JP4904256B2 - 組織および骨用の足場において傾斜細孔構造を得るための方法、ならびに、組織および骨用の傾斜細孔構造を有する足場 - Google Patents

Description

発明の分野

本発明は、組織および骨用の足場において傾斜細孔構造を得るための方法、ならびに、傾斜細孔構造を有する組織および骨用の足場に関する。具体的には、網羅的ではないが、傾斜細孔構造は初期の構造強度をもたらし、かつ、分解を制御しながら組織成長を可能にする。

発明の背景

組織工学技術は一般に、初期の細胞付着およびその後の組織形成のための三次元鋳型としての一時的な足場の使用を必要とする。足場が身体によって代謝される能力により、足場が新しい細胞によって徐々に置換されて、機能的な組織を形成することが可能になる。

繊維結合、ソルベントキャスティングおよび粒子溶出をはじめとする多くの従来の技術が、足場を設計および製造するために開発されている。迅速プロトタイピング作製技術もまた、コンピューター制御技術を使用して足場の設計および製造を可能にしている。

生分解性ポリマーは、新しい組織が形成されるに従って分解し、最終的には、身体に対する異物を何も残さないので、様々な生分解性ポリマーが、足場形成材料のための注目される候補となっている。いくつかの技術、例えば、塩溶出、繊維状織物加工、発泡、エマルジョン凍結乾燥、三次元印刷および相分離などが、組織工学用の多孔性の高いポリマー足場を作製するために開発されている。しかしながら、骨、組織および器官用の臨床的に有用な足場を操作・作製することは依然として難題である。

足場は、組織工学における使用のために下記の特徴を有することが期待される：
（ｉ）細胞／組織の成長ならびに栄養分および代謝廃棄物の流れ輸送のための相互につながった細孔網状組織を伴って多孔性である三次元構造；
（ｉｉ）インビトロおよび／またはインビボで細胞／組織の成長と一致するために制御可能な分解速度および再吸収速度を伴って生分解性または生体再吸収性でなければならない；
（ｉｉｉ）表面化学が、細胞の付着、増殖および分化のために伝導性でなければならない；
（ｉｖ）埋め込み部位において組織の機械的性質と一致するための適切な機械的性質；および
（ｖ）様々な形状およびサイズを形成するために容易に加工されなければならない。

上記性質に加えて、足場は、先導された組織再生を行うことができなければならない。このことは、三次元網目組織の全域での機能的に段階的に変化した性質を必要とする。その細孔サイズ、多孔性および表面積（面積対体積比）が、組織工学用の足場のための重要なパラメーターとして広く認識されている。他の構造的特徴、例えば、足場形成材料の細孔形状、細孔壁形態および細孔間の相互連絡性などもまた、細胞播種、遊走、成長、物質輸送、遺伝子発現、および、三次元での新組織形成のために重要であることが示唆されている。

４種の生体材料が組織工学用途向けの足場材料として実験的および／または臨床的に研究されている：
（ｉ）合成有機材料、例えば、脂肪族ポリエステル、ポリエチレングリコールなど；
（ｉｉ）合成無機材料、例えば、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、焼き石膏、ガラスセラミックスなど；
（ｉｉｉ）天然起源の有機材料、例えば、コラーゲン、フィブリン糊、ヒアルロン酸など；および
（ｉｖ）天然起源の無機材料、例えば、サンゴヒドロキシアパタイトなど。

一般に、足場は、ヒト体内に埋め込まれたときに免疫拒絶を生じさせない非常に生体適合性の材料から製造されなければならない。

プロセスおよび装置に関する現在の技術的制約は、細孔における望ましい相互連絡性を有する足場の設計を達成する際に重大な制限をもたらしている。プロセス制限の単純な一例がステレオリソグラフィーの使用である。これは、要求された構造を得るために光硬化性ポリマーを必要とし、また、得ることができる最大強度に対する制限を有する。三次元印刷技術は、要求された構造を得るためのバインダー配合に依存する。塩溶出および相分離などの方法は、細孔の必要な相互連絡性を創り出すことにおいて様々な制限を受けている。

現在の組織工学用足場では、迅速プロトタイプ作製技術または発泡／溶媒溶出法のいずれかが、多孔性構造を得るために使用される。

発明の要約

好ましい態様によれば、少なくとも２種のポリマーから製造される、組織再生または骨成長用の足場が提供される。ポリマーは生分解性の異なる速度を有する。少なくとも２種のポリマーのうちの第１のポリマーが溶媒によって溶出可能（または除去可能）である場合があり、かつ、少なくとも２種のポリマーの他のポリマーのすべてがその溶媒に対して不活性であり得るか、または、より低い溶解速度をその溶媒において有し得る。本発明の足場は、足場の表面では多孔性が高く、足場のコアでは多孔性が低い傾斜多孔性を有し得る。

別の態様によれば、少なくとも２種のポリマーから製造される、組織再生または骨成長用の足場が提供される。少なくとも２種のポリマーのうちの第１のポリマーが溶媒によって溶出可能（または除去可能）であり、かつ、少なくとも２種のポリマーの他のポリマーのすべてがその溶媒に対して不活性であるか、または、より低い溶解速度をその溶媒において有し得る。

さらなる態様によれば、足場の表面では多孔性が高く、足場のコアでは多孔性が低い傾斜多孔性を有する、組織再生または骨成長用の足場が提供される。この足場は、生分解性の異なる速度を有する少なくとも２種のポリマーから製造することができる。加えて、または、代替として、この足場は少なくとも２種のポリマーから製造することができ、この場合、少なくとも２種のポリマーのうちの第１のポリマーが溶媒によって溶出可能（または除去可能）であり、かつ、少なくとも２種のポリマーの他のポリマーのすべてがその溶媒に対して不活性であるか、または、より低い溶解速度をその溶媒において有し得る。

最後の態様において、組織再生または骨成長用の足場を製造する方法で、
（ａ）少なくとも２種のポリマーを混合して、ポリマー混合物を形成するステップ；
（ｂ）足場をポリマー混合物から形成するステップ；
（ｃ）足場を、溶媒を使用して溶出して、少なくとも２種のポリマーのうちの第１のポリマーを除くステップ（この場合、少なくとも２種のポリマーの他のポリマーのすべてがその溶媒に対して不活性であるか、または、より低い溶解速度をその溶媒において有し得る）
を含む方法が提供される。

ポリマーは混合前に粉砕することができる。少なくとも２種のポリマーのすべてのポリマーが生分解性の異なる速度を有し得る。溶出は足場のほんの一部分についてのみであり得る。そのような一部分は、足場のコアではなく、足場の表面または表面近くであり得る。好ましくは、第１のポリマーは生分解性のより速い速度を有する。

形成には、圧縮成形、射出成形、迅速プロトタイピングおよび三次元印刷からなる群から選択される少なくとも１つの方法を用い得る。圧縮成形は０ＭＰａ〜２０ＭＰａの範囲の圧力および２５℃〜８０℃の範囲の温度においてであり得る。溶出が溶媒の超音波槽においてであり、この場合、溶媒は、好ましくは、２５℃〜５０℃の範囲の温度であり、振動数が１ＫＨｚ〜４０ＫＨｚの範囲であり、かつ、暴露時間が、好ましくは、５分〜１２０分の範囲である。少なくとも２種のポリマーは、２０μｍ〜５００μｍの範囲の好ましい粒径を形成するために超低温ミルにおいて粉砕され、次いで混合され得るか、または、超低温ミルにおいて粉砕および混合され得る。

粉砕は、ポリマーについて所望される粒径およびポリマー種に依存し得るサイクルについてであり得る。粉砕は、１分当り１５サイクル〜３０サイクルの範囲の頻度においてであり得るし、かつ、衝突割合が１５回／秒の衝突であり得る。

すべての態様について、少なくとも２種のポリマーは、純粋に合成されたポリマー、例えば、ポリグリコリド、ポリＬ−ラクチド、ポリＤＬ−ラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリカプロラクトンまたはホロリヒドロキシブチレート；合成ポリマーと天然ポリマーとの混合物、または天然ポリマーであり得る。溶媒は、アセトン、ジクロロメタン、ヘキサフルオロイソプロパノール、クロロホルムまたはアルコールあるいは類似する有機溶媒であり得る。

２種のポリマーは６０：４０〜３０：７０の範囲の割合で存在し得る。

本発明が容易に理解され、かつ、実際に実行され得るために、次に、本発明の好ましい実施形態のみが、添付されている例示的な図面を参照して非限定的な実施例として記載されるものとする。

好ましい実施形態の詳細な説明

図１、図２および図６を参照すると、組織工学および／または骨成長用の足場１０の１つの実施形態が示される。

足場１０が組織を十分に模倣し、かつ、インプラント内で生じる組織再生／骨成長の性状を改善することを可能にするために、足場１０は、傾斜多孔性を含む傾斜特性を有する。このことは、種々の組織および細胞の最適な内部成長を得るのに役立ち、かつ、インプラントの特定領域で様々な機械的負荷にインプラントが耐える能力を高める。細孔１２の傾斜構造は、成長因子を制御された様式で送達することを助ける。したがって、細孔１２の傾斜構造は、制御および先導された骨形成および血管形成を有することを助ける。ポリマー混合物が使用されるが、この場合、異なるポリマーが、組織、骨および血管の形成に好ましくは対応する異なる分解速度を有する。これにより、再生プロセスを助けるための足場に十分な支持および強度がもたらされる。

細孔１２は段階的に変化しており、その結果、成長が表面から始まるので、足場１０のコア１４が組織成長の必要な支持および遅れを提供し、したがって、血管形成がコアで生じることを可能にする。

１つの好ましい形態において、２つの異なるポリマーが使用されたが、任意の要求される数のポリマーを、構築される足場の要求された特徴に依存して使用することができる。例えば、３つまたは４つの異なるポリマーを使用することができる。

２種のポリマーを使用する場合、使用される２種のポリマーの比率は６０：４０〜３０：７０の範囲としてよい。正確な比率は、構築される足場の要求特性にやはり依存することになろう。ポリマーは天然ポリマーまたは合成ポリマーであってもよい。ポリマーには、ポリグリコリド、ポリラクチド（これには、ポリＤＬ−ラクチドおよびポリＬ−ラクチドが含まれる）、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリカプロラクトンおよびポリヒドロキシブチレートが含まれ得るが、これらに限定されない。

足場１０を製造するために、ポリマーが選択され、妥当な比率で粉末に粉砕され、混合されて、ポリマー混合物を形成する。混合された粉末は所定のサイズにふるい分けされ、混合物が、足場を製造するために使用される。その後、足場は二次加工に供される。粉砕は超低温ミルにおいて行われる場合があり、また、混合を含む場合がある。

二次加工はポリマー混合物におけるポリマーの１つの制御された溶出である。溶出は、表面多孔性を高め、しかし、同時に、足場１０のコア１４における細孔１２の低下した濃度を有するために溶媒２０（好ましくは、有機溶媒）の使用によってであり得る。ポリマーのうちの第１のポリマーのみと反応し、それ以外のポリマーとは反応しない溶媒、あるいは、それ以外のポリマーとの限定された反応性またはより遅い反応性を有する溶媒を使用することによって、主として第１のポリマーが溶出によって除かれる。このことは、すべての他のポリマーがそのような溶媒に対して不活性であるか、または、そのような溶媒に対するより低い反応速度を有するか、または、そのような溶媒に対するより低い溶解速度を有することを要求する。溶出は、ヒーター１６の使用により溶出溶媒の温度を制御することによって、および／または、例えば、超音波テーブル１８を使用する超音波撹拌によるか、もしくは、超音波処理装置における撹拌によって高めることができる。

足場の異なる領域において異なるポリマー比率を有することによって、異なる多孔性が溶出から生じる。代替として、または、加えて、溶出プロセスは、溶出が足場の表面においてより大きな程度であり、かつ、足場１０のコア１４においてより小さい程度であるように制御することができる。これは、溶媒の槽における足場１０の浸漬速度を制御することによって、または、浸漬時間を制御し、その結果、溶媒がコアのより近いところでの第１のポリマーの溶解を完全に完了させないようにすることによって、または、他の方法によって行うことができる。溶出が足場１０の表面から始まり、溶出により作製された細孔１２を介してコア１４に向かって進行するので、溶媒浴の持続時間、温度および撹拌を制御することによって、コア１４を部分的にだけ溶出することができ、または、足場１０のコア１４における溶出を全くなくすことができる。このようにして、細孔１２は、数、サイズおよび接続性が足場１０の表面２２から足場１０のコア１４まで低下する。

多孔性がより高い場合には、生分解性の速度がより速くなり、多孔性がより低い場合には、分解速度がより遅くなる。より高い多孔性を表面２２に有することによって、組織／骨の再生／成長がより早期であり、かつ、最も速い場合、足場１０は、再生／成長が生じるに従って生分解する。多孔性がコア１４においてより低い場合、組み合わさった強度が依然として比較的一様のままであるように組織／骨が再生／成長するので、足場は構造強度を保持する。

生分解性の速度が異なる少なくとも２つの異なるポリマーを有することによって、このことが強化され得る。また、より速く分解するポリマーはコア１４に向かって徐々に分解して、したがって、組織／骨の再生成長を高める。溶媒によって溶出されるポリマーが生分解性のより速い速度／最も速い速度を有することが好ましい。

一例において、ポリグリコリド顆粒、ポリＬ−ラクチド顆粒およびポリラクチド−ｃｏ−グリコリド顆粒が、１分間当り、１５サイクル〜３０サイクルの頻度で粉砕された。使用される正確なサイクルは、使用されたポリマー、粒径、および、ポリマーのガラス転移温度の１つまたは複数に依存する。２０μｍ〜５００μｍの範囲での粒径が好ましい。１５回／秒の衝突の衝突割合が使用された。

使用される有機溶媒は、ポリマーの１つを選択的に溶解するための、また、それ以外のポリマーが不活性であるか、または、それ以外のポリマーがより低い溶解速度を有するアセトン、ジクロロメタン、ヘキサフルオロイソプロパノール、クロロホルム、アルコールまたは任意の他の好適な有機溶媒から選択することができる。

足場１０の製造は、例えば、圧縮成形、射出成形または迅速プロトタイピング（例えば、好適なバインダー系を使用する足場の三次元印刷など）などの方法によって行うことができる。例えば、０ＭＰａ〜２０ＭＰａの圧力および２５℃〜８０℃の範囲の温度における圧縮成形を使用することができる。

溶媒は、足場が入れられる槽に存在させることができる。槽における溶媒の温度は２５℃〜５０℃の範囲であり得る。槽は、１ＫＨｚ〜４０ＫＨｚの範囲の振動数を使用する超音波槽であり得る。槽における足場の暴露時間は５分〜１２０分の範囲であり得る。

図３から明らかであるように、細孔間における良好な相互連絡性、および、細孔の良好な三次元網目組織が存在する。使用されたポリマーは、
（ａ）ジクロロメタンにおいて溶出されるような５０：５０の比率でのポリグリコリドおよびポリラクチド−ｃｏ−ポリグリコリド；および
（ｂ）アセトンにおいて溶出されるような５０：５０の比率でのポリグリコリドおよびポリヒドロキシブチレート
であった。

図４は、上記サンプル（ａ）を、
（ａ）溶出前［（ａ）］；
ならびに、
（ｂ）ジクロロメタンにおける溶出の後；および
（ｃ）アセトンにおける溶出の後
で示し、また、表面細孔の一様な分布および細孔間の相互連絡性を示す。

図４（ｄ）は、１０μｍ以下の範囲での細孔サイズの微細孔に関するコアにおける多孔性分布を示す。

図５は、二次加工に供した後でのポリＬ−ラクチド／ポリグリコリドサンプルにおいて得られた２つの多孔性プロフィルを示す。多孔性測定は、１０μｍを超える細孔サイズの分解能を有したプロフィルメーターの使用によってであった。

本発明の好ましい実施形態が前記の記載において記載されているが、設計、構築または操作の細部における多くの変化または改変が、本発明から逸脱することなく行われ得ることが当業者によって理解される。

足場の１つの実施形態を例示する図である。 図１の足場の垂直断面図である。 異なる溶媒による溶出の後での２つのサンプルの共焦点画像である。 溶出前、および、異なる溶媒による溶出の後でのサンプルの光学画像である。 １つのサンプルの多孔性プロフィルである２つのグラフを示す。 足場の製造の１つの実施形態を例示する図である。

符号の説明

１０．．．足場、１２．．．細孔、１４．．．コア、２２．．．表面、１６．．．ヒーター、１８．．．超音波テーブル、２０．．．溶媒。

Claims (24)

1. 組織再生および骨成長の少なくとも一方のための足場であって、
   足場の表面は足場のコアに比べて高い多孔性である傾斜多孔性を有し、
   少なくとも２種のポリマーから製造され、該少なくとも２種のポリマーのうちの第１のポリマーが溶媒によって溶出可能であり、かつ、該少なくとも２種のポリマーの他のポリマーのすべてが、該溶媒に対して不活性であるもの、および、より低い溶解速度を該溶媒において有するものからなる群から選択され、
   前記足場の製造は、前記傾斜多孔性を有する足場を得るために、第１のポリマーの溶出が、足場の表面では最大化され、足場のコアでは最小化される、第１のポリマーの制御された溶出を含む、
   足場。
2. 前記少なくとも２種類のポリマーのすべてのポリマーがそれぞれ互いに、生分解性の異なる速度を有する、請求項１に記載の足場。
3. 前記足場が、足場の表面では多孔性が高く、足場のコアでは多孔性が低い傾斜多孔性を有する、請求項１または２に記載の足場。
4. 前記少なくとも２種のポリマーが、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリＬ−ラクチド、ポリＤＬ−ラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリカプロラクトン、およびポリヒドロキシブチレートからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の足場。
5. 前記溶媒が、有機溶媒および無機溶媒からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の足場。
6. 前記有機溶媒が、アセトン、ジクロロメタン、ヘキサフルオロイソプロパノール、クロロホルムおよびアルコールからなる群から選択される、請求項５に記載の足場。
7. ２種のポリマーが６０：４０〜３０：７０の範囲の割合で存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の足場。
8. （ａ）少なくとも２種のポリマーを混合して、ポリマー混合物を形成するステップ；
   （ｂ）足場を該ポリマー混合物から形成するステップ；
   （ｃ）該足場を、溶媒を使用して溶出して、該少なくとも２種のポリマーのうちの第１のポリマーを除くステップ（この場合、該少なくとも２種のポリマーの他のポリマーのすべてが該溶媒に対して不活性である）を含み、第１のポリマーの溶出が、足場の表面では最大化され、足場のコアでは最小化されるように制御され、前記足場が、足場の表面では多孔性が高く、足場のコアでは多孔性が低い傾斜多孔性を有する、組織再生および骨成長の少なくとも一方のための足場を製造する方法。
9. 前記少なくとも２種のポリマーのすべてのポリマーがそれぞれ互いに、生分解性の異なる速度を有する、請求項８に記載の方法。
10. ２種のポリマーが６０：４０〜３０：７０の範囲の割合で存在する、請求項８または請求項９に記載の方法。
11. 前記少なくとも２種のポリマーが、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリＬ−ラクチド、ポリＤＬ−ラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリカプロラクトンおよびポリヒドロキシブチレートからなる群から選択される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記溶媒が、アセトン、ジクロロメタン、ヘキサフルオロイソプロパノール、クロロホルムおよびアルコールからなる群から選択される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記形成するステップが、圧縮成形、射出成形、迅速プロトタイピングおよび三次元印刷からなる群から選択される少なくとも１つの方法によってなされる、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 圧縮成形が０ＭＰａ〜２０ＭＰａの範囲の圧力および２５℃〜８０℃の範囲の温度においてなされる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記第１のポリマーが生分解性のより速い速度を有する、請求項９に記載の方法。
16. 溶出が前記溶媒の超音波槽においてなされる、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記溶媒が２５℃〜５０℃の範囲の温度であり、振動数が１ＫＨｚ〜４０ＫＨｚの範囲であり、かつ、暴露時間が５分〜１２０分の範囲である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記少なくとも２種のポリマーが混合の前に粉砕され、粉砕および混合が、２０μｍ〜５００μｍの範囲の粒径を形成するために超低温ミルにおいてなされる、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記粉砕が、前記少なくとも２種のポリマーのタイプ、および、前記少なくとも２種のポリマーの所望される粒径の少なくとも１つに依存するサイクルにおいてなされる、請求項１８に記載の方法。
20. 粉砕が、１分当り１５サイクル〜３０サイクルの範囲の頻度においてなされる、請求項１７または請求項１９に記載の方法。
21. 粉砕期間中において、衝突割合が１５回／秒の衝突である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 溶出が除去および溶解を含む、請求項８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 請求項８〜２２のいずれか一項に記載される方法によって製造される足場。
24. 溶出が除去および溶解を含む、請求項１〜７のいずれか一項、または請求項２３に記載の足場。

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