JPH04506752A

JPH04506752A - チロトロピンレセプター活性を有するポリペプチド、このレセプターとポリペプチドとをコードする核酸、そしてこのようなペプチドの利用

Info

Publication number: JPH04506752A
Application number: JP3501671A
Authority: JP
Inventors: パルメンティエール，マルク; リベール，フレデリック; デュモン，ジャック; ヴァッサール，ギルバート
Original assignee: ベー・エル・アー・ハー・エム・エス・ディアグノスティカ　ゲーエムベーハー
Priority date: 1989-12-14
Filing date: 1990-12-12
Publication date: 1992-11-26
Anticipated expiration: 2015-09-25
Also published as: DK0458940T3; EP0433509B1; AU641209B2; ATE145240T1; WO1991009121A3; ATE143375T1; AU7038691A; EP0458940A1; DE68927461D1; DE68927461T2; ES2091317T3; CA2046917C; ES2092998T3; DE69028695T2; EP0433509A2; EP0433509A3; CA2046917A1; EP0458940B1; US6228597B1; JP3090682B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】チロトロピンレセプター活性を有するポリペプチド、このレセプターとポリペプチドとをコードする核酸、そしてこのようなペプチドの利用本発明は、チ；・クロームレセプター活性を有するポリペプチドと、そのようなレセプターおよびポリペプチドをコードする核酸と、それらのペプチドに対する抗体と、それらのポリペプチドおよび抗体をアッセイ法に利用することに関するものである。

本明細書において、参照文献は、本発明の詳細な説明の終わりの文献目録としてまとめ、また該当文献を括弧内の数字によって本発明の詳細な説明中に示した。

下垂体糖タンパク質（黄体化ホルモン、ｌｈ；ろ胞刺激ホルモン、ＦＳＨ；および甲状腺刺激ホルモンあるいはチロトロピン、ＴＳＨ）は、密接に関係したホルモンのひとつのファミリーを形成する。

下垂体ホルモンチロトロピン（ＴＳＨ）は、甲状腺機能調整を担う中心的な生理活性物質である。このホルモンは、甲状腺細胞の生理機能をこう道させ、増殖させ、また分化を誘導する（１）。そのような効果のほとんどは、サイクリ、りＡＭＰ　（ｃＡＭＰ）を介したものである（１）。他の下垂体および胎盤糖タンパク質ホルモン（ＦＳＨ，ＬＨ，ＣＦＧ）と同様に、ＴＳＨはヘテロダイマーである。これらのホルモンは、すべて同一のアルファサブユニット、ベータサブユニットを持ち、アミノ酸配列は類似しているが、それぞれ特異的である。活性化されたＴＳＨ，ＦＳ）ｌおよびＬＨＣＧレセプターは、Ｇタンパク質Ｇｓを介する機構を経て、それぞれの標的細胞のアデニリックサイクラーゼを刺激する（３）。ヒトでは、自己免疫反応の標的として考えられており、甲状腺機能こう進症においては、自己抗体によってＴＳＨレセプターの過剰刺激がなされ、また特発性粘液水腫においては、自己抗体によってＴＳＨレセプターの刺激低下が起こる（４）。

このような疾患を研究する上で、またレセプターのｍａおよび機能を解明する上で不可欠なものは、レセプター試料が容易に調製可能なものであるかということであり、特に、ヒトの場合においては、経済的コストの問題や試料調製量の問題が生ずる。今までは、このような研究材料として、ブタや牛から単離された膜分画試料や、界面活性剤で可溶化された甲状Ａ１Ｍ分画が使用された（４）。しかし、ヒトの場合、経済的なコストが高いにもかかわらず、単離されたヒトレセプター試料を用いた研究の再現性は低いものであった。さらに、既知の試料調製方法では、精製純度の高いレセプター試料を調製することが困難であった。レセプター材料の濃度を高めても、精製過程にともなう部分的な配列分析に提供されるほどの濃度には達しないという問題もあった。よって、このようなレセプター試料調製方法では、ＴＳＨ結自活性に関して全体的な特性解明にはつながらなかつブこ。

しかし、近年になって関連するＬＨ−ＣＧレセプター遺伝子のクローニングとその発現が達成された。

精製レセプタータンパク質のペプチド配列をもとにしたオリゴヌクレオチドブライマーによるポリメラーゼ鎖反応によって得られたＤＮＡプローブを利用して、。

ラットのＬＨＣＧレセプターのｃＤＮＡが単離された（１５）。また、ブタのＬＨＣＧレセプターの変種は、モノクローン抗体によって単離されたｃ　ＤＮＡプローブによるλｇｔ１１ライブラリーのスクリーニングによってクローン化された（１６）。

ＴＳＨレセプターのクローン化の試みは、すでに知られているすべてのＧタンパク質共役レセプターとの配列類似性を利用した方法によってなされている。トランスメンブランセグメントＩ１１およびＶ＋に対応する一対のオリゴヌクレオチドブライマーを、ポリメラーゼ鎖反応によってプライマー配列の増幅を許す条件下で、甲状腺組織由来のｃＤＮＡに対して用いた。この方法によって、ＴＳＨレセプターがクローニングなされるものではないが、Ｇタンパク質共役レセプターファミリーの新しい４つの仲間がクローニングされた。

ＴＳＨレセプターの精製およびクローニングが困難な理由として、このＴＳＨレセプターの存在量が甲状腺細胞においてさえ、非常に少ないということである。

本発明者らは、まず最初に、文献（６）に記載された方法をプライマーは翼なるものにして、ｃＤＮＡよりはむしろヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして実施し、そして箪二にプローブとしてこの方法によって増幅された選択配列を用いることによって、ＴＳＨレセプターとその変種のクローニングに成功した。

本発明の態様は、箪１図ないし東１２図に示した。これらの図は、アミノ酸配列を表わしており、それぞれのアミノ酸は一字（−文字コード）で略されて記載されている。

Ｍ１図は、クローンＨＧＭＰＯ９の配列をＧタンパク質共役レセプター（文献（６）およびその文献で参照された文献に記載されている）と比較したものである。それぞれのレセプターのトランスメンブランセグメントＩＩＩ付近の配列は一文字フーＶで示されており、またＨＧＭＰＯ９と他のレセプターの５９％以上で保存された残基は屋（★）印で示されている。そして「ドライ」およびｒＡｓＰ１１３」残基（９）は−文字コードの上に上付点（゛）印によって示されている。

箪２ａ図は、イヌＴＳＨレセプタ＝（ｄＴｓＨｒ）の−次構造を示すものであり、イヌＴＳＨレセプターのヌクレオチド配列から推測されるものである。このアミノ酸配列をラットおよびブタのＬＨ−ＣＧ全配列ともに並べて図示されており、またＨＧＭＰＯ９の配列の一部とも並べて図示されている（１５．１６．１７）。数字は、ボンハイネアルゴリズム（ｖａｎ　１ｉａｌｈｎｅ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、成熟ポリペプチドの最初の残基から付けられている（１１）。ＴＳＨレセプターおよびＬＨ−ＣＧレセプターでの同一残基と保守的置換は、それぞれ星（★）印と点（、）印によって示されている。Ｎ−グリコリル化の部位は下線で示した。推定される（ｐｕｔａｔｉｖｅ）　トランスメンブランセグメントは上線で示した。ラムダブ１−ジをふくむｄＴＳＨｒ挿入配列をＭ２Ｓにづプクローノ化し、強制的クローニングおよびエクソヌクレアーゼＩｌｌ欠失を組み合わせて利用することによって、両路の配列をンークエンス（アプライドバイオ／ステムズモデル３７ＱＡ）した（２１）。

第２ｂ図は、複数のＧ−タンパク質共役レセプターの配列から構築されたプントグラムを示すものである。クラスタルアルゴリズム（ＣＬＵＳＴＡＬ　ａｌｇｏｒＨｈｍ）（１７）を２２のレセプターの配列（６）からプントグラムを構成することに用いた。この際、対照としてラットおよびブタのＬＨ−ＣＧレセプター（＋６．１７）　、ＨＧＭＰＯ９およびＴＳＨレセプターが含まれる。また、それぞれのレセプターに対して、ＨＧＭＰＯ９の既知の配列に該当するセグメント（１３１残基、トランスメンブランセグメントＩＩから■へ延びる）をプログラムのＮ照として利用した。

１３ａｉは、ＴＳＨレセプターのｍＲＮＡをマイクロイノノエクンーンすることによって誘導されたＹ１細胞のＴＳＨ＃Ｒ導形態変化を示すものである。Ｙｌ細胞は、文献（１３）にしたがって組換えＴＳＨレセプターｍ　ＲＮ　Ａ　（０，２ＳＨｇ／ａｌ濃度を０．１ｐｌ）　（右側）または水（左側）をマイクロイノノエクシッンし、対照培養液（上側の写真）またはＴ　Ｓ　Ｈ（０，１ｎＭ）含有培養液（下側の写真）でインキュベーン讐ンした。なお、ＲＯ２０１７２４およびイソブチルメチルキサンチン（それぞれとも、濃度は１０−’１１）はすべての培養液に添加しである。

第３ｂ図は、ＴＳＨレセプターのｍＲＮＡをマイクロインジェクン四ンすることによって誘導されたアフリカッメガエル卵母細胞におけるＴＳＨＩＩＩ導ｃ　ＡＭＰ集積を示すものである。アフリカンメガエルの卵母細胞は、文献（２２）にしたがって調製された。そして、それぞれの細胞に水（白色のンンボル）または組換えＴＳＨレセプターｍＲＮＡ　（１３）　（０，１μｇ／μ１２１度を５０％Ｍ）　（黒色のンンボル）を注射した。対照培養液に３日間静置させた後、３５個の卵母細胞からなるバッチを種々の濃度からなるＴＳＨ（マル印）、Ｌｆ（（ｒ！！１角印）またはＦＳＨ（三角形印）を加えた培養液で９０分間インキュベートした。ｃＡＭＰの濃度は文献（１４）にもとづいて測定した。

なお、ＲＯ２Ｑ１７２４およびインブチルメチル本サンチン（それぞれとも、濃度は１０−’Ｍ）はすべての培養液に添加しである。１０−’Ｍのフォルスコリンでインキュページ璽ンした対照群の卵母細胞では、ｃＡＭＰ濃度が倍加していた（図示せず）。

第４図は、ｃｏｓ７細胞で現われた′２’Ｉ−ＴＳＨレセプターの置換を示すものである。Ｃｏ５７細胞は、ｐＳＶＬで号ブクローン化されたＴＳＨレセプターｃＤｈＴＡによってトランスフェクシ璽ンされたものである（２３）。７２時間後、細胞を集めて、膜分画を調製した（２４）。初期培養において野生型ｃｏｓ７ｍ胞およびイヌ甲状腺細胞でも同様にして膜分画をＨ製したく２０）。１２Ｊ　７ＳＨ（ＴＲＡＫヘニング）の結合は、種々の濃度からなる結合拮抗阻害剤（ＴＳＨアルモール（＾ｒｍｏｕｒ）　、Ｌ　）（およびＦＳＨ，ｔＪｃＢバイオプロダクト）０℃、１２０分間で実施された。結合放射活性は、遠心分離によって分離された後、測定された。

第５図は、イヌのＴＳＨレセプターをコー・ドするｃＤＮＡ配列を示すもので、これは卵母細胞および培養細胞で遺伝子発現された。

第６図は、７つの推定されるトランスメンプランセグメントと、大きなＮＨ２末端細胞外ドメインからなる（シグナルベブチドを除外）。アミノ酸欠失変異部分は、黒く塗り潰しである。また、５つの推定されるグリコ化部化部位も示されている。

第７図は、チロトロピルレセプターのアミノ酸配列の細胞外ドメインを構成する繰り返し部分の配列を示すものである。ボンハイネアルゴリズムによって決定されるシグナルペプチドはイタリックで示されている。レセプターの分子変異に繰り返しの欠失は、左方間に同いた矢印で示されている。

第８図は、ｃＤＮＡから推論されるヒトＴＳＨレセプターの一次構造を示すものである。このアミノ酸配列は、ラムダ１１クローンの２つの重なり合う挿入部位の配列から決定される２２９２ヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームに一致する（実施例を見よ）。このヒトＴＳＨレセプターの配列は、イヌのＴＳＨレセプターの配列（アミノ酸の異なる部分だけ示した）とともに比較のために掲載した。番号付けは、ボ／ハイネアルゴズムによって決定される成熟ポリ（ブチドの第一残基から開始した（Ｉｆ）ａ強力なＮ−グリコジル化部位を下線で示した。また、推定されるトランスメンブランセグメントを上線で示した。

第９図は、ｃｏｓ−７細胞で発現されるヒトＴＳＨレセプターから１＋！５１− ７ＳＨがアイ゛／−ブラベルされていないＴＳＨによって置換されることを示している図である。結果は、非特異的結合（１，ＯＯｎＭの未標１１ＴｓＨ１２４０ｃｐｍ）で訂正した後に、競合４−るもの（１４００ｃｐ＋＋）が存在Ｌ５ない状態で、トランスフエフ７・ヨ／された細胞に結合した′２ｓ（７ＳＨのｔｔパーセント・で示した。

第１０図は、ｃｏｓ−７細胞で発現されるヒトＴＳＨレセプターから１２’！　 ■、−ＴＳＨが免疫グロブリンによって置換されることを示している図である。

結果は、第９図と同様にして示した。免疫グロブリン１寸、正常個体（Ｎ　）　、　１ｄｉｏｐｊｔｈｉｃ町ｙｘｏｅｄｅｍａ、’！！者（１Ｍ＋、、１Ｍ２）またはグレーブヴス病患者（Ｇｌ）１．ＧＤ２）から調製した〈実施例を見よ）。アッセイでの免疫グロブリンの濃度を示した。Ｉ　Ｍ　ｌ　ｉｒよびＪＭ２（１，５１／１）が、ヒト甲状腺細胞アブセイでＴ　Ｓ　Ｈｔｕｔ激によるｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ産生を阻害する能力は、それぞれ１００％および８５％である。ＧＤＩおよびＧＤ２　（１，５ｍｇ／ｍｌ）の甲状腺刺激活性は、それぞれとも１０ｍＵ／ｍｌのＴ　Ｓ　Ｈの場合に等しかった。

第１１図は、本発明にもとづ＜　Ｔ　Ｓ　Ｉ−ルセプターの一次構造を示すものである。

いずれかひとつの部位にある複数の文字は、その部位での与えられたアミノ酸残基のうちのひとつの存在を示すものである。

第１２図は、クローン化されたヒトＴＳＨレセプターのｃＤＮＡ配列を示すものである。

本発明は、チロトロピンレセプター活性を有するポリペプチドに関するものでる。このポリペプチドは、第１１図に示されたアミノ酸配列あるいはその断片、第１１図に示されたアミノ酸残基のいずれかＣごおいて欠失または置換が生じたアミノ酸配列、または新たなアミノ酸配列の挿入が生じたアミノ酸配列を含むことを特徴とするものである。この新たなアミノ酸配列の挿入が生じたアミノ酸配列の例は、第１１５Ｕの配列と８０％の相同性を有する配列である。本発明のぎりペプチドは、実質的に純粋な形状からなるもので、好ましくは非甲状腺的環境（ｎ。

ｎ−ｔｈｙｒｏｉｄ　ｅｎｖｉｒｏｎｓｅ＋＋Ｌ）にある。ここで、「実質的に純粋な形状」の意味は界面活性剤によって可溶化された甲状１膜分画ｊこ結合した「不純物な状態ではないｊことを意味している。

ｒ　Ｔ　Ｓ　Ｈレセプター活性」は、ＴＳＨ結合特性または抗ＴＳＨレセプター抗体結合特性またはＴＳＨあるいはＴ　Ｓ　Ｈレセプタ・−抗体にさらされた場合に６タンパク質を介して抗アデニリルンクラーゼまたはホスファリパーゼＣを活性化させる能力を意味している。これらの特性は、ポリペプチドを例えば標１１ＴｓＨまた１；Ｌ４１１！ｔＴｓＨレセプター抗体と接触させるこ七によって、あるいはそのポリペプチドを含む膜分画のアデニリルンクラーゼ活性を調べることによって、確証される。本発明のポリペプチドは、本発明者らによって同定されたＴ　Ｓ　Ｈ＋、、セプター全体、および断片またはこのポリペプチドの変異体を含むものである。Ｔ　Ｓ　Ｈレセプター全体は、ひとつのペプチド（２０残Ｍ）から構成され、そのペプチドには細胞外トメイア（３９８残基）がつながっている。この細胞外ドメイ／はＮ−グリコリル化のための５つの部位を有するもので、ト・ランスメンブラ／セグメントを含む３４６残基からなるＣ０ＯＨトメイノに結合している。このレセプターのアミノ酸配列は第１１図に示した。

さらに、本発明は以下の一般式で表わされるアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチドに関するものである。

一般式＝　５−コー−ｇｙＵアー　ｒｚｌｐ式中、ｎ＝ｏまたはＩ、ｍ−０または１．’ｐ−０または１で、かつこれらはｎ　＋　ｍ　＋　ｐ　＞　０の関係にある。

また、ｘ、ｙ、ｚは以下のように定義される（ひとつのアミノ酸を一文字で表わしており、またいずれかひとつの部位にある複数の文字は、その部位での与えられたアミノ酸残基のうちのひとつの存在を示すものである）。

ｘ＝　ＭＲＰＡＤＬＬＱＬＶＬＬＬＤＬＰＲＤＬ。

ｙ＝免疫学的な特性を現わすのに必要な以下の配列からなる連続的なアミノ酸の少なくとも最小な数。

ＧＣＭＧＣ５ＳＰＰＣＥＣＨＱＥＥＤＦＲＶＴＣＫＤＩＱＲＩＰＳＩＪＰＳＴＱＴＬＸＬ１にＰ　Ｄ　ＨＴ　ＦＡＬＸ、ＥＬＪＬＬＸＦＬＣＩＴ”ＮＴＣＬＩＣＭＦＰｏＬＴＫＶＹＳＴＤＩＦＦＩＬＥＩＴＤＮＰＹＭＴＳＩＴ’ＶＮＡＦＱＧＬＣＮＥＴk ｃｖｖｖ　ＡＡＤＥＩＴＣＦｌｌ；ＱＥＬＫＮＰＱＥＥＴＬＱＡＦＤＳ）（ＹＤＹｒＩＣＣＤＳＥＤＭＶＣ丁Ｐに５ＤＥＦ’ＮＰＣＥＤＬ　Ｖ　ＣＮ式中、アミノ酸配列　！−１１−１１．−１１１−１１１．−ＩＶ−Ｖ−ｖＩＩ −Ｖｌ＋、　ハ、独立的に存在マたは不存在であり、また以下の意味を有する。

！　−ＩＭＧＹＫＦＬＲ工Ｗ訃■」Ｌ工間バＬＬ工ＬＬＴＳＨＹＫＩＩ−ＬＮＶＰＲＦＬＭＣＮＬＡＦＡＤＦＣＭＧＭＹＬＬＬＩＡＳＶＤＬＹＴＨ５ＥＹＹＮｌｔＡＴ　工　工　ＩＨＫ　Ｑ　ＨＹまたは、この配列の少な（とも１２の連続するアミノ酸残基。

１１、−　より賢ＱＴＧＰＧＣ１ｌ− ＮＴＡＧＦＦＴＶＦＡＳＥＬＳＶＹＴＬＴＶＩＴＬＡまたは、この配列の少な（とも２２の連続するアミノ酸残基。

＋　１１１−　ＥＲＷＹＡ工ＴＦＡＩ伝ＬＤＨＴ　ＨＱまたは、この配列の少なくとも２の連続するアミノ酸残基。

ＩＶｘ　ＲＫ工ＲＬＲＨＡＣＡ工ＭＶＧＧＷＶＣＣＦＬＬＡＬＬＰＬＶ（ｄｓｓＹＡＫＶｓＩｃＬＣＶＱ　ＹＳＶ　Ｍ工ＦＡＡＡＦ工ＦＭまたは、この配列の少なくとも１２の連続するアミノ酸残基。

Ｖ　−ＰＭＤＴＥＴＰＬＡＬＡＹＩＶＦＶＬＴＬＮＩＶＡＦＶＩＶＣＣＣＹＶＸＩＹＩＴＶＲＮより５ＳＱＬＶ工ＬＬＶＬＩＳＶ　１−　ＰＱＹＮＰＧＤＫＤＴＫＩＡ）ＣＲＭＡＶＬ工ＦＴＤＦＩＣＭＡＰＩＳＦＹＡＬＳＡｒＬＮＫＰＬ工ＴＭ　ＬＭまたは、この配列の少なくとも１２の連続するアミノ酸残基。

Ｖ　Ｉ　Ｉ　”　ＶＳＮＳＫＩＬＬＶＬＦＹＰＬＮＳＣＡＮＰＦＬＹＡＩＦＴＫＡＦＱＲＤＨＬＴＰＩＧ＜ＱＧＱＩＳＥＥＹＭＱＴＶＬＮ　ＫＮ上記に特定されたアミノ酸のどれでも、置換または欠失が可能であることが理解される。また、上記配列の外側に記載されたアミノ酸残基は挿入可能であり、チロトロピンレセプター活性は保持される。

上記一般式の［ｘ］ＩＩによって示される配列は、ＴＳＨレセプターのシグナル配列に一致する。ポリペプチドのこの部分は、細胞内におけるその産生の後、隣接するＣｙ］および（または）［２］断岸の細胞膜への移動を確実にする。明らかに、シグナル配列は、膜への移動が必要でない場合は、そのポリペプチド中に存在する必要はないが（例えばそのポリペプチドをフードするｍＲＮＡのイノビトロ翻訳において）、またはある宿主細胞内で組換え体レセプターの産生を促すための他のシグナル配列によって置き換えられる。

上記式中の［２］、によって示される配列は、７つの推定されるトランスメンプランセグメントＩＪＩ＋を含むポリペプチド全体のＣ０ＯＨドメインに一致する。

これは、他のＧタンパク質の該当する領域と相同である。本発明のポリペプチドは、上記したように、トランスメンブランドメインの一部分またはその全部を欠如した基本的なＴＳＨレセプター配列の変異も含まれる。このような変異体は、自然的に存在するもので、二者択一的なスプライシング現象によって起こるであろう。他のものとの、すなわち既知のＧタンパク質共役レセプターとの相同性によって、７つの推定されるトランスメツブランセグメントは第＋１図（Ｉからｎｌまで）に示されるようにどうにか同定された。本発明の変異ポリペプチドは、すでに定義されたような■からｖ！、までのフラグメントすべてか、あるいはその一部分を欠失している。これらのフラグメントは第６図に示したように、細胞外および細胞内に延びるループを形成するものとして定義される。したがって、ひとつあるいは複数のトランスメンプランセグメントは、例えば第１１図に示したようなセグメン！ないしＶｌｌから選択されるひとつのセグメントあるいはこれらのセグメントのうちのひとつの一部分、あだは隣接する細胞内およびくまたは）細胞外ループに連結されたひとつのトランスメンプランセグメントを欠失したものとなる。

本発明はまた、他のレセプターのトランスメンプツトメインまたはその一部分によってすべてのトランスメンプラノトメイノまたはその一部分を置換することによって雑種（ハイブリッド）レセプターを作ることも含まれる。このようなレセプターは、特にＴＳＨレセプターの膜を横切る部分（トランスメンプラン部分）とは相客れないか、もしくはその部分とは興なる特性を有し、かつ細胞膜にアンカーされる必要のあるＴＳＨレセプターの細胞外部分において用いられる可能性がある。また、どのアミノ酸配列も適当なアンカーとしての特性を示すようなハイブリッドレセプター内のトランスメンブランドメインとして使用する可能性もある。そのようなアミノ酸配列は合成されたものか、あるいはどのようなトランスフ／プランタ／バク質でもかまわないだろう。

ここで特記すべきことは、本発明にはチロトロピンレセプターを持つポリペプチドも含まれ、このポリペプチドはトランスメンブランドメイン全体を欠如したものである。この場合、このポリペプチドは野生型レセプターの細胞外ドメインと一致する。このレセプターの細胞外の部分は、明らかにリガンドの結合に関与するものであり、一般式の［ｙｌによって同定される。トランスメンブランドメイン全体を欠失したポリペプチドは、一般式［ｙｌ、によって表わされる。式中、ｍ−１あり、配列の［Ｚ］部分は欠如している。このレセプターの細胞外部分［ｙｌは、箪７図によって示される不完全な繰り返し配列によって特定される。

本発明のポリペプチドは、このような繰り返し配列のひとつまたは複数のもののなかに変異が生じたものが含まれる。しかし、モノクローンまたは多りロンーンからなる抗体を産生させるのに十分なアミノ酸が存在するかどうかが重要である。

そのような免疫源的なアミノ酸配列は、例えば５．６．７．８または９個の連続するのアミノ酸からなる上記”ｙ”配列を含むであろう。本発明のフラグメントの免疫源的な姿は、実験動物にフラグメントを注射して、産生された抗体間の反応性を調べることによって行なった。

特に、本発明は第二の繰り返し部分（第７図中、矢印で示した部分）が欠失したポリペプチドを含むものである。

また、本発明は、対応する相補的配列と同様に、本発明のポリペプチドをフードする核酸配列に関係する。そのような配列の例は、第５図および第１２図に示されているものと、対応する変性配列と同様に、それらの配列の断片である。本発明によって示される複数の核酸フラグメントは、通常少なくとも８個のヌクレオチドからなる核酸フラグメントと、好ましくは少なくとも１２個またｊｆ好ましくは少なくとも１６１１１のヌクレオチドからなる核酸フラグメントからなる。

そのようなフラグメントは、またはそれらの相補的配列は、例えばチロトロピンレセプター活性を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡの産生のような、ポリメラーゼ鎖反応を用いたＤＮＡ断片増幅のためのプライマーとして利用できよう。

完全なＴＳＨレセプターをコードする本発明の核酸配列は、甲状腺細胞に自然に見られる環境よりも遺伝的な環境下にある。例えば、Ｃｏ５−７細胞、ＣＨＯ細胞またはＹｌ細胞の遺伝的環境である。

本発明のポリペプチドは、いくつかの異なった方法で産生される。例えば、ＣＯ３−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、アフリカッメガエル卵母細胞またはＹｌ細胞のような宿主細胞は、プロモーター配列、転写終了シグナル配列などのすべての調整要素と組み合わせられて、目的ポリペプチドをフードする核酸が挿入されたベクターによって、あるいはレセプターをコードする配列を含む適当なベクターから得られた転写産物である組換えｍＲＮＡを注射することによって形質転換される。挿入配列の遺伝子発現は、通常、宿主として用いられた細胞の膜内に組換えポリペプチドの挿入につながる。この方法では、レセプターポリペプチドはこの形状で用いられ、したがってこのレセプターは非甲状腺真核細胞環境内に置かれるか、可溶化された膜断片形状として存在することになる。組換え体を発現する非甲状腺細胞は、甲状Ｈｍ胞で見られたよりも１０倍高いレセプターｒｉを示した。

さらに、ポリペプチドの一断片のみがめられる場合、対応する短かめの核酸配列、例えば推定される細胞外領域のみ、またはこの領域の繰り返し部分の一つまたは複数の繰り返しをコードするＤＮＡが適当な宿主細胞を形質転換させるのに用いられる。また、本発明ではめられるアミノ酸配列の連続的連結による化学的なポリペプチド合成も含まれる。大きなフラグメントが要求される場合、始めに一連の短いフラグメントを合成し、それらを最終的に連結することによって大きなフラグメントにすることが可能である。

また、本発明はテロトロピルレセプターポリペプチドに対して産生されるモノクローン抗体および多クローン抗体に関するものである。本発明の抗体（よ、好ましくは精製されたもので、うさぎまたはマウスのような動物由来のものである。

すでに述べたように、ヒトでは、Ｔ　Ｓ　Ｈレセプターは自己免疫反応の標的とされ、甲状腺機能こう進症においては、自己抗体によってＴＳＨレセプターの過剰刺激がなされ、また特発性粘液水腫においては、自己抗体によってＴ　Ｓ　Ｈレセプターの刺激低下が起こる。本発明のポリペプチド、特に推定される細胞外ドメインの抗原性は、いろいろな研究やアアセイに用いることが可能な抗体の産生を可能とする。ＴＳＨレセプターはＴ　Ｓ　Ｈおよび抗ＴＳＨレセプター抗体に結合することから、抗ＴＳＨレセプター抗体によってＴＳＨを置換するようなある橿の研究に用いることが可能である。標識されたものと、非標議のものとの拮抗現象は、そようなアーメセイに好適に用いられる。ＴＳＨレセプターの特定フラグメントを用いることによって、特定のエピトープに対する抗体のｉＩ製が可能となり、またそのような抗体を用いて自己免疫反応を呈する萄者の診断が可能となる。

そのようなアッセイのひとつで本発明にもとづ（ものは、生物学的試料に含まれるチロトロピン（ＴＳＨ）または抗チロトロピンレセプター抗体（抗ＴＳＨレセプター）の定量的分析方法である。この方法では、本発明にもとづくポリペプチドはＴＳＨまたは抗ＴＳＨレセプター抗体を含むと思われる生物学的試料と接触させられると同時に、あるいは連続して、標識ＴＳＨまたは樟識抗ＴＳＨレセプター抗体と接触させられる。そして、標識されたものと、未標識のものとの拮抗の後に、標識ＴＳＨまたは標識樟識抗ＴＳＨレセプター抗体の結合量を測定する。

この種のアブセイは、生物学的試料に存在する未標識のＴＳＨまたは抗ＴＳＨレセプター抗体と、標識ＴＳＨまたは標識探識抗ＴＳＨレセプター抗体との間の拮抗関係を、その試料に含まれるそれらのものの量を示すものとして測定する。

また、別の方法として、ＴＳＨ測定するために二種類のものの間の拮抗関係を利用する変わりに、レセプターポリペプチドを用いることも可能で、このレセプターポリペプチドとと生物学的液体中のＴＳＨとを結合させて、つづいて洗′ｆｐ後、結合ＴＳＨを選択的に検出するＩｎ抗ＴＳＨレセプター抗体を添加する。このようなタイプのアブセイもまた、固定化された、あるいは可溶化されたレセプターポリペプチドを生物学的試料に含まれる抗ＴＳＨレセプター抗体との結合に用いられ、１１ｍ抗免疫グロブリンまたはプロティンＡまたはプロティンＧまたは抗体を検知可能な他の薬剤によって結合抗体を検出するものである。

試料中のＴＳＨまたは抗ＴＳＨレセプター抗体をアッセイするための他の手段は、レセプターを持つ細胞に備わっているアデニリル７クラーゼ活性にもとづいたＴＳＨレセプターへの結合効果を利用するものである。よって、本発明はＴＳＨまたは按Ｔ　ＳＨレセプター抗体の定量的検出方法に関するものである。この方法は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列によって形質転換された細胞またはそのような細胞から調製された膜分画と、ＴＳＨまたは抗ＴＳＨレセプター抗体を含むと考えられる生物学的試料とを接触させ、それらの細胞または膜分画での、アデニリルシクラーゼ活性を、例えばｃＡＭＰ度生または放出を測定することによって、測定するものである。

ＴＳＨ自体による、または刺激された抗ＴＳＨレセプター抗体によるレセプターポリペプチドへのＴＳＨの結合は、アデニリルシクラーゼ活性を増加させるが、阻害された抗ＴＳＨレセプター抗体はＴＳＨ誘導アデニリルシクラーゼ刺激の阻害につながる。ＴＳＨにレセプターポリペプチドをさらすことによって誘導されたアデニリルシクラーゼ活性と、試料中の抗体によって誘導されたアデニリルシクラーゼ活性とを比較すると、本発明にもとづけば、刺激抗体（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）から阻害抗体（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）を見分けることは可能テアル。試料中に含まれる阻害抗体の定量を行なうには、試料をレセブターポリペプチドベブチドと、ＴＳＨと同時に、あるいはＴＳＨとの接触前に、接触させる。この方法では、レセプターに対するＴＳＨのアデニリルシクラーゼ刺激効果は、阻害抗体によって阻害され、また試料中に含まれる阻害抗体の濃度を示すために定量される。そのような測定は、本発明のＴＳＨレセプターを持つ細胞またはそのような細胞の膜分画に対してなされる。この種の検知に用いられる効果測定系は、例えばフォスホリパーゼＣ１プロティンチロシン牛ナーゼ、フォスホリパーゼＡ２などの活性がある。

本発明のアッセイに用いられる標識は、すでによく知られているものであり、例えば放射性標識、酵素標本、標識抗免疫グロブリン、プロティンＡ１プロテインＧなどでγノセイの種類に依存して決められる。

本発明はさらに、生物学的液体中のＴＳＨレセプターの７ラグメントを定量する方法に関するものである。そのようなフラグメントは、甲状腺機能異常の患者の体内において検出されるものである。本発明にもとづく方法では、試料を事前に標識された本発明にもとづく抗体と接触させることが含まれるもので、もし必要ならば、本発明にもとづくポリペプチドと前記フラグメントとの間の拮抗によって、あるいは結合標識抗体を非結合標識抗体から分離する方法によって結合測定を行なうことも含まれる。後者の場合、レセプターポリペプチドを、例えば１５Ｉで標識する必要がある。

本発明の抗体は、ＴＳＨレセプターの免疫組織化学的検出に用いることが可能である。例えば内分泌学的研究や病理解剖学的研究において利用可能である。このようなプロセスでは、抗体は検出可能なものとなるために再度標識される。

本発明のポリペプチドは、ポリペプチドをＴＳＨレセプターまたは抗ＴＳＨレセプター抗体源と接触させ、結合したものと結合に明日１からなかったものとを分離し、そして最後にレセプター結合物を分離することによってなされる、ＴＳＨレセプターまたは抗ＴＳＨレセプター抗体に対する刺激抗体または阻害抗体の精製にも用いられよう。もし必要ならば、さらに精製を行なう。そような精製過程は、レセプターポリペプチドを例えばカラムや他の固体支持体で固定化することによりて促進される。

本発明は、ＴＳＨまたは抗ＴＳＨレセプター抗体の検出に好適なキットを提供するものである。このようなキットは、以下のものを含むことによって特徴づけられる。

（ａ）上記したようにチロシンレセプター活性を有し、かつ固定化または可溶化された形状にある本発明にもとづ（ポリペプチド；（Ｆ））以下に示す少なくともひとつの試薬：ｌ）標識ＴＳＨ目）！ａ識抗ＴＳＨレセプター抗体、そして１ｉｉ）アデニリルシクラーゼ活性の測定に必要な試薬。

例えば、［１ｊＩＬＴ　Ｓ　ＨまたはＴ　Ｓ　Ｈｔｊｌ識可能な試薬と組み合わされた未標ｗＬＴｓＨとともに、固定化または可溶化された形状にある本発明のポリペプチドを含む拮抗によってＴＳＨレセプターに対する自己抗体の検出のためのキットである。

または、そのようなキットはＴＳＨレセプターに対する抗体と、ＴＳＨのかわりにそれを標識する手段とを含むものである。

以下、本発明を実施例により明らかにする。

実施例１、イヌＴＳＨレセプターのクローニング（ａ）ＨＧＭＰＯ９の同定はとんどのＧタンパク質共役レセプター遺伝子がそれらがコードされている配列にイントロンを含んでいないので、文献（６）記載と同一の戦略を用いることにした。しかし、変性プライマーの異なるセットと、原料としてとトゲツムＤＮＡとともに用いた。Ｇ−タンパク質共役レセプター（７）と同一性を有する配列を示す７つのクローンが得られた。この他に、トランスメンプランセグメント！■ およびＶｌ＋に対応するプライマーによって増幅されたひとつのクローン（ＨＧＭＰ０９）は、レセプターの別個のサブファミリーに属することを示唆するような配列特性を示した。

この増幅に用いられるプライマーは、およびであり、いずれのひとつの部位の複数のヌクレオチドはその部位において与えられたヌクレオチドのひとつの存在を示している。

第１図に示された配列から構成されたデンドログラムが示すことは、最近までクローン化されたすべてのレセプター（７）から等距離にある；特に、トランスメンプランセグメント＋＋＋（＠ｌに近接した正統の（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）　Ａ　ｓ　ｐ　Ａ　ｒ　ｇＴｙｒ　（ドライ）トリペプチドを含まず、また荷電したアミンの結合に関係したアスパラギン（Ａ　ｓ　ｐ）残基が欠けたレセプターは、アドレナリン（ＡｓｐＨ３）、ムスカリン、ドーパミン、そしてセロトニンレセプター（９）である。

（ｂ）イヌＴＳＨレセプターの同定甲状腺組織での新しいレセプターの発現をスクリーニングする方法において、ＨＧＭＰＯ９を甲状腺組織と甲状腺以外の組織とを用いたノーインプロット実験のプローブとして、またイヌ甲状ＩＩ９　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーのプローブとして用いた。ＨＧＭＰＯ９は、甲状腺由来ｍＲＮＡとバイブリフトしなかったが、卵巣および精巣において２．６ｋｌ）からなるメジャーな転写度を同定した。しかし、適当な条件下において、それは５０．０００の甲状Ｉｌｌ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのひとつと雑種形成（ハイブリダイズ）した。このことは、甲状腺の相対的に豊富な推定されるレセプターとクロスーハイブリダイゼーシ膠ンすることを示唆している。このような特性から、ＨＧＭＰＯ９は、ＴＳＨレセプターとは別個の、しかしＬＨまたはＦＳＨレセプターのような類似のレセプターから期待される配列特性を持つレセプターフラグメントをコードすると考えることが可能である。全長にわたってクロス−ハイブリダイズしたクローン（ｄＴｓＨｒ）を単離して、１０種類のイヌ組織のノーインプロットのプローブとした。このプローブは甲状腺およびその組織培養細胞のみに現われる４、９ｋｂの転写産物とハイブリダイズした。面白いことに、シグナルは甲状腺組織よりもｃＡＭＰアゴニストであるフォルスコリンに数日さらされた培養甲状腺細胞のほうが強かった。このことは、培養細胞においてＴＳＨレセプターがｃＡＭＰアゴニストによって過剰調整されるという知見（ｌＯ）から期待されるひとつの特性である。４，４１７ｂｐ＜塩基対）からな４ｃＤＮＡクローンの全配列を決定した。この配列は、ボンハイネアルゴリズム（１１）（第２ａ図）から予測される、２０残基からなるシグナルペプチドから始まる７６４のアミノ酸かなるオーブンリーディングフレームを含む。すでに知られているＧタンパク質共役レセプター（以下の記載と第２ｂ図を見よ）との比較と、ハイドＯ／４　シイブロアｙイル分析（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ａｎａｌｙｓｉｇ）　（示さず）とがテしたこ七け、大きな−Ｐｉ久Ｆメインを構成する３９８個のアミノ酸によって先行された７つのトランスメンブランドメインを持つ３４６残基からなるＣ−末端構造である。

（Ｃ）イヌＴＳＨレセプターの発現コードされたポリペプチドは、種々の系でのｃＤＮＡの発現によるＴＳＨレセプターとして同定された。副腎皮質Ｙ１１Ｈ胞およびアフリカッメガエルの卵母細胞への組換えｍＲＮＡのマイクロインジェクシ１ンによって、これらの細胞に対してＴＳＨに感応な表現型が与えられた。Ｙｌ細胞の場合、ＴＳＨに対して特徴的な形態変化によって応答した。この形態変化は、細胞質におけるｃＡＭＰ濃度の上昇によって引き起こされた（１２．１３）。一方、アフリカッメガエルの卵母細胞（第３図）は、ＴＳＨによる刺激に対して特異的なｃＡＭＰの用量依存型の増加が認められ、ランＴＳＨに対するイスレセプターの期待される感受性に一致した（５０％効果は約０．３ｎＭで得られた）（１４）。レセプターｃＤＮＡの一時的な発現は、Ｃｏ５−７細胞（第４図）で得られた。膜への１！５１標２ｆｉＴＳＨの４！翼的結合は、トランスフエクン夏ンされた細胞のみで観察された。ＴＳＨによる標識の減少曲線は、イヌの甲状腺細胞から得られた膜分画によって得られたものと大変類似した特性を表わしたく５０％効果はｃｏｓ細胞で約０．４ｎＭ１甲状腺細胞で０．１６ｎＭのところで観察された）（第４Ｃ図）。

Ｃｏ５−７細胞の膜分画では、わずかながら右側にずれた減少曲線が得られたが、このことはレセプターが多く含まれていることを示している。

イヌＴＳＨレセプターをフードするｃ　ＤＮＡの全配列を決定し、第５図に示した。

（ｄ）ＴＳＨレセプターとＬＨ−ＣＧレセプターとの比較ＴＳＨレセプターと、最近になってクローン化されたＬＨ−ＣＧレセプター（１５，１６）との比較から、興味深い特性が明らかになった。その性質から、それらはＧタンパク質共役レセプターの新しいサブファミリーに属するものとなった。両者とも、Ｎ−グリフシル化のための多価部位（ＴＳＨレセプターでは５つ）を含む長いアミノ末端からなる延長部分を示した。このＴＳＨレセプターは、推定される細胞外トメイノと第一のトランスメンブランセグメントとの間に近い部分に挿入される追加の５２残基からなる挿入配列を持つ（第２ａ図）。Ｔ　Ｓ　Ｈ細胞外ドメインとＬＨ−ＣＧレセプターとの全体の配列類似性は、４５％であった（第２８図）。大豆のレクチンの断片と、ラットＬＨレセプターとの類似性（１５）は、ＴＳＨレセプターでは保持されていなかった。このことは、偶然なことかもしれない。トランスメンプランセグメントを含むＴＳＨレセプターのＣ−末端の半分は、ブタおよびラットＬＨレセプター（第２ａ図）と７０％の相同性を有する。この相同性は、特にトランスメンプランセグメントそれ自体で顕著である。そこでは、２４個の同一の残基が一列に延びている（トランスメンプラン領域１１１）。また、第三の推定される細胞内ループのカルボキシル末端領域は、ＴＳＨおよびＬＨレセプターで特に短く、またＧａ５（８，９）と関係しており、それは両レセプターで同一である。このような類似性のパターンは、細胞外ドメインがリガンド３４′に認識されるものであるということを支持している。一方で、膜に挿入されたドメインは、Ｇ、ｓの活性に関与する（１５．１６）。ＴＳＨおよびＬＨ− ＣＧレセプターと、ＨＧＭＰＯ９とは、ともにＧタンパク質共役レセプターの別個のサブファミリーを構成する（ＨＧＭＰＯ９が実際にＦＳＨレセプターであるという証拠が存在する（７））。最近までにクローン化されたＧり／バク質共役レセプターのほとんどを含む配列相同性デンドログラム（１７）は、それらの近接した関係と、他のレセプターの大部分からの距離とを示す（第２ｂ図）。ＦＳＨレセプターの完全配列は、ＴＳＨレセプター（１８ンを刺激するＬＨ−ＣＧの既に知られている能力がＬＨおよびＴＳＨレセプターの細胞外トメイノの高配列相同性を反映しているかどうかを明らかにするであろう。

＜ｅ＞イヌＴＳＨレセプター変異体ＨＧＭＰＯ９クローン（ＦＳＨレセプタ一部分として考えられる）によるイヌ甲状腺細胞ｃＤＮＡライブラリー（３ｏ）のスクリーニングは、スクリーンされた８４０，０００個のプラークから１６個の陽性クローンを得た。ハイブリダイゼーシ冒ンは、３５％フォルムアルデヒド中、４２℃で実施した。そして、２倍のＳＳＣ，６５℃でフィルターを洗浄した。オートラジオグラフィーの前に０゜１％ＳＤＳした。ｎ製された１２のクローンをＥｃｏＲＩ消化によって分析した。

ソシテ、３つ（１））ローン（ｄＴｓＨＲｌ、、ｄＴＳＨＲ２およびｄＴＳＨＲ３）をＭｌ　３ｍｐｌ　８およびｐＢｓベクターでサブクローン化した。ｄＴｓＨＲｌおよびｄ　Ｔ　Ｓ　ＨＲ２Ｉｔ、２８００および１５００ｂｐからなる２つのＥｃｏＲＩ断片を有スル。ｄ　Ｔ　Ｓ　ＨＲ３ｉ１短くて、２２００および１５００ｂｐからなるＥｃ。

Ｒ１断片からなる。ｄＴｓＨＲｌおよびｄＴｓＨＲ２の２８００ｂｐ７ラグメントの制限酵素での消化による分析から、制限地図にわずがなからの違いが認められた。すなわち、おもな違いはｄＴｓＨＲｌにおいてＰＳｔｌ制限部位が存在することであり、これはｄＴＳＧＲ２には存在しない。ｄＴｓＨＲｌの塩基配列は完全に明らかにされ、卵母細胞および培養細胞でのｅＤＮＡの発現によるチロトロピンレセプターとして同定される７６４コドンからなるオーブンリーディングフレームが明らかになった（実施例１　（ｂ）および第５図参Ｍ）。ｄＴＳＨＲ３はｄＴｓＨＲｌと同様であるが、５′末端がｅｏｏｂｐ欠けていた。なぜなら、ｄＴｓＨＲｌおよびｄＴＳＨＲ２の制限地図と興なり、また後者のクローンは開鎖上の配列が決定された。

この配列から、ｄＴｓＨＲ］クローンと比較した場合、い（っかの突然変異が生じているのが明らかになった。全体で５つの突然変異が認められ、ひとつは単一塩基欠失、単一塩基挿入そして５塩基挿入が２０６０ｂｐかなる長い３′未翻訳領域（図示せず）内に散在している。しかし、ｄＴｓＨＲｌとｄＴｓＨＲ２とのあいだの主な違いは、遺伝子をフードする領域に位置しているということであり、開始コド／から２４０ｂｐ下流に’ｙｓｂｐの欠失があるということである。

この欠失に対応するタンパク質でのアミノ酸の２５個の欠失ば、長いＮＨ２末端細胞外ドメインにある。このドメインはＴＳＨレセプター（２５）と、それに密接に関連かつ最近になってクローン化されたＬＨレセプター（１５，１６）に特有なものである（第６図）。ＬＨレセプターに見られるように、テロトロピンレセプターのＮＨ２末端部分は不完全な繰り返し構造によって特徴づけられる。この不完全な繰り返し構造は、第７図に示されたようにして配列されている。これらの繰り返しは、ロイノン−リッチな糖タンパク質の仲間を含むいろいろなタンパク質で見られるロインンーリフチな繰り返しと構造が類似している（２６．１５）。ｄＴＳＨＲ２クローンにみれられる欠失は、繰り返し配列の長さが規則的で、またその並び方は明確であるタンパク質の領域にある、これらの繰り返し配列のひとつと正確に一致する。そのような使興の存在は、この綴り返し構造の意義を高めるものであり、その構造のｍ能的的意味と染色体遺伝子の構造との関係に関して興味ある問題を提起している。

ＴＳＨおよびＬＨレセプターの細胞外ドメインは、あきらかにリガンドの結合に関与している（４）。欠失繰り返し構造は、Ｎ−グリコジル化のための５つのコンセンサス配列のひとつも含む。ＴＳＨレセプターのグリコジル化は、リガンドの結合またはシグナル伝達にとって重要なものであると考えられる。もし、この繰り返しが欠けているとしたら、結合能および（または）レセプター機能に影響がでるだろうが、今のところ明らかにされていない。この変異を発現する細胞系統と、完全な大きさのレセプターを発現する有効かつ安定なトランスフェクタントとを比較すると、この問題の部分的な回答が得られる。インビトロの系で生じたＴＳＨレセプターに関する他の突然変異体の機能的分析はそのような研究を完結させよう。

繰り返し全体の欠失もまた、ＴＳＨレセプター遺伝子の構造を明らかにする上で役に立つ。繰り返し単位がエクソンに一致する可能性は非常に高いと考えられるので、すべての繰り返し配列はイントロンによりて分断されているのだろう。

おもしろいことに、Ｇタンパク質共役レセプターをコードする遺伝子の大部分は、イントロン的な構造を完全に欠いている。もちろん、このようなことの機能的および進化的な１８はわからないが、しかし糖タンパク質ホルモンレセプター遺伝子のエフソノ的な構造の高断片化は、レセプターファミリーの他のものとは対照的である。

＋＋、ヒトＴＳＨレセプター遺伝子のクローニングヒトラムダｇｔｌｌｃＤＮＡライブラリー（２９）をイヌＴＳＨレセプター遺伝７　〔２５ＣＯ′ｒＴｒ：テ＝、りｙ　ＨｔりＬｐ−２！　Ｂ　”、＋＋　、　、−、５Ｃ’００）、そのうちの２４クローンプラ〜り精製して、挿入配列の大きさを決定した。

２３７０ｂｐの挿入配列を持つクローンと３０５０ｂｐの挿入配列を持つクローンとを、Ｍ１３プリバチイブ中で断片のオーパーラ、ピングとしてサブクローン化して配列を決定した（第１２図）。全体で４２７２ｂｐが決定され、そのなかに２２９２ｂｐからなるオープンリーディングフレームが同定された。この遺伝子をタンパク質に翻訳すると、その遺伝子をコードしている配列はイヌＴＳＨレセプターと９０，３％の相同性を示したく第８図）（１）。それは、糖タンパク質ホルモン結合Ｇタンパク質共役レセプターのサブファミリーの特徴のすべてを示している。すなわち、シグナルペプチド（２０残基）の後ｌこ、Ｎ−グリコＶル化のための５つの部位を有する大きな細胞外ドメイン（３９８残基）が続き、またそのドメインは７つのトランスメンプランセグメンを含む３４６残基がなるカルオキシル末端ドメインに連結されている（第８図）。他のＧタンパク質共役レセプターには見つからないアミノ末端ドメインは、脳下垂体および胎盤の糖タンパク質ホルモンの結合に関与する領域に相当すると考えられる（２５．１５．１６）。

ヒトＴＳＨレセプターの変異体ヒトＴ　Ｓ　Ｈレセプター遺伝子をプローブとして、ヒト胎盤、精巣および甲状腺から抽出したＲＮＡのノーインプロットを行なった。その結果、４．６おび４４ｋｂからなるメジャーな甲状腺特異的転写産物が明らかになった。また、サイスノ小すくかウマイナーな甲状腺特異的ＲＮＡ橿も観察された。しがし、メジャーな甲状腺特異的転写産物は、その遺伝子の３″領域にある多数のポリアデニル化部位に単純に当てはまった。このことは、ブタＬＨ−ＣＧレセプターで観察されたものを思い出させる。この場合、多数の転写産物がメンプランスバンニングセグメント（ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｐａｎｎｉｎｇ　ｓｅｇｍｅｎｔｓ）　（１６）をコードする能力を欠いているレセプターｃＤＮＡの変異体と一致する。レセプター機能およびその調整と重要な関係するこのような観察をヒトＴＳＨレセプター遺伝子にも、ｃＤＮＡ５イブラリ−から得た追加のクローンの配列決定をまりで適用する。

ヒトＴＳＨレセプターの発現単離されたクローンがヒトＴＳＨレセプターを発現するかどうかを証明するために、そのコード配列を５Ｖ−４０をもとにしたベクターｐＳＶＬに挿入し、Ｃｏ５−７細胞にトランスフェクシ１ンした（２４）。このトランスフェクン璽ンされた細胞から調製した膜分画に対して［ｔｇｓ　Ｉ　］Ｔ　Ｓ　Ｈの特異的結合を調べた（第９図）。拮抗させるための未標識ＴＳＨとして牛のものを用いた。

未標識ＴＳＨによる置換を示す曲線の特徴は、同様の条件下で行なったイヌＴＳＨレセプターの場合と類似している（約０．５Ｍのとこで５０％置換がなされた）（２５）イヌＴＳＨレセプターとの配列の類似性、対応する転写産物の組織特異的遺伝子発現、そしてトランスフエフ／璽ンされたＣ０９−７細胞から得られた膜分画の結合アッセイから、正真正銘のヒトＴＳＨレセプターがクローン化された。

ヒトＴＳＨレセプターに対する抗体甲状腺ｇ己免疫グロブリンに対するクローン化されたヒトＴＳＨレセプターの関係を調べるために、Ｃｏ５−７細胞で発現された組換えレセプターに対する結合について、（”５１ＥＴＳＨと轡者からｊｌｉＩ製された免疫グロブリンとの拮抗関係を調べた。免疫グロブリンは、流安沈澱によって、患者の血清または正常個体の血清から調製したものである。調製された血清はみずに溶解されて、ダルベツコの修飾イーグル培地に対して透析された。正＄個体からの免疫グロブリンが［′”ＩＩＴｓＨと置換されないのに、イデイオバ７ノクミクソエデマ（１ｄｅｏｐａｔｈｉｅ　ｍｙｘｏａｄｅｍａ）の二人のも者から得た試料では、［” ’Ｉ　］　Ｔ　Ｓ　ｆ（と用量依存的に置換された。

この用量依存は、これらの患者から得られた免疫グロブリンが組み換えレセプターに対ｌ、て高い親和性を有することを示している。高レベルの甲状腺刺激免疫グロブリン（ｔｈｙｒｏｉｄ　ｓｔｉｕｌａｔｉｎｇ　ｉ１＋＋ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｌｌｓ）を有するグレージス病の患者二人から得た試料の場合、そのうちのひとつはそのアッセイ条件下において標識されたＴ　Ｓ　Ｈとの置換を行なうことが抑制されたく第１０図）。これら２つのカテゴリーの免疫グロブリンの、Ｃｏ５−７細胞で発現されるレセプターからＴＳＨを置換させる能力の違いは、共通の抗原に対するそれらの親和性の違いを反映させている。あるいは、刺激抗体および阻害抗体がＴＳＨレセプターのいくつかの部分に結合するという従来の知見（２６，２７）にもかかわらず、それの標的とされる抗原は実際のところ基本的に異なるものである可能性がある。この点に関しては、より多くの免疫グロブリンの結合活性を、トランスフエクシヨンされた細胞でのアデニル酸ンクラーゼ活性と比較することによって明らかにされるであろう。

（以上）謬照文献１、　Ｊ、Ｅ、　Ｄｕｍｏｎｊ、Ｇ、Ｗａｓｓａｓｒｌ　＆　Ｓ、Ｒｅｆｅｔｏｆｆ、ｉｎ　Ｔｈｅ　＊ｅｔａｂｏｌ＋ｅ　Ｂａ５ｅｓ　ｏ■ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ　Ｄｌｓａａｓｅｓ、　Ｃ，Ｒ，５ｃｒｌｖｅｒｓ、＾、Ｌ、　Ｂｅａｕｄｅｔ、　Ｗ、Ｓ、　Ｓｌｙ　＆　Ｄ、　Ｖａ撃■@ｅｄｓ、ＭｅＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、　ｐｐ　１８４３−１８８０（１９８９）。

２、　１．Ａ、Ｋｏｕｒｉｄｅｓ、Ｊ、Ａ、Ｇｕｒｒ　＆　Ｏ，Ｗｏｌｖ、Ｒｅｃ、Ｐｒｏｇｒ、Ｈｏｒｌ、Ｒｅｓ、４０．　７９３、　Ｆ、Ｒｌｂｅｉｒｏ− ＮａＬｏ、Ｌ、Ｂｒｒｎｂａｕｍｅｒ　ａｎｄ　ＪＭ、Ｂ、Ｆｉｅｌｄ、Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏ、］、Ｉｌ＋）　S ｇ２−２９０　（１９８７）。

４、　Ｂ、　Ｒｅｅｓ−Ｓｍｉｔｈ、　Ｓ、Ｍ、　ＭｃＬａｅｈｌａｎ　＆　Ｊ、　Ｆｕｒｍａｎｉａｋ、Ｅｎｄｏｃｒｌｎｅ　Ｒｅｖ、　X．１０６−１２１　〈＋９ｓａ）。

５、　Ｒ，に、５ａｉｋ［ａｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．　ｐｐ、４８７−４９１　４１９８８）。

６、　Ｆ、ＬＩｂａｒｔ　ａｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４．　ｐｐ、５６９−５フ２　（１９８８）７、　Ｍ、　Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ　ａｔ　ａｌ；　ｔｏ　ｂｅ　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｅｌｓｅｗｈｅｒｅ。

８、　Ｂ、Ｆ、Ｏ’Ｄｏｖｄ、ａｔ　ａｔ、Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｗ、２６３．　１５９８５−１５９９２　（１！８ｇ）。

９、　Ｃ，５ｔｒａｄｅｒ、　１．Ｓ、　Ｓｉｇａｌ　＆　Ｒ，Ｄｉｘｏｎ、　ＦＡＳＥＢ　Ｊ　３．１８２５−１８３２　（１９８９）１０、　Ｓ、　Ｌｌｓｓｌｔｚｋｙ、　Ｇ、　Ｆａｙｅｔ　ａｎｄ　Ｂ、　Ｖｅｒｒｉｅｒ、＾ｄｖ、　Ｃｙｃｌｌｅ　Ｎｕｃｌ、　ＲｅｓA　５゜１３３−１５２　（１９７５）。

１　１、　Ｇ、ｗｏｎ　Ｈａｉｊｎｅ、Ｎｕｃｌ　＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１４．　４６８３　＜１９８６＞。

１２、　Ｂ、Ｐ、　Ｓｈｉｍｍｅｒ、　ｒｎ　Ｆｕｎｃｔｒｏｎａｌｌｙ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｃｅｌ１口ｎｅｓ、　ｐｐ　６P−９２、　Ｇ、　５ａｔｏ、　ｅｄ、＾！ａｎＲ，Ｒｉｓ＊　Ｉｎｃ、　（１９８り　Ｎ、Ｙ。

１３、　Ｃ，Ｍａｅｎｈａｕｔ　＆　Ｆ、　Ｌｉｂａｒｔ、寄託Ｙｌ細胞を文献（１２）記載にもとづいて単層培養した。１ｍｍ２方形区を培養皿のうらにマークして、この方形区に含まれるすべての細胞にｍＲＮＡを０．２５μｇ／μｌマイクロインジェクン１ンした。このｍＲＮＡは、ＰＳＰ６４　（プロメガ）でサブクローン化したＴＳＨレセプターＣＤＮＡから合成されたものである。３０分後、ＴＳＨを添加し、１２０分後に細胞の写真をとった。ＴＳＨ濃度が０．１ｍＭに低下するとともに、形管変化（２０時間安定）を観察した。ＦＳＨＳ　ＬＨおよびｈＣＧは効果を示さなかった（図示せず）。

＋　４．　Ｊ、　Ｖａｎ　５ａｎｄｅ、　Ｐ、　Ｃｏｃｈａｕｘ　ａｎｄ　Ｊ、Ｅ、　Ｄｕ＋＋ｏｎｔ、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１５０．P３７−１４１　（１９Ｂ）＋　５．　Ｋ、Ｃ，ＭｃＦａｒｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４５．　４＋１４　＜１９１１９）１６、　Ｅ　Ｌｏｏｓｆｅｌｔ　ａｔ　ａｔ、、Ｉｂ１ｄ　２４５．　５２５．　＜１９Ｈ）。

１７、Ｄ、Ｇ、　Ｂｉｇｇｌｎｓ　ａｎｄ　Ｐ、Ｍ、　５ｈａｒｐ、　Ｇｅｎｅ、　７３．２３７−２４４　（１９８Ｂ）。

１８、　Ｊ、Ｇ、　Ｋｅｎｉｍｅｒ、Ｊ、Ｍ、　ｔｌｅｒｓｈｓａｎ　＆　［１，Ｐ、　１１１ｇｇ１ｎｓ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｐｅ、@Ｍｅｇａｂ、４０．　４８２　＋１９７５）＋　９．　７．　ｍａｒ＋１ａｔｌｓ、　Ｅ、Ｐ、　Ｆｒ１ｓｃｈ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、（１９８２）　Ｉ＊　Ｍｏ１ａｃｕ撃≠秩@Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ？ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅ唐刀A　Ｎｅｗ　Ｙ。

ｒｋ）。

２０、　Ｐ、Ｒｏｇｅｒ　ａｔ　ａｌ）：ｕｔ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５２．　２３９−２４５　（１９８５）２　ｔ、　Ｐ、Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ、Ｎ１ｅｋｌｅｎ　＆＾Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、ＳＣｉ、１１．ｓ＾　７４．　５４６３　（＋９７７＋、Ｓ、Ｈｅｎ１ｋｏｆｆ、Ｇｅｎｅ　２ｇ、３６１　（１９８４）２２、　Ｉｌ、Ｌ　Ｋｏｂｉｌｋａ　ｅｔ　ａｌ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、２６２．　７３２１　（１９１１？）２３、　Ｇ、ｌｏｎｇ、Ｙ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２８．　８１０−８１５　（１９８５）２　４、　Ｒ，Ａ、Ｆ、Ｄｉｘｏｎ　ａｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　３２６．　７３−７１　（１９８７１２５、Ｐａｒ＋＋ｅｎｔ［ｃｒ、Ｍ、、Ｌｉｂｅｒｔ、　Ｆ、１ｌｌａ＊ｎｈａｕ＋、Ｃ，、Ｌｅｆｏｒｔ、　＾、　Ｇｅｒａｒｄ、Ｃ。

、Ｐｅｒｒｅｊ、Ｊ、、Ｖａｎ　Ｓ！ｎｄｅ、Ｊ、Ｄｕｗｏｎｔ　Ｊ、Ｅ、ａｎｄ　ｖａｓｓａｒｔ、ｃ、（１９Ｂ’ｌ）、Ｓｕｂｍｉ＋、P ２　Ｇ、　ＴａｋａｈａＳｈｌ、Ｎ、、丁ａｋａｈａｓｈｉ、Ｙ、ａｎｄ　Ｐｕｔａａｎ、Ｆ、Ｗ、　（＋９８５）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ＋１、Ａｅａｃｌ、Ｓｅｔ、［１，Ｓ、Ａ、８２．　ｌ９Ｑ６２７、Ｄａｖｉ６ｓ　Ｊｏｎｅｓ、Ｅ、Ｗａｓｈｉｓ、Ｆ、、Ｃｒｅａｇｈ、Ｆ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｓ、ａｎｄ　Ｒｅｅｓ　５ｗ１ｔｈ、Ｂ、（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｅｎｄｏ、４１．　２５７−２６５２８、　Ａｓ１ｎｏ、　Ｎ、、　Ｗａｔａｎａｂｅ、　Ｙ、、　Ｔａ１ａｋｉ、　Ｈ，、Ｉｖａｔａｎｉ、Ｙ；　ａｎｄ　Ｍｉｙａｉ、　Ｌi １９Ｂ？）　Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏ、２７．　６１５−６２０２９、　Ｌｉｂｌｌｒｊ、　Ｆ、、　ＲｕｅＩＪ、、　Ｌｕｄｇａｌｅ、　Ｍ、、　Ｓ豐１１１ｅｎｓ、　Ｓ、、　Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、　m、、　Ｖａｓｓａｒｔ、Ｇ、ａｎｄ　Ｄｉｎｓａｒｔ、Ｃ（＋９１１７）　ＥＭＢＯＪ、Ｔ、４ｉ９３−４１９１ｉ３　０、　Ｌｅｆｏｒｔ、＾　、　Ｌｅｅｏｅｑ、Ｒ，、Ｌｉｂｅｒｔ、Ｆ、、Ｌａｍｙ、Ｆ、、５ｗ１ｌｌｅｎｓ、Ｓ、、Ｖａｓｓａｒｔ、Ｇ、ａｎｄ　Ｄｕ＋＋ｏｎｔ、Ｊ、Ｅ、（＋９８９）　ＥＭＢＯＪ、８．　ｌ１ｌ−１１６゜Ｆ工ＧＵＲＥ　３ａｃＡＭＰ濃度　（ｐｍｏ　ｌ　ｅ　ｓ）結合［１２５１コＴＳＨ（％全結合ｊＩ）ｎ　Ｗ　ｎ　ｌｊ　ｎ　ｊ　ｎど　ｅ”’＋　’に’　ｎ「！１結合［１２５ ■］ＴＳＨ（％全結合量）結合［１２５■コＴＳ　Ｈｌ；全Ｍ合量）○　ｆｌ　ど）ｆＩ＋Ｉ　○　μ−〇　Ｉｎ　（”ｔ　４　ｎ　Ｉｎ　ｒ）Ｉｓ　／’％　Ｌ−○Ｔｎ（１１−ｒ＋１−／“’＋ｒ１ｒ、６＾ｆｆｒ、ｒｌ＾４．−、／ｒ要約本発明は、チロトロピンレセプター活性を有するポリペプチドに関するもので、このポリペプチドは第１１図に示すアミノ酸配列、またその断片、または第１１図に示すアミノ酸残基のいずれかに置換または欠失、あるいは追加のアミノ酸残基の挿入が生ずることによって誘導されたアミノ酸配列を有することを特徴とする特国際調査報告１＋ｔｍｒｎａＩｍｅａ昏＾１１１１＋１ｅｍｌ、。、ｐ−０ＰＣＴ／ＥＰ９０１０２１５４１、ｌ８．、．１．１．Ｉｌ、１．、．６４．１．、いＨ０ＰｃＴ／ＥＰ　９０１０２１５４１ｍｒ４ｎｌ１１６Ｎ１１＾−〇１１ｃｌ”””ａｐｒ’Ｔ／ＦＤＯｎ／ｌ’ｔフ１ζＡｌｍｅ＋〜トー−＾−−−１１−角−〇ＰＣ ”ｒ／ｌ！Ｐ９０１０２１５４国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．第１１図に示したアミノ酸配列たはその配列の断片、または第１１図に示されたアミノ酸残基のいずれかが置換または欠失されることによって、または追加のアミノ酸残基を挿入されることによって前記配列から誘導されたアミノ酸配列からなることを特徴とするチロトロピンレセプター活性を有するポリペプチド。
２．以下の一般式で表わされるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載のポリペプチド。一般式：［Ｘ］ｎ−〔ｙ］ｍ−〔Ｚ〕ｐ式中、ｎ＝０または１、ｍ＝０または１、ｐ＝０または１で、かつこれらはｎ＋ｍ＋Ｐ＞０の関係にあり、また、ｘ，ｙ，ｚは以下のように定義され（ひとっのアミノ酸を−文字で表わしており、またいずれかひとっの部位にある複数の文字は、その部位での与えられたアミノ酸残基のうちのひとっの存在を示すものである）、ｘ＝ＭＲＰＡＤＬＬＱＬＶＬＬＬＤＬＰＲＯＬ，ＰＰＨＡＡＳｙ＝免疫学的な特性を現わすのに必要な以下の配列からなる連続的なアミノ酸の少なくとも最小な数であり、【配列があります】そして、【配列があります】式中、アミノ酸配列【配列があります】は、独立的に存在または不存在であり、また以下の意味を有しており、【配列があります】ＩＶまたは、この配列の少なくとも１２の連続するアミノ酸残基であり、【配列があります】または、この配列の少なくとも１２の連続するアミノ酸残基であり、【配列があります】または、この配列の少なくとも２の連続するアミノ酸残基であり、【配列があります】または、この配列の少なくとも２２の連続するアミノ酸残基であり、【配列があります】または、この配列の少なくとも２の連続するアミノ酸残基であり、【配列があります】または、この配列の少なくとも１２の連続するアミノ酸残基であり、【配列があります】または、この配列の少なくとも１２の連続するアミノ酸残基であり、【配列があります】または、この配列の少なくとも１２の連続するアミノ酸残基であり、【配列があります】または、この配列の少なくとも１２の連続するアミノ酸残基であり、【配列があります】または、この配列の少なくとも１２の連続するアミノ酸残基あり、上記に特定されたアミノ酸のどれでもは置換または欠失が可能であることが理解される。また、上記配列の外側に記載されたアミノ酸残基は挿入可能であり、チロトロピンレセプター活性は保持されるものである。
３．“ｙ”は少なくとも以下のサブ配列：Ｙ１ないしＹ１３から少なくとも一っ選択されるものであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のポリペプチド。【配列があります】
４．前記ポリペプチドの一部分、例えばトランスメンブランドメインを形成する部分は前記ＴＳＨレセブターに対してヘテロなものなので、前記ポリペプチドは雑種ポリペプチドであることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかの項記載のポリペプチド。
５．第１１図に示された配列からなることを特徴とする請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
６．請求の範囲第１項ないし第５項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも８個のヌクレオチドからなる配列を有する断片と、１２個のヌクレオチドからなる配列を有する断片と、そしてより好ましくは少なくとも１６個のヌクレオチドとからなる配列を有する断片とからなる前記配列の断片と、前記配列または断片と相補的な関係にあるヌクレオチド配列。
７．前記配列は、第５図また第１２図に示された配列を有するＤＮＡ配列、あるいは８個のヌクレオチドからなる配列、１２個のヌクレオチドからなる配列、そしてより好ましくは少なくとも１６個のヌクレオチドからなる配列を存する断片、あるいは前記配列または断片と相補的な関係にあるヌクレオチド配列であることを特徴とする請求の範囲第５項記載にもとづくヌクレオチド配列。
８．前記核酸が操作的に押入されたベクターによって形質転換された宿主細胞内で前記ポリペプチドをコードする核酸の発現にもとづくことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項記数のポリペプチドの調製方法。
９．請求の範囲第１項ないし第５項のいず札か一項記載のポリペプチドをＴＳＨまたは抗ＴＳＨレセブタ−抗体を含むと思われる生物学的試料と接触させると同時に、あるいは連続して、標識ＴＳＨまたは標識抗ＴＳＨレセブタ−抗体と接触させ、そして標識されたものと、未標識のものとの拮抗の後に、標識ＴＳＨまたは標識抗ＴＳＨレセブタ−抗体の結合量を測定することを特徴とする生物学的試料に含まれるチロトロビン（ＴＳＨ）または抗チロトロビンレセブタ−抗体（抗ＴＳＨレセブター）の定量的分析方法。
１０．請求の範囲第５項または第６項の核酸配列によって形質転換された細胞またはそのような細胞から調製された膜分画と、ＴＳＨまたは抗ＴＳＨレセブタ− 抗体を含むと考えられる生物学的試料とを接触させ、それらの細胞たは膜分画での、アデニリルシクラーゼ活性を、例えばｃＡＭＰ産生または放出を測定することを特徴とする生物学的試料に含まれるチロトロビン（ＴＳＨ）または抗チロトロビンレセブタ−抗体（抗ＴＳＨレセブター）の定量的分析方法。
１１．レセプターポリペプチドペプチドを発現する細胞または前記細胞の膜分画を、ＴＳＨと同時に、あるいはＴＳＨとの接触前に、生物学的試料と接触させ、そしてせ接触させ、生物学的試料中に含まれる抗ＴＳＨレセブタ−抗体を阻害することによって、ＴＳＨによるアデニリルシクラーゼ活性効果の阻害を行なうことを特徴とする請求の範囲第１０項記載の方法。
１２．請求の範囲第１項ないし第５項記載のレセプターポリペプチドに対する多クローン抗体またはモノクローン抗体。
１３．請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか一項記載にもとづくポリペプチドと、ＴＳＨ源または抗ＴＳＨレセブタ−抗体との接触と、結合したものと遊離しているものとの分離と、レセブター結合ＴＳＨまたは抗体の解離とからなるＴＳＨまたは刺激および阻害抗体の精製方法。
１４．生物学的試料を請求の範囲第１２項記載にもとづく抗体と接触させることによって前記生物学的試料中に含まれるＴＳＨレセブターの断片を定量的に検出するための方法であって、もし必要ならば前記抗体を事前に標識し、請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか一項記載にもとづくポリペプチドと前記断片との間の拮抗によって、あるいは結合標識抗体を非結合標識抗体から分離することよって結合測定を行なうもので、前記ポリペプチドは、例えば１２５１で標識されていること特徴とする方法。
１５．請求の範囲第１２項記載の抗体を用いることを特徴とする生物学的試料に含まれるＴＳＨレセブターの免疫組織化学的検出方法。
１６．（ａ）上記したようにチロシンレセプター活性を有し、かつ固定化または可溶化された形状にある本発明にもとづくポリベブテド；（ｂ）以下に示す少なくともひとつの試薬：ｉ）標識ＴＳＨ、ｉｉ）標識抗ＴＳＨレセブタ−抗体、そしてｉｉｉ）アデニリルシクラーゼ活性の測定に必要な試薬、を含むことを特徴とするＴＳＨまたは抗ＴＳＨレセブタ− 抗体を検出するためのキット。
１７．前記ポリペプチドは、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によって事前に操作的に形質転換きれた細胞に存在し、必然的に前記細胞の膜に置かれたかたちで、あるいは前記細胞の可溶化された膜のかたちで、存在することを特徴とする請求の範囲第１６項記載のキット。