JP4879537B2 - ヘリコバクター・ピロリ剥離作用を有する組成物 - Google Patents
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Description
また、本発明は、上記組成物から沈殿物を除去した液体またはその乾燥粉末を有効成分とする、ヘリコバクター・ピロリ接着抑制作用のみならず剥離作用を有する組成物を提供するものである。
本発明の組成物は、ホエー1Lあたりから乾燥重量で2〜8g回収でき、上述の乳汁ムチンと比較すると回収率が非常に高い。また、ホエーパウダーを初発原料とした場合は10〜20%の高収率で調製することができ、上述の採算性の問題を解決するものである。
本発明の組成物は、例えば以下のようにして調製することができる。ホエーまたはホエーパウダー、あるいはホエーを成分として含有するその他の原料を脱イオン水に懸濁し、85〜90℃で加熱殺菌する。懸濁液を冷却後、水酸化ナトリウムあるいは塩酸を添加して、用いるプロテアーゼに至適のpHに調整する。その後、プロテアーゼ粉末、あるいは懸濁液を添加し、至適温度で緩く撹拌しながら反応させる。反応後、水酸化ナトリウムあるいは塩酸でpHを6.8〜7.0に調整し、90℃、10分間の加熱でプロテアーゼを失活させる。冷却後、凍結乾燥し、ホエー加水分解物を得る。プロテアーゼの使用量、反応温度、反応時間などの具体的な反応条件については、当業者であれば容易に設定が可能であろう。このホエー加水分解物中に含まれるポリペプチドは、本発明に精製して用いてもよく、また未精製のまま用いてもよい。
本発明の組成物は、ホエー加水分解物から遠心分離などにより沈殿物を除去した液体若しくはその乾燥粉末、またはその沈殿物を用いることもできる。
本発明の消化器潰瘍の予防・改善用食品は、実質的に上記ポリペプチドのみを含む食品であってもよいし、他の栄養補助食品と組み合わせたサプリメントの形であっても良い。また、当該ポリペプチドを既存の食品や飲料等に直接添加したものであってもよい。例えば、ペプチドをガム、キャンディー、ゼリー、グミ、クッキー、ビスケット、チョコレート等の菓子類、ジュース等の清涼飲料、チーズ、バター、ヨーグルト等の乳製品、アイスクリーム、ハム等の農産加工品、ちくわ、はんぺん等の水産加工品、そば、うどん等の麺類、パン、ケーキ等の小麦粉加工品、缶詰または味噌、醤油、塩、こしょう、さとう、人工甘味料等の調味食品等に直接添加することができる。また、ポリペプチドをこれらの食品の加工段階で混合してもよい。ポリペプチドを食品に加工する際は、通常の食品加工方法に基づき行うことができる。また、ポリペプチドを食品に添加・混合する際は、ポリペプチドを粉末、顆粒、細粒等の固形状で用いてもよく、あるいは液状で用いてもよい。本発明の消化器潰瘍の予防・改善用食品は、消化器潰瘍の予防または改善用の特定保健用食品、機能性食品、健康食品としても応用可能である。なお、「機能性食品」とは、生体調節機能をもつ物質を含む食品を意味し、厚生労働省より特定保健用食品として食品毎に個別の許可を得ることにより、機能性を表示することができる。
本発明の消化器潰瘍の予防剤又は治療剤を生体に投与する場合は、経口的に投与する。
材料および方法
(1)使用菌株
この試験において使用したHelicobacter pylori ATCC 43504TおよびATCC 43579はAmerican Type Culture Collectionより購入した。
成分無調整牛乳をpH4.6に調整後、遠心分離して得た牛乳ホエー、クリームチーズ及びカッテージチーズ製造時に生じるホエーを原材料とした。それぞれを85〜95℃で15分間殺菌し、冷却した。それぞれのホエーを2N水酸化ナトリウムあるいは塩酸(ペプシンを使用する場合は濃塩酸)にて至適pH付近に調製し、ホエー1Lあたり2gの各種プロテアーゼ粉末(日本バイコン社製)を添加し、至適温度で24時間緩く撹拌しながら反応させた。反応開始12時間後にpHを再調整し、2gのプロテアーゼ粉末を再添加した。反応後、水酸化ナトリウムあるいは塩酸にてpHを6.8〜7.0に調整し、90℃、10分間の加熱で酵素を失活させた。冷却後、凍結乾燥し、ホエー加水分解物を得た。使用酵素、その至適温度および至適pHを表1に示す。
各種プロテアーゼによるホエー加水分解物、未処理ホエー、ブタ胃粗ムチンを、それぞれ10mg/mLとなるように0.1M炭酸バッファー(pH9.6)に懸濁/溶解し、96ウェルマイクロプレート(Nunc A/S)に75μL/ウェルずつ加え、37℃で2時間コーティングした。滅菌PBS(pH7.2)250μLにて各ウェルを3回洗浄後、Hp懸濁液を50μL/ウェルずつ添加し、微好気条件下で緩やかに振とうしながら(30rpm)37℃で2時間培養した。滅菌PBSで5回洗浄することにより非接着菌体を除去した。その後、100μLのPBSを添加して激しいピペッティングを行い、接着菌体を剥離し、50μLを5%緬羊脱繊維血液添加Tryptic soy寒天培地に塗抹した。37℃で96時間、微好気培養後、出現コロニー数をカウントし、1ウェル当たりの接着菌数を算出した。
また、Hp懸濁液は上記の培地上で96時間培養したHpコロニーを綿棒にて回収し、660nmの吸光度が0.4±0.01となるようにPBSに懸濁したものを100倍希釈した調製液である。
接着性の比較は独立2標本のt−検定にて実施し、p<0.05を統計学的有意とした。なお、統計解析用ソフトはSTATISTICA(デザインテクノロージーズ)を使用した。
各種プロテアーゼ処理されたホエー加水分解物のATCC 43504T及びATCC 43579に対する接着性を、平均接着菌体数として図1に示す(4回平均)。
実施例1でホエーをプロテアーゼ処理することによりHpに対し強力な接着性を示す分解物が得られることが確認されたことから、このホエー分解物を用いてHp剥離活性を確認した。
(1)使用菌株
ヘリコバクター・ピロリATCC 43504TおよびATCC 43579はAmerican Type Culture Collectionより購入した。これらの菌株は5%緬羊脱繊維血液添加Tryptic soy 寒天培地(MERCK)に白金耳にて塗抹し、アネロパック・ヘリコ(三菱ガス)を用いた微好気培養にて96時間毎に継代培養した。なお、継代毎にグラム染色による形態観察とカタラーゼ、ウレアーゼおよびオキシダーゼ試験にて純粋培養が行われていることを確認した。
実施例1と同様の方法でホエー分解物を調製した。プロテアーゼは実施例1でHpに対し高い接着活性が得られたパパインおよびパンクレアチンを用いた。
ブタ胃ムチンを、10mg/mLとなるように0.1M炭酸バッファーに懸濁し、96ウェルマイクロプレートに75μL/ウェルずつ加えて37℃で2時間コーティングした。滅菌PBS(pH7.2)250μLにて各ウェルを3回洗浄後、Hp懸濁液を50μL/ウェルずつ添加し、微好気条件下で緩やかに振とうしながら(30rpm)37℃で2時間培養した。滅菌PBSにて2回洗浄後、PBSに2.5mg/mLの濃度で懸濁/溶解したホエー加水分解物を50μL/ウェル添加し、微好気条件下で緩やかに振とうしながら(30rpm)37℃で1時間培養した。滅菌PBSにて2回洗浄後、100μLのPBSを添加し、激しいピペッティングにて接着菌体を剥離し、50μLを上記の培地に塗抹し、微好気条件にて培養後のコロニー数を計測した。コントロールはホエー加水分解物の代わりにPBSを用いた。各濃度における剥離率は以下の式で算出した。
剥離率(%)=[(A−B)/A]×100
A:コントロールサンプルにおけるマイクロプレート当たりの接着菌体数
B:ホエー分解物添加サンプルにおけるマイクロプレート当たりの接着菌体数
接着性の比較は独立2標本のt−検定にて実施し、p<0.05を統計学的有意とした。なお、統計解析用ソフトはSTATISTICA(デザインテクノロージーズ)を使用した。
生乳、クリームチーズ及びカッテージチーズ由来のホエー分解物のHp剥離活性を表2に示す。全てのホエーが未処理では活性が無かったのに対し、パンクレアチン又はパパインで加水分解を行うことにより剥離活性を発揮することが判明した。この活性はバターミルク分解物と比較すると劣るものの、乳汁ムチン(特許文献1)とほぼ同等で、カッテージチーズホエー分解物に関しては大きく上回っていた。以上の結果は、ホエー分解物を予防目的以外に治療目的でも使用できる可能性を示している。
実施例1および2で、ホエー分解物にHpに対する強力な接着作用及び剥離作用が確認されたが、既にピロリに対し定着阻害作用を示す類似物質として、乳汁ムチンが報告されている(特許文献1参照)。本実施例ではホエー分解物、乳汁ムチン及びバターミルク分解物との違いを明確にするため、以下の試験検討を行った。
(1)ホエー加水分解物
生乳、クリームチーズホエー及びカッテージチーズホエーから、実施例1と同様の方法でホエー分解物を調製した。性状分析に用いたホエーは実施例1で活性の強かったパパイン及びパンクレアチン処理物である。乳汁ムチンは特許文献1に、バターミルク分解物は非特許文献25にしたがい調製した。
ホエー分解物のタンパク質及び糖質の含有量、分子量分布を、ケルダール法、フェノール硫酸法、及びゲルろ過法でそれぞれ測定し、特許文献1に記載の乳汁ムチン及び非特許文献25に記載のバターミルク分解物の成分組成及び分子量と比較した。また、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)後に銀染色を行い、ペプチドパターンを比較した(図2A)。さらに、SDS−PAGE後にウエスタンブロット法にて膜転写し、ペルオキシダーゼ標識小麦胚芽レクチンと反応させ、糖鎖パターンを比較した(図2B)。
表3に示すように、ホエー分解物は乳汁ムチンと比較してタンパク質含量が高く、糖質が少ないことが確認された。一方、バターミルク分解物と比較したところ、タンパク質含量が低く、糖質含量が高いことが認められた。また、乳汁ムチン及びバターミルク分解物とは分子量が大きく異なることが確認された(図2A)。
Claims (6)
- 牛乳に由来するホエーまたはその乾燥物の溶液を、トリプシン、パパイン、パンクレアチンまたはペプシンで処理することにより得られる分子量1〜20kDaのポリペプチドを含む、ヘリコバクター・ピロリ感染の予防用医薬組成物または治療用医薬組成物。
- ヘリコバクター・ピロリ感染の治療用医薬組成物である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 牛乳に由来するホエーまたはその乾燥物の溶液を、トリプシン、パパイン、パンクレアチンまたはペプシンで処理することにより得られる分子量1〜20kDaのポリペプチドを含む、ヘリコバクター・ピロリの接着抑制用医薬組成物または剥離用医薬組成物。
- 牛乳に由来するホエーまたはその乾燥物の溶液を、トリプシン、パパイン、パンクレアチンまたはペプシンで処理することにより得られる分子量1〜20kDaのポリペプチドを用いる、ヒトに対する医療行為を除く、ヘリコバクター・ピロリに起因する消化器潰瘍の予防方法。
- 牛乳に由来するホエーまたはその乾燥物の溶液を、トリプシン、パパイン、パンクレアチンまたはペプシンで処理することにより得られる分子量1〜20kDaのポリペプチドを含む、ヘリコバクター・ピロリに起因する消化器潰瘍の予防用医薬組成物または治療用組成物。
- 牛乳に由来するホエーまたはその乾燥物の溶液を、トリプシン、パパイン、パンクレアチンまたはペプシンで処理することにより得られる分子量1〜20kDaのポリペプチドを用いる、ヒトに対する医療行為を除く、ヘリコバクター・ピロリの接着抑制方法または剥離方法。
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