅｖ ２２：６３７−５４）。このＧＭＳＡは、タンパク質／オリゴ糖類複合体を、質量比およびコンホメーションに対するゲルの電荷に基づいて分離する非変性ポリアクリルアミドゲルを使用する。緩衝液条件を最適化し、その結果、ＮＲＧ１（ｐＩ８．８）は、荷電領域において最小限の易動度を生じる網目の中性の電荷に近かった（図１４Ａ）。しかし、ヘパリンと複合体化した場合、ＮＲＧ１−ヘパリン複合体は、さらに移動し、そしてウェスタンブロットによるＮＲＧ１の易動度において「シフト」を示した。図１４Ａは、ヘパリンの増加性の濃度が、図１４Ｂにおいて定量化される用量依存性の様式でＮＲＧ１をシフトさせることを示す。
このゲル易動度シフトアッセイを使用することで、十分に硫酸化したヘパリンを、完全に脱硫酸化したヘパリンおよび脱−Ｎ硫酸化ヘパリンと比較した。完全に脱硫酸化したヘパリンは、ＮＲＧ１の易動度をシフトできなかった（図１５Ａ）。これは、意外なことではない。なぜなら、比較的中性に荷電した脱硫酸化ヘパリンは、ＮＲＧ１と複合体化した場合でさえ非常に低い易動度を有するはずだからである。しかし、電場においてさらに移動するはずである脱−Ｎ硫酸化糖類もまた、ＮＲＧ１をシフトさせず、このことは、ＮＲＧ１の結合に対するＮ−硫酸化の決定的な重要性を示唆した。ＮＲＧ１の結合に対する２Ｏ−硫酸化および６Ｏ−硫酸化の重要性を、これらの基の各々を欠くヘパリンを使用して調べた。これらの化学的に改変したヘパリンの両方は、ＮＲＧ１のシフトにおいて同等に有効であったが、十分に硫酸化したヘパリン程有効ではなく、そして脱−Ｎ硫酸化ヘパリンより有効であった。これは、中間を示唆するが、ＮＲＧ１の結合に対するこれら２つの硫酸基の重要性は等しい（図１５Ｂ）。
（ヘパリン上の同じ順位の硫酸基は、Ｌ６筋細胞においてＮＲＧ１誘導性のレセプターリン酸化をブロックする）
他のヘパリン結合タンパク質に対して行われた（Ｗｕら．、２００２、２００３、前出）ような放射標識したオリゴ糖類ではなくＮＲＧ１に対するウェスタンブロットを使用するゲルシフトアッセイの制限は、結合していないＮＲＧ１がより高いｐＨにおいてさえほとんどゲルに進入しなかったことである。これは、ゲルの上端において結合していないＮＲＧ１を示すＮＲＧ１バンドの強度における可変性をもたらした。この問題に起因して、そして第２に、ヘパリンとＮＲＧ１との相互作用における特定のヘパリン硫酸化パターンの相対的な重要性を確認する独立の手段として、これらの同じ脱硫酸化ヘパリンのＬ６筋細胞においてｅｒｂＢレセプターリン酸化をブロックする能力を試験した可溶性ヘパリンがｅｒｂＢレセプター活性化をブロックする正確な機構は知られていないが、生物学的に関連する系においてＮＲＧ１とヘパリンとの相互作用の親和性を比較することは、有用なアッセイであり、そして異なる硫酸化オリゴ糖類の相対的親和性を規定するために先に使用されている（Ｌｏｅｂら．、１９９５、前出）。図１６Ａは、ＮＲＧ１誘導性のｅｒｂＢレセプターリン酸化が十分に硫酸化したヘパリンによって、用量依存性の様式で阻害されることを示す。図１６Ｂは、改変したヘパリンの各々について、ＮＲＧ１誘導性のｅｒｂＢレセプターリン酸化をブロックする有効性の減少を示す。ゲル易動度シフトアッセイと同様に、完全に脱硫酸化したヘパリンおよび脱−Ｎ硫酸化ヘパリンは、１００μｇ／ｍｌにおいてさえほとんど阻害を有さなかった。同様に、２Ｏ−脱硫酸化ヘパリンおよび６Ｏ−脱硫酸化ヘパリンは、再び、十分に硫酸化したヘパリンと比較して、類似する中間の効果を示した。この結果を、図１６Ｃにおいて定量化し、そしてコントロールの％として提示した。珍しいことに、低濃度（１μｇ／ｍｌ）の脱−Ｎ硫酸化ヘパリンは、レセプターリン酸化に対して小幅な刺激性を有した。この再現可能な観察は、低濃度の低親和性ヘパリンが細胞表面上の内因性ＨＳＰＧ結合部位からＮＲＧ１を放出することによってｅｒｂＢレセプター活性化を増強し得るという可能性を生じる。
（ヘパリンの鎖長は、ＮＲＧ１の結合およびｅｒｂＢレセプターの遮断に影響する）
この結果は、これまでのところ、ＮＲＧ１とヘパリンとの相互作用を促すための特定の硫酸化パターンの重要性を示唆し、そして硫酸基についての重要性の上下関係を示した。ＮＲＧ１とヘパリンとの相互作用に対する鎖長の重要性を、１２個の二糖類から２個の二糖類へとサイズが減少する十分に硫酸化したヘパリンフラグメントのセットを使用して、ＧＭＳＡ（図１７Ａ）およびレセプターリン酸化アッセイ（図１７Ｂ）の両方において調査した。ヘパリンの鎖長が減少した場合、これらのオリゴ糖類の等しい重量／容量濃度は、優勢なＮＲＧ１−ヘパリン複合体において上方向へのシフトをもたらした。シフトされたＮＲＧ１の相対量は、より短いヘパリンの鎖長によって減少し、このことは、より長いヘパリンが、より効率的にＮＲＧ１を結合することを示唆する。等モル量の各オリゴ糖類によって、より長いオリゴ糖類とより小さいオリゴ糖類との間のさらに大きな違いが、予想された。所定のオリゴ糖類の長さに対する複数のバンドの出現は、複数のＮＲＧ１モノマーが単一のヘパリン鎖を結合することか、または複数のオリゴ糖類モノマーが単一のＮＲＧ１を結合することのいずれかの可能性をもたらす。長さが２個の二糖類と同じ小ささであるヘパリンは、少量のＮＲＧ１をシフトさせ得、これは、ゲルの右側において見られる（そして、より長いフィルムの露出において明確に見られ、ここでは示されない）。種々のサイズのヘパリンフラグメントの能力を、図１７Ａ中のＮＲＧ１の結合の効果に沿って、ＮＲＧ１誘導性レセプターリン酸化のブロックについて比較した。ヘパリンの鎖長が減少するにつれて、ＮＲＧ１誘導性のｅｒｂＢレセプターリン酸化を阻害するヘパリンの能力は、漸進的に損なわれた（図１７Ｂ）。一旦その鎖長が、約４個の二糖類以下に減少すると、ヘパリンによる有意な阻害は存在しなくなる。内因性ヘパラン硫酸基は、ＮＲＧ１ 誘導性のｅｒｂＢレセプター活性化を増強する。
（内因性ヘパラン硫酸基は、ＮＲＧ−１誘導性ｅｒｂＢレセプターの活性化を増強する）
内因性ＨＳＰＧは、ＮＲＧ１（ＩｇＥＧＦ）のヘパリン結合形態によって、ｅｒｂＢレセプター活性化を有意に増強するが、ヘパリン結合Ｉｇ様ドメイン（ＥＧＦ）を欠くＮＲＧ１の形態によっては増強しない（ＷＯ ０３／０１２０４５；Ｌｉ ＆ Ｌｏｅｂ、前出）。内因性硫酸化の役割を、Ｌ６筋細胞を、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホスルフェート（ＰＡＰＳ）（スルホトランスフェラーゼ反応のためのスルフェート供与体）の形成を競合的に阻害する塩素酸塩を用いて４８時間処理することによって調べた（Ｓａｆａｉｙａｎ，Ｆら、（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：３６２６７−７３；Ｇａｏ，Ｒら、（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：８８４８−５５；Ｋａｎｅｉｄｅｒ，Ｎら、（２００４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：２３７−４４）。全長の、ＮＲＧ１のヘパリン結合形態（ＩｇＥＧＦ）を使用することで、塩素酸処理は、レセプターリン酸化を５３％減少させたのに対して、ヘパリン結合ドメインを欠くＥＧＦ形態を用いた場合に減少は認められなかった（図１８Ａ〜１８Ｂ）。このことは、ＮＲＧ１との細胞の相互作用を増強するための内因性ＨＳＰＧ硫酸基の重要性を実証する。
ＧＭＳＡおよびｅｒｂＢリン酸化阻害アッセイにおいて観察された特異性に基づいて、筋細胞におけるＨＳＰＧとＮＲＧ１との相互作用についての内因性Ｎ−硫酸基の重要性を、ＧｌｃＮＡｃ Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ−１（ＮＤＳＴ−１）に対するｓｉＲＮＡを用いて内因性Ｎ−硫酸化を減少させることによって試験した。ＮＤＳＴ−１は、４つのＮ−スルホトランスフェラーゼアイソフォームのうちの最も広範に発現されるものであり、そしてＮＤＳＴ−２と近い相同性を共有する（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｊら、（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３７：３４３−４８；Ｇｒｏｂｅ，Ｋら、（２００２） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５７３：２０９−１５）。このｓｉＲＮＡを用いたＬ６細胞の処理は、３つの異なるプライマー対を使用して、ＮＤＳＴ−１ ｍＲＮＡの２倍〜３倍の減少を生じる（プライマーセット１：２．３倍、プライマーセット２：３．２倍、プライマーセット３：１．４倍）。ｍＲＮＡレベルの減少は、それらの認識にＮ−硫酸基を必要とすることが示された１０ｅ４抗体を使用して、Ｎ−硫酸基の染色の４７（±１１）％の減少へと変換された（Ｄａｖｉｄ，Ｇら、（１９９２）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１９：９６１−７５）（図１９Ａ）。コントロールｓｉＲＮＡと比較して、ＮＤＳＴ−１ ｓｉＲＮＡは、ＮＲＧ１誘導性の（ＩｇＥＧＦ）レセプターリン酸化において５８％の減少をもたらした（ｐ＝０．００４）。ＮＲＧ１誘導性のｅｒｂＢリン酸化において２０％の重要でない減少を、ＮＲＧ１の単離ＥＧＦドメインを使用したＮＤＳＴ−Ｉ ｓｉＲＮＡ処理によって観察した（ｐ＝０．２８）（図１９Ｂ−１９Ｃ）。これらの結果は、化学的に改変したヘパリンによる本発明者らの結果に匹敵する、ＮＲＧ１−ＨＳＰＧ相互作用における内因性Ｎ−硫酸化の重要性を示唆する。
（実施例３の考察）
実質的に全ての細胞が、ＨＳＰＧを発現し、そしてヘパリン結合因子の一覧が増加し続けるとすると仮定すると、発生の間および一生を通じた動的な要求に応じて、どの因子が所定の細胞表面に結合し、そしてそれに沿って集まるのかを識別するために、機構が必要とされる。ＨＳＰＧの量におけるバリエーションおよびそれらの特定の硫酸化パターンは、このことが達成され得る方法である。特定の増殖因子が必要とされる場合、それに応じて、細胞は、ＧＡＧ鎖を改変する酵素の発現を調節し得る。実際に、ＨＳＰＧ構造における領域特異性は、抗ヘパラン硫酸ｍＡｂによって観察されており、抗ヘパラン硫酸ｍＡｂの各々は、発達の間の骨格筋の独特な領域を染色する（Ｊｅｎｎｉｓｋｅｎｓ，ＧＪら、（２０００）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０：４０９９−４１１１）。ヒヨコ肢芽の前方および後方または基部における２つの異なる６Ｏ−スルホトランスフェラーゼ酵素の局在化した発現、および肢芽全体にわたる２Ｏ−スルホトランスフェラーゼのより均一な発現は、それぞれ、この知見が無秩序ではないが、合成酵素の発現によって発生の間で高度に協調していることを示唆する（Ｎｏｇａｍｉ，Ｋら．、（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：８２１９−２９）。特定のスルファターゼの活性化によってＨＳＰＧの硫酸化の状態を調節し得るＨＳ鎖の合成後の改変がまた、記載されている。これは、ＨＳのＳ−ドメインを標的化し、そしてＷｎｔシグナル伝達を促進する鳥類のスルファターゼＱ−ｓｕｌｆｌ（Ｄｈｏｏｔ，ＧＫら、（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：１６６３−６６）、および癌における増殖因子シグナル伝達をアップレギュレートするのに必要とされる哺乳動物のホモログＨｓｕｌｆ−１（Ｌａｉ，Ｊら、（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：２３１０７−１７）を含む。
この実施例において、化学的に改変したヘパリンのセットを使用して、最適なＮＲＧ１の結合についての特定の硫酸化の要求を同定した。２つの独立のアッセイ（ＧＭＳＡおよびｅｒｂＢレセプターリン酸化）を使用することで、重要性の再現可能な上下関係を発見し、Ｎ−硫酸基が、ＮＲＧ１とヘパリンとの相互作用のために最も重要であり、次いで２Ｏ−硫酸基および６Ｏ−硫酸基が重要である。脱−２Ｏ硫酸化ヘパリンおよび脱−６Ｏ硫酸化ヘパリンで認められる同様の親和性は、各々がＮＲＧ１の結合についての類似性に寄与することを示唆する。硫酸化の状態に加えて、二糖類の鎖長は、最適なヘパリンとＮＲＧ１との相互作用に重要であった。８個の二糖類〜１２個の二糖類である長さは、ＮＲＧ１に対する最大限の結合に必要であり、２個の二糖類と同程度に小さいヘパリンフラグメントは、程度は制限されるが、なお結合し得る。ｅｒｂＢレセプターは、ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両方として存在するので、所定のオリゴ糖類鎖に対する複数のＮＲＧ１ポリペプチドの結合は、ｅｒｂＢレセプターシグナル伝達を増強し得る。
ここで所望されるＮＲＧ１とヘパリンとの相互作用のための特定の硫酸化の要求はまた、発生の間の異なる組織領域における内因性ＨＳＰＧに関連するＮＲＧ１の生物学的機能の正確な局在化および増強を説明するのに役立ち得（Ｌｏｅｂ、２００３、前出）、そして特定のスルフェートに対するＨＢＤの特定の標的化についての基礎を提供する。塩素酸塩による全ての内因性ＨＳＰＧ硫酸化のブロックは、Ｌ６筋細胞においてｅｒｂＢレセプターを活性化するＮＲＧ１の能力を顕著に減少させた。筋細胞におけるＮＲＧ１活性の減少に対する塩素酸塩処理の効果は、ヘパリチナーゼを用いて全てのＨＳＰＧ ＧＡＧを除去した後において、先に見られるもの（Ｌｉ ＆ Ｌｏｅｂ、前出）またはＧＡＧを取り出しそして培養培地中にＧＡＧを放出するβ−Ｄ−キシロース処理によって見られるもの（Ｓｕｄｈａｌｔｅｒ，Ｊら、（１９９６）ＧＵａ １７：２８−３８）ほど明確ではなかった。これは、塩素酸塩によってもたらされる脱硫酸化が多くの場合、不完全であり、そして特定の硫酸基に対して選択的であり得るので、予想外ではない（Ｓａｆａｉｙａｎ、Ｆら、前出）。
ＮＲＧ１とヘパリンとの相互作用の媒介におけるＮ−硫酸化の生理学的重要性を、ＮＤＳＴ−１に対するｓｉＲＮＡを使用して、筋細胞において内因性Ｎ−硫酸化を減少させることによって実証した。このような処理細胞は、塩素酸塩処理によって認める効果に匹敵する、ＮＲＧ１誘導性レセプターリン酸化における２倍の減少を示し、これは、ＨＢＤを欠いた単離ＮＲＧ１ ＥＧＦドメインによっては認められない。ｓｉＲＮＡ処理の有効性を、ＮＤＳＴ−１ ｍＲＮＡにおける２〜３倍の減少、および抗体（その結合にはＮ−硫酸化グルコサミン残基を必要とする）での染色強度における対応する約５０％の減少によって実証した（Ｄａｖｉｄら、前出；Ｂａｉ，ＸＭら、（１９９４）Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ４２：１０４３−５４）。ｓｉＲＮＡでの処理によってここで観察されたこの約２倍の効果は、残留ＮＤＳＴ−１活性または他のスルホトランスフェラーゼ（ＮＤＳＴ−２〜４）による補償によって生じたものであり得る（Ｔｕｒｎｂｕｌｌら、前出）。しかしながら、ＮＤＳＴ−１に対して使用されたｓｉＲＮＡ配列は、２１ヌクレオチド中１９ヌクレオチドについてＮＤＳＴ−２と重複し、ＮＤＳＴ−２ ｍＲＮＡにおいても同様に約２倍の減少をもたらした。
ＨＳＰＧの新生ＧＡＧのＮ−硫酸化は、連続的なプロセスにおける早期段階である（Ｔｕｒｎｂｕｌｌら、前出）。従って、ＮＤＳＴ−１発現のサイレンシングもまた、２Ｏ−硫酸化および６Ｏ−硫酸化を減少させ得る。総合すると、塩素酸塩の結果は、内因性硫酸化の一般的重要性を強調するが、ｓｉＲＮＡの結果は、特異的なＨＳＰＧ硫酸化パターンが、ＮＲＧ１の局在化および活性化に重要なＮＲＧ１−ヘパラン硫酸相互作用を調節することを示唆する。ヘパリン硫酸化を制御する遺伝子における破壊を有するマウス（Ｉｎａｔａｎｉ、Ｍら、（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２：１０４４−４６；Ｒｉｎｇｖａｌｌ、Ｍら、（２０００）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：２５９２６−３０；Ｆａｎ、Ｇら、（２０００）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４６７：７−１１）のさらなる分析が、インビボでのこれらのＮＲＧ１−ＨＳＰＧ相互作用の理解を助ける。
（実施例ＩＶ ヒト患者におけるＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４融合ポリペプチドの抗腫瘍効果）
処置される全ての患者は、生検または細胞学によって確認された（組織学的に確認された）悪性塊を有する。悪性疾患としては、癌腫、肉腫、神経膠腫および髄芽腫が挙げられる。患者は、従来の治療に応答しないか、またはその癌が従来の治療にも関わらず進行している人達である。任意の臓器系に関する悪性疾患の全ての段階における患者を含める。病気分類は、腫瘍の起源の臓器、組織学的型、組織学的悪性度、腫瘍サイズの範囲、転移の部位およびその患者の機能の状態を含む、腫瘍および宿主の両方を記述する。一般的な分類は、ステージ１（局所的な疾患）からステージ４（広範な転移）の既知の範囲を包含する（Ａｂｒａｈａｍ Ｊら．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、２００１、またはより最近の版を参照のこと）。患者の病歴を得て、従来の心血管および肺機能の試験、ならびに適切な放射線手順と一緒に、理学的試験を実施する。この悪性塊は、Ｘ線もしくはＣＴスキャンで可視であり、そして／またはカリパスで測定可能である。患者は、任意の他の抗癌処置を少なくとも１ヶ月間受けておらず、少なくとも５０の臨床ＫＰＳを有する。
ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４を、原型的な融合タンパク質として使用する（しかし、本明細書中に記載される他のホモログおよび機能的誘導体は、同程度の用量において他の患者で使用され、類似の結果を得る）。ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４は、２〜７日間ごとに１回、腫瘍内（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ）に、０．０１〜１００μｇ／ｋｇの用量において、静脈内投与する。
（患者の評価）
治療に対する腫瘍の応答の評価は、ＣＴまたはＸ線可視化を使用して、治療の間およびその後３０日間、１週間に１回行う。処置への応答、副作用、および患者の健康状態に依存して、処置を終了するか、または上述の標準的なプロトコールから延長する。腫瘍の応答基準は、以下にまとめるＷＨＯおよびＲＥＣＩＳＴ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）によって確立されたものである（例えば、Ａｂｒａｈａｍら、前出）。
Figure 0004955548
 患者集団における処置の有効性を、従来の統計的方法（例えば、χ二乗検定またはＦｉｓｈｅｒの直接確立検定が挙げられる）を使用して評価する。測定における長期間での変化および短期間での変化は、別個に評価する。
（結果）
合計４００人の患者が、処置される患者である。各腫瘍の型についての患者の数および処置の結果は、表１にまとめる。陽性の腫瘍応答が、***腫瘍、卵巣腫瘍および胃腸（胃、食道、結腸および直腸を含む）腫瘍の患者の７７〜８５％もの多数の患者において観察される。
全ての腫瘍を有する３０５人の患者が、約７６％の奏効率で、目的の臨床応答を示す。腫瘍は次第に縮小し始め、治療の４週間後には目的の寛解が明白である。応答は、平均２４ヶ月の間持続する。
毒性は、処置を必要としない、穏やかな短期間の発熱、疲労および拒食症から構成される。副作用の発生（全ての処置の％として）は、以下の通りである：悪寒−１０；発熱−１０；疼痛−５；吐き気−５；呼吸器−３；頭痛−３；頻脈−２；嘔吐−２；高血圧−２；低血圧−２；関節痛−２；発疹−２；顔面紅潮−１；下痢−１；掻痒／蕁麻疹−１；鼻血−１；目眩−＜１；痙攣−＜１；疲労−＜１；気絶−＜１；単収縮−＜１；かすみ目−＜１；胃炎＜ｌ；手の紅化−＜１。ＣＢＣ、直腸および肝機能試験は、処置後に有意には変化しない。
Figure 0004955548
 発明者らの出願であるＰＣＴ／ＵＳ０２／２４０５３（ＷＯ０３／０１２０４５として公開）を含め、上記の引用文献は全て、具体的に援用されていようといまいと、本明細書中に参考として援用される。
本発明を十分に説明したが、広範な範囲内の等価なパラメーター、濃度および条件で、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、かつ過度の実験を課すことなく、本発明が実施され得ることが、当業者に認識される。
図１は、ＮＲＧドメイン構造および使用した構築物を示す。Ｉ型β１ＮＲＧを、Ｃ末端細胞質ドメインおよび単一の膜貫通ドメインＴＭを有する、プロＮＲＧと呼ばれる膜貫通前駆体として最初に合成する。それを膜貫通ドメインのすぐ外側で切断し、そしてＩＧドメインおよびＥＧＦドメインを含む可溶性ポリペプチドが放出される。ここで使用される単離ＥＧＦ様ドメイン構築物は、ヒトβ１形態のアミノ酸１７７−２４６に対応し、そしてＩＧ−ＥＧＦドメイン構築物は、ヒトβ１形態のアミノ酸１４−２４６に対応する。 図２Ａおよび２Ｂ Ｃは、ＨＢＤを有する組換えＮＲＧアンタゴニストの構築および大きさを示す。図２Ａは、アンタゴニスト構築物の模式図である。ｅｒｂＢ４のＥＣＤは、ＨＡタグのＮ末端におけるマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に挿入され、独特のドミナントネガティブなｅｒｂＢ４レセプター−Ｂ４−ＨＡを産生した。他の３種のアンタゴニストは、ドミナントネガティブなｅｒｂＢ４レセプター（Ｂ４−ＨＡ）のＮ−末端にスペーサードメインを含むか、または含まずにＨＢＤを付加（ＨＢＤ−Ｂ４−ＨＡおよびＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡ）し、そしてＣ−末端にＨＢＤを付加（Ｂ４−ＨＢＤ−ＨＡ）することによって構築された。図２ＢはトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の培地中に分泌されたＮＲＧアンタゴニストの大きさを示す。４種のＮＲＧアンタゴニストを安定に発現する細胞株由来の調整済みの培地のサンプルは、７．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で解析された。ウェスタンブロットが行われ、そして抗ＨＡモノクローナル抗体は、ＨＡタグ化アンタゴニストを検出するために使用された。全てのＮＲＧアンタゴニストは、その培地中に分泌された。 図３は、組換えタンパク質ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡおよびＢ４−ＨＢＤ−ＨＡのみがヘパリンカラムに結合し得ることを示す。４種のＮＲＧアンタゴニスト（図３Ａに模式的に示される）を含む調製済みの培地は、結合を可能にするヘパリンカラムに通され、次いで塩濃度を増加させることによって溶出された。流出（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）および溶出の両方から得た抗ＨＡウェスタンブロットは、Ｂ４−ＨＢＤ−ＨＡおよびＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡの両方が高い親和性でヘパリンカラムに結合する一方で、Ｂ４−ＨＡおよびＨＢＤ−Ｂ４−ＨＡがヘパリンに結合しなかったことを示した。ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡは、Ｂ４−ＨＢＤ−ＨＡより高い結合の親和性を有した。なぜなら、より高い塩濃度（１Ｍ）が、ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡ結合相互作用を崩壊させるのに必要とされる一方で、たった０．４〜０．５ＭのＮａＣｌがＢ４−ＨＢＤ−ＨＡを溶出させ得たからである。 図４は、ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡが、Ｌ６細胞においてＮＲＧ誘導性のｅｒｂＢレセプター活性化をブロックする能力において最も強力なＮＲＧアンタゴニストであったことを示す。Ｌ６培地中のＮＲＧ（５０ｐＭのＩＧ−ＥＧＦ形態）と組み合わせた比較可能な量のＮＲＧアンタゴニストが、Ｌ６細胞を４５分間処理するために使用された。次いでｐ１８５ ｅｒｂＢレセプターリン酸化を試験するウェスタンブロットが、行われた。Ｂ４−ＨＡおよびＨＢＤ−Ｂ４−ＨＡは、ＮＲＧによって誘導されるｐ１８５レセプターリン酸化に対する効果を有さなかったが、ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡおよびＢ４−ＨＢＤ−ＨＡは、ｐ１８５レセプターリン酸化を低いレベルまで減少させた。ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−ＨＡは、Ｂ４−ＨＢＤ−ＨＡより著しく強力な、ＮＲＧ−ｅｒｂＢ活性のインヒビターであった。 図５Ａ〜５Ｄは、精製ＮＲＧアンタゴニスト融合タンパク質を用いた研究を示す。図５Ａは、ＨＥＫ２９３細胞において作製された精製組換えタンパク質の、銀染色されたタンパク質ゲルを示す。左のレーンは、ＨＢＤ−Ｓ−Ｂ４−Ｈｉｓタグ融合体である「ＧｌｙＢ４」組換え体を示す。右のレーンは、Ｂ４−Ｈｉｓタグ化融合体単独である「Ｂ４」を示し、ＨＡタグの代わりにＨｉｓタグの組み込みによる容易な精製を示す。図５Ｂは、ＧｌｙＢ４との事前のインキュベーション後の洗浄が、ｐ１８５のリン酸化として測定されるニューレグリンシグナル伝達の持続性の途絶をもたらすことを示す。ＧｌｙＢ４およびＢ４は、Ｌ６筋肉細胞と一緒に事前に１時間インキュベートされ、次いで組換えニューレグリンを添加する前に十分に洗浄された。ＧｌｙＢ４による前処理が、ニューレグリンシグナル伝達の完全かつ持続性の遮断をもたらしたのに対して、Ｂ４（ＨＢＤを欠く）は、ニューレグリン負荷（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対する持続性の効果を有さなかった。 図５Ａ〜５Ｄは、精製ＮＲＧアンタゴニスト融合タンパク質を用いた研究を示す。図５Ｃは、ＧｌｙＢ４が、０日目、３日目および６日目に薬物無し（コントロール）、ＧｌｙＢ４、Ｂ４、またはＨｅｒｃｅｐｔｉｎのいずれかによって処置されたＭＣＦ１０ＣＡ１ヒト乳癌の増殖のブロックにおいて、Ｂ４より有効であったことを示す。同一の濃度の１ｎＭ ＧｌｙＢ４が、コントロール細胞またはＢ４によって処理された細胞の増殖と比較した、癌細胞増殖のブロックにおいて、より有意に強力であった。ＧｌｙＢ４は、かなり高い濃度のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（１００μｇ／ｍｌ）に匹敵した（少なくともよりわずかに有効）（これらのヒト乳腺細胞株およびヒト乳癌細胞株を用いたさらなる研究についての図６〜１１を参照のこと）。図５Ｄは、増殖が図５Ｃにグラフで記載される細胞の４つの顕微鏡写真を示す。ＧｌｙＢ４の添加は、培地のみ（コントロール）、Ｂ４、ＧｌｙＢ４およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎの存在下において６日間増殖させたＭＣＦ１０ＣＡ１細胞のこれらの顕微鏡写真に示されるように、接触阻害を促すことによって部分的に増殖をブロックする。 図６Ａ〜６Ｃ。乳腺上皮細胞株ＭＣＦ１０Ａ（図６Ａ）、ＭＣＦ１０ＡＴ（図６Ｂ）およびＭＣＦ１０ＣＡ１（図６Ｃ）の細胞増殖に対するＮＲＧの差次的な効果。乳腺上皮細胞株ＭＣＦ１０Ａ細胞、ＭＣＦ１０ＡＴ細胞およびＭＣＦ１０ＣＡ１細胞は、ウェル１つあたり５０００個にて４８ウェルプレートで３日間プレートされた。その後細胞は、細胞数を４〜８日目に毎日計測する前に、１ｎＭ ＮＲＧを伴って（三角）か、または伴わず（菱形）に、ＭＣＦ １０ Ａ／ＡＴ培地中で２４時間処理された（矢印）。 図７Ａ〜７Ｂ。ＮＲＧ処理は、３種の細胞株における８種の「増殖」遺伝子の発現レベルを差次的に調節した。図７Ａは、２４時間の１ｎＭ ＮＲＧ処理を行ったか、または行わなかったＭＣＦ１０Ａ細胞、ＭＣＦ１０ＡＴ細胞およびＭＣＦ１０ＣＡ１細胞から単離された全ＲＮＡを使用して実施したノーザンブロットを示す。熱ショック遺伝子（Ｍ２２８３２、Ｌ１５１８９、Ｍ９４８５９およびＮＭ＿００６５９７）、オンコジーン（Ｍ １９７２２）、細胞周期制御遺伝子（Ｕ４７４１３）、ならびに翻訳および代謝に関連した遺伝子（Ｌ４１４９０およびＹ００７１１）を含む８種の遺伝子が、３種の細胞株に対して分析された。ＮＲＧ処理しない場合、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞は、ＭＣＦ１０Ａ細胞と比較してこれらの遺伝子のずっと高い基礎レベルを発現したが、前悪性のＭＣＦ１０ＡＴ細胞は、ずっと低いレベルを発現し、したがってより長い曝露を必要とし、これは、一番右に示される。各ブロットは、再度４回プローブされ、そしてロードの正規化のために使用された１８Ｓ ＲＮＡが、各ゲルについて示されている。 図７Ａ〜７Ｂ。ＮＲＧ処理は、３種の細胞株における８種の「増殖」遺伝子の発現レベルを差次的に調節した。図７Ｂは、ＮＲＧ処理後の遺伝子発現レベルの定量化（変化倍数（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ））を示す。ＭＣＦ１０Ａ細胞のＮＲＧ処理は、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞によって認められるごくわずかの遺伝子の最小限のダウンレギュレーションと共に、ＭＣＦ１０ＡＴ細胞より、有意にダウンレギュレーションを誘導した。 図８Ａ〜８Ｃは、ＭＣＦ１０Ａ細胞が、より悪性になるような、ＮＲＧに対する応答性の減少、ｅｒｂＢ２レセプター発現の増加、およびｅｒｂＢ３レセプター発現の減少を示す。図８Ａは、ＭＣＦ１０Ａ細胞、ＭＣＦ１０ＡＴ細胞およびＭＣＦ１０ＣＡ１細胞に適用されるＮＲＧの増加性の濃度によって測定される、ＥｒｂＢレセプターリン酸化（ｐ１８５、上のバンド）を示す。下のバンドは、より高い用量のＮＲＧによっても増加し得るリン酸化ＥＧＦレセプター（ｅｒｂＢ１）を示す。ｐ１８５レベルの定量化は、ｅｒｂＢレセプターリン酸化が未処理のＭＣＦ１０ＡＴ細胞およびＭＣＦ１０ＣＡ１細胞において提示され、そして外来性ＮＲＧ処理が、ＭＣＦ１０Ａ細胞およびＭＣＦ１０ＡＴ細胞の両方において強力であるが、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞における高いベースラインを最小限に上回る、ｅｒｂＢリン酸化を誘導したこと示した。図８Ｂは、ｅｒｂＢ２抗体によって再度プローブしたとき、図８Ａにおける上のバンドのみが、ブロットが重ねられる場合に認識されることを示した。ｅｒｂＢ２の増加性のレベルは、正常な乳腺上皮細胞が悪性癌細胞へと形質転換された場合に認められた。定量化は、ＭＣＦ１０Ａに対して、ＭＣＦ１０ＡＴ細胞（２倍）およびＭＣＦ１０ＣＡ１細胞（６倍）におけるｅｒｂＢ２発現の統計学的に有意な増加を示した。これらの変化倍数の両方は、両側スチューデントｔ検定を使用した０．００１未満のｐ値を有した（＊）。図８Ｃは、主に上のバンドがｅｒｂＢ３を含むが、より小さい割合の下のバンドもまたｅｒｂＢ３を含んだことを示す、ｅｒｂＢ３抗体を用いた同じブロットの再度プローブの結果を示す。ｅｒｂＢ２と対照的に、ｅｒｂＢ３発現は、ＭＣＦ１０ＡＴ細胞（＊ｐ＜０．０１）およびＭＣＦ１０ＣＡ１細胞（＊＊ｐ＜０．００５）の両方においてほぼ２倍減少した。 図９Ａ〜９Ｂ。内因性ＮＲＧ発現は、正常の表現型から悪性の表現型への形質転換の間に、ＭＣＦ１０細胞株において増加した。図９Ａは、ＭＣＦ１０Ａ細胞、ＭＣＦ１０ＡＴ細胞およびＭＣＦ１０ＣＡ１細胞に対して行われたＲＴ−ＰＣＲを示し、そして乳腺上皮細胞がより悪性になるにつれて、増加性のＮＲＧ ｍＲＮＡ（約５００ｂｐのＰＣＲ産物として）を示す。図９Ｂは、ＭＣＦ１０Ａ細胞、ＭＣＦ１０ＡＴ細胞およびＭＣＦ１０ＣＡ１細胞からの、濃縮された調整済みの培地による結果を示し、これらの結果は、ＮＲＧ分泌の量における進行性の増加を示す。培養培地は、Ｌ６細胞に４５分間適用され、細胞がより悪性になるにつれて、ｅｒｂＢレセプターリン酸化（ｐ１８５）を誘導する内因性ＮＲＧの産生の増加性のレベルを示す（左）。Ｌ６細胞はまた、０ｐＭ、１０ｐＭおよび５０ｐＭのＮＲＧによって処理されて、検量線が作成された（右）。 図１０Ａ〜１０Ｃ。可溶性ＮＲＧアンタゴニストＩｇＢ４は、ｅｒｂＢレセプターリン酸化およびＭＣＦ１０ＣＡ１細胞の増殖の両方をブロックした。図１０Ａにおいて、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞は、ＩｇＢ４と組み合わせた１ｎＭ ＮＲＧによって３０分間処理されたかまたは、処理されず、次いでｐ１８５レセプターリン酸化のウェスタンブロット分析が行われた。メンブレンは、タンパク質のロードに対して正規化するために，ｅｒｂＢ２レセプターについて再度プローブされた。図１０Ｂは、ｐ１８５／ｅｒｂＢ２レベルの定量化を示す。ＩｇＢ４は、内因性ＮＲＧおよび外来性ＮＲＧの両方によって誘導されるｐ１８５レセプターリン酸化を阻害した。図１０Ｃは、ＮＲＧの添加を伴う（三角）か、または伴わずに（菱形）、ＭＣＦ１０ＣＡ１の増殖速度に対するＩｇＢ４（塗りつぶした記号）の効果を試験した細胞増殖アッセイを示す。ＩｇＢ４は、通常の細胞増殖およびＮＲＧ誘導性の細胞増殖の両方を、同様のレベルまで有意にブロックした。 図１１Ａ〜１１Ｃは、チロシンキナーゼインヒビターＡＧ１４７８がｅｒｂＢレセプターリン酸化およびＭＣＦ１０ＣＡ１細胞の増殖の両方をブロックすることを示す。図１１Ａにおいて、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞は、ＡＧ１４７８と組み合わせた１ｎＭ ＮＲＧによって３０分間処理されたかまたは、処理されず、次いでｐ１８５レセプターリン酸化のウェスタンブロット分析が行われた。メンブレンは、タンパク質のロードに対して正規化するために，ｅｒｂＢ２レセプターについて再度プローブされた。このアンタゴニストはまた、下の、ＥＧＦレセプターのバンドをブロックする。図１１Ｂは、ｐ１８５／ｅｒｂＢ２レベルの定量化を示す。ＩｇＢ４は、内因性ＮＲＧおよび外来性ＮＲＧの両方によって誘導されるｐ１８５レセプターリン酸化を阻害した。図１１Ｃは、ＮＲＧの添加を伴う（三角）か、または伴わずに（菱形）、ＭＣＦ１０ＣＡ１の増殖速度に対するＡＧ１４７８（塗りつぶした記号）の効果を試験した細胞増殖アッセイを示す。ＡＧ１４７８は、通常の細胞増殖およびＮＲＧ誘導性の細胞増殖の両方を、同様のレベルまで有意にブロックした。 図１２Ａ〜１２Ｃ。ｅｒｂＢ２特異的なｍＡｂトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））は、ｅｒｂＢレセプター活性化を減少させたが、ＮＲＧ誘導性のＭＣＦ１０ＣＡ１細胞の増殖に対する効果を有さなかった。図１２Ａにおいて、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞は、１００μｇ／ｍｌのｅｒｂＢ２レセプター特異的なｍＡｂトラスツズマブによって２４時間、前処理され、次いで１ｎＭ ＮＲＧによって３０分間処理されたか、または処理されなかった。ｐ１８５レセプターリン酸化およびｅｒｂＢ２レセプター発現は、ウェスタンブロットによって試験された。図１２Ｂは、ｐ１８５／ｅｒｂＢ２レベルの定量化を示す。トラスツズマブは、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞のみに適用された場合、ｅｒｂＢレセプターリン酸化に影響しなかったが、ＮＲＧ誘導性のｅｒｂＢレセプター活性化を減少させた。図１２Ｃにおいて、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞は、１００μｇ／ｍｌのトラスツズマブによって２４時間、前処理され（塗りつぶした記号）、次いで処理無し（菱形）または１ｎＭ ＮＲＧ処理（三角）のいずれかが行われた。トラスツズマブは、添加されるＮＲＧの非存在下において、ＭＣＦ１０ＣＡ１細胞の増殖速度を有意に減少させなかった。 図１３は、ＭＣＦ１０シリーズの乳腺上皮細胞におけるＮＲＧのシグナル伝達および作用を要約する略図である。細胞細胞が、正常のＭＣＦ１０Ａ細胞から前悪性のＭＣＦ１０ＡＴ細胞まで、前悪性のＭＣＦ１０ＡＴ細胞から非常に悪性のＭＣＦ１０ＣＡ１細胞まで進行する場合、外来性ＮＲＧの効果は、抗増殖性から増殖性に切り換わる。この切り換えは、互いにヘテロダイマーを形成するｅｒｂＢ３レセプターに対するｅｒｂＢ２レセプターの発現速度の増加、および内因性ＮＲＧの産生の顕著な上昇に関連する。これは、多くの異なる方法でブロックされて、それらの増殖速度を減少させ得るオートクラインシグナル伝達ループをもたらす。ＮＲＧは、ヘパリン結合ドメイン（明るい球体）およびレセプター結合ＥＧＦ様ドメイン（暗い球体）の両方を有するものとして示される。 図１４Ａ〜１４Ｂは、ヘパリンが、用量依存性の様式で、ゲル中のＮＲＧ１を結合し、そしてＮＲＧ１の位置をシフトさせることを示す。図２１Ａにおいて、３５ｎｇのＮＲＧ１は、示される濃度のヘパリンと一緒に２０分間インキュベートされ、そして非変性ゲル上で電気泳動された。ＮＲＧ１は、ＮＲＧ１抗体を使用したウェスタンブロットによって測定し、そして図１４Ｂにおいて定量化したところ、ヘパリン濃度が増加するにつれて、ＮＲＧ１−ヘパリン複合体を形成する用量依存性の様式でシフトした。 図１５Ａ〜１５Ｂは、Ｎ−硫酸化が、２Ｏ−硫酸化および６Ｏ−硫酸化より、ヘパリン−ＮＲＧ１結合のために重要であることを示す。平行ゲルシフトアッセイは、０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／ｍｌにて、（図１５Ａ）十分に硫酸化したヘパリン、完全に脱硫酸化したヘパリン、および脱−Ｎ硫酸化ヘパリン、または（図１５Ｂ）十分に硫酸化したヘパリン、脱−２Ｏ硫酸化ヘパリン、および脱−６Ｏ硫酸化ヘパリンを使用して行われた。完全に脱硫酸化したヘパリンおよび脱−Ｎ硫酸化ヘパリンが、ＮＲＧ１を結合できず、そしてＮＲＧ１をシフトさせられなかったのに対して、脱−２Ｏ硫酸化ヘパリンおよび脱−６Ｏ硫酸化ヘパリンは、脱−Ｎ硫酸化ヘパリンより良好にＮＲＧ１をシフトさせたが、十分に硫酸化したヘパリンよりＮＲＧ１をシフトさせなかった。これらの改変ヘパリンの各々の略図は、「Ｓ」で示される硫酸基を用いて各々のゲルの下部に示される。 図１６Ａ〜１６Ｃは、Ｎ−硫酸化が、２Ｏ−硫酸化および６Ｏ−硫酸化より、ＮＲＧ１誘導性のｅｒｂＢリン酸化を阻害するために重要であることを示す。図１６Ａにおいて、７５ｐｍのＮＲＧ１は、（所定の濃度にて）ヘパリンと一緒に三連で２０分間インキュベートされ、そしてＬ６細胞に適用された。ｅｒｂＢレセプターリン酸化（ｐ１８５）は、ヘパリン濃度が増加するにつれて、漸進的に阻害された。ウェスタンブロットは、データを正規化するために、ｅｒｂＢレセプター（ｅｒｂＢ２／３）について再度プローブされた。図１６Ｂは、脱硫酸化ヘパリン、脱−Ｎ硫酸化ヘパリン、脱−２Ｏ硫酸化ヘパリン、および脱−６Ｏ硫酸化ヘパリンを用いて行われた同じアッセイの結果を示す。完全に硫酸化したヘパリンおよび脱−Ｎ硫酸化ヘパリンが、ｅｒｂＢレセプターリン酸化の阻害において、最も低い有効性であり、次いで脱−２Ｏ硫酸化ヘパリンおよび脱−６Ｏ硫酸化ヘパリンの順で低い有効性であり、そしてこれらは、コントロールの％として定量化された（図１６Ｃ）。これらの改変ヘパリンの各々の略図は、「Ｓ」で示される硫酸基を用いて各々のゲルの隣に盛り込まれる。 図１７Ａ〜１７Ｂは、十分なヘパリンの鎖長が、ＮＲＧ１結合およびｅｒｂＢレセプター遮断に必要とされることを示す。図１７Ａにおいて、３５ｎｇのＮＲＧ１は、長さが１２〜２個の二糖類の範囲である十分に硫酸化したヘパリンフラグメントと一緒に２０分間インキュベートされ、そして非変性ゲル上で電気泳動された。ヘパリンの鎖長が短縮するにつれて、ＮＲＧ１抗体によって可視化されるＮＲＧ１−ヘパリン複合体の位置は、より小さいヘパリンフラグメントに付随する電荷／質量の比の減少を反映して、上方にシフトした。ＮＲＧ１バンドの強度はまた、鎖長が小さくなると共に減少し、これは、ＮＲＧ１に対する、より低い結合親和性を反映しているようである。ヘパリンの長さのいくつかに関する複数のバンドの存在は、多量体相互作用の可能性を示唆する。図１７Ｂにおいて、図１７Ａ中のヘパリンフラグメントの各々は、ＮＲＧ１と一緒にインキュベートされ、そしてＬ６細胞に適用された。ヘパリンの鎖長が短縮されるにつれて、ＮＲＧ１−誘導性のｅｒｂＢレセプターリン酸化（ｐ１８５）を阻害するその能力は、減少した（コントロールの％として示される）。 図１８Ａ〜１８Ｂ。外来性ＨＳＰＧの硫酸化は、ＮＲＧ１誘導性のｅｒｂＢリン酸化を増強する。図１８Ａにおいて、Ｌ６筋細胞の三連の培養物は、２５ｍＭの塩素酸塩または５０ｍＭの塩素酸塩のいずれかによって４８時間、前処理され、次いで全長ＮＲＧ１（ＩｇＥＧＦ）またはヘパリン結合ドメインを欠くＮＲＧ１（ＥＧＦ）のいずれかと一緒にインキュベートされた。５０ｍＭの塩素酸塩は、ホスホチロシン抗体を使用したｅｒｂＢ２／３免疫沈降物のウェスタンブロッティングによって測定したところ、ＩｇＥＧＦ処理した筋管においてｅｒｂＢリン酸化（ｐ１８５）の有意な減少を引き起こしたが、ＥＧＦ処理した筋管においてはｅｒｂＢリン酸化（ｐ１８５）の有意な減少を引き起さなかった。三連の各々についてのバンド強度は、定量化され、サンプル中に存在するｅｒｂＢレセプター（ｅｒｂＢ２／３）の総量に対して正規化され、そして（図１８Ｂ）においてコントロールの平均％として表される。図１８Ａおよび図１８Ｂは、異なる時間について展開した別々のゲル上で解析された。したがって、量的比較を、ＩｇＥＧＦ形態とＥＧＦ形態との間で行うことはできない。 図１９Ａ〜１９Ｃは、内因性ＨＳＰＧのＮ−硫酸化がＮＲＧ１誘導性のｅｒｂＢリン酸化を増強することを示す。Ｎ−硫酸化の減少は、ＮＤＳＴ−ｌａｓと相補的なｓｉＲＮＡを使用したＬ６細胞においてもたらされ、これは、コントロールｓｉＲＮＡ（−）と比較したｓｉＲＮＡ処理細胞（＋）における染色の減少によって示された（図１９Ａ）。４つの別々の視野の蛍光強度の定量化は、ｍＲＮＡレベルの減少と一致する、コントロールの平均４７（±１１）％の染色の減少を示した。図１９Ｂは、図１８Ａ〜Ｃにおける場合と同じアッセイを使用して、Ｎ−硫酸化ヘパラン硫酸の低下した発現が、ＩｇＥＧＦ ＮＲＧ１媒介性のｅｒｂＢ活性化の効力を減少させた（＊ｐ＝０．００４）が、ヘパリン結合ドメイン（ＥＧＦ）を欠くＮＲＧ１は、ＩｇＥＧＦ ＮＲＧ１媒介性のｅｒｂＢ活性化の効力を減少させなかった（ｐ＝０．２１９）ことを示す。「Ｃ」を表示したレーンは、ＮＲＧ１無しおよびｓｉＲＮＡ無しのネガティブコントロールに対応する。これらの結果は、最初に、存在するｅｒｂＢ２／３の総量に対して正規化され、次いでコントロールのｓｉＲＮＡ処理した培養物の％としてプロットした（図１９Ｃ）。複数のｐ１８５バンドの良好な分離は、図１９ＢのＥＧＦ処理アッセイにおいて認められる。＋ｓｉＲＮＡ処理後において、ＩｇＥＧＦ活性とＥＧＦ活性との間に統計学的な差は存在しなかった（ｐ＝０．２４）。有意性は、等分散を仮定する、両側スチューデントｔ検定を使用して評価された。

Claims (29)

  1. ニューレグリンヘパリン結合ドメイン（Ｎ−ＨＢＤ）融合ポリペプチドをコードするハイブリッド核酸分子であって、該分子は、以下：
    （ａ）ヒトＮ−ＨＢＤポリペプチドをコードする第１の核酸配列；
    （ｂ）該第１の核酸配列とインフレームで融合された、スペーサー（Ｓ）をコードする第２の核酸配列であって、該スペーサー（Ｓ）は、ヒトニューレグリンの天然のアミノ酸スペーサーであり、該スペーサー（Ｓ）の配列は、配列番号１４の残基１３１〜１９５にある、第２の核酸配列；および
    （ｃ）第３の核酸配列であって、該第３の核酸配列が、（ｉ）該第２の核酸配列にインフレームで連結され、そして（ｉｉ）Ｓに対してＣ末端側に融合された標的化ポリペプチドをコードし、該標的化ポリペプチドは、ヘパラン硫酸に富んだ細胞または組織表面に標的化および局在化され、そして、ヒトｅｒｂＢ４レセプター（Ｂ４）細胞外ドメイン（Ｂ４−ＥＣＤ）を含む、第３の核酸配列、
    を含む、ハイブリッド核酸分子。
  2. 配列番号１３のコード部分である、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
  4. 以下に作動可能に連結された請求項１〜３のいずれかに記載の核酸を含む発現ベクターであって：
    （ａ）プロモーターおよび
    （ｂ）真核生物細胞における該核酸の発現を調節する、さらなる調節配列、
    該ベクターが、細胞へのインビトロまたはインビボでの送達の後に、該細胞中で発現され得る、発現ベクター。
  5. プラスミドである、請求項４に記載の発現ベクター。
  6. ウイルスベクターである、請求項４の発現ベクター。
  7. ベクター組成物であって、以下：
    （ａ）第１の組換え発現ベクターであって、請求項１〜３のいずれかに記載の第１および第２の核酸配列を含む、第１の組換え発現ベクター；
    （ｂ）第２の組換え発現ベクターであって、請求項１〜３のいずれかに記載の第３の核酸配列を含む、第２の組換え発現ベクター、ならびに
    （ｃ）請求項４に定義されるプロモーターおよび調節配列
    を含み、該発現ベクターは、宿主細胞を同時感染または同時トランスフェクトして、コードされるＮ−ＨＢＤ融合ポリペプチドの同時発現をもたらし得る、ベクター組成物。
  8. 請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子によって、形質転換されたか、またはトランスフェクトされた細胞。
  9. 請求項４〜６のいずれかに記載の発現ベクターによって、形質転換されたか、またはトランスフェクトされた細胞。
  10. 請求項７に記載の組成物によって、形質転換されたか、またはトランスフェクトされた細胞。
  11. 哺乳動物細胞である、請求項８〜１０のいずれかに記載の細胞。
  12. ヒト細胞である、請求項１１に記載の細胞。
  13. 請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子または請求項４〜６のいずれかに記載のベクターによってコードされる、Ｎ−ＨＢＤ融合ポリペプチド。
  14. 請求項８〜１２のいずれかに記載の細胞によって産生される、Ｎ−ＨＢＤ融合ポリペプチド。
  15. 融合ポリペプチドであって、以下：
    （ａ）ヒトＮ−ＨＢＤを含む第１のポリペプチド；
    （ｂ）（ａ）のポリペプチドに対してＣ末端側に融合されたスペーサー（Ｓ）であって、該スペーサー（Ｓ）は、ヒトニューレグリンの天然のアミノ酸スペーサーであり、該スペーサー（Ｓ）の配列は、配列番号１４の残基１３１〜１９５にある、スペーサー（Ｓ）；および
    （ｃ）Ｓに対してＣ末端側に融合された第２のポリペプチドであって、該第２のポリペプチドは、ヘパラン硫酸に富んだ細胞または組織表面に標的化および局在化されたヒトＢ４−ＥＣＤを含む、第２のポリペプチド
    を含む、融合ポリペプチド。
  16. 配列番号１３のコード部分によってコードされる、請求項１５に記載の融合ポリペプチド。
  17. 前記Ｎ−ＨＢＤが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１５または１６に記載の融合ポリペプチド。
  18. Ｃ末端タグ配列をさらに含む、請求項１５〜１７のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
  19. 前記タグ配列が、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）配列である、請求項１８に記載の融合ポリペプチド。
  20. 前記融合ポリペプチドの配列が配列番号１４であり、該配列において、前記Ｎ−ＨＢＤが残基３１〜１３０にあり、Ｂ４−ＥＣＤが残基２００〜８２０にある、請求項１５〜１９のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
  21. 標的化されるポリペプチドを細胞または組織表面に送達するため、および該標的化されるポリペプチドの生物学的活性を増強するために有用な薬学的組成物であって、以下：
    （ａ）請求項１５〜２０のいずれかに記載の融合ポリペプチド；および
    （ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリア、
    を含む、薬学的組成物。
  22. ＥＧＦ−レセプターのニューレグリンによる活性化および／またはニューレグリンによるこのようなレセプターを有する細胞の増殖の刺激を阻害するための組成物であって、該組成物は、該細胞において発現され、そして（ｉ）ニューレグリンの結合、（ｉｉ）該レセプターの活性化および／または（ｉｉｉ）該細胞の増殖の刺激を阻害する融合ポリペプチドを産生する、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸の有効量を含む、組成物。
  23. ＥＧＦ−レセプターのニューレグリンによる活性化および／またはニューレグリンによるこのようなレセプターを有する細胞の増殖の刺激を阻害するための組成物であって、該組成物は、該細胞において発現され、そして（ｉ）ニューレグリンの結合、（ｉｉ）該レセプターの活性化および／または（ｉｉｉ）該細胞の増殖の刺激を阻害する融合ポリペプチドを産生する、請求項４〜６のいずれかに記載の発現ベクターの有効量を含む、組成物。
  24. ＥＧＦ−レセプターのニューレグリンによる活性化および／またはニューレグリンによるこのようなレセプターを有する細胞の増殖の刺激を阻害するための組成物であって、該組成物は、請求項７に記載のベクターが該細胞において同時発現され、そして（ｉ）ニューレグリンの結合、（ｉｉ）該レセプターの活性化および／または（ｉｉｉ）該細胞の増殖の刺激を阻害する融合ポリペプチドを産生するように、請求項７に記載のベクター組成物の有効量を含む、組成物。
  25. ＥＧＦ−レセプターのニューレグリンによる活性化および／またはニューレグリンによるこのようなレセプターを有する細胞の増殖の刺激を阻害するための組成物であって、該組成物は、（ｉ）ニューレグリンの結合、（ｉｉ）該レセプターの活性化および／または（ｉｉｉ）該細胞の増殖の刺激を阻害する、請求項１５〜２０のいずれかに記載の融合ポリペプチドの有効量を含む、組成物。
  26. ニューレグリンシグナル伝達の阻害によって処置可能な被験体における疾患または状態を処置するための組成物であって、該組成物は、請求項２１に記載の薬学的組成物の有効量を含み、ここで、前記融合ポリペプチドの生物学的活性は、ネイティブのＢ４−ＥＣＤまたは前記標的化ポリペプチドに融合されないＢ４−ＥＣＤの活性と比較して増加される、組成物。
  27. 前記疾患または前記状態は、腫瘍の増殖および／もしくは転移がＮＲＧによるオートクライン刺激に依存する腫瘍、または癌である、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記腫瘍または前記癌の細胞表面における前記ヘパラン硫酸が、Ｎ−硫酸化、２−Ｏ−硫酸化および６−Ｏ硫酸化を含むパターンで硫酸化される、請求項２７に記載の組成物。
  29. 前記腫瘍または前記癌が、***もしくは卵巣の腫瘍または癌である、請求項２７に記載の組成物。
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KR20130000384A (ko) * 2010-02-18 2013-01-02 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 뉴레귤린 길항제 및 암의 치료에서의 그의 용도
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US20130058871A1 (en) * 2011-07-28 2013-03-07 Howard Hughes Medical Institute Method and system for mapping synaptic connectivity using light microscopy
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