JP4897581B2 - 親水化磁性体内包粒子の製造方法、親水化磁性体内包粒子及び免疫測定用粒子 - Google Patents

Description

本発明は、クロマト展開性に優れ、高感度な免疫測定を行うことが可能な親水化磁性体内包粒子の製造方法、親水化磁性体内包粒子及び免疫測定用粒子に関する。

測定試料中に含有される被検物質を検出する方法としては、例えば、抗原−抗体反応を利用した酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、ラテックス凝集法、免疫クロマト法等の、生物学的反応を利用した種々の方法が提案されている。なかでも、簡便かつ迅速であることから、免疫クロマト法が多用されるようになってきている。

免疫クロマト法では、通常、少なくとも２種類の抗体を利用したサンドイッチ法が採用されている。即ち、金属コロイドや着色粒子を支持体として、アイソトープ、酵素、蛍光物質等で標識された抗体を含む試薬と測定試料とを反応させ、測定試料中に含まれる抗原と標識抗体とを結合し、これをもう一つの抗体が固定化されたクロマト担体に流すことにより、クロマト担体中に抗原を捕捉し、捕捉された抗原を標識をもとに分析するというものである。

このような免疫クロマト法等に供するための支持体として、磁性体内包粒子が注目されている。磁性体内包粒子は、以前からラジオイムノアッセイ等において磁性により効率よく簡便にＢ／Ｆ分離を行うための支持体としての利用が提案されていたが、磁性体内包粒子の磁性量を標識とすることにより、他の標識物質で標識せずに分析を行うことができる等の利点があるとされる（特許文献１〜３）。

しかしながら、実際に磁性体内包粒子を免疫クロマト法に用いると、磁性体内包粒子がクロマト担体中に滞留してしまったり、展開させる側のクロマト先端部位付近に不均一に残留してしまったりする等、金属コロイドや着色粒子に比べてクロマト展開性が大きく劣るという問題があった。
また、免疫測定用粒子として使用する際に、測定試料中の抗原又は抗体が非特異吸着を生じる恐れがあり、これを防止するためには、ブロッキング剤によるブロッキング処理を施さなければならないという問題があった。
更に、免疫測定用粒子として使用する際に、磁性体内包粒子と抗原又は抗体とを物理的に吸着させる方法では、経時的な安定性に欠け、吸着させた抗原又は抗体が脱離したりするという問題があった。

こうした問題を解決するために、疎水性モノマーからなる磁性体内包粒子表面を親水性モノマーで被覆することによって、コア・シェル型粒子を形成する方法が考えられる。しかしながら、このような方法では、重合方法が煩雑になるため、工業的に好ましくないという問題があった。
特開平６−１４８１８９号公報 特開平７−２２５２３３号公報 特表２００１−５２４６７５号公報

本発明は、上記現状に鑑み、クロマト展開性に優れ、高感度な免疫測定を行うことが可能な親水化磁性体内包粒子の製造方法、親水化磁性体内包粒子及び免疫測定用粒子を提供することを目的とする。

本発明は、有機高分子物質と前記有機高分子物質中に１〜３０ｎｍの分散径で分散した磁性体とからなる平均粒子径５０〜５００ｎｍの磁性体内包粒子を、濃度が２０ｐｐｍ以上のオゾン水を用いて親水化処理する工程を有する免疫クロマト法用の親水化磁性体内包粒子の製造方法である。
以下に本発明を詳述する。

本発明者らは、鋭意検討した結果、磁性体内包粒子を所定の濃度のオゾン水を用いて処理することによって、極めて均一に親水化することができ、親水化して得られた親水化磁性体内包粒子を、例えば、免疫クロマト法に用いると、測定対象物質等の非特異吸着を抑制し、高いクロマト展開性が発揮できることを見出し、本発明を完成するに至った。
これは、オゾン水処理により、有機高分子物質表面の疎水性構造部分が酸化されたり、ベンゼン環や未反応の二重結合がオゾンと反応したりすることにより、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基等の親水性基が生成するためと考えられる。

上記磁性体内包粒子は、有機高分子物質と前記有機高分子物質中に分散した磁性体とからなる。
上記有機高分子物質は、上記磁性体内包粒子のマトリックスとしての役割を有する。
上記有機高分子物質としては、スチレン系モノマーに由来するセグメントを有する共重合体、すなわち、ポリスチレン系樹脂であることが好ましい。スチレン系モノマーに由来するセグメントを有することにより、上記磁性体内包粒子の水系媒体中における分散性が向上することに加え、後述するようにオゾン水を用いて親水化処理をした場合に、上記磁性体内包粒子の表面にカルボキシル基を生成することができる。

上記スチレン系モノマーとしては特に限定されず、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、クロロメチルスチレン等、又は、二官能性のジビニルベンゼン等が挙げられる。これらのスチレン系モノマーは単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

上記スチレン系モノマーに由来するセグメントの含有量の好ましい下限は６０重量％である。６０重量％未満であると、得られる上記磁性体内包粒子の水系媒体中での分散性が劣ることがある。

上記有機高分子物質は、スチレン系モノマーに由来するセグメントのほかに、反応性官能基を含有するビニルモノマーに由来するセグメントを有していてもよい。反応性官能基を含有するビニルモノマーに由来するセグメントを有することにより、該反応性官能基を介して抗原や抗体を容易に結合することができる。

上記反応性官能基を含有するビニルモノマーの反応性官能基としては、抗原や抗体等を共有結合により結合可能なものであれば特に限定されず、例えば、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、アミノ基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルアミノ基、スルホン酸基等が挙げられる。このような反応性官能基を含有するビニルモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、グリシジル（メタ）アクリレート、トリエチルアンモニウム（メタ）アクリレート、ジメチルアミノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらの反応性官能基を含有するビニルモノマーは単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

上記共重合体は、その他のビニルモノマーに由来するセグメントを有していてもよい。
その他のビニルモノマーとしては特に限定されず、例えば、塩化ビニル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類；アクリロニトリル等の不飽和ニトリル類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、エチレングリコール（メタ）アクリレート、トリフルオロエチル（メタ）アクリレート、ペンタフルオロプロピル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、グリシジルメタクリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。これら単量体は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

上記共重合体は、架橋性モノマーに由来するセグメントを有していてもよく、これらのセグメントにより架橋が施されていてもよい。
上記架橋性モノマーとしては特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリトリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ジアリルフタレート及びその異性体、トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体等が挙げられる。これら架橋性単量体は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

上記磁性体は、上記有機高分子物質中に分散されている。
上記磁性体としては特に限定されないが、残留磁気がない超常磁性を有するものが好適である。残留磁気があると自己凝集しやすくなり、クロマト展開性が劣ることがある。
上記超常磁性を有する磁性体としては特に限定されず、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ_３Ｏ_４）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ_２Ｏ_３）等の各種フェライト類；鉄、マンガン、コバルト等の金属又はこれらの合金等が挙げられる。なかでもフェライト類が好適であり、なかでも四三酸化鉄（Ｆｅ_３Ｏ_４）が好適である。
このような磁性体としては、Ｆｅ^２＋とＦｅ^３＋を１：２の割合で含む混合液を塩基性の溶液に滴下することでＦｅ_３Ｏ_４が得られる共沈反応法により調製したもの等を用いることができる。また、フェリコロイドＨＣ−５０（タイホー工業社製）、ＨＸ―２０（シグマハイケミカル社製）等の市販品も用いることができる。

上記有機高分子物質中における磁性体の分散径の好ましい下限は１ｎｍ、好ましい上限は３０ｎｍである。１ｎｍ未満であると、磁性体の製造自体が困難であることに加え、磁性体の磁性応答特性が減少し、標識として用いたときの感度が低下することがある。３０ｎｍを超えると、残留磁気を生じやすくなり、自己凝集しやすくなることに加え、磁性体が磁性体内包粒子の表面に露出しやすくなることがある。より好ましい下限は５ｎｍ、より好ましい上限は２０ｎｍである。

上記磁性体内包粒子中における磁性体の含有量の好ましい下限は５０重量％、好ましい上限は８０重量％である。５０重量％未満であると、磁性量が低く、極微量の測定対象成分を分析する際に検出が困難となることがある。８０重量％を超えると、自己凝集しやすくなったり、磁性体内包粒子全体の重量が大きくなり過ぎたりしてクロマト展開性が劣ることがある。より好ましい下限は６０重量％、より好ましい上限は７０重量％である。

上記磁性体内包粒子は、平均粒子径の下限が５０ｎｍ、上限が５００ｎｍである。５０ｎｍ未満であると、媒体中に懸濁させたときの分散安定性が悪くなって自己凝集しやすくなり、５００ｎｍを超えると、クロマト担体の孔を通過しにくくなり、クロマト展開性が劣る。好ましい下限は１００ｎｍ、好ましい上限は４００ｎｍである。

上記磁性体内包粒子は、粒子径のＣＶ値が５０％未満であることが好ましい。５０％以上であると、粒子径の大きい粒子がクロマト担体の孔を通過しにくくなり、クロマト担体中に残存することがある。

上記磁性体内包粒子は、上記有機高分子物質を構成する炭素元素と上記磁性体を構成する金属元素との構成比率の絶対偏差の好ましい上限が０．３である。
なお、本明細書において絶対偏差とは、上記有機高分子物質を構成する炭素元素と、磁性体を構成する金属元素の同期発光を測定し、粒子毎の炭素元素と金属元素との混在比率のバラツキから算出したその測定データの分散状態を示す偏差値であって、磁性体内包粒子の磁性体含有量のバラツキを示すパラメータである。上記絶対偏差の数値が小さいほど磁性体含有量のバラツキが小さく、即ち磁性体内包粒子の均一性が高く、大きいほど磁性体含有量のバラツキが大きい、即ち磁性体内包粒子の均一性が低いことを示す。
上記絶対偏差が０．３を超えると、免疫測定法に利用した場合に、測定再現性や定量性が低くなり測定精度が悪化することがあり、得られる測定データの信頼性が低くなる。より好ましい上限は０．２７、更に好ましい上限は０．２５、特に好ましい上限は０．２０である。

上記磁性体内包粒子は、平均粒子径が５０〜５００ｎｍであり、上記磁性体は、分散径が１〜３０ｎｍであることが好ましい。
このような平均粒子径等を有することによって、自己凝集を抑制することができ、上記磁性体内包粒子を支持体として、抗原や抗体等を結合又は吸着させた免疫測定用粒子は、通常孔径が５〜２０μｍであるクロマト担体中を容易に展開（移動）することができる。更に、クロマト担体に非特異的に吸着することもないことから、クロマト展開性にも極めて優れる。従って、上記磁性体内包粒子を用いてなる免疫測定用粒子を用いれば、磁性体内包粒子の磁性量を標識として分析を行う免疫測定法、特に免疫クロマト法を好適に行うことができる。

上記磁性体内包粒子を製造する方法としては特に限定されず、例えば、懸濁重合法、マイクロサスペンジョン重合法、ミニエマルジョン重合法、分散重合法等を応用した方法が挙げられる。なかでも、粒子径の小さな粒子を容易に製造することができることから、ミニエマルジョン重合法を応用した方法が好適である。
具体的には、例えば、特開２００６−２９２７２１号公報に開示されているように、有機溶媒中に磁性体を分散させた磁性体分散液と、モノマー、重合開始剤、及び、共界面活性剤を含有するモノマー溶液とを混合してモノマー混合液を調製する工程１、前記モノマー混合液を、界面活性剤を溶解させた水系媒体に滴下し、微分散させることにより、不均一なモノマー液滴が形成したミニエマルジョン溶液を調製する工程２、前記モノマー液滴を重合させ、磁性体内包粒子分散液を調製する工程３、及び、前記磁性体内包粒子分散液から、磁気分離法により磁性体含有率が５０〜８０重量％の粒子を分画し、回収する工程４を有する磁性体内包粒子の製造方法が挙げられる。

本発明の親水化磁性体内包粒子の製造方法は、上記磁性体内包粒子を、濃度が２０ｐｐｍ以上のオゾン水を用いて親水化処理する工程を有する。
本明細書において、上記オゾン水とは、オゾンガスが水に溶解してなるものをいう。

一般に、親水化処理を行うためには、オゾンガスを用いることも考えられるが、オゾンガスを用いる場合には、磁性体内包粒子を均一に親水化処理することが非常に難しいという問題がある。これに対して、オゾン水を用いれば、オゾン水中に磁性体内包粒子を分散させるだけで、簡便かつ均一に親水化処理を施すことができる。

上記磁性体内包粒子が上記オゾン水中で溶存オゾンと接触すると、オゾンが有する強力な酸化作用によって、上記磁性体内包粒子の疎水性の構造部分が酸化されることによって、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基等の親水性基が生成する。
また、オゾンは、二重結合との反応性が高いことが知られている。オゾンが二重結合と反応すると、中間体であるオゾナイドが形成され、その後、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基等の親水性基が生成する。例えば、上記有機高分子物質として、ポリスチレン系樹脂を用いた場合には、構造中のベンゼン環や未反応の二重結合が溶存オゾンと反応することによって、容易にカルボキシル基が生成すると考えられる。

上記オゾン水は、濃度（溶存オゾンガス濃度）の下限が２０ｐｐｍである。２０ｐｐｍ未満であると、親水化処理に時間がかかったり、充分な親水化処理を施せず、測定対象物質等の非特異吸着を充分に抑制することができなかったりすることがある。好ましい下限は、５０ｐｐｍである。
上記オゾン水の濃度は、高い程好ましいが、ある程度以上の高濃度とするには技術的に困難となるため、現実的には、好ましい上限が２００ｐｐｍ、より好ましい上限が１５０ｐｐｍである。将来的に利用可能になれば、より高濃度のオゾン水を用いることが好ましい。

上記オゾン水を調整する方法としては特に限定されず、例えば、特開２００１−３３０９６９号公報に記載されているように、原料水とオゾンガスとを、気体のみ通し液体の透過を阻止するオゾンガス透過膜を介して接触させる方法等が挙げられる。このような方法を用いることによって、濃度が２０ｐｐｍ以上であるような高濃度オゾン水を簡易に調製することができる。

本発明の親水化磁性体内包粒子の製造方法によって、有機高分子物質と前記有機高分子物質中に分散した磁性体とからなり、表面が親水化された親水化磁性体内包粒子を製造することができる。こうして得られた親水化磁性体内包粒子は、免疫クロマト法に用いた場合に、測定対象物質等の非特異吸着を抑制し、高いクロマト展開性を発揮することができる。
このような有機高分子物質と前記有機高分子物質中に分散した磁性体とからなり、表面を濃度が２０ｐｐｍ以上のオゾン水を用いて親水化処理された親水化磁性体内包粒子もまた、本発明の一つである。

本発明の親水化磁性体内包粒子の表面に形成されたカルボキシル基等の親水性基に、抗原又は抗体を共有結合により固定化させることによって免疫測定用粒子を製造することができる。こうして得られた免疫測定用粒子は、極微量の親水化磁性体内包粒子であっても磁性量の検出が可能であり、高感度な免疫測定を行うことができる。
このような本発明の親水化磁性体内包粒子と、該磁性体内包粒子の表面に共有結合により固定化した抗原又は抗体とからなる免疫測定用粒子もまた、本発明の一つである。

本発明の免疫測定用粒子を製造する方法としては特に限定されず、例えば、本発明の親水化磁性体内包粒子の表面に形成されたカルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基等の親水性基と、抗原又は抗体とを、従来公知の方法によって共有結合により固定化させる方法が挙げられる。
具体的には、例えば、縮合剤として水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を用いることによって、本発明の親水化磁性体内包粒子の表面に形成されたカルボキシル基等の親水性基と、抗原又は抗体とを共有結合により固定化する方法が挙げられる。この方法によれば、本発明の免疫測定用粒子を容易に製造することができる。

本発明によれば、所定の濃度のオゾン水を用いることによって、磁性体内包粒子表面を親水化処理するのと同時に、磁性体内包粒子表面にカルボキシル基等の抗体結合用の親水性基を生成させることができる。そのため、クロマト展開性に優れ、高感度な免疫測定を行うことが可能な親水化磁性体内包粒子の製造方法、親水化磁性体内包粒子及び免疫測定用粒子を提供することができる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
（１）磁性体内包粒子の作製
磁性流体「フェリコロイドＨＣ５０（タイホー工業社製）」１０．０ｇ（磁性体５ｇ含有）をインキュベーター中で８０℃にて１２時間乾燥し、濃縮された磁性流体７．０ｇを得た。得られた磁性流体にヘキサン３ｇを加えて、一晩放置し、磁性体を分散させて磁性体分散液を得た。
得られた磁性体分散液の全量に対して、スチレン１０ｇ、ヘキサデカン０．８ｇ及び２，２’−アゾビスイソブチロニトリル０．０５ｇを加え、スターラーを用いて氷冷下で混合してモノマー混合液を得た。

次いで、水１００ｇにドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．８ｇを溶解させた水溶液を、得られたモノマー混合液を加え、出力２００Ｗのプローブ型の超音波ホモジナイザー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ｍｏｄｅｌ２５０、Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いて、氷冷下、出力目盛り５（７０Ｗ）で２分間処理して、磁性体を含むモノマー混合液の液滴が水中に分散したミニエマルジョン溶液を調製した。
得られたミニエマルジョン溶液を窒素雰囲気下、８０℃で、２４時間重合することにより、磁性体内包粒子分散液を得た。
次いで、得られた磁性体内包粒子分散液のうち、ネオジム磁石を用いて１分間で磁石に引き寄せられる磁性体含有率が高い分画を、磁性体内包粒子として分取した。

得られた磁性体内包粒子について、動的光散乱光度計（Ｐｈｏｔａｌ ＰＡＲ−ＩＩＩＳ、大塚電子社製）を用いて動的光散乱法により粒子径を測定したところ、平均粒子径は２６３ｎｍであった。また、得られた磁性体内包粒子を水で希釈し、金属メッシュで支持したコロジオン膜上に沈着固定した後、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、磁性体の分散径を測定したところ、１０〜２５ｎｍであった。更に、ＴＧ−ＤＴＡ分析により磁性体内包粒子中の磁性体含有量を測定したところ６７重量％であった。

（２）親水化磁性体内包粒子の作製（磁性体内包粒子のオゾン水処理）
得られた磁性体内包粒子１０ｇにｐＨ９．５の水酸化カリウム水溶液１００ｍＬを加え、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離後、上清を除去し、分散液に存在する界面活性剤を除去した。続いて、得られた磁性体内包粒子に、純水１００ｍＬを添加し、超音波で再分散後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離し、上清を除去した。この遠心洗浄操作を３回繰り返した。続いて、溶存オゾンガス濃度１００ｐｐｍのオゾン水３００ｍＬに浸漬し、３０分間攪拌した。攪拌終了後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離し、上清を除去した。この操作を２回繰り返し、親水化処理を施し、粒子表面にカルボキシル基を有する親水化磁性体内包粒子を得た。
なお、オゾン水は、内径１５ｃｍ×長さ２０ｃｍの円柱形を有する外套内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径０．５ｍｍ×厚さ０．０４ｍｍ×長さ３５０ｃｍの中空管状のオゾンガス透過膜４００本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム（積水化学工業社製）を用いて調製した。

（３）免疫測定用粒子の作製
オゾン水で親水化処理した親水化磁性体内包粒子１０．０ｍｇに０．０２Ｍリン酸緩衝液を６２５μＬ、予め調製した２％濃度の水溶性カルボジイミド溶液（リン酸緩衝液）６２５μＬ添加し、３７℃恒温槽中で１．５時間撹拌した。反応溶液は、１５０００ＰＲＭにて２０分間遠心分離し、上清を除去した。その後、０．０２Ｍリン酸緩衝液１．２ｍＬを添加し、超音波で再分散し、１５０００ＰＲＭにて２０分間遠心分離し、上清を除去した。この操作を３回繰り返し、未反応の水溶性カルボジイミドを除去した。

続いて、得られた沈渣に、０．１Ｍホウ酸バッファー１．２ｍＬを添加し、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体２００μｇ加え、３７℃恒温槽中で一晩攪拌した。翌日、反応溶液に３０ｍＭグリシン溶液（ホウ酸バッファー）５０μＬを添加し、３７℃恒温槽中で３０分間攪拌した。その後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、未反応の抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体を除去した。なお、粒子への抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体結合量は、上清の蛋白濃度測定から仕込みの７０％であることを確認した。

（比較例１）
実施例１と同様の方法により得られた磁性体内包粒子について、１５ｐｐｍのオゾン水を用いて親水化処理を行ったこと以外は、実施例１と同様の方法により、免疫測定用粒子を得た。
なお、粒子への抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体結合量は、上清の蛋白濃度測定から仕込みの６％であることを確認した。

（比較例２）
（１）磁性体内包粒子の作製
実施例１と同様の方法により、磁性体内包粒子を作製した。
（２）免疫測定用粒子の作製
得られた磁性体内包粒子５．０ｍｇにｐＨ９．５の水酸化カリウム水溶液１ｍＬを加え、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離後、上清を除去し、分散液に存在する界面活性剤を除去した。続いて、得られた磁性体内包粒子に、０．０２Ｍリン酸バッファー１．０ｍＬを添加し、超音波で再分散後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離し、上清を除去した。この遠心洗浄操作を３回繰り返した。

続いて、得られた磁性体内包粒子に、０．０２Ｍリン酸バッファー１．０ｍＬを添加し、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体１００μｇ加え、３７℃恒温槽中で２時間攪拌した。その後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、未反応の抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体を除去した。なお、粒子への抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体結合量は、上清の蛋白濃度測定から仕込みの７２％であることを確認した。

得られた磁性体内包粒子を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を行った。その後、磁性体内包粒子を、牛血清アルブミンが１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、３７℃恒温槽で１時間撹拌し、ブロッキング処理を行った。次いで、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、牛血清アルブミン及びグリセロールを各々１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに分散させ、免疫測定用粒子を得た。

（評価）
実施例１及び比較例１、２で得られた免疫測定用粒子について、以下の方法により性能評価を行った。

ニトロセルロースメンブレン（ＳＲＨＦ Ｐ７０、日本ミリポア社製）を幅２０ｃｍ×長さ６ｃｍに裁断し、その長さ方向上端より２ｃｍの部位（反応部位）に、抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を２．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにトリス塩酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解した溶液を幅０．７ｍｍの直線状に塗布した。その後、３７℃で２時間乾燥した後、牛血清アルブミン（和光純薬社製）を１重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液に１時間浸漬し、ブロッキング処理を行った。更にその後、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムを０．１重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液にて洗浄後、シリカゲルデシケーター内で室温下にて乾燥し、抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を固定化した試験片を得た。

得られた試験片を幅５ｍｍに裁断し、長さ方向上端に幅５ｍｍ×長さ２０ｍｍの吸水パッド（ＡＰ２２、日本ミリポア社製）を、下端に幅５ｍｍ×長さ１５ｍｍのコンジュゲートパッド（グラスファイバー、日本ミリポア社製）を重ね、透明なテープで固定して試験片とした。

試験液として、牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ ０．０３％（ｖ／ｖ）、及び、ｈＣＧ濃度が０ｍＩＵ／ｍＬ、１０ｍＩＵ／ｍＬ、５０ｍＩＵ／ｍＬ、１００ｍＩＵ／ｍＬとなるような生理食塩水を調整した。
次いで、各試験液２００μＬに免疫測定用粒子１０μｇを添加、混合した後、作製した試験片のコンジュゲートパッドに１００μＬをそれぞれ滴下した。

滴下２０分後、市販のＧＭＲセンサ（差動磁界センサ、ＮＶＥ社製）を用いて、試験片の反応部位の磁性量（ｍＶ）を測定した。
測定結果を表１に示した。

表１より、実施例１で作製した免疫測定用粒子では、試験片への免疫測定用粒子の残留がなく、かつ、披検物質が存在しない場合（０ｍＩＵ／ｍＬ）の検出値がゼロであることから、クロマト展開性が優れていることが確認された。また、低濃度のｈＣＧが検出可能であり、かつ、検出された磁性量はｈＣＧ濃度に依存していることが確認された。これにより、実施例で得られた親水化磁性体内包粒子は免疫測定用粒子として有用であることが判った。

一方、比較例１、２で作製した免疫測定用粒子では、試験片への残留が認められ、また、披検物質が存在しない場合（０ｍＩＵ／ｍＬ）にも、磁性量が検出されていることから、抗体固定化部への非特異吸着が認められ、実施例の場合に比べ、検出感度が低い結果となった。

本発明によれば、クロマト展開性に優れ、高感度な免疫測定を行うことが可能な親水化磁性体内包粒子の製造方法、親水化磁性体内包粒子及び免疫測定用粒子を提供することができる。

Claims (5)

1. 有機高分子物質と前記有機高分子物質中に１〜３０ｎｍの分散径で分散した磁性体とからなる平均粒子径５０〜５００ｎｍの磁性体内包粒子を、濃度が２０ｐｐｍ以上のオゾン水を用いて親水化処理する工程を有することを特徴とする免疫クロマト法用の親水化磁性体内包粒子の製造方法。
2. 有機高分子物質は、ポリスチレン系樹脂であることを特徴とする請求項１記載の免疫クロマト法用の親水化磁性体内包粒子の製造方法。
3. 平均粒子径５０〜５００ｎｍであり、有機高分子物質と前記有機高分子物質中に１〜３０ｎｍの分散径で分散した磁性体とからなり、表面を濃度が２０ｐｐｍ以上のオゾン水を用いて親水化処理されたものであることを特徴する免疫クロマト法用の親水化磁性体内包粒子。
4. 有機高分子物質は、ポリスチレン系樹脂であることを特徴とする請求項３記載の免疫クロマト法用の親水化磁性体内包粒子。
5. 請求項３又は４記載の免疫クロマト法用の親水化磁性体内包粒子と、前記親水化磁性体内包粒子の表面に共有結合により固定化した抗原又は抗体とからなることを特徴とする免疫クロマト法用粒子。