JP4887144B2 - バベシアワクチン - Google Patents
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Description
Bd37タンパク質又はそのコード配列と、この2つのBc28タンパク質又はそれらのコード配列のいずれかとの間に有意な配列の類似性はない。
物理的に、巨大分子構造中又は巨大分子構造上での捕捉を介して、連結させることによる。又は、好ましくは、
1つの連続した発現産物が最終的に産生されるような、2つのものをそれぞれコードすることができる核酸のフラグメントを含有する組み換え核酸分子の連結を介した、生物学的融合による。分子工学的技術が好ましい。
1.1 使用技術
1.1.1. 全体的技術
1.1.1.1. Babesia canis(バベシア キャニス)の培養
Babesia canis(バベシア キャニス)の分離株(A、B、Castres、Gignac、34.01及びRobinと称する。)を、フランスの様々な部門からの自然感染したイヌから得た。Schettersら(1997、Parasitology,vol.115,p.485−493)の方法に従い、これらをインビトロ培養で維持した。
T3及びT7ユニバーサルプライマー及び既に確立された各鎖の配列由来の様々なオリゴヌクレオチドを用いて、選択したプラスミドの両鎖において、Genome Express S.A.(Zone Astec,Grenoble,France)により、Sangerら(1977、Proc.Natl/Acad.Sci.USA,vol.74,p.5463−5467)の方法に従い、アルカリ変性させた2本鎖鋳型からのジデオキシチェーンターミネーション法を用いてヌクレオチド配列決定を行った。
ゲノムフラグメントの単離、プローブの生成及びPCR反応に使用したDNAプライマーを、個別の配列番号とともに表5に開示する。プライマーは全て、Sigma−Genosys(Cambridge,UK)により合成された。
製造者(Macherey−Nagel)に従い、Nucleospin(R)カラムを用いて血液200μlに対して、B.canis(B.キャニス)インビトロ培養物又は感染したイヌ血液の野外試料からのゲノムDNA抽出を行った。サザンブロット実験は、Sambrook&Russell(前出)の標準的手順を用いて行った。
トータルRNA抽出、mRNA精製及びRNAハイブリダイゼーションは、Drakulovskiら(2003、Infect.Immun.,vol.71,p.1056−1067)で述べられているようにして行った。ディゴキシジェニン(DIG)−11−UTP−標識Bc28アンチセンスリボプローブ(プライマー、Fspe3及びRspe4を使用して得た相補的mRNA配列)は、DIG High Prime(R)DNA標識キット(Boehringer Mannheim)に従い、合成した。
Depoixら(前出)で述べられているようにして、Accu Taq(R)DNAポリメラーゼ(Sigma)を用いて、PTC−100(R)Programable Thermal Controller(MJ Research,Inc)で増幅を行った。
B.canis(B.キャニス)の分離株AからのゲノムDNAにおけるPCR設定に、2種類のプライマー、pr3及びE4を使用した。アニーリング条件は、以下の通り:アニーリング温度を45℃から55℃まで、1サイクルごとに2℃ずつ上昇させ、次に、55℃にて増幅を25サイクル行った。これらの条件により、500bpのゲノムフラグメントが増幅され、これをBc28.2とした。次に、製造者の使用説明書(Invitrogen)に従い、このPCRフラグメントをpCRII−TOPO(R)クローニングベクターにクローニングし、配列決定を行った。
最初の逆転写段階に対して、Bc28.2 ゲノムフラグメントの配列由来のプライマーを用いて、cDNA Bc28.1からの完全配列をRT−PCRにより調べた。RT−PCR実験に対して、製造者の使用説明書(Invitrogen)に従い、B.canis(B.キャニス)からのインタクトな(完全な)mRNAに対して、GeneRace(R)プロトコールを適用した。最初の逆転写段階に対して、リバースプライマー RT1を使用して、cDNAの5’末端配列(クローン5’−Bc28.1、5’−RACE PCR産物)を調べた。プロトコールの最初の逆転写段階において、クローン5’−Bc28.1の配列由来の、フォワードプライマー、Inv5を使用して、cDNA Bc28.1の3’末端(クローン3’−Bc28.1、3’−RACE PCR産物)を得た。次に、各逆転写段階で最初に使用したものに対応するプライマーカップルを使用して、及び、GeneRacerTMキット(Invitrogen)中で与えられているフォワードGeneRacer(R)5’プライマー(5’−CGACTGGAGCACGAGGACACTGA−3’)又はリバースGeneRacer(R)3’プライマー(5’−GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG−3’)(表5)を用いて、cDNA Bc28.1の5’及び3’末端をPCRにより増幅した。両ケースにおいて、Accu Taq(R)DNAポリメラーゼ(Sigma)を用いて、1種類のPCR産物が得られた。これらのフラグメントをpCRII−TOPOにクローニングし、配列決定を行った。クローン、5’−Bc28.1及び3’−Bc28.1からの配列を集めて、B.canis(B.キャニス)由来のBc28.1 cDNAの完全配列を形成した。
Bc28.1及びBc28.2ヌクレオチド配列の対応するゲノムコピーの配列を決定するために、Bc28.1及びBc28.2ヌクレオチド配列からの特異的なリバースプライマーを設計した。Bc28.1 cDNA配列の5’末端由来のフォワード5’UTRプライマー及びBc28.2のゲノム配列の3’末端に特異的にハイブリダイズするリバースRspe3Gプライマーを用いて、コード配列 Bc28.2からの完全なオープンリーディングフレーム(ORF)をPCRにより増幅した。5’UTRプライマー及びBc28.1 cDNA配列の3’末端に特異的にハイブリダイズするリバースRspe3Cプライマーを用いて、Bc28.1コード配列からの完全なORFの配列をPCRにより増幅した。DNAテンプレートとして、B.canis(B.キャニス)由来の生物学的クローン A8からのゲノムDNAを用いて、PCR増幅を行った。次の条件:94℃にて3分間の変性ステップ、94℃にて1分間の変性、55℃にて1分間のアニーリング及び72℃にて1分間の伸長から構成される3段階のサイクルプログラム、次に、72℃にて5分間のステップで増幅を行った。次に、そのPCRフラグメントをpCRII−TOPOにクローニングし、配列決定を行った。
フランスの研究所 Babesia canis(バベシア キャニス)分離株B、Robin、Castres、Gignac及び34.01からのBc28.1及びBc28.2コード配列を、プライマーカップル、Fspe3/Rspe3C又はFspe3/Rspe3Gを用いてPCRにより増幅し、5種類の制限酵素(AluI、EcoRI、HinfI、MboI及びMspI)に基づいた制限マップを両遺伝子に対して予測した。Bc28.1コード配列からの推定制限マップに基づき、プライマーカップル、5’UTR/Rspe3Cを用いて、フランスの研究所 Babesia canis(バベシア キャニス)分離株B、Robin、Castres及び34.01からのBc28.1のコード領域全体をPCRにより増幅し、上述のようにクローニングして配列決定を行った(セクション1.1.2)。
1.2.1. PCRによるB.canis(B.キャニス)由来ゲノムフラグメントの同定
B.canis(B.キャニス)由来ゲノムDNAにおいて、45℃から55℃までアニーリング温度を上昇させるPCR設定に対して、2種類のプライマー、pr3及びE4を用いた(図5)。
1.2.2.1. 完全なBc28.1 cDNAのクローニング
Bc28.2のゲノムフラグメントに対応する完全なcDNA配列を見つけるために、GeneRacerプロトコールを用いて、B.canis(B.キャニス)由来のインタクトなmRNAに対するRT−PCR実験を行った。最初に、ゲノムクローン Bc28.2の配列由来のリバースプライマー RT1を用いて最初の逆転写段階を行い、続いて、同じRT1プライマー及びGene Racerキットで提供されるフォワードGeneRacer5’プライマーを用いてPCRを行うことにより、1個の5’−RACE PCR産物を得た。次に、プロトコールの最初の逆転写段階において、5’−RACE PCR産物の推定配列由来のフォワードプライマー、Inv5を用いて、続いて、同じプライマー及びキットで提供されるGeneRacer3’プライマーを用いてPCRを行い、1個の3’−RACE PCR産物を得た。5’−RACE及び3’−RACE PCR産物からの配列を集め、Bc28.1 cDNAの完全配列を構成した。このcDNAには、ポリ(A)20テール及び753ヌクレオチドORFとともに1039bp配列が含有されていた。cDNAのセグメント 5’UTR/Rspe3C内で、このORFは、ヌクレオチド(nt)位置50(又はcDNA全体からのnt位置71)でATG開始コドンにより開始し、ヌクレオチド位置820(又はcDNA全体からのnt位置841)TAA終止コドンで終わる。
cDNA Bc28.1及びゲノムクローン Bc28.2からのヌクレオチド配列の比較から、本寄生虫のゲノムにおける2つの関連するゲノムコピーが示唆されたので、それら各コピーを増幅できる特異的プライマーを設計した。従って、Bc28.2及びBc28.1コード配列を増幅するためにそれぞれ設計した、その3’末端において最もかけ離れた2つの配列、プライマー、Rspe3G及びRspe3Cを、この領域から選択した(図3)。各コード配列に対するそれらの特異性を明らかにするために、Bc28.2配列の5’末端に位置し、2つの配列の保存領域でハイブリダイズするプライマー、Cons3.1(図3)と組み合わせて、PCRによりそれらを試験した。さらに、関連コード配列の2つのコピーが、分離株AにおけるB.canis(B.キャニス)の2つの亜種由来のものでないことを確認するために、B.canis(B.キャニス)の生物学的クローン、クローンA8からのゲノムDNAを用いてPCRを行った。
ハイブリダイゼーション実験(サザンブロット、ノーザンブロット及びPFGE分析)に用いたプローブ(図7)は、プライマー Fspe3及びRspe4の間に位置するBc28.1 cDNAのコード領域に対応していた(図3)。
既に述べたデータからBc28.1 cDNAに関連する少なくとも10個のメンバーがあることが示されている一方で、B.canis(B.キャニス)由来のトータルRNAにおけるプローブのハイブリダイゼーションから、1.1kb前後のmRNAの1個のバンドが明らかになったが、これは、Bc28.1 cDNA配列の大きさと一致する(図7、B、II)。さらに、2つの関連するコード配列、Bc28.1及びBc28.2が異なる産物をコードする(28及び45kDa、実施例2、セクション2.2.1参照)ことが発明者らのデータから示されている一方、45kDaをコードする、より大きいmRNAは検出されなかった。
DNAテンプレートとしてB.canis(B.キャニス)由来生物学的クローン A8からのゲノムDNAを用い、プライマーの組み合わせ、5’UTR/Rspe3Gを用いて、PCRにより、Bc28.2 コード配列からの特異的ゲノムフラグメントを増幅した。そのゲノムフラグメントをクローニングし、配列決定を行った。ゲノム配列 Bc28.2をアライメントし、プライマーの組み合わせ、5’UTR/Rspe3Cを用いて増幅した、相当するBc28.1コード配列と、ヌクレオチド(図3)及びアミノ酸(図1)の両レベルで比較した。
このようなPCRにより、それぞれBc28.2及びBc28.1ゲノム配列に対する845及び852ヌクレオチド長の配列が増幅された(図3)。Bc28.1 cDNA及びゲノムの相当する配列の比較から、Bc28.1コード配列においてイントロン配列が見出されないことが示された。上述のようにBlastNプログラムを用いて決定した、ヌクレオチドレベルにおけるBc28.1とBc28.2配列との間の同一性のパーセンテージは、この2つの配列からの全845ヌクレオチドで比較を行った場合、94%であった(表3)。しかし、PCR−RFLP実験を用いた、既に述べた比較のための制限マップ分析により示唆されたように(図6、C)、この2つのヌクレオチド配列の比較から、5’末端において強い保存性があり、一方でそれらの3’末端が多型であることが明らかになった(図3)。実際に、ヌクレオチドレベルにおける同一性のパーセンテージは、この2つの配列からの最初の652ヌクレオチドを用いて比較を行った場合、97%である一方、それらの3’末端からの残り193ヌクレオチドの比較から、同一性は81%しかないことが明らかになった(表3)。
DNAテンプレートとしてB.canis(B.キャニス)由来の生物学的クローン A8からのゲノムDNAを使用して、プライマー、Fspe3及びRspe3C又はRspe3G間のBc28.1及びBc28.2コード配列のコード領域に対応する特異的ゲノムフラグメントをPCRにより増幅した。A8生物学的クローン内で、Bc28.1コード配列及びBc28.2コード配列の制限マップを比較するために(図8、A)、生物学的クローン A8からの2つのコピーに対応するこれらのゲノムフラグメントを様々な制限酵素により消化した。
Bc28.1及びBc28.2のコード配列によりコードされる産物の比較分析を行った(図1)。Bc28.2及びBc28.1 ゲノム配列に対して、244及び256アミノ酸のORFがそれぞれ予想された(図1)。それらのヌクレオチド配列で、両方が同じヌクレオチド位置(位置50)で始まっている一方で、Bc28.2 ORFは位置784のTGA終止コドンで終わっており、Bc28.1 ORFは位置820のTAA終止コドンで終わっているため、2つのORFはサイズが異なっていた(図3)。既に述べたように、BalstPプログラムを用いて、完全配列又はそのタンパク質のN末端もしくはC末端を用いて、この2つの予想されるタンパク質間のパーセンテージ相同性を決定した(表1)。この2つの完全タンパク質(244残基における。)の比較から、91%の全体的相同性が明らかになった。既に述べたように、この2つのタンパク質のN−末端部分が非常に良く保存されている(この2つのタンパク質の最初の180アミノ酸の間で97%相同性)ことが分かったが、一方、それらのC−末端部分は、より多型であり、最後の64アミノ酸において相同性は73%であることが分かった。
Bc28cDNA.1によりコードされるタンパク質の予想分子量が28.3kDa(及び6.24のpI)である一方、Bc28.2コード配列にコードされるタンパク質の予想分子量は27.5kDa(及び9.30のpI)である。
1.2.3.1. PCR−RFLPによるBc28.1及びBc28.2 コード配列の制限マップの比較
DNAテンプレートとして、フランスのB.canis(B.キャニス)分離株 A8、B、Castres、Gignac、34.01及びRobinからのゲノムDNAを用いて、プライマー、Fspe3及びRspe3C又はRspe3Gの間の、Bc28.1及びBc28.2コード配列のコード領域に対応する特異的ゲノムフラグメントをPCRにより増幅した。分離株間で、Bc28.1及びBc28.2コード配列の制限マップと比較するために、分離株A8、B、Castres、Gignac及び34.01からの2つのコピーに対応するこれらのゲノムフラグメントを様々な制限酵素により消化した(それぞれ図8、B、C)。
プライマーの組み合わせ、Fspe3/Rspe3Cにより増幅されたPCRフラグメントのこのPCR−RFLP分析から、様々な入手可能な分離株からのBc28.1コード配列間の制限マップの重要な保存が明らかになった(図8、B)。
Bc28.1コード配列に対するもののように、プライマーの組み合わせ、Fspe3/Rspe3Gを用いて増幅されたPCRフラグメントのPCR−RFLP分析から、様々な分離株からの潜在的Bc28.2コード配列間で制限マップにおいて重要な保存があることが明らかになった(図8、C)。
地理的かつ遺伝的に離れているB.canis(B.キャニス)野生分離株間のBc28.1コード配列の保存性を確認するために、分離株A8、Robin、Castres、B及び34.01からのBc28.1コード配列のコード領域(つまり、プライマー5’UTR/とRspe3Cとの間)を、PCRにより増幅し、クローニングし、配列決定を行い、アライメントし、ヌクレオチド(図4)及びアミノ酸(図2)の両レベルで比較した。
プライマーカップル、5’UTR/Rspe3Cを用いたPCRにより、分離株B、Robin及びAに対する852ヌクレオチド長のゲノムBc28.1配列及び分離株34.01及びCastresに対する849ヌクレオチド長のゲノムBc28.1配列が増幅された(図4)。Blastプログラムを用いたペアワイズアライメントにおける、ヌクレオチドレベルでの、これらのBc28.1配列間の同一性のパーセンテージは、100%(A8及びRobinが最も近い。)と97%の間に含まれており(図4)、このことから、B.canis(B.キャニス)の分離株間のコード配列の強い保存性が示される。
これらの様々な分離株からのBc28.1コード配列によりコードされるタンパク質の比較解析を行った(図2、表2)。分離株B、A及びRobinに対して256アミノ酸のORFを得たが、一方、分離株34.01及びCastresに対しては、このORFは255アミノ酸であった(図2)。既に述べたように、BlastPプログラムを用いたペアワイズアライメントにおいて決定した様々なBc28.1タンパク質間の相同性は非常に強く、100%(AとRobin)と97%との間であった(表2)。
2.1. 使用技術
2.1.1. E.コリにおけるGST−Bc28.2及びHis−Bc28.1組み換えタンパク質の発現及び精製
2.1.1.1. Hisタグ付加Bc28.1組み換えタンパク質の産生
Bc28.1のN−末端部分がなく、C−末端部分にGPIアンカーがある、又はない、2つの組み換えヒスチジンタグ付加Bc28.1タンパク質を、それぞれHis−Bc28.1C(V16−V256)及びHis−Bc28.1(V16−K233)と名付けた。His−Bc28.1Cタンパク質の場合は変性条件下で、又は、His−Bc28.1タンパク質の場合は非変性条件下で、製造者の使用説明書(Qiagen)に従い、これらのタンパク質を、Ni−NTAビーズでアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
DNAテンプレートとしてBabesia canis(バベシア キャニス)(分離株A)からのcDNAライブラリを用いて、N−末端部分がないBc28.1C cDNA配列(cDNA全体からのnt 104−865又は5’UTR/Rspe3cセグメントからのnt83−844)をPCRにより増幅した。Carretら(1999,Eur.J.Biochem.,vol.,265,p.1015−1021)で述べられているようにして、ZAP Express(R)cDNA Gigapack II(R)Gold Cloning kit(Stratagene)を用いて、このcDNAライブラリーを構築した。内部で改変したプライマー、3.1expfor及び3.1exprevCを用いてPCRを行った。これらのプライマーは、それぞれ、BamHI及びHindIII制限部位を含有しており、BamHI/HindIIIで消化したpQE−30ベクター(Qiagen)に、そのプラスミドに存在するHisタグとインフレームになるように、増幅した配列をクローニングすることができる。次に、0.8%アガロースゲル(電気泳動グレード、Eurobio,France)に添加して、0.5xTAE(25xTAE保存溶液、Euromedex、から調製)中、100Vでアガロースゲル電気泳動を行って、PCR産物を精製した。所望する産物に対応するバンドをそのゲルから切り出し、gel−extraction(ゲル抽出)Spin kit(R)(Q−Bio−Gene)を用いて、ゲルのスライスからDNAを単離した。次に、それをBamHIとHindIIIとで消化し、ゲルを再び精製した。室温において、2mM ATP(Sigma)を添加した1xライゲーション緩衝液(MBI Fermentas)中でT4DNAライゲース(MBI Fermentas,France)を用いて3時間、ライゲーションを行うことにより、脱リン酸化したBamHI/HindIII消化pQE−30ベクターに、得られたフラグメントをライゲーションした。ベクター:インサートの比は、通常は1:3であり、使用した消化済みベクターの量は、0.5μgから1μgであった。
N及びC末端部分からの欠失があるBc28.1 cDNA配列(cDNA全体からのnt 104−787又は5’UTR/Rspe3Cセグメントからのnt83−766)を上述のようにして、内部で改変したプライマー、3.1expfor及び3.1exprevを用いてPCRにより増幅した。これらのプライマーは、それぞれ、BamHI及びHindIII制限部位を含有しており、これにより、BamHI/HindIIIで消化したpQE−30ベクターに、Hisタグとインフレームになるように、増幅配列をクローニングすることができる。
GSTとインフレームのBc28.2コード配列の3’末端部分をサブクローニングすることにより、GST−Bc28.2組み換タンパク質を作製した。最初に、部分的なBc28.2配列を担った組み換えPCRII−TOPOクローニングベクターを制限酵素、BamHI/EcoRIで消化した(5’BamHI部位は、ベクター由来であり、3’EcoRIは、プライマー、E4由来である。)。既に述べたようにして、このBamHI/EcoRIフラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製し、ゲルから切り出し、gel−extraction(ゲル抽出)Spin kit(R)(Q−Bio−Gene)を用いて、ゲルのスライスからDNAを単離した。室温において、2mM ATP(Sigma)を添加した1xライゲーション緩衝液(MBI Fermentas)中でT4DNAライゲース(MBI Fermentas,France)を用いて3時間のライゲーションを行うことにより、脱リン酸化したBamHI/EcoRI消化pGEX−4T3ベクター(Amersham−Pharmacia)に得られたフラグメントをライゲーションした。ライゲーション混合液をE.コリ(大腸菌)BL21細胞(Novagen)にトランスフォーメーションし、アンピシリン含有寒天プレートにこれらの細胞を播種し、一晩置いた。プライマー、pr 3/E4を用いてPCRにより陽性のコロニーを選択し、GST−Bc28.2タンパク質の発現を調べるために、それに対してIPTGにより誘導を行った。このように、陽性細菌培養物を一晩増殖させ、アンピシリン 50μg/mlを添加したLB培地で1:10に希釈した。その培養物を37℃にて1時間インキュベーションし、次に、0.1mM IPTGとともに3時間インキュベーションした。遠心(15分間、4000xg)により細胞を回収し、1% Triton X−100を含有するMTPBS(150mM NaCl、16mM Na2HPO4、4mM NaH2PO4、pH7.3)中で超音波破砕により溶解した。この組み換えタンパク質を、グルタチオン−アガロースビーズ(Sigma)を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、還元グルタチオンとの競合により、つまり、45mM グルタチオンとともに、50mM Tris(pH8)を含有する緩衝液中で、溶出した(Smith&Johnson、1988、Gene,vol.67,p.31−40)。
E.Harlow&D.Lane(“Antibodies:a laboratory manual(抗体:実験室マニュアル)“,ISBN 2907516159)に従い、GST−Bc28.2又はHis−Bc28.1Cタンパク質に対して惹起させたポリクローナル抗血清を、マウス又はウサギにおいてそれぞれ作製した。最初の注射では、ウサギ(New Zealand White)に対して、Freund(フロイント)の完全アジュバント(FCA)(Sigma)で乳化した精製His−Bc28.1C組み換えタンパク質 50μgを皮下に免疫付与し、その後の2回の注射では、Freund(フロイント)不完全アジュバント(FIA)(Sigma)を用いて筋肉内注射を行った。Balb/Cマウスに対して、最初の注射では、FCAで乳化させたGST−Bc28.2 15μgを腹腔内に免疫付与し、その後の2回の注射では、FIAで乳化させたものを用いた。動物の注射は、3週間間隔で行い、各免疫付与から8日後に採血を行った。
2.1.3.1. イムノブロッティング
Drakulovskiら(2003,Infect.Immun.,vol.71,p.1056−1067)で述べられているようにして調製した精製B.canis(B.キャニス)メロゾイトを用いて、イムノブロッティングを行った。次に、電気泳動用にメロゾイトを処理し、15% SDS−PAGEによりそのタンパク質を分離した。ポリクローナル血清 α−His−Bc28.1Cの1:100希釈液を用いて、イムノブロッティングを行った。
Drakulovskiら(前出)で述べられているようにして、ポリクローナル血清 α−His−Bc28.1Cの1:100希釈液を用いて、B.canis(B.キャニス)寄生赤血球(5% 寄生虫血症レベル)においてIFAを行った。蛍光の減衰を抑えるために、Citifluor(R)溶液(Citifluor Ltd,London,UK)でスライドを封入し、蛍光顕微鏡(Axioscope,Zeiss)を用いて蛍光を検出した。
Drakulovskiら(前出)で述べられているようにして、B.canis(B.キャニス)のインビトロ培養物の[35S]−メチオニン放射性標識及び免疫沈降実験を行った。簡潔に述べると、50μCi/ml(1200Ci/mmol、Amersham Pharmacia Biotech)及び5%の開始時寄生虫血症レベルで、[35S]−メチオニン放射性標識を行った。B.canis(B.キャニス)からの免疫沈降用の使用画分は:放射性標識抗原(106cpm)のソースとして、トータル、培養上清(SPA)、感染赤血球支質、精製メロゾイト、Triton X−114水性(可溶性及び親水性抗原)及びTriton X−114界面活性(不溶性及び疎水性抗原)画分であった。放射性標識成分 50μCi/ml(25μCi/mmol、Amersham−Pharmacia Biotech)及び5%の開始時寄生虫血症レベルでB.canis(B.キャニス)からのインビトロ培養物の[3H]−エタノールアミン放射性標識を行い、B.canis(B.キャニス)からの[3H]−エタノールアミン放射性標識抗原(106cpm)のソースとして、トータル及びSPA画分を用いて、免疫沈降実験を行った。
[35S]−メチオニン放射性標識メロゾイト及び感染赤血球支質画分からのB.canis(B.キャニス)のタンパク質を、Precigoutら(1991、Infect.Immun.,vol.59,p.2799−2805)で述べられているように、Triton X−114(Sigma)中で分相した。
非変性条件下で、製造者の使用説明書に従い(Qiagen)、His−Bc28.1タンパク質又はHis−GST(対照として)100μgを精製した。次に、PBS 1ml中のイヌ 赤血球細胞 50μlとともに、室温にて1時間、これらをインキュベーションした。遠心(2分間、200xg)により赤血球を回収し、PBS 200μl中で再懸濁した。次に、400μl シリコーン油クッション(Aldrich)上にその懸濁液を重層した。遠心(4分間、3000xg)後、その上清及びシリコーン油を捨て、0.5M PO4NaCl 75μlで赤血球に結合したタンパク質を溶出した。溶出したタンパク質をSDS−PAGEにより分解し、製造者の使用説明書(Pierce)に従い、SuperSignal West Pico Chemoluminescent Substrate kitを用いて、ウェスタンブロットにおいて、1/20.000希釈の抗Hisタグモノクローナル抗体(Qiagen)により検出した。
最初に、既に述べたように、B.canis(B.キャニス)のインビトロ培養物を[35S]−メチオニンで放射性標識した。次に、赤血球を回収し、EZ link(R)sulfoLC NHSビオチン(Pierce)(PBS、pH7.2中で1M)の溶液中で、室温にて30分間、ビオチン化した。次に、PBSで赤血球を3回洗浄し、ビオチン化した抽出物をシリコーン油クッション(Aldrich)上に移し、細胞溶解した赤血球を除去した。遠心(20分間、700xg)後、ペレットからの無傷の赤血球をPBSで洗浄し、細胞溶解し、Drakulovskiら(前出)で述べられているようにして、免疫沈降実験用に処理した。既に述べたように、α−His−Bc28.1C抗血清を用いて、又はワクチン接種/攻撃感染血清を用いて、免疫沈降を行った。SPAでイヌに3回のワクチン接種を行い、次に同種攻撃感染を行うことにより、これらのワクチン接種/攻撃感染血清を生成させた。B.canis(B.キャニス)分離株A(α−A)、分離株B(α−B)及びB.rossi(B.ロッシ)分離株F(α−F)寄生虫に対して、このような血清を生成させた。対応する免疫前のイヌ血清もまた、ネガティブコントロールとして試験に供した。次に、免疫沈降実験の検出のために処理するのではなく、免疫沈降させたタンパク質をSDS−PAGEで分離し、そのゲルをニトロセルロース膜にブロットした。次に、1/2000希釈のストレプトアビジン−PODコンポーネント(Roche)とともにその膜をインキュベーションし、製造者の使用説明書に従い(Pierce)、SuperSignal(R) West Pico Chemoluminescent Substrate kitを用いることにより、赤血球表面からのビオチン化タンパク質を検出した。赤血球表面からの全体のビオチン化タンパク質を明らかにした後、ビオチン化タンパク質の寄生虫起源を確認するために、ウェスタンブロットに対して、Biomax MRフィルム(Eastman Kodak Co)上でオートラジオグラフィーを行った。
α−His−Bc28.1C抗血清により免疫沈降させたB.canis(B.キャニス)からの潜在的な表面抗原が、真の表面に統合された抗原であるというのではなく、赤血球表面に接着して離れられないだけであるかどうかを分析するための試験において、感染した赤血球表面とのそれらの相互作用の強さを評価した。既に述べたように、B.canis(B.キャニス)のインビトロ培養からの赤血球を放射性標識し、ビオチン化し、シリコーン油クッションを通過させた。無傷の赤血球を回収し、0.5Mから2Mの様々な濃度のNaCl 等量と室温にて2分間インキュベーションした。次に、α−His−Bc28.1C又は対照としての免疫前ウサギ血清を用いて、溶出物をウェスタンブロットにおいて分析した。
2.2.1. Bc28.2タンパク質の生化学的特性の決定
504bp Bc28.2クローンをpGEXベクターにクローニングし、35kDa前後の精製GST−Bc28.2組み換えタンパク質(図10、A)を得て、マウスにおいてポリクローナル抗体を産生させるために使用した。このα−GST−Bc28.2血清は、免疫沈降において、トータル画分の45kDaタンパク質と弱いが特異的に反応する(図10、B、レーン3、星印で示す。)。この45kDaタンパク質はまた、B.canis(B.キャニス)のメロゾイト画分において血清により検出されるが、支質及びSPA画分においては検出されない(データを示さず。)。対照として、無関係の抗−GSTBicvir15は、その15kDaタンパク質とのみ反応性があったが(図10、B、レーン1)、免疫前血清はネガティブであった(図10、B、レーン2及び5)。α−His−Bc28.1Cにより免疫沈降された28/26kDaの2つのタンパク質は、α−GST−Bc28.2血清では全く免疫沈降されなかった。B.canis(B.キャニス)の分離株Bで同様の結果が得られた。
それぞれHis−Bc28.1C(V16−V256)及びHis−Bc28.1(V16−K233)と名付けた、Bc28.1のN−末端部分がなく、C−末端部分のGPIアンカーがある、又はない、2つの組み換えヒスチジンタグ付加Bc28.1タンパク質を精製した(図12)。His−Bc28.1Cタンパク質を変性条件下で精製し、ポリクローナル血清(α−His−Bc28.1C)を産生させるために、ウサギに注射した。His−Bc28.1タンパク質を非変性条件下で精製し、赤血球結合アッセイに使用した(セクション2.1.4.)。
2.2.3.1. トータル抗原及び可溶性寄生虫抗原(SPA)における反応性
α−His−Bc28.1C血清により、B.canis(B.キャニス)のトータル画分において、28/26kDaの2つのタンパク質が認識されたが、上清、つまりSPA画分においては26kDaタンパク質のみが検出された(図12、A、レーン2)。さらに、この28/26kDaの2つのタンパク質は、抗−Aワクチン接種/攻撃感染血清により特異的に認識されたタンパク質と対応した(図13、A、レーン3)。ウサギ又はイヌの免疫前血清は反応性がなかった(図13、A、それぞれレーン1及び4)。
[35S]−メチオニン放射性標識した寄生赤血球細胞をストレプトリジンで細胞溶解した。その試料を遠心し、上清(赤血球支質画分)を回収した。ペレット(ゴーストと混ざったメロゾイト)をPercoll勾配を介して処理し、精製放射性標識メロゾイト濃度が高い画分(メロゾイト画分)を回収した。メロゾイト及び感染赤血球支質画分の1部をTX−114におけるタンパク質の相分離に使用した。B.canis(B.キャニス)の放射性標識抗原のソースとして、赤血球支質及びメロゾイト画分、及び、それらの対応するTX−114水性(可溶性抗原、Aqで示す。)及び界面活性(不溶性抗原、Det.で示す。)画分を用いて、α−His−Bc28.1C血清による免疫沈降実験を行った(図13、B)。
B.canis(B.キャニス)の分離株Aからの、固定した感染赤血球におけるα−His−Bc28.1C血清の蛍光パターン(図13、D)から、メロゾイト表面の標識が示される(写真II、矢印で示す。)。さらに、感染赤血球の支質に存在する小胞の強い標識も得られた(写真I、4個が集まった形において矢印で示す。)。
最初にTX−114で疎水性(界面活性剤:Det.)相及び親水性(水性:Aq.)相に分離しておいた、[35S]標識B.canis(B.キャニス)分離株Bのトータル抗原の免疫沈降において、B.rossi(B.ロッシ)分離株Fに対するワクチン接種/攻撃感染血清を使用した。この異種抗血清により、疎水性相においてBc28.1の28kDa型が沈降し、親水性相において26及び28kDa型の両方が沈降し(図11、レーン3及び7)、見えるものは全て、30kDaを示すマーカーバンド位置のすぐ下であった。ポジティブ及びネガティブ対照抗血清を含む。
α−His−Bc28.1C抗血清により免疫沈降されたB.canis(B.キャニス)からの28.1表面抗原が、それと会合しているというより、赤血球表面に接着しているだけであるかどうかを分析するための試験において、感染した赤血球表面とのそれらの相互作用の強さを評価した。
3.1. 使用技術
3.1.1. 動物
雄及び雌のイヌ、例えば6ヶ月齢のビーグル、を適切な施設で飼育する。無作為割り当てに基づき、適切な大きさのいくつかの群に分ける。開始前、実験中数回、血液試料を採取する。これらの動物の全般的健康を定期的に調べる。
例えば、バキュロウイルス発現ベクター系又はRocheインビトロ発現系において、Bc28.1及び/又はBc28.2タンパク質を産生させる。ウェスタンブロットによりタンパク質の特性を調べ、好ましくはElisaにより定量し、好ましくはQuil Aを用いて処方する。
約3週間の間隔で、2回、イヌに、ワクチンの単回投与を行う。注射は皮下に行う。
Bc28.1タンパク質に特異的な抗体がバベシア寄生虫の赤血球への侵入を顕著に低下させる能力を証明するために、ウサギポリクローナル抗血清を使用した。
(Schettersら、1994、前出)で述べられているようにして、イヌ赤血球における標準的バベシア培養を行った。α−His−Bc28.1C抗血清は、上述のようにして作製した(セクション2.1.2.)。その同じ実験において、Bc28.1タンパク質と反応しないウサギ免疫前血清を得た(図13参照)。これらの血清を、次のスキームで、純粋なまま、又は1:1に混合して、バベシア寄生虫培養物に添加した:
血清試料nr 1:純粋なα−His−Bc28.1C抗血清
血清試料nr 2:α−His−Bc28.1C抗血清と免疫前血清とを1:1混合
血清試料nr 3:純粋な免疫前血清。
寄生虫侵入低下アッセイの結果を表6に示し、図15のグラフに表す。この結果から、非特異的(免疫前)ウサギ血清のみが添加された培養物と比較して、α−His−Bc28.1C抗血清を含有する赤血球−培養物における寄生虫血症レベルが顕著に低下したことが明らかである。侵入低下は、25%に達し、寄生虫感染赤血球のレベルは、28%から21%に低下した。
Claims (21)
- 配列番号2のアミノ酸位置1から位置244までのアミノ酸配列と少なくとも91%の同一性を持つアミノ酸配列を含有することを特徴とする、バベシアタンパク質、又は該タンパク質の免疫原性フラグメント。
- 配列番号2で示される通りのアミノ酸配列と少なくとも97%の同一性を持つアミノ酸配列を含有することを特徴とする、請求項1に記載のバベシアタンパク質、又は該タンパク質の免疫原性フラグメント。
- 配列番号4で示される通りのアミノ酸配列を含有することを特徴とする、請求項1に記載のバベシアタンパク質、又は該タンパク質の免疫原性フラグメント。
- 請求項1から請求項3に記載のタンパク質又は該タンパク質の免疫原性フラグメントをコードすることを特徴とする、核酸。
- 配列番号1の核酸を含有することを特徴とする、請求項4に記載の核酸。
- 配列番号3の核酸を含有することを特徴とする、請求項4に記載の核酸。
- 請求項4から請求項6に記載の核酸を含有する、cDNAフラグメント。
- 機能的に連結されたプロモーターの制御下で、請求項4から請求項6に記載の核酸又は請求項7に記載のcDNAフラグメントを含有する、組み換えDNA分子。
- 請求項4から請求項6に記載の核酸、請求項7に記載のcDNAフラグメント又は請求項8に記載の組み換えDNA分子を含有する、生きている組み換え担体。
- 請求項4から請求項6に記載の核酸、請求項7に記載のcDNAフラグメント、請求項8に記載の組み換えDNA分子又は請求項9に記載の生きている組み換え担体を含有する、宿主細胞。
- 請求項1から請求項3に記載のタンパク質もしくは該タンパク質の免疫原性フラグメント、請求項4から請求項6に記載の核酸、請求項7に記載のcDNAフラグメント、請求項8に記載の組み換えDNA分子、請求項9に記載の生きている組み換え担体又は請求項10に記載の宿主細胞、又はそれらの組み合わせ、及び医薬適合性の担体を含有するワクチン。
- アジュバントを含有することを特徴とする、請求項11に記載のワクチン。
- さらなる免疫活性成分又は該さらなる免疫活性成分をコードする核酸を含有することを特徴とする、請求項11から請求項12に記載のワクチン。
- 前記さらなる免疫活性成分又は前記さらなる免疫活性成分をコードする核酸が、エーリキア キャニス(Ehrlichia canis)、バベシア ギブソニ(Babesia gibsoni)、B.ボゲリ(B.vogeli)、B.ロッシ(B.rossi)、リーシュマニア ドノバン−コンプレックス(Leishmania donovani−complex)、イヌ パルボウイルス(Canine parvovirus)、イヌ ジステンパーウイルス(Canine distempervirus)、イヌが媒介する血清型レプトスピラ カニコーラ(Leptospira interrogans serovar canicola)、イクテロヘモラジ(icterohaemorrhagiae)、ポモナ(pomona)、グリポティフォーサ(grippotyphosa)、ブラチスラバ(bratislava)、イヌ肝炎ウイルス(Canine hepatitisvirus)、イヌパラインフルエンザウイルス(Canine parainfluenzavirus)、狂犬病ウイルス(rabies virus)、ヘパトゾーン キャニス(Hepatozoon canis)及びボレリア ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)からなる群から選択される生物から得られることを特徴とする、請求項13に記載のワクチン。
- 請求項1から請求項3に記載のタンパク質に対する抗体又は該タンパク質の免疫原性フラグメントに対する抗体、又はそれらの組み合わせと、医薬適合性の担体と、を含有することを特徴とする、ワクチン。
- 請求項1から請求項3に記載のタンパク質もしくは該タンパク質の免疫原性フラグメント、請求項4から請求項6に記載の核酸、請求項7に記載のcDNAフラグメント、請求項8に記載の組み換えDNA分子、請求項9に記載の生きている組み換え担体又は請求項10に記載の宿主細胞、又はそれらの組み合わせと、医薬適合性の担体と、を混合することを含む、請求項11から請求項14に記載のワクチンの調製のための方法。
- 請求項1から請求項3に記載のタンパク質に対する抗体又は該タンパク質の免疫原性フラグメントに対する抗体と、医薬適合性の担体と、を混合することを含む、請求項15に記載のワクチンの調製のための方法。
- バベシア科の生物により引き起こされる感染又はその臨床的徴候の予防又は治療処置用のワクチンの製造のための、請求項1から請求項3に記載のタンパク質又は該タンパク質の免疫原性フラグメントの使用。
- 配列番号1又は3で示される核酸配列と少なくとも94%の同一性を有する核酸、又は該核酸と相補的な核酸を含有し、該核酸の両者とも少なくとも12、好ましくは15、より好ましくは18ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする、バベシア科の生物に関連する核酸検出のための診断キット。
- 請求項1から請求項3に記載のタンパク質もしくは該タンパク質の免疫原性フラグメント、又はそれらの組み合わせを含有することを特徴とする、バベシア科の生物に対する抗体検出のための診断キット。
- 請求項1から請求項3に記載のタンパク質に対する抗体もしくは該タンパク質の免疫原性フラグメントに対する抗体、又はその組み合わせを含有することを特徴とする、バベシア科の生物由来の抗原物質検出のための診断キット。
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