JP4942044B2 - 精神障害関連遺伝子及びその利用 - Google Patents
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Description
本発明は以上の課題に鑑み、精神障害の治療や診断に有用な手段を提供することを目的の一つとする。治療用途に関しては特に、精神障害に対する薬剤候補を選抜する方法を提供することで、治療法の確立に貢献することを目的とする。診断用途に関しては特に、罹患の有無の判定、病態の把握、さらには罹患リスクの評価などを可能とする手段を提供することを目的とする。また本発明は、精神障害の治療に直接的に有効な手段を提供することも目的の一つとする。さらに本発明は、精神障害の原因究明など、研究目的において有効な研究ツールを提供することも目的とする。
本発明者らは更に、同定に成功した遺伝子についてヒト相同遺伝子が存在するとの予測の下、公共のデータベースを用いてホモロジー検索を実施した。その結果、各遺伝子に対するヒト相同遺伝子の存在を確認した。即ち、本発明者らは精神障害に関連すると考えられるヒト遺伝子の同定にも成功した。これらの遺伝子は精神障害の治療又は診断(発症リスク診断も含む)において、或いは精神障害に対する薬剤の開発や精神障害の発症又は進行機構の究明においてその利用が図られるものであり、有用性は非常に高い。
本発明は主として以上の成果ないし知見に基づくものであり、次の構成を提供する。即ち、本発明の第1の局面は精神障害に有効な化合物のスクリーニング方法であって、(1)配列番号1の塩基配列を有する遺伝子、配列番号2の塩基配列を有する遺伝子、配列番号3の塩基配列を有する遺伝子、及びこれらの相同遺伝子からなる群より選択される遺伝子(対象遺伝子)を発現する細胞を用意するステップ、(2)前記細胞に試験化合物を曝露するステップ、(3)試験化合物の曝露後の前記細胞における、前記対象遺伝子の発現量を測定するステップ、及び(4)試験化合物の曝露による、前記対象遺伝子の発現量変化を求めるステップを含むことを特徴とする。
本発明の一態様では、動物個体を用いたスクリーニング方法が提供される。当該スクリーニング方法は、(i)非ヒト動物を用意するステップ、(ii)前記非ヒト動物に試験化合物を投与するステップ、(iii)試験化合物の投与後、前記非ヒト動物の中枢神経系組織内における、配列番号1の塩基配列を有する遺伝子、配列番号2の塩基配列を有する遺伝子、配列番号3の塩基配列を有する遺伝子、及びこれらの相同遺伝子からなる群より選択される遺伝子(対象遺伝子)の発現量を測定するステップ、及び(iv)試験化合物の投与による、前記対象遺伝子の発現量変化を求めるステップを含むことを特徴とする。
本発明の一態様では非ヒト動物として、精神障害の病態を呈する非ヒト動物が使用される。
本発明のスクリーニング方法において非ヒト動物として例えばマウスが使用される。この場合、列番号1の塩基配列を有する遺伝子、配列番号2の塩基配列を有する遺伝子、又は配列番号3の塩基配列を有する遺伝子が検出対象の遺伝子となる。
本発明のスクリーング方法はその好適な一形態において、薬物依存症に有効な化合物を選抜・同定することを目的とする。
本発明の他の局面は、精神障害関連遺伝子の診断用途への適用に関する。この局面では、精神障害診断用の情報を取得する方法が提供される。当該方法は、a)対象から採取された生体試料を用意するステップ、及びb)配列番号4の塩基配列を有する遺伝子、配列番号5の塩基配列を有する遺伝子、配列番号6の塩基配列を有する遺伝子、及びこれらの天然変異体からなる群より選択される遺伝子の前記生体試料中の発現量を測定するステップを含むことを特徴とする。
本発明の更に他の局面は、精神障害関連遺伝子の治療用途への適用に関する。この局面では、配列番号4の塩基配列を有する遺伝子、配列番号5の塩基配列を有する遺伝子、配列番号6の塩基配列を有する遺伝子、及びこれらの天然変異体からなる群より選択される遺伝子の標的組織内発現量を増加させる化合物を含む抗精神障害薬が提供される。
本発明の一態様では、抗精神障害薬の有効成分として、配列番号10のアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質、配列番号11のアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質、配列番号12のアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質、これらの天然変異体、配列番号10のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、配列番号11のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、配列番号12のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、及び前記天然変異体をコードする単離された核酸からなる群より選択される化合物が用いられる。
本発明の更なる局面は、精神障害関連遺伝子の研究用途への適用に関する。この局面では配列番号1〜6のいずれかの塩基配列を有する単離された核酸を含む精神障害研究用試薬又はそれを含むキットが提供される。
本発明の更に、配列番号7〜12のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸を保持する、精神障害治療用又は精神障害研究用発現ベクターを提供する。本発明はまた、配列番号7〜12のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質に対する、単離された精神障害治療用、精神障害診断用又は精神障害研究用抗体を提供する。好ましい一態様において本発明の抗体は、配列番号19又は20のアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異的結合性を有することを特徴とする。
本明細書において「抗精神障害薬」とは、精神障害の発症を抑制するために使用される薬剤、又は精神障害の症状を改善(部分的又は完全な治癒を含む)するために使用される薬剤のことをいう。したがって本発明の抗精神障害薬には、精神障害の予防的処置に使用可能な薬剤、及び精神障害の治療に使用可能な薬剤が含まれる。
本発明において遺伝子に言及する場合、その天然変異体についても考慮される。
本発明の一局面は精神障害に対して有効な化合物のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法で選抜された化合物は、精神障害に関する医療措置に対して有効であると期待される。即ち、本発明のスクリーニング方法によって選抜された化合物は精神障害に対する薬剤の有力な候補又はそのような薬剤を開発する際の有用な材料となる。選抜された化合物が精神障害に対して十分な薬効を有する場合にはそのまま薬剤の有効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しない場合には化学的修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で薬剤の有効成分としての使用に供することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であっても、更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもよい。
本発明のスクリーニング方法は、特定の細胞又は動物個体を利用して実施することができる。
本発明の一態様では細胞ベースのスクリーニング方法が提供される。この態様では試験化合物の曝露(投与、添加)によって細胞内における特定の遺伝子の発現量が変化するか否かが調べられる。具体的には、本発明のスクリーニング方法では以下の各ステップが実施される。
ステップ1:配列番号1の塩基配列を有する遺伝子、配列番号2の塩基配列を有する遺伝子、配列番号3の塩基配列を有する遺伝子、及びこれらの相同遺伝子からなる群より選択される遺伝子(対象遺伝子)を発現する細胞を用意するステップ。
ステップ2:上記細胞に試験化合物を曝露するステップ。
ステップ3:試験化合物の曝露後の上記細胞における、対象遺伝子の発現量を測定するステップ。
ステップ4:試験化合物の曝露による、対象遺伝子の発現量変化を求めるステップ。
以下、ステップ毎にその詳細を説明する。
ステップ1では検出対象の遺伝子(本明細書において「対象遺伝子」という)を発現する細胞を用意する。対象遺伝子は、配列番号1の塩基配列を有する遺伝子(本明細書において「対象マウス遺伝子1」ともいう)、配列番号2の塩基配列を有する遺伝子本明細書において「対象マウス遺伝子2」ともいう)、配列番号3の塩基配列を有する遺伝子(本明細書において「対象マウス遺伝子3」ともいう)、及びこれらの相同遺伝子の中らか選択される。これら二種類以上を検出対象としてもよい。尚、対象マウス遺伝子1〜3はいずれも、薬物依存症に関連性が認められたマウスの遺伝子である(後述の実施例を参照)。
ヒト以外の動物細胞(例えばマウス、ラット、ウサギ、ニワトリなど)であることを条件として、生体から分離されていない状態(即ち生体を構成している状態)の細胞を使用してもよい。
ステップ2では、用意した細胞に試験化合物を曝露する。試験化合物の曝露は例えば、培養液中に試験化合物が存在する条件下で細胞を所定時間培養することによって実施される。或いは、試験化合物又はそれを含む溶液などを直接細胞に接触させることにしてもよい。
曝露量は任意に設定可能である。例えば、細胞に致死的な影響を与えない範囲で可能な限り最大の曝露量を採用することができる。
曝露時間は特に限定されない。例えば、曝露時間を1分〜10日の範囲内で設定することができる。間隔をおいて連続的に曝露してもよい。
ステップ3では、試験化合物の暴露後の細胞を用いて対象遺伝子の発現量を測定する。本発明の一態様では対象遺伝子の発現量として、対象遺伝子の転写産物であるmRNAの量が測定される。mRNAの検出にはRT-PCR法、特異的なプローブを用いた各種ハイブリダイゼーション法(例えばサザンハイブリダイゼーション、in situハイブリダイゼーション)などの常法を採用できる。
本発明の他の態様では、対象遺伝子の発現産物であるタンパク質の量が測定される。例えば、目的のタンパク質に対して特異的に結合する化合物を用いて検出(測定)を実施できる。検出方法(又は測定方法)は、これに限定されるものではないが、免疫学的手法によることが好ましい。免疫学的手法では特定のタンパク質に対する抗体が使用され、当該抗体の結合性(結合量)を指標として当該タンパク質が検出される。ここでの用語「抗体」はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、CDRグラフト抗体、ヒト化抗体、又はこれらの断片等を含む。本発明における抗体は、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。
免疫学的検出法によれば迅速で感度のよい検出が可能となる。また、操作も簡便である。尚、検出方法としては例えば、ELISA法、ラジオイムノアッセイ、FACS、免疫沈降法、イムノブロッティング等の方法が挙げられる。
ステップ4では、上記ステップの測定結果を用いて対象遺伝子の発現量変化を求める。例えば、試験化合物を曝露する細胞(曝露群)と試験化合物を曝露しない細胞(非曝露群、対照群)とを用意し、曝露群、非曝露群それぞれについて対象遺伝子の発現量を測定し、両者を比較する。尚、試験化合物の曝露がないときの対象遺伝子の発現量が予め判明している場合には、この発現量を非曝露群の発現量として用いることもできる。比較結果から、試験化合物の曝露の結果として対象遺伝子の発現が変化した程度(発現量変化)が求められる。このようにして対象遺伝子の発現量に対する試験化合物の作用を評価する。
非暴露群に比較して暴露群の発現量が多い場合、即ち試験化合物に発現量増加作用が認められる場合には、当該試験化合物が精神障害に対して有効な化合物であると判定できる。暴露群において発現量の顕著な増加が認められる場合には、当該試験化合物が精神障害に対して特に有効な化合物であると判定できる。
以上のように、当該ステップの結果を用いて精神障害に対する試験化合物の有効性が評価される。
精神障害に有効な化合物のスクリーニングを、動物個体を用いて実施することもできる。即ち本発明は、以下のステップを含む動物個体ベースのスクリーニング方法も提供する。
ステップi:非ヒト動物を用意するステップ。
ステップii:上記非ヒト動物に試験化合物を投与するステップ。
ステップiii:試験化合物の投与後、上記非ヒト動物の中枢神経系組織内における、配列番号1の塩基配列を有する遺伝子、配列番号2の塩基配列を有する遺伝子、配列番号3の塩基配列を有する遺伝子、及びこれらの相同遺伝子からなる群より選択される遺伝子(対象遺伝子)の発現量を測定するステップ。
ステップiv:試験化合物の投与による、対象遺伝子の発現量変化を求めるステップ。
以下、ステップ毎にその詳細を説明するが、特に言及しない事項については上記の細胞ベースのスクリーニング方法の説明における対応する記述が援用される。
ステップiでは非ヒト動物を用意する。非ヒト動物とは、例えばヒト以外の霊長類(サル、チンパンジーなど)、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ等である。この中でもマウス又はラットを好適に用いることができる。
非ヒト動物は通常、対象マウス遺伝子1〜3に対する、その種固有の相同遺伝子を発現する。後述のように遺伝子改変動物を使用する場合は例外として、通常、この相同遺伝子の発現量を本スクリーニング法での検出対象とする。
精神障害の病態を呈している非ヒト動物を用いることが好ましい。かかる疾患モデル動物を使用すれば、精神障害状態において対象遺伝子の発現に対する試験化合物の作用が調べられる。つまり実際の治療時を想定したスクリーニング系となる。かかるスクリーニング系によれば、精神障害に実際に作用し且つ有効性に優れた化合物を効率的に選抜することが可能となる。一方、対象遺伝子の発現量の測定に並行して非ヒト動物の病態の変化を観察すれば、対象遺伝子の発現量変化と病態の変化との間の相関性を調べることができ、試験化合物の作用を評価する上で有益な情報が得られる。
精神障害の病態を呈する非ヒト動物として、遺伝子改変及び/又は特定の条件下での飼育によって特定の病態を呈するに至る動物を使用することができる。例えば、NMDA受容体ε1やε4を欠く遺伝子改変マウス等が統合失調症のモデル動物として有効であると提案されており(Miyamoto, Y., Yamada, K., Noda, Y., Mori, H., Mishina, M. and Nabeshima, T.: Hyperfunction of dopaminergic and serotonergic neuronal systems in mice lacking the NMDA receptor ε1 subunit.: FASEB J., 15, 1407-1409 (2001)、Miyamoto, Y., Yamada, K., Noda, Y., Mori., H., Mishina, M. and Nabeshima, T., :Lower sensitivity to stress and altered monoaminergic neuronal function in mice lacking the NDMA receptor ε4 subunit.: J. Neurosci., 21, 750-757 (2001))、これらの非ヒト動物を本発明に利用することができる。また、マウスなどへのフェンシクリジン(PCP)の投与によって統合失調症の症状が再現されたマウス(Noda Y, et al.,Repeated phencyclidine treatment induces negative symptom-like behavior in forced swimming test in mice: imbalance of prefrontal serotonergic and dopaminergic functions. Neuropsychopharmacology. 2000 Oct. 23(4):375-87)などを、統合失調症のモデル動物として本発明に利用することができる。一方、後述の実施例にも示されるように、メタンフェタミンなどの連続投与を受けたマウスは薬物依存症の病態を呈する。従って、このような条件で処理されたマウスを薬物依存症のモデル動物として好適に本発明に利用することができる。
ステップiiでは非ヒト動物に試験化合物を投与する。投与経路は特に限定されず、経口投与、静脈内投与(注射)、皮内投与(注射)、皮下投与(注射)、経皮投与、口腔内投与、標的組織への直接投与(注射)等から適当なものを選択できる。尚、ここでの標的組織は、精神障害に関与する組織であり、典型的には中枢神経系組織(前脳の中でも前頭前皮質、側坐核、線条体、中脳、海馬など)が該当する。
投与量は任意に設定可能である。例えば、非ヒト動物に致死的な影響を与えない範囲で可能な限り最大の投与量とすることができる。
投与回数も任意に設定可能である。例えば、投与回数を1回〜20回の範囲内とする。
ステップiiiでは、試験化合物の投与後の非ヒト動物を用いて、中枢神経系組織(前脳の中でも前頭前皮質、側坐核、線条体、中脳、海馬など)内における対象遺伝子の発現量を測定する。即ち、特定の中枢神経組織内における、対象遺伝子のmRNA及び/又は発現産物(タンパク質)の量が測定される。尚、組織抽出液を用いた測定、組織切片を用いた測定(例えば免疫組織染色)のいずれを実施してもよい。
ここで、使用する非ヒト動物がマウスであれば、対象マウス遺伝子1〜3のいずれか(又はこれらの任意の組合せ)を検出対象とする。使用する非ヒト動物がマウス以外の種であれば、対象マウス遺伝子1〜3に対応する当該種の相同遺伝子を検出対象とする。例えば、ラットを使用する場合にはラット相同遺伝子が検出対象となる。但し、他の種の相同遺伝子を発現する非ヒト動物(遺伝子組み換え動物)を用いた場合には、当該相同遺伝子を検出対象とすることができる。このように、遺伝子組み換え技術を利用して、その動物種が本来は発現しない遺伝子を検出対象としたスクリーニング方法を構築してもよい。
ステップivでは、上記ステップの測定結果から対象遺伝子の発現量変化を求める。例えばまず、試験化合物を投与する動物個体(投与群)と試験化合物を投与しない動物個体(非投与群)とを用意し、投与群と非投与群それぞれについて対象遺伝子の発現量を測定する。続いて、投与群の発現量と非投与群の発現量とを比較する。比較結果から、試験化合物の投与の結果として対象遺伝子の発現が変化した程度(発現量変化)が求められる。このようにして対象遺伝子の発現量に対する試験化合物の作用を評価する。
非投与群に比較して投与群の発現量が多い場合、即ち試験化合物に発現量増加作用が認められる場合には、当該試験化合物が精神障害に対して有効な化合物であると判定できる。投与群において発現量の顕著な増加が認められる場合には、当該試験化合物が精神障害に対して特に有効な化合物であると判定できる。
以上のように、当該ステップの結果を用いて精神障害に対する試験化合物の有効性が評価される。
尚、細胞ベースのスクリーング方法と同様、ある動物個体(動物群)において試験化合物投与前後の遺伝子発現量を比較することによって試験化合物の作用を評価することにしてもよい。
本発明の他の局面は、本発明者らが同定に成功した遺伝子の診断用途に関する。この局面の一態様は精神障害診断用の情報を取得する方法に関し、次のステップを含む。
ステップa:対象から採取された生体試料を用意するステップ。
ステップb:配列番号4の塩基配列を有する遺伝子、配列番号5の塩基配列を有する遺伝子、配列番号6の塩基配列を有する遺伝子、及びこれらの天然変異体からなる群より選択される遺伝子の前記生体試料中の発現量を測定するステップ。
当該方法で得られる情報は精神障害の診断に利用される。例えば、精神障害の患者を対象として上記方法を実施して得られた情報は、当該患者の病態の評価ないし把握、治療効果の評価などに利用できる。例えば、精神障害の治療と並行して本発明の方法を実施すれば、結果として得られる情報を基に治療効果を評価することができる。具体的には、薬剤投与後に本発明の方法を実施することで特定の遺伝子の発現量の変化を調べ、発現量の増減から治療効果を判定することができる。このように本発明の方法を治療効果のモニターに利用してもよい。
一方、患者以外の者、即ち精神障害が認定されていない者を対象とした場合に得られた情報は、精神障害に関して罹患の有無の判定、罹患リスクの評価等に利用できる。
本発明の方法によれば、遺伝子の発現量という客観性に優れた指標を基に精神障害の診断を行えることから、従来では客観的に診断することが困難であった精神障害の診断分野においてその価値は非常に高い。
ステップaでは対象(被験者)から採取された生体試料を用意する。精神障害の患者に限らず、健常者(精神障害のおそれがある者を含む)をここでの対象とすることもできる。例えば、対象から採取された組織片、細胞抽出液、脳脊髄液等を生体試料として用いることができる。生体試料として好ましくは核酸試料を用いる。核酸試料は、対象(被験者)の血液、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から公知の抽出方法、精製方法を用いて調製することができる。
ステップbでは生体試料を用いて特定遺伝子の発現量を測定する。測定対象の遺伝子は、配列番号4の塩基配列を有する遺伝子(対象ヒト遺伝子1)、配列番号5の塩基配列を有する遺伝子(対象ヒト遺伝子2)、又は配列番号6の塩基配列を有する遺伝子(対象ヒト遺伝子3)である。これらの遺伝子の天然変異体を測定対象としてもよい。天然変異体が複数存在する場合にはその中の一つ又は任意の組合せを測定対象とすることができる。
標準型遺伝子と変異型遺伝子の両者を測定対象としてもよい。例えば標準型遺伝子と変異型遺伝子の両者を同時に測定し、得られた総発現量を診断用の情報として利用することができる。又は、標準型遺伝子の発現量と変異型遺伝子の発現量をそれぞれ求め、両者の比較データを診断用の情報として利用してもよい。
尚、対応するmRNA量又はタンパク質量を測定することによって、特定の遺伝子の発現量を求めることができる(具体的な測定法は上記スクリーニング方法の欄を参照)。
ステップA:対象から採取された核酸試料を用意するステップ。
ステップB:核酸試料中における、配列番号4の塩基配列を有する遺伝子、配列番号5の塩基配列を有する遺伝子、及び配列番号6の塩基配列を有する遺伝子からなる群より選択される遺伝子の型を解析するステップ。
ステップBの結果得られた遺伝子型に関する情報は、精神障害のリスク診断に利用することができる。例えば、遺伝子型(特定のアリルの組合せ)に基づいて、精神障害の遺伝的リスクの程度を判定することができる。
このような遺伝子の発現産物を用いて解析する方法としては、多型部位のアミノ酸を直接分析する方法、又は立体構造等の変化を利用して免疫学的に分析する方法などが挙げられる。前者としては周知のアミノ酸配列分析法(エドマン法を利用した方法)を用いることができる。後者としては、多型を構成するいずれかの遺伝子型を有する遺伝子の発現産物に特異的な結合活性を有するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いたELISA法(酵素結合免疫吸着定量法)、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、免疫拡散法等を用いることができる。
本発明の更なる局面は、本発明者らが同定に成功した遺伝子の治療用途に関する。この局面の一態様では抗精神障害薬が提供される。本発明の抗精神障害薬は、配列番号4の塩基配列を有する遺伝子(対象ヒト遺伝子1)、配列番号5の塩基配列を有する遺伝子(対象ヒト遺伝子2)、配列番号6の塩基配列を有する遺伝子(対象ヒト遺伝子3)、及びこれらの天然変異体からなる群より選択される遺伝子の標的組織内発現量を増加させる化合物を含む。このように本発明の抗精神障害薬は、標的組織内において特定の遺伝子の発現量を増加させる作用を有する。
通常、中枢神経系組織がここでの「標的組織」となる。中枢神経系組織において上記遺伝子の発現量を増加させれば、精神障害に対する直接的な作用を期待できる。
本発明におけるタンパク質が天然材料に由来する場合の「単離された」状態とは通常、当該天然材料の中で当該タンパク質以外の成分を実質的に含まない(特に夾雑タンパク質を実質的に含まない)状態をいう。具体的には、本発明の単離されたタンパク質では夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体の例えば約20%未満、好ましくは約10%未満、更に好ましくは約5%未満、より一層好ましくは約1%未満である。
一方、タンパク質が組換えDNA技術によって生産されたものである場合の「単離された」状態とは通常、使用された宿主細胞に由来する他の成分や培養液等を実質的に含まない状態をいう。具体的には、単離されたタンパク質では夾雑成分の含有量は重量換算で全体の例えば約20%未満、好ましくは約10%未満、更に好ましくは約5%未満、より一層好ましくは約1%未満である。
また、タンパク質が化学合成によって生産されたものである場合の「単離された」状態とは通常、前駆体(原材料)や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない状態をいう。具体的には、単離されたタンパク質では前駆体の含有量は重量換算で全体の例えば約20%未満、好ましくは約10%未満、更に好ましくは約5%未満、より一層好ましくは約1%未満である。
現在広く利用されている無細胞合成系には以下のものがある。即ち、大腸菌S30画分抽出液の系(原核細胞の系)、コムギ胚芽抽出液の系(真核細胞の系)、及びウサギ網状赤血球可溶化物の系(真核細胞の系)である。これらの系はキットとしても市販されており、容易に利用することが可能である。
天然ソース(取得源)からの分離、精製によって目的のタンパク質を調製することもできる。本発明におけるタンパク質のソースとしては例えば、動物細胞(ヒトを含む)、植物細胞、体液(血液、尿等)等が考えられる。
また、本明細書において用語「単離された核酸」とは、もともと天然に存在している核酸(例えばヒト生体内の核酸)の場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態の核酸をいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えばゲノムDNAの場合の「単離された核酸」の好ましい形態では、天然状態において共存する他のDNA成分(天然状態において隣接するDNA配列を含む)を実質的に含まない。
例えばcDNA分子など遺伝子組み換え技術によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない状態の核酸をいう。同様に、化学合成によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、dDNTPなどの前駆体(原材料)や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない状態の核酸をいう。
核酸がベクターや組成物の一部として存在していても又は外来性分子として細胞内に存在していても、人為的操作の結果として存在している限り「単離された核酸」である。
本発明に使用する核酸は好ましい態様として、配列番号4〜6のいずれかの塩基配列を有する。本発明の他の態様では、配列番号4〜6のいずれかの塩基配列から、その5’非翻訳領域又はその一部、及び3’非翻訳領域又はその一部のいずれか一つ以上を欠失したDNA分子(例えばコード領域のみからなる核酸)を使用する。尚、コード領域の翻訳に悪影響を与えないことを条件として、本来の非翻訳領域とは異なる非翻訳領域をコード領域に組み合わせた核酸を使用してもよい。
このように製剤化した本発明の薬剤はその形態に応じて経口投与又は非経口投与(静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射など)によって患者に適用され得る。
本発明の薬剤中における有効成分(化合物)の含量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように例えば約0.001重量%〜約90重量%とする。
本発明は更に、同定に成功した遺伝子の研究用途に関する。この局面の一態様では配列番号1〜6のいずれかの塩基配列を有する単離された核酸、又はその相同核酸を含む精神障害研究用試薬が提供される。本発明の他の態様では配列番号7〜12のいずれかのアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質、又はその相同タンパク質を含む精神障害研究用試薬が提供される。
本発明の試薬は精神障害の発症メカニズムや症状の進展メカニズムなどを研究するための実験ツールとして利用され得る。また、本発明の方法(スクリーング方法、診断用の情報を取得する方法など)を実施するための試薬として、又は本発明の薬剤の構成成分として利用することができる。本発明の試薬を、精神障害のモデル動物としてのキメラマウスやトランスジェニックマウスの作製に利用することもできる。
本発明の試薬において核酸は、例えば、適当なベクター(例えば発現ベクター)に挿入された状態で含有される。即ち本発明は、配列番号7〜12のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸を保持する発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターの具体的一態様では、配列番号1〜6のいずれかの塩基配列を有するDNAが保持される。
相同核酸の更に他の例として、SNPに代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められる核酸を挙げることができる。
本発明の各方法(スクリーニング方法、診断用の情報を取得する方法など)を、キット化した試薬等を用いて実施してもよい。本発明の他の局面はこのような目的に使用されるキットを提供する。例えば、本発明の方法における検出に利用される核酸(プローブやプライマー)、反応用試薬、希釈液、反応容器などをキットに含めることができる。尚、本発明のキットには通常、使用説明書が添付される。
本発明は更に、配列番号7〜12のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質(対象タンパク質)に対して特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。本発明の抗体は精神障害の研究用ツールとして有用である。例えば、本発明の抗体は対象タンパク質の検出、測定、定量などにその利用が図られ、精神障害の作用機序の解明への貢献が期待される。本発明の抗体はまた、精神障害の治療又は診断への応用も期待される。
免疫惹起作用を増強するために、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いてもよい。キャリアタンパク質としてはKLM(Keyhole Light Hemocyanin)、BSA(Bovine Serum Albumin)、OVA(Ovalbumin)などが使用される。キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBS(マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド)法などを使用できる。一方、対象タンパク質(又はその一部)を、GST、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又はヒスチジン(His)タグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。
一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物(例えばマウス)の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。
1-1.薬物依存関連遺伝子の検索
1-1-1.mRNAの抽出
RNeasy mini kit(キアゲン)を使用し、以下の手順でmRNAを調製した。マウス脳を取り出し、組織を30mg以下になるように取り分ける。蛋白変性剤を含む溶出液に脳組織を溶解し、スピンカラムで遠沈する。エタノール沈殿を繰り返し、最終的にはシリカゲルにてmRNAの精製を行う。
1-1-2.cDNAサブトラクション
CLONTECH PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit(クローンテック)を使用し、添付の説明書に従って実施した。
1-2.場所嗜好性実験
1-2-1.動物
実験には、開始時8週齢のc57/black6 雄性マウス(日本SLC、浜松)を使用した。マウスは明暗サイクルが 12時間(点灯A.M8:00)、室温23±1℃、湿度50±5 %の条件下で飼育し、餌(CE2: 日本クレア、東京)および水は共に自由に与えた。なお、本研究計画は名古屋大学医学部動物実験委員会により承認され、名古屋大学医学部動物実験指針およびPrinciples of Laboratory Animal Care (National Institutes of Health Publication 85-23, 1985)に準じた。
実験には塩酸メタンフェタミン(ヒロポン、大日本製薬、大阪)を生理食塩水(saline)に溶解して用いた。
実験には明暗の2つのチャンバーからなり、マウスが2つのチャンバーの行き来できないようにすることのできる仕切りを有する装置(それぞれ縦15 cm, 横15 cm, 高さ15cm) を使用した。それぞれの箱の滞在時間はSCANET(ニューロサイエンス、東京)を用いて、測定した。
条件付け場所嗜好性試験は、Noda らの方法(Noda Y, Miyamoto Y, Mamiya T, Kamei H, Furukawa H, Nabeshima T: Involvement of dopaminergic system in phencyclidine-induced place preference in mice pretreated with phencyclidine repeatedly. J Pharmacol Exp Ther 286: 44-51 (1998))に準じて行った。2日間のPre-conditioning testでは1日15分3日間、マウスを両チャンバー間を自由に行き来させ、装置に馴れさせた後、3日目に各チャンバーそれぞれの滞在時間(pre-value)を計測した。Pre-conditioning testにひき続き、6日間のConditioning testを行った。Conditioning testでは、各チャンバー間に仕切りを入れ、いずれの一方のチャンバーのみにマウスが滞在するようにした。4、6、8日目はメタンフェタミンもしくはモルヒネを皮下投与直後後、嗜好性の低かった(Pre-conditioning testにおいて滞在時間の短かった)チャンバーに、5、7、9日目は、生理食塩水を皮下投与した直後に逆のチャンバーに入れた。Post conditioning testでは再びマウスを両チャンバー自由に行き来させ、各チャンバーの滞在時間、即ち、post-valueを計測した。場所嗜好性は(post-value)-(pre-value)で求めた。なお、Leu-Ileはテスト期間の全日においてマウスをチャンバーに入れる1時間前に腹腔内投与を行った。
結果は全て平均値と標準誤差によって示した。統計解析には一元配置分散分析を行い、有意差が認められた場合、さらにBonferroniの多重比較検定を行った。なお、危険率5%以下で差がある場合を有意な差があるとした。
1-3-1.動物
実験には、開始時8週齢のICR雄性マウス(日本SLC、浜松)を使用した。マウスは明暗サイクルが12時間(点灯A.M8:00)、室温23±1℃、湿度50±5%の条件下で飼育し、餌(CE2: 日本クレア、東京)および水はともに自由に与えた。なお、本研究計画は名古屋大学医学部動物実験委員会により承認され、名古屋大学医学部動物実験指針およびPrinciples of Laboratory Animal Care (National Institutes of Health Publication 85-23, 1985)に準じた。
実験には塩酸メタンフェタミン(ヒロポン、大日本製薬、大阪)を生理食塩水(saline)に溶解して用いた。
実験にはホームケージと同一種類のアクリルケージ(縦28 cm, 横17 cm, 高さ13cm)を用い、床には少量の飼育用チップを置いた。実験開始日から終了日まで、測定時のケージおよび飼育用チップは各マウスごとに同一とした。行動量の測定には、infrared detector(ニューロサイエンス、東京)を用い、AB305 MeasureおよびABTEXT(ニューロサイエンス、東京)によって解析した。
第1〜3日目は、マウスを測定用のケージに2時間入れ、測定環境に馴れさせた。4日目以降は、1日1回、メタンフェタミンの皮下投与を行い、投与直後から2時間の総運動量を測定した。
結果は全て平均値と標準誤差によって示した。統計解析には二元配置反復測定分散分析を行い、有意差が認められた場合、さらにBonferroniの多重比較検定を行った。なお、危険率5%以下で差がある場合を有意な差があるとした。
2-1.モデル動物を用いた新規遺伝子の検索
メタンフェタミンを投与されたマウスは運動量過多を示すが、連日投与を行うと、運動量の増加の程度が増加してくる。これを、薬物依存に伴う精神障害と捕らえることができる(図1)。そこで、メタンフェタミンを10日間連続投与したマウス(C57black6)側坐核からmRNAを取り出し、それらをもとに、cDNAサブトラクション(クローンテック)を行い、コントロールに比べ、メタンフェタミンを投与したマウスにおいてmRNA発現量が20倍以上増加している遺伝子を検索した。その結果、5個の遺伝子が条件を満たした(図2)。この中でCREB3とOdz4を除く3個の遺伝子を以降の実験に用いた。尚、説明の便宜上、各遺伝子をGene1、Gene2、Gene3(Piccolo)と呼ぶ。
Gene1、2及び3をBLASTサーチで検索したところ、それぞれBC034068(GenBank Accession No. NM_001001985 XM_194205、Mus musculus cDNA sequence BC034068 (BC034068), mRNA:配列番号1)、8430437G11Rik(GenBank Accession No. NM_028990、 Mus musculus RIKEN cDNA 8430437G11 gene (8430437G11Rik), mRNA.:配列番号2)、及びPiccolo又はAczonin(GenBank Accession No.NM_011995、Mus musculus piccolo (presynaptic cytomatrix protein) (Pclo), mRNA.:配列番号3)として登録されている遺伝子の部分配列と完全に一致した(図3、図4)。Gene1(BC034068)、2(8430437G11Rik)、及び3(Piccolo又はAczonin)がコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号7、配列番号8、及び配列番号9に示す。尚、Gene1はマウスShatiの名称でGeneBankに登録された(Accession No. DQ174094)。
Gene1、2及び3について、BLASTサーチを用いてヒト相同遺伝子を検索した。その結果、Gene1、2及び3についてそれぞれヒト相同遺伝子(それぞれGene1ヒト相同遺伝子、Gene2ヒト相同遺伝子、及びGene3ヒト相同遺伝子と呼ぶ)が以下の通り見つかった。尚、これらヒト相同遺伝子の中の二つは機能未知の遺伝子であり、残りの一つはPiccolo又はAczoninとして同定されている遺伝子であった。
Gene1ヒト相同遺伝子:Homo sapiens cDNA FLJ3478 fis, clone BRAWH2013219, weakly similar to Homo sapiens N-acetyltransferase Camello 2(CML2) mRNA(Genbank Accession No. AK094797:配列番号4)
Gene2ヒト相同遺伝子:Homo sapiens cDNA FLJ13576 fis, clone PLACE1008715.(Genbank Accession No. AK023638:配列番号5)
Gene3ヒト相同遺伝子:Homo sapiens piccolo (presynaptic cytomatrix protein) (PCLO), mRNA.(Genbank Accession No. NM_033026、XM_168530 :配列番号6)
尚、Gene1ヒト相同遺伝子、Gene2ヒト相同遺伝子、及びGene3ヒト相同遺伝子がコードするアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12に示す。
Gene1〜3について、これらの遺伝子の一部分ずつについて、RT-PCR法を行ったところ、すべてのプライマーの組み合わせについて、コントロール群に比べてメタンフェタミン投与群でmRNAの増加が観察された(図5〜9)。さらに、リアルタイムRT-PCR法で、発現量の増加を検討したところ、メタンフェタミン前頭葉皮質、側坐核および線条体においてそれぞれ発現量が増加していた(図10〜12)。
マウス各組織におけるGene1の発現量をRT-PCRで調べたところ、大脳及び小脳でGene1が高発現していることが明らかとなった(図13)。また、肝臓、腎臓及び脾臓においてもGene1が高発現していた。尚、RT-PCRに使用した3種類のプライマーセット及びPCR条件を以下に示す。
(1)プライマーセット1
フォワードプライマー:cttgcctccccagcccatca(配列番号13)、リバースプライマー:ctgggggccagggttctgct(配列番号14)
反応条件:95℃×5分の反応の後、94℃×30秒、70℃×40秒、及び72℃×1分からなる反応サイクルを35回繰り返し、72℃×5分の反応を行い、4℃で放置
(2)プライマーセット2
フォワードプライマー:gggtggccgggtaggtggaa(配列番号15)、リバースプライマー:ggcagtgcccagcccttcct(配列番号16)
反応条件:95℃×5分の反応の後、94℃×30秒、71℃×40秒、及び72℃×1分からなる反応サイクルを35回繰り返し、72℃×5分の反応を行い、4℃で放置
(3)プライマーセット3
フォワードプライマー:tgtacattcctccctggtggtg(配列番号17)、リバースプライマー:aaatctgagagctgcaagaaaataggg(配列番号18)
反応条件:95℃×5分の反応の後、94℃×30秒、65℃×40秒、及び72℃×1分からなる反応サイクルを35回繰り返し、72℃×5分の反応を行い、4℃で放置
4-1.メタンフェタミン誘発自発運動量亢進におけるGene1アンチセンスオリゴヌクレオチド及びGene2アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
Gene1および2について、それぞれのアンチセンスヌクレオチドを、ミニ浸透圧ポンプを用いてマウスの脳室に持続注入を行い、その動物にメタンフェタミン投与を毎日行い、1、3および5日目の自発運動量を測定した。尚、マウスには5日間メタンフェタミン (1mg/kg, s.c.) を投与した。自発運動量は2時間測定した。右脳室内 (AP -0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV -2.0 mm from the skull) にアンチセンスオリゴヌクレオチド (Gene1-AS又はGene2-AS, 1.8nmol /6μl/ day) 、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド (Gene1-SC又はGene2-SC) 、人工脳脊髄液 (CSF) が浸透圧ポンプによって持続的に注入された。
Gene1についての測定結果を図14に示し、Gene2についての測定結果を図15に示す。結果は平均値±標準誤差で示した (Gene1:n=5-7、Gene2:n=3-5)。Gene1に関しては、繰り返しのある二元配置分散分析において、Gene1アンチセンスオリゴヌクレオチド処理群とコントロール群及びスクランブルコントロールオリゴヌクレオチド群との間に有意な差が認められた(* P<0.05 対 生理食塩水+CSF-処置群。# P<0.05 対 生理食塩水+Gene1-SC-処置群)。
Gene1、Gene2に関して、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて場所嗜好性試験を実施した。マウスには条件付けの間メタンフェタミン(0.3mg/kg, s.c.)あるいは生理食塩水を投与した。右脳室内(AP-0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV -2.0 mm from the skull)にアンチセンスオリゴヌクレオチド(Gene1-AS又はGene2-AS, 1.8nmol /6μl/ day)、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド(Gene1-SC又はGene2-SC)、人工脳脊髄液(CSF)が浸透圧ポンプによって持続的に注入された。
Gene1についての測定結果を図16に示し、Gene2についての測定結果を図17に示す。結果は平均値 ±標準誤差で示した(n=5-12)。Gene1アンチセンスオリゴヌクレオチド処理群とコントロール群及びスクランブルコントロールオリゴヌクレオチド群との間に有意な差が認められた(* P<0.05 対 生理食塩水-処置群。# P<0.05 対 メタンフェタミン+CSF-処置群とメタンフェタミン+Gene1-SC-処置群)。
Gene3(piccolo)について、アンチセンスヌクレオチドをミニ浸透圧ポンプを用いて、脳室に持続注入を行い、その動物にメタンフェタミン投与を毎日行い、1、3および5日目の自発運動量を測定した。マウスには6日間メタンフェタミン(1mg/kg,皮下投与)を連続投与した。最終投与24時間後に断頭し、サンプルとした。個体数は各群5匹とした。
測定結果を図18に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=5)。繰り返しのある二元配置分散分析において、Gene3アンチセンスオリゴヌクレオチド処理群とコントロール群及びセンスオリゴヌクレオチド群との間に有意な差が認められた(*** p<0.0005 対 生理食塩水)。
Gene1のアンチセンスヌクレオチドを、ミニ浸透圧ポンプを用いてマウスの脳室に持続注入を行い、その動物にメタンフェタミン投与を毎日行った。実験開始から3日目にマウスを断頭し、側坐核のGene1発現量をリアルタイムRT-PCR法で測定した。測定結果を図19に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=8)。繰り返しのある二元配置分散分析において、Gene1アンチセンスオリゴヌクレオチド処理群、コントロール群及びスクランブルコントロールオリゴヌクレオチド群の間で有意な差が認められた(* P<0.05 対 生理食塩水+CSF-処置群。#P<0.05 対 生理食塩水+Gene1-SC-処置群。$ P<0.05 対 生理食塩水+Gene1-AC-処置群。 + P<0.05 対 メタンフェタミン+Gene1-SC-処置群)。
5-1. 側坐核でのメタンフェタミン誘発Gene1 mRNAの発現増加におけるドパミンD1受容体拮抗薬R(+)-SCH23390とドパミンD2受容体拮抗薬racloprideの効果
マウスに6日間、1日1回の間隔でメタンフェタミンを(2mg/kg, s.c.)投与するとともに、メタンフェタミン投与の30分前にドパミンD1受容体拮抗薬R(+)-SCH23390 (0.1mg/kg, i.p.)又はドパミンD2受容体拮抗薬raclopride (2mg/kg, i.p.)を投与した。最終投与から2時間後にマウスを断頭し、側坐核のGene1発現量をRT-PCR法で測定した。測定結果を図20に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=6-8)。繰り返しのある二元配置分散分析において、賦形剤投与群、R(+)-SCH23390投与群及びraclopride投与群の間で有意差が認められた(* P<0.05 対 賦形剤/生理食塩水-投与群。# P<0.05 対 賦形剤/メタンフェタミン-投与群)。この結果より、Gene1のmRNA発現量の増加がドパミン受容体を介したシグナルによって制御されていることが示唆された。
マウスに5日間メタンフェタミン(1mg/kg, s.c.)を投与した。この間、右脳室内(AP ?0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV ?2.0 mm from the skull)にGene1アンチセンスオリゴヌクレオチド(Gene1-AS, 1.8nmol /6μl/ day)、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド(Gene1-SC)、人工脳脊髄液(CSF)を浸透圧ポンプによって持続的に注入した。メタンフェタミンの最終投与から2時間後にマウスを断頭し、側坐核のTNF-α mRNA発現量をRT-PCR法で測定した。測定結果を図21に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=8-10)。Gene1アンチセンスオリゴヌクレオチド処理群、コントロール(CSF処置)群、及びスクランブルコントロールオリゴヌクレオチド群の間で有意差が認められた(* P<0.05 対 生理食塩水-投与群。# P<0.05 対 生理食塩水+CSF-処置群と生理食塩水+Gene1-SC-処置群。$ P<0.05 対 メタンフェタミン+Gene1- SC処置群)。この結果より、TNF-αを介してGene1が作用する可能性が示唆された。
マウスに2日間メタンフェタミン(1mg/kg, s.c.)を投与した。この間、右脳室内(AP ?0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV ?2.0 mm from the skull)にGene1アンチセンスオリゴヌクレオチド(Gene1-AS, 1.8nmol /6μl/ day)、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド (Gene1-SC)、又は人工脳脊髄液(CSF)を浸透圧ポンプによって持続的に注入した。3日目にin vivo マイクロダイアリシス法によって側坐核(AP +1.7 mm, ML ?0.8 mm from bregma, DV ?4.0 mm from the skull)における細胞外ドパミン量をメタンフェタミン投与後の220分間測定した。測定結果を図22に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=5-6)。繰り返しのある二元配置分散分析において、Gene1アンチセンスオリゴヌクレオチド処理群、コントロール(CSF)群、及びスクランブルコントロールオリゴヌクレオチド群の間で有意差が認められた(* P<0.05 対 Gene1-SC-処置群)。この結果より、メタンフェタミンによって誘発される細胞外ドパミン量の増加をGene1が抑制していることが示唆された。
マウスに3日間メタンフェタミン(1mg/kg, s.c.)を投与した。この間、右脳室内(AP ?0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV ?2.0 mm from the skull)にGene1アンチセンスオリゴヌクレオチド(Gene1-AS, 1.8nmol /6μl/ day)、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド(Gene1-SC)、人工脳脊髄液(CSF)を浸透圧ポンプによって持続的に注入した。[3H]DAの最終濃度は5nMとした。メタンフェタミンの最終投与から2時間後にマウスを断頭し、中脳シナプトソーム内の[3H]DA量を測定した。測定結果を図23に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=7-8)。生理食塩水+CSF-処置群、生理食塩水+Gene1-SC-処置群、生理食塩水+Gene1-AS-処置群、メタンフェタミン+CSF-処置群、メタンフェタミン+Gene1-SC-処置群、メタンフェタミン+Gene1-AS-処置群のシナプトソーム[3H]DA取り込み量はそれぞれ0.32±0.04、0.29±0.03、0.20±0.02、0.18±0.01、0.20±0.01、0.09±0.01 pmol/4分/mg プロテインである。この結果より、メタンフェタミンによって誘発される、シナプトソームへのドパミン取り込みの低下をGene1が抑制することが示唆された。
マウスに3日間メタンフェタミン(1mg/kg, s.c.)を投与した。この間、右脳室内(AP ?0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV ?2.0 mm from the skull)にGene1アンチセンスオリゴヌクレオチド(Gene1-AS, 1.8nmol /6μl/ day)、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド(Gene1-SC)、人工脳脊髄液(CSF)を浸透圧ポンプによって持続的に注入した。[3H]DAの最終濃度は30nMとした。メタンフェタミンの最終投与から2時間後にマウスを断頭し、中脳シナプトソーム内の[3H]DA量を測定した。測定結果を図24に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=8)。生理食塩水+CSF-処置群、生理食塩水+Gene1-SC-処置群、生理食塩水+Gene1-AS-処置群、メタンフェタミン+CSF-処置群、メタンフェタミン+Gene1-SC-処置群、メタンフェタミン+Gene1-AS-処置群のシナプト小胞[3H]DA取り込み量はそれぞれ3.76±0.25、4.05±0.29、2.80±0.20、1.74±0.21、1.85±0.14、0.90±0.14 pmol/4分/mg プロテインである。この結果より、メタンフェタミンによって誘発される、シナプト小胞へのドパミン取り込みの低下をGene1が抑制することが示唆された。
pcDNA-DEST53(Invitrogen社)を利用してGene1の全長又はフラグメントを挿入した発現ベクターを構築した(図25)。PC12細胞にリポフェクトアミンを用いてGene1全長を発現する発現ベクター、Gene1フラグメントを発現する発現ベクター、又はpcDNA-DESTベクター(空ベクター)をトランスフェクトした。24穴プレートで細胞を2〜3日間培養した後、30分間メタンフェタミン(1.0μM)で前処置した。その後、10μM pagylineと10μM ascorbic acidを添加したKrebs-Ringer HEPESバッファーを用い、細胞内への[3H]DA取り込み量を測定した。[3H]DAの最終濃度は20nMとした。また、細胞を22℃で10分間インキュベートした。結果は平均値±標準誤差で示した(n=9-12)。測定結果を図26に示す。Gene1全長を発現する発現ベクターをトランスフェクトした細胞では、メタンフェタミンによって誘導される、[3H]DA取り込み量の低下が抑制されていることがわかる(* P<0.05 対 pcDNA-DEST53ベクター処置細胞。# P<0.05 対 Gene1全長処置細胞。$ P<0.05 対 Gene1フラグメント処置細胞。+P<0.05 対 メタンフェタミン+pcDNA-DEST53ベクター処置細胞)。
一方、細胞内のGene1 mRNA発現量をRT-PCR法で測定した結果、Gene1全長を発現する発現ベクターをトランスフェクトした細胞ではGene1 mRNA発現量の顕著な増加が確認された(図27)。
以上の結果より、メタンフェタミンによって誘発される、細胞内へのドパミン取り込みの低下をGene1が抑制することが示唆された。
Gene1がコードする部分ペプチド(S-3抗原:CNTAFRGLRQHPRTQLL:配列番号19、又はS-4抗原:CMSVDSRFRGKGIAKALG:配列番号20)を抗原としてウサギに免疫し、2種類のポリクローナル抗体(Gene1抗体S-3、Gene1抗体S-4)を得た。一方、マウスに6日間メタンフェタミン(2mg/kg, s.c.)を投与し、最終投与から24時間後に断頭した。側坐核の標本サンプルを作製し、上記ポリクローナル抗体(Gene1抗体S-3)を用いて免疫染色を行った(図28)。図28に示す染色結果より、Gene1は神経細胞の細胞質に局在することがわかる。尚、Gene1抗体S-4を使用した場合も同様の染色像が得られた(図示せず)。
ニコチン、アルコール、フェンサイクリジンに対するGene1の応答性を調べた。
(1)ニコチン
マウスに12日間ニコチン(0.05-1.0mg/kg, s.c.)を投与した。最終投与から2時間後に断頭し、側坐核内のGene1 mRNA量をRT-PCR法で測定した。測定結果を図29(a)に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=5)。図示の通り、ニコチンの投与とGene1の発現量との間に相関が認められた(* P<0.05 対 生理食塩水-投与群)。
(2)アルコール
マウスに6%エタノール又は水(コントロール)を12日間摂取させた後、断頭した。側坐核内のGene1 mRNA量をRT-PCR法で測定した。測定結果を図29(b)に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=7-8)。図示の通り、エタノールの投与とGene1の発現量との間に有意な相関は認められなかった。
(3)フェンサイクリジン
マウスに14日間フェンサイクリジン(10mg/kg, s.c.)を投与した。最終投与から2時間後に断頭し、前頭葉皮質内のGene1 mRNA量をRT-PCR法で測定した。測定結果を図29(c)に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=8-9)。図示の通り、フェンサイクリジンの投与とGene1の発現量との間に有意な相関は認められなかった。
以下の手順でPiccoloタンパク質の神経細胞における発現状態を調べた。ラット13日齢から取り出した中脳培養細胞を用いて、チロシンハイドロキシラーゼおよびPiccoloを蛍光2重染色した。染色結果を図30、31に示す。この結果より、ドパミン作動性神経及び中脳ドパミン神経の神経前節においてPiccoloタンパク質が発現していることがわかる。
8-1. ヒトドパミントランスポーターを強制発現させたPC12細胞でのドパミン取り込み抑制に対するPiccolo C2Aドメインの作用
Piccoloの特定のドメイン(CA2、PDZ)を発現する発現ベクターを構築した(図示せず)。ヒトドパミントランスポーターを強制発現させたPC12細胞に、この発現ベクターをトランスフェクトした後、1μMのメタンフェタミンを30分間作用させ、細胞内へのドパミン取り込み量を測定した。尚、3Hで標識したドパミンを最終濃度20mMになるように10分間作用させた。測定結果を図32に示す。図示の通り、ヒトドパミントランスポーターを強制発現させたPC12細胞にPiccolo C2Aドメインを発現させると、メタンフェタミンによるドパミン取り込み抑制作用が低下した。
ヒトドパミントランスポーターを過剰発現させたPC12細胞にPiccoloタンパク質のオリゴヌクレオチドアンチセンスまたはセンスを導入した後、3Hで標識したドパミンを最終濃度20nMとなるように10分間作用させ、細胞内の放射能を測定した。測定結果を図33に示す。この結果より、ヒトドパミントランスポーターを過剰発現させたPC12細胞における、メタンフェタミンによるドパミン取り込み抑制をPiccoloが阻止することが示唆された。
(1)メタンフェタミンによるドパミントランスポーターの細胞内移動に対するPiccoloの作用
PC12細胞にヒトドパミントランスポーターを強制発現させ、メタンフェタミンの作用前後におけるヒトドパミントランスポーターについて蛍光免疫染色を行った。メタンフェタミンを作用させるとヒトドパミントランスポーターの細胞内移動が観察された。また、同じ細胞にPiccoloのC2Aドメインも強制発現させたところ、両タンパクの細胞内局在化は同じであった。
以上の結果より、メタンフェタミンによるドパミントランスポーターの細胞内移動をピッコロCA2ドメインは促進することが判明した。
以下の手順でPiccoloタンパク質のドパミン作動性神経細胞における発現状態を調べた。胎児期13日目のラット中脳から取り出したドパミン作動性神経を用いて、Piccoloとドパミントランスポターの2重染色を行った。染色結果を図35に示す。図35からわかるように、ドパミン作動性神経細胞においてドパミントランスポーターとPiccoloは同じ領域に局在する。
以上の(1)(2)の結果より、メタンフェタミンを作用させるとドパミントランスポーターの内在化がおきること(図36(a))、及びドパミントランスポーターとピッコロのC2Aドメインは同じ場所で発現していること(図36(b))が明らかとなった。
以上の実験結果から、同定に成功したGene1〜3はいずれも、薬物依存形成とともに中枢神経系組織内での発現量が増加することが明らかとなった。また、Gene1はドパミンの神経細胞内への取り込みに関与することが明らかとなった。また、Gene1はニコチン応答性であることも判明した。Gene3(Piccolo)についてはドパミントランスポーターの内在化に関与することが判明した。このように、薬物依存に強い関連性を有する遺伝子が同定された。また、Gene1〜3のヒト相同遺伝子も同定された。これらの遺伝子は、薬物依存症の診断又は治療において有用であると期待される。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (6)
- 薬物依存症に有効な化合物のスクリーニング方法であって、
(1)配列番号1の塩基配列を有する遺伝子、及び配列番号4の塩基配列を有する遺伝子からなる群より選択される遺伝子(対象遺伝子)を発現する細胞を用意するステップ、
(2)前記細胞に試験化合物を曝露するステップ、
(3)試験化合物の曝露後の前記細胞における、前記対象遺伝子の発現量を測定するステップ、
(4)試験化合物の曝露による、前記対象遺伝子の発現量変化を求めるステップ、を含むスクリーニング方法。 - 薬物依存症に有効な化合物のスクリーニング方法であって、
(i)非ヒト動物を用意するステップ、
(ii)前記非ヒト動物に試験化合物を投与するステップ、
(iii)試験化合物の投与後、前記非ヒト動物の中枢神経系組織内における、配列番号1の塩基配列を有する遺伝子、及び配列番号4の塩基配列を有する遺伝子からなる群より選択される遺伝子(対象遺伝子)の発現量を測定するステップ、
(iv)試験化合物の投与による、前記対象遺伝子の発現量変化を求めるステップ、
を含むスクリーニング方法。 - 前記非ヒト動物が、薬物依存症のモデル動物である、請求項2に記載のスクリーニング方法。
- 前記対象遺伝子が、配列番号1の塩基配列を有する遺伝子であり、
前記非ヒト動物がマウスである、請求項2又は3に記載のスクリーニング方法。 - a)対象から採取された生体試料を用意するステップ、
b)配列番号4の塩基配列を有する遺伝子の前記生体試料中の発現量を測定するステップ、
を含む、薬物依存症診断用の情報を取得する方法。 - 配列番号1又は4の塩基配列を有する単離された核酸を含む薬物依存症研究用試薬。
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