JP4889206B2 - Il−12産生誘導活性を有するマクロファージ活性化剤 - Google Patents
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また、IL-12産生誘導を伴うマクロファージの活性化に関する報告が少なかったことより、マクロファージ活性化及びIL-12の産生を誘導する新たな手段が求められていた。
インターロイキン12産生誘導活性を有し、酸性ムコ多糖類が、下記の構造式(I)で示される化合物であり、構造式(I)で表わされる化合物が、マクロファージ活性化剤の全重量基準で少なくとも0.001重量%含まれるマクロファージ活性化剤を要旨とする。
本発明の第2の態様は、海洋細菌が生産する酸性ムコ多糖類又はその生理学的に許容される塩を有効成分として含むマクロファージ活性化剤であって、
インターロイキン12産生誘導活性を有し、酸性ムコ多糖類が、下記の構造式(I)で示される化合物であり、構造式(I)で表わされる化合物が、マクロファージ活性化剤の全重量基準で少なくとも0.001重量%含まれる免疫賦活剤を要旨とする。
また、マクロファージ活性化及びIL-12の産生を誘導する新たな手段が提供される。
(マクロファージ活性化剤)
本発明者等は、優れたマクロファージ活性化効果を有する物質を見出すべく、マウス由来マクロファージ様細胞株を用いて検索した。その結果、海洋細菌が生産する酸性ムコ多糖類が、マクロファージ活性を有することを知見した。また、上記酸性ムコ多糖類は、IL-12産生を誘導すると共に、細胞毒性が極めて弱く、免疫賦活化剤として極めて有効であることを見出した。即ち、本発明は、上記知見に基づいて完成されたものであり、海洋細菌が生産する酸性ムコ多糖類を有効成分として含有するマクロファージ活性化剤に関する。
かかる酸性ムコ多糖類としては、海洋細菌シュードモナス・エスピーWAK-1 (Pseudomonas sp. WAK-1)菌株又はその変異株の培養物より分離精製された酸性ムコ多糖類を用いることが好ましい[マツダ(M.Matsuda)ら: Fisheries Science, 63, 983-988(1997)]。これら「酸性ムコ多糖類」は、本明細書において単に「WAK-1-A」又は「多糖類WAK-1-A」と表記する。多糖類WAK-1-Aは、すでに公知の物質であり上記構造式(I)で示される化合物である[上記マツダ (M.Matsuda)ら: 1997]。また、上記WAK-1-Aは、軟骨培養細胞増殖促進効果を有することが知られているが、これをマクロファージ活性化及びサイトカイン類の誘導活性、特にIL-12産生誘導剤として使用したという報告は、現在までに全く知られていないものである。
上記WAK-1-Aは、マクロファージ活性化及びIL-12産生誘導を促進することができることから、免疫効果が期待される医薬分野、健康食品分野及び化粧品分野に有用な素材を提供することができる。特に花粉症やアトピー性皮膚炎などのアレルギーやリウマチなどの自己免疫疾患及びがんの予防又は治療に有効である。
上記マクロファージ活性化剤を免疫賦活組成物として用いる場合、有効成分であるWAK-1-Aと医薬品又は食品に一般に用いられている各種成分、例えば、油分、保湿剤、防腐剤、殺菌剤、色剤、粉末、香料、増粘剤、緩衝剤などを、その剤形にあわせ、本発明の効果を損なわない範囲で適宜配合することにより調製される。また、上記免疫賦活組成物に、WAK-1-Aを配合するに当たっては、これら化合物のマクロファージ活性化及びIL-12産生誘導作用を考慮することが好ましく、一般にはこれら化合物を有効成分として少なくとも0.001重量%以上、好ましくは0.01〜20.0重量%程度添加すればよい。必ずしも有効成分を単離して使用する必要はなく、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、本発明の化合物を含む粗精製物を使用することができる。免疫賦活組成物の剤型は任意であり、例えばカプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、ドリンク剤等の可溶化系、乳液またはクリーム等の乳化系、あるいは軟膏または分散液などの剤型をとることができる。
上記免疫賦活剤は、優れた免疫賦活効果を示すと共に、安定性及び高い安全性を併せ持つ。例えばがん、ウイルス病、アトピー性皮膚炎等の発生を防ぐことができる。また既に発症しているがん、ウイルス病、アトピー性皮膚炎等の治療に使用できる。
上記WAK-1-Aは、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。WAK-1-Aの調製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、海洋微生物を炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを含有する海水を寒天で固めた培地で培養して多糖類を生産し、採取、精製して得ることができる[マツダ(M.Matsuda)ら、日本水産学会誌,58, 1735-1741(1992)]。また、海洋微生物を所定の培地において培養して多糖類を生産するに際し、海水よりも高濃度の塩化ナトリウム含有培地において微生物を培養することを特徴とする多糖類の生産方法によることもできる(特開2003-274928号公報参照)。より具体的には、例えば寒天平板培養では、炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを含有する多糖類生産用海水培地を寒天で固めた培地においてシュードモナス・エスピーWAK-1(Pseudomonas sp. WAK-1)菌株又はその変異株を培養し、寒天平板上に生じた粘質物中からWAK-1-Aを分離、精製して得ることができる。
次に、有効成分としてのWAK-1-Aの製造方法について、好ましい1実施形態を挙げて説明する。尚、WAK-1-Aの生産方法は以下の製法に限定されないことはいうまでもない。
好ましい1実施形態としてのWAK-1-Aの製造方法は、(a)高濃度の塩化ナトリウムを含有する培地を調製する工程と、(b)上記培地において微生物を培養し多糖類を生産する工程と、(c)生産されたWAK-1-Aを抽出・回収する工程と、任意の工程として(d)生産されたWAK-1-Aを分離・回収する工程と、(e)緩やかな攪拌又は弱い嫌気条件で培養を行う工程と、を有する。
(a)高濃度の塩化ナトリウムを含有する培地を調製する工程
まず、海水よりも高濃度の塩化ナトリウムを含有する培地を調製する。この場合、培地中の塩化ナトリウム濃度が5.5〜8.0%(W/V)となるように調製することが好ましい。さらに好ましくは上記した本発明の培地を用いることが望ましく、その際に炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを用いることがより望ましい。
(b)上記培地において微生物を培養し多糖類を生産する工程
上記のようにして調製した培地を用いて微生物を培養して目的の多糖類を生産するわけであるが、WAK-1-Aを得るためには微生物としてシュードモナス(Pseudomonas)属を用いることが好ましい。さらに好ましくはシュードモナス・エスピーWAK-1(Pseudomonas sp.WAK-1)菌株又はその変異株を用いることが望ましい。微生物としてシュードモナス・エスピーWAK-1(Pseudomonas sp.WAK-1)菌株又はその変異株を用いることで、WAK-1-Aを効率的に生産することができる。
そして、以下に説明する抽出・回収工程を経ることにより高純度のWAK-1-Aを高収率で得ることが可能となる。
上記製造方法で得られた培養液からWAK-1-Aを抽出する方法としては、従来公知の方法を用いることができる。例えば、培養液をそのまま、あるいは高温で殺菌した後で、遠心分離により菌体を除去し、これをそのまま、あるいは濃縮してから、2〜3倍量のエタノール、イソプロパノール、あるいはアセトン等を加え、沈殿を生じさせる。この沈殿物を再度、水あるいは1〜15重量%塩化ナトリウム溶液に溶解させた後で、アルコール等による沈殿を2〜3回繰り返し、水で透析を行い、噴霧乾燥や凍結乾燥機等を用いて乾燥させることにより、WAK-1-Aを得る。これ以外にも電気透析法や限外濾過法も利用することができる。さらに精製するためには、イオン交換、ゲル濾過等の各種クロマトグラフィーや第4級アンモニウム塩による沈殿や塩析などを用いることができる。
上記した抽出・回収方法により、多糖類を抽出・回収することが可能であるが、任意の工程として、本発明者らが先に出願した特開2002-065292号に開示された、シュードモナス属に属し、WAK-1-Aを生産する能力のある細菌を液体培地中実質的に静置の条件で培養し、培養物中にWAK-1-Aを生産蓄積させ、これを採取することを特徴とするWAK-1-Aの分離方法を併用してもよい。かかる分離方法を併用することにより、効率的にWAK-1-Aを分離回収することができる。
上記の知見より、本発明はさらに任意の工程として(e)緩やかな攪拌又は弱い嫌気条件で培養する工程を有してもよい。
(参考例1)
ペプトン0.5%、 酵母エキス0.1%、蔗糖3%の組成を有し海水で調製した培地を、温度121℃としたオートクレーブ中で20分間滅菌し、シュードモナス・エスピーWAK-1 (Pseudomonas sp. WAK-1)菌株の保存用斜面培養から、1白金耳を試験管中の上記滅菌培地(10ml)に接種し、25℃の温度で24時間振とう培養を行い、次いでこの前培養液を500ml容の三角フラスコ中に上記組成に食塩3%を追加した組成を有し海水で調製した滅菌培地200ml(121℃、20分間)に接種し、25℃の温度で5日間の静置培養を行った。培養後培養液を濾過助剤(セライト)を用いて濾過し、菌体を除いた上澄液に、2倍量のエタノールを加えて白色沈殿を得た。この沈殿物を採取して水200ml中に溶解し、この溶液に再度2倍量のエタノールを加えて多糖類を沈殿させ、凍結乾燥により粉末化とした。これをM/100 リン酸緩衝液(pH=7.0)に溶解し、予め同緩衝液で平衡化したDEAE−セルロースイオン交換カラムクロマトグラフィーにより吸着した画分から0.4M NaClで溶出される画分を集め、透析後凍結乾燥して酸性ムコ多糖類粉末を得た。
このようにして得られた多糖類については、セルロースアセテート膜電気泳動法を用いて均一性を確認すると共に、化学分析、核磁気共鳴分析により、公知の多糖類WAK-1-Aであることを確認した。
前培養までは参考例1と同様に処理し、次いでこの前培養液を500ml容の三角フラスコ中に上記組成を有する海水から調製した滅菌培地200ml(121℃、20分間)に接種し、25℃の温度で5日間緩やかな振とう培養を行った。培養後培養液を孔径0.2μmである中空糸MF膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置を用いて菌体を除き、この溶液から分子量5万カットの中空糸UF膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を短時間のうちに濃縮、脱塩回収し、凍結乾燥により粉末化した。これをM/100リン酸緩衝液 (pH=7.0)に溶解し、予め同緩衝液で平衡化したDEAE−セルロースイオン交換カラムクロマトグラフィーにより吸着した画分から0.4MNaClで溶出される画分を集め、透析後凍結乾燥して酸性ムコ多糖類粉末を得た。なお、上記膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製SYLS-SB04型を用いた。
このようにして得られた多糖類については、セルロースアセテート膜電気泳動法を用いて均一性を確認すると共に、化学分析、核磁気共鳴分析により、公知の多糖類WAK-1-Aであることを確認した。
前培養までは参考例2と同様に処理し、上記参考例2で述べた蔗糖を含む培地に寒天を1.5%添加した寒天培地250mlを平板(18×26cm)に広げて前培養液を塗沫し、25℃の温度で7日間培養を行った後、寒天平板の表面に生じた粘質物をかきとり、1%フエノール液に懸濁させ、参考例1と同じ方法で菌体を濾過により除いて得られた上澄液にエタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後5%第4級アンモニウム塩 (Cetavlon)溶液を加えて沈殿する画分を濾過により集めた。これを4MNaClに溶解し再度エタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後透析し凍結乾燥により多糖類を得た。これをM/100リン酸緩衝液(pH=7.0)に溶解し、予め同緩衝液で平衡化したDEAE−セルロースイオン交換カラムクロマトグラフィーにより吸着した画分から0.4MNaClで溶出される画分を集め、透析後凍結乾燥して酸性ムコ多糖類粉末を得た。
このようにして得られた多糖類については、セルロースアセテート膜電気泳動法を用いて均一性を確認すると共に、化学分析、核磁気共鳴分析により、公知の多糖類WAK-1-Aであることを確認した。
培養液には、10%(V/V)FBSを含むRPMI1640培地(コージンバイオ社製)を用いた。マウス由来マクロファージ様細胞株J774.1(Riken Cell Bank)を所定の濃度となるように含む上記培養液100μlずつを96穴プレートに播種し(1.5×105個/well)、マクロファージ細胞に分化誘導した後試料を添加して37℃、5%CO2下で培養した。試料は、10mg/mlの濃度となるように上記培養液に溶解した後0.2mmのフイルターで予め滅菌して使用した。24時間培養後、培養上清を回収し、酸化窒素(NO)が培地中で酸化されることによって生ずる亜硝酸イオン濃度をグリース試薬法で、IL-12の濃度をサイトカイン測定キット(BioSource International, Inc.)を用いてELISA法でそれぞれ測定した。なお、IL-12濃度はIL-12p40 + p70を測定した。NO産生量は、陽性コントロールであるLPS(10mg/ml)添加時のNO産生量を測定し、比活性(LPSのNO産生量に対するサンプルのNO産生量、単位:%)をNO産生能とした。これらの結果を図1及び図2にそれぞれ示す。
Claims (3)
- 前記構造式(I)で表わされる化合物が、前記マクロファージ活性化剤の全重量基準で0.01〜20重量%含まれることを特徴とする請求項1記載のマクロファージ活性化剤。
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