JP4938263B2 - 一本鎖抗体によるサイトゾルタンパク質の機能阻害法およびその利用 - Google Patents
一本鎖抗体によるサイトゾルタンパク質の機能阻害法およびその利用 Download PDFInfo
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Description
本発明は、サイトゾルタンパク質を認識する抗体における、重鎖可変領域あるいは軽鎖可変領域のシグナルペプチドを残して構築した一本鎖抗体を用いたサイトゾルタンパク質の機能阻害方法、該一本鎖抗体を用いてサイトゾルタンパク質の機能を解析する方法、サイトゾルタンパク質の機能を特異的に阻害する特徴を有する該一本鎖抗体の製造方法、に関する。
現在のタンパク質の機能解析法は、タンパク質をコードする遺伝子のノックアウト（破壊）法が主流である。近年、RNAi法による標的遺伝子mRNAの干渉除去による遺伝子サイレンシング法がC.エレガンスで可能になり、急速に植物、動物へと応用範囲が広がっている。しかしながら、それら方法では標的タンパク質が産生されないので、タンパク質の特定ドメイン機能や翻訳後の修飾による機能解析には利用できないという問題があった。
細胞質ゾル（サイトゾル）のタンパク質機能をシグナル伝達経路を例にして見ると、チロシンキナーゼとリン酸化受容タンパク質の会合、会合させるのに必要なアダプタータンパク質やドッキングタンパク質、マップキナーゼリン酸化カスケード反応の足場として必要なスカフォールタンパク等、ほとんどのタンパク質がドメイン間会合機能によりシグナル伝達を行っている。また一つのリガンドと受容体で導入されるシグナル伝達においても、例えば細胞活性化あるいは細胞死を誘導するようにシグナル伝達経路は複数存在する。交通で例えると信号機、インターネットで例えるとルーターの様に、経路の選択は主としてアダプタータンパク質によって制御されている。
細胞内発現抗体（イントラボディー）は、細胞内の種々のタンパク質の機能阻害に利用されてきた。また、動物細胞内で一本鎖抗体scFvを発現させ、細胞内標的タンパク質の機能を阻害する試みはすでに行われてきた。
抗体は分泌タンパク質であり、H鎖あるいはL鎖のリーダー配列（シグナルペプチド）を有するscFv遺伝子を発現させると、小胞体（ER）膜を通過し、酸化状態のER内にイントラボディーとして安定に発現する。ERで合成される膜受容体は、ERで発現させたイントラボディーと会合し機能阻害される。
一方、サイトゾルにscFvを発現させるためには、分泌タンパク質である抗体のH鎖あるいはL鎖のリーダー配列（シグナルペプチド）を除去するのが常識となっているが、リーダー配列を除去してscFvを発現させると、タンパク質の発現は極端に低いこと、また還元状態のサイトゾルでの安定した発現のためにscFv遺伝子の抗原結合部位(CDR)以外の配列（フレームワーク）の改変による安定化が必要とされる。また、標的タンパク質との結合もほとんど検出されないので、scFvイントラボディーによる機能阻害効果の評価は困難であった。
機能阻害効果のある報告でも、scFvイントラボディーと標的タンパク質の会合の証拠はほとんどなく、イントラボディーによるサイトゾルでの機能阻害は確立された方法となっていないのが実状である。また現在のところ、サイトゾルで安定してかつ機能を有するイントラボディーの発現にはいまだ十分成功していない。
なお、本発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
Bird, R. E.外９名著、「Single-chain antigen-binding proteins.」、Science、1988年、Vol.242、p.423-426.
Huston, J. S.外１０名著、「Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli.」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1988年、Vol.85、p.5879-5883.
Biocca, S.外２名著、「Expression and targeting of intracellular antibodies in mammalian cells.」、EMBO J.、1990年、Vol.9、p.101-108.
Werge, T.外２名著、「Cloning and intracellular expression of a monoclonal antibody to the p21ras protein.」、FEBS Lett.、1990年、Vol.274、p.193-198.
Barbas, C. F., III, 外３名著、「Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site.」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1991年、Vol.88、p.7978-7982.
Marasco, W. A., 外２名著、「Design, intracellular expression, and activity of a human anti-human immunodeficiency virus type 1 gp120 single-chain antibody.」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1993年、Vol.90、p.7889-7893.
Biocca, S.外３名著、「Intracellular immunization with cytosolic recombinant antibodies.」、Biotechnology 、1994年、Vol.12、p.396-399.
Beerli, R. R.外２名著、「Intracellular expression of single chain antibodies reverts ErbB-2 transformation.」、J. Biol. Chem.、1994年、Vol.269、p. 23931-23936.
Jost, C. R.,外５名著、「Mammalian expression and secretion of functional single-chain Fv molecules.」、J. Biol. Chem.、1994年、Vol.269、p.26267-26273.
Mhashilkar, A. M.外５名著、「Inhibition of HIV-1 Tat-mediated LTR transactivation and HIV-1 infection by anti-Tat single chain intrabodies.」、EMBO J.、1995年、Vol.14、p.1542-1551.
Richardson, J. H.外３名著、「Phenotypic knockout of the high-affinity human interleukin 2 receptor by intracellular single-chain antibodies against the alpha subunit of the receptor.」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1995年、Vol.92、p.3137-3141.
Biocca, S.外４名著、「Redox state of single chain Fv fragments targeted to the endoplasmic reticulum, cytosol and mitochondria.」、Biotechnology 、1995年、Vol.13、p.1110-1115.
Jannot, C. B.外４名著、「Intracellular expression of a single-chain antibody directed to the EGFR leads to growth inhibition of tumor cells.」、Oncogene、1996年、Vol.13、p.275-282.
Greenman, J.外３名著、「The use of intracellular single-chain antibody fragments to inhibit specificity the expression of cell surface molecules.」、J. Immunol. Methods、1996年、Vol.194、p.169-180.
Persic, L.外５名著、「Targeting vectors for intracellular immunization.」、Gene、1997年、Vol.187、p.1-8.
Jannot, C. B. および Hynes, N. E.著、「Characterization of scFv-421, a single-chain antibody targeted to p53.」、Biochem. Biophys. Res. Commun.、1997年、 Vol.230、p.242-246.
Caron de Fromentel, C.外８名著、「Restoration of transcriptional activity of p53 mutants in human tumour cells by intracellular expression of anti-p53 single chain Fv fragments.」、Oncogene、1999年、Vol.18、p.551-557.
Zhu, Q.外１３名著、「Extended half-life and elevated steady-state level of a single-chain Fv intrabody are critical for specific intracellular retargeting of its antigen, caspase-7.」、J. Immunol. Methods、1999年、Vol.231、p.207-222.
Marasco, W.A.外２名著、「Human anti-HIV-1 tat scFv intrabodies for gene therapy of advanced HIV-1-infection and AIDS.」、J. Immunol Methods、1999年、Vol.231、p.223-238.
Steinberger, P.外４名著、「Functional deletion of the CCR5 receptor by intracellular immunization produces cells that are refractory to CCR5-dependent HIV-1 infection and cell fusion.」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2000年、Vol.97、p. 805-810.
Alvarez, R. D.外１０名著、「A cancer gene therapy approach utilizing an anti-erbB-2 single-chain antibody-encoding adenovirus (AD21): a phase I trial.」、Clin. Cancer Res.、2000年、Vol. 6、p.3081-3087.
Worn, A.および Pluckthun, A. 、「Stability engineering of antibody single-chain Fv fragments.」、J. Mol. Biol.、2001年、Vol.305、p.989-1010.
Mhashilkar, A. M.外９名著、「Intrabody-mediated phenotypic knockout of major histocompatibility complex class I expression in human and monkey cell lines and in primary human keratinocytes.」、Gene Ther.、2002年、Vol.9、p.307-319.
Tanaka, T.およびRabbitts, T. H.著、「Intrabodies based on intracellular capture frameworks that bind the RAS protein with high affinity and impair oncogenic transformation.」、EMBO J.、2003年、Vol.22、p.1025-1035.
Cardinale, A.外３名著、「Intracellular targeting and functional analysis of single-chain Fv fragments in mammalian cells.」、Methods 、2004年、Vol.34、p.171-178.
Visintin, M.外３名著、「Intracellular antibodies for proteomics.」、J. Immunol. Methods.、2004年、Vol.290、p.135-153.
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、一本鎖抗体（scFv）によるサイトゾルタンパク質の機能阻害方法を提供することを課題とする。詳しくは、抗サイトゾルタンパク質抗体における重鎖可変領域あるいは軽鎖可変領域の一方のシグナルぺプチドを除去して構築した一本鎖抗体を用いたサイトゾルタンパク質の機能阻害方法、該一本鎖抗体を用いてサイトゾルタンパク質の機能を解析する方法、サイトゾルタンパク質の機能を特異的に阻害する特徴を有する該一本鎖抗体の製造方法、並びにサイトゾルタンパク質の機能を特異的に阻害する特徴を有する該一本鎖抗体を発現し、サイトゾルタンパク質の機能が阻害されているトランスジェニック非ヒト動物を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究を行い、抗サイトゾルタンパク質抗体における重鎖可変領域あるいは軽鎖可変領域の一方のシグナルぺプチドを除去して構築した一本鎖抗体を新たに作製し、この一本鎖抗体によって、抗サイトゾルタンパク質抗体によって認識されるサイトゾルタンパク質の機能を阻害することに成功した。さらに本発明者らは、該一本鎖抗体を導入したトランスジェニック動物の作製に成功した。
具体的には、下記実施例記載のように、本発明者らはT細胞受容体（TCR）シグナル伝達経路で、アクチン重合とIL-2産生を仲介するアダプタータンパク質として機能しているサイトゾルタンパク質であるWASタンパク質（WASP）のN末端領域EVH1ドメインに対する単クローン抗体を作製し、ハイブリドーマ細胞からVH遺伝子及びVL遺伝子を単離し、一本鎖抗体遺伝子を構築した（図１）。T細胞培養株に遺伝子導入したところ、サイトゾルでEVH1結合活性を有するscFv抗体（イントラボディー）の大量発現を得た。また同じscFv遺伝子のトランスジェニック（Tg）マウスを作製したところ、単離精製したT細胞においてサイトゾルに大量のイントラボディーが検出され、免疫沈降法によりscFvイントラボディーとWASPの結合が確認された（図２）。抗CD3抗体刺激によるTCRシグナル導入は細胞骨格再編とIL-2産生を誘導するが、WASP-EVH1結合イントラボディーによりIL-2産生の特異的阻害が得られた（図３）。
また、N末端にH鎖可変領域(VH)リーダーシグナル配列を有するscFvが、T細胞においてタンパク合成される場である小胞体（endoplasmic reticulum）からサイトゾルに逆輸送（retro-translocation）され、ユビキチン/プロテアソーム系の分解を受けずに標的タンパク質に結合し機能阻害させることに成功した。
なお、T細胞ではscFvがERからサイトゾルへ逆輸送されたが、NIH-3T3細胞では逆輸送は認められなかった。このことは、ERで合成されるタンパク質のサイトゾルへの逆輸送とユビキチン化とプロテアソームの分解による品質管理が細胞種で異なることを強く示唆するものである。
以上のように本発明者らは、サイトゾルに十分量発現できたscFvを、サイトゾルの標的タンパク質WASPの標的ドメインと結合させることによって、特異的にドメインの機能阻害（ファンクショナルノックダウン）させることに成功した。
なお本発明で作製したscFv TgマウスはTgマウスの各種細胞におけるscFvの細胞内局在化を解析することによりERの品質管理機構を解析する素材として有用である。また本発明で確立した方法は、研究解析ツールとしてまたT細胞治療などの応用としてin vitroおよびin vivoのリンパ球でのタンパク質発現に普遍的に利用可能と考えられる。
従来、サイトゾルにscFvを発現させるために抗体の重鎖可変領域あるいは軽鎖可変領域に含まれるシグナルペプチドを除去することが常識となっていた。また、このようにして作製されたシグナルペプチドを含まないscFvは、タンパク質の発現が極端に低く、還元状態のサイトゾルでの安定した発現のためにscFv遺伝子の抗原結合部位(CDR)以外の配列（フレームワーク）の改変による安定化が必要とされ、さらに標的タンパク質との結合も検出されない、という事情があった。
しかし上述のごとく、本発明者らは初めて、抗サイトゾルタンパク質抗体における重鎖可変領域あるいは軽鎖可変領域の一方のシグナルぺプチドを除去して構築した一本鎖抗体によって、抗サイトゾルタンパク質抗体によって認識されるサイトゾルタンパク質の機能が阻害されることを見出した。なお、上記サイトゾルタンパク質の名称は一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。また本発明者らはサイトゾルタンパク質の特異的機能阻害方法およびscFv Tgマウスを確立することに成功し、本発明を完成させた。本発明はサイトゾルタンパク質の機能解析および機能阻害の新しい方法として有用である。
すなわち本発明は、サイトゾルタンパク質を認識する抗体における、重鎖可変領域あるいは軽鎖可変領域のシグナルペプチドを残して構築した一本鎖抗体を用いたサイトゾルタンパク質の機能阻害方法、該一本鎖抗体を用いてサイトゾルタンパク質の機能を解析する方法、サイトゾルタンパク質の機能を特異的に阻害する特徴を有する該一本鎖抗体の製造方法に関し、より詳しくは、
〔１〕 以下の（ａ）または（ｂ）に記載の一本鎖抗体を細胞内で発現させることを特徴とする、サイトゾルタンパク質の機能を阻害する方法、
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーペプチドを有する一本鎖抗体
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない重鎖可変領域、シグナルペプチドを有する軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーペプチドを有する一本鎖抗体
〔２〕 以下の（ａ）または（ｂ）に記載の一本鎖抗体をサイトゾルで発現させ、該サイトゾルタンパク質の機能を阻害し、該サイトゾルタンパク質の機能を解析することを特徴とする、サイトゾルタンパク質の機能解析方法、
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体
〔３〕 〔１〕に記載のサイトゾルタンパク質の機能を阻害する方法による該サイトゾルタンパク質の機能阻害の結果、細胞、組織、あるいは個体に現れる表現型の変化を解析することを特徴とする、サイトゾルタンパク質の機能解析方法、
〔４〕 以下の工程（ａ）〜（ｅ）を含む、サイトゾルタンパク質の機能を特異的に阻害する特徴を有する一本鎖抗体の製造方法、
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を単離する工程
（ｂ）該軽鎖可変領域からシグナルペプチドをコードする配列を除去し、さらに該重鎖可変領域および該軽鎖可変領域を結合するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいは
該重鎖可変領域からシグナルペプチドをコードする配列を除去し、さらに該軽鎖可変領域および該重鎖可変領域を結合するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製する工程
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを含むベクターを作製する工程
（ｄ）前記ベクターを宿主細胞に導入する工程
（ｅ）前記宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から産生させた抗体を回収する工程
〔５〕 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、機能性抗体の探索方法、
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体、あるいは抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体を、サイトゾルタンパク質を発現する細胞において発現させる工程
（ｂ）前記細胞における、サイトゾルタンパク質の発現量または活性を測定する工程
（ｃ）前記一本鎖抗体を接触させていない場合と比較して、該サイトゾルタンパク質の発現量または活性を変化させる一本鎖抗体を選択する工程
〔６〕 以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、サイトゾルタンパク質の機能が阻害された非ヒト動物細胞を生産する方法、
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体、あるいは抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルぺプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを非ヒト動物に導入する工程
（ｂ）前記抗体をコードするポリヌクレオチドが導入された非ヒト動物細胞を選択する工程
〔７〕 以下の（ａ）または（ｂ）の各可変領域がリンカーペプチドで結合された構造の一本鎖ポリペプチドである抗体、
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域
〔８〕 抗サイトゾルタンパク質抗体における重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、一本鎖ポリペプチドのN末端側を起点として、以下の（ａ）または（ｂ）に記載の順に並んでいることを特徴とする、請求項７に記載の抗体、
（ａ）シグナルペプチドを含む重鎖可変領域、リンカーペプチド、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域
（ｂ）シグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、リンカーペプチド、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域
〔９〕 シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域あるいはシグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域のC末端側に重鎖定常領域あるいは軽鎖定常領域を有する、〔７〕または〔８〕に記載の抗体、
〔１０〕 一本鎖ポリペプチドのC末端側に検出用配列を有する、〔７〕〜〔９〕のいずれかに記載の抗体、
〔１１〕 小胞体でタンパク質合成後にサイトゾルに逆輸送されることを特徴とする、〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載の抗体、
〔１２〕 ユビキチン化およびプロテアソーム分解されずにサイトゾルで発現することを特徴とする、〔７〕〜〔１１〕のいずれかに記載の抗体、
〔１３〕 細胞内発現抗体（イントラボディー）である、〔７〕〜〔１２〕のいずれかに記載の抗体、
〔１４〕 サイトゾルタンパク質に結合し、該タンパク質の機能を特異的に阻害することを特徴とする、〔７〕〜〔１３〕のいずれかに記載の抗体、
〔１５〕 サイトゾルタンパク質が、T細胞あるいはB細胞において発現するタンパク質である、〔１４〕に記載の抗体、
〔１６〕 サイトゾルタンパク質が、サイトゾルで機能するタンパク質であって、アダプタータンパク質、キナーゼタンパク質、酵素、あるいは細胞骨格タンパク質からなる群より選択されるタンパク質である、〔１４〕または〔１５〕に記載の抗体、
〔１７〕 〔７〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体を発現し、サイトゾルタンパク質の機能が阻害されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物、
〔１８〕 〔７〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、サイトゾルタンパク質機能阻害剤、
〔１９〕 〔７〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、サイトゾルタンパク質の機能解析用キット、
〔２０〕 〔７〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、サイトゾルタンパク質の機能解析用試薬、に関する。
〔１〕 以下の（ａ）または（ｂ）に記載の一本鎖抗体を細胞内で発現させることを特徴とする、サイトゾルタンパク質の機能を阻害する方法、
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーペプチドを有する一本鎖抗体
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない重鎖可変領域、シグナルペプチドを有する軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーペプチドを有する一本鎖抗体
〔２〕 以下の（ａ）または（ｂ）に記載の一本鎖抗体をサイトゾルで発現させ、該サイトゾルタンパク質の機能を阻害し、該サイトゾルタンパク質の機能を解析することを特徴とする、サイトゾルタンパク質の機能解析方法、
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体
〔３〕 〔１〕に記載のサイトゾルタンパク質の機能を阻害する方法による該サイトゾルタンパク質の機能阻害の結果、細胞、組織、あるいは個体に現れる表現型の変化を解析することを特徴とする、サイトゾルタンパク質の機能解析方法、
〔４〕 以下の工程（ａ）〜（ｅ）を含む、サイトゾルタンパク質の機能を特異的に阻害する特徴を有する一本鎖抗体の製造方法、
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を単離する工程
（ｂ）該軽鎖可変領域からシグナルペプチドをコードする配列を除去し、さらに該重鎖可変領域および該軽鎖可変領域を結合するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいは
該重鎖可変領域からシグナルペプチドをコードする配列を除去し、さらに該軽鎖可変領域および該重鎖可変領域を結合するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製する工程
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを含むベクターを作製する工程
（ｄ）前記ベクターを宿主細胞に導入する工程
（ｅ）前記宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から産生させた抗体を回収する工程
〔５〕 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、機能性抗体の探索方法、
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体、あるいは抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体を、サイトゾルタンパク質を発現する細胞において発現させる工程
（ｂ）前記細胞における、サイトゾルタンパク質の発現量または活性を測定する工程
（ｃ）前記一本鎖抗体を接触させていない場合と比較して、該サイトゾルタンパク質の発現量または活性を変化させる一本鎖抗体を選択する工程
〔６〕 以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、サイトゾルタンパク質の機能が阻害された非ヒト動物細胞を生産する方法、
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体、あるいは抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルぺプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを非ヒト動物に導入する工程
（ｂ）前記抗体をコードするポリヌクレオチドが導入された非ヒト動物細胞を選択する工程
〔７〕 以下の（ａ）または（ｂ）の各可変領域がリンカーペプチドで結合された構造の一本鎖ポリペプチドである抗体、
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域
〔８〕 抗サイトゾルタンパク質抗体における重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、一本鎖ポリペプチドのN末端側を起点として、以下の（ａ）または（ｂ）に記載の順に並んでいることを特徴とする、請求項７に記載の抗体、
（ａ）シグナルペプチドを含む重鎖可変領域、リンカーペプチド、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域
（ｂ）シグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、リンカーペプチド、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域
〔９〕 シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域あるいはシグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域のC末端側に重鎖定常領域あるいは軽鎖定常領域を有する、〔７〕または〔８〕に記載の抗体、
〔１０〕 一本鎖ポリペプチドのC末端側に検出用配列を有する、〔７〕〜〔９〕のいずれかに記載の抗体、
〔１１〕 小胞体でタンパク質合成後にサイトゾルに逆輸送されることを特徴とする、〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載の抗体、
〔１２〕 ユビキチン化およびプロテアソーム分解されずにサイトゾルで発現することを特徴とする、〔７〕〜〔１１〕のいずれかに記載の抗体、
〔１３〕 細胞内発現抗体（イントラボディー）である、〔７〕〜〔１２〕のいずれかに記載の抗体、
〔１４〕 サイトゾルタンパク質に結合し、該タンパク質の機能を特異的に阻害することを特徴とする、〔７〕〜〔１３〕のいずれかに記載の抗体、
〔１５〕 サイトゾルタンパク質が、T細胞あるいはB細胞において発現するタンパク質である、〔１４〕に記載の抗体、
〔１６〕 サイトゾルタンパク質が、サイトゾルで機能するタンパク質であって、アダプタータンパク質、キナーゼタンパク質、酵素、あるいは細胞骨格タンパク質からなる群より選択されるタンパク質である、〔１４〕または〔１５〕に記載の抗体、
〔１７〕 〔７〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体を発現し、サイトゾルタンパク質の機能が阻害されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物、
〔１８〕 〔７〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、サイトゾルタンパク質機能阻害剤、
〔１９〕 〔７〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、サイトゾルタンパク質の機能解析用キット、
〔２０〕 〔７〕〜〔１６〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、サイトゾルタンパク質の機能解析用試薬、に関する。
本発明は、シグナル伝達経路におけるタンパク質の機能解析のみならず、抗キナーゼ抗体や抗リン酸化部位抗体のサイトゾル発現によるファンクショナル・プロテオミックスに応用ができ、ポストゲノムにおけるタンパク質の機能解析法のツールとして利用できる。
一方、本発明はリンパ球（造血系を含む）へのscFv遺伝子導入による遺伝子治療やエイズの治療にも利用可能である。またタンパク質機能ノックダウン生物の作製および感染症抵抗性生物の作出にも利用できる。さらに本発明によって作製されるscFvトランスジェニックマウスのリンパ球およびその他の細胞種を用い、細胞特異的小胞体管理機構の差異を明らかとすることにより、本発明で明らかとなった分解されないERからサイトゾルへの逆転送(retro-translocation)機構解明により、アミロイド病やプリオン病などのタンパク質分解異常あるいはタンパク質変性異常などタンパク質病の原因解明と治療法の開発研究に利用可能である。
本発明者らによって、抗サイトゾルタンパク質抗体における重鎖可変領域（VH）あるいは軽鎖可変領域（VL）に含まれるいずれかのシグナルペプチド（リーダー配列）を残し、各可変領域をリンカーペプチドで結合し一本鎖抗体（single chain Fv；scFv）を作成したところ、サイトゾルにて該一本鎖抗体が発現し、該サイトゾルタンパク質と会合して該サイトゾルタンパク質の機能を阻害することが初めて示された。
すなわち本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）に記載の一本鎖抗体を細胞内で発現させることを特徴とする、サイトゾルタンパク質の機能を阻害する方法を提供する。
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーペプチドを有する一本鎖抗体
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーペプチドを有する一本鎖抗体
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーペプチドを有する一本鎖抗体
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーペプチドを有する一本鎖抗体
本発明において、「サイトゾルタンパク質」とは、サイトゾル（細胞質ゾル）で機能するタンパク質である。好ましくは、リンパ球において発現するタンパク質であり、さらに好ましくはT細胞あるいはB細胞において発現するタンパク質である。また本発明におけるサイトゾルタンパク質は、アダプタータンパク質、キナーゼタンパク質、酵素、あるいは細胞骨格タンパク質からなる群より選択されるタンパク質である。
「アダプタータンパク質」とは、タンパク質−タンパク質相互作用のうち、触媒ドメインなど機能的なドメインを持たず、結合モジュールのみを複数有するタンパク質を指す。「キナーゼタンパク質」とは、細胞内の種々の機能を調節する過程におけるタンパク質のリン酸化反応を触媒する酵素タンパク質を指す。「細胞骨格タンパク質」とは、細胞の内部で互いに重合し、フィラメントと呼ばれる非常に長い繊維構造を構築し細胞の空間的骨組みを形作るタンパク質を指す。
つまり本発明は、これらのサイトゾルタンパク質の機能を阻害する方法に関する。
本発明における「抗サイトゾルタンパク質抗体」とは、サイトゾルタンパク質に結合する抗体を意味する。また本発明の一本鎖抗体には、通常、抗サイトゾルタンパク抗体のVHおよびVLが含まれ、これらの領域は単一のポリペプチド鎖中に存在する。本発明の一本鎖抗体は、サイトゾルタンパク質抗体のVH及びVLを含み、さらに該VHあるいは該VLのいずれかのシグナルペプチドを含んでいることが好ましい。
「Fv」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。「Fv」断片は1つのVHおよびVLが非共有結合により強く連結されたダイマー（VH-VLダイマー）である。各可変領域の3つの相補鎖決定領域（complementarity determining region；CDR）が相互作用し、VH-VLダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。6つのCDRが抗体に抗原結合部位を付与している。しかしながら、1つの可変領域（または、抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分）であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
一般に、最小の抗体断片であり完全な抗原認識部位と結合部位を含むFvポリペプチドは、さらにVHおよびVLの間にポリペプチドリンカーを含んでおり、これによりscFvは、抗原結合のために必要な構造を形成することができる（scFvの総説については、Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal Antibodies』Vol.113（Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp.269-315, 1994）を参照）。本発明におけるリンカーペプチドは、その両端に連結された抗体可変領域の発現を阻害するものでなければ特に限定されない。
リンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のリンカーペプチド、又は合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996参照に開示されるリンカー）等を用いることができるが、本発明においてはリンカーペプチドが好ましい。リンカーペプチドの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、1〜100アミノ酸、好ましくは1〜50アミノ酸、更に好ましくは1〜30アミノ酸、特に好ましくは12〜18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。
但し、リンカーペプチドの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。本発明において好ましく用いられるリンカーペプチドは、（Gly4 Ser）3 （配列番号：９）のリンカーペプチドである。
合成化学物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）などであり、これらの架橋剤は市販されている。化学架橋の代わりにFosやJunなどに由来するロイシンジッパーを用いることも出来る。
複数の抗体可変領域を結合する場合には、通常、複数のリンカーが必要となるが、全て同じリンカーを用いてもよいし、異なるリンカーを用いてもよい。例えばdiabody（ダイアボディ）あるいはsc(Fv)2のような低分子化抗体を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し、抗体断片を生成させるか、又はこれら抗体断片をコードするDNAを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976参照）。
本発明の一本鎖抗体におけるVHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入がされていてもよい。さらに抗原であるサイトゾルタンパク質への結合能を有する限り、VH又は/及びVLの一部を欠損させてもよい。また、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。本発明における一本鎖抗体以外に、サイトゾルタンパク質の機能を阻害する効果を有する抗体としては、本発明の一本鎖抗体の構造を少なくとも有する抗体であれば特に制限されない。具体例として、例えば、ダイアボディ、sc(Fv)2（single chain (Fv)2）、sc(Fv)2の構造異性体であるsingle chain diabody型とbivalent scFv型などを挙げることができる。
ダイアボディは、遺伝子融合により構築された二価(bivalent)の抗体断片を指す。ダイアボディは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、通常、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中でVL及びVHが、互いに結合できない位に短い、例えば、5残基程度のリンカーにより結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、その間のリンカーが短いため単鎖可変領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、ダイアボディは2つの抗原結合部位を有することとなる。
sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である。sc(Fv)2は、例えば、本発明のscFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。sc(Fv)2は、VH、VL、およびリンカー以外のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
また、例えば、少なくとも2種類の異なるサイトゾルタンパク質に対して特異的に結合することができる、本発明の一本鎖抗体の構造を含む抗体（多重特異性抗体）を作成する場合、上記ダイアボディおよびsc(Fv)2を利用することができる。
例えば、上記ダイアボディにおいて、２つのサイトゾルタンパク質（抗原）に対して特異的に結合することができる二種特異性抗体を作製し得る。二種特異性ダイアボディは二つのcross-over scFv断片のヘテロダイマーである。つまり二種の抗体A,B由来のVHとVLを5残基前後の比較的短いリンカーで結ぶことによって作製されたVH (A)-VL (B), VH (B)-VL (A)を用いてヘテロダイマーを構成することによって出来る（Holliger P et al. Proc of the National Academy of Sciences of the USA 1993, 90: 6444-6448）。
この際、二種のscFvを15残基程度の柔軟な比較的長いリンカーで結ぶ（一本鎖ダイアボディ）、適当なアミノ酸置換(knobs-into-holes: Zhu Z et al. Protein Science. 1997, 6: 781-788)を行うことによって目的の構成を促進させることも出来る。
二種のscFvを15残基程度の柔軟な比較的長いリンカーで結ぶことによって作製できるsc(Fv) 2も、上記二種特異性抗体となり得る。
また、sc(Fv)2が、[可変領域１](リンカー１)[可変領域２](リンカー２)[可変領域３](リンカー３)[可変領域４]の順で並んでいる場合、本発明においてbivalent scFv型とは、可変領域１と可変領域２が会合し、かつ可変領域３と可変領域４が会合した状態の構造を有するsc(Fv)2をいう。本発明においてsingle chain diabody型とは可変領域1と可変領域4が会合し、かつ可変領域2と可変領域3が会合した状態の構造を有するsc(Fv)2のことをいう。このような型のsc(Fv)2も、本発明の一本鎖抗体の構造を有する抗体として挙げられる。
本発明において、「異なるサイトゾルタンパク質」とは必ずしもサイトゾルタンパク質自体が異なる必要はなく、抗原決定基が異なる場合等も本発明の「異なるサイトゾルタンパク質」に含まれる。従って、例えば、単一分子内の異なる抗原決定基も本発明の異なるサイトゾルタンパク質に含まれ、このような単一分子内の異なる抗原決定基を各々認識する抗体は、本発明において異なる抗原を認識する抗体として扱われる。
抗サイトゾルタンパク質抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然のサイトゾルタンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントサイトゾルタンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、サイトゾルタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、サイトゾルタンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、サイトゾルタンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、サイトゾルタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
本発明の「抗サイトゾルタンパク質抗体」は、サイトゾルタンパク質に結合する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のほかに、遺伝子改変抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体など）、低分子化抗体（抗体断片も含む）、多特異性抗体等、さらに抗体修飾物が含まれる。低分子化抗体は、全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。抗サイトゾルタンパク抗体における可変領域は、可変領域の全長でもよいが、抗原への結合活性を維持する限り可変領域の部分配列でもよい。又、可変領域中のアミノ酸配列を置換、欠失、付加、挿入などがされていてもよい。例えば、抗原性を低下させるために、キメラ化やヒト化されていてもよい。
ヒト抗体の取得方法は既に知られており、例えば、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を目的の抗原で免疫することで目的のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。
遺伝子改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。具体的には、たとえばキメラ抗体は、免疫動物の抗体のH鎖、およびL鎖の可変領域と、ヒト抗体のH鎖およびL鎖の定常領域からなる抗体である。免疫動物由来の抗体の可変領域をコードするDNAを、ヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによって、キメラ抗体を得ることができる。
ヒト化抗体は、再構成（reconstructed）ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のCDRを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAを、ヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 96/02576参照）。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato K et al, Cancer Research 1993, 53: 851-856）。また、様々なヒト抗体由来のフレームワーク領域に置換してもよい（国際特許出願公開番号WO 99/51743参照）。
抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
抗サイトゾルタンパク質抗体取得の感作抗原として使用される本発明のサイトゾルタンパク質は、ヒト、マウス、ラットなど、その由来となる動物種に制限されない。例えば、哺乳動物由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。
本発明において、抗サイトゾルタンパク質抗体取得の感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（N）末端断片やカルボキシ（C）末端断片が挙げられる。本明細書における「抗サイトゾルタンパク質抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久***能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
また本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）に記載の一本鎖抗体をサイトゾルで発現させ、該サイトゾルタンパク質の機能を阻害し、該サイトゾルタンパク質の機能を解析することを特徴とする、サイトゾルタンパク質の機能解析方法を提供する。
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーペプチドを有する、一本鎖抗体
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーペプチドを有する、一本鎖抗体
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーペプチドを有する、一本鎖抗体
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーペプチドを有する、一本鎖抗体
さらに本発明は、上記サイトゾルタンパク質の機能阻害方法によって、該サイトゾルタンパク質の機能を阻害した結果、細胞、組織、あるいは個体に現れる表現型の変化を解析することを特徴とする、サイトゾルタンパク質の機能解析方法を提供する。
サイトゾルタンパク質の機能を阻害した結果現れる指標として、細胞、組織、あるいは個体に現れる表現型の変化が挙げられ、これらの指標を元にしてサイトゾルタンパク質の機能解析を行うことができる。細胞系の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び／又は質的変化、増殖活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化等がある。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、mRNA等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び／又は突起の数の変化、偏平度の変化、伸長度／縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変化、細胞集団としての異形性／均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。これらの形態の変化は検鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、足場依存性、サイトカイン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性としては、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、酵素活性、mRNA量、Ca2+やcAMP等の細胞内情報伝達物質量、細胞内タンパク質量等を用いることができる。組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。生体系の指標としては組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変化、タンパク質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、血圧、心拍数の変化等を用いることができる。
これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなく、吸光、発光、発色、蛍光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動、等を用いることができる。これらの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて、適宜選択することができる。例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発光はルミノメータ等、蛍光はフルオロメータ等で測定することができる。質量は質量分析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度はBEACON（宝酒造）、表面プラズモン共鳴シグナルはBIACORE、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などはARVOなどにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。これらの測定方法は、一つの測定方法で2種以上の検出指標を測定しても良く、簡便であれば、2種以上の測定を同時及び／又は連続して測定することによりさらに多数の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を同時にフルオロメータで測定することができる。
さらに本発明は、サイトゾルタンパク質の機能を特異的に阻害する特徴を有する一本鎖抗体の製造方法を提供する。本製造方法の好ましい態様としては、以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む製造方法である。
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を単離する工程
（ｂ）該軽鎖可変領域からシグナルペプチドをコードする配列を除去し、さらに該重鎖可変領域および該軽鎖可変領域を結合するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいは
該重鎖可変領域からシグナルペプチドをコードする配列を除去し、さらに該軽鎖可変領域および該重鎖可変領域を結合するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製する工程
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを含むベクターを作製する工程
（ｄ）前記ベクターを宿主細胞に導入する工程
（ｅ）前記宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から産生させた抗体を回収する工程
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を単離する工程
（ｂ）該軽鎖可変領域からシグナルペプチドをコードする配列を除去し、さらに該重鎖可変領域および該軽鎖可変領域を結合するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいは
該重鎖可変領域からシグナルペプチドをコードする配列を除去し、さらに該軽鎖可変領域および該重鎖可変領域を結合するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製する工程
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを含むベクターを作製する工程
（ｄ）前記ベクターを宿主細胞に導入する工程
（ｅ）前記宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から産生させた抗体を回収する工程
本製造方法においては、まず抗サイトゾルタンパク質抗体のVHをコードする遺伝子およびVLをコードする遺伝子を単離する。
次いで、該VLからシグナルペプチドをコードする配列を除去し、さらに該VHおよび該VLを結合するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいは該VHからシグナルペプチドをコードする配列を除去し、さらに該VLおよび該VHを結合するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製する。該製造方法において、各可変領域からシグナルペプチドをコードする配列の除去は、当業者に公知の方法によって行うことができる。
上記ポリヌクレオチドは、抗サイトゾルタンパク質抗体のVHあるいはVLに含まれるシグナルペプチド、シグナルペプチドを含まないVHおよびVLをコードする限り、特に限定されず、複数のデオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）等の塩基または塩基対からなる重合体である。天然以外の塩基を含んでいてよい。
次いで、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを作成する。通常、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。
本発明のベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。
本発明のベクターとしては、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明のベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMTV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
本方法においては次いで、該ベクターを宿主細胞に導入する。ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。宿主細胞は、例えば、本発明の一本鎖抗体もしくはポリペプチドのの製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
宿主細胞として使用できる真核細胞として、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞が挙げられる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108, 945）、COS、3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero等、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340）、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が例示される。本発明においては、CHO-DG44、CHO-DXB11、COS7細胞、BHK細胞が好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、この細胞をカルス培養する方法により本発明の一本鎖抗体を産生させることができる。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）等を用いたタンパク質発現系が公知であり、本発明の抗体産生の宿主として利用できる。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌を用いた産生系が知られており、本発明の抗体産生に利用できる。
本方法においては次いで上記宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から産生させた抗体を回収する。目的とするポリヌクレオチドを含む発現ベクターによりにより形質転換された宿主細胞を培養することにより、抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、FBS、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養により細胞を培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするポリヌクレオチドを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702）。
また、本発明の抗体を産生させる昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得ることができる（Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。
さらに、植物を本発明の抗体産生に使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする抗体をコードするポリヌクレオチドを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得ることができる（Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138）。
このようにして得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地、乳汁など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。
なお必要に応じ、抗体の精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
さらに本発明は、機能性抗体の探索方法を提供する。本発明の探索方法の好ましい態様においては、サイトゾルタンパク質の発現量または活性を指標とする方法である。即ち、サイトゾルタンパク質の発現量または活性を変化させる抗体は、サイトゾルタンパク質の機能を変化させることが期待される。
本発明の上記方法においては、まず抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含むVH、シグナルペプチドを含まないVL、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体、あるいは抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含むVL、シグナルペプチドを含まないVH、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体を、サイトゾルタンパク質を発現する細胞において発現させる。
本方法に用いる「細胞」は、特に制限されないが、好ましくは哺乳動物由来の細胞であり、さらに好ましくはマウスおよびヒト由来の細胞である。
また本方法に用いる一本鎖抗体は、必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
上記方法において、上記一本鎖抗体のサイトゾルタンパク質発現細胞における発現は、例えば該一本鎖抗体を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことができる。
本方法においては、次いで、サイトゾルタンパク質を発現する細胞におけるサイトゾルタンパク質の発現量または活性を測定する。発現量の測定は、当業者が簡便に行ない得るものであり、一般的な方法、例えばノーザンブロット法、ウェスタンブロット法等により適宜実施することが可能である。例えば、サイトゾルタンパク質を発現する細胞に発現させた一本鎖抗体に付した標識を指標にして測定することも可能である。
尚、本発明において「発現」とは、タンパク質をコードする遺伝子からの転写（mRNAの生成）、または該遺伝子の転写産物からの翻訳のいずれの場合をも意味する。
サイトゾルタンパク質の活性の測定は、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することができる。一例を示せば、リン酸化活性測定、リン酸化チロシン検出、細胞増殖アッセイ、サイトカイン定量、免疫沈降法によるタンパク会合検出の方法によって、適宜測定することができる。
本方法においては、次いで、前記一本鎖抗体を接触させない場合と比較して、サイトゾルタンパク質の発現量または活性を変化させる一本鎖抗体を選択する。本方法により単離される一本鎖抗体は、サイトゾルタンパク質の機能を変化させる機能性抗体であり、サイトゾルタンパク質の機能解析のために有用である。
さらに本発明は、本発明の一本鎖抗体が導入されていることを特徴とする、サイトゾルタンパク質の機能が阻害された遺伝子改変非ヒト動物細胞（本明細書においては、「遺伝子改変非ヒト動物細胞」あるいは単に「遺伝子改変細胞」と記載する場合あり）を提供する。
本発明者らは、本発明の一本鎖抗体を導入した遺伝子改変マウスの解析を行うことで、本発明の一本鎖抗体の導入がによってサイトゾルタンパク質の発現が阻害されることを見出した。本発明の遺伝子改変非ヒト動物細胞は、例えばサイトゾルタンパク質の機能を特異的に阻害する薬剤のスクリーニングに用いることが可能であり、遺伝子改変した各種非ヒト細胞におけるscFvの細胞内局在化を解析することによりERの品質管理機構を解析する素材として有用である。
本発明のサイトゾルタンパク質の機能が阻害された非ヒト動物細胞を生産する好ましい態様として、例えば以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む方法を挙げることができる。
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体、あるいは抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルぺプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを非ヒト動物に導入する工程
（ｂ）前記抗体をコードするポリヌクレオチドが導入された非ヒト動物細胞を選択する工程
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体、あるいは抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルぺプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを非ヒト動物に導入する工程
（ｂ）前記抗体をコードするポリヌクレオチドが導入された非ヒト動物細胞を選択する工程
本発明における「非ヒト動物」とは、ヒトを含まない脊椎動物や無脊椎動物を意味する。遺伝子改変技術を用いて遺伝子の発現を人為的に改変するのに適した非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物や昆虫等が挙げられるが、より好適には、非ヒト哺乳動物（例えば、マウスやラットなどのげっ歯類）であり、最も好ましくはマウスである。
遺伝子改変動物の作製は、例えば次にようにして行うことができる。まず、抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含むVH、シグナルペプチドを含まないVL、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体、あるいは抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルぺプチドを含むVL、シグナルペプチドを含まないVH、および該可変領域を結合するリンカーぺプチドを有する一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを作製する。
構築したベクターを、個体へ分化させることが可能な非ヒト動物細胞（例えば、胚性幹細胞（ES細胞））に導入し、遺伝子改変非ヒト動物細胞を作製する。ベクターの細胞への導入は、当業者に公知の方法によって行うことができる。具体的には、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法等を例示することができる。
次いで、本方法においては前記抗体をコードするポリヌクレオチドが導入された非ヒト動物細胞を選択する。個体へ分化させることが可能な動物細胞としてES細胞を用いた場合は、例えば、該細胞を胚盤胞に注入することによりキメラ胚を作製し、偽妊娠させた動物の子宮に移植して産仔を得る。遺伝子改変ES細胞由来の組織を有するキメラ動物を選別できるようにするために、より好適には、作製された個体の外部的特徴（例えば、毛色）が、遺伝子改変ES細胞由来の組織と胚盤胞由来の組織とで異なるように、胚盤胞を選択する。また、遺伝子改変ES細胞由来の生殖組織を有するキメラ動物であるか否かの判定は、一般的には、該キメラ哺乳動物と適当な系統の同種哺乳動物との交配により得られた仔の毛色で行うが、その他の方法として、例えば、該キメラ哺乳動物の生殖細胞から抽出したDNAを鋳型としたPCR反応を行い、挿入された遺伝子の有無を検出する方法を用いることも可能である。
該キメラ動物と適当な系統の同種動物との交配により得られた仔が、ヘテロ接合型遺伝子改変動物であるか否かは、例えば、該動物細胞から抽出したDNAを鋳型とするPCRやサザンハイブリダイゼーションで判定することができる。また、ヘテロ接合型遺伝子改変動物同士の交配により、ホモ接合型遺伝子改変動物細胞を作製することができる。交配により得られた細胞が、ホモ接合型遺伝子を有する改変動物細胞であるか否かも上記の判定法に従い実施することができる。
遺伝子改変動物細胞の作製は、上記の方法に制限されない。例えば、体細胞クローン動物の作製技術に従って遺伝子改変非ヒト動物細胞を作製することもできる。具体的には、ES細胞以外の体細胞（例えば、皮膚細胞等）を用いて、ES細胞の場合と同様な方法に従って遺伝子改変動物細胞を作製することができる。
さらに本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）の各可変領域がリンカーぺプチドで結合された構造の一本鎖ポリペプチドである抗体を提供する。
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域
（以下、本明細書において「一本鎖ポリペプチドである抗体」を、「一本鎖抗体」と記載する場合がある。）
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、シグナルペプチドを含まない重鎖可変領域
（以下、本明細書において「一本鎖ポリペプチドである抗体」を、「一本鎖抗体」と記載する場合がある。）
本発明においては、VHおよびVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH-リンカーペプチド-VL、あるいはVL-リンカーペプチド-VHの順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。VHおよびVLには、本来シグナルペプチドが含まれているが、本発明の抗体は、VHまたはVLのどちらかのシグナルペプチドを残し、もう一方の鎖のシグナルペプチドは除去することを特徴とする抗体である。例えば、本発明においては、以下のような配置を挙げることができる。
[シグナルペプチドを含むVH]-[リンカー]-[シグナルペプチドを含まないVL]
[シグナルペプチドを含むVL]-[リンカー]-[シグナルペプチドを含まないVH]
[シグナルペプチドを含むVL]-[リンカー]-[シグナルペプチドを含まないVH]
すなわち本発明は、抗サイトゾルタンパク質抗体におけるVHおよびVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を起点として、以下の（ａ）または（ｂ）に記載の順に並んでいることを特徴とする、一本鎖ポリペプチドである抗体を提供する。
（ａ）シグナルペプチドを含むVH、リンカーペプチド、シグナルペプチドを含まないVL
（ｂ）シグナルペプチドを含むVL、リンカーペプチド、シグナルペプチドを含まないVH
（ａ）シグナルペプチドを含むVH、リンカーペプチド、シグナルペプチドを含まないVL
（ｂ）シグナルペプチドを含むVL、リンカーペプチド、シグナルペプチドを含まないVH
さらに本発明は、シグナルペプチドを含まないVHあるいはシグナルペプチドを含まないVLのC末端側に軽鎖定常領域（CL）あるいは重鎖定常領域(CH)を有する、一本鎖ポリペプチドである抗体を提供する。
さらに本発明は、上記本発明の一本鎖ポリペプチドのC末端側に検出用配列を有する、一本鎖ポリペプチドである抗体に関する。検出用配列としては、特に制限されないが、例えばMyc-tag配列を用いることができる。
例えば、以下の
「シグナルペプチドを含むVH、リンカーペプチド、シグナルペプチドを含まないVL、CL、Myc-tag」
という構造からなる一本鎖抗体の一例として、実施例に記載された#21SHL-CLの塩基配列を配列番号：１に、アミノ酸配列を配列番号：２に示す。配列番号：１に記載の塩基配列において、１〜６位はベクター構築およびインフレームにするための挿入した配列、13〜69位はVHのシグナルペプチド、13〜429位はシグナルペプチドを含むVH、430〜474位はリンカーペプチド、475〜813位はシグナルペプチドを含まないVL、814〜822位はベクター構築およびインフレームにするために挿入した配列、823〜1140位はCL、1141〜1148位はベクター構築およびインフレームにするために挿入した配列、1156〜1185位はMyc-tagを指す。図６にも、#21SHL-CLの配列を示す。
「シグナルペプチドを含むVH、リンカーペプチド、シグナルペプチドを含まないVL、CL、Myc-tag」
という構造からなる一本鎖抗体の一例として、実施例に記載された#21SHL-CLの塩基配列を配列番号：１に、アミノ酸配列を配列番号：２に示す。配列番号：１に記載の塩基配列において、１〜６位はベクター構築およびインフレームにするための挿入した配列、13〜69位はVHのシグナルペプチド、13〜429位はシグナルペプチドを含むVH、430〜474位はリンカーペプチド、475〜813位はシグナルペプチドを含まないVL、814〜822位はベクター構築およびインフレームにするために挿入した配列、823〜1140位はCL、1141〜1148位はベクター構築およびインフレームにするために挿入した配列、1156〜1185位はMyc-tagを指す。図６にも、#21SHL-CLの配列を示す。
また、本発明には、上記のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入され、かつ本発明の一本鎖抗体と機能的に同等の活性を有する抗体も含まれる。
ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が本発明の一本鎖抗体と同様の生物学的あるいは生化学的活性を有することを指す。このような活性としては、例えば、サイトゾルタンパク質の機能阻害活性を例示することができる。
あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内）であると考えられる。
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413 ）。
本発明の抗体のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された抗体には、これら抗体を含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、これら抗体と他のペプチド又はタンパク質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein C の断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
本発明の抗体は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、本発明の抗体と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明の抗体はこのような抗体も包含する。
また本発明の一本鎖抗体は、抗サイトゾルタンパク質抗体における重鎖可変領域あるいは軽鎖可変領域に含まれるシグナルペプチドを残すことで、T細胞においてタンパク合成される場である小胞体からサイトゾルに逆輸送されることが本発明者らによって確認された。また、該抗体はユビキチン／プロテアソーム系の分解を受けずにサイトゾルで発現することが確認された。
すなわち本発明は、小胞体でタンパク質合成後にサイトゾルに逆輸送されることを特徴とする、一本鎖ポリペプチドである抗体を提供する。さらに本発明は、ユビキチン化およびプロテアソーム分解されずにサイトゾルで発現することを特徴とする、一本鎖ポリペプチドである抗体を提供する。従来、小胞体内に一本鎖抗体を留めるために、リテンション配列と呼ばれる配列（例えば、KDELのような配列）を、一本鎖抗体をコードするポリペプチドのC末端側に付加している。本発明においては、上記本発明の一本鎖ポリペプチドである抗体をサイトゾルで発現させるために、リテンション配列は付加しないことが好ましい。
すなわち本発明は、小胞体でタンパク質合成後にサイトゾルに逆輸送されることを特徴とする、一本鎖ポリペプチドである抗体を提供する。さらに本発明は、ユビキチン化およびプロテアソーム分解されずにサイトゾルで発現することを特徴とする、一本鎖ポリペプチドである抗体を提供する。従来、小胞体内に一本鎖抗体を留めるために、リテンション配列と呼ばれる配列（例えば、KDELのような配列）を、一本鎖抗体をコードするポリペプチドのC末端側に付加している。本発明においては、上記本発明の一本鎖ポリペプチドである抗体をサイトゾルで発現させるために、リテンション配列は付加しないことが好ましい。
また本発明によって提供される一本鎖抗体は、細胞内で発現する抗体（細胞内発現抗体；イントラボディー）である。また本発明は、サイトゾルタンパク質に結合し、該タンパク質の機能を特異的に阻害する特徴を有する一本鎖抗体を提供する。
また本発明は、本発明の一本鎖抗体を発現し、サイトゾルタンパク質の発現が阻害されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物（本明細書においては、「トランスジェニック動物」、「Tg動物」、「Tg」、「遺伝子改変非ヒト動物」、「ノックアウト動物」、「ノックダウン動物」と記載する場合あり）を提供する。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、例えばサイトゾルタンパク質の発現を抑制するための薬剤のスクリーニングに用いることが可能である。例えば、本発明の一本鎖抗体の発現が変化している動物は、該一本鎖抗体の遺伝子の発現レベルを正常に戻す作用を有する物質のスクリーニングに利用することができる。
また本発明は、上記本発明の抗体を有効成分として含有する、サイトゾルタンパク質機能阻害剤を提供する。本発明の上記抗体は、サイトゾルタンパク質と結合することにより、該タンパク質の機能を阻害する。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
さらに本発明は、上記本発明の抗体を有効成分として含有する、サイトゾルタンパク質の機能解析用キット、および機能解析用試薬を提供する。本発明のキットには、標識の検出に用いられる試薬、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
また本発明は、本発明の抗体を含有する医薬組成物を提供する。本発明の抗体を含有する医薬組成物は自己免疫疾患あるいはアレルギー疾患などの治療および／または予防に有用である。
本発明の抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80（TM）、HCO-50と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001〜100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により制限されるものではない。
〔実施例１〕 抗WASP-EVH1モノクローナル抗体遺伝子のVH、VLおよびCL領域のクローニングとscFv遺伝子発現ベクターの構築
GST-融合タンパク発現法により、EVH1ドメインタンパク質を生産し、定法に従いマウスモノクローナル抗体(mAb)を作製した。ハイブリドーマ細胞よりRNAを抽出精製し、SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech, Palo Alto,CA）のマニュアルに従いcDNAを作製した。抗体のサブクラスを同定した後、cDNAから以下のプライマーセットを用いPCRによりDNA断片を増幅した。VH領域はIgG3に対するセンスプライマー5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’（配列番号：３）およびアンチセンスプライマー5’-GTACTGGGCTTGGGTATTCTAGGCTC-3’（配列番号：４）、またIgG2bに対するセンスプライマー5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCG-3’（配列番号：５）およびアンチセンスプライマー5’-GGACAGGGGTTGATTGTTGAAATGGG-3’（配列番号：６）、κ鎖VL領域はセンスプライマー5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’（配列番号：７）およびアンチセンスプライマー5’-CCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGGTG-3’（配列番号：８）を用いた。
GST-融合タンパク発現法により、EVH1ドメインタンパク質を生産し、定法に従いマウスモノクローナル抗体(mAb)を作製した。ハイブリドーマ細胞よりRNAを抽出精製し、SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech, Palo Alto,CA）のマニュアルに従いcDNAを作製した。抗体のサブクラスを同定した後、cDNAから以下のプライマーセットを用いPCRによりDNA断片を増幅した。VH領域はIgG3に対するセンスプライマー5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’（配列番号：３）およびアンチセンスプライマー5’-GTACTGGGCTTGGGTATTCTAGGCTC-3’（配列番号：４）、またIgG2bに対するセンスプライマー5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCG-3’（配列番号：５）およびアンチセンスプライマー5’-GGACAGGGGTTGATTGTTGAAATGGG-3’（配列番号：６）、κ鎖VL領域はセンスプライマー5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’（配列番号：７）およびアンチセンスプライマー5’-CCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGGTG-3’（配列番号：８）を用いた。
増幅したDNA断片をpGEM-T Easy Vector（Promega）のTA-クローニングサイトに挿入しクローニングを行った。塩基配列決定を行い、クローニングDNA配列にVHおよびVLそれぞれの5’末端のリーダー配列またVH配列の後のCH1配列およびVL配列の後のCL配列を同定した。VHおよびVLフラグメントをペプチドリンカー(Gly4Ser)3で結合させた各種一本鎖抗体（scFv）遺伝子を構築し、N末端にはMycタグ配列をつないだ（図１）。それらscFv遺伝子を動物細胞発現ベクターpCAGGSのマルチクローニングサイト（MCS）に挿入した。
〔実施例２〕 培養細胞へのトランスフェクションとトランスジェニックマウスの作製
T細胞株DO-11.10は1.25% DMSOを含む培地でエレクトロポレーション法により、またNIH-3T3細胞株へはFuGENE6トランスフェクション試薬（Roche）により、それぞれscFv遺伝子発現ベクターをトランスフェクトした。また定法に従いC57BL/6Jマウスの受精卵前核へのマイクロインジェクション法によりscFv遺伝子発現ベクターを注入し、疑似妊娠ICR雌マウスの子宮に移植しトランスジェニック（Tg）マウスを得た。
T細胞株DO-11.10は1.25% DMSOを含む培地でエレクトロポレーション法により、またNIH-3T3細胞株へはFuGENE6トランスフェクション試薬（Roche）により、それぞれscFv遺伝子発現ベクターをトランスフェクトした。また定法に従いC57BL/6Jマウスの受精卵前核へのマイクロインジェクション法によりscFv遺伝子発現ベクターを注入し、疑似妊娠ICR雌マウスの子宮に移植しトランスジェニック（Tg）マウスを得た。
構築した種々のscFv遺伝子をT細胞株DO-11.10細胞にトランスフェクトし24時間培養後、細胞抽出液のSDS-PAGEをウエスタンブロットで解析した結果、２種類（#18および#21）のハイブリドーマ由来のリーダー配列を有するVHにリーダー配列を除去したVLをリンカーでつないだscFv遺伝子(SHL)、およびCL配列を有する遺伝子(SHL-CL)のトランスフェクションで十分なscFv抗体が検出された。一方、リーダー配列を欠いたscFv遺伝子(HLおよびHL-CL)ではscFv抗体は検出できなかなった（図は示さず）。
#18および#21のscFvのアミノ酸配列を比較した図を、図７に示す。
〔実施例３〕 GST融合タンパク結合活性測定
scFv遺伝子トランスフェクト細胞およびTgマウス細胞の細胞抽出液を調整し、GST融合EVH1タンパク質結合グルタチオンセファロースビーズと4℃で一昼夜反応させた後、ビーズを洗浄しSDSサンプルバッファーで溶解後、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行い、結合しているscFv量を抗Mycタグ抗体によるウエスターンブロット法で定量を行った。
結果、#21ハイブリドーマ由来の構築scFv遺伝子 (21SHLおよび21SHL-CL)トランスフェクトの発現抗体がEVH1タンパクドメインと結合活性を示した（図は示さず）。
scFv遺伝子トランスフェクト細胞およびTgマウス細胞の細胞抽出液を調整し、GST融合EVH1タンパク質結合グルタチオンセファロースビーズと4℃で一昼夜反応させた後、ビーズを洗浄しSDSサンプルバッファーで溶解後、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行い、結合しているscFv量を抗Mycタグ抗体によるウエスターンブロット法で定量を行った。
結果、#21ハイブリドーマ由来の構築scFv遺伝子 (21SHLおよび21SHL-CL)トランスフェクトの発現抗体がEVH1タンパクドメインと結合活性を示した（図は示さず）。
〔実施例４〕 免疫沈降法とウエスタンブロット解析
抗WASP-EVH1 scFv（SHL、SHL-CL）を発現するトランスジェニックマウスの脾臓よりT細胞およびB細胞を精製し、それぞれの細胞抽出液を調整した後、抗Myc-tag抗体を用いてウェスタンブロットを行った。
結果、T細胞およびB細胞内で十分な量のscFvの発現が確認された（図２a）。
抗WASP-EVH1 scFv（SHL、SHL-CL）を発現するトランスジェニックマウスの脾臓よりT細胞およびB細胞を精製し、それぞれの細胞抽出液を調整した後、抗Myc-tag抗体を用いてウェスタンブロットを行った。
結果、T細胞およびB細胞内で十分な量のscFvの発現が確認された（図２a）。
抗Myc抗体を用いて免疫沈降させSDS-PAGEをを行い、抗WASP抗体によるウエスタンブロットの結果、細胞内における抗WASP-EVH1 scFvとネイテイブWASPの結合を確認した。（図２b）。さらに、T細胞およびB細胞におけるWASPの発現は同程度であることをウェスタンブロットで確認した（図２c）。
細胞抽出液と抗WASP mAb（Santa Cruz Biotechnology）あるいは抗MycタグmAb（MBL）とインキュベイトした後、scFvとmAbの免疫複合体をプロテインG-セファロースを加え免疫沈降させた。
細胞抽出液あるいは免疫沈降物をSDSサンプルバッファーで溶解し、SDS-PAGEを行い、polyvinylidene difluoride membrane（Bio-Rad）に転写した。フィルターを抗Mycタグ抗体（MBL）、抗WASP抗体（Upstate）、抗RibophorinIあるいは抗Ubiquitin抗体（Santa Cruz Biotecnology）とそれぞれインキュベイトし、二次抗体HRP結合抗マウスあるいは抗ウサギIgG(DAKO)とインキュベイトの後、発色させた。
〔実施例５〕 T細胞受容体シグナル導入とIL-2産生の定量
抗WASP-EVH1 scFv 21SHL TgおよびscFv 21SHL-CL Tgマウス、さらに野生型およびWASPドミナントネガティブTg（WASP-15 Tg）マウスの脾臓よりT細胞を採取し精製を行い、T細胞抗原レセプター（TCR）に対する抗体（抗CD3抗体）で刺激を加え、24時間培養後のT細胞より分泌される培養上清中のIL-2産生に関してELISA法により定量し評価した。
抗WASP-EVH1 scFv 21SHL TgおよびscFv 21SHL-CL Tgマウス、さらに野生型およびWASPドミナントネガティブTg（WASP-15 Tg）マウスの脾臓よりT細胞を採取し精製を行い、T細胞抗原レセプター（TCR）に対する抗体（抗CD3抗体）で刺激を加え、24時間培養後のT細胞より分泌される培養上清中のIL-2産生に関してELISA法により定量し評価した。
その結果、野生型マウスに比べて、抗WASP-EVH1 scFv TgマウスではIL-2の産生が顕著に阻害されていることが明らかとなった（図３-a）。
T細胞株あるいはTgマウス脾臓リンパ球より調整したT細胞を、抗CD3ε抗体でコートした培養プラスチックシャーレで培養しT細胞受容体刺激によるシグナル導入を行った。培養上清をOptEIA セット（BD Pharmingen）を用いたELISA法によりIL-2の定量を行った。
〔実施例６〕 免疫染色とT細胞キャッピング
T細胞受容体（TCR）刺激による細胞骨格再編に関して、TCRのキャッピング反応を指標に確かめた。TCRキャッピングは、TCRシグナル導入により誘発される細胞骨格再編の結果として観察される。T細胞とFITC結合抗CD3ε抗体とを反応させ、共焦点レーザー顕微鏡（Olympus）にてT細胞受容体のキャッピングを蛍光染色により観察した。
T細胞受容体（TCR）刺激による細胞骨格再編に関して、TCRのキャッピング反応を指標に確かめた。TCRキャッピングは、TCRシグナル導入により誘発される細胞骨格再編の結果として観察される。T細胞とFITC結合抗CD3ε抗体とを反応させ、共焦点レーザー顕微鏡（Olympus）にてT細胞受容体のキャッピングを蛍光染色により観察した。
結果、野生型マウスT細胞と同様、TgマウスT細胞で正常であることが確認された（図３b）。これらの結果から、抗WASP-EVH1 scFvイントラボディーはTCR刺激に伴うIL-2産生を特異的に阻害することが示された。
WASPはArp2/3結合ドメインでアクチンフィラメントの重合脱重合を仲介していることが明らかとされている。従来はTCRシグナル導入がWASPを介したアクチン脱重合による細胞骨格再編を誘導し、その結果、シグナル伝達複合体免疫シナプスが形成されIL-2産生が可能となると考えられていたが、EVH1ドメインに対する細胞内発現抗体によりIL-2産生のみを阻害したことからWASP EVH1ドメインがIL-2産生経路に直接機能していることが明らかとなった。またTCRキャッピングが正常であることから、細胞内scFv抗体結合によってもWASPの構造全体に影響を与えないことが示された。すなわち細胞内発現抗体によりタンパク質の標的ドメインのみを特異的に機能阻害することが可能となった。
〔実施例７〕 細胞分画による細胞内発現抗体scFvの細胞内局在
WASPはサイトゾルに存在しアダプターとして機能しているが、抗EVH1 scFvで機能阻害が認められたことから、scFv抗体がサイトゾルに発現していることが示唆された。一方、21SHLおよび21SHL-CL遺伝子は、H鎖のN末端にリーダー配列を有しているので、分泌タンパク質としてmRNAが翻訳されるときにリーダー配列はシグナルペプチドとして小胞体(ER)膜を通過した後、シグナルぺプチダーゼで切断除去される。scFvはERのルーメン内に蓄積し、ゴルジ体およびエンドソームを経由して細胞外に分泌されるものと考えられた。
WASPはサイトゾルに存在しアダプターとして機能しているが、抗EVH1 scFvで機能阻害が認められたことから、scFv抗体がサイトゾルに発現していることが示唆された。一方、21SHLおよび21SHL-CL遺伝子は、H鎖のN末端にリーダー配列を有しているので、分泌タンパク質としてmRNAが翻訳されるときにリーダー配列はシグナルペプチドとして小胞体(ER)膜を通過した後、シグナルぺプチダーゼで切断除去される。scFvはERのルーメン内に蓄積し、ゴルジ体およびエンドソームを経由して細胞外に分泌されるものと考えられた。
細胞内21SHL-CLを精製し、エドマン法によるN末端アミノ酸配列決定を行ったところ、N末端がブロックされていること、またlysyl endopeptidase消化によるペプチド断片のマススペクトル解析から、シグナルペプチド配列が除去されていることが明らかとなった（図表は示していない）。
さらに、抗WASP-EVH1 scFv Tgマウスの脾臓よりT細胞を精製し、それぞれ特異的な溶出バッファーを用いてサイトゾルと膜分画に分離し、抗Myc-tag抗体を用いてscFvの細胞内局在に関して調べた。また、それぞれの分画においてコンタミネーションが無いことを確認するために、WASPとRibopholin Iの抗体を用いてウェスタンブロットを行った。
さらに、繊維芽細胞である培養細胞株NIH-3T3に、H鎖のリーダー配列を持たないscFv 21HL-CLとTgマウスに用いたコンストラクトと同様なリーダー配列を持つscFv 21SHL-CLをトランスフェクトし、上記と同様の方法でサイトゾルと膜分画に分離し、リーダー配列による細胞内局在の影響を見た。T細胞およびNIH-3T3細胞のサイトゾル分画および膜/膜オルガネラ分画の調整は、それぞれProteoExtractTM Subcellular Proteome Extraction Kit(Calbiochem)を用いて行った。各分画のscFv抗体はウエスタンブロットにより検出を行った。
その結果、T細胞の場合は、scFv 21SHLおよび21SHL-CLのどちらのコンストラクトにおいても、サイトゾルに十分な発現が確認された。（図４a）。一方、NIH-3T3細胞の場合は、Tgマウスと同様のリーダー配列をもつscFvは細胞膜分画にのみ発現が検出され、サイトゾルには検出されず、リーダー配列を除去した21HL-CLはサイトゾルにのみに検出された（図４b）。
T細胞における結果は予想外であり、T細胞ではリーダー配列を有するscFvがERで翻訳されシグナルペプチドが除去された後サイトゾルに逆転送(retro-translocation)されることを示している。
〔実施例８〕 ポリユビキチン化／プロテアソーム分解されないT細胞サイトゾルscFv抗体
ERで翻訳合成される分泌タンパク質あるいは膜タンパク質が正常な立体構造を取れなかったりした場合、ERからサイトゾルに逆輸送され、その際にポリユビキチン化されサイトゾルでプロテアソームで分解されることが明らかとされてきた。
ERで翻訳合成される分泌タンパク質あるいは膜タンパク質が正常な立体構造を取れなかったりした場合、ERからサイトゾルに逆輸送され、その際にポリユビキチン化されサイトゾルでプロテアソームで分解されることが明らかとされてきた。
TgマウスT細胞の細胞抽出液を抗Myc抗体で免疫沈降し、サイトゾルのscFvのユビキチン化の有無を抗ユビキチン抗体によるウエスタンブロットにより検討した。詳しくは、抗WASP-EVH1 scFv 21SHL、21SHL-CL Tgマウスの脾臓よりT細胞を精製し、抗Myc抗体で免疫沈降したサンプル（レーン１および２）と細胞抽出液（レーン３および４）をそれぞれ、SDS-PAGEした後、抗Myc抗体と抗ユビキチン（Ub）抗体を用いてウェスタンブロットを行った。
その結果、小胞体（ER；endoplasmic reticulum）からサイトゾル（cytosol）への逆輸送ｂ（retro-translocation）されたscFvはポリユビキチン化されず、プロテアソーム分解系からの影響を逃れ、安定に且つ大量に発現できることが確かめられた。矢印で示されているスメアーな（不鮮明な）バンドは、細胞抽出液中のポリユビキチン化された非特異的なタンパク質である。
Claims (10)
- in vitroまたは非ヒト動物において、以下の（ａ）または（ｂ）に記載の一本鎖抗体をＴ細胞またはＢ細胞内で発現させることを特徴とする、サイトゾルタンパク質の機能を阻害する方法。
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、リンカーペプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖抗体
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、リンカーペプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない重鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖抗体 - in vitroまたは非ヒト動物において、以下の（ａ）または（ｂ）に記載の一本鎖抗体をＴ細胞またはＢ細胞のサイトゾルで発現させ、該サイトゾルタンパク質の機能を阻害し、該サイトゾルタンパク質の機能を解析することを特徴とする、サイトゾルタンパク質の機能解析方法。
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、リンカーペプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖抗体
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、リンカーペプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない重鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖抗体 - 請求項１に記載のサイトゾルタンパク質の機能を阻害する方法による該サイトゾルタンパク質の機能阻害の結果、細胞、組織、あるいは個体に現れる表現型の変化をin vitroまたは非ヒト動物において、解析することを特徴とする、サイトゾルタンパク質の機能解析方法。
- 以下の工程（ａ）〜（ｅ）を含む、Ｔ細胞またはＢ細胞のサイトゾルタンパク質の機能を特異的に阻害する特徴を有する一本鎖抗体の製造方法であって、in vitroまたは非ヒト動物において行われる製造方法。
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を単離する工程
（ｂ）該軽鎖可変領域からシグナルペプチドをコードする配列を除去し、さらに該重鎖可変領域および該軽鎖可変領域を結合するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいは
該重鎖可変領域からシグナルペプチドをコードする配列を除去し、さらに該軽鎖可変領域および該重鎖可変領域を結合するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製する工程
（ｃ）シグナルペプチドを含む重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、リンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び、シグナルペプチドが除去された軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドがN末端側を起点としてこの順で並んでいるポリヌクレオチド、あるいは
シグナルペプチドを含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、リンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び、シグナルペプチドが除去された重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドがN末端側を起点としてこの順に並んでいるポリヌクレオチド、を作製する工程
（ｄ）前記ポリヌクレオチドを含むベクターを作製する工程
（ｅ）前記ベクターをＴ細胞またはＢ細胞に導入する工程 - 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、in vitroまたは非ヒト動物において機能性抗体を探索する方法。
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、リンカーペプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域がＮ末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖抗体、あるいは抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、リンカーペプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない重鎖可変領域がＮ末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖抗体を、サイトゾルタンパク質を発現するＴ細胞またはＢ細胞において発現させる工程
（ｂ）前記細胞における、サイトゾルタンパク質の発現量または活性を測定する工程
（ｃ）前記一本鎖抗体を接触させていない場合と比較して、該サイトゾルタンパク質の発現量または活性を変化させる一本鎖抗体を選択する工程 - 以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、サイトゾルタンパク質の機能が阻害された非ヒト動物Ｔ細胞またはＢ細胞を生産する方法。
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、リンカーペプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖抗体、あるいは抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルぺプチドを含む軽鎖可変領域、リンカーペプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない重鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを非ヒト動物Ｔ細胞またはＢ細胞に導入する工程
（ｂ）前記抗体をコードするポリヌクレオチドが導入され、抗体がサイトゾルで発現されることによって、サイトゾルタンパク質の機能が阻害された非ヒト動物Ｔ細胞またはＢ細胞を選択する工程 - 以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、サイトゾルタンパク質の機能が阻害されたトランスジェニック非ヒト動物を製造する方法。
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、リンカーペプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖抗体、あるいは抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、リンカーペプチド、及び該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない重鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを非ヒト動物に導入する工程
（ｂ）前記抗体をコードするポリヌクレオチドが導入され、抗体がサイトゾルで発現されることによって、サイトゾルタンパク質の機能が阻害された非ヒト動物を選択する工程 - （A）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、リンカーペプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖抗体、または
（B）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、リンカーペプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない重鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖抗体、
をＴ細胞またはＢ細胞内で発現させることを特徴とする、サイトゾルタンパク質の機能を阻害する方法で用いるものである、以下の抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含有する、サイトゾルタンパク質機能阻害剤；
以下の（ａ）または（ｂ）の構造の一本鎖ポリペプチドである抗体であって、Ｔ細胞またはＢ細胞の小胞体におけるタンパク質合成後にシグナルペプチドを失いサイトゾルに輸送され、ユビキチン化およびプロテアソーム分解されずにサイトゾルで発現することを特徴とする抗体；
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、リンカーペプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖ポリペプチド
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、リンカーぺプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない重鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖ポリペプチド。 - 請求項２に記載の方法で用いるものである、以下の抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含有する、サイトゾルタンパク質の機能解析用キット；
以下の（ａ）または（ｂ）の構造の一本鎖ポリペプチドである抗体であって、Ｔ細胞またはＢ細胞の小胞体におけるタンパク質合成後にシグナルペプチドを失いサイトゾルに輸送され、ユビキチン化およびプロテアソーム分解されずにサイトゾルで発現することを特徴とする抗体；
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、リンカーペプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖ポリペプチド
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、リンカーぺプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない重鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖ポリペプチド。 - 請求項３に記載の方法で用いるものである、以下の抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含有する、サイトゾルタンパク質の機能解析用試薬；
以下の（ａ）または（ｂ）の構造の一本鎖ポリペプチドである抗体であって、Ｔ細胞またはＢ細胞の小胞体におけるタンパク質合成後にシグナルペプチドを失いサイトゾルに輸送され、ユビキチン化およびプロテアソーム分解されずにサイトゾルで発現することを特徴とする抗体；
（ａ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む重鎖可変領域、リンカーペプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖ポリペプチド
（ｂ）抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含む軽鎖可変領域、リンカーぺプチド、及び、該抗サイトゾルタンパク質抗体におけるシグナルペプチドを含まない重鎖可変領域がN末端側を起点としてこの順で並んでいる一本鎖ポリペプチド。
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