JP4890926B2 - 検出方法、およびキット - Google Patents

Description

本発明は、核酸分析方法及び核酸検出キットに関する。

ヒトをはじめとするさまざまな生物のゲノム等の塩基配列解析が精力的に進められ、その結果として、遺伝子を解析して、遺伝病、癌、感染症、生活習慣病等の診断、治療方針の決定、治療後の管理、予後予想等が行われるようになってきた。また、別の分野では、同様に遺伝子を解析することにより、食肉、穀物等の食品の流通管理も行われようとしてきている。

これらの遺伝子解析に広く使用される技術として、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；以下「ＰＣＲ」とも呼ぶ）がある。ＰＣＲは、標的とする遺伝子やその遺伝子領域の核酸塩基配列に相補的な１組の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、複製・増幅する手法である。また標的遺伝子の確認には、ゲル電気泳動法などを用いることが一般的である。

近年、ＰＣＲ中の反応容器内に励起光を照射し、反応容器内で増幅反応の進行状況を観察する方法が開発されている（特表２０００−５１２１３８号公報）。この方法では、蛍光を検出する機構を組み入れたＰＣＲ用温度制御装置、およびＰＣＲによる遺伝子の増幅にともない蛍光強度が増加するように工夫された蛍光色素や反応試薬が用いられている。この発明では、ＰＣＲ後に試料溶液を反応容器から取り出して電気泳動等の分析操作を行う必要が無くなり、また、目的遺伝子ごとに、異なる蛍光特性を有する色素を用いることにより複数の目的遺伝子の増幅反応を１つの反応容器で実施することが可能になる。

一方、同時に複数個の遺伝子を増幅、検出することを目的として、標的となる遺伝子に対応するプライマーの組の両方、または片方を基体に固定して、ＰＣＲにより伸張・増幅した遺伝子を検出する分析方法（特開２００３−３２５１９９号公報）が報告されている。この発明では、遺伝子の検出工程に表面プラズモン測定を利用しており、検出チップ上の特定核酸の増幅部位を固有の共鳴周波数を有する振動子とすることにより、増幅核酸を共鳴周波数の変化として検出することができる。そのため、蛍光色素などのラベル化が不要で、検出操作の簡便化やラベル化に要するコストの削減などが期待できる。
特表２０００−５１２１３８号公報 特開２００３−３２５１９９号公報

特表２０００−５１２１３８号公報のような蛍光色素を用いる方法では、ＰＣＲ反応の試薬に添加してもＰＣＲ反応を妨害せず、かつ蛍光特性を弁別可能な蛍光色素の種類が限られているため、同時に検出できる遺伝子の数に限界がある。更に、プライマーへの蛍光色素の修飾（プライマー合成）が非常に高価であることが運用コストの面で問題となる。さらに、また複数のプライマーを混合して複数の目的遺伝子を複製増幅した場合には、プライマー同士や増幅される遺伝子断片同士の相互作用により予期せぬ複製反応が生じる場合があり、また修飾する蛍光色素の検出波長数も限られている。そのため事実上、１つの反応容器で増幅反応が実施できる目的遺伝子の数は４種類程度にとどまっている。

また、特開２００３−３２５１９９号公報では、核酸増幅の検出工程で表面プラズモン測定を用いているが、この表面プラズモン測定は、測定する試料溶液の温度に依存し共鳴周波数が大きく変化するという問題がある。つまり、ＰＣＲのような急激な温度の上昇・下降を必要とする反応を測定する場合、急激な温度変化に伴う共鳴周波数の変化がノイズとなり得る。そのため、一定温度条件で測定する必要があった。更に、表面プラズモン測定はエバネッセント波に基づく検出方法であるため、エバネッセント波の存在する領域、つまり、基体上の固定化された核酸プローブから数百ｎｍの領域での屈折率変化を信号として検出する事となる。よって基体上の核酸プローブ以外の反応も信号として検出してしまうため、事実上、洗浄操作が必要となり、煩雑であるばかりか、増幅反応の進行状況を同時に検出することは非常に困難である。

よって、本発明の目的は、複数の目的遺伝子の遺伝子増幅反応における核酸増幅の有無または増幅された核酸の量を、遺伝子増幅反応と同時に検出することが可能であり、ならびに遺伝子増幅反応時の温度変化の影響を受けず、かつ核酸プローブとの反応のみを検出することにより正確に検出することが可能である標的核酸検出方法および、この方法に用いる検査キットを提供することにある。

即ち本発明は、試料中の標的核酸の有無、もしくは量を検出する方法であって、
基体と、該基体の表面に固定された微小金属構造体とを備え、前記微小金属構造体に前記標的核酸と相補的な核酸プローブが固定されている検査チップを用意する工程と、
前記検査チップに前記試料と遺伝子増幅反応試薬とを混合して接触せしめる工程と、
前記接触後に前記検査チップ上で遺伝子増幅反応を行う工程と、
局在プラズモン共鳴を利用して前記検査チップの光学的特性を検出する工程と、を含むことを特徴とする標的核酸検出方法である。

更に本発明は、試料中の標的核酸の有無、もしくは量を検査する検査キットであって、
遺伝子増幅反応試薬と、局在プラズモン共鳴用の検査チップとを備え、
前記検査チップは、基体と、該基体の表面に固定された微小金属構造体とを有し、
前記微小金属構造体には前記標的核酸と相補的な核酸プローブが固定されていることを特徴とする標的核酸検査キットである。

本発明の方法及び検査キットを用いることによって、多種多様の遺伝子に対し、複数種を同時に検査でき、また核酸プローブへの蛍光色素等の修飾も必要なく、更に核酸が増幅する工程を検査素子の光学的特性検出する工程と同時に行うことが可能となる。つまり、遺伝子検出のスループット化、簡便化、低コスト化、高精度化が可能となり、遺伝子検出をベースとした分野で広範囲に利用できる。

また本発明は、急激な温度変化を必要とする核酸増幅反応の進行状況を同時かつ簡便に検出することが特徴であり、下記のような効果を有する。

本発明の検出方法は、特開２００３−３２５１９９号公報に開示の方法と比較し、反応温度の変化による信号への影響が少ない。そのため、一定温度条件下での測定を必要とせず、異なる温度で測定する場合でも温度変化に対する信号の補正や対照反応槽あるいは対照反応容器などを必ずしも必要としない簡便な核酸検査方法である。

更に本発明は、特開２００３−３２５１９９号公報に開示の方法と比較し、核酸プローブの伸張反応等が生じる基体の極近傍のみを信号として捉えるため、特別な洗浄工程、洗浄機構などを必ずしも必要としない簡便な核酸検査方法である。

また本発明は、特表２０００−５１２１３８号公報に開示の方法と比較し、核酸プローブへの蛍光色素等の修飾が不要であるため、核酸プローブを低コストで用意することが可能な核酸検査方法である。

更に本発明は、特表２０００−５１２１３８号公報に開示の方法と比較し、核酸プローブへの蛍光色素等の修飾が不要であるため、複数種の遺伝子を同時に検査することが可能な核酸検査方法である。

本発明は、試料中の標的核酸の有無、もしくは量を検出する方法であって、
基体と、該基体の表面に固定された微小金属構造体とを備え、この微小金属構造体に前記標的核酸と相補的な核酸プローブが固定されている検査チップを用意する工程と、
この検査チップに標的核酸を含む試料と遺伝子増幅反応試薬とを混合して接触せしめる工程と、
この接触の後に前記検査チップ上で遺伝子増幅反応を行う工程と、
前記検査チップの光学的特性を検出する工程と、を含むことを特徴とする標的核酸検出方法である。

更に本発明は、上記の標的核酸検出方法において、前記遺伝子増幅反応を行う工程と、前記検査チップの光学的特性を検出する工程と、を同時に行うことを特徴とする標的核酸検出方法である。

更に本発明は、試料中の標的核酸の有無、もしくは量を検査する検査キットであって、
遺伝子増幅反応試薬と、検査チップとを備え、
前記検査チップは、基体と、該基体の表面に固定された微小金属構造体とを有し、
前記微小金属構造体には前記標的核酸と相補的な核酸プローブが固定されていることを特徴とする標的核酸検査キットである。

本発明に係る測定方法の一例の概略を、図を用いて説明する。なお、図に示す検出用チップを用いる場合には、例えば、以下の手順に従って本発明の検出方法を実施することができるが、この手順に限定されるものではない。

始めに、検体試料を含む遺伝子増幅反応試薬を、図１に示す検査チップ１の遺伝子増幅溶液添加用の穴３ａから、検査素子２および反応用基板３、４から構成される反応容器内に加える。その後、図示しない遺伝子増幅反応用装置のヒーター５を検査チップ１に押し当て、遺伝子増幅反応が実施可能な温度を与える。また、前記遺伝子増幅反応により、微小金属構造体６上に固定化した核酸プローブ９に、標的となる遺伝子またはその増幅産物が会合し、ポリメラーゼによって、核酸プローブ９が伸張する。

また、前記プローブ９の伸張により、微小金属構造体６近傍において密度の変化が生じ、この密度変化を、局在プラズモン共鳴を利用して測定を行うことで、ＤＮＡ伸張の有無、つまり、標的とする遺伝子の有無および数が検出可能となる。

また、局在プラズモン共鳴を利用する測定は、図１に示した例のように検査チップに対して光を入射し、その透過光や反射光を受光することで行う。

更に、この局在プラズモン共鳴測定に基づく標的核酸の検出は、複数種の遺伝子を同時に検査することもできる。例えば、図５に示すように、同一の基体上に複数の反応領域（予め、微小金属構造体６を固定化した領域）を設け、その個々の領域に種類の異なる核酸プローブを固定化し、前記検査方法を実施することで、複数種の標的遺伝子（核酸）の検出を同時に行うことが可能である。

これにより、１つの検査チップ１を用いて、複数種の遺伝子を、遺伝子種ごとに試薬等を添加するといった煩雑な作業を伴うことなく増幅し、また、増幅した遺伝子（核酸）を取り出すことなく直接的かつ同時に検出することができる。

次に本発明の方法およびキットについて詳細に説明する。

＜核酸の種類＞
本発明の検出方法を適用することのできる核酸は、遺伝子増幅反応用のプライマーを設計することができ、そのプライマーを用いて遺伝子増幅反応を実施可能な塩基配列を有する核酸である限り、特に限定されるものではない。また、そのような核酸であれば、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれも利用でき、更に一本鎖および二本鎖のいずれの核酸も利用できる。そのような核酸が有する塩基配列としては検出対象である遺伝子をコードする配列の少なくとも一部を含むものが好適に適用できる。そのような配列を含む核酸の有無あるいは量を検出することにより、当該遺伝子の有無あるいはコピー数を調べることができる。核酸の由来は例えば、天然に存在する核酸（例えば、動物、植物、微生物、ウイルスに由来する核酸）あるいは、人工的に合成した核酸（例えば、化学的に合成した核酸、あるいは、遺伝子工学的に合成した核酸）のいずれも利用することができる。

また、本発明の検出方法を適用することのできる試料は、標的となる核酸を含む可能性がある限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料あるいは、環境由来の試料を挙げることができる。生物学的試料としては、例えば、動物の体液（例えば、血液、血清、血漿、ずい液、汗、唾液、尿など）もしくは、毛髪、***物、臓器、組織、または動植物それ自体もしくは、それらの乾燥体などを挙げることができる。環境由来の試料としては、例えば、河川水、湖沼水、もしくは海水、土壌などを挙げることができる。
＜遺伝子増幅反応＞
本発明の検出方法で実施する遺伝子増幅反応は、核酸を鋳型として、遺伝子増幅反応を行うことができる反応である限り、特に限定されるものではないが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が好ましい。

検出対象遺伝子（核酸）がＤＮＡである場合には、ＰＣＲ法により実施することができる。ＰＣＲ法は、通常のプロトコールであれば、特に限定なく用いられるが、例えば、初期変性反応を実施した後、次の（１）乃至（３）の工程からなる増幅サイクルを繰り返すことにより、遺伝子増幅を実施することができる。すなわち、（１）ＤＮＡの変性工程（９０℃以上９４℃以下で３０秒間）、（２）１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング工程（５０℃以上５５℃以下で３０秒間）、及び（３）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（７０℃以上７５℃以下で１分間以上２分間以下）。ここで、初期変性反応は、例えば９７℃で２分間以上３分間以下で行うことができる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとして例えばＴａｑポリメラーゼを用いることができる。増幅サイクルについては例えば１５回以上４５回以下に設定することができる。ここで、遺伝子増幅に関しての条件（温度条件や反応時間など）は、標的核酸の状態（例えば、血清状態や精製状態等）や、増幅させる標的核酸の長さ等により決まるものであり、必ずしも上記条件に限定されるものではない。また、前記反応条件は、３ステップ法での例であって、本発明は２ステップ法を用いることもできる。

また検出対象遺伝子がＲＮＡである場合には、例えば、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法により実施することができる。すなわち、通常の逆転写酵素及びオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて、逆転写反応を実施した後、前記ＤＮＡの場合と同様に、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）を用いて、初期変性反応及びそれに続く増幅サイクルを繰り返すことができる。

さらに、本発明の検出方法により標的核酸を定量的に検出する場合には、遺伝子増幅反応に用いる増幅用プライマーは、検査チップに固定されている核酸プローブと同一である方を加えずに遺伝子増幅反応を行うことが好ましい。
＜検査素子＞
本発明で用いる、基体と、その基体の表面に固定された微小金属構造体とを備えた検査素子とは、局在プラズモン共鳴を誘起し得る光学デバイスを意味している。この検査素子は、図２に示されるように、金や銀などの微小金属構造体６と、ガラスやプラスチックなどの基体２とから構成されている。

本発明に係る微小金属構造体は、例えば、球形、ロッド型、針状、中空素子、異なる金属の層状構造、誘電体との層状構造、チューブ型等を挙げることができ、本発明の効果を達成し得る形状であれば特に制限れるものではなく、例えば、凹凸、突起を有していてもよい。

また、前記基体の形状は、本発明の効果を達成し得る形状であれば特に制限されるものではない。例えば、平面構造体、多孔質構造体、微粒子集合体、柱状構造体、中空カラム構造体、凸状構造体、凹状構造体、突起状構造体、繊維状構造体などから選ばれるいずれか１つ以上の形状を含んでもよい。また、本発明の検査素子の作製方法には、微細加工技術等が利用できる。例えば、前記基体上に金属薄膜を真空蒸着法やスパッタ法などで成膜し、その上に電子線レジストをスピンコートにより成膜する。その後、電子線描画装置で露光し、現像、エッチング等を行うことで、前記検査素子を得ることができる。また、前記電子線描画装置の他、集束イオンビーム加工装置、Ｘ線露光装置あるいは紫外線露光装置など、種々の微細加工技術等が利用できる。

また、前記微小金属構造体に含有される金属元素は、局在プラズモン共鳴が生じうる金属元素であればよく、限定されるものではないが、その中でも金、銀、銅、白金あるいはアルミニウムなどが好ましい。

本発明に係る微小金属構造体の大きさは、局在プラズモン共鳴が生じうる大きさであればどのようなものでも利用できるが、好ましくは外周部における任意の一点から他の点までの距離が１０ｎｍ以上１４５０ｎｍ以下の範囲内にあることが好ましい。さらに好ましくは５０ｎｍ以上４５０ｎｍ以下の範囲にあることが好ましい。この場合、任意の２点間の最大距離がこの範囲に入っていればよい。

本発明に係る微小金属構造体は互いに離隔した状態で基体上に固定されることが好ましく、更には５０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の間隔で離隔されていることが好ましい。
＜検査チップ＞
本発明における検査チップには、本発明の検査素子の有する微小金属構造体に標的となる遺伝子（核酸）を認識する核酸プローブが、所定の間隔またはランダムに１種以上配置されている。標的となる核酸を認識する核酸プローブは、標的核酸の塩基配列と相補的な配列を有するように設計する。

また前記検査チップは、標的とする遺伝子（核酸）が複数である場合は、それぞれの種類に応じて反応領域を複数に増やし、それぞれの反応領域に種類の異なる核酸プローブを配置してもよい。さらにこの核酸プローブは、核酸増幅（遺伝子増幅反応）を実施する際に必要なプライマー（合成核酸）やペプチド核酸、また、標的とする遺伝子（核酸）を認識する核酸断片であってもよい。

また、核酸プローブ９の微小金属構造体への固定は、既知のオリゴヌクレオチドの固定化方法が利用できる。例えば、硫黄原子を持つ有機物が金などの金属表面に硫黄原子を介して共有結合することを利用する方法が挙げられる。この場合オリゴヌクレオチド合成時にオリゴヌクレオチドの末端にチオール基を導入したプライマーの溶液を、表面を洗浄したＤＮＡ検出チップの金属箔膜上に滴下することにより行うことができる。また、予めストレプトアビジンを微小金属構造体に吸着させ、ビオチン修飾核酸プローブをストレプトアビジンに選択的に結合させて固定化する方法等が上げられる。さらに前記固定化溶液の滴下には、所定の微小金属構造体にのみ試薬を滴下することが可能な位置制御機能を有するノズルを持った装置（例えば、ＤＮＡアレイヤー、インクジェット装置など）を用いてもよい。

また、前記検査チップを用いて遺伝子増幅反応を検査する場合、標的核酸を含む試料と混合した遺伝子増幅反応試薬に核酸プローブが固定化された微小金属構造体が接触していればよい。その形状（プレート状、キャピラリー上、反応チューブ状など）に限定されるものではないが、好ましくは、遺伝子増幅反応用の容器を兼ね備えた検査チップがよい。

以下、添付図面に沿って、前記検査チップの１例について説明する。図３には、本発明の検査チップ１の構成が示されており、ここでの検査チップ１は、検査素子２と、複数枚の反応用板３、４とを重ね合わせて一体化することにより構成した場合の例を示している。ここで本発明における検査チップは、前記検査素子上の微小金属構造体に標的となる遺伝子を認識する核酸プローブが固定化された状態を意味する。それゆえ、図１、３に示すように、必ずしも遺伝子増幅用の反応槽が一体化されている必要はなく、例えば、別途設けた遺伝子増幅用反応槽に前記検査チップを接触させる方法や、前記反応槽中の遺伝子増幅溶液に前記検査チップを接触させてもよい。

また反応用基板３には、遺伝子増幅反応試薬等の添加用の穴（３ａ、３ｂ）が設けられており、図示していない加温装置からのヒーター５を上部および下部、または上下から基板に押し当てることで、遺伝子増幅反応を行うことができる。またヒーター５は、遺伝子増幅反応が実施可能な熱源であればよく、ペルチェ素子、ヒートブロック、温水または温風等であっても構わない。
＜検査キット＞
本発明の遺伝子検出キットとしては、
（１）遺伝子増幅反応試薬、
（２）検査チップ、
を備えていることを特徴とする。

本発明の遺伝子検査キットに備わる検査チップは、本発明の検出方法において開示した検査チップと同じものである。

ここで遺伝子増幅反応試薬とは、遺伝子増幅反応を実施可能にするために必要な試薬を少なくとも一つ以上備え、例えば遺伝子増幅反応が、ＤＮＡを鋳型とする通常のＰＣＲであれば、従来一般的に実施されているＰＣＲを実施可能な試薬が利用できる。このような試薬としては例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー、ＭｇＣｌ、ｄＮＴＰ混合液、フォワードプライマー、リバースプライマーまたは滅菌水があげられる。よって、これらの試薬のうち、少なくとも一つ以上をそれぞれ個別の状態で備える遺伝子増幅反応試薬が好適に利用できる。あるいは、上記の試薬を適宜、混合した状態で提供されてもよい。

また、上記の試薬に限定されるものではなく、反応促進試薬などを添加してもよい。また、遺伝子増幅反応がＲＮＡを標的核酸とする場合は、逆転写反応を行うための逆転写酵素等の試薬を更に有していてもよい。

本発明の検査キットでは、前記遺伝子増幅反応により、検査チップ上の核酸プローブに標的核酸が結合する工程や、また、前記核酸プローブが伸張する工程を、局在プラズモン共鳴を利用して直接検査する。それによって、試料中における標的核酸の有無および量（例えばコピー数）を判定できる。

例えば、標的とする遺伝子（核酸）を含む試料を用いて前記遺伝子増幅反応を行う場合、検査チップ上の核酸プローブに標的核酸ならびにその増幅産物が結合し、それにより前記核酸プローブは伸張する。さらに増幅サイクルを繰り返すに従い、核酸プローブへの標的核酸の結合量および伸張反応量が増加する。

一方、標的とする遺伝子（核酸）を含まない試料を用いて前記遺伝子増幅反応を行う場合、検査チップ上の核酸プローブに対する標的核酸の結合や、前記核酸プローブの伸張は起こらない。本発明の検査キットでは、前記遺伝子増幅反応で生じる前記核酸プローブへの結合や核酸プローブの伸張を、局在プラズモン共鳴を利用した測定により検出することで、標的核酸の有無および量を検出することができる。

さらに、検出工程は遺伝子増幅反応工程と同時に行ってもよく、この方法では、標的となる核酸を増幅しながら増幅された核酸が同時に検出されるので、増幅の１サイクルにより増幅される核酸量をリアルタイムで測定することができる。

また本発明の核酸分析方法および検査キットは、上述したような試料中の標的核酸の有無及び量を検出するのみならず、標的核酸の塩基配列における１塩基変異の有無を検出することにも利用することができる。この場合には、例えば３’末端あるいは３’末端から３塩基以内を標的核酸の配列の１塩基変異部分に一致するように設計した、１塩基変異タイプの標的核酸と相補的な配列からなる変異プローブを使用することができる。この変異プローブを用いて遺伝子増幅反応を行うと、目的とする１塩基変異を含む核酸のみが検査チップ上に増幅される。増幅された核酸を前記同様に検出することにより、１塩基変異遺伝子（核酸）を検出することができる。

以下、本発明の実施例を説明する。なお、本発明における遺伝子増幅反応には、従来一般的に実施されているＰＣＲと同様の反応条件が適応できる。また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関しては、現在ＰＣＲに利用されている酵素に限定されるものではない。さらに、下記に記載する反応手順も一例であり、これに限定されるものではない。
（実施例１）
本実施例は、石英ガラスを基体として用い、微小金属構造体として金微粒子を基体上に固定化し、さらに金微粒子表面に核酸プローブを固定化して検査チップを作製する。この検査チップと遺伝子増幅反応試薬を用いて、遺伝子増幅反応を起こし、検査チップを透過した光により特定の遺伝子の有無、もしくは分子数を検出する例である。

本実施例のように、微小構造体を有する検査チップを用いることで、標識物質を用いるといった煩雑な検出操作を行うことなく、安価に核酸の検出を行うことが可能となる。
＜検査チップの作製＞
予め底面にアミノ基が導入された石英ガラス（シンエツ製；石英ウェハーにシランカップリング剤（ＫＢＭ９０３：アミノ基導入試薬）をコーティングしたものをシンエツより購入）を用いる。この石英ガラスに平均粒径１００ｎｍの金微粒子コロイド溶液（田中貴金属社製）の原液を純水で３０％に希釈したものを導入して室温で２４時間浸漬後、純水で洗浄した後チッソガスで乾燥することで検査素子を作製する。

次に、核酸プローブを、５’末端に修飾しチオール基を介して前記検査素子（金微粒子）表面に固定化する。その後、図３に示すように、検査素子１と反応用板３、４をはり合わせ、これを検査チップとする。
＜遺伝子増幅反応試薬の付与＞
遺伝子増幅反応試薬（ＴＯＹＯＢＯ製）は、ｄＮＴＰｍｉｘ ５μｌ、１０×ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、２５ｍＭ−ＭｇＣｌ₂ ８μｌ、ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １μｌ、ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ５μｌ、ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ５μｌ、Ｈ₂Ｏ ２０μｌからなり、これに標的核酸（試料）としてｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ１μｌを混合し、５０μｌの溶液を調整する。その後、前記検査チップ内に前記反応試薬を添加する。
＜遺伝子増幅反応＞
遺伝子増幅反応は、初期変性反応（９５℃：５ｍｉｎ）を実施後、下記（１）乃至（３）の工程を１サイクルとする温度サイクルを３５サイクルさせる。（１）ＤＮＡの変性工程（９５℃：３０ｓｅｃ）、（２）１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング工程（６３℃：３０ｓｅｃ）、及び（３）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（７２℃：３０ｓｅｃ）。
＜光学的特性の検出＞
次に、検出装置の例を説明する。尚、本実施例は検査チップを透過した光により検出を行う例である。

図４（ａ）は本実施例による検出方法を模式的に示した図である。また、図示しない検出装置は、検査チップの保持機構、光源、受光素子を備える。

検出時の光源の位置は、図４（ａ）に模式的に示すように、検査チップに測定光を照射しえる位置にあり、受光素子の位置は検知素子を透過した測定光の特性を検出しうる位置にある。尚、この他に、図示しない分光検出器が受光素子に備えられていても構わない。さらには、図示しないが、検出した特性変化を演算する演算装置、検出結果を表示する表示手段等が備えられていることが好ましい。

次に、核酸を検出する例を説明する。

まず、検査チップに、標的核酸としてヒトゲノムを加えた前記遺伝子増幅反応試薬を添加し、検査チップ内の核酸プローブと接触させ、図４（ａ）の位置関係に検査チップ、光源、受光素子を配置し、スペクトルを検出する。

次に遺伝子増幅反応を行い、その後再び、上記検出時と同様な位置関係に検査チップ、光源、受光素子を配置し、スペクトルを検出する。

遺伝子増幅反応によるスペクトル変化は、微小金属構造体の局在表面プラズモン共鳴状態の変化に由来するものであり、微小金属構造体上で核酸プローブの伸張反応が起こり、遺伝子増幅試薬内に標的とする遺伝子が含まれていることを意味する。よって、スペクトル変化を検出することで、検体中の標的遺伝子の有無を検知することが可能となる。

尚、ここではスペクトルの変化と記載したが、このスペクトル変化は、最大値をもつ波長でのスペクトルピークの変化でもよいし、スペクトルピーク波形の半値幅等ピーク形状の変化をもちいてもよい。さらには、一つあるいは、複数の波長点での光強度をもちいても構わない。

以上のように、本発明により、検体中の標的遺伝子を蛍光物質のような標識を行うことなく検出することが可能となる。
（実施例２）
本実施例は、基体として石英基板を用い、微小金属構造体として金ドットパターンを基体上に形成し、さらに金ドットパターン表面に複数の核酸プローブを固定化して検査チップを作製する。この検査チップと遺伝子増幅反応試薬を用いて、標的核酸を鋳型として遺伝子増幅反応を起こしながら、同時に、検査チップに反射した光により特定の遺伝子の有無、もしくは量を検出する例である。

本発明によれば、核酸プローブが固定された反応領域を基体上に複数形成することが可能であり、マルチ検出が可能と成る。また、反応と同時に検出を行うことで、リアルタイム検出が可能となる。
＜検査チップの作製＞
予め底面にアミノ基が導入された石英ウェハー（シンエツ製）に、微細加工技術を用いて金ドットパターンを形成し、検査素子を作製する。金ドットパターンでの金ドットの径は約２００ｎｍ、金ドット間の間隔は約５００ｎｍである。

次に、図５に示すように、４種類の核酸プローブをそれぞれ異なる反応領域（微小金属構造体が複数固定されて形成された領域）に、５’末端に修飾しチオール基を介して前記検査素子（金微粒子）表面に固定化する。その後、図３に示すように、検査素子１と反応用板３、４をはり合わせ、これを検査チップとする。
＜遺伝子増幅反応＞
遺伝子増幅反応は、初期変性反応（９５℃：５ ｍｉｎ）を実施後、下記（１）乃至（３）の工程を１サイクルとする増幅サイクルを３５回サイクルさせる。（１）ＤＮＡの変性工程（９５℃：３０ ｓｅｃ）、（２）１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング工程（６３℃：３０ ｓｅｃ）、及び（３）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（７２℃：３０ ｓｅｃ）。
＜光学的特性の検出＞
次に、検出装置の例を説明する。尚、本実施例は検査チップに反射した光により検出を行う例である。

本実施例における検出方法は、検査チップの反応領域に対して光を照射する光源と、反応領域からの反射光を受光する受光素子とを備える検出装置により行う。検出時の光源の位置は、図４（ｂ）に模式的に示すような、検査素子内反応領域中の微小金属構造体に対して測定光を照射しえる位置である。また、受光素子の位置は検査素子を反射した測定光の特性を検出しうる位置である。

尚、この他に、図示しない分光検出器が受光素子に備えられていても構わない。さらには、図示しないが、上記の検出装置に受光素子が受光した光を信号に変換する信号変換手段、および検出した特性変化を演算する演算装置を更に備えた構成の装置は、試料中の標的核酸の有無あるいは量を検出する装置として好適に用いることが出来る。また、検出結果を表示する表示手段を更に備えていてもよい。

尚、本実施例では、複数の反応領域に対して検出を行う。よって各反応領域それぞれに対して、光源および受光素子が備えられてもよいが、光源および受光素子に対して、各反応領域を検出位置に配置するために検査チップを移動させる移動手段や、逆に各反応領域に対して光源および受光素子を検出位置に配置するための移動手段を設けることがより好ましい。もしくは、各反応領域に対して検出可能な方向に測定光を屈折させる手段等を設けてもよい。

次に、標的遺伝子（核酸）を検出する例を説明する。

まず、検査チップに標的遺伝子（核酸）としてヒトゲノムが含まれた試料と混合した遺伝子増幅反応試薬を添加し、検査チップ内の核酸プローブと接触させ、遺伝子増幅反応を開始する。更に、それぞれの反応領域において、遺伝子増幅反応における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（７２℃：３０ｓｅｃ）のスペクトルをサイクル（１サイクルから３５サイクル）毎に検出する。

耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（７２℃：３０ｓｅｃ）のスペクトル変化は、微小金属構造体の局在表面プラズモン共鳴状態の変化に由来するものである。この変化は、微小金属構造体上で核酸プローブの伸張反応が起こり、遺伝子増幅反応試薬内に標的とする遺伝子が含まれていることを意味する。また、温度サイクル毎に前記スペクトルを検出することで、標的遺伝子（核酸）のリアルタイム検出が可能となる。

また、ここでスペクトルの変化と標的遺伝子（核酸）の初期コピー数の関係については、あらかじめ、既知の複数濃度（コピー数）の標準検体を用いて、スペクトル変化と濃度の関係を取得しておく。この関係をもとに検量線を求めスペクトル変化と濃度の関数を求めておけば、この関数を用いて、実際の計測時のスペクトル変化から標的核酸の初期コピー数を求めることができる。

尚、ここではスペクトルの変化と記載したが、このスペクトル変化は、最大値をもつ波長でのスペクトルピークの変化でもよいし、スペクトルピーク波形の半値幅等ピーク形状の変化をもちいてもよい。さらには、一つあるいは、複数の波長点での光強度をもちいても構わない。

以上のように、本発明により、核酸プローブが固定された反応領域を基体上に複数形成することが可能であり、マルチ検出が可能と成る。また、反応と同時に検出を行うことで、リアルタイム検出が可能となる。

本発明の一実施形態にかかる検査チップの図である。 本発明の一実施形態にかかる検査素子の図である。 本発明の一実施形態にかかる検査チップの分解斜視図である。 本実施形態にかかる検査チップにおける局在プラズモン共鳴を利用した検出原理の概念図である。（ａ）透過光タイプ（ｂ）反射光タイプ 本実施形態にかかる検査チップにおいて、複数の遺伝子を同時に検査するための検査素子の概念図である。

符号の説明

１ 検査チップ
２ 基体
３ 反応用基板（１）
３ａ 試料添加用開口部
３ｂ 試料添加用開口部
４ 反応用基板（２）
５ ヒーター
６ 微小金属構造体
７ 検査素子
８ 光源
９ 核酸プローブ
１０ 受光素子
１１ 反応領域Ａ
１２ 反応領域Ｂ
１３ 反応領域Ｃ
１４ 反応領域Ｄ

Claims (3)

1. 試料中の標的核酸の有無、もしくは量を検出する方法であって、
   基体と、該基体の表面に固定された微小金属構造体とを備え、前記微小金属構造体に前記標的核酸と相補的な核酸プローブが固定されている検査チップを用意する工程と、
   前記検査チップに前記試料と遺伝子増幅反応試薬とを混合して接触せしめる工程と、
   前記接触後に前記検査チップ上で遺伝子増幅反応を行う工程と、
   局在プラズモン共鳴を利用して前記検査チップの光学的特性を検出する工程と、を含むことを特徴とする標的核酸検出方法。
2. 前記遺伝子増幅反応を行う工程と、局在プラズモン共鳴を利用して前記検査チップの光学的特性を検出する工程と、を同時に行うことを特徴とする請求項１に記載の標的核酸検出方法。
3. 試料中の標的核酸の有無、もしくは量を検査する検査キットであって、
   遺伝子増幅反応試薬と、局在プラズモン共鳴用の検査チップとを備え、
   前記検査チップは、基体と、該基体の表面に固定された微小金属構造体とを有し、
   前記微小金属構造体には前記標的核酸と相補的な核酸プローブが固定されていることを特徴とする標的核酸検査キット。

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