JP4935969B2 - 酵母カプロン酸高生産株 - Google Patents
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Description
(i) 酵母の脂肪酸合成酵素のFAS1の配列番号1に示す部分アミノ酸配列においてアミノ酸番号7のXaaがグルタミン酸である場合は、アスパラギン酸である場合より、その酵母のカプロン酸生産量が高い。
(ii) FAS1遺伝子の配列番号3に示す部分塩基配列において塩基番号21のnがA又はGであることにより、FAS1タンパク質が配列番号1に示す部分アミノ酸配列においてアミノ酸番号7のXaaがグルタミン酸であるものとなる。
(iii) 清酒酵母、及び焼酎酵母のFAS1は配列番号1に示す部分アミノ酸配列においてアミノ酸番号7のXaaがアスパラギン酸であるが、実験室酵母、ワイン酵母、ウィスキー酵母、パン酵母、上面ビール酵母、ラガービール酵母、蒸留酒酵母、及び酵母基準株は、Xaaがグルタミン酸になった対応する部分アミノ酸配列を有する。
項1. 配列番号1に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号7のXaaがグルタミン酸である部分アミノ酸配列を有するFAS1を備える脂肪酸合成酵素を生産する酵母を変異処理し、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択することにより得られる酵母カプロン酸高生産株。
(I)酵母カプロン酸高生産株、及びその製造方法
本発明の酵母カプロン酸高生産株は、アミノ酸配列(Asn Thr Asp Asp Tyr Phe Xaa Glu Leu Arg;配列番号1)においてアミノ酸番号7のXaaがグルタミン酸である部分アミノ酸配列を有するFAS1を備える脂肪酸合成酵素を生産する酵母を変異処理する工程と、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択する工程とを含む方法により得られる。
(II)カプロン酸生産量の調節方法
本発明の酵母のカプロン酸生産量を調節する方法は、酵母の脂肪酸合成酵素遺伝子FAS1の目的塩基を置換する工程を含む方法である。前述したように、目的塩基とは、FAS1遺伝子の部分塩基配列であって、配列番号3に示す塩基配列において塩基番号21の塩基nをいう。酵母の脂肪酸合成酵素FAS1遺伝子の513番目の塩基が、C又はTである場合にこれをA又はGに置換すれば、カプロン酸生産量を増大させることができる。一方、FAS1遺伝子の目的塩基がA又はTである場合にこれをCに置換すれば、カプロン酸生産量を低減させることができる。
(III)酒類又はパン、及びその製造方法
本発明の酒類、又はパンの製造方法は、酵母として、上記説明した本発明のカプロン酸高生産株を用いる方法である。本発明の酵母株は、カプロン酸の生産量が高いことから、カプロン酸エチルの生産量が高い。この方法により得られる酒類やパンはカプロン酸エチルによる香気が非常に高いものとなる。酒類は特に限定されず、清酒、焼酎、ビール、ウィスキー、ワインなどが挙げられる。
実施例
以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
<セルレニン耐性株のFAS1遺伝子の破壊>
清酒酵母の日本醸造協会7号の変異処理及びセルレニン耐性選択により得たカプロン酸高生産変異株7−C−8(FERM−P−8452;特公平7−46982)のFAS1を、kanMXマーカーの両端にFAS1相同配列を有する遺伝子破壊用カセットで形質転換して、FAS1破壊株を得た。
<変異FAS1の導入>
FAS1を破壊した7−C−8株に、(i)部位特異的変異によってFAS1の171番目のアミノ酸をグルタミン酸に置換したFAS1クローン;(ii)本来的にFAS1のアミノ酸がグルタミン酸である実験室酵母S288C株及びD458−5A株の各FAS1アレル;及び(iii)FAS1(コントロール)を、それぞれ導入した。
<形質転換方法>
上記の(i)、(ii)、及び(iii)のプラスミドを用いて、7−C−8株のFAS1破壊株の形質転換を行った。形質転換は、Gietz et.al.Yeast 11,355−360(1995)らの酢酸リチウム法に準じた。すなわち、YPD培地(2%グルコース、2%ポリペプトン、1%酵母エキス)で一晩振盪培養した酵母を、新鮮なYPD培地2〜5×106cell/mlになるように接種し、2〜3時間30℃で振盪培養し集菌した。この酵母菌体を10mlの滅菌水で2回、10mlのTE/LiAc溶液(100mM−酢酸リチウムpH7.5、10mM トリス塩酸緩衝液、1mM EDTA pH7.5)で1回洗浄し2×109cell/mlになるようTE/LiAc溶液に懸濁し30℃で15分間インキュベーションした。懸濁液50μlを滅菌したエッペンドルフチューブにとり、一本鎖キャリアDNA5μl(50μg)、DNA5μl(10μg)、PEG/TE/LiAc溶液(40%(w/v)PEG3350、100mM-酢酸リチウムpH7.5、10mMトリス塩酸緩衝液、1mM EDTA pH7.5)300μlを加えボルテックスでよく攪拌後、30℃で30分間インキュベーション、さらに42℃で20分間のヒートショック処理後、15秒間遠心し集菌した酵母菌体をYPD培地に懸濁して2時間30℃で振盪培養、培養液を遠心し集菌した酵母菌体を選択培地に塗布した。FAS1遺伝子破壊株の選択培地はYPD+FA+G418寒天培地(2%グルコース、2%ポリペプトン、1%酵母エキス、2mMミリスチン酸ナトリウム、0.5%Tween40、1000ppmG418 (ジェネティシン)、2%寒天)、FAS1形質転換体の選択培地としてはYPD+NAT寒天培地(2%グルコース、2%ポリペプトン、1%酵母エキス、200ppm clonNAT(nourseothricin)、2%寒天)を使用した。
<カプロン酸生産量の測定方法>
5mlのYPD培地で、30℃、2日間振盪培養した各形質転換酵母菌体を集菌し、α米7.8g、乾燥麹1.9g、水23.2ml、50%醸造乳酸15μlと混合し15℃一定で20日間醗酵した。得られた発酵もろみの遠心上清0.8mlをバイアルにとり、100ppmの4−メチル−2−ペンタノール(内部標準液)を10μl加え密栓し、バイアルのヘッドスペースにSPME(固相マイクロ抽出)ファイバーを挿入し、30℃で20分間ファイバーを振盪させながら抽出処理を行った後、SPMEファイバーをガスクロマトグラフィーに注入し分析した。
清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、上面ビール酵母(エール酵母)、蒸留酒酵母、ウィスキー酵母、パン酵母、実験室酵母、ラガービール酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、及び酵母基準株について、FAS1のアミノ酸配列、及びFAS1遺伝子の塩基配列を解析した。
実験室酵母D458−5A株、及びS288C株の変異処理によりカプロン酸高生産株を得た。具体的には、0.2Mリン酸緩衝液(pH8.0)9.2ml、40%グルコース溶液0.5ml、EMS(エチルメタンスルホネート)0.3mlに約1×106cell/mlとなるように酵母を加え30℃で60分間ゆっくり振盪させた。処理後の酵母菌体を集菌し、水で数回洗浄後、25μMセルレニンを含むYPD寒天培地に酵母懸濁液をまいた。プレートを30℃で3日〜7日間インキュベーションし、生育してきたコロニーをセルレニン耐性変異株とした。
7−C−8株、itr001株、及びS288CR株及びそれぞれの親株(G1103株、D458−5A株、S288C株)を用いて清酒を製造した。7−C−8株は、特許文献1に記載されているように、清酒酵母協会701号から分離した一倍体酵母G1103株のEMS変異処理により分離したセルレニン耐性株である。清酒醸造は次のようにして行った。5mlのYPD培地で、30℃、2日間振盪培養した酵母菌体を集菌し、α米7.8g、乾燥麹1.9g、水23.2ml、50%醸造乳酸15μlと混合し15℃一定で20日間醗酵した。
Claims (5)
- 実験室酵母itr001株(FERM P−20638)。
- 実験室酵母S288CR株(FERM P−20639)。
- 清酒酵母、又は焼酎酵母の脂肪酸合成酵素FAS1中に含まれる配列番号1に示す部分アミノ酸配列のアミノ酸番号7のXaaをアスパラギン酸からグルタミン酸に置換する工程と、変異処理する工程と、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択する工程とを含む酵母カプロン酸高生産株の製造方法。
- 酵母の脂肪酸合成酵素FAS1遺伝子中に含まれる配列番号3に示す部分塩基配列の塩基番号21のnをA又はGに置換する工程、変異処理する工程と、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択する工程とを含む、酵母のカプロン酸生産量を調節する方法。
- 酵母を用いて酒類、又はパンを製造する方法であって、酵母として、請求項1又は2の株を使用する方法。
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