JP4877588B2

JP4877588B2 - 合焦補正方法

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Publication number: JP4877588B2
Application number: JP2006221442A
Authority: JP
Inventors: 耕徳横山; 虹之景
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2006-08-15
Filing date: 2006-08-15
Publication date: 2012-02-15
Anticipated expiration: 2026-08-15
Also published as: JP2008046327A

Description

本発明は、焦点誤差信号を用いた観察光学系の自動合焦機能を有する生物顕微鏡に用いて好適な合焦補正方法に関するものである。

顕微鏡の対物レンズをアクチュエータで駆動することで、自動的な合焦制御を実行する
自動焦点装置が知られている。この装置では、顕微鏡の対物レンズの焦点位置からのずれ
を検出し、そのずれの検出信号に応じて圧電素子等のアクチュエータにより対物レンズを
移動させ、合焦させている。

図６は焦点誤差検出装置より出力される焦点誤差信号の一例を示すもので、最初に一つのウェル穴に対物レンズを動かし、その場所で対物レンズをアクチュエータにてＺ軸方法にスキャンする。

即ち、ウェル５の底板に対して対物レンズ１１をＺ方向に動かすと焦点誤差信号は図６に示すようにＳ字カーブを描く。そして、焦点誤差信号が、このＳ字カーブのある値に達したときに、合焦となる。
ウェルプレートには観察試料を収納するウェル穴が格子状に多数形成されているが、ウェルプレートには本質的なたわみがあるため、基本的には一つ一つのウェル穴において以上のような動作を行って合焦を行っている。
このような自動焦点装置としては下記の特許文献が知られている。

特開平５−８８０７２号公報

上述の従来例においては、焦点誤差信号が、対物レンズのＺ軸方向の動きに対して非線形であるので、合焦させるためには、焦点誤差信号を読み取りながら、対物レンズをスキャンしなければならない。
しかしながら、ＨＣＡ（ＨｉｇｈＣｏｎｔｅｎｔＡｎａｌｙｓｉｓ）装置のような高速性を要求されるときの自動合焦においては、一つ一つのウェル穴において以上のような動作をさせていたのでは、一つのウェルを観察し終えるまでに、非常に時間がかかってしまうという問題があった。

本発明は、上述の課題を解決するためになされたもので、一つ一つのウェル穴において、対物レンズをスキャンさせなくていいような合焦補正方法により、ＨＣＡにおける観察時間を短縮することが可能な合焦補正方法を提供することを目的とする。

本発明の合焦補正方法は、請求項１においては、
焦点誤差検出光学系により得られる焦点誤差信号を用いて観察光学系の自動合焦を観察用ウェルプレートのたわみを補正して焦点を合わせる合焦補正方法において、
ｎ番目の穴の底面とｎ＋１番目及びｎ＋２番目の穴の底面のたわみを下記のステップにより求めることを特徴とする。
ステップ１：ｎ番目のウェル穴の底面に対してＺ軸方向に対物レンズをスキャンさせ、Ｓ字状の焦点誤差信号を検出し、合焦位置に合わせる。
ステップ２：合焦したウェル穴の底面から、ｎ＋１番目のウェル穴の底面に移す際に、ＸＹ軸方向にウェルプレートを移動させる。
ステップ３：ｎ番目の穴の底面とｎ＋１番目のウェル穴の底面のたわみによるＺ方向のずれ（ΔＺ）により、焦点誤差信号の変位を検出する。
ステップ４：焦点誤差信号の変位量より、ｎ番目の穴の底面とｎ＋１番目のウェル穴の底面の変位量を演算する。
ステップ５：演算により算出した変位量の分だけ、対物レンズを駆動させ合焦とする。
ステップ６：ｎ＋２番目の変位量をｎ番目とｎ＋１番目の変位量の差分より決定しこれを仮の焦点位置とする。
ステップ７：ｎ＋２番目のウェル穴の底面に移動完了後、その焦点誤差信号の値より、真の焦点位置を計算する。
ステップ８：真の焦点位置が仮の焦点位置と、ある誤差範囲内を持って同等であれば、そのまま撮影を行う。
ステップ９：仮の焦点位置と真の焦点位置がずれている場合、対物レンズの駆動量を反転させる。
ステップ１０：仮の焦点位置と真の焦点位置がある誤差範囲内をもって同等の場合、撮影を行う。
ステップ１１：仮の焦点位置と真の焦点位置がずれている場合、対物レンズをＺ軸方向にスキャンさせ、Ｓ字状の焦点誤差信号を検出し、合焦位置に合わせる。
ステップ１２：合焦したウェル穴の底面から、次のウェル穴の底面に移す際にはＸＹ軸方向にウェルプレートを移動させる。

本発明の合焦補正方法によれば、各ウェルおいて対物レンズを大きくスキャンする必要がないのでＨＣＡにおける観察時間の短縮化を図ることができる。

以下、図１〜図４を参照して、本発明による合焦補正方法の一実施形態について説明する。
はじめに本発明で使用する自動焦点装置を有する生物顕微鏡について、図１のブロック構成図を用いて説明する。

図１に示すように、本発明が適用される生物顕微鏡は、観察光学系１０および焦点誤差検出光学系２０からなる光学系と、対物レンズ１１の位置を制御するための制御回路３と、観察光学系の焦点位置を調整する焦点調整手段としての焦点調整部４と、を備えている。

光学系は、試料が載置されるウエルプレート５の近傍に配置される対物レンズ１１と、ウエルプレート５側からの光を観察光および焦点誤差検出光に分離する分離手段としてのダイクロイックミラー１２と、ダイクロイックミラー１２を透過した観察光が入射する顕微鏡１３と、顕微鏡１３への焦点誤差検出光の入射を防止するためのフィルタ１４と、焦点誤差検出用光源としてのレーザダイオード２１と、レーザダイオード２１から照射された焦点誤差検出光をウエルプレート５に向けて通過させるレンズ群２２と、焦点誤差検出光の一部を分岐するハーフミラー２３と、ウエルプレート５で反射されハーフミラー２３を通過した焦点誤差検出光を受光する焦点誤差信号生成手段としての４分割フォトダイオード２５と、４分割フォトダイオード２５に入射する焦点誤差検出光のビーム形状を所定形状に成形するコリメータレンズ２６およびシリンドリカルレンズ２７と、ダイクロイックミラー１２で分岐した観察光を遮断するためのフィルタ２８と、を備えている。

図１に示すように、対物レンズ１１は、アクチュエータ１６によりＺ方向(光軸方向)に
移動可能とされている。アクチュエータ１６は制御回路３により制御される。

次に、このような自動焦点装置を有する生物顕微鏡の動作について説明する。

ウエルプレート５からの観察光は、対物レンズ１１、ダイクロイックミラー１２、フィルタ１４を介して顕微鏡１３に入射し、顕微鏡１３において試料が載置されたウエルプレート５の観察像が得られる。

これら、対物レンズ１１、ダイクロイックミラー１２、フィルタ１４および顕微鏡１３は、観察光学系１０を構成する。

一方、レーザダイオード２１から照射された焦点誤差検出光は、レンズ群２２、ハーフ
ミラー２３、フィルタ２８を通ってダイクロイックミラー１２により分岐して、対物レンズ１１を介してウエルプレート５に照射される。ウエルプレート５で反射された焦点誤差検出光は、対物レンズ１１を介してダイクロイックミラー１２に戻り、ここで分岐してフィルタ２８に入射する。

フィルタ２８を通過した焦点誤差検出光は、ハーフミラー２３を通過して、コリメータレンズ２６およびシリンドリカルレンズ２７を通過する。コリメータレンズ２６およびシリンドリカルレンズ２７を通過した焦点誤差検出光は、４分割フォトダイオード２５で受光される。

これら、レンズ群２２、ハーフミラー２３、フィルタ２８、ダイクロイックミラー１２
、対物レンズ１１、４分割フォトダイオード２５、コリメータレンズ２６およびシリンドリカルレンズ２７は、焦点誤差検出光学系２０を構成する。

焦点誤差検出光学系２０に設けられたフィルタ２８は、ダイクロイックミラー１２によ
り除去されきれなかったウエルプレート５の側からの観察光を遮断する。
本実施形態では、フィルタ２８において観察光を遮断し、フィルタ２８を経由した焦点誤差検出光のみが４分割フォトダイオード２５に入射する。このため、４分割フォトダイオード２５において、観察光の影響を受けない正確な焦点誤差信号を生成することができる。また、観察光の影響を排除することで、焦点誤差検出の感度を向上させることができるので、ウエルプレート５に照射する焦点誤差検出光の光量を低下させることができ、ウエルプレート５上に載置された試料が生細胞である場合などに、試料への悪影響を防止できる。

コリメータレンズ２６およびシリンドリカルレンズ２７は、光軸（ｚ軸）と直交し、か
つ互いに直交する２方向（ｘ方向、ｙ方向）について焦点距離を異ならせ、４分割フォト
ダイオード２５の受光量に基づく、非点収差法を用いた焦点誤差検出が可能となる。後述
のように、焦点誤差検出光学系２０および制御回路３等は合焦手段として機能する。

図２は、４分割フォトダイオード２５に照射される焦点誤差検出光の投影形状を示して
おり、図２（ａ）は合焦時の形状、図２（ｂ）は焦点が遠い場合の形状、図２（ｃ）は焦
点が近い場合の形状を、それぞれ示している。フォトダイオード２５の領域２５ａの出力
レベルを「Ａ」、領域２５ｂの出力レベルを「Ｂ」、領域２５ｃの出力レベルを「Ｃ」、
領域２５ｄの出力レベルを「Ｄ」とすると、「（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ）」を演算すること
で、焦点誤差（フォーカスエラー）検出信号を得ることができる。

いわゆる焦点誤差検出信号のＳ字カーブにおいて、信号強度が「０」の点で合焦状態が得られる。４分割フォトダイオード２５から出力された焦点誤差検出信号は、焦点調整部４を介して制御回路３に与えられる。なお、非点収差法による焦点誤差検出は周知の技術であるため、詳細説明は省略する。

ところで、先にも書いたようにウェルプレートには本質的なたわみがある。
図３（ａ，ｂ，ｃ）は前記たわみを補正するための方法を示す説明図である。
１）まず１番目のウェル穴(底面)５ａにおいて、従来技術と同様に、対物レンズをＺ軸方向にスキャンさせ、Ｓ字状の焦点誤差信号（図６参照）を検出し、合焦位置に合わせる。

２）合焦したウェル穴(底面)から、次のウェル穴に移す際に、まずＸＹ軸方向にウェルプレートを移動させる。移動させるとウェル穴(底面)５ａのたわみによるＺ方向のずれ（ΔＺ）により、焦点誤差信号が変位する。

３）焦点誤差信号の変位量より、ウェル穴(底面)の変位量を計算し、その変位量の分だけ、対物レンズ１１を駆動させ、合焦とする。

上述の方法による場合、隣接するウェル穴(底面)５ａのたわみ量が、焦点誤差信号のＳ字領域より小さくなければならない。このＳ字領域は図１に示した焦点誤差検出光学系の調整により変えることができる。

次に一つ先のウェル穴(底面)におけるＺ方向の変位量を予測する方法について図４を用いて説明する。
図４（ａ）はウェル穴(底面)５ａが直線状に変化している場合を示している。この場合、ｎ番目とｎ＋１番目は上述の方法にて合焦を行う。即ち、対物レンズをＺ軸方向にスキャンさせ、Ｓ字状の焦点誤差信号（図６参照）を検出し、合焦位置に合わせる。次に、合焦したウェル穴(底面)５ａから、次のウェル穴(底面)５ａに移す際に、まずＸＹ軸方向にウェルプレートを移動させる。

移動させるとウェル穴(底面)５ａのたわみによるＺ方向のずれ（ΔＺ）により、焦点誤差信号が変位する。そして、焦点誤差信号の変位量より、ウェル底面の変位量を計算し、その変位量の分だけ、対物レンズ１１を駆動させ、合焦とする。

ｎ＋２番目はｎ番目とｎ＋１番目の変位量の差分より、その変位量を決定する。これを仮の焦点位置とする。あらかじめ変位量が分かっているので、ウェルプレートのＸＹ軸移動と同時に、対物レンズを動かすことが出来る。

ｎ＋２番目のウェル穴(底面)５ａに移動完了後、その焦点誤差信号の値より、真の焦点位置を計算する。真の焦点位置が仮の焦点位置と、ある誤差範囲内を持って同等であれば、そのまま撮影を行う。

図４（ｂ）はウェルの底面のたわみが、ｎ＋１番目のウェル穴において極値をとっている場合を示している。その場合、仮の焦点位置と真の焦点位置がずれることがある。その可能性を考慮し、仮の焦点位置と真の焦点位置がずれた場合、対物レンズの駆動量を反転させる。このとき、仮の焦点位置と真の焦点位置がある誤差範囲内をもって同等であれば、撮影を行う。

また、このとき仮の焦点位置と真の焦点位置がずれた場合、先に述べたように、対物レンズをＺ軸方向にスキャンさせ、Ｓ字状の焦点誤差信号を検出し、合焦位置に合わせる。次に、合焦したウェル穴(底面)から、次のウェル穴(底面)に移す際に、まずＸＹ軸方向にウェルプレートを移動させる。

次に、ウェルプレート全体におけるＺ変位量を予測する方法について図５を用いて説明する。
この方法では、ウェルプレートの四隅と中央において、対物レンズのＺ軸方向のスキャンを行い、合焦位置におけるアクチュエータのＺ軸駆動量から、ウェルのその点におけるＺ軸座標を求める。この５点のＺ軸座標を元にウェルの曲面を求め、マッピングを行う。
観察時には、このマッピングされた座標に基づいて、対物レンズを動かしながら撮影を行う。

以上説明したように、本発明の合焦補正方法によれば、観察用ウェルプレートのたわみを補正して、焦点を合わせるものであり、隣接したウェルのたわみ量を、焦点誤差信号の差分より計算し、その量を加算して次のウェルの焦点位置とし、

また、現時点のウェルのたわみ測定量と一つ前のウェルのたわみ測定量の差分をたわみ偏差とし、現時点のウェルのたわみ量に前記たわみ偏差を加算もしくは減算したものを、次のウェルの仮の焦点位置とし、仮の焦点位置における焦点誤差信号量と、真の焦点位置における焦点誤差信号量との差が、閾値より小さければそのまま観察を続け、閾値より大きければたわみ偏差の加算と減算を入れ替えて、仮の焦点位置を焦点位置とし、

また、観察前にウェルプレートの複数点のたわみ量を焦点誤差信号より測定し、ウェルの２次元的なたわみをマッピングし、そのマッピングしたたわみ量に基づいて焦点位置を演算して合焦を行うものである。
その結果、各ウェルおいて対物レンズを大きくスキャンする必要がないのでＨＣＡにおける観察時間の短縮化を図ることができる。

なお、以上の説明は、本発明の説明および例示を目的として特定の好適な実施例を示したに過ぎない。本発明では生物顕微鏡について説明したが自動焦点装置を有する他の顕微鏡であってもよい。
従って本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形を含むものである。

本発明が適用される生物顕微鏡の構成を示すブロック図である。４分割フォトダイオードに照射される焦点誤差検出光の投影形状を示すもので、（ａ）は合焦時の形状、（ｂ）は焦点が遠い場合の形状、（ｃ）は焦点が近い場合の形状を示す図である。本発明の焦点補正方法の一例を示する図である。本発明の焦点補正方法の他の例を示する図である。本発明の焦点補正方法の他の例を示する図である。焦点誤差検出装置より出力される焦点誤差信号の一例を示す図である。

符号の説明

３制御回路（合焦手段）
４焦点調整部（焦点調整手段）
５ウェルプレート
１０観察光学系
１１対物レンズ
１２ダイクロイックミラー
１６レンズアクチュエータ
２０焦点誤差検出光学系（合焦手段）
２１レーザダイオード
２２レンズ群
２３ハーフミラー
２５４分割フォトダイオード（焦点誤差信号生成手段）

Claims

焦点誤差検出光学系により得られる焦点誤差信号を用いて観察光学系の自動合焦を観察用ウェルプレートのたわみを補正して焦点を合わせる合焦補正方法において、
ｎ番目の穴の底面とｎ＋１番目及びｎ＋２番目の穴の底面のたわみを下記のステップにより求めることを特徴とする合焦補正方法。
ステップ１：ｎ番目のウェル穴の底面に対してＺ軸方向に対物レンズをスキャンさせ、Ｓ字状の焦点誤差信号を検出し、合焦位置に合わせる。
ステップ２：合焦したウェル穴の底面から、ｎ＋１番目のウェル穴の底面に移す際に、ＸＹ軸方向にウェルプレートを移動させる。
ステップ３：ｎ番目の穴の底面とｎ＋１番目のウェル穴の底面のたわみによるＺ方向のずれ（ΔＺ）により、焦点誤差信号の変位を検出する。
ステップ４：焦点誤差信号の変位量より、ｎ番目の穴の底面とｎ＋１番目のウェル穴の底面の変位量を演算する。
ステップ５：演算により算出した変位量の分だけ、対物レンズを駆動させ合焦とする。
ステップ６：ｎ＋２番目の変位量をｎ番目とｎ＋１番目の変位量の差分より決定しこれを仮の焦点位置とする。
ステップ７：ｎ＋２番目のウェル穴の底面に移動完了後、その焦点誤差信号の値より、真の焦点位置を計算する。
ステップ８：真の焦点位置が仮の焦点位置と、ある誤差範囲内を持って同等であれば、そのまま撮影を行う。
ステップ９：仮の焦点位置と真の焦点位置がずれている場合、対物レンズの駆動量を反転させる。
ステップ１０：仮の焦点位置と真の焦点位置がある誤差範囲内をもって同等の場合、撮影を行う。
ステップ１１：仮の焦点位置と真の焦点位置がずれている場合、対物レンズをＺ軸方向にスキャンさせ、Ｓ字状の焦点誤差信号を検出し、合焦位置に合わせる。
ステップ１２：合焦したウェル穴の底面から、次のウェル穴の底面に移す際にはＸＹ軸方向にウェルプレートを移動させる。