KR101723292B1 - Kai1 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관신생 억제용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 KAI1 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관신생 억제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 KAI1 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물 및 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 혈관내피세포가 아니라 Pericyte에서 발현하는 KAI1이 Negative angiogenic regulator로서 혈관신생을 억제할 수 있는바, KAI1을 강제로 증가시키거나 혹은 KAI1이 강제로 증가된 Pericyte의 상등액을 이용하는 방법, KAI1 단백질을 사용 방법 또는 KAI1의 Degradation을 유발하는 Src, Pkc pathway를 억제하는 방법 등을 포함한 다양한 기법들을 통해서 기존에 알려진 혈관촉진인자에 의한 혈관 신생을 막을 수 있다. 또한 Pericyte의 KAI1 발현을 확인하여 암환자의 중증도를 확인 할 수 있다.

Description

KAI1 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관신생 억제용 조성물 및 이의 용도{Composition comprising KAI1 polypeptide or nucleic acids encoding the same for inhibiting angiogenesis, and uses thereof}
본 발명은 KAI1 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관신생 억제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 KAI1 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물 및 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
혈관 형성(vasculogenesis) 또는 혈관 신생(angiogenesis)은 새로운 혈관(blood vessels)이 형성되는 현상으로 배아 단계 뿐 만 아니라 성체에서도 중요하게 작용한다. 배아단계에서는 Mesoderm-derived endothelial precursors(Angioblasts)에서 혈관 내피 세포 (Endothelial cell)로 분화되어 혈관을 형성 한다. 성체에서도 혈관 신생은 일어나며, 일반적으로 Angiogenic cytokine, 특히 VEGF와 같은 Growth factor는 혈관 내피 세포(Endothelial cell)의 Receptor에 직접 작용하여 혈관 신생이 촉진된다. 특히, VEGF famaily 중 VEGF-A는 혈관 내피 세포에서 그것의 Receptor인 VEGFR2를 자극하여 혈관 신생을 유발한다. 이러한 혈관신생촉진 사이토카인은 Blood cell 혹은 Stromal cell 등에 의해서 분비 될 수 있다.
따라서, 혈관신생으로 인한 질병 치료제의 개발은 혈관 촉진인자를 중화하거나 혹은 그것의 Receptor을 억제하는 쪽으로 연구개발이 이루어져 왔고, 그 동안 혈관신생으로 인한 질병을 치료하는 주요한 물질로 anti-VEGF agent가 사용되어 왔다. 예컨대, VEGF-A를 타겟으로 하는 치료제들이 암 또는 망막 질환에서 주요하게 쓰이고 있으며, 특히 Bevacizumab (상품명 Avastin)은 VEGF-A에 대한 항체로서, 대장암에서 재발 방지 및 수명 연장에 효과가 있음이 증명되었고 다른 종류의 암에서도 효과가 있을 것으로 기대되고 있다. 하지만, anti-VEGF agent는 혈관의 integrity를 낮추어 출혈을 일으키며, 그 외 혈압 상승 등의 부작용이 있는 문제점이 있다(Elice F et al. Thrombosis Research (2012)).
이에, 이러한 부작용을 최소화 하고 VEGF 뿐 만 아니라 다양한 혈관 신생 촉진 인자들의 기능을 한번에 억제 할 수 있는 물질에 대한 연구가 주요한 과제 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나, 아직 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 KAI1 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물, 또는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 하기의 단계를 포함하는 혈관신생 억제제 또는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리한 후 KAI1의 발현을 분석하는 단계; 및
(b) 시험물질을 처리한 후 상기 시료의 KAI1의 발현이 시험물질을 처리하지 않은 분리된 생물학적 시료의 KAI1의 발현에 비하여 증가하면 혈관신생 억제제 또는 암 치료제로 판단하는 단계.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KAI1 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 KAI1 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 암 또는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로,상기 조성물은 DARC 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 KAI1 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 DARC 폴리펩타이드는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 혈관신생은 종양의 성장과 전이, 허혈성 심질환 (Ischemic heart disease), 버거씨병 (buerger's disease), 연령관련 황반변성(age-related macular degeneration), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 당뇨족 (diabetic foot), 당뇨병성 망막변증(diabetic retinopathy), 건선(psoriasis), 중심성 장액 맥락망막병증 (Central serous (chorio)retinopathy) 또는 만성염증(chronic inflammation)에 수반하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 KAI1 폴리펩타이드는 주피세포(pericyte)에서 발현되어 혈관신생을 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 주피세포는 장기 이식 또는 재생 능력을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 암은 대장암, 췌장암, 대장직장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 전립선암의 골전이암, 난소암, 또는 혈액암일 수 있다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 혈관신생 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리한 후 KAI1의 발현을 분석하는 단계; 및
(b) 시험물질을 처리한 후 상기 시료의 KAI1의 발현이 시험물질을 처리하지 않은 분리된 생물학적 시료의 KAI1의 발현에 비하여 증가하면 혈관신생 억제제로 판단하는 단계.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리한 후 KAI1의 발현을 분석하는 단계; 및
(b) 시험물질을 처리한 후 상기 시료의 KAI1의 발현이 시험물질을 처리하지 않은 분리된 생물학적 시료의 KAI1의 발현에 비하여 증가하면 암 치료제로 판단하는 단계.
본 발명은 상기 약학적 조성물의 약제학적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 허혈성 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 약학적 조성물의 약제학적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제방법을 제공한다.
본 발명은 분리된 생물학적 시료에서 Pericyte의 KAI1 발현을 확인하는 단계를 포함하는, 암의 중증도 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 약학적 조성물의 암 또는 허혈성 질환예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명은 상기 약학적 조성물의 혈관신생억제 용도를 제공한다.
본 발명에 따르면, 혈관내피세포가 아니라 Pericyte에서 발현하는 KAI1이 Negative angiogenic regulator로서 혈관신생을 억제할 수 있는바, KAI1을 강제로 증가시키거나 혹은 KAI1이 강제로 증가된 Pericyte의 상등액을 이용하는 방법, KAI1 단백질을 사용하는 방법 또는 KAI1의 Degradation을 유발하는 Src, Pkc pathway를 억제하는 방법 등을 포함한 다양한 기법들을 통해서 기존에 알려진 혈관촉진인자에 의한 혈관 신생을 막을 수 있다.
또한, 기존의 방법과 Target 하는 방법과 기전이 다를 뿐만 아니라 혈관 내피 세포를 직접 작용하는 기존의 치료제의 부작용을 최소화 할 수 있고, 기존의 치료제와 같이 사용하면 상승효과를 나타낼 수 있다.
더욱이, VEGF 뿐 만 아니라 다양한 Growth factor의 기능을 차단하기 때문에 1~2 가지 한정되지 않은 망막질환 또는 다양한 종류의 암을 포함한 광범위한 혈관 관련 질환에 적용 될 수 있다. 또한 Pericyte의 KAI1 발현을 확인하여 암환자의 중증도를 확인 할 수 있다.
도 1은 embryo 단계에서, WT과 KAI1 -/- mouse의 발생과정을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 postnatal 단계에서, KAI1-/-postnatal mice(P4 및 P5)의 retinal vessel development 능력을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 KAI1-/- postnatal mice(P5)와 WT의 망막(retina)의 empty sleeve를 확인하여 vessel regression을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4 및 도 5는 KAI1-/- postnatal mice(P4)와 WT의 사상위족(filopodia)을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 성체(adult)(15주) 단계에서, KAI1-/- mice와 WT의 adult retinal vessel networking을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 KAI1-/- mice와 WT의 시간에 따른 aortic ring의 신생(sprouting)을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 KAI1-/- mice와 WT의 시간에 따른 꼬리 부분의 상처 치유 상태를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 KAI1 발현의 주체를 확인하기 위해서, C57 mouse의 망막(retina)을 4% PFA로 고정한 후에 BS-1 Lectin, KAI1, DAPI에 대한 면역 염색을 실시한 후 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 10 및 도 11은 mouse EC line인 MS-1, mouse primary Vascular smooth muscle cell(mVSMC), mouse pericyte cell line인 10T1/2의 KAI1 발현을 RT-PCR, Western blot 및 면역 염색으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 in vitro angiogenic 환경에서 MS-1을 WT 또는 KAI1-/- mVSMC와 co-tubeformation assay를 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 mVSMC가 MS-1의 angiogenic 성향을 억제하는 것이 파라크린(Paracrine) 효과에 의한 것인지 확인하기 위해서, WT 또는 KAI1-/- mVSMC를 배양한 배양액(WT 또는 KAI1-/- mVSMC conditioned media)을 이용하여 MS-1의 tube-formation assay를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 mVSMC가 MS-1의 angiogenic 성향을 억제하는 것이 파라크린(Paracrine) 효과에 의한 것인지 확인하기 위해서, WT 또는 KAI1-/- mVSMC를 배양한 배양액(WT 또는 KAI1-/- mVSMC conditioned media)을 이용하여 MS-1의 scratch wound healing assay를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 pericyte의 KAI1 발현에 따른 EC에 대한 부착(adhesion) 능력을 확인하기 위해, MS-1 monolayer에 WT 또는 KAI1-/- mVSMC를 seed 한 후, mVSMC의 MS-1에 대한 adhesion 능력을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 KAI1 발현 여부에 따른 EC에서의 Tip, stalk cell 관련 유전자 발현을 비교하기 위한 실험의 개략적인 과정을 나타낸 것이다.
도 17은 도 15의 실험과정에 따라 Tip, stalk cell specific gene screening을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 WT과 KAI1-/- mVSMC RNA를 이용한 RNA sequencing을 RT-PCR 및 Western blot으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 10T1/2를 KAI1 overexpression adenovirus를 transduction시킨 군과 Mock adenovirus를 transduction 시킨 군 간의 LIF, SULF1, HOXA5, OPTC의 발현의 증가 여부를 real-time PCR과 Western blot으로 확인한 결과를 나타낸 겄이다.
도 20은 LIF가 실제로 EC의 sprouting을 억제하는지 관찰하기 위해 recombinant mouse LIF를 MS1에 처리하고, sox17의 유전자 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 LIF로 인한 EC sprouting 억제효과를 시각적으로 확인하기 위해, Matrigel 상에서 tube formation assay를 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 WT mVSMC를 단백질을 KAI1 항체를 이용하여 Immunoprecipitation을 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 KAI1 발현에 따라 Src의 인산화가 어떻게 변화하는지 확인하기 위해서, lentivrius로 KAI1을 과발현 시킨 10T1/2의 단백질로 western blot을 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 KAI1을 감소시키는 VEGF-A, bFGF 및 PDGF-bb 최적 농도를 qRT-PCR과 Western blot을 통해 선정한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 Cytokine에 의한 KAI1의 발현 감소가 각각의 receptor-mediated response 인지 확인하기 위한 실험의 개략적인 과정을 나타낸 것이다.
도 26은 도 25의 실험과정에 따라 KAI1의 발현을 RT-qPCR과 Western blot으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 사이토카인 종류별 KAI1 발현 감소 패턴 확인을 위한 실험의 개략적인 과정을 나타낸 것이다.
도 28 및 도 29은 도 27의 실험과정에 따라 KAI1 발현변화를 RT-qPCR과 Western blot 및 면역염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 KAI1 발현 감소가 가역적(reversible)인지 여부의 확인을 위한 실험의 개략적인 과정을 나타낸 것이다.
도 31은 도 30의 실험과정에 따라 KAI1 발현변화를 RT-qPCR과 Western blot으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 32 내지 도 35는 사이토카인에 의한 10T1/2에서의 KAI1발현 감소 신호전달을 확인하기 위해, 10T1/2에 사이토카인 자극을 주기 전에 signal molecule inhibitor(Src, PKC, TGF-β, MAPK, AKT, p53, JAK inhibitor)를 처리하여 사이토카인에 의한 10T1/2에 KAI1 발현 감소를 blocking하는지 여부를 RT-qPCR과 Western blot으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 36은 KAI1이 유전자 level에서 억제되는 기작을 확인하기 위한 실험의 개략적인 과정을 나타낸 것이다.
도 37은 도 36의 실험과정에 따라 KAI1 발현변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 38은 혈관신생 인자(angiogenic factor)로 인해 KAI1 promoter에 존재하는 CpG island의 methylation이 증가여부를 bisulfite sequencing으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 39는 DNMT3a(DNA methyltransferase 3a)의 발현이 증가하는 것을 western blot으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 40은 마우스 KAI1 promoter region의 CpG island를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 41은 KAI1 발현에 의한 혈관신생 억제 효과를 검증하기 위한 실험의 개략적인 과정을 나타낸 것이다.
도 42 및 도 43은 도 41의 실험과정에 따라 EC의 sprouting을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 44는 in vivo에서 pericyte의 KAI1 발현을 조절하여 실제로 Angiogenesis를 조절할 수 있는지 확인하는 Mouse cornea micropocket assay 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 45는 KAI1-발현 Pericyte의 종양 성장 억제 효과를 확인하기 위해, C57 mouse 등면(dorsal)에 mouse melanoma cell line인 B16과 WT 또는 KAI1-/- mVSMC를 마트리겔(matrigel)과 섞어 이식한 후, 종양 무게와 부피를 측정하여 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 46은 정상 조직과 종양 조직의 혈관 pericyte에서 KAI1 발현 양상을 비교하기 위해, KAI1(488), SMA(555)를 antibody를 이용하여 염색하여 이를 confocal 이미지를 통해 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 47 및 도 48은 KAI1 단백질 처리의 항암 효과를 검증하기 위해, B16, EC-pericyte hybrid spheroid를 제작하여 collagen에 embedding하고 시간별로 혈관발생 정도를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 49는 Mouse melanoma 세포주인 B16과 hepatoma 세포주인 Hepa-1c1c7, breast cancer 세포주인 EO771 각각을 배양한 상등으로 10T1/2과 WT mVSMC를 배양하였을 때, 대조군과 대비하여 KAI1 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 50은 Hepa-1C1C7과 EO771을 mouse에 넣어주어 종양을 만들고, 그 조직을 lectin(흰색), Mural cell marker(aSMA+NG2+Desmin, 빨간색), KAI1(초록색)으로 면역염색을 하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 51 및 도 52는 recombinat KAI1 protein이 항암제 효과를 보일 수 있는지 확인하기 위해, PC-3(prostate cancer cell line)을 matrigel과 섞어 준 후 mouse의 S,C에 주입하여 tumor mass 형성을 관찰 한 후 실험군 별 비교를 한 결과를 나타낸 것이다.
도 53은 혈관 신생에 있어서, EC의 KAI1 발현이 미치는 영향을 pericyte의 것과 비교하기 위해, EC와 Pericyte 각각에 KAI1 Adenovirus를 이용하여 과발현 시킨 후 Matrigel 상에서 co-tube formation을 진행한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 혈관신생을 조절할 수 있는 물질에 대하여 연구 노력한 결과, KAI1이 내피세포(Endothelial cell; EC)에서 보다 내피세포 주변의 주피세포(pericyte)에서 발현량이 최대 수십배 더 높을 뿐만 아니라, KAI1이 negative angiogenic regulator로서의 기능을 함을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 KAI1 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "혈관신생(angiogenesis)"이란 기존 혈관의 내피세포가 세포외 기질을 분해하고, 이동, 분열, 및 분화하여 새로운 모세혈관을 형성하는 현상을 말하며, 이는 림프관신생(lymphangiogenesis)과는 구별되는 의미이다. 즉, 포유동물의 순환계(the circulatory system)는 크게 혈관계 (the blood vascular system)와 림프계(the lymphatic system)로 구분된다. 혈관신생은 상기에 서술하였듯 혈관계 내에 이미 존재하는 혈관에서 새로운 혈관이 자라나는 현상인 반면, 림프관신생이란 림프계에서 새로운 림프관이 만들어지는 현상으로, 면역기능 유지와 염증 억제에 매우 중요한 과정이다. 혈관과 림프관은 표지자, 촉진인자들이 다를 뿐만 아니라 형태적으로도 차이가 있다. 림프관은 혈관과는 다르게 림프관 내피 세포 분화 단계에서 Prospero-related homeobox-1 (Prox1)을 발현하며, Lymphatic development에 중요하게 작용한다. VEGF-A가 혈관 신생에 중요하게 작용한다면, 림프관 형성에는 VEGF-C가 중요하게 작용한다. VEGF-C는 림프관 내피 세포의 VEGFR3에 주로 작용한다. VEGF-D도 림프관 형성에 중요하지만 림프관 Development에는 필수적으로 작용하지는 않는다.
본 발명은 일반적인 혈관신생 기전과는 다르게, 혈관내피세포가 아닌 주피세포(pericyte)의 KAI1을 표적(target)으로 하여 주피세포(pericyte)의 KAI1을 증가시킴으로써 혈관신생을 억제하는 것에 특징이 있다. 또한, 이러한 주피세포(pericyte)는 장기 이식 또는 재생 능력을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 KAI1(CD82) 폴리펩타이드는 인간에서 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 마우스에서 유래된 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 이에 한정되지 않고 상기 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 KAI1 폴리펩타이드을 코딩할 수 있는 어떤 유전자도 가능하다.
또한, 본 발명에서 상기 조성물은 DARC 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있으며, 상기 DARC 폴리펩타이드는 인간에서 유래된 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 마우스에서 유래된 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 이에 한정되지 않고 상기 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, KAI1이 내피세포(Endothelial cell; EC)가 아닌 그 주변을 감싸고 있는 주피세포(pericyte)에서 발현되고 있는 것을 확인하였다(실시예 2 참조). 또한, embryo, postnatal 및 성체단계에서 모두 KAI1이 발현된 마우스 군에서 혈관신생이 억제되었고(실시예 1 참조), KAI1 발현에 의해 혈관신생 성향이 억제되었으며(실시예 3, 실시예 10 참조), angiogenic 상황에서의 주피세포(Pericyte)의 KAI1 발현이 감소되고, 이는 Src, PKC 신호전달을 통해 이루어짐을 확인하였다(실시예 8 참조).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, KAI1-발현 Pericyte의 망막질환 치료효과를 확인한 결과, KAI1 단백질을 주입하는 경우, 대조군에 비해 VEGF 존재 하에서도 혈관 신생이 억제됨을 확인하였다(실시예 12 참조). 또한, KAI1-발현 Pericyte의 종양 성장 억제 효과도 확인한 결과, KAI1이 발현된 마우스 군에서 종양의 성장이 현저히 억제됨을 확인하였다(실시예 11 참조).
이러한 실험결과로부터, 내피세포가 아닌 주피세포(pericyte)에서 발현하는 KAI1이 Negative angiogenic regulator로서의 기능을 함으로써, 혈관신생을 억제한다는 것을 알 수 있다. 또한, KAI1은 혈관신생 억제를 통해 항암 효과가 있다는 것도 알 수 있다. 따라서, KAI1 또는 KAI1의 발현을 증진시키는 물질은 혈관신생 억제에 효과가 있으며, 종양의 치료에 효과가 있다고 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 혈관신생은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 종양의 성장과 전이, 허혈성 심질환 (Ischemic heart disease), 버거씨병 (buerger's disease), 연령관련 황반변성(age-related macular degeneration), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 당뇨족 (diabetic foot), 당뇨병성 망막변증(diabetic retinopathy), 건선(psoriasis), 중심성 장액 맥락망막병증 (Central serous (chorio)retinopathy) 또는 만성염증(chronic inflammation)에 수반하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 KAI1 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 암 또는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하며, DARC 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암을 또는 허혈성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암 또는 허혈성 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물에 의한 개선, 예방 또는 치료 대상 질병인 "암(cancer)" 은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 본 발명에서 암의 종류로는 대장암, 췌장암, 대장직장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 전립선암의 골전이암, 난소암, 또는 혈액암일 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 또한, 허혈성 질환은 심근장애, 심근허혈, 원발성 심장정지, 협심증, 심근경색, 부정맥, 심근경색, 뇌경색, 당뇨성 족부궤양, 당뇨성 신증, 허혈성 심부전, 허혈성 신부전, 허혈성 간부전 및 허혈성 뇌졸중으로 구성된 군으로 부터 선택될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 KAI1 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 조성물은 상기 유효성분을 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 100 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러번 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 약제학적 제형으로 제조될 수 있으며, 제제의 형태에는 제한이 없다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 약제학적 유효량을 개체에 투여하여 암 또는 허혈성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다. 또한, 본 발명에서 “약제학적 유효량”은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.
또한, 본 발명에 따르면, 내피세포가 아닌 주피세포(pericyte)에서 발현하는 KAI1은 Negative angiogenic regulator로서, KAI1이 발현되면 혈관신생이 억제되므로, 미지의 물질들 중에서 KAI1의 발현을 증가시키는 물질을 선택함으로써 혈관신생 억제제를 선별할 수 있다.
이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 혈관신생 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리한 후 KAI1의 발현을 분석하는 단계; 및
(b) 시험물질을 처리한 후 상기 시료의 KAI1의 발현이 시험물질을 처리하지 않은 분리된 생물학적 시료의 KAI1의 발현에 비하여 증가하면 혈관신생 억제제로 판단하는 단계.
더욱이, 본 발명에 따르면, KAI1이 발현되면 혈관신생이 억제되고, 이를 통해 종양 성장을 억제시킬 수 있으므로, 미지의 물질들 중에서 KAI1의 발현을 증가시키는 물질을 선택함으로써 암 치료제를 선별할 수 있다.
이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리한 후 KAI1의 발현을 분석하는 단계; 및
(b) 시험물질을 처리한 후 상기 시료의 KAI1의 발현이 시험물질을 처리하지 않은 분리된 생물학적 시료의 KAI1의 발현에 비하여 증가하면 혈관신생 억제제로 판단하는 단계.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. Negative angiogenic regulator로서의 KAI1 기능 검증
1-1. Mouse 성장과정을 통한 확인
KAI1이 Negative angiogenic regulator라는 것을 확인하기 위해, WT mouse(C57 mouse)와 KAI1 -/- mouse의 성장과정을 비교하였다.
먼저, embryo 단계에서, WT과 KAI1 -/- mouse의 발생과정을 비교하였다. 보다 구체적으로, mouse들을 교배시킨 다음날 오전 8시경 암컷에게서 mating plug를 확인한 날을 Embryonic day 0.5(E0.5)로 지정한 후 E11.5가 되는 날에 배아를 모체로부터 꺼내 관찰하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, KAI1-/-embryo(E11.5)가 WT embryo 보다 전체적인 크기가 크며 그 중 특히 머리 크기가 큰 것을 확인할 수 있었다. 또한, 혈관 발생이 많고 심장 부분에 출혈(hemorrhage)을 관찰 할 수 있었다.
다음으로, postnatal 단계에서, KAI1-/-postnatal mice(P4 및 P5)의 retinal vessel development 능력을 확인하였다. 보다 구체적으로, mouse가 태어난 날로부터 4, 5일째 된 개체(P4,5)를 희생하여 retina를 추출하여 BS-Lectin으로 염색 후 관찰하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, KAI1-/- postnatal mice(P4 및 P5)의 retinal vessel development 능력이 WT 보다 우수함을 확인할 수 있었다.
또한, KAI1-/- postnatal mice(P5)와 WT의 망막(retina)을 BS-1 lectin(녹색) 및 collagen IV(적색)으로 염색하고, empty sleeve(BS-1lectin - / collagen IV +)를 확인함으로써 vessel regression을 비교하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, KAI1-/- postnatal mice(P5)의 empty sleeve가 WT 보다 더 적은 것을 확인하였는바, 상기 결과로부터 KAI1-/- postnatal mice(P5)의 vessel regression 이 WT 보다 적게 일어남을 알 수 있었다.
추가적으로, KAI1-/- postnatal mice(P4)와 WT의 사상위족(filopodia)을 비교하였다. 보다 구체적으로, mouse가 태어난 날로부터 4, 5일째 된 개체(P4,5)를 희생하여 retina를 추출하여 BS-Lectin으로 염색 후 관찰하였고, 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다. 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, KAI1-/- postnatal mice(P4) 의 Filopodia 가 WT 보다 잘 발달되어 있음을 확인할 수 있었고, 상기 결과로부터 KAI1-/- postnatal retinal vessel 형성능력이 WT 보다 우수함을 알 수 있었다.
다음으로, 성체(adult)(15주) 단계에서, KAI1-/- mice와 WT의 adult retinal vessel networking을 확인하였다. 보다 구체적으로, 태어난 지 15주 된 성체 mouse의 retina를 lectin으로 염색한 뒤, 염색된 혈관의 length, area, branching point를 정량하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, KAI1-/- mice의 adult retinal vessel networking이 WT mice 보다 좋은 것을 확인할 수 있었고, 상기 결과로부터 KAI1-/-adult retinal vessel 형성이 WT 보다 우수함을 알 수 있었다.
1-2. mouse aortic ring assay를 통한 확인
KAI1-/- mice와 WT의 시간에 따른 aortic ring의 신생(sprouting)을 비교하였다. 보다 구체적으로, mouse의 aorta를 matrigel에 심어 DMEM media에 5%, 10% FBS 조건으로 culture하여 혈관 신생의 정도를 관찰하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, in vitro angiogenic 환경에서 KAI1-/- mouse aortic ring의 신생(sprouting)이 WT보다 더 빠르게 일어남을 확인할 수 있었다.
1-3. tail wound assay를 통한 확인
KAI1-/- mice와 WT의 시간에 따른 꼬리 부분의 상처 치유 상태를 비교하였다. 보다 구체적으로, WT과 KAI1-/- mice 꼬리 부분에 가로 2mm, 세로 1cm로 동일하게 상처를 준 후, 2주 동안 상처 치유 정도를 비교하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, in vivo KAI1-/- mouse의 tail wound healing이 WT 보다 더 빠르게 일어났으며, 혈관 신생 또한 많이 일어남을 확인할 수 있었다.
상기 결과들로부터, KAI1의 발현이 없을 때, in vitro, in vivo 모두에서 혈관신생(angiogenesis)이 촉진됨을 알 수 있었다.
실시예 2. KAI1 발현 주체 확인
KAI1 발현의 주체를 확인하기 위해서, 5주령의 C57 mouse의 망막(retina)을 4% PFA로 고정한 후에 BS-1 Lectin(EC marker, 488 파장 이용), KAI1(555 파장 이용), DAPI(핵, UV이용)에 대한 면역 염색을 실시한 후 컨포칼 이미지로 관찰하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타낸 바와 같이, KAI1은 내피세포(Endothelial cell; EC)가 아닌 그 주변을 감싸고 있는 주피세포(pericyte)에서 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다.
추가적으로, mouse EC line인 MS-1, mouse primary vascular smooth muscle cell(mVSMC), mouse pericyte cell line인 10T1/2의 KAI1 발현을 RT-PCR, Western blot, 면역 염색으로 확인하였다. 보다 구체적으로, RT-PCR을 위한 RNA는 Invitrogen 사의 TRIzol을 사용하여 얻었으며 (제조사에서 제공된 프로토콜을 따랐음), 상기 RNA를 다시 Takara 사의 Primescript 1st strand cDNA synthesis kit를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 이후 하기 [표 1]에 기재한 프라이머(primer)를 이용하여 RT-PCR을 진행하였고 전기영동을 통해 각 유전자들의 발현량을 확인하였다. 이때, 세포주 별로 분석하는 cDNA의 총량이 같음을 보여주는 endogenous control로는 housekeeping gene으로 널리 알려진 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 사용하였다. Western blot 실험의 경우, Cell Signaling 사의 Cell lysis buffer를 사용 및 제조사의 가이드라인에 따라 단백질을 얻었다. 그 후 BCA assay를 통해 단백질 농도를 측정하여 세포주 별로 같은 양의 단백질을 SDS-PAGE를 통해 분자량에 따라 분리하고, 항체 반응을 통해 KAI1 발현량을 비교하였다. 세포주 별로 분석하는 단백질의 총량이 같음을 보여주는 endogenous control로는 역시 housekeeping molecule로 알려진 beta actin을 사용하였다. 한편, RT-PCR 및 Western blot에서 KAI1 발현의 positive 대조군으로는 mouse brain 조직을 사용하였다.
구분 프라이머 서열

KAI1		 FW
(Forward)		 5′- CAGCCACTACAACTGGACAGAG-3′(서열번호 5)
RV
(Reverse)		 5′- TACTTGGGGACCTTGCTGTAGT-3′(서열번호 6)

αSMA		 FW
(Forward)		 5'- CTGACAGAGGCACCACTGAA-3'(서열번호 7)
RV
(Reverse)		 5'- ATCTCACGCTCGGCAGTAGTA-3'(서열번호 8)

Desmin		 FW
(Forward)		 5'- TGCAGCCACTCTAGCTCGTA-3'(서열번호 9)
RV
(Reverse)		 5'- CTCATCAGGGAGTCGTTGGT-3'(서열번호 10)

CD31		 FW
(Forward)		 5′- GAATGACACCCAAGCGTTTT-3′(서열번호 11)
RV
(Reverse)		 5′- GGCTTCCACACTAGGCTCAG-3′(서열번호 12)

VE-CAD		 FW
(Forward)		 5'- ATTGAGACAGACCCCAAACG-3'(서열번호 13)
RV
(Reverse)		 5'- ATTCGGAAGAATTGGCCTCT-3'(서열번호 14)

GAPDH		 FW
(Forward)		 5'- CCCTTCATTGACCTCAACTACAT-3'(서열번호 15)
RV
(Reverse)		 5'- CATTGCTGACAATCTTGAGTGAG-3'(서열번호 16)
그 결과, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, CD31, VE-CAD와 같은 EC marker에 positive인 MS-1에서는 KAI1이 발현되지 않는 반면, α-SMA, Desmin positive인 mVSMC, 10T1/2에서는 KAI1이 발현되는 것을 확인할 수 있었고, 상기 결과로부터, KAI1은 EC가 아닌 그 주변의 pericyte에서 발현되고 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. KAI1 발현-mVSMC의 내피세포(EC)의 혈관신생(angiogenesis) 성향 억제 확인
mVSMC의 KAI1의 발현 여부가 MS-1의 혈관신생(angiogenesis)에 어떤 영향을 미치는지 확인을 위해서, in vitro angiogenic 환경에서 MS-1을 WT 또는 KAI1-/- mVSMC를 동시에 matrigl에 culture하여 tube formation정도를 비교하는 co-tubeformation assay를 진행하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 이때의 WT, KAI1-/- mVSMC는 각각 WT mouse와 KAI1-/- mouse의 aorta에서 2 mg/ml collagenase A를 이용하여 primary VSMC를 분리하였으며 DMEM 20% FBS 1X antibiotics-antimycotics에서 배양하여 증식시킨 후 실험에 사용하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, tube length와 branching point 수 측면에서, WT mVSMC와 co-tubeformation을 진행한 군에서 KAI1-/-군 보다 tube formation이 억제됨을 확인할 수 있었다.
추가적으로, 이러한 KAI1을 발현하는 mVSMC가 MS-1의 angiogenic 성향을 억제하는 것이 파라크린(Paracrine) 효과에 의한 것인지 확인하기 위해서, WT 또는 KAI1-/- mVSMC를 배양한 배양액(WT 또는 KAI1-/- mVSMC conditioned media)을 이용하여 MS-1의 matrigel상에서의 tube formation정도를 비교하였고, 또한 MS-1 monolayer에 200p tip으로 scratch를 낸 뒤 wound healing 정도를 비교하였고, 그 결과를 각각 도 13 및 도 14에 나타내었다. 도 13에 나타낸 바와 같이, WT mVSMC conditioned media에서 진행된 tube formation에서 KAI1-/- 군의 것보다 tube length와 branching point 수의 감소뿐만 아니라, sprouting 하는 tip cell과 그 length가 감소된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, scratch wound healing assay를 통해서 WT mVSMC conditioned media가 KAI1-/- 군에 비해 MS-1의 migration을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라, pericyte의 KAI1 발현에 따른 EC에 대한 부착(adhesion) 능력을 확인하기 위해, MS-1 monolayer에 red color로 염색된 WT 또는 KAI1-/- mVSMC를 seed 한 후, 일정시간이 지난 뒤 adhesion되지 않은 cell들을 제거한 후 adhesion된 VSMC들만 관찰하여 mVSMC의 MS-1에 대한 adhesion 능력을 비교하였고, 그 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에 나타낸 바와 같이, WT mVSMC의 MS-1에 대한 adhesion 능력이 KAI1-/-mVSMC에 비해 감소한 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, KAI1을 발현하는 mVSMC가 EC의 angiogenic 성향을 억제하는 것은 direct effect와 paracrine effect 모두를 통한 것임을 알 수 있었다.
실시예 4. KAI1 발현 여부에 따른 EC에서의 Tip, stalk cell 관련 유전자 발현 비교
KAI1 발현 여부에 따른 EC에서의 Tip, stalk cell 관련 유전자 발현을 비교하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였고, 상기 실험의 개략적인 과정을 도 16에 나타내었다.
보다 구체적으로, 도 16에 나타낸 바와 같이, 혈관 형성이 활발히 이뤄지고 있다고 알려진 태어난 지 7일 된 WT 또는 KAI1-/- mouse를 harvest하여 1% collagenase A를 포함하는 DMEM 배지에서 37℃ 조건 및 30분 동안 배양하였다. 그로부터 얻어진 총 retinal 세포들 중 EC를 분리하기 위해 BS-1 lectin으로 염색하여 FACS를 통해 BS-1 lectin positive군을 분류한 후, RT-qPCR을 이용하여 Tip, stalk cell specific gene screening을 실시하였고, 그 결과를 도 17에 나타내었다. 이때 사용된 프라이머 정보는 하기 표 2에 나타내었다.
구분 프라이머 서열

Ang2		 FW
(Forward)		 5′-GAAGGACTGGGAAGGCAACGA -3′(서열번호 17)
RV
(Reverse)		 5′-CCACCAGCCTCCTGAGAGCAT -3′(서열번호 18)

PDGFb		 FW
(Forward)		 5'-ACAGGGAAGTGGACTCCGATACT -3'(서열번호 19)
RV
(Reverse)		 5'-ACATCCGTGTCCTGTTCCCGA -3'(서열번호 20)

Apelin		 FW
(Forward)		 5'-CGAGTTGCAGCATGAATCTGAG -3'(서열번호 21)
RV
(Reverse)		 5'-TGTTCCATCTGGAGGCAACATC -3'(서열번호 22)

Unc5b		 FW
(Forward)		 5′-GAGTGGCTATGCTTGTGATTTGG -3′(서열번호 23)
RV
(Reverse)		 5′-CATAGCAAAGCCTTTCCCTGTG -3′(서열번호 24)

Dll4		 FW
(Forward)		 5'-AGGTGCCACTTCGGTTACAC -3'(서열번호 25)
RV
(Reverse)		 5'-GGGAGAGCAAATGGCTGATA -3'(서열번호 26)

VEGFR3
 FW
(Forward)		 5'-TGGTACCGGCTCAACCTCTC -3'(서열번호 27)
RV
(Reverse)		 5'-CACGTTTTTGCAGTCCAGCA -3'(서열번호 28)

VEGFR1		 FW
(Forward)		 5′-GAGGAGGATGAGGGTGTCTATAGGT -3′(서열번호 29)
RV
(Reverse)		 5′-GTGATCAGCTCCAGGTTTGACTT -3′(서열번호 30)

Jag1		 FW
(Forward)		 5'-GAGGCGTCCTCTGAAAAACA -3'(서열번호 31)
RV
(Reverse)		 5'-ACCCAAGCCACTGTTAAGACA -3'(서열번호 32)

GAPDH		 FW
(Forward)		 5'-TGTCCGTCGTGGATCTGAC -3'(서열번호 33)
RV
(Reverse)		 5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG -3'(서열번호 34)

SOX17		 FW
(Forward)		 5'-CAGCAAGATGCTGGGAAAGT-3'(서열번호 35)
RV
(Reverse)		 5'-GTTGGGGTAGTCCTGCATGT-3'(서열번호 36)

VEGFR2
 FW
(Forward)		 5' -ATCGGAGAAGAACGTGGTTAAA -3'(서열번호 37)
RV
(Reverse)		 5 - CAAATGTTCCACCAACTCTGAA -3'(서열번호 38)
도 17에 나타낸 바와 같이, WT retinal EC보다 KAI1-/- retinal EC에서 Sox17 및 Tip, stalk cell에서 많이 발현되는 유전자들의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다. 다시 말해, KAI1을 발현하는 EC는 KAI1을 발현하지 않는 EC보다 Tip, stalk cell 발현이 감소되어 있었다.
실시예 5. KAI1 발현 여부에 따른 주피세포(pericyte) 간의 유전적 차이 확인
KAI1을 발현하는 Pericyte와 발현하지 않는 Pericyte 간의 어떤 유전적 차이가 있는지 확인하기 위해서, WT mouse와 KAI1-/- mouse의 aorta에서 collagenase A를 이용하여 분리한 WT과 KAI1-/- mVSMC RNA를 이용한 RNA sequencing을 RT-PCR 및 Western blot으로 확인하였고, 그 결과를 도 18에 나타내었다. 이때, RT-PCR에 사용된 프라이머 정보는 하기 표 3에 나타내었다.
구분 프라이머 서열

OPTC		 FW
(Forward)		 5′-TGAGGGGGTGTCTAGCTGTC-3′(서열번호 39)
RV
(Reverse)		 5′-TCTGAGGGAGGGGTAGGAGT-3′(서열번호 40)

PF4		 FW
(Forward)		 5'-AGTCCTGAGCTGCTGCTTCT-3'(서열번호 41)
RV
(Reverse)		 5'-GGCAAATTTTCCTCCCATTC-3'(서열번호 42)

HOXA5		 FW
(Forward)		 5'-AAAAACTCCCTGGGCAACTC-3'(서열번호 43)
RV
(Reverse)		 5'-TGGGCCACCTATATTGTCGT-3'(서열번호 44)

SULF1		 FW
(Forward)		 5′-CCAAACGACACAATCCACTG-3′(서열번호 45)
RV
(Reverse)		 5′-TGAAGGGGTGAAGGTGACTC-3′(서열번호 46)

Serpinf1		 FW
(Forward)		 5'-ACTGCCCCTGAGAAGAACCT-3'(서열번호 47)
RV
(Reverse)		 5'-GCCTGCACCCAGTTGTTAAT-3'(서열번호 48)

LIF		 FW
(Forward)		 5'-TACCGCATAGTCGTGTACCTTG-3'(서열번호 49)
RV
(Reverse)		 5'-ACTGGGGTTGAGGATCTTCTG-3'(서열번호 50)

CD59A		 FW
(Forward)		 5′-AGCCGGAATGCAAGTGTATC-3′(서열번호 51)
RV
(Reverse)		 5′-ATGGTGTCTTCCCCAAGGAT-3′(서열번호 52)

CCL2		 FW
(Forward)		 5'-CAGGTCCCTGTCATGCTTCT-3'(서열번호 53)
RV
(Reverse)		 5'-TCTGGACCCATTCCTTCTTG-3'(서열번호 54)

KLF4		 FW
(Forward)		 5'-CCAAAGAGGGGAAGAAGGTC-3'(서열번호 55)
RV
(Reverse)		 5'-CCTGTGTGTTTGCGGTAGTG-3'(서열번호 56)

Anigotensin		 FW
(Forward)		 5′-CCAGACACCCCTGCTACAGT-3′(서열번호 57)
RV
(Reverse)		 5′-TCTGTACTGACCCCCTCCAG-3′(서열번호 58)

ADAMTS1
 FW
(Forward)		 5'-GGTCACCTTGCAGTGCCTAC-3'(서열번호 59)
RV
(Reverse)		 5'-CCAGTGCACCACAGGGTAGT-3'(서열번호 60)

ROCK2
 FW
(Forward)		 5'-CAGGGAGGTACGACTTGGAA-3'(서열번호 61)
RV
(Reverse)		 5'-TCGGGAAGGTCTCTACATCG-3'(서열번호 62)

ROCK1		 FW
(Forward)		 5′-CCTGCCCTAGAGTGTCGAAG-3′(서열번호 63)
RV
(Reverse)		 5′-TCTTGTTGACAGCGTTCGAG-3′(서열번호 64)

Thrombospondin2		 FW
(Forward)		 5'-GGGTCTGTGGACTTCAGTGG-3'(서열번호 65)
RV
(Reverse)		 5'-GCCAGTACCAGTCGTGGAGT-3'(서열번호 66)

STAT1
 FW
(Forward)		 5'-CAGCTGAGTTCCGACACCTG-3'(서열번호 67)
RV
(Reverse)		 5'-CACCACGACAGGAAGAGAGG-3'(서열번호 68)
도 18에 나타낸 바와 같이, 15개의 negative angiogenic regulator 유전자가의 발현이 KAI1-/- mVSMC RNA에서 감소되어있는 것을 확인할 수 있었고, 이를 real-time PCR로 재현하였을 때, 15개 중 LIF, SULF1, HOXA5, OPTC, 즉 4개의 발현이 유의하게 감소되는 것을 확인하였다.
추가적으로, 10T1/2를 KAI1 overexpression adenovirus를 transduction하여 KAI1의 발현을 증진시킨 후, Mock adenovirus를 transduction 시킨 군과 비교하여 LIF, SULF1, HOXA5, OPTC의 발현의 증가 여부를 real-time PCR과 Western blot으로 확인하였고, 그 결과를 도 19에 나타내었다. 도 19에 나타낸 바와 같이, KAI1의 발현을 증진 시킨 군의 경우에, 그렇지 않은 군에 비하여 LIF, SULF1, HOXA5, OPTC의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. KAI1-발현 Pericyte의 anti-angiogenic factor 발현 증감 확인
KAI1이 어떠한 기작으로 혈관신생을 억제하는지 알아보기 위해, 상기 실시예 5의 기재된 방법과 동일하게 KAI1 wild type (WT), knockout (KO) mouse에서 각각 얻은 primary VSMC (Vascular Smooth Muscle Cell)로 RNA sequencing을 진행한 후, 이로부터 얻은 데이터로 Gene Ontology 분석을 시행한 결과, Negative angiogenic regulator (GO: 0016525) 세트의 유전자인 LIF (Leukemia Inhibitory Factor), HOXA5 (HomeoboxA5), SULF1 (Sulfatase1), OPTC (Opticin)가 KAI1 KO VSMC에서 발현량이 유의미하게 증가되어 있음을 관찰하였다. 이를 여러 종류의 pericyte에서 확인하기 위해, "KAI1 WT vs. KO VSMC", "mock vs. KAI1 과발현 10T1/2", "control siRNA vs. siKAI1 (siRNA로 KAI1 유전자 발현이 억제된 경우) 10T1/2" 세트를 마련하여 RT-qPCR (Reverse Transcription-quantitative Polymerase Chain Reaction)을 진행하였다.
한편, 상기의 anti-angiogenic factor 4개와 KAI1 사이의 연결고리를 찾기 위해, 공통 전사인자(transcripton factor)가 있는지 문헌조사를 실시하였고 그 결과 LIF, HOXA5, SULF1 promoter에 공통적으로 작용하는 Pbx1a를 밝혀냈다. 이후, 4개의 anti-angiogenic factor 중 가장 발현량이 많고 재현성이 있었던 LIF에 집중하여 하기 실험을 진행하였다.
먼저, LIF가 실제로 EC의 sprouting을 억제하는지 관찰하기 위해 recombinant mouse LIF를 MS1에 처리하였고, 그 결과 혈관신생의 master switch로 알려진 sox17의 유전자 발현을 확인하였고 그 결과를 도 20에 나타내었다. 도 20에 나타낸 바와 같이, recombinant mouse LIF를 MS1에 처리하는 경우, sox17의 유전자 발현이 저하됨을 확인할 수 있었다.
다음으로, LIF로 인한 EC sprouting 억제효과를 시각적으로 확인하기 위해, Matrigel 상에서 tube formation assay를 진행하였다. 보다 구체적으로, KAI1 adenovirus를 이용해 KAI1 과발현 10T1/2를 제작하고 MS1과 함께 Matrigel에 seeding해주었을 때, LIF 중화항체를 처리해준 군에서 KAI1 과발현으로 인한 sprouting 억제 효과가 회복되는 것을 확인할 수 있었다(도 21 참조).
실시예 7. 주피세포(Pericyte)의 KAI1 인산화 확인
WT mVSMC를 단백질을 KAI1 항체를 이용하여 Immunoprecipitation을 진행한 후, 인산화된 타이로신 잔기에 대한 immunobloting 뿐만 아니라 Src로도 immunobloting을 진행하였다. 보다 구체적으로, WT mVSMC의 단백질을 상기 실시예 2에 기재된 방법과 같이 얻어서 정량 후 일정량의 KAI1 항체와 함께 4℃ overnight incubation 한 후, 단백질-항체 혼합물을 protein A agarose bead와 다시 4℃에서 2시간 incubation하여 KAI1 항체와 bead가 서로 붙도록 하였다. 그리고 나서, 원심분리를 통해 bead를 가라앉힌 뒤 95℃에서 5분 간 열을 가하여 단백질을 bead로부터 분리한 뒤 SDS-PAGE를 진행하였다. 그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, WT mVSMC의 KAI1이 인산화되며 총 Src와 binding 함을 확인할 수 있었다.
추가적으로, KAI1 발현에 따라 Src의 인산화가 어떻게 변화하는지 확인하기 위해서, lentivrius로 KAI1을 과발현 시킨 10T1/2의 단백질로 western blot을 진행하였고, 그 결과를 도 23에 나타내었다. 도 23에 나타낸 바와 같이, 총 KAI1 발현하더라도 총 Src의 양은 변화가 없지만 타이로신 416번 잔기에 인산화된 src가 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 WT mVSMC 단백질에서 KAI1-/- mVSMC 단백질보다 타이로신 416번 잔기에 인산화된 src가 증가되는 것도 확인할 수 있었다.
실시예 8. Angiogenic 상황에서의 주피세포(Pericyte)의 KAI1 발현 증감 확인
8-1. KAI1 감소시키는 최적의 사이토카인 농도 선정
Angiogenic 상황에서 pericyte가 발현하는 KAI1이 감소하는 것을 증명하기 위해, in vitro 에서 10T1/2(mouse pericyte)에 대표적인 혈관신생 인자(angiogenic factor)인 VEGF-A, bFGF 및 PDGF-bb을 농도별(0, 10, 20, 40ng/ml)로 처리하면서 angiogenic 환경을 유도한 후, KAI1을 감소시키는 최적 농도를 qRT-PCR과 Western blot을 통해 선정하였고, 그 결과를 도 24에 나타내었다.
도 24에 나타낸 바와 같이, 40ng/ml을 KAI1 감소시키는 최적의 사이토카인 농도로 선정하였다.
8-2. 사이토카인에 의한 KAI1 발현 감소가 receptor-mediated 반응인지 여부 확인
Cytokine에 의한 KAI1의 발현 감소가 각각의 receptor-mediated response 인지 확인하기 위해, 하기와 같이 실험을 진행하였으며, 상기 실험의 개략적인 과정을 도 25에 나타내었다.
즉, 상기 실시예 8-1에 의해 선정된 사이토카인(VEGF-A, bFGF, PDGF-bb) 40ng/ml을 10T1/2에 처리하기 전에 cytokine receptor inhibitor를 먼저 처리하였다. 이를 위해 VEGF-A와 PDGF-bb 처리군에는 SU11248이라는 tyrosine kinase inhibitor를 처리하였으며, bFGF 처리군에는 PD173074라는 tyrosine kinase inhibitor를 2시간 전처리 후, 혈관신생 인자(angiogenic factor)인 각 사이토카인(VEGF-A, bFGF, PDGF-bb)를 40ng/ml 처리하여 24시간 후 harvest하여 KAI1의 발현을 RT-qPCR과 Western blot으로 확인하였고, 그 결과를 도 26에 나타내었다.
도 26에 나타낸 바와 같이, cytokine receptor inhibitor 처리에 의해 사이토카인에 의한 10T1/2의 KAI1 발현 감소 효과가 상쇄되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 사이토카인(VEGF-A, bFGF, PDGF-bb)에 의한 KAI1 발현 감소는 각각의 receptor-mediated 반응임을 알 수 있었다.
8-3. 사이토카인 종류별 KAI1 발현 감소 패턴 확인
Cytokine에 의한 10T1/2에 KAI1 발현 감소 패턴이 Cytokine별로 다를 수 있기 때문에, 이를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였으며, 상기 실험의 개략적인 과정을 도 27에 나타내었다.
즉, 각각의 사이토카인(VEGF-A, bFGF, PDGF-bb) 40ng/ml을 10T1/2에 처리한 후 시간에 따른(24시간, 48시간, 72시간) KAI1 발현변화를 RT-qPCR과 Western blot 및 면역염색을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 28 및 도 29에 나타내었다. 이때, 10T1/2는 10% (v/v) FBS (Fetal Bovine Serum), 1% antibiotics-antimycotics가 첨가된 RPMI 1640 HEPES 에 군별로 혈관신생 인자(angiogenic factor)인 각 사이토카인(VEGF-A, bFGF, PDGF-bb)를 40ng/ml 처리하여 배양액 교체 없이 72시간까지 배양하였다.
도 28 및 도 29에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 종류에 따라 KAI1 발현 감소 패턴이 다름을 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로, VEGF-A를 처리한 경우, 24시간까지 일시적으로 KAI1 발현이 감소하였지만 48시간 이후 발현양을 회복한 반면, bFGF 또는 PDGF-bb를 처리한 경우에는 모두 72시간까지 지속적으로 KAI1 발현이 감소하였다.
8-4. KAI1 발현 감소가 가역적(reversible)인지 여부 확인
10T1/2에 FGF, PDGF 자극이 지속적으로 KAI1 발현 감소를 유도하지만, FGF, PDGF 자극을 제거한 경우 10T1/2의 KAI1 발현이 회복되는지 여부를 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 진행하였으며, 상기 실험의 개략적인 과정을 도 30에 나타내었다.
즉, 10T1/2에 각각 FGF, PDGF 자극을 준 후, 24시간 후에 새로운 배양액(일반 배양액)으로 교체한 후, KAI1 발현 감소에 변화가 있는지 여부를 RT-qPCR과 Western blot으로 확인하였고, 그 결과를 도 31에 나타내었다. 도 31에 나타낸 바와 같이, 10T1/2에 FGF, PDGF 각각 자극 후(24h), 이를 제거하면 다시 KAI1 발현이 회복됨을 확인할 수 있었고, 상기 결과로부터 KAI1 발현 감소는 가역적(reversible)임을 알 수 있었다.
8-5. 사이토카인에 의한 KAI1 발현 감소의 신호전달(signaling) 확인
사이토카인에 의한 10T1/2에서의 KAI1발현 감소 신호전달을 확인 하기 위해, 10T1/2에 사이토카인 자극을 주기 전에 signal molecule inhibitor(Src, PKC, TGF-β, MAPK, AKT, p53, JAK inhibitor)를 처리하여 사이토카인에 의한 10T1/2에 KAI1 발현 감소를 blocking하는지 여부를 RT-qPCR과 Western blot으로 확인하였고, 그 결과를 도 32 내지 도 35에 나타내었다.
도 32 내지 도 35에 나타낸 바와 같이, 사이토카인(VEGF-A, bFGF, PDGF-bb) 공통적으로 Src, PKC inhibitor를 처리한 군에서 KAI1 발현 감소가 blocking 되어 있음을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 사이토카인에 의한 10T1/2에서의 KAI1발현 감소는 Src, PKC 신호전달을 통해 이루어 짐을 알 수 있었다.
실시예 9. KAI1 발현 감소 기작 확인
9-1. 유전자 레벨에서 확인
KAI1이 유전자 level에서 억제되는 기작을 확인하기 위해, 하기와 같이 실험을 진행하였으며, 상기 실험의 개략적인 과정을 도 36에 나타내었다.
즉, 10T1/2에 methylation inhibitor(5-azacytidine) 50μM을 처리한 후, 혈관신생 인자(angiogenic factor)인 각 사이토카인(VEGF-A, bFGF, PDGF-bb)을 처리하고 KAI1 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 37에 나타내었다. 도 37에 나타낸 바와 같이, 혈관신생 인자(angiogenic factor)와 함께 methylation inhibitor를 10T1/2에 처리해주면 KAI1의 유전자 발현이 감소하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
추가적으로, 혈관신생 인자(angiogenic factor)로 인해 KAI1 promoter에 존재하는 CpG island의 methylation이 증가여부를 bisulfite sequencing으로, DNMT3a(DNA methyltransferase 3a)의 발현이 증가하는 것을 western blot으로 확인하였고, 그 결과를 각각 도 38 및 도 39에 나타내었다.
도 38 및 도 39에 나타낸 바와 같이, 혈관신생 인자(angiogenic factor)로 인해 KAI1 promoter에 존재하는 CpG island의 methylation 및 DNMT3a이 증가함을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, KAI1이 유전자 level에서 억제되는 기작은 Src, PKC를 통한 DNMT3a (DNA methyltransferase 3a) 증가로 인한 CpG island methylation임을 알 수 있었다.
실시예 10. KAI1 발현에 의한 혈관신생 억제 효과 검증
KAI1 발현에 의한 혈관신생 억제 효과를 검증하기 위해, 하기와 같이 실험을 진행하였으며, 상기 실험의 개략적인 과정을 도 41에 나타내었다.
즉, 도 41에 나타낸 바와 같이, 혈관발생 정도를 정량하기 위해 EC-pericyte hybrid spheroid를 제작하여 collagen에 embedding하고 시간별로 혈관발생 정도를 관찰하였다. 이때, EC로는 MS-1 (mouse endothelial cell line)을 이용하였고, pericyte로는 10T1/2를 이용하였다. 또한, pericyte에는 아데노바이러스 (adenovirus)를 이용하여 KAI1을 과발현시켰다. Spheroid 제작 시 각 세포의 개체 수 비율은 EC : pericyte = 2 : 1였으며, 총 세포 수는 3x103로 고정하였다. Spheroid를 키우는 데 사용한 배양액은 10% FBS 및 1% antibiotics-antimycotics가 첨가된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 사용하였다. 또한, recombinant human VEGF를 100ng/ml 처리하여 EC의 효과적인 sprouting을 유도하였다. 그 결과, 도 42 및 도 43에 나타낸 바와 같이, KAI1 adenovirus로 KAI1 과발현된 pericyte가 포함된 spheroid에서 sprouting이 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (대조군 : mock adenovirus로 transduction된 pericyte).
위의 in vitro 실험을 바탕으로 in vivo에서 pericyte의 KAI1 발현을 조절하여 실제로 Angiogenesis를 조절할 수 있는지 확인하는 Mouse cornea micropocket assay 실험을 하였다. cytokine, sucralfate, poly-hema를 섞어 만든 pocket을 제작하여(천천히 cytokine이 조금씩 분비되게 된다.) mouse cornea에 넣어 준 후, 10일 동안 실험군 별 혈관신생정도를 관찰하였다. 그 결과, 도 44에 나타낸 바와 같이, vehicle 대비 cytokine만 들어간 pellet을 넣어 준 쥐의 cornea의 혈관 신생이 매우 증가해 있음을 확인 할 수 있었다. 그러나 cytokine과 recombinant KAI1 protein이 함께 들어간 pellet을 넣어 준 쥐의 cornea의 혈관 신생은 vehicle과 유사하게 없음을 확인 할 수 있었다. KAI1 adenovirus를 injection한 군 또한 mock adenovirus를 injection한 군 대비 혈관 신생이 매우 줄어 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 11. KAI1-발현 Pericyte의 종양 성장 억제 효과 확인
주피세포(Pericyte)의 KAI1 발현이 종양의 성장에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 하기와 같이 실험을 진행하였다.
먼저, C57 mouse 등면에 mouse melanoma cell line인 B16과 WT 또는 KAI1-/- mVSMC를 마트리겔(matrigel)과 섞어 이식한 후, 종양 무게와 부피를 측정하여 비교하였고, 그 결과를 도 45에 나타내었다. 도 45에 나타낸 바와 같이, WT mVSMC와 B16을 넣어준 군이 KAI1-/- mVSMC와 B16을 넣어준 군보다 종양의 성장이 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다.
다음으로, Human 조직샘플을 확보하여 정상 조직과 종양 조직의 혈관 주피세포에서 KAI1 발현 양상을 비교하는 실험을 하였다. 보다 구체적으로, KAI1(488), SMA(555)를 antibody를 이용하여 염색하였고, 이를 confocal 이미지를 통해 비교하였다. 그 결과, 도 46에 나타낸 바와 같이, 정상조직 주피세포의 KAI1 발현 대비 종양 조직 주피세포의 KAI1 발현이 낮음을 확인 할 수 있었다.
다음으로, KAI1 단백질 처리의 항암 효과를 검증하기 위해, B16, EC-pericyte hybrid spheroid를 제작하여 collagen에 embedding하고 시간별로 혈관발생 정도를 관찰하였다. 이때, EC로는 MS-1 (mouse endothelial cell line)을 이용하였고, pericyte로는 10T1/2를 이용하였다. Spheroid 제작 시 각 세포의 개체 수 비율은 EC : pericyte = 2 : 1였으며, 총 세포 수는 3x103로 고정하였다. Spheroid를 키우는 데 사용한 배양액은 10% FBS 및 1% antibiotics-antimycotics가 첨가된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)과 KAI-1 단백질을 사용하였다. 그 결과, 도 47 및 도 48에 나타낸 바와 같이, KAI1 단백질은 spheroid에서 sprouting이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 KAI-1 단백질의 항암 효과를 기대할 수 있었다.
다음으로, Mouse melanoma 세포주인 B16과 hepatoma 세포주인 Hepa-1c1c7, breast cancer 세포주인 EO771 각각을 배양한 상등으로 10T1/2과 WT mVSMC를 배양하였을 때, 대조군과 대비하여 KAI1 발현을 확인하였다. 그 결과, 도 49에 나타낸 바와 같이, 대조군과 대비하여 KAI1 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, Hepa-1C1C7과 EO771을 mouse에 넣어주어 종양을 만들고, 그 조직을 lectin(흰색), Mural cell marker(aSMA+NG2+Desmin, 빨간색), KAI1(초록색)으로 면역염색을 하여 관찰하였다. 그 결과, 도 50에 나타낸 바와 같이, 종양 조직의 혈관 주변의 대부분의 pericyte들은 KAI1 발현이 억제된 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 상기 실험을 바탕으로, 동물 실험을 진행하였다. C57 mouse에 종양 세포 주와 VEGF, FGF, PDGFb를 통해 KAI1 발현을 막는 signaling인 Src, PKC inhibitor를 동시에 처리하였다. 그 결과 종양 세포 주만 넣어준 군에 비하여 Src, PKC inhibitor를 처리해준 군의 종양 성장과 종양 조직 주변의 혈관 형성이 억제 되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 형성은 pericyte들의 KAI1 발현 때문임을 면역 염색을 통해 확인하였다. 이러한 현상은 rhKAI1과 KAI1이 발현하는 pericyte가 분비하는 LIF를 처리한 군에서도 동일하게 나타났다.
다음으로, recombinant KAI1 protein이 항암제 효과를 보일 수 있는지 확인 하는 동물 실험을 진행 하였다. 보다 구체적으로, PC-3(prostate cancer cell line)을 matrigel과 섞어 준 후 mouse의 피하주사(subcutaneous injection)하여 tumor mass 형성을 관찰 한 후 실험군 별 비교를 하였다. 그 결과, 도 51 및 도 52에 나타낸 바와 같이, recombinant KAI1 protein을 함께 injection한 군은 vehicle 대비 tumor mass가 줄어들어 있음을 확인할 수 있었다. 또한 KAI1 O/E 된 10T1/2의 sup을 함께 injection한 군은 mock 10T1/2의 sup을 함께 injection한 군 대비 tumor mass가 줄어들어 있음을 확인 할 수 있었다. 위 실험에서 얻은 tumor mass를 PFA로 fixation 한 후, 단면을 section 하여 각 실험군별 혈관 신생 정도를 IF로 확인 하였다. 이 때 사용한 항체는 BS-1 Lectin (EC marker, 488 형광), α-SMA(Pericyte marker, 555 형광), DAPI (핵 표지자, 405 형광)이다.
실시예 12. KAI1-발현 Pericyte의 망막질환 치료효과 확인
당뇨성 망막병증 (Diabetic retinopathy), 중심성 장액 맥락망막병증 (Central serous (chorio)retinopathy)과 같은 망막질환은 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)로 인해 혈관 투과성이 증가하여 망막 주변에 체액이 고이고 (황반부종 : macular edema), 병적인 혈관신생이 발생하여 시력을 잃는 질환이다.
이러한 질환을 구현하는 마우스 (mouse) 모델의 안와에 KAI1 단백질을 주입하고, 대조군 (아무 처리도 하지 않음)과 비교하여 혈관신생 억제 정도를 비교하였다. 그 결과, KAI1 단백질을 주입하는 경우, 대조군에 비해 VEGF 존재 하에서도 혈관 신생이 억제되는 것을 망막의 내피세포 및 주피세포에 특이적인 marker를 이용한 면역형광염색법 (immunofluorescence)을 통하여 확인할 수 있었다.
실시예 13. EC와 Pericyte의 KAI1 발현이 혈관 생성 조절에 미치는 영향 비교
혈관 신생에 있어서, EC의 KAI1 발현이 미치는 영향을 pericyte의 것과 비교 및 관찰하기 위해 하기와 같이 실험을 실시하였다.
즉, EC와 Pericyte 각각에 KAI1 Adenovirus를 이용하여 과발현 시킨 후 Matrigel 상에서 co-tube formation을 진행하였다. 당시 배양액은 DMEM 10% FBS 1X Antibiotics-antimycotics였다. 그 결과, 도 53에 나타낸 바와 같이, KAI1 과발현된 EC와 Mock adenovirus를 transduction시킨 pericyte를 co-tube formation 진행한 군보다 Mock adenovirus를 transduction EC와 시킨 KAI1 과발현된 pericyte를 co-tube formation 진행한 군에서 tube formation이 더 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, EC의 KAI1 발현보다 pericyte의 KAI1 발현이 혈관 생성 억제를 주요 인자임을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Composition comprising KAI1 polypeptide or nucleic acids encoding the same for inhibiting angiogenesis, and uses thereof <130> PB14-12382 <160> 68 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens CD82 <400> 1 Met Gly Ser Ala Cys Ile Lys Val Thr Lys Tyr Phe Leu Phe Leu Phe 1 5 10 15 Asn Leu Ile Phe Phe Ile Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Phe Gly Val 20 25 30 Trp Ile Leu Ala Asp Lys Ser Ser Phe Ile Ser Val Leu Gln Thr Ser 35 40 45 Ser Ser Ser Leu Arg Met Gly Ala Tyr Val Phe Ile Gly Val Gly Ala 50 55 60 Val Thr Met Leu Met Gly Phe Leu Gly Cys Ile Gly Ala Val Asn Glu 65 70 75 80 Val Arg Cys Leu Leu Gly Leu Tyr Phe Ala Phe Leu Leu Leu Ile Leu 85 90 95 Ile Ala Gln Val Thr Ala Gly Ala Leu Phe Tyr Phe Asn Met Gly Lys 100 105 110 Leu Lys Gln Glu Met Gly Gly Ile Val Thr Glu Leu Ile Arg Asp Tyr 115 120 125 Asn Ser Ser Arg Glu Asp Ser Leu Gln Asp Ala Trp Asp Tyr Val Gln 130 135 140 Ala Gln Val Lys Cys Cys Gly Trp Val Ser Phe Tyr Asn Trp Thr Asp 145 150 155 160 Asn Ala Glu Leu Met Asn Arg Pro Glu Val Thr Tyr Pro Cys Ser Cys 165 170 175 Glu Val Lys Gly Glu Glu Asp Asn Ser Leu Ser Val Arg Lys Gly Phe 180 185 190 Cys Glu Ala Pro Gly Asn Arg Thr Gln Ser Gly Asn His Pro Glu Asp 195 200 205 Trp Pro Val Tyr Gln Glu Gly Cys Met Glu Lys Val Gln Ala Trp Leu 210 215 220 Gln Glu Asn Leu Gly Ile Ile Leu Gly Val Gly Val Gly Val Ala Ile 225 230 235 240 Val Glu Leu Leu Gly Met Val Leu Ser Ile Cys Leu Cys Arg His Val 245 250 255 His Ser Glu Asp Tyr Ser Lys Val Pro Lys Tyr 260 265 <210> 2 <211> 266 <212> PRT <213> Mus musculus CD82 <400> 2 Met Gly Ala Gly Cys Val Lys Val Thr Lys Tyr Phe Leu Phe Leu Phe 1 5 10 15 Asn Leu Leu Phe Phe Ile Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Phe Gly Val 20 25 30 Trp Ile Leu Ala Asp Lys Asn Ser Phe Ile Ser Val Leu Gln Thr Ser 35 40 45 Ser Ser Ser Leu Gln Val Gly Ala Tyr Val Phe Ile Gly Val Gly Ala 50 55 60 Ile Thr Ile Val Met Gly Phe Leu Gly Cys Ile Gly Ala Val Asn Glu 65 70 75 80 Val Arg Cys Leu Leu Gly Leu Tyr Phe Val Phe Leu Leu Leu Ile Leu 85 90 95 Ile Ala Gln Val Thr Val Gly Val Leu Phe Tyr Phe Asn Ala Asp Lys 100 105 110 Leu Lys Lys Glu Met Gly Asn Thr Val Met Asp Ile Ile Arg Asn Tyr 115 120 125 Thr Ala Asn Ala Thr Ser Ser Arg Glu Glu Ala Trp Asp Tyr Val Gln 130 135 140 Ala Gln Val Lys Cys Cys Gly Trp Val Ser His Tyr Asn Trp Thr Glu 145 150 155 160 Asn Glu Glu Leu Met Gly Phe Thr Lys Thr Thr Tyr Pro Cys Ser Cys 165 170 175 Glu Lys Ile Lys Glu Glu Asp Asn Gln Leu Ile Val Lys Lys Gly Phe 180 185 190 Cys Glu Ala Asp Asn Ser Thr Val Ser Glu Asn Asn Pro Glu Asp Trp 195 200 205 Pro Val Asn Thr Glu Gly Cys Met Glu Lys Ala Gln Ala Trp Leu Gln 210 215 220 Glu Asn Phe Gly Ile Leu Leu Gly Val Cys Ala Gly Val Ala Val Ile 225 230 235 240 Glu Leu Leu Gly Leu Phe Leu Ser Ile Cys Leu Cys Arg Tyr Ile His 245 250 255 Ser Glu Asp Tyr Ser Lys Val Pro Lys Tyr 260 265 <210> 3 <211> 338 <212> PRT <213> Homo sapiens DARC <400> 3 Met Ala Ser Ser Gly Tyr Val Leu Gln Ala Glu Leu Ser Pro Ser Thr 1 5 10 15 Glu Asn Ser Ser Gln Leu Asp Phe Glu Asp Val Trp Asn Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Asp Ser Phe Pro Asp Gly Asp Tyr Gly Ala Asn Leu Glu 35 40 45 Ala Ala Ala Pro Cys His Ser Cys Asn Leu Leu Asp Asp Ser Ala Leu 50 55 60 Pro Phe Phe Ile Leu Thr Ser Val Leu Gly Ile Leu Ala Ser Ser Thr 65 70 75 80 Val Leu Phe Met Leu Phe Arg Pro Leu Phe Arg Trp Gln Leu Cys Pro 85 90 95 Gly Trp Pro Val Leu Ala Gln Leu Ala Val Gly Ser Ala Leu Phe Ser 100 105 110 Ile Val Val Pro Val Leu Ala Pro Gly Leu Gly Ser Thr Arg Ser Ser 115 120 125 Ala Leu Cys Ser Leu Gly Tyr Cys Val Trp Tyr Gly Ser Ala Phe Ala 130 135 140 Gln Ala Leu Leu Leu Gly Cys His Ala Ser Leu Gly His Arg Leu Gly 145 150 155 160 Ala Gly Gln Val Pro Gly Leu Thr Leu Gly Leu Thr Val Gly Ile Trp 165 170 175 Gly Val Ala Ala Leu Leu Thr Leu Pro Val Thr Leu Ala Ser Gly Ala 180 185 190 Ser Gly Gly Leu Cys Thr Leu Ile Tyr Ser Thr Glu Leu Lys Ala Leu 195 200 205 Gln Ala Thr His Thr Val Ala Cys Leu Ala Ile Phe Val Leu Leu Pro 210 215 220 Leu Gly Leu Phe Gly Ala Lys Gly Leu Lys Lys Ala Leu Gly Met Gly 225 230 235 240 Pro Gly Pro Trp Met Asn Ile Leu Trp Ala Trp Phe Ile Phe Trp Trp 245 250 255 Pro His Gly Val Val Leu Gly Leu Asp Phe Leu Val Arg Ser Lys Leu 260 265 270 Leu Leu Leu Ser Thr Cys Leu Ala Gln Gln Ala Leu Asp Leu Leu Leu 275 280 285 Asn Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ile Leu His Cys Val Ala Thr Pro Leu 290 295 300 Leu Leu Ala Leu Phe Cys His Gln Ala Thr Arg Thr Leu Leu Pro Ser 305 310 315 320 Leu Pro Leu Pro Glu Gly Trp Ser Ser His Leu Asp Thr Leu Gly Ser 325 330 335 Lys Ser <210> 4 <211> 334 <212> PRT <213> Mus musculus DARC <400> 4 Met Gly Asn Cys Leu Tyr Pro Val Glu Asn Leu Ser Leu Asp Lys Asn 1 5 10 15 Gly Thr Gln Phe Thr Phe Asp Ser Trp Asn Tyr Ser Phe Glu Asp Asn 20 25 30 Tyr Ser Tyr Glu Leu Ser Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Pro Ala Ala Pro 35 40 45 Cys Tyr Ser Cys Asn Leu Leu Gly Arg Ser Ser Leu Pro Phe Phe Met 50 55 60 Leu Thr Ser Val Leu Gly Met Leu Ala Ser Gly Gly Ile Leu Phe Ala 65 70 75 80 Ile Leu Arg Pro Phe Phe His Trp Gln Ile Cys Pro Ser Trp Pro Ile 85 90 95 Leu Ala Glu Leu Ala Val Gly Ser Ala Leu Phe Ser Ile Ala Val Pro 100 105 110 Ile Leu Ala Pro Gly Leu His Ser Ala His Ser Thr Ala Leu Cys Asn 115 120 125 Leu Gly Tyr Trp Val Trp Tyr Thr Ser Ala Phe Ala Gln Ala Leu Leu 130 135 140 Ile Gly Cys Tyr Ala Cys Leu Asn Pro Arg Leu Asn Ile Gly Gln Leu 145 150 155 160 Arg Gly Phe Thr Leu Gly Leu Ser Val Gly Leu Trp Gly Ala Ala Ala 165 170 175 Leu Leu Gly Leu Pro Val Ala Leu Ala Ser Asp Ala Tyr Asn Gly Phe 180 185 190 Cys Ala Phe Pro Ser Ser Arg Asp Met Glu Ala Leu Lys Tyr Met His 195 200 205 Tyr Ala Ile Cys Phe Thr Ile Phe Thr Val Leu Pro Pro Thr Leu Leu 210 215 220 Ala Ala Lys Gly Leu Lys Ile Ala Leu Ser Lys Gly Pro Gly Pro Trp 225 230 235 240 Val Ser Val Leu Trp Ile Trp Phe Ile Phe Trp Trp Pro His Gly Met 245 250 255 Val Leu Ile Phe Asp Ala Leu Val Arg Ser Lys Ile Val Leu Leu Tyr 260 265 270 Thr Cys Gln Ser Gln Lys Ile Leu Asp Ala Met Leu Asn Val Thr Glu 275 280 285 Ala Leu Ser Met Leu His Cys Val Ala Thr Pro Leu Leu Leu Ala Leu 290 295 300 Phe Cys His Gln Thr Thr Arg Arg Ser Leu Ser Ser Leu Ser Leu Pro 305 310 315 320 Thr Arg Gln Ala Ser Gln Met Asp Ala Leu Ala Gly Lys Ser 325 330 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KAI1 forward primer <400> 5 cagccactac aactggacag ag 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KAI1 reverse primer <400> 6 tacttgggga ccttgctgta gt 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha SMA forward primer <400> 7 ctgacagagg caccactgaa 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha SMA reverse primer <400> 8 atctcacgct cggcagtagt a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Desmin forward primer <400> 9 tgcagccact ctagctcgta 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Desmin reverse primer <400> 10 ctcatcaggg agtcgttggt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD31 forward primer <400> 11 gaatgacacc caagcgtttt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD31 reverse primer <400> 12 ggcttccaca ctaggctcag 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VE-CAD forward primer <400> 13 attgagacag accccaaacg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VE-CAD reverse primer <400> 14 attcggaaga attggcctct 20 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer type I <400> 15 cccttcattg acctcaacta cat 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer type I <400> 16 cattgctgac aatcttgagt gag 23 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ang2 forward primer <400> 17 gaaggactgg gaaggcaacg a 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ang2 reverse primer <400> 18 ccaccagcct cctgagagca t 21 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFb forward primer <400> 19 acagggaagt ggactccgat act 23 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFb reverse primer <400> 20 acatccgtgt cctgttcccg a 21 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apelin forward primer <400> 21 cgagttgcag catgaatctg ag 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apelin reverse primer <400> 22 tgttccatct ggaggcaaca tc 22 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Unc5b forward primer <400> 23 gagtggctat gcttgtgatt tgg 23 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Unc5b reverse primer <400> 24 catagcaaag cctttccctg tg 22 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dll4 forward primer <400> 25 aggtgccact tcggttacac 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dll4 reverse primer <400> 26 gggagagcaa atggctgata 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFR3 forward primer <400> 27 tggtaccggc tcaacctctc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFR3 reverse primer <400> 28 cacgtttttg cagtccagca 20 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFR1 forward primer <400> 29 gaggaggatg agggtgtcta taggt 25 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFR1 reverse primer <400> 30 gtgatcagct ccaggtttga ctt 23 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Jag1 forward primer <400> 31 gaggcgtcct ctgaaaaaca 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Jag1 reverse primer <400> 32 acccaagcca ctgttaagac a 21 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer type II <400> 33 tgtccgtcgt ggatctgac 19 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer type II <400> 34 cctgcttcac caccttcttg 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX17 forward primer <400> 35 cagcaagatg ctgggaaagt 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX17 reverse primer <400> 36 gttggggtag tcctgcatgt 20 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFR2 forward primer <400> 37 atcggagaag aacgtggtta aa 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFR2 reverse primer <400> 38 caaatgttcc accaactctg aa 22 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPTC forward primer <400> 39 tgagggggtg tctagctgtc 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPTC reverse primer <400> 40 tctgagggag gggtaggagt 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PF4 forward primer <400> 41 agtcctgagc tgctgcttct 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PF4 reverse primer <400> 42 ggcaaatttt cctcccattc 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXA5 forward primer <400> 43 aaaaactccc tgggcaactc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXA5 reverse primer <400> 44 tgggccacct atattgtcgt 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SULF1 forward primer <400> 45 ccaaacgaca caatccactg 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SULF1 reverse primer <400> 46 tgaaggggtg aaggtgactc 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Serpinf1 forward primer <400> 47 actgcccctg agaagaacct 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Serpinf1 reverse primer <400> 48 gcctgcaccc agttgttaat 20 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIF forward primer <400> 49 taccgcatag tcgtgtacct tg 22 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIF reverse primer <400> 50 actggggttg aggatcttct g 21 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD59A forward primer <400> 51 agccggaatg caagtgtatc 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD59A reverse primer <400> 52 atggtgtctt ccccaaggat 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL2 forward primer <400> 53 caggtccctg tcatgcttct 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL2 reverse primer <400> 54 tctggaccca ttccttcttg 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF4 forward primer <400> 55 ccaaagaggg gaagaaggtc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF4 reverse primer <400> 56 cctgtgtgtt tgcggtagtg 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anigotensin forward primer <400> 57 ccagacaccc ctgctacagt 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anigotensin reverse primer <400> 58 tctgtactga ccccctccag 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADAMTS1 forward primer <400> 59 ggtcaccttg cagtgcctac 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADAMTS1 reverse primer <400> 60 ccagtgcacc acagggtagt 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROCK2 forward primer <400> 61 cagggaggta cgacttggaa 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROCK2 reverse primer <400> 62 tcgggaaggt ctctacatcg 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROCK1 forward primer <400> 63 cctgccctag agtgtcgaag 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROCK1 reverse primer <400> 64 tcttgttgac agcgttcgag 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombospondin2 forward primer <400> 65 gggtctgtgg acttcagtgg 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombospondin2 reverse primer <400> 66 gccagtacca gtcgtggagt 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STAT1 forward primer <400> 67 cagctgagtt ccgacacctg 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STAT1 reverse primer <400> 68 caccacgaca ggaagagagg 20

Claims (12)

  1. KAI1 폴리펩타이드가 발현된 주피세포(pericyte) 또는 혈관 평활근세포 (vascular smooth muscle cell)를 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
  2. KAI1 폴리펩타이드가 발현된 주피세포(pericyte) 또는 혈관 평활근세포 (vascular smooth muscle cell)를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 DARC 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 KAI1 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 DARC 폴리펩타이드는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    혈관신생은 종양의 성장과 전이, 연령관련 황반변성(age-related macular degeneration), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 당뇨병성 망막변증(diabetic retinopathy), 건선(psoriasis), 중심성 장액 맥락망막병증 (Central serous (chorio)retinopathy) 또는 만성염증(chronic inflammation)에 수반하는 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 주피세포는 장기 이식 또는 재생 능력을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 암은 대장암, 췌장암, 대장직장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 전립선암의 골전이암, 난소암, 또는 혈액암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 하기의 단계를 포함하는 혈관신생 억제제의 스크리닝 방법:
    (a) 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리한 후 주피세포(Pericyte) 또는 혈관 평활근세포 (vascular smooth muscle cell)의 KAI1의 발현을 분석하는 단계; 및
    (b) 시험물질을 처리한 후 상기 KAI1의 발현이 시험물질을 처리하지 않은 분리된 생물학적 시료의 KAI1의 발현에 비하여 증가하면 혈관신생 억제제로 판단하는 단계.
  11. 하기의 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리한 후 주피세포(Pericyte) 또는 혈관 평활근세포 (vascular smooth muscle cell)의 KAI1의 발현을 분석하는 단계; 및
    (b) 시험물질을 처리한 후 상기 KAI1의 발현이 시험물질을 처리하지 않은 분리된 생물학적 시료의 KAI1의 발현에 비하여 증가하면 암 치료제로 판단하는 단계.
  12. 분리된 생물학적 시료에서 주피세포(Pericyte) 또는 혈관 평활근세포 (vascular smooth muscle cell)의 KAI1 발현을 확인하는 단계를 포함하는, 암의 중증도 진단을 위한 정보 제공 방법.
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