JP4871630B2 - A method for inhibiting cell growth, comprising inhibiting phosphatase - Google Patents
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本発明は脱リン酸化酵素の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞増殖阻害方法および細胞増殖阻害剤に関する。 The present invention relates to a cell growth inhibition method and a cell growth inhibitor characterized by inhibiting the expression and / or function of phosphatase.
より詳しくは、本発明は本脱リン酸化酵素の発現、本脱リン酸化酵素と基質の結合、および本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性のうちの少なくとも１を阻害することを特徴とする細胞増殖阻害方法および細胞増殖阻害剤に関する。 More specifically, the present invention inhibits at least one of the expression of the present phosphatase, the binding of the present phosphatase to a substrate, and the phosphatase activity of the present phosphatase. The present invention relates to a growth inhibition method and a cell growth inhibitor.
さらに詳しくは、本発明は本脱リン酸化酵素の発現、本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ １−ｌｉｋｅ）との結合、および本脱リン酸化酵素のＣＳＥ１Ｌに対する脱リン酸化活性のうちの少なくとも１を阻害することを特徴とする細胞増殖阻害方法および細胞増殖阻害剤に関する。 More specifically, the present invention relates to the expression of the present phosphatase, the binding between the phosphatase and CSE1L (chromosome segregation gene 1-like), and the phosphatase activity of the phosphatase against CSE1L. The present invention relates to a method for inhibiting cell growth and a cell growth inhibitor characterized by inhibiting at least 1.
本発明はまた、本細胞増殖阻害方法および細胞増殖阻害剤を用いることを特徴とする腫瘍疾患の防止および／または治療方法、並びに本細胞増殖阻害剤を含んでなる腫瘍疾患の防止および／または治療剤に関する。 The present invention also provides a method for preventing and / or treating a tumor disease characterized by using the present method for inhibiting cell growth and a cell growth inhibitor, and a method for preventing and / or treating a tumor disease comprising the present cell growth inhibitor. It relates to the agent.
本発明はさらに、本脱リン酸化酵素を用いることを特徴とするＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化方法に関する。 The present invention further relates to a method for dephosphorylating CSE1L, wherein the present dephosphorylating enzyme is used.
本発明はさらにまた、本脱リン酸化酵素の発現および／または機能を阻害することを特徴とするＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害方法および脱リン酸化阻害剤に関する。 The present invention further relates to a method for inhibiting dephosphorylation of CSE1L and a dephosphorylation inhibitor characterized by inhibiting the expression and / or function of the present dephosphorylation enzyme.
本発明はまた、細胞増殖を阻害する活性を有する化合物の同定方法、本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性を阻害する活性を有する化合物の同定方法、および本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を阻害する活性を有する化合物の同定方法に関する。 The present invention also provides a method for identifying a compound having an activity that inhibits cell proliferation, a method for identifying a compound having an activity that inhibits the dephosphorylation activity of the present dephosphorylation enzyme, and the binding between the present dephosphorylation enzyme and CSE1L. The present invention relates to a method for identifying a compound having an inhibitory activity.
本発明はさらに、本脱リン酸化酵素の発現量を測定することを特徴とする腫瘍組織の判定方法に関する。 The present invention further relates to a method for determining tumor tissue, which comprises measuring the expression level of the present dephosphorylating enzyme.
本発明はさらにまた、前記同定方法または前記判定方法に有用なオリゴヌクレオチドおよび試薬キットに関する。 The present invention further relates to oligonucleotides and reagent kits useful for the identification method or the determination method.
セリンスレオニン型脱リン酸化酵素にはいくつかのファミリーが存在し、その一つがプロテインフォスファターゼ２Ｃ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２Ｃ：以下、ＰＰ２Ｃと略称することがある）ファミリーである（非特許文献１）。ＰＰ２Ｃファミリーに属する脱リン酸化酵素は他のファミリーに属する酵素と異なり、活性に制御ユニットを必要とせず、モノマーで存在する。また、ＰＰ２Ｃファミリーに属する脱リン酸化酵素は、その活性を示すためにマグネシウムやマンガンといった金属２価イオンと必要とする一方、他のファミリーに属する脱リン酸化酵素（プロテインフォスファターゼ１（以下、ＰＰ１と略称することがある）やプロテインフォスファターゼ２Ａ（以下、ＰＰ２Ａと略称することがある））の阻害剤であるオカダ酸によって阻害されないことを特徴とする。 There are several families of serine threonine-type phosphatases, one of which is the protein phosphatase 2C (hereinafter sometimes abbreviated as PP2C) family (Non-patent Document 1). Unlike enzymes belonging to other families, phosphatases belonging to the PP2C family do not require a control unit for activity and exist as monomers. In addition, phosphatases belonging to the PP2C family require metal divalent ions such as magnesium and manganese to show their activity, while phosphatases belonging to other families (protein phosphatase 1 (hereinafter referred to as PP1) It is not inhibited by okadaic acid, which is an inhibitor of protein phosphatase 2A (hereinafter sometimes abbreviated as PP2A).
ＣＳＥ１Ｌをコードする遺伝子は、もともとアポトーシスに必須の遺伝子としてクローニングされ、ＣＡＳ（ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）と名づけられた（非特許文献２）。一方、ＣＡＳ遺伝子は、コードする推定アミノ酸配列の相同性から、酵母ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ １（ＣＳＥ１）のヒトオルソログであることが明らかとなり、ＣＳＥ１Ｌ（−ｌｉｋｅ）とも呼ばれている。ＣＳＥ１は染色体の分離に重要な役割を果たしていることが報告されている。ＣＳＥ１Ｌも細胞周期に関わる機能を有し、アポトーシスに関連することが知られており、それら以外にも多数の機能を有することが報告されている（非特許文献３）。例えば、多くの癌でＣＳＥ１Ｌの発現が亢進していることから、ＣＳＥ１Ｌは細胞の増殖・癌化に関与していると考えられる。すなわち、ＣＳＥ１Ｌは細胞増殖および細胞死の両方に関係していると考えられる。また、アミノ酸配列の相同性から、ＣＳＥ１Ｌはインポーチン（ｉｍｐｏｒｔｉｎ） ファミリーに属すると考えられるので、ｉｍｐｏｒｔｉｎ が有する核外輸送機能もその生物学的な活性の一つであると考えることができる。 The gene encoding CSE1L was originally cloned as an essential gene for apoptosis and was named CAS (cellular apoptosis sustainability) (Non-patent Document 2). On the other hand, the CAS gene is clarified to be a human orthologue of yeast chromosome segmentation gene 1 (CSE1) from the homology of the predicted amino acid sequence to be encoded, and is also called CSE1L (-like). CSE1 has been reported to play an important role in chromosome segregation. CSE1L also has a function related to the cell cycle and is known to be related to apoptosis. It has been reported that CSE1L has many other functions (Non-patent Document 3). For example, since the expression of CSE1L is increased in many cancers, CSE1L is considered to be involved in cell proliferation / carcinogenesis. That is, CSE1L is thought to be involved in both cell proliferation and cell death. Moreover, since CSE1L is considered to belong to the importin family from the homology of amino acid sequences, it can be considered that the nuclear export function of importin is one of its biological activities.
本発明の課題は、癌疾患の発生または増悪に関与する可能性がある蛋白質を見出し、該蛋白質の発現および／または機能を調節する手段を提供することである。また、本発明の課題には、該蛋白質の異常に起因する疾患、例えば癌疾患の防止および／または治療に有用な手段を提供することが含まれる。さらに、本発明の課題には、該蛋白質の発現および／または機能を調節する化合物の同定方法、該蛋白質をコードする遺伝子の発現量を測定することによる異常組織の判定方法、並びに該蛋白質、該遺伝子またはその断片を含有してなる試薬キットを提供することが含まれる。 An object of the present invention is to find a protein that may be involved in the development or exacerbation of cancer diseases, and to provide a means for regulating the expression and / or function of the protein. The subject of the present invention also includes providing a useful means for preventing and / or treating diseases caused by abnormality of the protein, such as cancer diseases. Furthermore, the subject of the present invention includes a method for identifying a compound that regulates the expression and / or function of the protein, a method for determining an abnormal tissue by measuring the expression level of a gene encoding the protein, the protein, Providing a reagent kit containing the gene or a fragment thereof is included.
上記課題を解決すべく本発明者は鋭意努力し、バイオエクスプレスの組織別発現遺伝子発現パターンより、大腸腫瘍組織および前立腺腫瘍組織において正常大腸組織および正常前立腺組織に比して発現が亢進している遺伝子を見出した。本遺伝子によりコードされる推定アミノ酸配列内にプロテインフォスファターゼ２Ｃ触媒部位が存在することから、本遺伝子によりコードされる蛋白質は、蛋白質脱リン酸化酵素活性をもつことが示唆された。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventor has made diligent efforts, and expression is increased in the colon tumor tissue and the prostate tumor tissue as compared with the normal colon tissue and the normal prostate tissue, from the expression gene expression pattern according to the tissue of BioExpress. I found a gene. The protein phosphatase 2C catalytic site is present in the deduced amino acid sequence encoded by this gene, suggesting that the protein encoded by this gene has protein phosphatase activity.
本発明者はさらに、（１）本遺伝子の発現が細胞の癌化に伴い亢進していること、（２）本遺伝子によりコードされる蛋白質がＰＰ２Ｃ様の脱リン酸化活性を示すこと、（３）本遺伝子によりコードされる蛋白質がＣＳＥ１Ｌと結合してこれを脱リン酸化すること、（４）本遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を阻害することにより、細胞の制癌剤感受性が減弱すること、および（５）本遺伝子の発現を阻害することにより細胞増殖が抑制されることを実証した。 The present inventors further (1) that the expression of this gene is enhanced with canceration of cells, (2) that the protein encoded by this gene exhibits PP2C-like dephosphorylation activity, (3 ) The protein encoded by this gene binds to CSE1L and dephosphorylates it; (4) the function of the protein encoded by this gene is inhibited, thereby reducing the sensitivity of the cell to anticancer agents; and (5) It was demonstrated that cell growth was suppressed by inhibiting the expression of this gene.
これら実証結果から、本遺伝子によりコードされる蛋白質は、その生体内基質であると考えられるＣＳＥ１Ｌに結合してこれを脱リン酸化することを介して、ＣＳＥ１Ｌの機能、例えば細胞周期・細胞増殖・癌化への関与を調節すると考えることができる。 From these demonstration results, the protein encoded by this gene binds to CSE1L, which is considered to be its in vivo substrate, and dephosphorylates it, thereby functioning CSE1L, such as cell cycle, cell proliferation, It can be considered to regulate the involvement in canceration.
したがって、本遺伝子によりコードされる蛋白質の発現および／または機能を阻害することにより、ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を阻害してその機能を阻害し、細胞増殖を阻害することができると発明者は考えている。さらに、本遺伝子によりコードされる蛋白質の発現および／または機能を阻害することにより、細胞増殖の異常に起因する疾患、例えば癌疾患を防止および／または治療できると発明者は考えている。 Therefore, the inventor believes that by inhibiting the expression and / or function of the protein encoded by this gene, the dephosphorylation of CSE1L can be inhibited to inhibit its function, thereby inhibiting cell proliferation. Yes. Furthermore, the inventor believes that by inhibiting the expression and / or function of the protein encoded by this gene, diseases caused by abnormal cell proliferation, such as cancer diseases, can be prevented and / or treated.
本発明は、これら知見により完成した。 The present invention has been completed based on these findings.
すなわち本発明は、下記の群より選ばれるＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞増殖阻害方法に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
That is, the present invention relates to a method for inhibiting cell growth, which comprises inhibiting the expression and / or function of a protein encoded by DNA selected from the following group:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
また本発明は、蛋白質の機能が、下記の群から選択される１つ以上の機能である、前記細胞増殖阻害方法に関する：
（１）該蛋白質とＣＳＥ１Ｌの結合、および
（２）該蛋白質の脱リン酸化活性。
The present invention also relates to the method for inhibiting cell proliferation, wherein the protein function is one or more functions selected from the following group:
(1) Binding of the protein to CSE1L, and (2) Dephosphorylation activity of the protein.
さらに本発明は、蛋白質の脱リン酸化活性が、ＣＳＥ１Ｌに対する脱リン酸化活性である、前記細胞増殖阻害方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to the method for inhibiting cell growth, wherein the protein dephosphorylation activity is dephosphorylation activity against CSE1L.
さらにまた本発明は、細胞が腫瘍細胞である、前記細胞増殖阻害方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to the cell growth inhibition method, wherein the cell is a tumor cell.
また本発明は、下記の群より選ばれるＤＮＡに対するＲＮＡ干渉により該ＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現および／または機能を阻害する、前記細胞増殖阻害方法に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
The present invention also relates to the method for inhibiting cell growth, wherein the expression and / or function of a protein encoded by the DNA is inhibited by RNA interference with the DNA selected from the following group:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
さらに本発明は、下記の群より選ばれるＤＮＡに対するＲＮＡ干渉が該ＤＮＡに対する短鎖二重鎖ＲＮＡを用いて行うＲＮＡ干渉である、前記細胞増殖阻害方法に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
Furthermore, the present invention relates to the method for inhibiting cell growth, wherein RNA interference with DNA selected from the following group is RNA interference performed using short double-stranded RNA for the DNA:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
さらにまた本発明は、短鎖二重鎖ＲＮＡが、配列表の配列番号１７に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖ＲＮＡである、前記細胞増殖阻害方法に関する。 Furthermore, in the present invention, a short double-stranded RNA comprises a short double-stranded RNA comprising an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing and an oligonucleotide represented by a complementary base sequence of the base sequence. The present invention relates to the method for inhibiting cell proliferation, which is a heavy chain RNA.
また本発明は、下記の群より選ばれるＤＮＡによりコードされる蛋白質の機能を、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質（配列番号２）のアミノ酸配列において第４３７番目のアスパラギン酸がアラニンに置換されたアミノ酸配列で表される蛋白質を用いて阻害する、前記細胞増殖阻害方法に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
In addition, the present invention provides an amino acid sequence of a protein (SEQ ID NO: 2) encoded by a DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, wherein the function of the protein encoded by the DNA selected from the following group is selected. In the method for inhibiting cell growth, wherein the protein represented by the amino acid sequence in which the 437th aspartic acid is substituted with alanine is used:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
さらに本発明は、下記の群より選ばれるＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞増殖阻害剤に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
Furthermore, the present invention relates to a cell growth inhibitor characterized by inhibiting the expression and / or function of a protein encoded by DNA selected from the following group:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
さらにまた本発明は、蛋白質の機能が、下記の群から選択される１つ以上の機能である、前記細胞増殖阻害剤に関する：
（１）該蛋白質とＣＳＥ１Ｌの結合、および
（２）該蛋白質の脱リン酸化活性。
Furthermore, the present invention relates to the cell growth inhibitor, wherein the protein function is one or more functions selected from the following group:
(1) Binding of the protein to CSE1L, and (2) Dephosphorylation activity of the protein.
また本発明は、蛋白質の脱リン酸化活性が、ＣＳＥ１Ｌに対する脱リン酸化活性である、前記細胞増殖阻害剤に関する。 The present invention also relates to the cell growth inhibitor, wherein the protein dephosphorylation activity is dephosphorylation activity against CSE1L.
さらに本発明は、細胞が腫瘍細胞である、前記細胞増殖阻害剤に関する。 Furthermore, the present invention relates to the cell growth inhibitor, wherein the cell is a tumor cell.
さらにまた本発明は、下記の群より選ばれるＤＮＡに対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖ＲＮＡを有効成分として含む、前記細胞増殖阻害剤に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
Furthermore, the present invention relates to the cell growth inhibitor comprising, as an active ingredient, a short double-stranded RNA having an RNA interference action against DNA selected from the following group:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
また本発明は、短鎖二重鎖ＲＮＡが、配列表の配列番号１７に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖ＲＮＡである、前記細胞増殖阻害剤に関する。 The present invention also provides a short duplex RNA comprising a short double-stranded RNA comprising an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing and an oligonucleotide represented by a complementary base sequence of the base sequence. It is related with the said cell growth inhibitor which is strand RNA.
さらに本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質（配列番号２）のアミノ酸配列において第４３７番目のアスパラギン酸がアラニンに置換されたアミノ酸配列で表される蛋白質を含んでなる、細胞増殖阻害剤に関する。 Furthermore, the present invention provides an amino acid sequence in which the 437th aspartic acid is substituted with alanine in the amino acid sequence of the protein (SEQ ID NO: 2) encoded by the DNA represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The present invention relates to a cell growth inhibitor comprising the expressed protein.
さらにまた本発明は、配列表の配列番号１７に記載の塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドに関する。 Furthermore, the present invention relates to an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17 of the sequence listing or a complementary base sequence of the base sequence.
また本発明は、配列表の配列番号１７に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号１８に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖ＲＮＡに関する。 The present invention also relates to a short double-stranded RNA comprising an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing and an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing.
さらに本発明は、前記いずれかの細胞増殖阻害方法を用いることを特徴とする腫瘍疾患の防止および／または治療方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to a method for preventing and / or treating a tumor disease, characterized by using any one of the cell growth inhibition methods described above.
さらにまた本発明は、前記いずれかの細胞増殖阻害剤を用いることを特徴とする腫瘍疾患の防止および／または治療方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to a method for preventing and / or treating a tumor disease characterized by using any of the cell growth inhibitors described above.
また本発明は、前記いずれかの細胞増殖阻害剤を含んでなる腫瘍疾患の防止および／または治療剤に関する。 The present invention also relates to a preventive and / or therapeutic agent for tumor diseases comprising any one of the aforementioned cell growth inhibitors.
さらに本発明は、下記の群より選ばれるＤＮＡによりコードされる蛋白質を用いることを特徴とするＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化方法に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
Furthermore, the present invention relates to a method for dephosphorylating CSE1L, characterized in that a protein encoded by DNA selected from the following group is used:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
さらにまた本発明は、下記の群より選ばれるＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現および／または機能を阻害することを特徴とするＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害方法に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
Furthermore, the present invention relates to a method for inhibiting dephosphorylation of CSE1L, which comprises inhibiting the expression and / or function of a protein encoded by a DNA selected from the following group:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
また本発明は、下記の群より選ばれるＤＮＡに対するＲＮＡ干渉により該ＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現および／または機能を阻害する、前記ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害方法に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
The present invention also relates to the method for inhibiting the dephosphorylation of CSE1L, wherein the expression and / or function of the protein encoded by the DNA is inhibited by RNA interference with the DNA selected from the following group:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
さらに本発明は、下記の群より選ばれるＤＮＡに対するＲＮＡ干渉が該ＤＮＡに対する短鎖二重鎖ＲＮＡを用いて行うＲＮＡ干渉である、前記ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害方法に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
Furthermore, the present invention relates to the above-mentioned CSE1L dephosphorylation inhibition method, wherein RNA interference with DNA selected from the following group is RNA interference using short double-stranded RNA against the DNA:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
さらにまた本発明は、短鎖二重鎖ＲＮＡが、配列表の配列番号１７に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖ＲＮＡである、前記ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害方法に関する。 Furthermore, in the present invention, a short double-stranded RNA comprises a short double-stranded RNA comprising an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing and an oligonucleotide represented by a complementary base sequence of the base sequence. The present invention relates to a method for inhibiting dephosphorylation of CSE1L, which is a heavy chain RNA.
また本発明は、下記の群より選ばれるＤＮＡによりコードされる蛋白質の機能を、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質（配列番号２）のアミノ酸配列において第４３７番目のアスパラギン酸がアラニンに置換されたアミノ酸配列で表される蛋白質を用いて阻害する、前記ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害方法に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
In addition, the present invention provides an amino acid sequence of a protein (SEQ ID NO: 2) encoded by a DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, wherein the function of the protein encoded by the DNA selected from the following group is selected. In the method for inhibiting dephosphorylation of CSE1L, wherein the protein represented by the amino acid sequence in which the 437th aspartic acid is substituted with alanine is used:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
さらに本発明は、下記の群より選ばれるＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現および／または機能を阻害することを特徴とするＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害剤に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
The present invention further relates to a CSE1L dephosphorylation inhibitor characterized by inhibiting the expression and / or function of a protein encoded by a DNA selected from the following group:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
さらにまた本発明は、蛋白質の機能が、下記の群から選択される１つ以上の機能である、前記ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害剤に関する：
（１）該蛋白質とＣＳＥ１Ｌの結合、および
（２）該蛋白質の脱リン酸化活性。
Furthermore, the present invention relates to the CSE1L dephosphorylation inhibitor, wherein the protein function is one or more selected from the following group:
(1) Binding of the protein to CSE1L, and (2) Dephosphorylation activity of the protein.
また本発明は、蛋白質の脱リン酸化活性が、ＣＳＥ１Ｌに対する脱リン酸化活性である、前記ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害剤に関する。 The present invention also relates to the dephosphorylation inhibitor of CSE1L, wherein the protein dephosphorylation activity is dephosphorylation activity against CSE1L.
さらに本発明は、下記の群より選ばれるＤＮＡに対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖ＲＮＡを有効成分として含む、前記ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害剤に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
Furthermore, the present invention relates to the CSE1L dephosphorylation inhibitor comprising, as an active ingredient, a short double-stranded RNA having an RNA interference action against DNA selected from the following group:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
さらにまた本発明は、短鎖二重鎖ＲＮＡが、配列表の配列番号１７に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖ＲＮＡである、前記ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害剤に関する。 Furthermore, in the present invention, a short double-stranded RNA comprises a short double-stranded RNA comprising an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing and an oligonucleotide represented by a complementary base sequence of the base sequence. The present invention relates to the dephosphorylation inhibitor of CSE1L, which is a heavy chain RNA.
また本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質（配列番号２）のアミノ酸配列において第４３７番目のアスパラギン酸がアラニンに置換されたアミノ酸配列で表される蛋白質を含んでなる、前記ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害剤に関する。 The present invention also relates to an amino acid sequence in which the 437th aspartic acid is substituted with alanine in the amino acid sequence of the protein (SEQ ID NO: 2) encoded by the DNA represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The present invention relates to a dephosphorylation inhibitor of CSE1L, comprising the protein represented.
さらに本発明は、細胞増殖を阻害する活性を有する化合物の同定方法であって、下記の群より選ばれるＤＮＡによりコードされる蛋白質とある化合物（被検化合物）とを接触させ、該蛋白質の脱リン酸化活性を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が該蛋白質の脱リン酸化活性を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
Furthermore, the present invention is a method for identifying a compound having an activity of inhibiting cell growth, comprising contacting a protein encoded by a DNA selected from the following group with a compound (test compound), and removing the protein. By using a system that uses a signal and / or marker capable of detecting phosphorylation activity, and detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker, the test compound exhibits the dephosphorylation activity of the protein. An identification method comprising the step of determining whether to inhibit:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
さらにまた本発明は、蛋白質の脱リン酸化活性を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系が、該蛋白質による下記の群より選ばれるいずれか１の化合物の脱リン酸化を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系である、前記同定方法に関する：
（１）ｐ−ニトロフェニルリン酸
（２）ＣＳＥ１Ｌ、
（３）カゼイン
（４）リン酸化ペプチドＲＲＡ−ｐＴ−ＶＡ（配列表の配列番号２１）
（５）リン酸化ペプチドＲＲＰ−ｐＴ−ＶＡ（配列表の配列番号２２）
Furthermore, the present invention provides a signal that can detect the dephosphorylation activity of a protein and / or a signal that can detect the dephosphorylation of any one compound selected from the following group by the protein using a marker. And / or a system using a marker, wherein the identification method is:
(1) p-nitrophenyl phosphate (2) CSE1L,
(3) Casein (4) Phosphorylated peptide RRA-pT-VA (SEQ ID NO: 21 in the sequence listing)
(5) Phosphorylated peptide RRP-pT-VA (SEQ ID NO: 22 in the sequence listing)
また本発明は、蛋白質の脱リン酸化活性を阻害することが明らかになった被検化合物が、細胞増殖を阻害する否かを測定する工程をさらに含む、前記同定方法に関する。 The present invention also relates to the above identification method, further comprising the step of measuring whether or not a test compound that has been shown to inhibit protein dephosphorylation activity inhibits cell proliferation.
さらに本発明は、細胞増殖を阻害する活性を有する化合物の同定方法であって、下記の群より選ばれるＤＮＡによりコードされる蛋白質とある化合物（被検化合物）とを接触させ、該蛋白質とＣＳＥ１Ｌとの結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が該蛋白質とＣＳＥ１Ｌとの結合を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
The present invention further relates to a method for identifying a compound having an activity of inhibiting cell proliferation, comprising contacting a protein encoded by a DNA selected from the following group with a compound (test compound), and said protein and CSE1L. A test compound inhibits the binding of the protein to CSE1L by detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker using a system that uses a signal and / or marker that detects binding to An identification method comprising the step of determining whether or not to do:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
さらにまた本発明は、蛋白質とＣＳＥ１Ｌとの結合を阻害することが明らかになった被検化合物が、細胞増殖を阻害する否かを測定する工程をさらに含む、前記同定方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to the above identification method, further comprising the step of measuring whether or not a test compound that has been shown to inhibit the binding between a protein and CSE1L inhibits cell proliferation.
また本発明は、下記の群より選ばれるＤＮＡによりコードされる蛋白質によるＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を阻害する活性を有する化合物の同定方法であって、該蛋白質および／またはＣＳＥ１Ｌとある化合物（被検化合物）とを接触させ、該蛋白質によるＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が該蛋白質によるＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
The present invention also relates to a method for identifying a compound having an activity of inhibiting the dephosphorylation of CSE1L by a protein encoded by a DNA selected from the group consisting of the protein and / or a compound (test compound) with CSE1L. ) And a system using a signal and / or marker that detects dephosphorylation of CSE1L by the protein and detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker, An identification method comprising determining whether a compound inhibits dephosphorylation of CSE1L by the protein:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
さらに本発明は、下記の群より選ばれるＤＮＡによりコードされる蛋白質とＣＳＥ１Ｌの結合を阻害する活性を有する化合物の同定方法であって、該蛋白質および／またはＣＳＥ１Ｌとある化合物（被検化合物）とを接触させ、該蛋白質とＣＳＥ１Ｌの結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が該蛋白質とＣＳＥ１Ｌの結合を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
The present invention further relates to a method for identifying a compound having an activity of inhibiting the binding of a protein encoded by DNA selected from the following group and CSE1L, wherein the compound (test compound) is a protein and / or CSE1L; And a system using a signal and / or marker for detecting the binding of the protein and CSE1L, and detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker, thereby allowing the test compound to contain the protein And a method of identification comprising the step of determining whether to inhibit the binding of CSE1L:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
さらにまた本発明は、被験組織が腫瘍組織由来であるか否かを判定する方法であって、下記の群より選ばれるＤＮＡの被験組織における発現量を測定することを特徴とする判定方法に関する：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。
Furthermore, the present invention relates to a method for determining whether or not a test tissue is derived from a tumor tissue, which comprises measuring the expression level of DNA selected from the following group in the test tissue:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 70% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) It encodes a protein having mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to several nucleotides in the DNA base sequence of (1) or (2) above and exhibiting dephosphorylation activity And (4) a DNA comprising any one of (1) to (3) above.
また本発明は、被験組織が大腸腫瘍由来であるか否かを判定する、前記判定方法に関する。 The present invention also relates to the above-described determination method for determining whether or not a test tissue is derived from a colorectal tumor.
さらに本発明は、被験組織が前立腺腫瘍組織由来であるか否かを判定する、前記判定方法に関する。 Furthermore, this invention relates to the said determination method of determining whether a test tissue is derived from a prostate tumor tissue.
さらにまた本発明は、下記工程を含む、前記判定方法に関する：
（１）被験組織から核酸を調製する工程、
（２）前記（１）で調製した核酸から、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および（ｉｉｉ）上記ＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡより選ばれるいずれか１のＤＮＡおよび／またはそのＤＮＡ断片を増幅する工程、および
（３）前記（２）で増幅したＤＮＡおよび／またはＤＮＡ断片の量を測定する工程。
Furthermore, this invention relates to the said determination method including the following processes:
(1) a step of preparing a nucleic acid from a test tissue,
(2) From the nucleic acid prepared in (1) above, by polymerase chain reaction (PCR), (i) DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, (ii) described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing A DNA encoding a protein having at least 70% homology with a DNA comprising the nucleotide sequence of (ii) and exhibiting dephosphorylation activity, and (iii) a deletion of one to several nucleotides in the nucleotide sequence of the DNA Amplifying any one of DNA selected from DNA encoding a protein having a mutation such as substitution, addition or induced mutation, and exhibiting dephosphorylation activity, and / or a DNA fragment thereof; and (3) A step of measuring the amount of DNA and / or DNA fragment amplified in (2).
また本発明は、ＰＣＲが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドおよび配列表の配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの組み合わせをプライマーとして用いるＰＣＲである、前記判定方法に関する。 The present invention also provides PCR using as a primer a combination of an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. This relates to the determination method.
さらに本発明は、配列表の配列番号３および配列番号４からなる群より選ばれるいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドに関する。 Furthermore, the present invention relates to an oligonucleotide represented by any one of the nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
さらにまた本発明は、前記オリゴヌクレオチドを含有してなる試薬キットに関する。 Furthermore, the present invention relates to a reagent kit containing the oligonucleotide.
また本発明は、腫瘍組織判定用試薬キットである、前記試薬キットに関する。 The present invention also relates to the reagent kit, which is a tumor tissue determination reagent kit.
さらに本発明は、下記Ａ群より選ばれるいずれか１と、下記Ｂ群より選ばれるいずれか１とを有してなる試薬キットに関する：
ここで、Ａ群は、
（１）次の群より選ばれるＤＮＡ：（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、（ｉｉｉ）上記ＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および（ｉｖ）上記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ、
（２）該ＤＮＡによりコードされる蛋白質、
（３）該ＤＮＡを含有する組み換えベクター、および
（４）該組み換えベクターを含有する形質転換体、からなり、
Ｂ群は、
ＣＳＥ１ＬをコードするＤＮＡ、ＣＳＥ１Ｌ、該ＤＮＡを含有する組み換えベクター、および該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる。
Furthermore, the present invention relates to a reagent kit comprising any one selected from the following group A and any one selected from the following group B:
Here, the A group is
(1) DNA selected from the following group: (i) DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, (ii) DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and at least 70% DNA encoding a protein having the above homology and exhibiting dephosphorylation activity, (iii) mutation or induction mutation such as deletion, substitution or addition of one to several nucleotides in the base sequence of the DNA. A DNA encoding a protein having dephosphorylation activity, and (iv) a DNA comprising any one of (i) to (iii) above,
(2) a protein encoded by the DNA,
(3) a recombinant vector containing the DNA, and (4) a transformant containing the recombinant vector,
Group B
It consists of DNA encoding CSE1L, CSE1L, a recombinant vector containing the DNA, and a transformant containing the recombinant vector.
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。
本明細書においては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail.
As used herein, “protein” is a generic term that refers to an isolated or synthetic full-length protein; an isolated or synthetic full-length polypeptide; or an isolated or synthetic full-length oligopeptide. The term is sometimes used. Here, the protein, polypeptide or oligopeptide includes two or more amino acids linked to each other by peptide bonds or modified peptide bonds. Hereinafter, when an amino acid is represented, it may be represented by one letter or three letters.
本明細書においては単離された完全長ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ；合成完全長ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ；単離されたＤＮＡおよび／またはＲＮＡオリゴヌクレオチド類；あるいは合成ＤＮＡおよび／またはＲＮＡオリゴヌクレオチド類を意味する総称的用語として「核酸」という用語を使用することがある。ここでそのようなＤＮＡおよび／またはＲＮＡは最小サイズが２ヌクレオチドである。 As used herein, isolated full-length DNA and / or RNA; synthetic full-length DNA and / or RNA; isolated DNA and / or RNA oligonucleotides; or synthetic DNA and / or RNA oligonucleotides The term “nucleic acid” may be used as a generic term to mean. Here, such DNA and / or RNA has a minimum size of 2 nucleotides.
（細胞増殖阻害方法および細胞増殖阻害剤）
本発明の一態様は、脱リン酸化酵素の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞増殖阻害方法および細胞増殖阻害剤に関する。
(Cell growth inhibition method and cell growth inhibitor)
One embodiment of the present invention relates to a method for inhibiting cell growth and a cell growth inhibitor characterized by inhibiting the expression and / or function of phosphatase.
本発明に係る脱リン酸化酵素として、配列番号１に記載の塩基配列で表されるヒト由来のＤＮＡを好ましく例示できる。配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、公共ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）にＫＩＡＡ１１５７として開示されている遺伝子の蛋白質コード領域からなるＤＮＡである。ＫＩＡＡ１１５７は、公共ヌクレオチドデータベースにアクセッション番号ＸＭ＿０５１０９３（［ｇｉ：１７４５５７１８］ Ｕｐｄａｔｅ Ｄａｔｅ：Ａｕｇ １ ２００２ ７：１０ＰＭ）として開示されている。 A preferred example of the phosphatase according to the present invention is a human-derived DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. The DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is a DNA comprising a protein coding region of a gene disclosed as KIAA1157 in the public nucleotide database (DDBJ / EMBL / GenBank). KIAA1157 is disclosed in the public nucleotide database as accession number XM_051093 ([gi: 17455718] Update Date: Aug 1 2002 7:10 PM).
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列（配列番号表２）には、プロテインフォスファターゼ２Ｃ触媒部位が存在する。このことから、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質は、蛋白質脱リン酸化酵素活性を有すると考えることができる。 There is a protein phosphatase 2C catalytic site in the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoded by the DNA represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 1. From this, it can be considered that the protein encoded by the present DNA has protein phosphatase activity.
本発明においては、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質が脱リン酸化活性を示すことを実証した。すなわち、後述するように、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、人工基質ｐ−ニトロフェニルリン酸（以下、ｐＮＰＰと略称することがある）、蛋白質基質カゼイン、およびペプチド基質リン酸化ペプチド（ＲＲＡ−ｐＴ−ＶＡ（配列表の配列番号２１）およびＲＲＰ−ｐＴ−ＶＡ（配列表の配列番号２２）：以下、リン酸化ペプチドを示す配列において、小文字ｐはリン酸を示す）をいずれも脱リン酸化した（実施例３参照）。また、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の脱リン酸化活性は、プロテインフォスファターゼ２Ｃと同様に金属イオン依存性を示し、さらに、プロテインフォスファターゼ１やプロテインフォスファターゼ２Ａの阻害剤であるオカダ酸によって阻害されなかった（実施例３参照）。このことから、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、プロテインフォスファターゼ２Ｃファミリーに属する蛋白質脱リン酸化酵素であると考えることができる。 In the present invention, it was demonstrated that the protein encoded by the DNA represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 exhibits dephosphorylation activity. That is, as will be described later, the protein encoded by the DNA represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an artificial substrate p-nitrophenyl phosphate (hereinafter sometimes abbreviated as pNPP), a protein substrate casein. , And peptide substrate phosphorylated peptides (RRA-pT-VA (SEQ ID NO: 21 in the Sequence Listing) and RRP-pT-VA (SEQ ID NO: 22 in the Sequence Listing): All of them were dephosphorylated (see Example 3). Further, the dephosphorylation activity of the protein encoded by the DNA represented by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is dependent on metal ions as in protein phosphatase 2C. Furthermore, protein phosphatase 1 and protein phosphatase 2A It was not inhibited by the inhibitor okadaic acid (see Example 3). From this, it can be considered that the protein encoded by the DNA represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 1 is a protein phosphatase belonging to the protein phosphatase 2C family.
本発明においてはまた、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の生体内基質の検索により、ＣＳＥ１Ｌを同定した。配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、ＣＳＥ１Ｌと結合し、これを脱リン酸化した（実施例４参照）。 In the present invention, CSE1L was also identified by searching the in vivo substrate of the protein encoded by the DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. The protein encoded by the DNA represented by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 bound to CSE1L and dephosphorylated it (see Example 4).
ＣＳＥ１Ｌは、細胞周期に関わる機能を有し、アポトーシスに関連することが知られており、それら以外にも多数の機能を有することが報告されている（非特許文献３）。例えば、多くの癌でＣＳＥ１Ｌの発現が亢進していることから、ＣＳＥ１Ｌは細胞の増殖・癌化に関与していると考えられる。 CSE1L has a function related to the cell cycle, is known to be related to apoptosis, and has been reported to have many other functions (Non-patent Document 3). For example, since the expression of CSE1L is increased in many cancers, CSE1L is considered to be involved in cell proliferation / carcinogenesis.
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質が蛋白質脱リン酸化酵素であると考えられること、およびその生体内基質がＣＳＥ１Ｌであると考えられることから、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質によるＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化が、ＣＳＥ１Ｌの機能、すなわち細胞周期・細胞増殖・癌化への関与を調節していると考えることができる。 Since the protein encoded by the DNA represented by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is considered to be a protein phosphatase, and its in vivo substrate is considered to be CSE1L, it is encoded by this DNA. It can be considered that the dephosphorylation of CSE1L by the protein to be regulated regulates the function of CSE1L, that is, the involvement in cell cycle, cell proliferation, and canceration.
実際、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現を、本ＤＮＡに対する特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を用いて阻害することにより細胞増殖が阻害された（実施例７参照）。このことから、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現阻害により、ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化が阻害され、その結果、細胞増殖が阻害されたと考えることができる。また、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質の機能を、該蛋白質の不活性変異体を用いて阻害することにより、制癌剤による癌細胞死が減弱した（実施例６参照）。このことから、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質の機能の阻害により、ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化が阻害され、その結果、細胞周期に遅滞が生じ、制癌剤に対する感受性が低下したと考えることができる。 In fact, cell growth was inhibited by inhibiting the expression of the protein encoded by the DNA represented by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 using a specific siRNA (small interfering RNA) against this DNA (implementation). Example 7). From this, it can be considered that the dephosphorylation of CSE1L was inhibited by inhibiting the expression of the protein encoded by this DNA, and as a result, cell proliferation was inhibited. In addition, by inhibiting the function of the protein encoded by this DNA using an inactive mutant of the protein, cancer cell death by an anticancer drug was attenuated (see Example 6). From this, it can be considered that the dephosphorylation of CSE1L is inhibited by the inhibition of the function of the protein encoded by this DNA, resulting in a delay in the cell cycle and a decrease in sensitivity to anticancer agents.
このように、本発明に係る脱リン酸化酵素、例えば配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現および／または機能を阻害することにより、細胞増殖を阻害することができる。 Thus, cell growth is inhibited by inhibiting the expression and / or function of the phosphatase according to the present invention, for example, the protein encoded by the DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Can do.
本発明に係る脱リン酸化酵素は、配列番号１に記載の塩基配列で表されるヒト由来のＤＮＡによりコードされる蛋白質に制限されず、本ＤＮＡと同様の構造的特徴を有し且つ本ＤＮＡによりコードされる蛋白質と同様の生物学的機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡによりコードされる蛋白質である限りにおいていずれの蛋白質も包含される。 The dephosphorylating enzyme according to the present invention is not limited to the protein encoded by the human-derived DNA represented by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and has the same structural characteristics as the present DNA and the present DNA Any protein is included as long as it is a protein encoded by a DNA encoding a protein having the same biological function as the protein encoded by.
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡの構造的特徴として、その塩基配列が挙げられる。塩基配列の配列相同性は通常、塩基配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、またさらにより好ましくは９５％以上であることが適当である。さらに、本発明に係る脱リン酸化酵素をコードするＤＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列と配列相同性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることが好ましい。アミノ酸配列の配列相同性は通常、アミノ酸配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、またさらにより好ましくは９５％以上であることが適当である。 Examples of the structural features of DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 include its nucleotide sequence. The sequence homology of the base sequence is usually 50% or more, preferably at least 70% as a whole. More preferably it is 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more. Furthermore, the DNA encoding the phosphatase according to the present invention is a DNA encoding a protein having sequence homology with the amino acid sequence of the protein encoded by the DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. It is preferable. The sequence homology of the amino acid sequences is usually 50% or more, preferably at least 70% as a whole. More preferably it is 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡと配列相同性を有するＤＮＡには、該塩基配列において、１個以上、例えば１〜３００個、好ましくは１〜９０個、より好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜３０個、特に好ましくは１〜数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列で表されるＤＮＡが含まれる。変異の程度およびそれらの位置は、該変異を有するＤＮＡによりコードされる蛋白質が、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と同様の配列相同性および生物学的機能を有するものである限り特に制限されない。配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と配列相同性を有する蛋白質には、そのアミノ酸配列において、１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異が存するアミノ酸配列で表される蛋白質が含まれる。変異を有するＤＮＡは天然に存在するものであってよく、また人工的に変異を導入したものであってもよい。 The DNA having the sequence homology with the DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is one or more, for example 1 to 300, preferably 1 to 90, more preferably 1 to 1, in the nucleotide sequence. 60, more preferably 1-30, and particularly preferably 1-several nucleotides, DNAs represented by nucleotide sequences having mutations such as deletion, substitution, addition or insertion of nucleotides are included. The degree of mutation and the position thereof are such that the protein encoded by the DNA having the mutation has the same sequence homology and biological function as the protein encoded by the DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. As long as it has, there is no particular limitation. The protein having sequence homology with the protein encoded by the DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 has one or more, for example 1 to 100, preferably 1 to 30, amino acid sequences. More preferably, it includes a protein represented by an amino acid sequence having a mutation such as deletion, substitution, addition or insertion of 1 to 20, more preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to several amino acids. The DNA having a mutation may be a naturally occurring DNA or an artificially introduced mutation.
また、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、本ＤＮＡと配列相同性を有するＤＮＡ、および本ＤＮＡの塩基配列において変異が存する塩基配列で表されるＤＮＡからなる群より選ばれるいずれか１のＤＮＡを含むＤＮＡも、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡと同様の構造的特徴を有するＤＮＡの範囲に包含される。 In addition, any one selected from the group consisting of DNA represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, DNA having sequence homology with the present DNA, and DNA represented by the base sequence having a mutation in the base sequence of the present DNA The DNA containing the DNA of 1 is also included in the range of DNA having the same structural characteristics as the DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡの構造的特徴としてまた、プロテインフォスファターゼ２Ｃ触媒部位をコードする領域を挙げることができる。配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、その塩基配列の第２８３番目から第６７５番目のヌクレオチドからなる領域にプロテインフォスファターゼ２Ｃ触媒部位をコードする領域を有する。該領域は、本ＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列（配列番号２）の第９５番目から２２５番目のアミノ酸領域に相当する。プロテインフォスファターゼ２Ｃ触媒部位をコードする領域における配列相同性は、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、またさらにより好ましくは９５％以上であることが適当である。さらに、プロテインフォスファターゼ２Ｃ触媒部位をコードする領域は、プロテインフォスファターゼ２Ｃ触媒部位として機能するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる領域であることが好ましい。 Examples of the structural features of the DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 include a region encoding a protein phosphatase 2C catalytic site. The DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 has a region encoding a protein phosphatase 2C catalytic site in a region consisting of nucleotides 283 to 675 of the nucleotide sequence. This region corresponds to the 95th to 225th amino acid region of the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoded by this DNA. The sequence homology in the region encoding the protein phosphatase 2C catalytic site is preferably at least 70%, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and even more preferably 95% The above is appropriate. Furthermore, the region encoding the protein phosphatase 2C catalytic site is preferably a region consisting of a base sequence encoding an amino acid sequence that functions as a protein phosphatase 2C catalytic site.
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の生物学的機能として、脱リン酸化活性を例示できる。本ＤＮＡによりコードされる蛋白質が、プロテインフォスファターゼ２Ｃファミリーに属する蛋白質脱リン酸化酵素であると考えられることから、その生物学的機能として好ましくは、プロテインフォスファターゼ２Ｃファミリーに属するセリンスレオニン脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性と同様の活性が挙げられる。 Dephosphorylation activity can be illustrated as a biological function of the protein encoded by the DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Since the protein encoded by this DNA is considered to be a protein phosphatase belonging to the protein phosphatase 2C family, its biological function is preferably a serine threonine phosphatase belonging to the protein phosphatase 2C family. Examples include the same activity as the dephosphorylation activity.
「セリンスレオニン脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性」とは、酵素が、基質と結合し、該基質内の、あるリン酸化されているセリン残基および／またはスレオニン残基に作用して、そのリン酸エステル結合の加水分解によるリン酸の遊離反応を触媒することにより、該基質を脱リン酸化する機能を意味する。 “Dephosphorylation activity of serine threonine dephosphorylation enzyme” means that an enzyme binds to a substrate and acts on a phosphorylated serine residue and / or threonine residue in the substrate, It means the function of dephosphorylating the substrate by catalyzing the release reaction of phosphoric acid by hydrolysis of the phosphate ester bond.
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の脱リン酸化活性により脱リン酸化される基質として、ＣＳＥ１Ｌを好ましく例示できる。また、基質として、人工基質ｐＮＰＰ、蛋白質カゼイン、リン酸化ペプチドＲＲＡ−ｐＴ−ＶＡ（配列表の配列番号２１）およびリン酸化ペプチドＲＲＰ−ｐＴ−ＶＡ（配列表の配列番号２２）を例示できる。本ＤＮＡによりコードされる蛋白質の基質は、これら例示した基質に限定されず、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質の脱リン酸化活性により脱リン酸化される基質である限りにおいて、蛋白質やペプチド等のいずれの化合物でもあり得る。 CSE1L is preferably exemplified as a substrate that is dephosphorylated by the dephosphorylation activity of the protein encoded by the DNA represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 1. Examples of the substrate include artificial substrate pNPP, protein casein, phosphorylated peptide RRA-pT-VA (SEQ ID NO: 21 in the sequence listing) and phosphorylated peptide RRP-pT-VA (SEQ ID NO: 22 in the sequence listing). The substrate of the protein encoded by this DNA is not limited to these exemplified substrates, and any protein, peptide, etc. may be used as long as it is a substrate that is dephosphorylated by the dephosphorylation activity of the protein encoded by this DNA. It can also be a compound of
脱リン酸化活性の測定は、基質の脱リン酸化を測定することにより実施できる。基質の脱リン酸化の測定は、自体公知の脱リン酸化測定方法を用いて、脱リン酸化活性を有すると考えられる蛋白質と基質とを共存させて脱リン酸化反応を行った後に、基質から遊離されたリン酸を検出することまたは遊離されたリン酸量を測定することにより実施できる。リン酸が検出されたとき、または遊離されたリン酸量が増加したとき、該蛋白質は脱リン酸化活性を有すると判定できる。あるいは、基質の脱リン酸化の測定は、脱リン酸化反応を行った後に、脱リン酸化された基質を検出することまたはその量を測定することにより実施できる。この場合、脱リン酸化された基質が検出されたとき、またはその量が増加したとき、該蛋白質は脱リン酸化活性を有すると判定できる。また、基質の脱リン酸化の測定は、脱リン酸化反応を行った後に、脱リン酸化されない基質を検出することまたはその量を測定することにより実施できる。この場合、脱リン酸化されない基質が減少したとき、または検出されなかったとき、該蛋白質は脱リン酸化活性を有すると判定できる。 The dephosphorylation activity can be measured by measuring the dephosphorylation of the substrate. The measurement of dephosphorylation of a substrate is carried out using a dephosphorylation measurement method known per se, and after the dephosphorylation reaction is carried out in the coexistence of a protein considered to have dephosphorylation activity and the substrate, it is released from the substrate. It can be carried out by detecting the released phosphoric acid or measuring the amount of released phosphoric acid. When phosphoric acid is detected or the amount of released phosphoric acid increases, it can be determined that the protein has dephosphorylation activity. Alternatively, the dephosphorylation of the substrate can be measured by detecting the dephosphorylated substrate or measuring the amount after the dephosphorylation reaction. In this case, when the dephosphorylated substrate is detected or the amount thereof is increased, it can be determined that the protein has dephosphorylation activity. Moreover, the measurement of the dephosphorylation of a substrate can be carried out by detecting a substrate that is not dephosphorylated or measuring the amount after the dephosphorylation reaction. In this case, when the substrate that is not dephosphorylated decreases or is not detected, it can be determined that the protein has dephosphorylation activity.
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、ＰＰ２Ｃファミリーに属する脱リン酸化酵素である。ＰＰ２Ｃファミリーに属する脱リン酸化酵素は、金属イオン依存的に脱リン酸化活性を示すこと、およびＰＰ１ファミリーやＰＰ２Ａファミリーに属する脱リン酸化酵素に対する阻害剤であるオカダ酸により阻害されないことが知られている。したがって、脱リン酸化活性の測定は、金属イオン存在下で実施することが好ましい。金属イオンとして、マンガンイオン（Ｍｎ２＋）およびマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を好ましく挙げることができる。また、オカダ酸に対する感受性を測定することにより、脱リン酸化活性を有すると判定された蛋白質が、ＰＰ２Ｃファミリーに属する脱リン酸化酵素であるか否かを判定することができる。 The protein encoded by the DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is a phosphatase belonging to the PP2C family. It is known that phosphatases belonging to the PP2C family exhibit dephosphorylation activity in a metal ion-dependent manner and are not inhibited by okadaic acid, which is an inhibitor for phosphatases belonging to the PP1 family and PP2A family. Yes. Therefore, it is preferable to measure the dephosphorylation activity in the presence of a metal ion. As metal ions, manganese ions (Mn 2+ ) and magnesium ions (Mg 2+ ) can be preferably mentioned. Further, by measuring the sensitivity to okadaic acid, it can be determined whether or not the protein determined to have dephosphorylation activity is a dephosphorylation enzyme belonging to the PP2C family.
基質から遊離されたリン酸の検出および定量は、例えば、マラカイトグリーンを用いた公知の方法（ファティー（Ｆａｔｈｉ，Ａ．Ｒ．）ら、「アナリティカルバイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００２年、第３１０巻、ｐ．２０８−２１４）に従って実施できる（実施例３参照）。 The detection and quantification of phosphate released from the substrate can be performed by, for example, a known method using malachite green (Fathi, AR. Et al., “Analytical Biochemistry”, 2002, No. 310, pages 208-214) (see Example 3).
脱リン酸化された基質の検出は、例えば、リン酸化されている基質を認識するが、リン酸化されていない基質は認識しない抗体を用いて、ウェスタンブロッティング等の公知の蛋白質検出方法により実施できる。 Detection of the dephosphorylated substrate can be carried out by a known protein detection method such as Western blotting using an antibody that recognizes a phosphorylated substrate but not a phosphorylated substrate.
脱リン酸化された基質の検出はまた、例えば、脱リン酸化されている蛋白質と脱リン酸化されていない蛋白質とでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での移動度が異なることを利用し、ウェスタンブロッティング等の公知の蛋白質検出方法により実施できる。一般的に、蛋白質が脱リン酸化された場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での移動度は、脱リン酸化されていない蛋白質と比較して上昇する。したがって、脱リン酸化反応後に、反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、次いでウェスタンブロッティング等の公知の蛋白質検出方法により基質を検出し、その移動度を、脱リン酸化反応を行っていない基質と比較することにより、脱リン酸化された基質の検出を実施できる（実施例４および５参照）。 The detection of dephosphorylated substrate is also performed by utilizing the difference in mobility on an SDS-PAGE gel between a dephosphorylated protein and a non-dephosphorylated protein, such as Western blotting. It can be carried out by a known protein detection method. In general, when a protein is dephosphorylated, the mobility on an SDS-PAGE gel is increased compared to a protein that is not dephosphorylated. Therefore, after the dephosphorylation reaction, the reaction solution is subjected to SDS-PAGE, then the substrate is detected by a known protein detection method such as Western blotting, and the mobility is compared with the substrate that has not undergone the dephosphorylation reaction. By doing so, the dephosphorylated substrate can be detected (see Examples 4 and 5).
脱リン酸化された基質の検出はまた、例えば、脱リン酸化されている基質と、脱リン酸化されていない基質との性質の違いを利用して、該性質を検出する方法により実施できる。例えば、人工基質ｐＮＰＰは、脱リン酸化されるとｐ−ニトロフェノールを遊離する。ｐ−ニトロフェノールは、ｐＮＰＰと異なり、波長４０５−４１０ｎｍで吸収を示す。したがって、該波長の吸光度を測定することにより、脱リン酸化反応によりｐＮＰＰから遊離されたｐ−ニトロフェノールの検出を実施できる（実施例３参照）。 The detection of the dephosphorylated substrate can also be carried out by a method for detecting the property using, for example, the difference in properties between the dephosphorylated substrate and the non-dephosphorylated substrate. For example, the artificial substrate pNPP releases p-nitrophenol when dephosphorylated. Unlike pNPP, p-nitrophenol exhibits absorption at a wavelength of 405-410 nm. Therefore, p-nitrophenol released from pNPP by dephosphorylation reaction can be detected by measuring the absorbance at the wavelength (see Example 3).
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の生物学的機能として、また、他の蛋白質との結合を例示できる。本ＤＮＡによりコードされる蛋白質と結合する蛋白質として、ＣＳＥ１Ｌを例示できる。本ＤＮＡによりコードされる蛋白質と結合する蛋白質は、例示した蛋白質に限定されず、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質と結合する蛋白質である限りにおいていずれの蛋白質でもあり得る。 Examples of the biological function of the protein encoded by the DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 include binding to other proteins. An example of a protein that binds to a protein encoded by this DNA is CSE1L. The protein that binds to the protein encoded by the present DNA is not limited to the exemplified protein, and can be any protein as long as it is a protein that binds to the protein encoded by the present DNA.
「本ＤＮＡによりコードされる蛋白質と他の蛋白質の結合」とは、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質と他の蛋白質とが、複合体を形成するように、水素結合、疎水結合または静電的相互作用等の非共有結合により相互作用することを意味する。ここでの結合とは、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質と他の蛋白質がその一部分において結合すれば足りる。例えば、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質または他の蛋白質を構成するアミノ酸の中に、両蛋白質の結合に関与しないアミノ酸が含まれていてもよい。また、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質と他の蛋白質により形成される複合体には、これら蛋白質とは別種の蛋白質が含まれていてもよい。本ＤＮＡによりコードされる蛋白質と他の蛋白質との結合の測定は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、プルダウン法、ツーハイブリッド法および蛍光共鳴エネルギー転移法等の自体公知の方法またはこれらの方法を組合わせることにより実施できる。 “Binding of the protein encoded by this DNA and other proteins” means that the protein encoded by this DNA and other proteins form hydrogen bonds, hydrophobic bonds or electrostatic interactions so that a complex is formed. It means to interact by noncovalent bonds such as action. The term “binding” here only suffices if the protein encoded by the present DNA and another protein bind in part. For example, amino acids that are not involved in the binding of both proteins may be included in the amino acids constituting the protein encoded by this DNA or other proteins. In addition, the complex formed by the protein encoded by the present DNA and another protein may contain a protein different from these proteins. Measurement of the binding between the protein encoded by this DNA and other proteins can be performed by methods known per se such as Western blotting, immunoprecipitation, pull-down, two-hybrid, and fluorescence resonance energy transfer, or a combination of these methods. Can be implemented.
「蛋白質の発現」とは、蛋白質をコードするＤＮＡの遺伝子情報がｍＲＮＡに転写されること、または、ｍＲＮＡに転写され、かつ蛋白質のアミノ酸配列として翻訳されることをいう。 “Protein expression” means that gene information of DNA encoding a protein is transcribed into mRNA, or transcribed into mRNA and translated as an amino acid sequence of the protein.
「蛋白質の発現を阻害する」とは、蛋白質をコードするＤＮＡの遺伝子情報がｍＲＮＡに転写される過程、または、ｍＲＮＡに転写され、かつ蛋白質のアミノ酸配列として翻訳される過程で生じる様々な反応の少なくとも１つを妨げることにより、該蛋白質をコードする遺伝子の転写・翻訳による該蛋白質の生成を妨げることを意味する。 “Inhibiting protein expression” refers to various reactions that occur during the process of transcribing the gene information of DNA encoding the protein into mRNA or the process of being transcribed into mRNA and translated into the amino acid sequence of the protein. By preventing at least one, it means preventing the production of the protein by transcription / translation of the gene encoding the protein.
目的の蛋白質の発現の阻害は、該目的蛋白質の発現を阻害する活性を有する化合物を用いて実施できる。このような化合物として、好ましくは該目的蛋白質の発現を特異的に阻害する活性を有する化合物、より好ましくは該目的蛋白質の発現を特異的に阻害する活性を有する低分子量化合物を挙げることができる。目的蛋白質の発現を特異的に阻害するとは、当該目的蛋白質発現を強く阻害するが、他の蛋白質の発現は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。低分子量化合物とは、ペプチド、ペプチド様物質、ポリペプチド、核酸、有機化合物、および無機化合物が含まれ、その分子量が好ましくは１００００以下、より好ましくは５０００以下、さらに好ましくは１０００以下、さらにより好ましくは５００以下の化合物を意味する。目的蛋白質の発現を阻害する化合物は、後述する化合物の同定方法を用いて取得できる。 Inhibition of the expression of the target protein can be carried out using a compound having an activity of inhibiting the expression of the target protein. As such a compound, a compound having an activity of specifically inhibiting the expression of the target protein, preferably a low molecular weight compound having an activity of specifically inhibiting the expression of the target protein can be mentioned. To specifically inhibit the expression of the target protein means to strongly inhibit the expression of the target protein but not or weakly inhibit the expression of other proteins. Low molecular weight compounds include peptides, peptide-like substances, polypeptides, nucleic acids, organic compounds, and inorganic compounds, and their molecular weights are preferably 10,000 or less, more preferably 5000 or less, even more preferably 1000 or less, and even more preferably Means 500 or less compounds. A compound that inhibits the expression of the target protein can be obtained using the compound identification method described below.
本発明に係る脱リン酸化酵素の発現を阻害する化合物として、例えば、該脱リン酸化酵素をコードする遺伝子の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を例示できる（エルバシ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ Ｓ．Ｍ．）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００１年、第４１１巻、ｐ．４９４−４９８；およびパディソン（Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．）ら、「ジーンズ アンド ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第１６巻、ｐ．９４８−９５８）。 Examples of the compound that inhibits the expression of phosphatase according to the present invention include siRNA (small interfering RNA) that can reduce or eliminate the expression of a gene encoding the phosphatase by an RNA interference technique ( Elbashir SM, et al., “Nature”, 2001, vol. 411, p. 494-498; and Paddison PJ, et al., “Genes and Development”. ", 2002, volume 16, pages 948-958).
本発明に係る脱リン酸化酵素をコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、該遺伝子の部分配列からなるＲＮＡ（センスＲＮＡ）と該ＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）とを、該遺伝子のｍＲＮＡの配列に基づいて設計し、自体公知の化学合成法により合成し、得られた両ＲＮＡをハイブリダイゼーションさせることにより製造できる。ｓｉＲＮＡを構成するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡは、それぞれ数個ないし１０数個程度のヌクレオチドからなることが好ましい。また、それぞれ、その３´末端に、オーバーハング配列と呼ばれる１個ないし数個の塩基配列からなるヌクレオチドを結合させることが好ましい。オーバーハング配列は、ＲＮＡをヌクレアーゼから保護する作用を有する。オーバーハング配列は、該ＲＮＡのＲＮＡ干渉効果を阻害しない限りにおいて特に制限されず、好ましくは１個ないし１０個、より好ましくは１個ないし４個、さらに好ましくは２個のヌクレオチドからなるものをいずれも用いることができる。具体的には、デオキシチミジル酸からなる配列（例えばＴＴ）、ウリジル酸からなる配列（例えばＵＵ）、デオキシチミジル酸に続いて任意のヌクレオチドが結合した配列（例えばＴＮ）といった配列を例示できる。合成を安価に行えることおよびヌクレアーゼ耐性がより強いことから、より好ましくは、２つのデオキシチミジル酸からなる配列をオーバーハング配列として用いる。オーバーハング配列は、センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡのそれぞれの３´末端のリボース３´水酸基部位にジエステル結合により結合させる。 The siRNA for the gene encoding the phosphatase according to the present invention comprises RNA (sense RNA) consisting of a partial sequence of the gene and RNA (antisense RNA) consisting of a base sequence complementary to the base sequence of the RNA. It can be produced by designing based on the mRNA sequence of the gene, synthesizing it by a chemical synthesis method known per se, and hybridizing the two RNAs obtained. Each of the sense RNA and antisense RNA constituting the siRNA is preferably composed of several to about 10 or more nucleotides. In addition, it is preferable that a nucleotide consisting of one to several base sequences called an overhang sequence is bound to the 3 ′ end of each. The overhang sequence has the effect of protecting RNA from nucleases. The overhang sequence is not particularly limited as long as it does not inhibit the RNA interference effect of the RNA, preferably any one consisting of 1 to 10, more preferably 1 to 4, and even more preferably 2 nucleotides. Can also be used. Specifically, sequences such as a sequence composed of deoxythymidylic acid (for example, TT), a sequence composed of uridylic acid (for example, UU), and a sequence in which any nucleotide is bound following deoxythymidylic acid (for example, TN) can be exemplified. More preferably, a sequence composed of two deoxythymidylic acids is used as an overhang sequence because synthesis can be performed at low cost and nuclease resistance is higher. The overhang sequence is bonded to the ribose 3 ′ hydroxyl site at the 3 ′ end of each of the sense RNA and the antisense RNA by a diester bond.
本発明に係る脱リン酸化酵素をコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡとして、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡに対するｓｉＲＮＡが挙げられる。 Examples of siRNA for the gene encoding the phosphatase according to the present invention include siRNA for DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡに対するｓｉＲＮＡとして具体的には、配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド（配列番号１８）とからなる短鎖二重鎖ＲＮＡを例示できる。本発明に係る脱リン酸化酵素をコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡは上記例示したものに制限されず、該遺伝子の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るものであればいずれも用いることができる。 Specifically, the siRNA against the DNA represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is represented by the oligonucleotide represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 and the complementary base sequence of the base sequence. A short double-stranded RNA consisting of an oligonucleotide (SEQ ID NO: 18). The siRNA for the gene encoding the phosphatase according to the present invention is not limited to those exemplified above, and any can be used as long as the expression of the gene can be reduced or eliminated by the RNA interference technique.
遺伝子の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るｓｉＲＮＡとしてまた、ｓｈＲＮＡを例示できる。ｓｈＲＮＡは、ヘアピン構造を有する短鎖二重鎖ＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡと同様、ＲＮＡ干渉により遺伝子の発現を抑制する（パディソン（Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．）ら、「ジーンズ アンド ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第１６巻、ｐ．９４８−９５８）。ｓｈＲＮＡは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとが例えばオリゴヌクレオチド等により連結され、センスＲＮＡ由来部分とアンチセンスＲＮＡ由来部分が二重鎖を形成するため、ヘアピン様構造を呈する。ｓｈＲＮＡは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡに加え、これら２つのＲＮＡを連結しかつループ構造を形成するようなオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡを、本発明に係る脱リン酸化酵素をコードする遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列に基づいて設計して、自体公知の方法により製造することができる。好ましくは、センスＲＮＡの３´末端とループ構造を形成するオリゴヌクレオチドの５´末端とが結合し、さらにループ構造を形成するオリゴヌクレオチドの３´末端とアンチセンスＲＮＡの５´末端とが結合したオリゴヌクレオチドであることが望ましい。ループ構造を形成するオリゴヌクレオチドとは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの間に存在して両ＲＮＡを連結でき、それ自体がループ構造を形成するものを意味する。このようなオリゴヌクレオチドの設計は、文献（パディソン（Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．）ら、「ジーンズ アンド ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第１６巻、ｐ．９４８−９５８）の記載を参考にして実施できる。好ましくは４個ないし２３個、より好ましくは４個ないし８個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが望ましい。例えば、ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ（Ａｍｂｉｏｎ社製またはＯｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ社製）、ＡＡＣＧＴＴ、ＴＴＡＡ、ＣＡＡＧＣＴＴＣ等の配列を挙げることができる。ヘアピン構造を有する二重鎖の形成は、センスＲＮＡ由来部分とアンチセンスＲＮＡ由来部分とを慣用の方法でアニーリングすることにより実施できる。 Examples of siRNA that can reduce or eliminate gene expression by RNA interference techniques include shRNA. shRNA is a short double-stranded RNA having a hairpin structure and, like siRNA, suppresses gene expression by RNA interference (Paddison PJ et al., “Genes and Development”). 2002, volume 16, pages 948-958). The shRNA has a hairpin-like structure because the sense RNA and the antisense RNA are linked by, for example, an oligonucleotide, and the sense RNA-derived portion and the antisense RNA-derived portion form a double strand. In addition to sense RNA and antisense RNA, shRNA is an RNA containing an oligonucleotide that links these two RNAs and forms a loop structure. The base of the mRNA of the gene encoding the phosphatase according to the present invention. It can be designed based on the sequence and manufactured by a method known per se. Preferably, the 3 ′ end of the sense RNA is bonded to the 5 ′ end of the oligonucleotide forming the loop structure, and the 3 ′ end of the oligonucleotide forming the loop structure is bonded to the 5 ′ end of the antisense RNA. An oligonucleotide is preferred. The oligonucleotide that forms a loop structure means an oligonucleotide that exists between a sense RNA and an antisense RNA and that can link both RNAs and itself forms a loop structure. The design of such oligonucleotides is based on the description in the literature (Paddison PJ, et al., “Jeans and Development”, 2002, Vol. 16, pp. 948-958). Can be implemented. An oligonucleotide consisting of preferably 4 to 23, more preferably 4 to 8 nucleotides is desirable. For example, sequences such as TTCAAGAGA (Ambion or Oligoengine), AACGTT, TTAA, CAAGCTTC and the like can be mentioned. Formation of a duplex having a hairpin structure can be carried out by annealing a sense RNA-derived portion and an antisense RNA-derived portion by a conventional method.
本発明に係る脱リン酸化酵素の発現を阻害する化合物としてまた、本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドを例示できる。 Examples of the compound that inhibits the expression of the phosphatase according to the present invention include an antisense oligonucleotide of a gene encoding the phosphatase.
本発明に係る脱リン酸化酵素の発現を阻害する機能を有するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの選択は、適当な細胞に本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子とｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれか１つとをコトランスフェクション（共遺伝子導入）し、本脱リン酸化酵素の発現をウェスタンブロッティング等の自体公知の方法により検出し、本脱リン酸化酵素の発現が阻害されるか否かを確認することにより実施できる。 Selection of siRNA, shRNA, and antisense oligonucleotide having a function of inhibiting the expression of phosphatase according to the present invention is carried out by selecting a gene encoding this phosphatase, siRNA, shRNA, and antisense in an appropriate cell. Is co-transfection (cogene transfer) with any one of the oligonucleotides, and the expression of the dephosphorylation enzyme is detected by a method known per se, such as Western blotting, and the expression of the dephosphorylation enzyme is inhibited? This can be done by checking whether or not.
内在性の本脱リン酸化酵素の発現の阻害は、本脱リン酸化酵素の発現を阻害する機能を有するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを、適当な遺伝子工学的手法、例えばリポフェクションにより細胞内に導入することにより達成できる。 Inhibition of endogenous phosphatase expression can be achieved using siRNA, shRNA, and antisense oligonucleotides that have the function of inhibiting the expression of the phosphatase in the cell by appropriate genetic engineering techniques such as lipofection. This can be achieved by introducing it into
ここでは、阻害効果を有する化合物（例えば競合阻害効果を有する低分子化合物等）を阻害剤と称する。 Here, a compound having an inhibitory effect (for example, a low molecular compound having a competitive inhibitory effect) is referred to as an inhibitor.
「蛋白質の機能」とは、蛋白質が備えている働きを意味する。本発明に係る脱リン酸化酵素の機能として、上述したように、本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性、および本脱リン酸化酵素と他の蛋白質、例えば基質との結合を例示できる。本脱リン酸化酵素が結合する蛋白質として、ＣＳＥ１Ｌを好ましく例示できる。本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性により脱リン酸化される基質として、ＣＳＥ１Ｌ、人工基質ｐＮＰＰ、蛋白質カゼイン、リン酸化ペプチドＲＲＡ−ｐＴ−ＶＡ（配列表の配列番号２１）およびリン酸化ペプチドＲＲＰ−ｐＴ−ＶＡ（配列表の配列番号２２）を例示できる。好ましくは、本脱リン酸化酵素の基質として、ＣＳＥ１Ｌを挙げることができる。本脱リン酸化酵素の基質は、これら例示した基質に限定されず、本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性により脱リン酸化される基質である限りにおいて、蛋白質やペプチド等のいずれの化合物でもあり得る。 “Protein function” means a function of a protein. As described above, the functions of the phosphatase according to the present invention include the phosphatase activity of the phosphatase and the binding of the phosphatase to other proteins such as substrates. CSE1L is preferably exemplified as a protein to which the present phosphatase binds. CSE1L, artificial substrate pNPP, protein casein, phosphorylated peptide RRA-pT-VA (SEQ ID NO: 21 in the sequence listing) and phosphorylated peptide RRP- as substrates to be dephosphorylated by the dephosphorylating activity of the present dephosphorylating enzyme An example is pT-VA (SEQ ID NO: 22 in the Sequence Listing). Preferably, CSE1L can be mentioned as a substrate of this phosphatase. The substrate of the present phosphatase is not limited to these exemplified substrates, and may be any compound such as a protein or a peptide as long as it is a substrate that is dephosphorylated by the phosphatase activity of the present phosphatase. obtain.
「本発明に係る脱リン酸化酵素の機能を阻害する」とは、本脱リン酸化酵素が備えている働きを低減させるまたは消失させることを意味する。具体的には、本脱リン酸化酵素の機能を阻害するとは、例えば、本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性、および本脱リン酸化酵素と基質、例えば基質である他の蛋白質との結合のうちの少なくとも１を阻害することを意味する。より具体的には、本脱リン酸化酵素の機能を阻害するとは、例えば、本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合および／または本脱リン酸化酵素のＣＳＥ１Ｌに対する脱リン酸化活性を阻害することを意味する。 “Inhibiting the function of the phosphatase according to the present invention” means reducing or eliminating the function of the phosphatase. Specifically, inhibiting the function of the present phosphatase refers to, for example, the activity of the phosphatase of the present phosphatase and the binding of the phosphatase to a substrate, for example, another protein as a substrate. Means inhibiting at least one of them. More specifically, inhibiting the function of the present phosphatase means, for example, inhibiting the binding of the phosphatase and CSE1L and / or the dephosphorylation activity of the phosphatase to CSE1L. To do.
本発明に係る脱リン酸化酵素の機能の阻害は、本脱リン酸化酵素の機能を阻害する化合物を用いて実施できる。このような化合物として、好ましくは本脱リン酸化酵素の機能を特異的に阻害する化合物、より好ましくは本脱リン酸化酵素の機能を特異的に阻害する活性を有する低分子量化合物を挙げることができる。本脱リン酸化酵素の機能を特異的に阻害するとは、当該機能を強く阻害するが、他の蛋白質の機能は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。本脱リン酸化酵素の機能を阻害する活性を有する化合物は、後述する化合物の同定方法を用いて取得できる。 Inhibition of the function of the phosphatase according to the present invention can be carried out using a compound that inhibits the function of the phosphatase. As such a compound, a compound that specifically inhibits the function of the present phosphatase, preferably a low molecular weight compound having an activity that specifically inhibits the function of the phosphatase can be exemplified. . Specifically inhibiting the function of the present phosphatase means that the function is strongly inhibited, but the functions of other proteins are not inhibited or weakly inhibited. A compound having an activity of inhibiting the function of the present dephosphorylating enzyme can be obtained by using a compound identification method described later.
本発明に係る脱リン酸化酵素の機能の阻害は、具体的には、本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性、および本脱リン酸化酵素と基質、例えば基質である他の蛋白質との結合のうちの少なくとも１を阻害する活性を有する化合物により実施できる。より具体的には、本脱リン酸化酵素の機能の阻害は、例えば、本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌとの結合および／または本脱リン酸化酵素のＣＳＥ１Ｌに対する脱リン酸化活性を阻害する活性を有する化合物を用いて実施できる。 Specifically, the inhibition of the function of the phosphatase according to the present invention includes the dephosphorylation activity of the phosphatase and the binding of the phosphatase to a substrate, for example, another protein as a substrate. It can carry out by the compound which has the activity which inhibits at least 1 of them. More specifically, inhibition of the function of the present phosphatase has, for example, an activity of binding the present phosphatase and CSE1L and / or inhibiting the dephosphorylation activity of the phosphatase against CSE1L. It can be carried out with compounds.
本発明に係る脱リン酸化酵素と基質の結合を阻害する活性を有する化合物は、該結合を阻害する結果、本脱リン酸化酵素の該基質への作用を阻害するため、例えば、本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性による該基質の脱リン酸化を阻害する。具体的には、例えば、本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を阻害する活性を有する化合物は、本脱リン酸化酵素のＣＳＥ１Ｌへの作用を阻害するため、本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性によるＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を阻害する。 The compound having an activity of inhibiting the binding between the dephosphorylating enzyme and the substrate according to the present invention inhibits the action of the present dephosphorylating enzyme on the substrate as a result of inhibiting the binding. Inhibits dephosphorylation of the substrate by the dephosphorylation activity of the enzyme. Specifically, for example, a compound having an activity that inhibits the binding of the present dephosphorylating enzyme and CSE1L inhibits the action of the present dephosphorylating enzyme on CSE1L. Inhibits the dephosphorylation of CSE1L.
本発明に係る脱リン酸化酵素と基質、例えば他の蛋白質との結合を阻害する活性を有する化合物として、本脱リン酸化酵素の不活性変異体を例示できる。 Examples of the compound having an activity of inhibiting the binding of the phosphatase according to the present invention and a substrate such as another protein include inactive mutants of the phosphatase.
「本発明に係る脱リン酸化酵素の不活性変異体」とは、本脱リン酸化酵素の変異体であって、脱リン酸化活性が本脱リン酸化酵素と比較して減弱したまたは消失した変異体を意味する。本発明に係る脱リン酸化酵素の不活性変異体は、ドミナントネガティブ変異体であることが好ましい。 “Inactive mutant of phosphatase according to the present invention” is a mutant of the present phosphatase, in which the phosphatase activity is attenuated or eliminated compared to the phosphatase Means the body. The inactive mutant of the phosphatase according to the present invention is preferably a dominant negative mutant.
「ドミナントネガティブ変異体」とは、正常蛋白質の持つ一部の機能が残されているために、正常蛋白質の作用を特異的に阻害するように働く変異体を意味する。ドミナントネガティブ変異体に対して、変異を有さない正常蛋白質を野生型と称することがある。本発明に係る脱リン酸化酵素のドミナントネガティブ変異体として、本脱リン酸化酵素にアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異が導入された不活性変異体であって、本脱リン酸化酵素が結合する基質との結合能を有するが脱リン酸化酵素活性を有さない変異体を例示できる。このような不活性変異体は、野生型の本脱リン酸化酵素と拮抗して基質と結合することにより、野生型の本脱リン酸化酵素の基質への結合を阻害し、その結果、該基質に対する本脱リン酸化酵素の作用を阻害できる。本脱リン酸化酵素の不活性変異体は、天然に存在するものであってよく、人工的に変異を導入したものであってもよい。本脱リン酸化酵素の不活性変異体における変異部位として、本脱リン酸化酵素のアミノ酸配列において該酵素の脱リン酸化活性に必要な部位を例示できる。本脱リン酸化酵素の不活性変異体は、本脱リン酸化酵素のアミノ酸配列に基づいて所望の蛋白質を設計して公知の方法で製造し、取得した蛋白質の中から本脱リン酸化酵素と基質との結合を阻害しかつ脱リン酸化活性を示さないものを、後述する化合物の同定方法に記載の方法を用いて選別することにより取得できる。 The “dominant negative mutant” means a mutant that functions to specifically inhibit the action of the normal protein because a part of the function of the normal protein remains. In contrast to the dominant negative mutant, a normal protein having no mutation may be referred to as a wild type. A dominant negative mutant of the phosphatase according to the present invention is an inactive mutant in which a mutation such as amino acid deletion, substitution, addition or insertion is introduced into the phosphatase, wherein the phosphatase Examples include mutants that have the ability to bind to a substrate to which the enzyme binds but do not have phosphatase activity. Such an inactive mutant inhibits the binding of the wild-type main phosphatase to the substrate by antagonizing the wild-type main phosphatase and binds to the substrate. Can inhibit the action of the present phosphatase on. The inactive mutant of the present phosphatase may be a naturally-occurring mutant or an artificially introduced mutation. Examples of the mutation site in the inactive mutant of the present dephosphorylating enzyme include a site necessary for the dephosphorylating activity of the enzyme in the amino acid sequence of the present dephosphorylating enzyme. The inactive mutant of the present phosphatase is produced by designing a desired protein based on the amino acid sequence of the phosphatase by a known method. Can be obtained by screening using the method described in the compound identification method described later.
本発明に係る脱リン酸化酵素のドミナントネガティブ変異体として、具体的には、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質（配列番号２）のアミノ酸配列において第４３７番目のアスパラギン酸がアラニンに置換された変異体を例示できる。本変異体は、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質の基質であるＣＳＥ１Ｌと結合したが、ＣＳＥ１Ｌに対するリン酸化活性は野生型と比較して低かった（実施例４および５参照）。 As the dominant negative mutant of the phosphatase according to the present invention, specifically, for example, the amino acid sequence of the protein (SEQ ID NO: 2) encoded by the DNA represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing In Fig. 4, a mutant in which the 437th aspartic acid is substituted with alanine can be exemplified. This mutant bound to CSE1L, which is a substrate for the protein encoded by this DNA, but its phosphorylation activity against CSE1L was lower than that of the wild type (see Examples 4 and 5).
本発明に係る脱リン酸化酵素の不活性変異体の作製は、例えば、本脱リン酸化酵素をコードするＤＮＡを組み込んだベクターを用いて公知の遺伝子工学的手法により該ＤＮＡに所望の変異を導入し、得られた変異ＤＮＡを用いて該変異ＤＮＡによりコードされる蛋白質を発現させることにより実施できる。（実施例４参照）。 For example, inactive mutants of the phosphatase according to the present invention can be prepared by introducing a desired mutation into the DNA by a known genetic engineering technique using a vector incorporating the DNA encoding the phosphatase. Then, the obtained mutant DNA can be used to express a protein encoded by the mutant DNA. (See Example 4).
本発明に係る脱リン酸化酵素と基質の結合を阻害する活性を有する化合物としてまた、本脱リン酸化酵素と基質とが結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを例示できる。このようなポリペプチドは、本脱リン酸化酵素と基質の結合を競合的に阻害することができる。このようなポリペプチドは、本脱リン酸化酵素または基質、例えば基質蛋白質のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、本脱リン酸化酵素と基質の結合を阻害するものを選択することにより取得できる。このように特定されたポリペプチドに、１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、本脱リン酸化酵素と基質の結合を阻害するものが好ましい。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよく、また人工的に変異を導入したものであってもよい。これらポリペプチドは、後述する一般的な製造方法により取得できる。 Examples of the compound having an activity of inhibiting the binding between the phosphatase and the substrate according to the present invention include a polypeptide comprising an amino acid sequence at a site where the present phosphatase and the substrate are bound. Such a polypeptide can competitively inhibit the binding between the present phosphatase and the substrate. Such a polypeptide is designed from the amino acid sequence of the present phosphatase or a substrate, for example, a substrate protein, and is synthesized by a peptide synthesis method known per se to inhibit the binding of the phosphatase to the substrate. Can be obtained by selecting. A polypeptide in which mutations such as deletion, substitution, addition or insertion of one to several amino acids are introduced into the thus identified polypeptide is also encompassed in the scope of the present invention. A polypeptide into which such a mutation is introduced preferably inhibits the binding between the present dephosphorylating enzyme and the substrate. The polypeptide having a mutation may be a naturally occurring polypeptide, or may be an artificially introduced mutation. These polypeptides can be obtained by a general production method described later.
本発明に係る脱リン酸化酵素と基質の結合を阻害する活性を有する化合物としてまた、本脱リン酸化酵素または基質を認識する抗体であって本脱リン酸化酵素と基質の結合を阻害する抗体および該抗体のフラグメントを例示できる。かかる抗体は、本脱リン酸化酵素または基質自体、またはこれらの断片、好ましくは本脱リン酸化酵素または基質が結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により取得できる。 As a compound having an activity of inhibiting the binding between the phosphatase and the substrate according to the present invention, an antibody that recognizes the phosphatase or the substrate and that inhibits the binding between the phosphatase and the substrate and A fragment of the antibody can be exemplified. Such an antibody can be obtained by an antibody production method known per se using as an antigen a polypeptide comprising the amino acid sequence of the site to which the present phosphatase or substrate itself or a fragment thereof, preferably the phosphatase or substrate binds. .
本発明に係る脱リン酸化酵素と基質の結合を阻害する活性を有する化合物としてさらにまた、本脱リン酸化酵素または基質を特異的に認識するアプタマーであって、本脱リン酸化酵素と基質の結合を阻害するアプタマーを例示できる。アプタマーは、核酸アプタマーまたはペプチドアプタマーのいずれであってもよい。かかるアプタマーは、公知の方法（例えば、ハーマン（Ｈｅｒｍａｎｎ Ｔ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２０００年、第２８７巻、第５４５４号、ｐ．８２０−８２５；バーグスタラー（Ｂｕｒｇｓｔａｌｌｅｒ Ｐ．）ら、「カレント オピニオン イン ドラッグ ディスカバリー アンド ディベロプメント（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第５巻、第５号、ｐ．６９０−７００；およびホップ−セイラー（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ Ｆ．）ら、２００２年、「カレント モレキュラー メディシン（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２００４年、第４巻、第５号、ｐ．５２９−５３８）に記載された方法）を用いて取得できる。 Further, the compound having an activity of inhibiting the binding between the phosphatase and the substrate according to the present invention is an aptamer that specifically recognizes the phosphatase or the substrate, and the binding of the phosphatase and the substrate Aptamers that inhibit the The aptamer may be either a nucleic acid aptamer or a peptide aptamer. Such aptamers can be prepared by known methods (eg, Hermann T. et al., “Science”, 2000, 287, 5454, p. 820-825; Burgstaller P. et al., “Current Opinion in Drug Discovery and Development”, 2002, Vol. 5, No. 5, p. 690-700; and Hoppe-Seyler F. et al., 2 Year, “Current Molecular Medicine”, 2004, Vol. 4, No. 5, pp. 529-538). It can be obtained using the method).
本発明に係る脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性を阻害する活性を有する化合物は、本脱リン酸化酵素がその基質を脱リン酸化する一連の反応、すなわち、本脱リン酸化酵素が基質と結合し、該基質内のあるリン酸化されているセリン残基および／またはスレオニン残基に作用して、そのリン酸エステル結合の加水分解によるリン酸の遊離反応を触媒することにより該基質を脱リン酸化する一連の反応において生じる様々な反応のうち少なくともいずれか１を阻害する活性を有する化合物であり得る。具体的には例えば、本脱リン酸化酵素の基質に対する脱リン酸化活性を阻害する活性を有する化合物は、本脱リン酸化酵素が、ＣＳＥ１Ｌと結合し、ＣＳＥ１Ｌを脱リン酸化する一連の反応において生じる様々な反応のうち少なくともいずれか１を阻害する活性を有する化合物であり得る。 The compound having the activity of inhibiting the dephosphorylation activity of the dephosphorylation enzyme according to the present invention is a series of reactions in which the dephosphorylation enzyme dephosphorylates the substrate, that is, the dephosphorylation enzyme binds to the substrate. Then, it acts on a phosphorylated serine residue and / or threonine residue in the substrate to catalyze the release reaction of phosphate by hydrolysis of its phosphate ester bond, thereby dephosphorylating the substrate. It may be a compound having an activity of inhibiting at least any one of various reactions occurring in a series of reactions that oxidize. Specifically, for example, a compound having an activity of inhibiting the dephosphorylation activity of the present dephosphorylating enzyme on a substrate is generated in a series of reactions in which the present dephosphorylating enzyme binds to CSE1L and dephosphorylates CSE1L. It may be a compound having an activity of inhibiting at least any one of various reactions.
本発明に係る脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性を阻害する活性を有する化合物として、本脱リン酸化酵素に特異的に結合しその脱リン酸化活性を阻害する抗体または該抗体のフラグメントを例示できる。また、本脱リン酸化酵素に特異的に結合しその脱リン酸化活性を阻害する活性を有するアプタマーを例示できる。抗体あるいはアプタマーは上述の方法で作製でき、本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性に対するこれらの阻害活性を後述する化合物の同定方法に記載の方法で測定することにより、本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性を阻害する活性を有する抗体あるいはアプタマーを取得できる。 Examples of the compound having an activity of inhibiting the dephosphorylation activity of the dephosphorylation enzyme according to the present invention include an antibody or a fragment of the antibody that specifically binds to the dephosphorylation enzyme and inhibits the dephosphorylation activity. . Moreover, the aptamer which has the activity which couple | bonds specifically with this phosphatase and inhibits the phosphatase activity can be illustrated. The antibody or aptamer can be prepared by the above-described method, and the dephosphorylation enzyme can be removed by measuring the inhibitory activity against the dephosphorylation activity of the dephosphorylation enzyme by the method described in the method for identifying a compound described later. Antibodies or aptamers having an activity that inhibits phosphorylation activity can be obtained.
上述のように、本発明に係る脱リン酸化酵素、例えば配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現および／または機能を阻害することにより、例えばＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を阻害することができ、さらに、細胞増殖を阻害することができる。 As described above, by inhibiting the expression and / or function of the protein encoded by the dephosphorylating enzyme according to the present invention, for example, the DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, for example, dephosphorylation of CSE1L Oxidation can be inhibited, and further cell proliferation can be inhibited.
「細胞増殖」とは、***により細胞の数が増すことを意味し、炎症性刺激に対する反応としての細胞増殖並びに腫瘍性増殖等を含む。 “Cell proliferation” means that the number of cells increases due to division, and includes cell proliferation as a response to inflammatory stimuli as well as neoplastic proliferation.
本発明に係る細胞増殖阻害方法および細胞増殖阻害剤により増殖が阻害される細胞として、本脱リン酸化酵素の発現が亢進している細胞を挙げることができる。このような細胞として具体的には、大腸腺腫細胞等の良性腫瘍細胞、および大腸癌細胞や前立腺癌細胞等の悪性腫瘍細胞を例示できる。 Examples of cells whose growth is inhibited by the cell growth inhibition method and the cell growth inhibitor according to the present invention include cells in which the expression of the present dephosphorylation enzyme is enhanced. Specific examples of such cells include benign tumor cells such as colon adenoma cells, and malignant tumor cells such as colon cancer cells and prostate cancer cells.
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現は、腫瘍組織において正常組織と比較して亢進が認められる。例えば、良性大腸腺腫組織、大腸癌組織、および前立腺癌組織等の腫瘍組織において、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現亢進が認められた（実施例１および図１参照）。また、大腸癌細胞（ＨＣＴ１１６およびＳＷ６２０）および前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰおよびＰＣ３）における本ＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現量が、それぞれ正常大腸細胞（ＣＣＤ８４１ＣｏＮ）および正常前立腺組織と比較して増加していた（実施例２および図２参照）。本ＤＮＡによりコードされる蛋白質が、細胞の増殖・癌化を調節するＣＳＥ１Ｌを脱リン酸化することから、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現が亢進している腫瘍細胞ではＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化が促進され、その結果、該腫瘍細胞の増殖が促進されていると考えることができる。 Expression of the protein encoded by the DNA represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is enhanced in tumor tissue as compared to normal tissue. For example, increased expression of the protein encoded by this DNA was observed in tumor tissues such as benign colorectal adenoma tissue, colorectal cancer tissue, and prostate cancer tissue (see Example 1 and FIG. 1). In addition, the expression level of the protein encoded by this DNA in colon cancer cells (HCT116 and SW620) and prostate cancer cells (LNCaP and PC3) is increased compared to normal colon cells (CCD841CoN) and normal prostate tissue, respectively. (See Example 2 and FIG. 2). Since the protein encoded by this DNA dephosphorylates CSE1L, which regulates cell growth and canceration, CSE1L is dephosphorylated in tumor cells in which the expression of the protein encoded by this DNA is enhanced. It can be considered that the growth of the tumor cells is promoted as a result.
本発明に係る細胞増殖阻害剤は、本発明に係る脱リン酸化酵素の発現および／または機能を阻害する活性を有する化合物を有効成分として含む。例えば、本脱リン酸化酵素の発現、本脱リン酸化酵素と基質の結合、および本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性のうちの少なくとも１を阻害する活性を有する化合物を有効成分として含む。より具体的には、本脱リン酸化酵素の発現、本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合、および本脱リン酸化酵素のＣＳＥ１Ｌに対する脱リン酸化活性のうちの少なくとも１を阻害する活性を有する化合物を有効成分として含む。 The cell growth inhibitor according to the present invention contains, as an active ingredient, a compound having an activity that inhibits the expression and / or function of the phosphatase according to the present invention. For example, a compound having an activity that inhibits at least one of the expression of the present phosphatase, the binding of the phosphatase and the substrate, and the dephosphorylation activity of the present phosphatase is included as an active ingredient. More specifically, a compound having an activity that inhibits at least one of the expression of the present phosphatase, the binding of the present phosphatase and CSE1L, and the dephosphorylation activity of the present phosphatase to CSE1L. Contains as an active ingredient.
本発明に係る脱リン酸化酵素の発現および／または機能を阻害する活性を有する化合物として、具体的には、本脱リン酸化酵素に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖ＲＮＡを例示できる。本脱リン酸化酵素に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖ＲＮＡは、本脱リン酸化酵素の発現を阻害することにより、本脱リン酸化酵素の発現量を減少させるまたは消失させることができるため、本脱リン酸化酵素と基質との結合を低減または消失させることができ、その結果、本脱リン酸化酵素の該基質への作用、例えば脱リン酸化活性を低減または消失させることができる。 Specific examples of the compound having the activity of inhibiting the expression and / or function of the phosphatase according to the present invention include short double-stranded RNA having an RNA interference effect on the phosphatase. The short double-stranded RNA having RNA interference with the present phosphatase can reduce or eliminate the expression level of the phosphatase by inhibiting the expression of the phosphatase. The binding between the present dephosphorylating enzyme and the substrate can be reduced or eliminated, and as a result, the action of the present dephosphorylating enzyme on the substrate, for example, the dephosphorylating activity can be reduced or eliminated.
本発明に係る脱リン酸化酵素に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖ＲＮＡとして、配列表の配列番号１７に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖ＲＮＡを好ましく例示できる。より好ましくは、配列表の配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖ＲＮＡを例示できる。配列表の配列番号１７に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとして、配列表の配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを例示できる。配列表の配列番号１７に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとして、配列表の配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、いわゆるオーバーハング配列、例えば２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなる配列を結合させたオリゴヌクレオチドを例示できる。この場合、配列表の配列番号１７に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと二重鎖を形成させるオリゴヌクレオチドとして、配列表の配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、いわゆるオーバーハング配列、例えば２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなる配列を結合させたオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。本発明に係る脱リン酸化酵素に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖ＲＮＡは上記例示したものに制限されず、本発明に係る脱リン酸化酵素の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るものであればいずれも用いることができる。 The short double-stranded RNA having an RNA interference effect on the phosphatase according to the present invention is represented by an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 of the sequence listing and a complementary base sequence of the base sequence A preferred example is a short double-stranded RNA comprising an oligonucleotide. More preferably, a short double-stranded RNA consisting of an oligonucleotide represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 of the sequence listing and an oligonucleotide represented by a complementary base sequence of the base sequence can be exemplified. Examples of the oligonucleotide represented by the complementary base sequence of the base sequence described in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing include the oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 18 of the sequence listing. As an oligonucleotide containing the base sequence described in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing, a so-called overhang sequence, for example, two deoxy groups, is present at the 3 ′ end of the oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing. An example is an oligonucleotide to which a sequence comprising thymidylate (TT) is bound. In this case, the 3 ′ end of the oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing is used as the oligonucleotide that forms a duplex with the oligonucleotide containing the base sequence described in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing. In addition, it is preferable to use an oligonucleotide to which a so-called overhang sequence, for example, a sequence composed of two deoxythymidylic acids (TT) is bound. The short double-stranded RNA having an RNA interference action on the phosphatase according to the present invention is not limited to those exemplified above, and the expression of the phosphatase according to the present invention is reduced or eliminated by the RNA interference technique. Any of those obtained can be used.
本発明に係る脱リン酸化酵素の発現および／または機能を阻害する活性を有する化合物として、具体的にはまた、本脱リン酸化酵素のドミナントネガティブ変異体を例示できる。より具体的には、本脱リン酸化酵素のドミナントネガティブ変異体として、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質（配列番号２）のアミノ酸配列において第４３７番目のアスパラギン酸がアラニンに置換された変異体を例示できる。本変異体は、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質の基質であるＣＳＥ１Ｌと結合するがＣＳＥ１Ｌに対するリン酸化活性は野生型と比較して低いため（実施例４および５参照）、野生型の本脱リン酸化酵素と拮抗してＣＳＥ１Ｌと結合することにより、野生型の本脱リン酸化酵素のＣＳＥ１Ｌへの結合を阻害し、その結果、ＣＳＥ１Ｌに対する本脱リン酸化酵素の作用を阻害する。このように、本変異体は、本脱リン酸化酵素によるＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を阻害することにより、ＣＳＥ１Ｌの作用を阻害し、その結果、例えば細胞増殖を阻害し得る。 Specific examples of the compound having an activity of inhibiting the expression and / or function of the phosphatase according to the present invention include a dominant negative mutant of the phosphatase. More specifically, as a dominant negative mutant of the present phosphatase, for example, in the amino acid sequence of the protein (SEQ ID NO: 2) encoded by the DNA represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, A mutant in which the 437th aspartic acid is substituted with alanine can be exemplified. This mutant binds to CSE1L, which is a substrate for the protein encoded by this DNA, but its phosphorylation activity against CSE1L is lower than that of the wild type (see Examples 4 and 5). By binding to CSE1L by antagonizing oxidase, the binding of wild-type main phosphatase to CSE1L is inhibited, and as a result, the action of the present phosphatase on CSE1L is inhibited. Thus, this mutant can inhibit the action of CSE1L by inhibiting the dephosphorylation of CSE1L by the present dephosphorylating enzyme, and as a result, for example, can inhibit cell proliferation.
本発明に係る細胞増殖阻害剤および細胞増殖方法を用いることにより、異常な細胞増殖を伴う疾患において、細胞増殖を阻害することができ、その結果、該疾患の防止および／または治療を実施できる。また、本発明において、本細胞増殖阻害剤を含む異常な細胞増殖を伴う疾患の防止および／または治療剤を提供できる。 By using the cell proliferation inhibitor and the cell proliferation method according to the present invention, cell proliferation can be inhibited in a disease accompanied by abnormal cell proliferation, and as a result, the disease can be prevented and / or treated. Moreover, in this invention, the prevention and / or treatment agent of the disease accompanying abnormal cell growth containing this cell growth inhibitor can be provided.
異常な細胞増殖を伴う疾患として、例えば良性腫瘍や悪性腫瘍等の腫瘍疾患を例示できる。より好ましくは、本脱リン酸化酵素の発現の亢進が認められる良性腫瘍および悪性腫瘍等の腫瘍疾患を例示できる。良性腫瘍とは、腫瘍細胞およびその配列がその由来する正常細胞に近い形態をとり、浸潤性や転移性のない腫瘍をいう。悪性腫瘍とは、腫瘍細胞の形態やその配列がその由来する正常細胞と異なっており、浸潤性や転移性を示す腫瘍をいう。良性腫瘍として、例えば大腸腺腫を挙げることができる。また、悪性腫瘍として、例えば大腸癌や前立腺癌を挙げることができる。 Examples of diseases associated with abnormal cell growth include tumor diseases such as benign tumors and malignant tumors. More preferable examples include tumor diseases such as benign tumors and malignant tumors in which increased expression of the present dephosphorylating enzyme is observed. A benign tumor is a tumor that has a form in which tumor cells and their sequences are close to normal cells from which they originate, and has no invasion or metastasis. A malignant tumor is a tumor that is different from normal cells from which the morphology and arrangement of tumor cells are derived, and exhibits invasiveness and metastasis. An example of a benign tumor is colon adenoma. Examples of malignant tumors include colon cancer and prostate cancer.
（ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化方法）
本発明の一態様は、本発明に係る脱リン酸化酵素を用いることを特徴とするＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化方法に関する。ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化方法は、インビボおよびインビトロのいずれの条件でも実施できる。「インビボ」は、動植物の生体内を意味し、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む。「非ヒト哺乳動物」とは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ等の哺乳動物を意味する。好ましくはマウスが使用される。「インビトロ」は、試験管内を意味し、生体外試料を含む。「生体外試料」とは、動物、例えば哺乳動物から調製された細胞や組織、動物由来の培養細胞、並びに前記細胞、組織および培養細胞から調製された蛋白質や遺伝子を含む溶液等の試料を意味する。
(Method for dephosphorylating CSE1L)
One embodiment of the present invention relates to a method for dephosphorylating CSE1L, wherein the dephosphorylating enzyme according to the present invention is used. The method for dephosphorylating CSE1L can be carried out under both in vivo and in vitro conditions. “In vivo” means in vivo in animals and plants, including human and non-human mammals. “Non-human mammal” means mammals other than human, for example, mammals such as mice, rats, rabbits, dogs and goats. Preferably a mouse is used. “In vitro” means in vitro and includes in vitro samples. “In vitro sample” means a sample such as a cell or tissue prepared from an animal such as a mammal, a cultured cell derived from an animal, and a solution containing a protein or gene prepared from the cell, tissue or cultured cell. To do.
本発明に係るＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化方法は、本発明に係る脱リン酸化酵素によるＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を阻害する活性を有する化合物の同定方法に用いることができる。 The method for dephosphorylating CSE1L according to the present invention can be used for a method for identifying a compound having an activity of inhibiting the dephosphorylation of CSE1L by the dephosphorylating enzyme according to the present invention.
本発明に係るＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化方法は、例えば、次に示すいずれかの方法で実施できる：（１）ＣＳＥ１Ｌの発現が認められた細胞を用いて、該細胞に本脱リン酸化酵素を発現させる；および（２）細胞に、ＣＳＥ１Ｌのおよび本脱リン酸化酵素を発現させる。ＣＳＥ１Ｌの発現および本脱リン酸化酵素の発現は、それぞれＣＳＥ１Ｌをコードする遺伝子を含む適当なベクターおよび本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子を含む適当なベクターを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。細胞は、真核細胞が好ましく用られる。真核細胞は、真核生物から調製した細胞、初代培養細胞、および培養細胞株のいずれでもあり得る。好ましくは哺乳動物由来の培養細胞株、より好ましくはヒト由来の培養細胞株を用いる。ヒト由来の培養細胞株として、２９３細胞を好ましく例示できる。 The method for dephosphorylating CSE1L according to the present invention can be carried out, for example, by any of the following methods: (1) Expressing the present dephosphorylation enzyme in cells using CSE1L-expressed cells. And (2) let cells express CSE1L and the present phosphatase. The expression of CSE1L and the present phosphatase can be carried out by conventional genetic engineering techniques using an appropriate vector containing a gene encoding CSE1L and an appropriate vector containing a gene encoding this phosphatase, respectively. Can be achieved by transfecting the cells. As the cell, a eukaryotic cell is preferably used. Eukaryotic cells can be any of cells prepared from eukaryotes, primary cultured cells, and cultured cell lines. Preferably, a mammalian cell line, more preferably a human cell line is used. A preferred example of a human-derived cell line is 293 cells.
ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化の検出は、例えば、リン酸化されているＣＳＥ１Ｌを認識するが、リン酸化されていないＣＳＥ１Ｌは認識しない抗体を用いて、ウェスタンブロッティング等の公知の蛋白質検出方法により実施できる。 Detection of dephosphorylation of CSE1L can be carried out, for example, by a known protein detection method such as Western blotting using an antibody that recognizes phosphorylated CSE1L but not phosphorylated CSE1L.
ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化の検出はまた、例えば、脱リン酸化されている蛋白質と脱リン酸化されていない蛋白質とでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での移動度が異なることを利用して実施できる。具体的には、脱リン酸化反応後に、反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、次いでウェスタンブロッティング等の公知の蛋白質検出方法によりＣＳＥ１Ｌを検出し、その移動度を、脱リン酸化反応を行っていないＣＳＥ１Ｌと比較することにより、脱リン酸化されたＣＳＥ１Ｌの検出を実施できる（実施例４および５参照） The detection of dephosphorylation of CSE1L can also be carried out, for example, by utilizing the difference in mobility on an SDS-PAGE gel between a protein that is dephosphorylated and a protein that is not dephosphorylated. Specifically, after the dephosphorylation reaction, the reaction solution is subjected to SDS-PAGE, then CSE1L is detected by a known protein detection method such as Western blotting, and the mobility is not dephosphorylated. Detection of dephosphorylated CSE1L can be performed by comparison with CSE1L (see Examples 4 and 5)
（ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害方法および脱リン酸化阻害剤）
本発明の一態様は、本発明に係る脱リン酸化酵素の発現および／または機能を阻害することを特徴とするＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害方法に関する。ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害方法は、インビボおよびインビトロのいずれの条件でも実施できる。
(Method of inhibiting dephosphorylation of CSE1L and dephosphorylation inhibitor)
One aspect of the present invention relates to a method for inhibiting dephosphorylation of CSE1L, which comprises inhibiting the expression and / or function of the dephosphorylation enzyme according to the present invention. The method for inhibiting dephosphorylation of CSE1L can be carried out under both in vivo and in vitro conditions.
本発明に係る脱リン酸化酵素の発現の阻害は、上記のように、本脱リン酸化酵素の発現を阻害する活性を有する化合物、例えば本脱リン酸化酵素の発現を阻害する機能を有するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることにより実施できる。 As described above, the inhibition of phosphatase expression according to the present invention is a compound having an activity of inhibiting the expression of the present phosphatase, for example, an siRNA having a function of inhibiting the expression of the phosphatase, It can be carried out by using shRNA and antisense oligonucleotides.
本発明に係る脱リン酸化酵素の機能の阻害は、上記のように、本脱リン酸化酵素の機能を阻害する活性を有する化合物、例えば本脱リン酸化酵素のドミナントネガティブ変異体を用いることにより実施できる。本脱リン酸化酵素のドミナントネガティブ変異体は、好ましくは、ＣＳＥ１Ｌと結合するが、ＣＳＥ１Ｌに対する脱リン酸化活性を示さない不活性変異体である。このような不活性変異体として、具体的には、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質（配列番号２）のアミノ酸配列において第４３７番目のアスパラギン酸がアラニンに置換された変異体を例示できる。 As described above, the inhibition of the function of the phosphatase according to the present invention is carried out by using a compound having an activity of inhibiting the function of the phosphatase, for example, a dominant negative mutant of the phosphatase. it can. The dominant negative mutant of the present phosphatase is preferably an inactive mutant that binds to CSE1L but does not exhibit dephosphorylation activity against CSE1L. As such an inactive mutant, specifically, for example, the 437th asparagine in the amino acid sequence of the protein (SEQ ID NO: 2) encoded by the DNA represented by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing A mutant in which the acid is substituted with alanine can be exemplified.
本発明の一態様は、本発明に係る脱リン酸化酵素の発現および／または機能を阻害することを特徴とするＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害剤に関する。本ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害剤は、本脱リン酸化酵素の発現および／または機能を阻害する活性を有する化合物を有効成分としてその有効量含んでなる。例えば、本ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害剤は、本脱リン酸化酵素の発現を阻害する機能を有するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および本脱リン酸化酵素のドミナントネガティブ変異体より選ばれるいずれか１を有効成分として含んでなる。 One aspect of the present invention relates to a dephosphorylation inhibitor of CSE1L, which inhibits the expression and / or function of the dephosphorylation enzyme according to the present invention. The present CSE1L dephosphorylation inhibitor comprises an effective amount of a compound having an activity of inhibiting the expression and / or function of the present dephosphorylation enzyme as an active ingredient. For example, the dephosphorylation inhibitor of CSE1L is any one selected from siRNA, shRNA, antisense oligonucleotide, and dominant negative mutant of the dephosphorylation enzyme having a function of inhibiting the expression of the dephosphorylation enzyme. 1 as an active ingredient.
一般的に蛋白質のリン酸化および脱リン酸化は、該蛋白質の機能の調節に関与している。したがって、本発明に係るＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害剤により、ＣＳＥ１Ｌの機能を阻害することができる。ＣＳＥ１Ｌの機能として、上述のように、細胞の増殖・癌化への関与が知られている。また、ＣＳＥ１Ｌを脱リン酸化する本発明に係る脱リン酸化酵素の発現を阻害することにより、細胞増殖が阻害された（実施例７）。したがって、本ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害剤により、細胞増殖を阻害できる。すなわち、本ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害剤は、本発明に係る細胞増殖阻害方法に用いることができ、また、本発明に係る細胞増殖阻害剤として用いることができる。 In general, phosphorylation and dephosphorylation of a protein are involved in regulation of the function of the protein. Therefore, the function of CSE1L can be inhibited by the CSE1L dephosphorylation inhibitor according to the present invention. As described above, the function of CSE1L is known to be involved in cell proliferation / carcinogenesis. Moreover, cell growth was inhibited by inhibiting the expression of the phosphatase according to the present invention that dephosphorylates CSE1L (Example 7). Therefore, cell growth can be inhibited by the dephosphorylation inhibitor of CSE1L. That is, the CSE1L dephosphorylation inhibitor can be used in the cell growth inhibition method according to the present invention, and can also be used as the cell growth inhibitor according to the present invention.
（医薬組成物）
本発明に係る細胞増殖阻害剤およびＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化阻害剤は、医薬組成物として調製することができる。この場合、通常、有効成分に加えて１種または２種以上の医薬用担体を含む医薬組成物として製造することが好ましい。
(Pharmaceutical composition)
The cell growth inhibitor and CSE1L dephosphorylation inhibitor according to the present invention can be prepared as a pharmaceutical composition. In this case, it is usually preferable to produce a pharmaceutical composition containing one or more pharmaceutical carriers in addition to the active ingredient.
本発明に係る医薬製剤は、異常な細胞増殖を伴う疾患に適用できる。異常な細胞増殖を伴う疾患として、例えば良性腫瘍や悪性腫瘍等の腫瘍疾患を例示できる。良性腫瘍として、例えば大腸腺腫を挙げることができる。悪性腫瘍として、例えば大腸癌や前立腺癌を挙げることができる。 The pharmaceutical preparation according to the present invention can be applied to diseases associated with abnormal cell proliferation. Examples of diseases associated with abnormal cell growth include tumor diseases such as benign tumors and malignant tumors. An example of a benign tumor is colon adenoma. Examples of malignant tumors include colon cancer and prostate cancer.
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。 The amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical preparation according to the present invention is appropriately selected from a wide range. Usually, it is appropriate that the amount is in the range of about 0.00001 to 70% by weight, preferably about 0.0001 to 5% by weight.
医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて一般的に使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。 Examples of the pharmaceutical carrier include fillers, fillers, binders, moistening agents, disintegrating agents, lubricants, diluents and excipients that are generally used depending on the form of use of the preparation. These are appropriately selected and used depending on the administration form of the resulting preparation.
より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースを例示できる。これらは、本医薬組成物の剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合わせて使用される。 More specifically, water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, xanthan gum, gum arabic, casein, Examples include gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, and lactose. These may be used singly or in combination of two or more according to the dosage form of the pharmaceutical composition.
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびｐＨ調整剤等を適宜使用することもできる。 If desired, various components that can be used in normal protein preparations, such as stabilizers, bactericides, buffers, isotonic agents, chelating agents, surfactants, pH adjusters, and the like can be used as appropriate. .
安定化剤は、ヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合わせて使用できる。特にこの組合わせによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。 Examples of the stabilizer include human serum albumin, ordinary L-amino acids, sugars, and cellulose derivatives. These can be used alone or in combination with a surfactant or the like. In particular, according to this combination, the stability of the active ingredient may be further improved. The L-amino acid is not particularly limited, and may be any of glycine, cysteine, glutamic acid and the like. The saccharides are not particularly limited, for example, monosaccharides such as glucose, mannose, galactose, and fructose, sugar alcohols such as mannitol, inositol, and xylitol, disaccharides such as sucrose, maltose, and lactose, dextran, hydroxypropyl starch, chondroitin sulfate, Any of polysaccharides such as hyaluronic acid, and derivatives thereof may be used. The cellulose derivative is not particularly limited, and may be any of methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, carboxymethyl cellulose sodium and the like.
界面活性剤も特に限定はなく、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。 There is no particular limitation on the surfactant, and either an ionic surfactant or a nonionic surfactant can be used. Examples of the surfactant include polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester, polyoxyethylene alkyl ether, sorbitan monoacyl ester, and fatty acid glyceride.
緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）を例示できる。 Buffering agents include boric acid, phosphoric acid, acetic acid, citric acid, ε-aminocaproic acid, glutamic acid and / or salts thereof (for example, alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, etc. An alkaline earth metal salt).
等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンを例示できる。 Examples of the isotonic agent include sodium chloride, potassium chloride, saccharides and glycerin.
キレート剤は、エデト酸ナトリウム、クエン酸を例示できる。 Examples of the chelating agent include sodium edetate and citric acid.
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。 The medicament and pharmaceutical composition according to the present invention can be used as a solution preparation, and after lyophilized and stored, the medicine and pharmaceutical composition are dissolved in a buffer solution containing water, physiological saline, etc. at the time of use. It can also be used after adjusting to an appropriate concentration.
医薬および医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１回〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。 The dose range of the medicine and the pharmaceutical composition is not particularly limited, and the effectiveness of the contained components, the administration form, the administration route, the type of the disease, the nature of the subject (weight, age, medical condition, presence or absence of use of other medicines, etc.) ) And the judgment of the doctor in charge, etc. In general, an appropriate dose is, for example, about 0.01 μg to 100 mg, preferably about 0.1 μg to 1 mg, per 1 kg body weight of the subject. However, these dose modifications can be made using general routine experimentation for optimization well known in the art. The above dosage can be administered once to several times a day, and may be administered intermittently at a rate of once every several days or weeks.
本発明に係る医薬組成物を投与するときは、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは目的の疾患の防止および／または治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。例えば、他の抗腫瘍用医薬の有効成分等を配合してもよい。 When administering the pharmaceutical composition according to the present invention, the pharmaceutical composition may be used alone or in combination with other compounds or medicines necessary for the prevention and / or treatment of the target disease. . For example, you may mix | blend the active ingredient etc. of the medicine for other anti-tumors.
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることができる。あるいは経口経路で投与することもできる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。腫瘍疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することも可能である。 As the administration route, either systemic administration or local administration can be selected. In this case, an appropriate administration route is selected according to the disease, symptoms and the like. For example, examples of parenteral routes include normal intravenous administration, intraarterial administration, subcutaneous, intradermal, intramuscular administration, and the like. Alternatively, it can be administered by the oral route. Furthermore, transmucosal administration or transdermal administration is also possible. When used for tumor diseases, it can be administered directly to the tumor by injection or the like.
投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものには、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらはさらに投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。 Various forms can be selected according to the purpose. Typical examples include solid dosage forms such as tablets, pills, powders, powders, fine granules, granules, capsules, aqueous preparations, ethanol solution preparations, suspensions, fat emulsions, liposome preparations. And inclusion forms such as cyclodextrin, and liquid dosage forms such as syrup and elixir. Depending on the route of administration, these may be oral, parenteral (instillation, injection), nasal, inhalation, vaginal, suppository, sublingual, eye drops, ear drops, ointments, creams And can be prepared, molded and prepared according to ordinary methods.
（化合物の同定方法）
本発明の一態様は、細胞増殖を阻害する活性を有する化合物の同定方法、並びに本発明に係る脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を阻害する活性を有する化合物の同定方法および本脱リン酸化酵素によるＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を阻害する活性を有する化合物の同定方法に関する。
(Compound identification method)
One embodiment of the present invention is a method for identifying a compound having an activity of inhibiting cell proliferation, a method for identifying a compound having an activity of inhibiting the binding of phosphatase according to the present invention and CSE1L, and the present phosphatase. The present invention relates to a method for identifying a compound having an activity of inhibiting the dephosphorylation of CSE1L.
本発明においては、細胞増殖の阻害を、本発明に係る脱リン酸化酵素の発現を阻害することにより達成できることを見出した（実施例７参照）。また、細胞の増殖・癌化に関与することが知られているＣＳＥ１Ｌに、本脱リン酸化酵素が結合してこれを脱リン酸化することを見出した（実施例４および５参照）。これら知見から、本脱リン酸化酵素の発現および／または機能を阻害することにより、ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を阻害して、細胞増殖を阻害することができると本発明者は考えている。すなわち、本脱リン酸化酵素の発現および／または機能を阻害する活性を有する化合物は、ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を阻害でき、細胞増殖を阻害できる。 In the present invention, it has been found that inhibition of cell proliferation can be achieved by inhibiting the expression of the phosphatase according to the present invention (see Example 7). It was also found that the present dephosphorylation enzyme binds to CSE1L, which is known to be involved in cell proliferation / carcinogenesis, and dephosphorylates this (see Examples 4 and 5). From these findings, the present inventor believes that by inhibiting the expression and / or function of the present phosphatase, the dephosphorylation of CSE1L can be inhibited to inhibit cell proliferation. That is, a compound having an activity that inhibits the expression and / or function of the present phosphatase can inhibit the dephosphorylation of CSE1L and inhibit cell proliferation.
したがって、細胞増殖を阻害する活性を有する化合物の同定方法は、本発明に係る脱リン酸化酵素の発現および／または機能を阻害する活性を指標にして実施できる。 Therefore, the method for identifying a compound having an activity of inhibiting cell growth can be carried out using the activity of inhibiting the expression and / or function of the phosphatase according to the present invention as an index.
本発明に係る脱リン酸化酵素の機能として、上述のように、脱リン酸化活性、および基質、例えば基質蛋白質との結合を例示できる。すなわち、本発明に係る細胞増殖を阻害する活性を有する化合物の同定方法は、本脱リン酸化酵素の発現、本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性、および本脱リン酸化酵素と基質との結合の少なくともいずれか１を阻害する活性を指標にして実施できる。 As described above, examples of the function of the dephosphorylating enzyme according to the present invention include dephosphorylation activity and binding to a substrate, for example, a substrate protein. That is, the method for identifying a compound having an activity of inhibiting cell growth according to the present invention comprises the expression of the present dephosphorylating enzyme, the dephosphorylating activity of the present dephosphorylating enzyme, and the binding between the present dephosphorylating enzyme and a substrate. The activity of inhibiting at least any one of the above can be used as an index.
本発明に係る脱リン酸化酵素の基質として、具体的には、ＣＳＥ１Ｌを例示できる。本脱リン酸化酵素のＣＳＥ１Ｌとの結合、および本脱リン酸化酵素によるＣＳＥ１Ｌに対する脱リン酸化活性によりＣＳＥ１Ｌが脱リン酸化される。ただし、本脱リン酸化酵素の機能である脱リン酸化活性が、ＣＳＥ１Ｌに対するリン酸化活性に留まらないことはいうまでもない。 Specific examples of the substrate for the phosphatase according to the present invention include CSE1L. CSE1L is dephosphorylated by the binding of the present dephosphorylating enzyme to CSE1L and the dephosphorylating activity on CSE1L by the present dephosphorylating enzyme. However, it goes without saying that the dephosphorylation activity which is a function of the present dephosphorylation enzyme is not limited to the phosphorylation activity for CSE1L.
例えば、本発明に係る同定方法を実施する場合、脱リン酸化酵素、好ましくはセリンスレオニン脱リン酸化酵素の一般的な基質として当業者に知られている適当な基質を用いたり、市販のキットを使用したりして実施することができる。一般的な基質として、人工基質ｐＮＰＰ、蛋白質基質カゼイン、ペプチド基質リン酸化ペプチド（ＲＲＡ−ｐＴ−ＶＡ（配列表の配列番号２１）およびＲＲＰ−ｐＴ−ＶＡ（配列表の配列番号２２））を例示できる。 For example, when carrying out the identification method according to the present invention, an appropriate substrate known to those skilled in the art as a general substrate of phosphatase, preferably serine threonine phosphatase, or a commercially available kit can be used. Or can be implemented. Examples of general substrates include artificial substrate pNPP, protein substrate casein, peptide substrate phosphorylated peptides (RRA-pT-VA (SEQ ID NO: 21 in the sequence listing) and RRP-pT-VA (SEQ ID NO: 22 in the sequence listing)). it can.
このように本発明において、細胞増殖を阻害する活性を有する化合物の同定方法、並びに本発明に係る脱リン酸化酵素の発現および／または機能を阻害する活性を有する化合物の同定方法を提供できる。より具体的には、細胞増殖を阻害する活性を有する化合物の同定方法、本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を阻害する活性を有する化合物の同定方法、および本脱リン酸化酵素によるＣＳＥ１Ｌのリン酸化を阻害する活性を有する化合物の同定方法を提供できる。 Thus, the present invention can provide a method for identifying a compound having an activity that inhibits cell proliferation, and a method for identifying a compound having an activity that inhibits the expression and / or function of the phosphatase according to the present invention. More specifically, a method for identifying a compound having an activity that inhibits cell growth, a method for identifying a compound having an activity that inhibits the binding of the present dephosphorylating enzyme and CSE1L, and phosphorylation of CSE1L by the present dephosphorylating enzyme Can be provided.
細胞増殖を阻害する活性を有する化合物の同定方法は、例えば、本発明に係る脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性を測定する実験系を用いて実施できる。このような実験系において、ある化合物（以下、被検化合物と称する）と本脱リン酸化酵素を接触させ、本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物が本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性を阻害するか否かを決定することにより、細胞増殖を阻害する活性を有する化合物を同定できる。 The identification method of the compound which has the activity which inhibits cell growth can be implemented using the experimental system which measures the dephosphorylation activity of the dephosphorylation enzyme based on this invention, for example. In such an experimental system, a certain compound (hereinafter referred to as a test compound) is brought into contact with the present dephosphorylating enzyme, and a signal and / or marker capable of detecting the dephosphorylating activity of the present dephosphorylating enzyme is used. The system is used to detect the presence or absence or change of this signal and / or marker and to determine whether the test compound inhibits the dephosphorylation activity of the present dephosphorylation enzyme Can be identified.
このような実験系は、脱リン酸化酵素阻害剤のスクリーニングにおいて一般的に用いられている同定方法を参考にして実施できる。例えば、本発明に係る脱リン酸化酵素と基質とを試験管内で反応させて脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性を測定するといった実験系を用いることができる。その他、例えば、本脱リン酸化酵素の基質の発現が確認されている細胞を用い、本脱リン酸化酵素を発現させて、本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性を測定するといった実験系を用いることができる。また、本脱リン酸化酵素と基質とを共に発現させた細胞を用いて、本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性を測定するといった実験系を用いることができる。細胞は、真核細胞が好ましく用いられる。真核細胞は、真核生物から調製した細胞、初代培養細胞、および培養細胞株のいずれでもあり得る。好ましくは哺乳動物由来の培養細胞株、より好ましくはヒト由来の培養細胞株を用いる。ヒト由来の培養細胞株として、２９３細胞を好ましく例示できる。細胞における本脱リン酸化酵素および／またはＣＳＥ１Ｌの発現は、本脱リン酸化酵素をコードするＤＮＡを含む適当なベクターおよび／またはＣＳＥ１ＬをコードするＤＮＡを含む適当なベクターを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらベクターを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。 Such an experimental system can be carried out with reference to identification methods generally used in screening for phosphatase inhibitors. For example, an experimental system in which the dephosphorylation enzyme according to the present invention and a substrate are reacted in a test tube to measure the dephosphorylation activity of the dephosphorylation enzyme can be used. In addition, for example, using a cell in which the expression of the substrate of this phosphatase is confirmed, the present phosphatase is expressed, and the dephosphorase activity of this phosphatase is measured. be able to. In addition, an experimental system in which the dephosphorylating enzyme's dephosphorylating activity is measured using cells expressing both the dephosphorylating enzyme and the substrate can be used. As the cell, a eukaryotic cell is preferably used. Eukaryotic cells can be any of cells prepared from eukaryotes, primary cultured cells, and cultured cell lines. Preferably, a mammalian cell line, more preferably a human cell line is used. A preferred example of a human-derived cell line is 293 cells. Expression of the present phosphatase and / or CSE1L in cells is carried out by conventional genetic engineering using an appropriate vector containing DNA encoding the present phosphatase and / or an appropriate vector containing DNA encoding CSE1L. This can be accomplished by transfection of these vectors into cells.
本発明に係る脱リン酸化酵素は、ＰＰ２Ｃファミリーに属する脱リン酸化酵素である。ＰＰ２Ｃファミリーに属する脱リン酸化酵素は、金属イオン依存的に脱リン酸化活性を示すことが知られている。したがって、本発明に係る同定方法に用いる実験系は、金属イオン存在下で実施することが好ましい。金属イオンとして、マンガンイオン（Ｍｎ２＋）およびマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を好ましく挙げることができる。 The phosphatase according to the present invention is a phosphatase belonging to the PP2C family. It is known that phosphatases belonging to the PP2C family exhibit dephosphorylation activity in a metal ion-dependent manner. Therefore, the experimental system used for the identification method according to the present invention is preferably carried out in the presence of metal ions. As metal ions, manganese ions (Mn 2+ ) and magnesium ions (Mg 2+ ) can be preferably mentioned.
被検化合物は本発明に係る脱リン酸化酵素による基質の脱リン酸化反応に共存させることもできるし、被検化合物を予め本脱リン酸化酵素と接触させ、その後に本脱リン酸化酵素による基質の脱リン酸化反応を行うこともできる。本脱リン酸化酵素による基質の脱リン酸化により生じるシグナルまたはマーカーが、被検化合物を本脱リン酸化酵素と接触させたときに、被検化合物を接触させなかったときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物は本脱リン酸化酵素による基質の脱リン酸化を阻害し、その結果、細胞増殖を阻害すると判定できる。 The test compound can coexist in the dephosphorylation reaction of the substrate by the dephosphorylation enzyme according to the present invention, or the test compound is previously brought into contact with the dephosphorylation enzyme and then the substrate by the dephosphorylation enzyme. The dephosphorylation reaction of can also be performed. The signal or marker generated by dephosphorylation of the substrate by the dephosphorylating enzyme is reduced or eliminated when the test compound is brought into contact with the dephosphorylating enzyme compared to when the test compound is not brought into contact. In the case of showing such a change, it can be determined that the test compound inhibits the dephosphorylation of the substrate by the present dephosphorylating enzyme, and as a result, inhibits cell proliferation.
本発明に係る脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系は、本脱リン酸化酵素による基質の脱リン酸化を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系であり得る。基質として、ＣＳＥ１Ｌ、人工基質ｐＮＰＰ、蛋白質基質カゼイン、ペプチド基質リン酸化ペプチド（ＲＲＡ−ｐＴ−ＶＡ（配列表の配列番号２１）およびＲＲＰ−ｐＴ−ＶＡ（配列表の配列番号２２））より選ばれるいずれか１を用いることができる。本脱リン酸化酵素の生体内基質がＣＳＥ１Ｌであると考えられることから、好ましい基質としてＣＳＥ１Ｌを挙げることができる。一方、本脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性を簡便に検出するという観点から、好ましい基質として人工基質ｐＮＰＰを挙げることができる。 The system using a signal and / or marker capable of detecting the dephosphorylating activity of the dephosphorylating enzyme according to the present invention uses the signal and / or marker capable of detecting the dephosphorylation of the substrate by the present dephosphorylating enzyme. It can be a system that does. The substrate is selected from CSE1L, artificial substrate pNPP, protein substrate casein, peptide substrate phosphorylated peptide (RRA-pT-VA (SEQ ID NO: 21 in the sequence listing) and RRP-pT-VA (SEQ ID NO: 22 in the sequence listing)). Any one can be used. Since the in vivo substrate of the present dephosphorylating enzyme is considered to be CSE1L, CSE1L can be mentioned as a preferred substrate. On the other hand, from the viewpoint of simply detecting the dephosphorylation activity of the present dephosphorylating enzyme, an artificial substrate pNPP can be mentioned as a preferred substrate.
脱リン酸化活性の測定は、上述のように、基質の脱リン酸化を測定することにより実施できる。基質の脱リン酸化の測定は、上述のように、基質から遊離されたリン酸、脱リン酸化された基質、および脱リン酸化されない基質より選ばれる少なくともいずれか１を検出すること、またはその量を測定することにより実施できる。 The dephosphorylation activity can be measured by measuring the dephosphorylation of the substrate as described above. As described above, the measurement of the dephosphorylation of the substrate is performed by detecting at least one selected from the phosphoric acid released from the substrate, the dephosphorylated substrate, and the non-dephosphorylated substrate, or the amount thereof. It can be implemented by measuring.
上記同定方法により同定される化合物は、本発明に係る脱リン酸化酵素の脱リン酸化活性を阻害する活性を有する化合物である。このような化合物には、本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を阻害する活性を有する化合物や、本脱リン酸化酵素によるＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を阻害する活性を有する化合物が含まれる。 The compound identified by the identification method is a compound having an activity of inhibiting the dephosphorylation activity of the dephosphorylation enzyme according to the present invention. Such a compound includes a compound having an activity of inhibiting the binding between the present dephosphorylating enzyme and CSE1L and a compound having an activity of inhibiting the dephosphorylation of CSE1L by the present dephosphorylating enzyme.
細胞増殖を阻害する活性を有する化合物の同定方法はまた、例えば、本発明に係る脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を測定する実験系を用いて実施できる。このような実験系において、被検化合物と本脱リン酸化酵素を接触させ、本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物がＣＳＥ１Ｌの結合を阻害するか否かを決定することにより、細胞増殖を阻害する活性を有する化合物を同定できる。 A method for identifying a compound having an activity of inhibiting cell proliferation can also be carried out using, for example, an experimental system for measuring the binding of the phosphatase and CSE1L according to the present invention. In such an experimental system, the test compound and the present phosphatase are brought into contact, and a signal and / or marker that can detect the binding of the present phosphatase and CSE1L is used, and this signal and / or Alternatively, a compound having an activity of inhibiting cell proliferation can be identified by detecting the presence or absence or change of the marker and determining whether the test compound inhibits the binding of CSE1L.
被検化合物は本発明に係る脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合反応に共存させることもできるし、被検化合物を予め本脱リン酸化酵素と接触させ、その後に本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合反応を行うこともできる。本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合により生じるシグナルまたはマーカーが、被検化合物を本脱リン酸化酵素と接触させたときに、被検化合物を接触させなかったときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物は本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を阻害し、その結果、細胞増殖を阻害すると判定できる。 The test compound can coexist in the binding reaction of the phosphatase according to the present invention and CSE1L, or the test compound is brought into contact with the phosphatase in advance and then the binding of the phosphatase and CSE1L. A reaction can also be performed. The signal or marker generated by the binding of the present phosphatase and CSE1L decreases or disappears when the test compound is brought into contact with the present phosphatase compared to when the test compound is not brought into contact, etc. When this change is shown, it can be determined that the test compound inhibits the binding between the present dephosphorylating enzyme and CSE1L, and as a result, inhibits cell proliferation.
このような実験系は、蛋白質の結合阻害剤のスクリーニングにおいて一般的に用いられている同定方法を参考にして実施できる。例えば、本発明に係る脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌとを試験管内で反応させて、ウェスタンブロッティングやプルダウン法により両蛋白質の結合を検出する実験系を例示できる。その他、例えば、ＣＳＥ１Ｌの発現が確認されている細胞を用い、本脱リン酸化酵素を発現させて、本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を検出する実験系を例示できる。また、本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌとを共に発現させた細胞を用い本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を検出する実験系を例示できる。細胞は、真核細胞が好ましく用いられる。真核細胞は、真核生物から調製した細胞、初代培養細胞、および培養細胞株のいずれでもあり得る。好ましくは哺乳動物由来の培養細胞株、より好ましくはヒト由来の培養細胞株を用いる。ヒト由来の培養細胞株として、２９３細胞を好ましく例示できる。細胞における本脱リン酸化酵素および／またはＣＳＥ１Ｌの発現は、本脱リン酸化酵素をコードするＤＮＡを含む適当なベクターおよび／またはＣＳＥ１ＬをコードするＤＮＡを含む適当なベクターを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらベクターを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。 Such an experimental system can be carried out with reference to identification methods generally used in screening for protein binding inhibitors. For example, an experimental system in which the phosphatase according to the present invention and CSE1L are reacted in a test tube and the binding of both proteins is detected by Western blotting or pull-down method can be exemplified. In addition, for example, an experimental system in which the present phosphatase is expressed using cells in which the expression of CSE1L is confirmed, and the binding between the present phosphatase and CSE1L can be exemplified. Moreover, the experiment system which detects the coupling | bonding of this phosphatase and CSE1L using the cell which expressed this phosphatase and CSE1L together can be illustrated. As the cell, a eukaryotic cell is preferably used. Eukaryotic cells can be any of cells prepared from eukaryotes, primary cultured cells, and cultured cell lines. Preferably, a mammalian cell line, more preferably a human cell line is used. A preferred example of a human-derived cell line is 293 cells. Expression of the present phosphatase and / or CSE1L in cells is carried out by conventional genetic engineering using an appropriate vector containing DNA encoding the present phosphatase and / or an appropriate vector containing DNA encoding CSE1L. This can be accomplished by transfection of these vectors into cells.
本発明に係る脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合の検出は、自体公知の蛋白質の検出方法、例えば免疫沈降法、プルダウン法、ツーハイブリッド法、ウェスタンブロッティングおよび蛍光共鳴エネルギー転移法等の方法またはこれらの方法を組合わせて、本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌにより形成される複合体を検出することにより実施できる。本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌにより形成される複合体の検出を容易にするために、本脱リン酸化酵素および／またはＣＳＥ１Ｌは、適当な標識物質により標識されたものを用いることが好ましい。標識物質として、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇおよびＨＡ−ｔａｇ等のタグペプチド類が好ましく例示できる。標識物質の検出は、自体公知の検出方法を用いて実施できる。例えば、タグペプチド類は、抗タグペプチド抗体により検出できる。このとき、抗タグペプチド抗体として、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略称する）やアルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰと略称する）等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等で標識した抗体を用いることにより検出がより容易に実施できる。あるいは、ＨＲＰやＡＬＰ等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等で標識した二次抗体を用いてもよい。 The detection of the binding of phosphatase and CSE1L according to the present invention can be performed by a known protein detection method such as immunoprecipitation method, pull-down method, two-hybrid method, Western blotting and fluorescence resonance energy transfer method or the like. The methods can be combined to detect a complex formed by the present phosphatase and CSE1L. In order to facilitate detection of the complex formed by the present dephosphorylating enzyme and CSE1L, it is preferable to use the present dephosphorylating enzyme and / or CSE1L labeled with an appropriate labeling substance. Preferred examples of the labeling substance include tag peptides such as FLAG-tag, Myc-tag and HA-tag. The labeling substance can be detected using a detection method known per se. For example, tag peptides can be detected by anti-tag peptide antibodies. At this time, an antibody labeled with an enzyme such as horseradish peroxidase (hereinafter abbreviated as HRP) or alkaline phosphatase (hereinafter abbreviated as ALP), a radioisotope, a fluorescent substance or biotin is used as the anti-tag peptide antibody. Therefore, detection can be performed more easily. Alternatively, a secondary antibody labeled with an enzyme such as HRP or ALP, a radioisotope, a fluorescent substance, or biotin may be used.
具体的には、本発明に係る脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を阻害する活性を有する化合物の同定方法は、例えば、ＦＬＡＧ−ｔａｇが付加された本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子を含む適当なベクターおよびＨＡ−ｔａｇが付加されたＣＳＥ１Ｌをコードする遺伝子を含む適当なベクターをトランスフェクションした細胞（実施例４参照）を用いて実施できる。該細胞を、被検化合物で処理した後、細胞を回収し、適当な方法で細胞を溶解して細胞溶解物を調製し、該細胞溶解物中に含まれる本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌにより形成された複合体を検出する。細胞溶解物中に含まれる該複合体の検出は、一方の蛋白質に付加されたタグペプチドに対する抗体を用いた免疫沈降の後に、もう一方の蛋白質に付加されたタグペプチドに対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行うことにより実施できる。被検化合物で処理したときに検出される本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌにより形成された複合体の量が、細胞を被検化合物で処理しないときに検出される複合体の量と比較して低減または消失する場合には、被検化合物は本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を阻害すると判定できる。また、例えば、本脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌの一方が適当なタグペプチドにより標識されており、他方が標識されていない場合、抗タグペプチド抗体によりタグペプチド標識された蛋白質を免疫沈降した後に、標識されていない蛋白質に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行うことにより、同様に、化合物の同定方法を実施することができる（実施例４参照）。 Specifically, the method for identifying a compound having an activity of inhibiting the binding of phosphatase and CSE1L according to the present invention includes, for example, an appropriate method including a gene encoding the present phosphatase with FLAG-tag added. And a cell transfected with an appropriate vector containing a gene encoding CSE1L to which HA-tag has been added (see Example 4). After the cells are treated with a test compound, the cells are collected, lysed by an appropriate method to prepare a cell lysate, and formed by the present dephosphorylating enzyme and CSE1L contained in the cell lysate. Detected complex. Detection of the complex contained in the cell lysate is performed by immunoprecipitation using an antibody against the tag peptide added to one protein, followed by Western blotting using an antibody against the tag peptide added to the other protein. It can be implemented by performing. The amount of complex formed by the present phosphatase and CSE1L detected when treated with a test compound is reduced compared to the amount of complex detected when cells are not treated with the test compound Alternatively, when it disappears, it can be determined that the test compound inhibits the binding between the present dephosphorylating enzyme and CSE1L. In addition, for example, when one of the present dephosphorylation enzyme and CSE1L is labeled with an appropriate tag peptide and the other is not labeled, the protein labeled with the tag peptide with an anti-tag peptide antibody is immunoprecipitated and then labeled. Similarly, the compound identification method can be carried out by performing Western blotting using an antibody against a protein that has not been performed (see Example 4).
本発明に係る脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を阻害する活性を有する化合物の同定方法はまた、公知のツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いて実施できる。例えば、本脱リン酸化酵素とＤＮＡ結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、ＣＳＥ１Ｌと転写活性化蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続したｌａｃＺ等レポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母や真核細胞等の細胞に導入し、該細胞を被検化合物で処理したときのレポーター遺伝子の発現量を、被検化合物で該細胞を処理しないときのレポーター遺伝子の発現量とを比較する。被検化合物で処理した該細胞のレポーター遺伝子の発現量が、被検化合物で処理しない該細胞のレポーター遺伝子の発現量と比較して低減または消失する場合、該被検化合物は本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を阻害すると判定できる。 The identification method of the compound which has the activity which inhibits the coupling | bonding of phosphatase and CSE1L based on this invention can also be implemented using the well-known two-hybrid (two-hybrid) method. For example, a plasmid containing the present phosphatase and DNA-binding protein as a fusion protein, a plasmid expressing CSE1L and a transcription activation protein as a fusion protein, and a plasmid containing a reporter gene such as lacZ connected to an appropriate promoter gene Compare the expression level of the reporter gene when introduced into cells such as yeast or eukaryotic cells and treating the cells with the test compound with the expression level of the reporter gene when the cells are not treated with the test compound. . When the expression level of the reporter gene of the cell treated with the test compound is reduced or eliminated compared to the expression level of the reporter gene of the cell not treated with the test compound, the test compound is dephosphorase It can be determined that the binding of CSE1L is inhibited.
上記同定方法により同定される化合物は、本発明に係る脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を阻害する活性を有する化合物である。 The compound identified by the above identification method is a compound having an activity of inhibiting the binding of phosphatase according to the present invention and CSE1L.
細胞増殖を阻害する活性を有する化合物の同定方法はまた、例えば、本発明に係る脱リン酸化酵素の発現を測定する実験系を用いて実施できる。このような実験系において、本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子と被検化合物とを共存させてその発現を測定し、ついで、被検化合物の非存在下での測定結果との比較における発現の変化（低減または消失）を検出し、被検化合物が本脱リン酸化酵素の発現を阻害するか否かを決定することにより、細胞増殖を阻害する活性を有する化合物を同定できる。 A method for identifying a compound having an activity of inhibiting cell growth can also be carried out using, for example, an experimental system for measuring the expression of a phosphatase according to the present invention. In such an experimental system, the gene encoding this phosphatase and the test compound are coexisted and the expression is measured, and then the expression in comparison with the measurement result in the absence of the test compound is measured. By detecting the change (reduction or disappearance) and determining whether the test compound inhibits the expression of the present dephosphorylation enzyme, a compound having an activity of inhibiting cell proliferation can be identified.
本発明に係る脱リン酸化酵素の発現を測定できる実験系として、具体的には、本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターをトランスフェクションした細胞を用いて本脱リン酸化酵素を発現させる実験系を例示できる。このような実験系において、該細胞を、被検化合物で処理した後、細胞を回収し、適当な方法で細胞を溶解して細胞溶解物を調製し、該細胞溶解物中に含まれる本脱リン酸化酵素を検出する。細胞を被検化合物で処理したときに検出される本脱リン酸化酵素の量が、細胞を被検化合物で処理しないときに検出される本脱リン酸化酵素の量と比較して低減または消失する場合には、被検化合物は本脱リン酸化酵素の発現を阻害すると判定できる。 As an experimental system capable of measuring the expression of phosphatase according to the present invention, specifically, the present phosphatase is expressed using cells transfected with an expression vector containing a gene encoding the phosphatase. An experimental system can be exemplified. In such an experimental system, after the cells are treated with a test compound, the cells are collected, and the cells are lysed by an appropriate method to prepare a cell lysate. Detect phosphorylating enzyme. The amount of the present phosphatase detected when the cells are treated with the test compound is reduced or eliminated compared to the amount of the present phosphatase detected when the cells are not treated with the test compound. In this case, it can be determined that the test compound inhibits the expression of the present phosphatase.
本発明に係る脱リン酸化酵素の発現の測定は、自体公知の蛋白質の検出方法、例えばウェスタンブロッティング等の方法により、本脱リン酸化酵素を直接的に検出することにより実施できる。また、発現の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより、本脱リン酸化酵素の測定を容易に実施できる。発現の指標となるシグナルとして、例えば、標識物質を例示できる。標識物質で本脱リン酸化酵素を標識し、該標識物質を測定することにより、本脱リン酸化酵素の測定を容易に実施できる。標識物質として、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇおよびＨＡ−ｔａｇ等のタグペプチド類が好ましく例示できる。標識物質の検出は、自体公知の検出方法を用いて実施できる。例えば、タグペプチド類は、抗タグペプチド抗体により検出できる。このとき、抗タグペプチド抗体として、ＨＲＰやＡＬＰ等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等で標識した抗体を用いることにより検出がより容易に実施できる。あるいは、ＨＲＰやＡＬＰ等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等で標識した二次抗体を用いてもよい。 The measurement of the expression of phosphatase according to the present invention can be carried out by directly detecting the phosphatase using a known protein detection method such as Western blotting. Moreover, the present dephosphorylating enzyme can be easily measured by introducing a signal serving as an expression index into an experimental system and detecting the signal. As a signal serving as an expression index, for example, a labeling substance can be exemplified. The present dephosphorylating enzyme can be easily measured by labeling the present dephosphorylating enzyme with a labeling substance and measuring the labeled substance. Preferred examples of the labeling substance include tag peptides such as FLAG-tag, Myc-tag and HA-tag. The labeling substance can be detected using a detection method known per se. For example, tag peptides can be detected by anti-tag peptide antibodies. At this time, detection can be performed more easily by using an antibody labeled with an enzyme such as HRP or ALP, a radioisotope, a fluorescent substance, or biotin as an anti-tag peptide antibody. Alternatively, a secondary antibody labeled with an enzyme such as HRP or ALP, a radioisotope, a fluorescent substance, or biotin may be used.
本発明に係る脱リン酸化酵素の発現を測定できる実験系としてまた、本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流に、該遺伝子の代わりにレポーター遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターを導入した細胞、例えば真核細胞等を用いた実験系を例示できる。このような実験系において、該細胞を被検化合物で処理したときのレポーター遺伝子の発現量を、被検化合物で該細胞を処理しないときのレポーター遺伝子の発現量とを比較する。被検化合物で処理した該細胞のレポーター遺伝子の発現量が、被検化合物で処理しない該細胞のレポーター遺伝子の発現量と比較して低減または消失する場合、該被検化合物は本脱リン酸化酵素の発現を阻害すると判定できる。レポーター遺伝子として、レポーターアッセイで一般的に用いられている遺伝子を使用でき、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素をコードする遺伝子を例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。 As an experimental system capable of measuring the expression of the phosphatase according to the present invention, a vector in which a reporter gene is linked instead of the gene downstream of the promoter region of the gene encoding the phosphatase is prepared, An experimental system using cells into which a vector has been introduced, such as eukaryotic cells, can be exemplified. In such an experimental system, the expression level of the reporter gene when the cells are treated with the test compound is compared with the expression level of the reporter gene when the cells are not treated with the test compound. When the expression level of the reporter gene of the cell treated with the test compound is reduced or eliminated compared to the expression level of the reporter gene of the cell not treated with the test compound, the test compound is dephosphorase Can be determined to inhibit the expression of. As the reporter gene, a gene generally used in reporter assays can be used, and examples include genes encoding enzymes such as luciferase, β-galactosidase or chloramphenicol acetyltransferase. The expression of the reporter gene can be detected by detecting the activity of the gene product, for example, the enzyme activity in the case of the reporter gene exemplified above.
本発明に係る細胞増殖を阻害する活性を有する化合物の同定方法は、さらに、上記同定方法により本発明に係る脱リン酸化酵素の発現および／または機能を阻害する活性を有することが明らかになった被検化合物が、細胞増殖を阻害し得るか否かを測定する工程をさらに含む同定方法であり得る。 The method for identifying a compound having an activity of inhibiting cell proliferation according to the present invention was further revealed to have the activity of inhibiting the expression and / or function of the phosphatase according to the present invention by the above identification method. The identification method may further include a step of measuring whether the test compound can inhibit cell proliferation.
細胞増殖の測定は、例えば、細胞のＤＮＡ合成または細胞数の測定により実施できる。細胞のＤＮＡ合成の測定は、例えばブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）のＤＮＡへの取り込みを、抗ＢｒｄＵ抗体を用いて測定することにより実施できる。細胞数の測定は、一般的に行われている細胞数測定方法により実施できる。細胞数測定方法として、セルカウンターによる方法、［３Ｈ］チミジン等の放射性同位体を用いる方法、色素を用いた方法、テトラゾリウム塩を用いる方法等により実施できる。細胞は、真核細胞が好ましく用いられる。真核細胞は、真核生物から調製した細胞、初代培養細胞、および培養細胞株のいずれでもあり得る。好ましくは哺乳動物由来の培養細胞株、より好ましくはヒト由来の培養細胞株を用いる。ヒト由来の培養細胞株として、ＨｅＬａ細胞、ＨＣＴ１１６細胞等を好ましく例示できる。 Cell proliferation can be measured, for example, by measuring cell DNA synthesis or cell number. Cellular DNA synthesis can be measured, for example, by measuring bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation into DNA using an anti-BrdU antibody. The measurement of the number of cells can be carried out by a commonly used method for measuring the number of cells. As a method for measuring the number of cells, a cell counter method, a method using a radioisotope such as [ 3 H] thymidine, a method using a dye, a method using a tetrazolium salt, and the like can be used. As the cell, a eukaryotic cell is preferably used. Eukaryotic cells can be any of cells prepared from eukaryotes, primary cultured cells, and cultured cell lines. Preferably, a mammalian cell line, more preferably a human cell line is used. Preferred examples of cultured cell lines derived from humans include HeLa cells and HCT116 cells.
このような細胞増殖を測定する実験系において、該細胞を被検化合物で処理することにより、細胞増殖を阻害する活性を有する化合物を同定できる。被検化合物で処理した細胞における細胞増殖が、被検化合物で処理していない細胞と比較して低下した場合、該細胞の増殖が阻害されたと判定できる。 In such an experimental system for measuring cell proliferation, a compound having an activity of inhibiting cell proliferation can be identified by treating the cells with a test compound. When the cell proliferation in the cells treated with the test compound is reduced as compared with the cells not treated with the test compound, it can be determined that the proliferation of the cells is inhibited.
本発明に係る脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を阻害する活性を有する化合物の同定方法は、上述の本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合を測定する実験系を用いて実施できる。 The identification method of the compound which has the activity which inhibits the coupling | bonding of phosphatase and CSE1L based on this invention can be implemented using the experimental system which measures the coupling | bonding of this above-mentioned phosphatase and CSE1L.
本発明に係る脱リン酸化酵素によるＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を阻害する活性を有する化合物の同定方法は、上述の本脱リン酸化酵素によるＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を測定する実験系を用いて実施できる。 The identification method of the compound which has the activity which inhibits the dephosphorylation of CSE1L by the dephosphorylating enzyme based on this invention can be implemented using the experimental system which measures the dephosphorylation of CSE1L by the above-mentioned this dephosphorylating enzyme.
被検化合物は、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、または本発明に係る脱リン酸化酵素やＣＳＥ１Ｌの一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等を挙げることができる。あるいは、本脱リン酸化酵素とＣＳＥ１Ｌの結合部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物として好適である。 Examples of the test compound include a compound derived from a chemical library or a natural product, or a compound obtained by drug design based on a primary structure or a three-dimensional structure of the phosphatase or CSE1L according to the present invention. . Alternatively, a compound obtained by drug design based on the structure of a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the binding site of the present phosphatase and CSE1L is also suitable as the test compound.
（腫瘍組織の判定方法）
本発明のまた別の一態様は、被験組織における本発明に係る脱リン酸化酵素をコードする遺伝子の発現量を測定することにより被験組織が腫瘍組織由来であるか否かを判定する方法に関する。
(Tumor tissue judgment method)
Another aspect of the present invention relates to a method for determining whether or not a test tissue is derived from a tumor tissue by measuring the expression level of a gene encoding the phosphatase according to the present invention in the test tissue.
本発明に係る脱リン酸化酵素をコードする遺伝子の発現強度は、腫瘍組織や腫瘍細胞において正常組織や正常細胞と比較して亢進していた。したがって、被験組織における本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子の発現量を測定することにより、被験組織が腫瘍組織由来であるか否かを判定することができる。 The expression intensity of the gene encoding the phosphatase according to the present invention was enhanced in tumor tissues and tumor cells compared to normal tissues and normal cells. Therefore, by measuring the expression level of the gene encoding the present dephosphorylating enzyme in the test tissue, it can be determined whether or not the test tissue is derived from a tumor tissue.
具体的には、良性大腸腺腫組織内および大腸癌組織内における本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子の発現平均量の比はそれぞれ、正常大腸組織内における本遺伝子の発現平均量に対して２．９および２．７であった（実施例１および図１）。また、前立腺癌組織内における本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子の発現平均量の比は、正常前立腺組織内における本遺伝子の発現平均量に対して１．７であった（実施例１および図１）。さらに、大腸癌細胞（ＨＣＴ１１６およびＳＷ６２０）および前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰおよびＰＣ３）における本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子の発現が、それぞれ正常大腸細胞（ＣＣＤ８４１ＣｏＮ）および正常前立腺組織と比較して亢進していることが判明した（実施例２および図２）。 Specifically, the ratio of the expression level of the gene encoding the present dephosphorylating enzyme in benign colorectal adenoma tissue and colorectal cancer tissue is 2. 9 and 2.7 (Example 1 and FIG. 1). The ratio of the expression average amount of the gene encoding the present dephosphorylating enzyme in prostate cancer tissue was 1.7 relative to the expression average amount of the gene in normal prostate tissue (Example 1 and FIG. 1). Furthermore, the expression of the gene encoding this dephosphorylation enzyme in colon cancer cells (HCT116 and SW620) and prostate cancer cells (LNCaP and PC3) is enhanced as compared with normal colon cells (CCD841CoN) and normal prostate tissue, respectively. (Example 2 and FIG. 2).
本発明に係る被験組織の判定方法は、ヒト大腸組織由来の被験組織が大腸腺腫または大腸癌由来であるか否かの判定に好ましく使用できる。ヒト大腸組織由来の被験組織における本発明に係る脱リン酸化酵素をコードする遺伝子の発現強度が、正常な対照組織との比較において、好ましくは２．０倍以上である場合、該被験組織は大腸腺腫または大腸癌由来であると判定できる。 The test tissue determination method according to the present invention can be preferably used for determining whether or not a test tissue derived from human large intestine tissue is derived from colorectal adenoma or colorectal cancer. When the expression intensity of the gene encoding the phosphatase according to the present invention in a test tissue derived from human large intestine tissue is preferably 2.0 times or more in comparison with a normal control tissue, the test tissue is It can be determined that it is derived from adenoma or colon cancer.
本発明に係る被験組織の判定方法はまた、ヒト前立腺組織由来の被験組織が前立腺癌由来であるか否かの判定に好ましく使用できる。ヒト前立腺組織由来の被験組織における本発明に係る脱リン酸化酵素をコードする遺伝子の発現強度が、正常な対照組織との比較において、好ましくは１．５倍以上である場合、該被験組織は前立腺癌由来であると判定できる。 The test tissue determination method according to the present invention can also be preferably used to determine whether a test tissue derived from human prostate tissue is derived from prostate cancer. When the expression intensity of the gene encoding the phosphatase according to the present invention in a test tissue derived from human prostate tissue is preferably 1.5 times or more compared to a normal control tissue, the test tissue is a prostate gland. It can be determined that the cancer originates.
本発明に係る脱リン酸化酵素をコードする遺伝子の発現量の測定は、該遺伝子由来のＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡ、あるいは本脱リン酸化酵素に由来する蛋白質の存在を検出すること、および／またはその存在量を決定することにより実施できる。正常な対照組織との比較において、本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子由来のＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡ、あるいは本脱リン酸化酵素の存在の変化およびその量的変化を検出できる。 The measurement of the expression level of the gene encoding the phosphatase according to the present invention is carried out by detecting the presence of RNA and / or cDNA derived from the gene or a protein derived from the phosphatase and / or This can be done by determining the abundance. In comparison with a normal control tissue, RNA and / or cDNA derived from the gene encoding the present phosphatase, or a change in the presence and quantitative change of the present phosphatase can be detected.
本発明に係る脱リン酸化酵素をコードする遺伝子由来のＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡの検出および定量は、自体公知の遺伝子検出法により実施できる。具体的には、ノザンブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）法およびドットブロット法等を例示できる。ＰＣＲ法が感度の点から好ましい。ＰＣＲ法は、本遺伝子を特異的に増幅できるプライマーを使用する方法である限り、従来公知の方法のいずれも使用できる。例えば逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＲＴ−ＰＣＲと略称する）法を挙げることができるが、その他、当該分野で使用される種々のＰＣＲ法の変法を適応できる。また、ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲやｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション等を利用した細胞レベルでの測定により検出できる。 Detection and quantification of RNA and / or cDNA derived from the gene encoding the phosphatase according to the present invention can be carried out by a gene detection method known per se. Specific examples include Northern blotting, polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR), and dot blotting. The PCR method is preferable from the viewpoint of sensitivity. As long as the PCR method is a method using a primer capable of specifically amplifying this gene, any conventionally known method can be used. For example, a reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR) method can be mentioned, but various other modified PCR methods used in the art can be applied. Moreover, it can detect by the measurement in the cell level using in situ RT-PCR, in situ hybridization, etc.
このような遺伝子検出法において、本発明に係る脱リン酸化酵素をコードする遺伝子の部分配列からなるオリゴヌクレオチドであってプローブとしての性質を有するものまたはプライマーとしての性質を有するものが有用である。プローブとしての性質を有するオリゴヌクレオチドとは、本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子のみに特異的にハイブリダイゼーションできる該遺伝子特有の配列からなるものを意味する。プライマーとしての性質を有するものとは本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子のみを特異的に増幅できる該遺伝子特有の配列からなるものを意味する。プローブまたはプライマーとして、塩基配列長が一般的に５〜５０ヌクレオチド程度であるものが好ましく、１０〜３５ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、１５〜３０ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。 In such a gene detection method, an oligonucleotide consisting of a partial sequence of a gene encoding the dephosphorylating enzyme according to the present invention and having a probe property or a primer property is useful. The oligonucleotide having the property as a probe means one consisting of a sequence peculiar to the gene that can specifically hybridize only to the gene encoding the present phosphatase. What has the property as a primer means the thing which consists of an arrangement | sequence peculiar to this gene which can amplify only the gene which codes this phosphatase specifically. The probe or primer generally has a base sequence length of preferably about 5 to 50 nucleotides, more preferably about 10 to 35 nucleotides, and even more preferably about 15 to 30 nucleotides.
本発明に係る脱リン酸化酵素をコードする遺伝子またはその断片を増幅するためのプライマー、あるいは本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子を検出するためのプローブとして、具体的には、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドおよび配列表の配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして好ましく例示できる。プローブは、通常は標識したプローブを使用するが、非標識であってもよい。また、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合により検出してもよい。プローブおよびリガンドを標識する方法は、種々の方法が知られており、ニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法等を例示できる。適当な標識物質として、放射性同位体、ビオチン、蛍光物質、化学発光物質、酵素、抗体等を例示できる。 As a primer for amplifying the gene encoding the phosphatase according to the present invention or a fragment thereof, or as a probe for detecting the gene encoding the phosphatase, specifically, SEQ ID NO: in the sequence listing Preferred examples of the primer include the oligonucleotide represented by the base sequence described in 3 and the oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. As the probe, a labeled probe is usually used, but it may be unlabeled. Alternatively, it may be detected by specific binding with a directly or indirectly labeled ligand. Various methods are known for labeling probes and ligands, and examples include methods using nick translation, random priming, or kinase treatment. Examples of suitable labeling substances include radioisotopes, biotin, fluorescent substances, chemiluminescent substances, enzymes, antibodies and the like.
本発明に係る脱リン酸化酵素をコードする遺伝子の発現量の測定は、具体的には、以下に例示する方法で実施できる。まず、被験組織から本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子のｃＤＮＡを調製し、ＰＣＲにより該ｃＤＮＡを増幅し、次いで、増幅された該ｃＤＮＡを定量する。被験組織から本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子のｃＤＮＡを調製する方法は、公知の遺伝子工学的手法をいずれも使用できる。例えば、被験組織から、全ＲＮＡを抽出し、得られた全ＲＮＡを使用して逆転写反応によりｃＤＮＡを取得できる。ＰＣＲにより該ｃＤＮＡを増幅する方法は、該ｃＤＮＡに特異的なプライマーを使用して実施できる。本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子特異的なプライマーとして、配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドおよび配列表の配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの組み合わせを例示できる。増幅された該ｃＤＮＡを定量する方法として、アガロースゲルを使用した電気泳動により増幅された該ｃＤＮＡを、他のｃＤＮＡと分離し、次いでエチジウムブロマイドといった色素によりｃＤＮＡを染色することにより検出する方法を例示できる。その他、一般的に使用されているｃＤＮＡの検出方法をいずれも利用できる。 The measurement of the expression level of the gene encoding the phosphatase according to the present invention can be specifically carried out by the method exemplified below. First, cDNA of a gene encoding the present phosphatase is prepared from a test tissue, the cDNA is amplified by PCR, and then the amplified cDNA is quantified. Any known genetic engineering technique can be used as a method for preparing cDNA of a gene encoding the present phosphatase from a test tissue. For example, total RNA can be extracted from the test tissue, and cDNA can be obtained by reverse transcription using the obtained total RNA. The method of amplifying the cDNA by PCR can be performed using primers specific to the cDNA. As a gene-specific primer encoding this phosphatase, an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing and an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing The combination of can be illustrated. An example of a method for quantifying the amplified cDNA is to detect the cDNA amplified by electrophoresis using an agarose gel by separating it from other cDNAs and then staining the cDNA with a dye such as ethidium bromide. it can. In addition, any commonly used cDNA detection method can be used.
本発明に係る脱リン酸化酵素の検出および定量は、一般的な蛋白質検出法あるいは定量法により実施できる。例えば、抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）を使用して、本脱リン酸化酵素の検出および定量を実施できる。蛋白質検出法あるいは定量法の好ましい具体例として、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を使用するサンドイッチ法を含む、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、および免疫酵素法（ＩＥＭＡ）等を挙げることができる。その他、ラジオイムノアッセイや競争結合アッセイ等を利用することもできる。具体的には、被験組織から常法により調製した試料について、本脱リン酸化酵素に対する特異抗体を使用して免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法またはイムノブロット法で本脱リン酸化酵素の解析を行うことにより、本脱リン酸化酵素の検出および定量を実施できる。また、本脱リン酸化酵素の検出および定量に対する特異抗体を使用して免疫組織化学的技術によりパラフィンまたは凍結組織切片中の本脱リン酸化酵素の検出および定量を検出できる。抗体は、本脱リン酸化酵素またはその断片を使用して自体公知の抗体作成法により取得できる。 Detection and quantification of the phosphatase according to the present invention can be carried out by a general protein detection method or quantification method. For example, an antibody (polyclonal antibody or monoclonal antibody) can be used to detect and quantify the present dephosphorylating enzyme. Preferred specific examples of the protein detection method or quantitative method include enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), and immunoradioassay (IRMA), including sandwich methods using monoclonal antibodies and / or polyclonal antibodies. And immunoenzyme method (IEMA). In addition, a radioimmunoassay, a competitive binding assay, or the like can be used. Specifically, a sample prepared from a test tissue by a conventional method is immunoprecipitated using a specific antibody against the present dephosphorylating enzyme, and the present dephosphorylating enzyme is analyzed by Western blotting or immunoblotting. Thus, the present phosphatase can be detected and quantified. In addition, detection and quantification of the present phosphatase in paraffin or frozen tissue sections can be detected by immunohistochemical techniques using specific antibodies for the detection and quantification of the phosphatase. The antibody can be obtained by a known antibody production method using the present dephosphorylating enzyme or a fragment thereof.
被験組織は、特に制限されず、例えば、細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等の生体由来の試料を例示できる。所望により被験組織から核酸を抽出して核酸試料を調製して使用することもできる。核酸は、ＰＣＲまたはその他の増幅法により酵素的に増幅してもよい。核酸試料は、また、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティング等により調製してもよい。 The test tissue is not particularly limited, and examples thereof include biological samples such as cells, blood, urine, saliva, spinal fluid, tissue biopsy, and autopsy material. If desired, a nucleic acid sample can be prepared by extracting a nucleic acid from a test tissue. The nucleic acid may be amplified enzymatically by PCR or other amplification methods. Nucleic acid samples may also be prepared by various methods that facilitate the detection of the target sequence, such as denaturation, restriction digestion, electrophoresis or dot blotting.
本発明に係る被験組織の判定方法は、被験組織が腫瘍由来であるか否かを判定できるためきるため、腫瘍疾患の検査方法に使用できる。本判定方法は腫瘍疾患の診断等に有用である。 Since the test tissue determination method according to the present invention can determine whether or not the test tissue is derived from a tumor, it can be used in a method for examining a tumor disease. This determination method is useful for diagnosis of tumor diseases.
（試薬キット）
本発明の一態様は、試薬キットに関する。本試薬キットは、本発明に係る脱リン酸化酵素、本脱リン酸化酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれるいずれか１つと、ＣＳＥ１Ｌ、ＣＳＥ１ＬをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組み換えベクター、および該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれるいずれか１つとを含有してなる試薬キットであり得る。
(Reagent kit)
One embodiment of the present invention relates to a reagent kit. The reagent kit is any one selected from the group consisting of the dephosphorylating enzyme according to the present invention, a DNA encoding the dephosphorylating enzyme, a recombinant vector containing the DNA, and a transformant containing the recombinant vector. And a reagent kit comprising any one selected from the group consisting of CSE1L, DNA encoding CSE1L, a recombinant vector containing the DNA, and a transformant containing the recombinant vector.
本発明に係る試薬キットはまた、配列表の配列番号３および配列番号４からなる群より選ばれるいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを含有してなる試薬キットであり得る。 The reagent kit according to the present invention can also be a reagent kit containing an oligonucleotide represented by any one of the base sequences set forth in the sequence list, selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
本発明に係る試薬キットは、例えば、本発明に係る化合物の同定方法や本発明に係る被検組織の判定方法に用いることができる。 The reagent kit according to the present invention can be used for, for example, the compound identification method according to the present invention and the test tissue determination method according to the present invention.
本発明に係る試薬キットは、本発明に係る化合物の同定方法や本発明に係る被検組織の判定方法において用いるシグナルおよび／またはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。 The reagent kit according to the present invention contains a required substance such as a signal and / or marker, a buffer solution, and a salt used in the method for identifying the compound according to the present invention and the method for determining the test tissue according to the present invention. Can do. Furthermore, substances such as stabilizers and / or preservatives may be included. In formulating, formulation means corresponding to each substance to be used may be introduced.
（本発明に係る脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌの取得） (Acquisition of phosphatase and CSE1L according to the present invention)
本発明に係る脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌはヒト由来の蛋白質であることが好ましいが、該ヒト由来の蛋白質と同質の機能を有し、かつ構造的相同性を有する哺乳動物由来の蛋白質、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、ラットまたはウサギ等に由来する蛋白質であることができる。また、本脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌをそれぞれコードする遺伝子は、ヒト由来の遺伝子であることが好ましいが、上記ヒト由来の蛋白質と同質の機能を有しかつ構造的相同性を有する哺乳動物由来の蛋白質をコードする遺伝子であれば、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、ラットまたはウサギ等に由来する遺伝子であることができる。本脱リン酸化酵素の性質や機能として、例えば、ＣＳＥ１Ｌとの結合およびＣＳＥ１Ｌに対する脱リン酸化活性を挙げることができる。ＣＳＥ１Ｌの性質や機能として、例えば、細胞周期・細胞の増殖や癌化への関与を挙げることができる。 The phosphatase and CSE1L according to the present invention are preferably human-derived proteins, but mammal-derived proteins having the same functions and structural homology as the human-derived proteins, such as mice , Proteins derived from horses, sheep, cows, dogs, monkeys, cats, rats or rabbits. In addition, the genes encoding the present dephosphorylation enzyme and CSE1L are preferably human-derived genes, but they are derived from mammals having the same function as the human-derived protein and having structural homology. As long as it is a gene encoding a protein, for example, it can be a gene derived from mouse, horse, sheep, cow, dog, monkey, cat, rat or rabbit. Examples of the properties and functions of the present dephosphorylation enzyme include binding to CSE1L and dephosphorylation activity against CSE1L. Examples of the properties and functions of CSE1L include involvement in cell cycle / cell proliferation and canceration.
本発明に係る脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌは、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、本脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌのうち少なくとも１を遺伝子工学的手法で発現させた細胞を使用することもできる。本脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌは、その性質や機能に影響がない限りにおいて、Ｎ末端側やＣ末端側に別種の蛋白質やポリペプチドを、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加してもよい。別種の蛋白質やポリペプチドとして、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、あるいはＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類を例示できる。 The phosphatase and CSE1L according to the present invention may be prepared from cells or biological samples in which they are expressed by genetic engineering techniques, cell-free synthetic products or chemical synthetic products, or further purified from them. It may be what was done. In addition, cells in which at least one of the present dephosphorylating enzyme and CSE1L is expressed by a genetic engineering technique can also be used. As long as this phosphatase and CSE1L do not affect its properties and functions, other types of proteins and polypeptides may be directly or indirectly via a linker peptide or the like on the N-terminal side or C-terminal side. It may be added using a genetic engineering technique or the like. Other types of proteins and polypeptides include enzymes such as glutathione S-transferase (GST), β-galactosidase, HRP or ALP, His-tag, Myc-tag, HA-tag, FLAG-tag, Xpress-tag, etc. Tag peptides can be exemplified.
遺伝子工学的手法として、公知の方法がいずれも使用できる。公知の方法として、成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社；ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス等を参照）を例示できる。 Any known method can be used as a genetic engineering technique. As a publicly known method, the method described in the book (edited by Sambrook et al., “Molecular Cloning, Laboratory Manual Second Edition”, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory; Muramatsu Masatsugu, “Lab Manual Genetic Engineering” 1988, Maruzen Co., Ltd .; Ulmer, KM, “Science”, 1983, Vol. 219, pp. 666-671; Ehrlich, HA, edited by Ehrlich, HA. "PCR technology, principle and application of DNA amplification", see 1989, Stockton Press, etc.).
本発明に係る脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌをそれぞれコードする遺伝子は、例えば、各遺伝子の発現が認められる適当な起源から、自体公知のクローニング方法等を用いて容易に取得できる。これら遺伝子の起源として、該遺伝子の発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞を例示できる。本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子の起源として卵巣組織を例示できる。本脱リン酸化酵素をコードする遺伝子は様々な組織で普遍的に発現しているが、高発現が認められる組織として、例えば、ヒトの腫瘍組織、具体的には大腸腺腫や大腸癌、および前立腺癌を挙げることができる。ＣＳＥ１Ｌをコードする遺伝子の起源として、卵巣組織を例示できる。 The genes encoding phosphatase and CSE1L according to the present invention can be easily obtained from, for example, appropriate sources where the expression of each gene is recognized using a cloning method known per se. Examples of the origin of these genes include various cells and tissues in which the expression of the gene has been confirmed, or cultured cells derived therefrom. An example of the origin of the gene encoding this phosphatase is ovarian tissue. The gene encoding this phosphatase is ubiquitously expressed in various tissues. Examples of tissues that are highly expressed include, for example, human tumor tissues, specifically colon adenoma, colon cancer, and prostate. Mention can be made of cancer. As the origin of the gene encoding CSE1L, ovarian tissue can be exemplified.
起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。また、市販されているｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。所望のクローンをｃＤＮＡライブラリーから選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を使用できる。例えば、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法を挙げることができる。ここで用いるプローブとして、本脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌをそれぞれコードする遺伝子の塩基配列に関する情報に基づいて化学合成されたＤＮＡ等が一般的に使用できる。また、該遺伝子の塩基配列情報に基づき設計したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをこのようなプローブとして使用できる。ｃＤＮＡライブラリーからの目的クローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンについて発現蛋白質の確認を行い、その生物学的機能を指標にして実施できる。 Isolation of total RNA from origin, isolation and purification of mRNA, acquisition of cDNA, and cloning thereof can all be performed according to conventional methods. Commercially available cDNA libraries can also be used. The method for selecting a desired clone from a cDNA library is not particularly limited, and a conventional method can be used. Examples thereof include a plaque hybridization method using a probe that selectively binds to a target DNA sequence, a colony hybridization method, and the like, and a combination of these methods. As the probe used here, DNA or the like chemically synthesized based on information on the base sequences of the genes encoding the present dephosphorylating enzyme and CSE1L can be generally used. In addition, sense primers and antisense primers designed based on the base sequence information of the gene can be used as such probes. Selection of the target clone from the cDNA library can be performed, for example, by confirming the expressed protein for each clone using a known protein expression system and using the biological function as an index.
遺伝子の取得にはその他、ＰＣＲ（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス；サイキ（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．１３５０−１３５４））によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。ｃＤＮＡライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法（「実験医学」、１９９４年、第１２巻、第６号、ｐ．３５−）、特に５´−ＲＡＣＥ法（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ Ｍ．Ａ．）ら、「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２）等の採用が好適である。ＰＣＲに使用するプライマーは、ＤＮＡの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により取得できる。増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、常法により実施できる。例えばゲル電気泳動法等によりＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製を実施できる。 In addition to gene acquisition, PCR (Ulmer, KM, Science, 1983, Vol. 219, p. 666-671; edited by Ehrlich, HA,) “PCR Technology, Principles and Applications of DNA Amplification”, 1989, Stockton Press; Saiki RK, et al., “Science”, 1985, Vol. 230, pp. 1350-1354)) The DNA / RNA amplification method can be suitably used. When it is difficult to obtain a full-length cDNA from a cDNA library, the RACE method (“Experimental Medicine”, 1994, Vol. 12, No. 6, p. 35-), particularly the 5′-RACE method (flow Frohman MA, et al., "Proceedings of the National Academy of the United States, 1985", Proceedings of the National Academy of the United States, 1985, Proceedings of the National Academy of the United States. 23, p.8998-9002) and the like are suitable. Primers used for PCR can be appropriately designed based on DNA base sequence information, and can be obtained by synthesis according to conventional methods. Isolation and purification of the amplified DNA / RNA fragment can be performed by a conventional method. For example, DNA / RNA fragments can be isolated and purified by gel electrophoresis or the like.
遺伝子は、その機能、例えばコードする蛋白質の発現や、発現された蛋白質の機能が阻害されない限りにおいて、５´末端側や３´末端側に、例えばＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、あるいはＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類等の遺伝子が、１つまたは２つ以上付加されたＤＮＡであることができる。これら遺伝子の付加は、慣用の遺伝子工学的手法により実施できる。 A gene has an enzyme such as GST, β-galactosidase, HRP or ALP on the 5 ′ end side or 3 ′ end side as long as the function thereof, for example, the expression of the encoded protein or the function of the expressed protein is not inhibited. , His-tag, Myc-tag, or a tag peptide such as HA-tag, FLAG-tag or Xpress-tag can be added with one or more genes. The addition of these genes can be performed by a conventional genetic engineering technique.
本発明に係る脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌをそれぞれコードする遺伝子を含む組み換えベクターを構築し、該組み換えベクターを用いて適当な宿主細胞で該遺伝子を発現させることにより、本脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌのうち少なくとも１を発現する細胞を取得できる。また、該細胞から、公知の方法で本脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌを調製することができる。 By constructing a recombinant vector containing genes encoding phosphatase and CSE1L according to the present invention, and expressing the gene in an appropriate host cell using the recombinant vector, the phosphatase and CSE1L Among them, cells expressing at least 1 can be obtained. Moreover, this phosphatase and CSE1L can be prepared from this cell by a well-known method.
ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。代表的なものとして、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを例示できる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドを例示できる。バクテリオファージＤＮＡとして、λファージを例示できる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとして、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターを例示できる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡを例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミド等）を例示できる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクター等、いずれも用いることができる。 The vector DNA is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and is appropriately selected depending on the type of host and intended use. The vector DNA may be one in which a part of the DNA other than the part necessary for replication is missing, in addition to one extracted from a naturally occurring one. Representative examples include plasmid, bacteriophage and virus-derived vector DNA. Examples of plasmid DNA include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, and plasmids derived from yeast. An example of bacteriophage DNA is λ phage. Examples of the virus-derived vector DNA include vectors derived from animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, adenovirus, papova virus, SV40, fowlpox virus, and pseudorabies virus, or vectors derived from insect viruses such as baculovirus. In addition, vector DNA derived from a transposon, an insertion element, or a yeast chromosome element can be exemplified. Alternatively, vector DNA prepared by combining these, for example, vector DNA (cosmid, phagemid, etc.) prepared by combining genetic elements of plasmid and bacteriophage can be exemplified. Any expression vector or cloning vector may be used depending on the purpose.
ベクターＤＮＡには、目的遺伝子の機能が発揮されるように遺伝子を組込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子配列とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー等から選択した１つまたは複数の遺伝子配列を自体公知の方法により組合せてベクターＤＮＡに組込むことができる。選択マーカーとして、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子を例示できる。 It is necessary to incorporate the gene into the vector DNA so that the function of the target gene is exhibited, and at least the target gene sequence and the promoter are constituent elements. In addition to these elements, a gene sequence carrying information on replication and control, if desired, for example, a ribosome binding sequence, a terminator, a signal sequence, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a selection marker, and the like. Alternatively, a plurality of gene sequences can be combined into a vector DNA by a method known per se. Examples of selection markers include dihydrofolate reductase gene, ampicillin resistance gene, and neomycin resistance gene.
ベクターＤＮＡに目的遺伝子配列を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、目的遺伝子配列を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的遺伝子配列に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組み換えベクターが得られる。 As a method for incorporating the target gene sequence into the vector DNA, a method known per se can be applied. For example, a method is used in which a target gene sequence is treated with an appropriate restriction enzyme, cleaved at a specific site, then mixed with a similarly treated vector DNA, and religated by ligase. Alternatively, a desired recombinant vector can also be obtained by ligating an appropriate linker to the target gene sequence and inserting it into a multicloning site of a vector suitable for the purpose.
本発明に係る脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌをそれぞれコードする遺伝子を含む組み換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換体が得られる。ベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、これら遺伝子のうち少なくとも１を発現する細胞を取得でき、さらに該細胞用いて公知の方法により本脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌを製造できる。該形質転換体には、本脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌをそれぞれコードする遺伝子以外の所望の遺伝子を組込んだベクターＤＮＡの１つまたは２つ以上をさらに導入することもできる。 A transformant can be obtained by introducing a recombinant vector containing a gene encoding phosphatase according to the present invention and CSE1L into a host. If an expression vector is used as the vector DNA, cells expressing at least one of these genes can be obtained, and the present dephosphorylation enzyme and CSE1L can be produced using the cells by a known method. One or more vector DNAs incorporating a desired gene other than the genes encoding the present dephosphorylating enzyme and CSE1L can be further introduced into the transformant.
宿主として、原核生物および真核生物のいずれも使用できる。原核生物として、例えば大腸菌（エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌を例示できる。真核生物として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母、Ｓｆ９やＳｆ２１等の昆虫細胞、あるいはサル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒト２９３細胞等の動物細胞を例示できる。好ましくは動物細胞を用いる。 Either prokaryotic or eukaryotic organisms can be used as the host. Examples of prokaryotes include, for example, Escherichia such as Escherichia coli, Bacillus such as Bacillus subtilis, Pseudomonas putida such as Pseudomonas, Rhizobium meliloti Examples of the bacteria to which it belongs. As eukaryotes, yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe, insect cells such as Sf9 and Sf21, monkey kidney-derived cells (COS cells, Vero ham cells) Examples include animal cells such as (CHO cells), mouse L cells, rat GH3 cells, and human 293 cells. Preferably animal cells are used.
ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用でき、例えば成書に記載されている標準的な方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法を挙げることができるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的な方法として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染を例示できる。 Introducing vector DNA into a host cell can be carried out by a method known per se, for example, a standard method described in a book (Sambrook et al., “Molecular Cloning, Laboratory Manual, Second Edition”). , 1989, Cold Spring Harbor Laboratory). As a more preferable method, an integration method into a chromosome can be mentioned if gene stability is taken into account, but an autonomous replication system using an extranuclear gene can be used conveniently. Specific methods include calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, microinjection, cationic lipid mediated transfection, electroporation, transduction, scrape loading, ballistic introduction and infection. Can be illustrated.
本発明に係る脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌは、本発明に係る脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌをそれぞれコードする遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製した蛋白質、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製された蛋白質であってもよい。また、本蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を含む細胞において発現しているものであり得る。該細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションして得られた形質転換体であり得る。 The phosphatase and CSE1L according to the present invention include a protein prepared from a cell or biological sample in which genes encoding the phosphatase and CSE1L according to the present invention are expressed by genetic engineering techniques, and a cell-free synthetic product, respectively. Alternatively, it may be a chemically synthesized product, or a protein further purified from these. In addition, the present protein can be expressed in a cell containing a gene encoding the present protein. The cell may be a transformant obtained by transfecting a vector containing a gene encoding this protein.
本発明に係る脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌはさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変できる。また、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質等を、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加することにより標識化したものであってもよい。好ましくは、本蛋白質の基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。付加する蛋白質等として、ＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）等の蛍光色素類、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンのＦｃ断片あるいはビオチンを例示できるが、これらに限定されない。また、放射性同位元素により標識することもできる。標識化に用いる物質は、１つまたは２つ以上を組合せて付加できる。これら標識化に用いた物質自体、またはその機能を測定することにより、本蛋白質を容易に検出または精製でき、また、例えば本蛋白質と他の蛋白質との相互作用を検出できる。 The dephosphorylating enzyme and CSE1L according to the present invention can be further modified without significant changes in function, such as by amidation modification of the constituent amino group or carboxyl group. Further, it may be labeled by adding another protein or the like to the N-terminal side or C-terminal side directly or indirectly using a genetic engineering technique or the like via a linker peptide or the like. . Preferably, labeling so that the basic properties of the protein are not inhibited is desirable. Examples of proteins to be added include enzymes such as GST, β-galactosidase, HRP or ALP, tag peptides such as His-tag, Myc-tag, HA-tag, FLAG-tag or Xpress-tag, fluorescein isothiocyanate (fluorescein) Examples include, but are not limited to, fluorescent dyes such as isothiocyanate or phycoerythrin, maltose binding protein, Fc fragment of immunoglobulin or biotin. It can also be labeled with a radioisotope. One or a combination of two or more substances used for labeling can be added. By measuring the substance itself used for labeling or its function, the present protein can be easily detected or purified, and for example, the interaction between the present protein and other proteins can be detected.
具体的には例えば、本脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌの製造は、これらいずれかの蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターＤＮＡをトランスフェクションした形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とする蛋白質を回収することにより実施できる。形質転換体の培養は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で実施できる。培養は、形質転換体により発現される本蛋白質自体またはその機能を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された本蛋白質自体またはその蛋白質量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。 Specifically, for example, the present phosphatase and CSE1L are produced by culturing a transformant transfected with a vector DNA containing a gene encoding any of these proteins, and then obtaining the target from the resulting culture. This can be done by recovering the protein. The transformant can be cultured by culture conditions and culture methods known per se optimal for each host. The culture can be performed using the present protein expressed by the transformant itself or its function as an index. Alternatively, the present protein produced in or outside the host or the amount of the protein may be used as an indicator, or subculture or batch culture may be performed using the amount of transformant in the medium as an indicator. .
目的とする蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して目的とする蛋白質を抽出する。また、目的とする蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を用いる。 When the target protein is expressed in the cell or on the cell membrane of the transformant, the target protein is extracted by crushing the transformant. When the target protein is secreted outside the transformant, the culture solution is used as it is, or a culture solution from which the transformant has been removed by centrifugation or the like is used.
本発明に係る脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌはまた、一般的な化学合成法により製造できる。例えば、成書（「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年および「ペプチド シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９６年）に記載の方法により、これら蛋白質を製造できるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。蛋白質の化学合成方法として、固相合成方法や液相合成方法等が知られているがいずれも用いることができる。このような蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含し、本蛋白質の合成は、そのいずれによっても実施できる。上記蛋白質合成において用いられる縮合法も、常法に従うことができ、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法を例示できる。また、市販のアミノ酸合成装置を用いてペプチドを製造することができる。 The phosphatase and CSE1L according to the present invention can also be produced by a general chemical synthesis method. For example, these proteins can be obtained by the method described in the book (“Peptide Synthesis”, Maruzen Co., Ltd., 1975 and “Peptide Synthesis”, Interscience, New York, 1996). Although it can manufacture, not only these but a well-known method can be utilized widely. As a protein chemical synthesis method, a solid phase synthesis method, a liquid phase synthesis method, and the like are known, and any of them can be used. More specifically, such a protein synthesis method includes a so-called stepwise elongation method in which each amino acid is sequentially linked one by one to extend a chain based on amino acid sequence information, and a fragment consisting of several amino acids. This method includes a fragment condensation method in which each fragment is subjected to a coupling reaction in advance, and the protein can be synthesized by any of them. Condensation methods used in the protein synthesis can also follow conventional methods, such as azide method, mixed acid anhydride method, DCC method, active ester method, redox method, DPPA (diphenylphosphoryl azide) method, DCC + additive (1 -Hydroxybenzotriazole, N-hydroxysuccinamide, N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, etc.) method and Woodward method. Moreover, a peptide can be manufactured using a commercially available amino acid synthesizer.
本発明に係る脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌに変異が導入されたものも本発明において使用できる。蛋白質、ポリペプチドおよびポリペプチドに変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（ウルマー（Ｋ．Ｍ．Ｕｌｍｅｒ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１）を利用して実施できる。このような変異の導入において、当該の基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変することができる。 The phosphatase according to the present invention and those in which a mutation is introduced into CSE1L can also be used in the present invention. Proteins, polypeptides, and means for introducing mutations into polypeptides are known per se, such as Ulmer's technique (KM Ulmer, Science, 1983, 219, p. 666). -671). For example, homologous amino acids (polar amino acids, nonpolar amino acids, hydrophobic amino acids, hydrophilicity) from the viewpoint of not changing the basic properties (physical properties, functions, immunological activities, etc.) of such mutations. Mutual substitution between amino acids, positively charged amino acids, negatively charged amino acids, aromatic amino acids, etc.) is readily envisioned. Furthermore, these usable polypeptides can be modified to such an extent that the structural amino group or carboxyl group or the like is not significantly changed in function, for example, by amidation modification.
本発明に係る脱リン酸化酵素およびＣＳＥ１Ｌは、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種分離操作方法により精製および／または分離できる。分離および／または精製は、本蛋白質の機能を指標にして実施できる。分離操作方法として、例えば硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を単独でまたは適宜組合せて使用できる。好ましくは、本蛋白質のアミノ酸配列情報に基づき、これらに対する特異的抗体を作成し、該抗体を用いて特異的に吸着する方法、例えば該抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーを用いることが推奨される。 The dephosphorylating enzyme and CSE1L according to the present invention can be purified and / or separated by various separation operation methods utilizing their physical properties, chemical properties and the like, if desired. Separation and / or purification can be performed using the function of the protein as an index. As the separation operation method, for example, ammonium sulfate precipitation, ultrafiltration, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high-performance liquid chromatography, dialysis method and the like can be used alone or in appropriate combination. Preferably, based on the amino acid sequence information of this protein, a specific antibody against them is prepared and specifically adsorbed using the antibody, for example, affinity chromatography using a column to which the antibody is bound is used. Is recommended.
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated concretely based on an Example, this invention is not limited to the following Example.
（正常大腸組織と比較し、大腸癌組織において発現が亢進している遺伝子の同定）
＜材料と方法＞
正常組織と比較して癌組織において発現が亢進している遺伝子の同定は、バイオエクスプレス（ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社）のマイクロアレイデータベースの利用により実施した。マイクロアレイデータベースには正常大腸組織２３４サンプル、大腸癌組織１３９サンプルの発現プロファイルデータが含まれていた。発現プロファイルデータはアフィメトリクスヒト遺伝子オリゴチップＨＧ−Ｕ１３３を用いて解析された各細胞内の発現データベースとして格納されている。
(Identification of genes whose expression is increased in colorectal cancer tissues compared to normal colon tissues)
<Materials and methods>
Identification of genes whose expression is enhanced in cancer tissues as compared with normal tissues was carried out using a microarray database of BioExpress (GeneLogic). The microarray database contained expression profile data of 234 samples of normal colon tissue and 139 samples of colon cancer tissue. The expression profile data is stored as an expression database in each cell analyzed using Affymetrix human gene oligochip HG-U133.
＜結果＞
公共ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に遺伝子の全長の塩基配列（ＸＭ＿０５１０９３［ｇｉ：１７４５５７１８］ Ｕｐｄａｔｅ Ｄａｔｅ：Ａｕｇ １ ２００２ ７：１０ＰＭ）が登録されている遺伝子、ＫＩＡＡ１１５７を、正常大腸組織内での発現量よりも大腸癌組織内での発現量が多い遺伝子のうちの一つとして同定した。ＸＭ＿０５１０９３［ｇｉ：１７４５５７１８］（Ｕｐｄａｔｅ Ｄａｔｅ：Ａｕｇ １ ２００２ ７：１０ＰＭ）として登録されているＫＩＡＡ１１５７の塩基配列の長さは６４６２ｂｐであり、その第４１５番目から１９５９番目にコード領域を有する。
<Result>
KIAA1157, a gene registered in the public nucleotide database (DDBJ / EMBL / GenBank), whose full-length nucleotide sequence (XM — 051093 [gi: 17455718] Update Date: Aug 1 2002 7:10 PM) The gene was identified as one of the genes whose expression level in the colon cancer tissue was higher than the expression level. The length of the base sequence of KIAA1157 registered as XM_051093 [gi: 17455718] (Update Date: Aug 1 2002 7:10 PM) is 6462 bp, and has a coding region from the 415th to the 1959th.
正常大腸組織（２３４サンプル）におけるＫＩＡＡ１１５７の発現量の平均値に対する大腸癌組織（１３９サンプル）における同遺伝子の発現量の平均値の比は２．７で、有意水準は４．５×１０−４３であった（図１の左パネル）。さらに正常大腸組織におけるＫＩＡＡ１１５７の発現量の平均値と、良性大腸腺腫組織（２７サンプル）における同遺伝子の発現量の平均値の比を求めたところ、その値は２．９（有意水準３．７×１０−３１）であった（図１の右パネル）。 The ratio of the average value of the expression level of the same gene in the colon cancer tissue (139 sample) to the average value of the expression level of KIAA1157 in the normal colon tissue (234 sample) is 2.7, and the significance level is 4.5 × 10 −43. (Left panel in FIG. 1). Further, when the ratio of the average expression level of KIAA1157 in normal colon tissue and the average expression level of the same gene in benign colorectal adenoma tissue (27 samples) was determined, the value was 2.9 (significance level 3.7). × 10 −31 ) (right panel of FIG. 1).
これら結果から、ＫＩＡＡ１１５７の発現は、大腸癌のみならず、前癌状態にある大腸腺腫の段階から亢進していることがわかった。 From these results, it was found that the expression of KIAA1157 was increased not only from colorectal cancer but also from the stage of colorectal adenoma in a precancerous state.
一方、正常前立腺組織（６３サンプル）と前立腺癌組織（９５サンプル）の比較により、前立腺癌でもＫＩＡＡ１１５７の発現が亢進していることがわかった（発現平均量比１．７、有意水準３．６×１０−１７）。しかし、前立腺良性腫瘍４２サンプルではＫＩＡＡ１１５７の発現は全く亢進していなかった（発現平均量比１．０）。 On the other hand, a comparison between normal prostate tissue (63 samples) and prostate cancer tissue (95 samples) showed that KIAA1157 expression was also increased in prostate cancer (average expression level ratio 1.7, significance level 3.6). × 10 −17 ). However, expression of KIAA1157 was not enhanced at all in 42 prostate benign tumor samples (average expression ratio 1.0).
これら結果から、ＫＩＡＡ１１５７の発現は、前立腺では腫瘍が悪性化して初めて発現が亢進することが示された。 From these results, it was shown that the expression of KIAA1157 increased only after the tumor became malignant in the prostate.
（大腸癌細胞および前立腺癌細胞におけるＫＩＡＡ１１５７の発現解析）
＜材料と方法＞
ＫＩＡＡ１１５７の発現を大腸癌細胞および前立腺癌細胞を用いて検討した。大腸癌細胞ＨＣＴ１１６およびＳＷ６２０は大日本製薬より購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、岩城硝子社製）を含むＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）で培養した。一方、正常大腸上皮細胞ＣＣＤ８４１ＣｏＮはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入し、ＡＣＬ−４無血清培地で培養した。前立腺癌細胞ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３はＡＴＣＣより購入し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で培養した。これらの細胞からアイソゲン（日本ジーン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。１μｇの全ＲＮＡから、ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用いて３０℃ １０分、４２℃ ３０分、９９℃ ５分、５℃ ５分の条件でｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡの１／１０量あるいは２μｌのヒト前立腺ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（白人男性２０人のプールより調製、ＢＤバイオサイエンスクロンテック社製）を鋳型とし、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用い、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｉｘ（ＢＤバイオサイエンスクロンテック社製）を酵素として用いて、次の条件でＰＣＲを実施した：９４℃ １．５分処理後、９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒および７２℃ １分からなる工程を３０回行い、最後に７２℃ ３分処理した。反応液を１％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により増幅産物を検出した。対照として、配列番号５および配列番号６に記載の各塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）の発現をＰＣＲにより検出した。
(Expression analysis of KIAA1157 in colon cancer cells and prostate cancer cells)
<Materials and methods>
The expression of KIAA1157 was examined using colon cancer cells and prostate cancer cells. Colon cancer cells HCT116 and SW620 were purchased from Dainippon Pharmaceutical and cultured in DMEM medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (FCS, manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.). On the other hand, normal colon epithelial cell CCD841CoN was purchased from American Tissue Culture Collection (ATCC) and cultured in ACL-4 serum-free medium. Prostate cancer cells LNCaP and PC-3 were purchased from ATCC and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. Total RNA was extracted from these cells using isogen (Nippon Gene). From 1 μg of total RNA, RNA PCR Kit (AMV) Ver. 2.1 (manufactured by Takara Bio Inc.) was used to synthesize cDNA under conditions of 30 ° C. for 10 minutes, 42 ° C. for 30 minutes, 99 ° C. for 5 minutes, and 5 ° C. for 5 minutes. 1/10 amount of the synthesized cDNA or 2 μl of human prostate QUICK-Clone cDNA (prepared from a pool of 20 white males, manufactured by BD Biosciences Clontech) from the base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 4 of the Sequence Listing and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 as the sense primer and antisense primer, respectively, and using the Advantage 2 polymerase mix (manufactured by BD Bioscience Clontech) as the enzyme, the following conditions: PCR was carried out at: 94 ° C for 1.5 minutes, followed by 30 steps of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute, and finally 72 ° C for 3 minutes. The reaction solution was electrophoresed on a 1% agarose gel, and the amplification product was detected by ethidium bromide staining. As a control, the expression of glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase (G3PDH) was detected by PCR using oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 as primers.
＜結果＞
大腸癌細胞ＨＣＴ１１６およびＳＷ６２０ではＫＩＡＡ１１５７の発現（図２のレーン１およびレーン２）が、正常大腸細胞ＣＣＤ８４１ＣｏＮ（図２のレーン３）に比して亢進していることがわかった。また、前立腺癌細胞ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３（図２のレーン４およびレーン５）でも、ＫＩＡＡ１１５７の発現が正常前立腺組織（図２のレーン６）に比べ、亢進していることが示された。
<Result>
It was found that the expression of KIAA1157 (lane 1 and lane 2 in FIG. 2) was increased in colon cancer cells HCT116 and SW620 as compared to normal colon cell CCD841CoN (lane 3 in FIG. 2). In addition, it was shown that the expression of KIAA1157 was also increased in prostate cancer cells LNCaP and PC-3 (lane 4 and lane 5 in FIG. 2) compared to normal prostate tissue (lane 6 in FIG. 2).
（ＫＩＡＡ１１５７の遺伝子の取得とＰＰ２Ｃ活性の確認）
＜材料と方法＞
（遺伝子の取得）
マイクロアレイデータベースのプローブ配列情報に相当する遺伝子として、公共ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）中には、ＫＩＡＡ１１５７の塩基配列（ＸＭ＿０５１０９３［ｇｉ：１７４５５７１８］ Ｕｐｄａｔｅ Ｄａｔｅ：Ａｕｇ １ ２００２ ７：１０ＰＭ）が登録されていた。そこで、配列の確認と発現用ベクター構築のため、ＰＣＲによりＫＩＡＡ１１５７のｃＤＮＡクローニングを行った。プライマーは、ＸＭ＿０５１０９３［ｇｉ：１７４５５７１８］（Ｕｐｄａｔｅ Ｄａｔｅ：Ａｕｇ １ ２００２ ７：１０ＰＭ）として登録されている塩基配列に基づいて設計した、配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用した。鋳型として卵巣ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（ＢＤバイオサイエンスクロンテック社製）、酵素はＫＯＤ Ｐｌｕｓ（東洋紡）を用い、次の条件でＰＣＲを実施した：９５℃ ２分処理後、９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒および６８℃ ４分からなる工程を３５回行い、最後に６８℃ １０分処理した。得られた増幅産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ組み込んだ後、ＡＢＩ３１００（パーキンエルマー社製）により配列決定を行った。
(Acquisition of KIAA1157 gene and confirmation of PP2C activity)
<Materials and methods>
(Genetic acquisition)
In the public nucleotide database (DDBJ / EMBL / GenBank), the base sequence of KIAA1157 (XM_051093 [gi: 1745718] Update Date: Aug 1 2002 7:10 PM) is registered as a gene corresponding to probe sequence information in the microarray database. It was. Therefore, cDNA cloning of KIAA1157 was performed by PCR for sequence confirmation and expression vector construction. The primer was designed based on the nucleotide sequence registered as XM_051093 [gi: 17455518] (Update Date: Aug 1 2002 7:10 PM), and the oligonucleotide having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing and the arrangement thereof. Oligonucleotides having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8 in the column table were used as the sense primer and antisense primer, respectively. Ovarian QUICK-Clone cDNA (manufactured by BD Biosciences Clontech) was used as a template, and KOD Plus (Toyobo) was used as an enzyme, and PCR was carried out under the following conditions: 95 ° C. for 2 minutes, 94 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. 30 The process consisting of 1 second and 68 ° C. for 4 minutes was performed 35 times, and finally the treatment was performed at 68 ° C. for 10 minutes. The obtained amplification product was incorporated into a pCR4 Blunt-TOPO vector (Invitrogen) and then sequenced with ABI 3100 (Perkin Elmer).
取得したクローンの塩基配列は、ＫＩＡＡ１１５７の塩基配列（ＸＭ＿０５１０９３［ｇｉ：１７４５５７１８］ Ｕｐｄａｔｅ Ｄａｔｅ：Ａｕｇ １ ２００２ ７：１０ＰＭ）と一致した。なお、これ以外のすべての試験において、発現用ベクター構築に用いたＰＣＲ産物は全て配列決定により変異の有無を確認した。 The base sequence of the obtained clone matched the base sequence of KIAA1157 (XM — 051093 [gi: 1745718] Update Date: Aug 1 2002 7:10 PM). In all other tests, the PCR products used for constructing the expression vector were all confirmed for mutation by sequencing.
ＫＩＡＡ１１５７のコード領域の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。また、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる推定アミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。 The base sequence of the coding region of KIAA1157 is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The deduced amino acid sequence encoded by KIAA1157 is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
（ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質の調製）
ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる推定アミノ酸配列は、蛋白質脱リン酸化酵素の一種であるプロテインフォスファターゼ２Ｃファミリーと相同性を有していた。そこで、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質の脱リン酸化酵素活性を調べるため、同蛋白質とマルトース結合蛋白質（以下、ＭＢＰと略称する）との融合蛋白質を生産した。具体的には、上記のように取得したＫＩＡＡ１１５７を組み込んだｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターをＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理することにより遊離した断片を、同様に処理したｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ社製）と連結した。精製したベクターを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（インビトロジェン社製）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと０．２％グルコースを添加したＬＢ培地中３７℃で、波長６００ｎｍにおける吸光度（Ａ６００）が約０．５になるまで培養した後、３ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略称する）を用いて発現誘導し、３時間後に集菌した。菌体を精製緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと略称する）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュダイアグノティックス社製）を含んだ２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４）に懸濁し、超音波処理により破砕した。得られた細胞破砕液を遠心し、得られた上清からＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質をアミロースカラム（ＮＥＢ社製）を用いてプロトコールに従って精製した。得られた蛋白質をマイクロコンＹＭ−１０（ミリポア社製）で濃縮し、５０％までグリセロールを加え、−７０℃で保存した。この精製融合蛋白質を脱リン酸化アッセイに使用した。
(Preparation of protein encoded by KIAA1157)
The deduced amino acid sequence encoded by KIAA1157 had homology with the protein phosphatase 2C family, which is a kind of protein phosphatase. Therefore, in order to examine the phosphatase activity of the protein encoded by KIAA1157, a fusion protein of the protein and a maltose binding protein (hereinafter abbreviated as MBP) was produced. Specifically, a fragment released by treating the pCR4Blunt-TOPO vector incorporating KIAA1157 obtained as described above with BamHI and HindIII was similarly treated with pMAL-c2X (New England Biolabs, manufactured by NEB) and Connected. The absorbance (A600) at a wavelength of 600 nm of E. coli BL21 (DE3) (manufactured by Invitrogen) into which purified vector was introduced was 37 ° C. in LB medium supplemented with 100 μg / ml ampicillin and 0.2% glucose. After cultivating until 3 hours, expression was induced using 3 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (hereinafter abbreviated as IPTG), and the cells were collected after 3 hours. The cells are suspended in a purification buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4) containing a purification buffer (200 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter abbreviated as EDTA), and a protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics). Crushed by sonication. The obtained cell lysate was centrifuged, and the protein encoded by KIAA1157 was purified from the obtained supernatant using an amylose column (NEB) according to the protocol. The obtained protein was concentrated with Microcon YM-10 (Millipore), glycerol was added to 50%, and the mixture was stored at -70 ° C. This purified fusion protein was used in the dephosphorylation assay.
（低分子基質に対する脱リン酸化活性の測定）
ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質の脱リン酸化活性を、低分子基質ｐＮＰＰ（シグマ社製）を用いて測定した。本測定において脱リン酸化活性はｐＮＰＰからのｐ−ニトロフェノールの遊離により示される。
(Measurement of dephosphorylation activity for low molecular weight substrates)
The dephosphorylation activity of the protein encoded by KIAA1157 was measured using the low molecular weight substrate pNPP (manufactured by Sigma). In this measurement, the dephosphorylation activity is shown by the release of p-nitrophenol from pNPP.
脱リン酸化活性の測定は、具体的には、アッセイ緩衝液（２０ｍＭ ＫＣｌおよび２ｍＭ ジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと略称する）含有４０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８）に１μｇの融合蛋白質および５ｍＭ ｐＮＰＰを加えて３０℃で５分間インキュベーションした。遊離したｐ−ニトロフェノールは４０５ｎｍで測定した。 Specifically, the dephosphorylation activity was measured by adding 1 μg of fusion protein and 5 mM pNPP to assay buffer (20 mM KCl and 2 mM dithiothreitol (hereinafter abbreviated as DTT) -containing 40 mM Tris-HCl, pH 8). Incubated at 30 ° C. for 5 minutes. The liberated p-nitrophenol was measured at 405 nm.
ＰＰ２Ｃファミリーに属する酵素の脱リン酸化活性は金属イオン依存性を示すことが知られている。そこで、本測定において、金属イオンとして３０ｍＭ ＭｇＣｌ２あるいは１０ｍＭ ＭｎＣｌ２を図３−Ａに示したように添加し、脱リン酸化活性の金属イオン依存性を調べた。 It is known that the dephosphorylation activity of enzymes belonging to the PP2C family shows metal ion dependence. Therefore, in this measurement, 30 mM MgCl 2 or 10 mM MnCl 2 was added as a metal ion as shown in FIG. 3-A, and the metal ion dependence of dephosphorylation activity was examined.
ＰＰ１ファミリーやＰＰ２Ａファミリーに属する酵素は、その脱リン酸化活性がオカダ酸により阻害されることが知られている。一方、ＰＰ２Ｃファミリーに属する酵素の脱リン酸化活性はオカダ酸により阻害されない。そこで、本測定において、融合蛋白質０．５ｇおよび金属イオン（ＭｎＣｌ２）１０ｍＭを用い、ｐＮＰＰを基質として行った脱リン酸化反応にオカダ酸（シグマ社製）を１μＭ添加してその効果を調べた。 It is known that enzymes belonging to PP1 family and PP2A family are inhibited by okadaic acid in their dephosphorylation activity. On the other hand, the dephosphorylation activity of enzymes belonging to the PP2C family is not inhibited by okadaic acid. Therefore, in this measurement, 0.5 g of fusion protein and 10 mM of metal ion (MnCl 2) were used, and 1 μM of okadaic acid (manufactured by Sigma) was added to the dephosphorylation reaction performed using pNPP as a substrate, and the effect was examined. .
（蛋白質基質に対する脱リン酸化活性の測定）
蛋白質基質に対するＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質の脱リン酸化活性を、カゼインを用いて以下に示すように測定した。カゼイン（シグマ社製）をアッセイ緩衝液に溶解し、フリーのリン酸をＹＭ−１０膜により除去した。カゼイン４０μｇと上記融合蛋白質１μｇ、１０ｍＭの金属イオンを図３−Ｃに示したような組み合わせでアッセイ緩衝液に加え、３７℃で６０分間反応を行った。マラカイトグリーン（シグマ社製）を用い文献記載の方法（ファティー（Ｆａｔｈｉ，Ａ．Ｒ．）ら、「アナリティカルバイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００２年、第３１０巻、ｐ．２０８−２１４）により遊離したリン酸を検出し、遊離リン酸量を、濃度既知のリン酸溶液（Ｋ３ＰＯ４）を用いて作成した標準曲線に基づいて決定した。
(Measurement of dephosphorylation activity on protein substrate)
The dephosphorylation activity of the protein encoded by KIAA1157 against the protein substrate was measured using casein as shown below. Casein (Sigma) was dissolved in the assay buffer, and free phosphoric acid was removed with a YM-10 membrane. Casein 40 μg, the above fusion protein 1 μg, and 10 mM metal ions were added to the assay buffer in a combination as shown in FIG. 3-C and reacted at 37 ° C. for 60 minutes. According to a method described in the literature using Malachite Green (manufactured by Sigma) (Fatii, AR, et al., “Analytical Biochemistry”, 2002, 310, p. 208-214). The liberated phosphoric acid was detected, and the amount of free phosphoric acid was determined based on a standard curve created using a phosphoric acid solution (K 3 PO 4 ) with a known concentration.
（リン酸化ペプチドに対する脱リン酸化活性）
リン酸化ペプチドＰＲＡ−ｐＴ−ＶＡ、ＰＲＰ−ｐＴ−ＶＡおよびＲＲＡ−ｐＴ−ＰＡ（一般的なアミノ酸省略法に順ずる。ｐはリン酸を表す：東レリサーチセンターで合成）に対するＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質の脱リン酸化活性を、上記と同様に測定した。具体的には、アッセイ緩衝液に１μｇの上記融合蛋白質と０．５ｍＭのリン酸化ペプチド、および１０ｍＭの金属イオンを図３−Ｄに示したような組み合わせで加え、３７℃で１０分間反応を行い、基質としてカゼインを用いた場合と同様にマラカイトグリーンを用いて遊離リン酸量を定量した。
(Dephosphorylation activity for phosphorylated peptides)
Encoded by KIAA1157 for phosphorylated peptides PRA-pT-VA, PRP-pT-VA and RRA-pT-PA (in accordance with general amino acid abbreviations; p stands for phosphoric acid: synthesized at Toray Research Center) The protein dephosphorylation activity was measured in the same manner as described above. Specifically, 1 μg of the above fusion protein, 0.5 mM phosphorylated peptide, and 10 mM metal ion are added to the assay buffer in the combination shown in FIG. 3-D, and the reaction is performed at 37 ° C. for 10 minutes. The amount of free phosphate was quantified using malachite green as in the case of using casein as a substrate.
＜結果＞
ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質とＭＢＰとの融合蛋白質の脱リン酸化活性を上記各種基質を用いて測定した結果を図３−Ａ〜Ｄに示す。図３−Ａは該融合蛋白質の低分子基質ｐＮＰＰに対する脱リン酸化活性および該活性の金属イオン依存性を検討した結果を示す。図３−Ｂは、該融合蛋白質のｐＮＰＰに対する脱リン酸化活性に対するオカダ酸の効果を検討した結果を示す。図３−Ｃは、該融合蛋白質の蛋白質基質カゼインに対する脱リン酸化活性および該活性の金属イオン依存性を検討した結果を示す。図３−Ｄは、該融合蛋白質のリン酸化ペプチドに対する脱リン酸化活性および該活性の金属イオン依存性を検討した結果を示す。
<Result>
The result of having measured the dephosphorylation activity of the fusion protein of the protein coded by KIAA1157 and MBP using the said various substrate is shown to FIG. FIG. 3-A shows the results of examining the dephosphorylation activity of the fusion protein for the low molecular weight substrate pNPP and the metal ion dependence of the activity. FIG. 3-B shows the results of examining the effect of okadaic acid on the dephosphorylation activity of the fusion protein for pNPP. FIG. 3C shows the results of examining the dephosphorylation activity of the fusion protein for the protein substrate casein and the metal ion dependence of the activity. FIG. 3-D shows the results of examining the dephosphorylation activity of the fusion protein on the phosphorylated peptide and the metal ion dependence of the activity.
図３−Ａに示すように、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質とＭＢＰとの融合蛋白質は、ｐＮＰＰを基質とした場合、金属イオン（Ｍｎ２＋）依存性の脱リン酸化活性を示した。また、本融合蛋白質による脱リン酸化反応は、オカダ酸により全く阻害されなかった（図３−Ｂ）。 As shown in FIG. 3-A, the fusion protein of the protein encoded by KIAA1157 and MBP showed a metal ion (Mn 2+ ) -dependent dephosphorylation activity when pNPP was used as a substrate. Moreover, the dephosphorylation reaction by this fusion protein was not inhibited at all by okadaic acid (FIG. 3-B).
ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質とＭＢＰとの融合蛋白質が金属イオン依存的に脱リン酸化活性を示し、オカダ酸に対して非感受性であること、さらにＭＢＰが脱リン酸化活性を有さないことから、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質はＰＰ２Ｃファミリーに属する脱リン酸化酵素であると考えることができる。 Because the fusion protein of the protein encoded by KIAA1157 and MBP shows dephosphorylation activity in a metal ion-dependent manner, is insensitive to okadaic acid, and MBP has no dephosphorylation activity. The protein encoded by KIAA1157 can be considered as a phosphatase belonging to the PP2C family.
さらに、図３−Ｃに示したように、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質とＭＢＰとの融合蛋白質は蛋白質基質カゼインに対しても金属イオン（Ｍｇ２＋）依存性の脱リン酸化活性を示した。 Furthermore, as shown in FIG. 3-C, the fusion protein of the protein encoded by KIAA1157 and MBP also showed metal ion (Mg 2+ ) -dependent dephosphorylation activity against the protein substrate casein.
また、図３−Ｄに示すように、本融合蛋白質はリン酸化ペプチドＰＲＡ−ｐＴ−ＶＡおよびＰＲＰ−ｐＴ−ＶＡも基質として認識し、金属イオン（Ｍｎ２＋およびＭｇ２＋）依存的に脱リン酸化することが示された。一方、本融合蛋白質はＲＲＡ−ｐＴ−ＰＡを脱リン酸化せず、配列特異的な脱リン酸化活性を示した。 As shown in FIG. 3-D, the fusion protein also recognizes phosphorylated peptides PRA-pT-VA and PRP-pT-VA as substrates, and dephosphorylates in a metal ion (Mn 2+ and Mg 2+ ) -dependent manner. Was shown to do. On the other hand, this fusion protein did not dephosphorylate RRA-pT-PA and showed sequence-specific dephosphorylation activity.
以上の結果から、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質は低分子人工基質（ｐＮＰＰ）、蛋白質（カゼイン）およびペプチド等の全てを基質とする、ＰＰ２Ｃファミリーに属する酵素であることが示された。 From the above results, it was shown that the protein encoded by KIAA1157 is an enzyme belonging to the PP2C family using all of low molecular weight artificial substrate (pNPP), protein (casein), peptide and the like as substrates.
（ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質と相互作用する蛋白質の探索）
ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質の生体内での基質を見出すため、細胞内で該蛋白質と相互作用する蛋白質を探索した。
(Search for proteins that interact with the protein encoded by KIAA1157)
In order to find a substrate in vivo of a protein encoded by KIAA1157, a protein that interacts with the protein in cells was searched.
＜材料と方法＞
（ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質と相互作用する蛋白質の同定）
まず、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質の哺乳類細胞発現用ベクターを構築した。上記の大腸菌発現用ベクターで使用した、ＫＩＡＡ１１５７を含むＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を鋳型とし、配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１０に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用い、ＫＯＤ Ｐｌｕｓを酵素として使用し、次の条件でＰＣＲ反応を実施した：９４℃ ２分処理後、９４℃ ３０秒および６８℃ ４分からなる工程を４０回行い、最後に６８℃ ３分処理した。得られた増幅産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターへ組み込んだ後、配列を確認した。精製したベクターのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＦＬＡＧタグ付加発現ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社製）に組み込み、哺乳類細胞発現用ベクターとして用いた。このベクターあるいは空ベクター４μｇを、１０ｃｍプレートで培養した２９３細胞に、リポフェクタミン（インビトロジェン社製）を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入４８時間後、氷上にて、溶解緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮＰ−４０およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュダイアグノティックス社製）含有５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．４）で細胞を１時間処理した。細胞溶解液を遠心処理して得られた上清を、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略称する）で処理したマウスＩｇＧアガロースビーズ（シグマ社製）と４℃で一晩接触させた。上清をさらに抗ＦＬＡＧ抗体アガロースビーズ（シグマ社製）と４℃で３時間反応させ、その後、該アガロースビーズを洗浄緩衝液（阻害剤カクテルを含まない上記溶解緩衝液）で３回、洗浄緩衝液からＮＰ−４０を除いた緩衝液で１回洗浄した。次いで、アガロースビーズを１０％ ２−メルカプトエタノール（以下、２−ＭＥと略称する）添加ＳＤＳサンプル緩衝液中で５分間熱処理し、回収された蛋白質を４／２％ ＳＤＳゲル（第一化学薬品社製）による電気泳動に供試した。泳動後、ゲルをクマジーブリリアントブルー（以下、ＣＢＢと略称する、ナカライ社製）染色し、対照細胞（空ベクターを導入した細胞）とＫＩＡＡ１１５７を導入した細胞のレーンのバンドパターンを比較し、ＫＩＡＡ１１５７を導入した細胞に特異的なバンドを切り出し、３７℃で一晩ゲル内トリプシン（プロメガ社製）消化を行った。生成したペプチド混合物をＭａｇｉｃ２００２ナノフローＨＰＬＣ（Ｍｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｉｎｃ．製）とＬＣＱ Ｄｅｃａ ＸＰ ＭＡＸイオントラップマス分析機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）から成るＬＣ−ＭＳ／ＭＳ装置により分析した。全てのＭＳ／ＭＳスペクトルについて、蛋白質同定のため、Ｍａｓｃｏｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いてＮＣＢＩｎｒとＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔデータベースに対し自動検索を行った。
<Materials and methods>
(Identification of the protein that interacts with the protein encoded by KIAA1157)
First, a mammalian cell expression vector for a protein encoded by KIAA1157 was constructed. Using the BamHI-HindIII fragment containing KIAA1157 used as a template for the E. coli expression vector described above as a template, an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 PCR reaction was carried out under the following conditions using KOD Plus as an enzyme, respectively as a sense primer and an antisense primer: 94 ° C. for 2 minutes, followed by 40 steps of 94 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 4 minutes Finally, it was treated at 68 ° C. for 3 minutes. After the obtained amplification product was incorporated into the pCR4 Blunt-TOPO vector, the sequence was confirmed. The purified BamHI-HindIII fragment of the purified vector was incorporated into a FLAG-tagged expression vector pCMV-Tag4 (Stratagen) and used as a mammalian cell expression vector. 4 μg of this vector or empty vector was introduced into 293 cells cultured on a 10 cm plate using Lipofectamine (Invitrogen). 48 hours after gene introduction, lysis buffer (300 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 and protease inhibitor cocktail (manufactured by Roche Diagnostics) containing 50 mM Tris-HCl, pH 7.4) on ice was used. Cells were treated for 1 hour. The supernatant obtained by centrifuging the cell lysate was contacted overnight at 4 ° C. with mouse IgG agarose beads (manufactured by Sigma) treated with bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA). The supernatant was further reacted with anti-FLAG antibody agarose beads (manufactured by Sigma) at 4 ° C. for 3 hours, and then the agarose beads were washed three times with a washing buffer (the above lysis buffer containing no inhibitor cocktail). The solution was washed once with a buffer obtained by removing NP-40. Subsequently, the agarose beads were heat-treated for 5 minutes in SDS sample buffer containing 10% 2-mercaptoethanol (hereinafter abbreviated as 2-ME), and the recovered protein was converted into 4/2% SDS gel (Daiichi Chemical Co., Ltd.). Were subjected to electrophoresis. After the electrophoresis, the gel was stained with Coomassie brilliant blue (hereinafter abbreviated as CBB, manufactured by Nacalai), and the lane band patterns of the control cells (cells into which the empty vector was introduced) and the cells into which KIAA1157 had been introduced were compared. A band specific to the cells into which was introduced was excised and digested in gel with trypsin (Promega) overnight at 37 ° C. The resulting peptide mixture was analyzed by an LC-MS / MS apparatus consisting of Magic2002 nanoflow HPLC (manufactured by Mchrom Bioresources Inc.) and an LCQ Deca XP MAX ion trap mass analyzer (manufactured by Thermo Electron Corporation). All the MS / MS spectra were automatically searched against NCBInr and Swiss Prot databases using Mascot Program (Matrix Science) for protein identification.
（ＫＩＡＡ１１５７とＣＳＥ１Ｌの結合：解析１）
ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質とＣＳＥ１Ｌの相互作用を確認するため、ＫＩＡＡ１１５７の一過性発現による免疫沈降実験を行った。この実験には、ＫＩＡＡ１１５７発現ベクターの他、ＫＩＡＡ１１５７ドミナントネガティブ変異体発現ベクターを使用した。
(Binding of KIAA1157 and CSE1L: Analysis 1)
In order to confirm the interaction between the protein encoded by KIAA1157 and CSE1L, an immunoprecipitation experiment by transient expression of KIAA1157 was performed. In this experiment, KIAA1157 dominant negative mutant expression vector was used in addition to KIAA1157 expression vector.
ＫＩＡＡ１１５７ドミナントネガティブ変異体は、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質の活性基に変異を導入したドミナントネガティブ変異体（不活性変異体）である。ＰＰ２Ｃαの第２３９番目のアスパラギン酸をアラニンに変換すると活性が消失することが知られており（オフェク（Ｏｆｅｋ，Ｐ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００３年、第２７８巻、ｐ．１４２９９−１４３０５）、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質でこのアスパラギン酸と等価なのは第４３７番目のアスパラギン酸である。そこで、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質の第４３７番目のアスパラギン酸をアラニンに置換することでドミナントネガティブ変異体を得られると考えた。 The KIAA1157 dominant negative mutant is a dominant negative mutant (inactive mutant) in which a mutation is introduced into the active group of the protein encoded by KIAA1157. It is known that the activity is lost when the 239th aspartic acid of PP2Cα is converted to alanine (Ofek, P. et al., “The Journal of Biological Chemistry”, 2003). 278th, p. 14299-14305), the protein encoded by KIAA1157 is equivalent to this aspartic acid is the 437th aspartic acid. Therefore, it was considered that a dominant negative mutant can be obtained by substituting alanine for the 437th aspartic acid of the protein encoded by KIAA1157.
ＫＩＡＡ１１５７ドミナントネガティブ変異体をコードするＫＩＡＡ１１５７変異体をドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７と称し、変異を導入していないＫＩＡＡ１１５７を野生型ＫＩＡＡ１１５７と称することがある。 A KIAA1157 mutant that encodes a KIAA1157 dominant negative mutant may be referred to as a dominant negative KIAA1157, and a KIAA1157 that has not been mutated may be referred to as a wild type KIAA1157.
ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質の第４３７番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したドミナントネガティブ変異体は、次のような手順で作成した。上記の、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ ベクターにＫＩＡＡ１１５７断片を組み込んだベクターを鋳型とし、配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマーおよびアンチプライマーとして用い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社製）を用いて、次の条件でＰＣＲを実施した：９５℃ １分処理後、９５℃ ５０秒、６０℃ ５０秒および６８℃ １６分からなる工程を１８回行い、最後に６８℃ ７分処理した。増幅産物は、その配列を確認後、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化した。得られた断片を鋳型として配列表の配列番号１３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマーおよびアンチプライマーとして用い、ＫＯＤ Ｐｌｕｓを酵素として用いて次の条件でＰＣＲを実施した：９４℃ ２分処理後、９４℃ ３０秒および６８℃ ４分からなる工程を４０回行い、最後に６８℃ ３分処理した。得られた増幅産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターに組み込んだ。配列確認後、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＣＭＶ−Ｔａｇ４に組み込み、ドミナントネガティブ変異体発現用ベクターとして用いた。このように変異を導入したＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質は、大腸菌で発現・精製して、脱リン酸化活性を失っていることを確認した（実施例５参照）。 A dominant negative mutant in which the 437th aspartic acid in the protein encoded by KIAA1157 was substituted with alanine was prepared by the following procedure. Using the above-described vector in which the KIAA1157 fragment is incorporated into the pCR4Blunt-TOPO vector as a template, the oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and the oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 are sense primers, respectively. PCR was performed under the following conditions using QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (manufactured by Stratagen), using as an anti-primer: 95 ° C. for 1 minute, 95 ° C. for 50 seconds, 60 ° C. for 50 seconds and 68 ° C. The process consisting of 16 minutes was performed 18 times, and finally treated at 68 ° C. for 7 minutes. The amplified product was digested with BamHI and NotI after confirming its sequence. Using the obtained fragment as a template, the oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and the oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 as the sense primer and anti-primer, respectively, and KOD Plus as the enzyme PCR was carried out under the following conditions: 94 ° C for 2 minutes, followed by 40 steps of 94 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 4 minutes, and finally 68 ° C for 3 minutes. The obtained amplification product was incorporated into a pCR4 Blunt-TOPO vector. After sequence confirmation, the BamHI-HindIII fragment was incorporated into pCMV-Tag4 and used as a dominant negative mutant expression vector. The protein encoded by KIAA1157 thus introduced with a mutation was expressed and purified in E. coli, and it was confirmed that it had lost its dephosphorylation activity (see Example 5).
１０ｃｍプレートで培養した２９３細胞に、空ベクター、あるいは野生型またはドミナントネガティブ型のＫＩＡＡ１１５７発現用ベクター４μｇをリポフェクタミンを用いて遺伝子導入した。４８時間後に細胞を回収し、０．６ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略称する）溶解緩衝液（０．１％ ＮＰ−４０およびプロテアーゼ阻害剤カクテル含有ＰＢＳ）で氷冷下処理し、細胞溶解液を遠心処理して上清を得た。得られた上清を抗ＦＬＡＧ抗体アガロースビーズと４℃で３時間以上反応させた。該アガロースビーズを０．１％ ＮＰ−４０含有ＰＢＳで３回、ＰＢＳで１回洗浄した後、１０％ ２−ＭＥ添加ＳＤＳサンプル緩衝液中、５分間熱処理した。回収された蛋白質を４／２０％ ＳＤＳゲル（第一化学薬品社製）電気泳動に供し、さらに抗ＣＳＥ１Ｌ抗体（１：１０００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）でウェスタン分析を行った。 A 293 cell cultured on a 10 cm plate was transfected with 4 μg of an empty vector or a wild type or dominant negative type KIAA1157 expression vector using lipofectamine. After 48 hours, the cells were collected and treated with 0.6 ml phosphate buffered saline (hereinafter abbreviated as PBS) lysis buffer (PBS containing 0.1% NP-40 and protease inhibitor cocktail) under ice cooling. The cell lysate was centrifuged to obtain a supernatant. The obtained supernatant was reacted with anti-FLAG antibody agarose beads at 4 ° C. for 3 hours or more. The agarose beads were washed 3 times with PBS containing 0.1% NP-40 and once with PBS, and then heat-treated in SDS sample buffer containing 10% 2-ME for 5 minutes. The recovered protein was subjected to 4/20% SDS gel (Daiichi Chemicals Co., Ltd.) electrophoresis, and further Western analysis was performed with an anti-CSE1L antibody (1: 1000, BD Biosciences).
（ＫＩＡＡ１１５７とＣＳＥ１Ｌの結合：解析２）
ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質とＣＳＥ１Ｌの相互作用を確認するため、ＫＩＡＡ１１５７の一過性発現による免疫沈降実験を、ＫＩＡＡ１１５７発現ベクターおよびＣＳＥ１Ｌ発現ベクターを使用して行った。
(Binding of KIAA1157 and CSE1L: Analysis 2)
In order to confirm the interaction between the protein encoded by KIAA1157 and CSE1L, an immunoprecipitation experiment by transient expression of KIAA1157 was performed using the KIAA1157 expression vector and the CSE1L expression vector.
ＫＩＡＡ１１５７発現ベクターは、上記作成したベクターを用いた。 As the KIAA1157 expression vector, the vector prepared above was used.
ＣＳＥ１Ｌ発現用ベクターを構築するために、配列表の配列番号１５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマーおよびアンチプライマーとして用い、卵巣ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用い、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは次の条件でを実施した：９５℃ ２分処理後、９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒および６８℃ ４分からなる工程を３５回行い、最後に６８℃ １０分処理した。得られた増幅産物を、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターへ組み込み、配列を確認後、ｐＣＩ−５´ＨＡ（ｐＣＩベクター（プロメガ社製）の５´末端にヘマグルチニンタグを付加したもの）のＮｈｅＩ−ＮｏｔＩ部位へ組み込み、ＣＳＥ１Ｌ発現用ベクターを構築した。 In order to construct a CSE1L expression vector, an ovarian QUICK was prepared using an oligonucleotide consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15 and an oligonucleotide consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 16 as a sense primer and an anti-primer, respectively. -PCR was performed using KOD Plus (Toyobo Co., Ltd.) using Clone cDNA as a template. PCR was performed under the following conditions: 95 ° C. for 2 minutes, followed by 35 steps of 94 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 4 minutes, and finally 68 ° C. for 10 minutes. The obtained amplification product was incorporated into the pCR4Blunt-TOPO vector, and after confirming the sequence, it was transferred to the NheI-NotI site of pCI-5′HA (having a hemagglutinin tag added to the 5 ′ end of pCI vector (Promega)). A CSE1L expression vector was constructed.
ＫＩＡＡ１１５７発現ベクター、ＣＳＥ１Ｌ発現用ベクター、およびそれらに対応する空ベクターを図４−Ｃに表示した組み合わせで、１０ｃｍプレートで培養した２９３細胞へリポフェクタミンにより遺伝子導入し、上記の方法に準じて抗ＨＡ抗体アガロースビーズ（シグマ社製）による免疫沈降を行い、抗ＦＬＡＧ抗体（１：８００、シグマ社製）で回収蛋白質のウェスタン分析を行った。 A KIAA1157 expression vector, a CSE1L expression vector, and a corresponding empty vector were introduced into 293 cells cultured on a 10 cm plate by lipofectamine in the combination shown in FIG. 4-C, and anti-HA antibody was applied according to the above method Immunoprecipitation was performed with agarose beads (manufactured by Sigma), and Western analysis of the recovered protein was performed with an anti-FLAG antibody (1: 800, manufactured by Sigma).
＜結果＞
ＫＩＡＡ１１５７を導入した細胞で検出された特異的なバンドに対応する蛋白質を、該バンドを切り出して調製したペプチド混合物のマススペクトル分析により解析した結果、該蛋白質としてＨｓｐ７０及びＣＳＥ１Ｌが同定された（図４−Ａ）。Ｈｓｐ７０はチャペロン蛋白質であり、大量発現した組み換え蛋白質全般と非特異的に結合する蛋白質である。一方、ＣＳＥ１ＬはＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質と特異的に結合する蛋白質であると考えることができる。ＣＳＥ１Ｌは細胞周期、アポトーシスおよび増殖に関与した遺伝子として知られている（非特許文献３）。
<Result>
As a result of analyzing a protein corresponding to a specific band detected in a cell into which KIAA1157 had been introduced by mass spectrum analysis of a peptide mixture prepared by cutting out the band, Hsp70 and CSE1L were identified as the proteins (FIG. 4). -A). Hsp70 is a chaperone protein, and is a protein that binds nonspecifically to all recombinant proteins expressed in large quantities. On the other hand, CSE1L can be considered as a protein that specifically binds to the protein encoded by KIAA1157. CSE1L is known as a gene involved in cell cycle, apoptosis and proliferation (Non-patent Document 3).
また、ＫＩＡＡ１１５７発現ベクターおよびＫＩＡＡ１１５７ドミナントネガティブ変異体発現ベクターをそれぞれ導入した細胞を用いた免疫沈降実験において、内在性のＣＳＥ１Ｌが、野生型およびドミナントネガティブ型、どちらのＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質によっても共沈殿された（図４−Ｂ）。本結果により、上記マススペクトル分析による結果が確認された。 Further, in an immunoprecipitation experiment using cells into which KIAA1157 expression vector and KIAA1157 dominant negative mutant expression vector were introduced, endogenous CSE1L was co-expressed by both wild type and dominant negative type proteins encoded by KIAA1157. It was precipitated (FIG. 4-B). From this result, the result of the mass spectrum analysis was confirmed.
さらに、ＫＩＡＡ１１５７発現ベクター、ＣＳＥ１Ｌ発現用ベクター、およびそれらに対応する空ベクターを様々に組み合わせて導入した細胞を用いた免疫沈降実験において、組み換え型ＣＳＥ１Ｌにより、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質が共沈殿された（図４−Ｃ）。 Furthermore, in an immunoprecipitation experiment using cells into which KIAA1157 expression vector, CSE1L expression vector, and empty vectors corresponding to them were introduced in various combinations, the protein encoded by KIAA1157 was co-precipitated by recombinant CSE1L. (FIG. 4-C).
以上の結果により、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質は細胞内でＣＳＥ１Ｌと結合することが示された。また、ドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質は脱リン酸化反応を有さないがＣＳＥ１Ｌと結合することが示された。 From the above results, it was shown that the protein encoded by KIAA1157 binds to CSE1L in cells. It was also shown that the protein encoded by dominant negative KIAA1157 does not have a dephosphorylation reaction but binds to CSE1L.
（ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質によるＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化反応）
＜材料と方法＞
ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質が、細胞内でＣＳＥ１Ｌに結合することが明らかになった（実施例４参照）。そこで、さらに同蛋白質がＣＳＥ１Ｌを脱リン酸化するかどうかを調べた。
(Dephosphorylation of CSE1L by the protein encoded by KIAA1157)
<Materials and methods>
It was revealed that the protein encoded by KIAA1157 binds to CSE1L in cells (see Example 4). Therefore, it was further investigated whether the same protein dephosphorylates CSE1L.
まず、野生型ＫＩＡＡ１１５７を遺伝子導入した細胞と、ドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７を遺伝子導入した細胞とを用い、これらの細胞における内在性ＣＳＥ１Ｌのリン酸化をＳＤＳゲル電気泳動におけるＣＳＥ１Ｌの移動度の変化を検出することにより測定した。具体的には、６穴プレートで培養した２９３細胞へ空ベクター、あるいは野生型またはドミナントネガティブ型のＫＩＡＡ１１５７発現用ベクター１μｇをリポフェクタミンにより遺伝子導入した。４８時間後に細胞を収穫し、Ｔ溶解緩衝液（実施例４で用いたＰＢＳ溶解緩衝液の０．１％ ＮＰ−４０を１％ ＴｒｉｔｏｎＸと替えたもの）に溶解し、ＳＤＳサンプル緩衝液中、還元下で熱処理して７．５％ ＳＤＳゲル電気泳動を行った。その後、抗ＣＳＥ１Ｌ抗体でウェスタン分析を行った。 First, using cells transfected with wild-type KIAA1157 and cells transfected with dominant-negative KIAA1157, the phosphorylation of endogenous CSE1L in these cells is detected by a change in mobility of CSE1L in SDS gel electrophoresis. Was measured. Specifically, 293 cells cultured in a 6-well plate were transfected with 1 μg of an empty vector or wild-type or dominant-negative KIAA1157 expression vector using lipofectamine. After 48 hours, the cells were harvested, lysed in T lysis buffer (PBS lysis buffer 0.1% NP-40 used in Example 4 was replaced with 1% Triton X), and in SDS sample buffer, 7.5% SDS gel electrophoresis was performed after heat treatment under reduction. Thereafter, Western analysis was performed with anti-CSE1L antibody.
次に、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質によるＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を試験管内で直接的に検討した。 Next, the dephosphorylation of CSE1L by the protein encoded by KIAA1157 was directly examined in vitro.
（ＣＳＥ１Ｌの調製）
１０ｃｍプレートで培養した２９３細胞に、実施例２で調製したＣＳＥ１Ｌ発現用ベクターをリポフェクタミンにより遺伝子導入し、４８時間後、細胞をキナーゼ溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で溶解した。細胞溶解液を遠心処理し、得られた上清を抗ＨＡ抗体アガロースビーズと４℃で一晩反応させた。次いで、該アガロースビーズをキナーゼ溶解緩衝液で３回洗浄し、ビーズ上に吸着したＨＡタグ付加ＣＳＥ１Ｌを直接実験に使用した。
(Preparation of CSE1L)
The CSE1L expression vector prepared in Example 2 was transfected into 293 cells cultured in a 10 cm plate using lipofectamine, and 48 hours later, the cells were lysed with a kinase lysis buffer (manufactured by Cell Signaling Technology). The cell lysate was centrifuged, and the resulting supernatant was reacted with anti-HA antibody agarose beads at 4 ° C. overnight. The agarose beads were then washed 3 times with kinase lysis buffer and HA-tagged CSE1L adsorbed on the beads was used directly in the experiment.
（ドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質の調製）
実施例２に記載した方法で、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いてＫＩＡＡ１１５７に変異を導入した。得られた遺伝子の配列を解析して所望の変異が導入されていることを確認した。その後、変異が導入された遺伝子を含むｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターから野生型の場合と同様にしてＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取り出しｐＭＡＬ−ｃ２Ｘに組み込んだ。このベクターを用い、野生型の場合と同様にして、ドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質を大腸菌培養により調製した。実施例２に記載した方法でｐＮＰＰを基質として脱リン酸化活性をアッセイした場合、該変異導入蛋白質は活性をもたないことを確認した（データは示さず）。
(Preparation of protein encoded by dominant negative KIAA1157)
Mutations were introduced into KIAA1157 using the QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit by the method described in Example 2. The sequence of the obtained gene was analyzed to confirm that the desired mutation was introduced. Thereafter, a BamHI-HindIII fragment was taken out from the pCR4Blunt-TOPO vector containing the gene into which the mutation was introduced in the same manner as in the wild type, and incorporated into pMAL-c2X. Using this vector, a protein encoded by dominant negative KIAA1157 was prepared by culturing E. coli in the same manner as in the wild type. When dephosphorylation activity was assayed using pNPP as a substrate by the method described in Example 2, it was confirmed that the mutagenized protein had no activity (data not shown).
上記のＣＳＥ１Ｌが吸着したビーズと５μｇの野生型またはドミナントネガティブ型のＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質とを、１５ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＤＴＴおよび１５ｍＭ Ｍｇ２＋含有３０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）中３７℃で適宜振盪しながらインキュベーションした。１時間後、ビーズを遠心処理して上清を除去し、さらに１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）で洗浄した後、１０％ ２−ＭＥを含むＳＤＳサンプル緩衝液中で熱処理することによりＣＳＥ１Ｌを溶出した。次に、溶出液を７．５％ ＳＤＳ電気泳動に供し、ＣＢＢ染色によりＣＳＥ１Ｌの移動度変化を観察した。 The above-mentioned beads adsorbed with CSE1L and 5 μg of the protein encoded by wild-type or dominant-negative KIAA1157 were appropriately shaken at 37 ° C. in 30 mM Tris-HCl (pH 8) containing 15 mM KCl, 1.5 mM DTT and 15 mM Mg 2+. Incubation. After 1 hour, the beads were centrifuged to remove the supernatant, further washed with 150 mM NaCl-containing 20 mM Tris-HCl (pH 8), and then heat-treated in SDS sample buffer containing 10% 2-ME to obtain CSE1L. Eluted. Next, the eluate was subjected to 7.5% SDS electrophoresis, and the change in mobility of CSE1L was observed by CBB staining.
＜結果＞
図５−Ａに示したように、野生型ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質を細胞内に発現させると、内在性ＣＳＥ１Ｌのゲル上での移動度が上昇した。一方、ドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７を発現させても内在性ＣＳＥ１Ｌのゲル上での移動度に変化が認められなかった。
<Result>
As shown in FIG. 5-A, when the protein encoded by wild-type KIAA1157 was expressed in cells, the mobility of endogenous CSE1L on the gel increased. On the other hand, even when dominant negative KIAA1157 was expressed, no change was observed in the mobility of endogenous CSE1L on the gel.
一般的に、蛋白質を脱リン酸化した場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での移動度は上昇する。したがって、この結果は、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質が細胞内でＣＳＥ１Ｌを脱リン酸化することを支持するものである。 Generally, when a protein is dephosphorylated, the mobility on an SDS-PAGE gel increases. Thus, this result supports that the protein encoded by KIAA1157 dephosphorylates CSE1L in the cell.
さらに、図５−Ｂに示したように、野生型ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質により試験管内で処理したＣＳＥ１Ｌは、ドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質で処理したＣＳＥ１Ｌ、あるいは対照（無処理）のＣＳＥ１Ｌと比較して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける移動度が増加し、かつＣＢＢ染色の強度が増強した。 Further, as shown in FIG. 5-B, CSE1L treated in vitro with a protein encoded by wild-type KIAA1157 is different from CSE1L treated with a protein encoded by dominant-negative KIAA1157, or a control (no treatment). Compared to CSE1L, the mobility in SDS-PAGE increased and the intensity of CBB staining was enhanced.
移動度の増加は細胞内での反応同様、ＣＳＥ１Ｌの脱リン酸化を支持するものである。また、ＣＢＢは陰性色素であり、蛋白質の陽性部分、すなわちアルギニンやリジン基と結合することが知られている（タル（Ｔａｌ，Ｍ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９８５年、第２６０巻、ｐ．９９７６−９９８０）。逆に、蛋白質中にリン酸のような強陰性の部分があると反発によりＣＢＢの蛋白質への結合が減弱すると考えられる。すなわち、野生型ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質で処理したＣＳＥ１ＬのＣＢＢ染色の強度が増したのは、脱リン酸化によりＣＳＥ１Ｌの陰性度が減じたことにより、陰性化合物ＣＢＢが結合し易くなったことに起因すると考えられる。本結果は、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質が試験管内でＣＳＥ１Ｌを脱リン酸化することを支持するものである。 The increase in mobility supports the dephosphorylation of CSE1L as well as the intracellular reaction. CBB is a negative dye and is known to bind to a positive part of a protein, that is, arginine or lysine group (Tal, M. et al., “The Journal of Biological Chemistry (The Journal of Biological Chemistry). Chemistry) ", 1985, 260, pp. 9976-9980). Conversely, if there is a strong negative part such as phosphate in the protein, it is thought that the binding of CBB to the protein is attenuated due to repulsion. That is, the intensity of CBB staining of CSE1L treated with the protein encoded by wild-type KIAA1157 increased because the negative degree of CSE1L decreased due to dephosphorylation, so that the negative compound CBB was easily bound. It is thought to be caused. This result supports that the protein encoded by KIAA1157 dephosphorylates CSE1L in vitro.
上記結果から、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質は、細胞内および試験管内のどちらにおいてもＣＳＥ１Ｌを基質として認識し、その脱リン酸化を触媒することが明らかになった。 The above results revealed that the protein encoded by KIAA1157 recognizes CSE1L as a substrate and catalyzes its dephosphorylation both in cells and in vitro.
（ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質の細胞死に対する効果）
ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質が、ＣＳＥ１Ｌに結合することおよびＣＳＥ１Ｌを脱リン酸化することが明らかになった（実施例４および５参照）。
(Effect of protein encoded by KIAA1157 on cell death)
It was found that the protein encoded by KIAA1157 binds to CSE1L and dephosphorylates CSE1L (see Examples 4 and 5).
ＣＳＥ１Ｌはアポトーシスに必須の蛋白質であるが、通常は細胞質に存在し、脱リン酸化により核内へ移行しその機能を発揮すると考えられている（非特許文献３）。もしＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質が実際にＣＳＥ１Ｌの細胞内機能を制御しているなら、野生型ＫＩＡＡ１１５７の大量発現によるアポトーシス促進、あるいはドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７の大量発現によるアポトーシス抑制がみられるはずである。そこで、２種類の制癌剤によりアポトーシスを誘起した条件下で、ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質を発現させ、該蛋白質のアポトーシスに対する効果を検討した。 CSE1L is a protein essential for apoptosis, but is usually present in the cytoplasm, and is considered to move into the nucleus by dephosphorylation and exert its function (Non-patent Document 3). If the protein encoded by KIAA1157 actually controls the intracellular function of CSE1L, apoptosis should be promoted by overexpression of wild type KIAA1157 or suppressed by overexpression of dominant negative KIAA1157. Therefore, under the conditions in which apoptosis was induced by two kinds of anticancer agents, a protein encoded by KIAA1157 was expressed, and the effect of the protein on apoptosis was examined.
＜材料と方法＞
６ｃｍプレート中のＨｅＬａ細胞に、２μｇの空ベクター、あるいは野生型もしくはドミナントネガティブ型のＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質発現用ベクターと、０．５μｇの対照用ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ＬａｃＺ、インビトロジェン）とをリポフェクタミンにより遺伝子導入し、次の日、細胞数４×１０４／ウェルで１２ウェルプレートに撒きなおした（３連または４連）。２４時間後、薬剤を加えてさらに２４時間培養した後、細胞をＰＢＳで２回洗浄して浮遊細胞（死細胞）を除去し、残存細胞（生細胞）中の ガラクトシダーゼ活性を ガラクトシダーゼエンザイムアッセイシステム（プロメガ社製）により測定した。細胞生存率は、薬剤処理細胞のガラクトシダーゼ活性を対照（薬剤無処理）細胞のガラクトシダーゼ活性で除した値で表した。アポトーシスを誘起する薬剤として、スタウロスポリンおよびタキソールを用いた。
<Materials and methods>
HeLa cells in a 6 cm plate were mixed with 2 μg of an empty vector, or a protein expression vector encoded by wild type or dominant negative type KIAA1157, and 0.5 μg of a control vector (pcDNA3.1 / myc-His / LacZ, Invitrogen) was transfected with lipofectamine, and the following day, cells were repopulated into 12-well plates at 4 × 10 4 cells / well (triplicate or quadruplicate). After 24 hours, the drug was added and the cells were further cultured for 24 hours. The cells were washed twice with PBS to remove floating cells (dead cells), and the galactosidase activity in the remaining cells (live cells) was determined using the galactosidase enzyme assay system ( Measured by Promega). The cell viability was expressed as a value obtained by dividing the galactosidase activity of drug-treated cells by the galactosidase activity of control (no drug-treated) cells. Staurosporine and taxol were used as drugs that induce apoptosis.
＜結果と考察＞
図６−Ａに示したように、空ベクターあるいは野生型ＫＩＡＡ１１５７発現用ベクターを導入した細胞に比し、ドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７発現用ベクターを導入した細胞はスタウロスポリンに対して抵抗性を示し、その生存率は増加した。同様に、タキソールで細胞死を誘導した場合にも、ドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７発現用ベクターを導入した細胞は、空ベクターあるいは野生型ＫＩＡＡ１１５７発現用ベクターを導入した細胞に比し、高い生存率を示した（図６−Ｂ）。
<Results and discussion>
As shown in FIG. 6-A, the cells introduced with the dominant negative KIAA1157 expression vector showed resistance to staurosporine, compared to the cells introduced with the empty vector or the wild type KIAA1157 expression vector. Its survival rate increased. Similarly, when cell death was induced with taxol, cells introduced with the dominant negative KIAA1157 expression vector showed a higher survival rate than cells transfected with the empty vector or the wild type KIAA1157 expression vector. (FIG. 6-B).
ＣＳＥ１Ｌは脱リン酸化により核内に移行し、その機能（例えば細胞死誘導）を発揮することが知られている。上記のように、癌細胞におけるドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７の発現により、該細胞をスタウロスポリンおよびタキソールのいずれの制癌剤で処理した場合でも、該制癌剤による細胞死の減弱が認められた。スタウロスポリンおよびタキソールは作用機序が異なる制癌剤であることから、両制癌剤による細胞死の減弱は、薬剤特異的な作用ではなく、ドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７の発現による細胞周期の遅滞に起因すると考えられる。 It is known that CSE1L moves into the nucleus by dephosphorylation and exhibits its function (for example, induction of cell death). As described above, due to the expression of dominant negative KIAA1157 in cancer cells, attenuation of cell death by the anticancer agent was observed when the cells were treated with any anticancer agent of staurosporine or taxol. Since staurosporine and taxol are anticancer agents with different mechanisms of action, attenuation of cell death by both anticancer agents is not due to drug-specific effects, but is thought to be due to cell cycle delay due to expression of dominant negative KIAA1157 .
これら結果からＫＩＡＡ１１５７は脱リン酸化を介してＣＳＥ１Ｌの機能調節を行っていることが強く示唆された。 These results strongly suggested that KIAA1157 regulates the function of CSE1L through dephosphorylation.
（ＫＩＡＡ１１５７に特異的なｓｉＲＮＡによる細胞増殖阻害効果）
ＫＩＡＡ１１５７によりコードされる蛋白質の細胞増殖への関与を、ＫＩＡＡ１１５７の発現を阻害するＫＩＡＡ１１５７特異的ｓｉＲＮＡを用いて検討した。
(Cell growth inhibitory effect by siRNA specific to KIAA1157)
The involvement of the protein encoded by KIAA1157 in cell proliferation was examined using a KIAA1157-specific siRNA that inhibits the expression of KIAA1157.
＜材料と方法＞
ＫＩＡＡ１１５７特異的ｓｉＲＮＡは、配列表の配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＲＮＡおよび配列表の配列番号１８に記載の塩基配列で表されるＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡである（キアゲン社により作製）。対照ｓｉＲＮＡとして、ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｓｉＲＮＡ（キアゲン社製）を用いた。
<Materials and methods>
The KIAA1157-specific siRNA is a double-stranded RNA composed of RNA represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 17 of the sequence listing and RNA represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 of the sequence listing (Qiagen). Produced by). As a control siRNA, non-silencing siRNA (manufactured by Qiagen) was used.
ＨＣＴ１１６細胞を１ウエルあたり細胞数３×１０５になるように１２ウェルプレートに播種した。２４時間後、１２０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡをリポフェクタミン２０００（インビトロジェン社製）を用いて遺伝子導入した。２４時間後に細胞を収穫し、細胞数５０００／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに再播種した（１０連）。また、全ＲＮＡ回収用として１／２倍希釈した細胞を１２ウェルプレートに再播種した。再播種より２４時間後、細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ発色キット（ロシュダイアグノティックス社製）を用いて９６穴プレート中の細胞増殖活性を測定した。一方、１２穴プレート中の細胞よりＲＮｅａｓｙ ９６ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを回収した。得られた全ＲＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドおよび配列表の配列番号２０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、各条件で処理した細胞におけるＫＩＡＡ１１５７の発現を定量した。ＲＴ−ＰＣＲは次の条件で実施した：５０℃ ３０分処理後、９５℃ １５分処理し、９４℃ ２０秒、５８℃ ２０秒、および７２℃ ３０秒からなる工程を４０回行った。 HCT116 cells were seeded in a 12-well plate so that the number of cells was 3 × 10 5 per well. After 24 hours, 120 pmol of siRNA was gene-transferred using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Cells were harvested 24 hours later and replated in 96-well plates at 5000 cells / well (10 reams). In addition, cells diluted 1 / 2-fold for total RNA recovery were replated in a 12-well plate. 24 hours after reseeding, cell proliferation activity in 96-well plates was measured using a cell proliferation ELISA and a BrdU color development kit (Roche Diagnostics). On the other hand, total RNA was recovered from the cells in the 12-well plate using RNeasy 96 kit (manufactured by QIAGEN). Using the obtained total RNA as a template, using the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19 of the Sequence Listing and the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 20 of the Sequence Listing as primers, QuantTect RT-PCR was performed using SYBR Green RT-PCR kit (QIAGEN) to quantify the expression of KIAA1157 in cells treated under each condition. RT-PCR was performed under the following conditions: 50 ° C. for 30 minutes, 95 ° C. for 15 minutes, and 40 steps of 94 ° C. for 20 seconds, 58 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds were performed.
＜結果と考察＞
図７に示したように、ＫＩＡＡ１１５７特異的ｓｉＲＮＡにより細胞数は約１０％減少した。ＫＩＡＡ１１５７特異的ｓｉＲＮＡを導入した細胞におけるＫＩＡＡ１１５７発現量は、対照ｓｉＲＮＡを導入した細胞におけるＫＩＡＡ１１５７発現量の１１．８％にまで抑制されていた。
<Results and discussion>
As shown in FIG. 7, the number of cells was reduced by about 10% by KIAA1157 specific siRNA. The expression level of KIAA1157 in the cells into which KIAA1157-specific siRNA was introduced was suppressed to 11.8% of the expression level of KIAA1157 in the cells into which the control siRNA was introduced.
これら結果から、ＫＩＡＡ１１５７の発現を抑制することにより細胞増殖が抑制されることが明らかになった。 From these results, it was revealed that cell growth is suppressed by suppressing the expression of KIAA1157.
配列番号１：ＫＩＡＡ１１５７遺伝子。
配列番号１：（２８３）．．（６７５）：ＰＰ２Ｃ触媒部位をコードする領域。
配列番号２：ＫＩＡＡ１１５７遺伝子によりコードされる蛋白質。
配列番号２：（９５）．．（２２５）：ＰＰ２Ｃ触媒部位。
配列番号３：ＫＩＡＡ１１５７の塩基配列に基づいて、ＲＴ−ＰＣＲプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４：ＫＩＡＡ１１５７の塩基配列に基づいて、ＲＴ−ＰＣＲプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５：Ｇ３ＰＤＨの塩基配列に基づいて、ＲＴ−ＰＣＲプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：Ｇ３ＰＤＨの塩基配列に基づいて、ＲＴ−ＰＣＲプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：ＫＩＡＡ１１５７の塩基配列に基づいて、ＰＣＲプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：ＫＩＡＡ１１５７の塩基配列に基づいて、ＰＣＲプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号９：ＫＩＡＡ１１５７の塩基配列に基づいて、哺乳類細胞発現用ベクター構築のためのＰＣＲプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０：ＫＩＡＡ１１５７の塩基配列に基づいて、哺乳類細胞発現用ベクター構築のためのＰＣＲプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１１：ドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７蛋白質をコードするＫＩＡＡ５７変異体を作製するためのプライマー用に、ＫＩＡＡ１１５７の塩基配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１２：ドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７蛋白質をコードするＫＩＡＡ５７変異体を作製するためのプライマー用に、ＫＩＡＡ１１５７の塩基配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１３：ドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７蛋白質をコードするＫＩＡＡ５７変異体を作製するためのプライマー用に、ＫＩＡＡ１１５７の塩基配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１４：ドミナントネガティブ型ＫＩＡＡ１１５７蛋白質をコードするＫＩＡＡ５７変異体を作製するためのプライマー用に、ＫＩＡＡ１１５７の塩基配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１５：ＣＳＥ１Ｌの塩基配列に基づいて、ＰＣＲプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１６：ＣＳＥ１Ｌの塩基配列に基づいて、ＰＣＲプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１７：ＫＩＡＡ１１５７特異的ｓｉＲＮＡを作製するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１８：ＫＩＡＡ１１５７特異的ｓｉＲＮＡを作製するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１９：ＫＩＡＡ１１５７の塩基配列に基づいて、ＲＴ−ＰＣＲプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２０：ＫＩＡＡ１１５７の塩基配列に基づいて、ＲＴ−ＰＣＲプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２１：第４番目のスレオニンがリン酸化されているリン酸化ペプチド。
配列番号２１：（４）．．（４）リン酸化。
配列番号２２：第４番目のスレオニンがリン酸化されているリン酸化ペプチド。
配列番号２２：（４）．．（４）リン酸化。
配列番号２３：配列番号２４に記載のアミノ酸配列をコードするＣＳＥ１Ｌ遺伝子。
SEQ ID NO: 1: KIAA1157 gene.
SEQ ID NO: 1: (283). . (675): a region encoding a PP2C catalytic site.
SEQ ID NO: 2: protein encoded by the KIAA1157 gene.
SEQ ID NO: 2: (95). . (225): PP2C catalyst site.
SEQ ID NO: 3: Oligonucleotide designed for RT-PCR primer based on the nucleotide sequence of KIAA1157.
SEQ ID NO: 4: Oligonucleotide designed for RT-PCR primer based on the nucleotide sequence of KIAA1157.
SEQ ID NO: 5: oligonucleotide designed for RT-PCR primer based on G3PDH base sequence.
Sequence number 6: The oligonucleotide designed for RT-PCR primer based on the base sequence of G3PDH.
SEQ ID NO: 7: oligonucleotide designed for PCR primer based on the nucleotide sequence of KIAA1157.
SEQ ID NO: 8: oligonucleotide designed for PCR primer based on the nucleotide sequence of KIAA1157
SEQ ID NO: 9: An oligonucleotide designed as a PCR primer for construction of a vector for mammalian cell expression based on the nucleotide sequence of KIAA1157.
SEQ ID NO: 10: oligonucleotide designed for a PCR primer for constructing a vector for mammalian cell expression based on the nucleotide sequence of KIAA1157.
SEQ ID NO: 11: an oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence of KIAA1157 as a primer for preparing a KIAA57 variant encoding a dominant negative KIAA1157 protein.
SEQ ID NO: 12: oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence of KIAA1157 for a primer for preparing KIAA57 mutant encoding dominant negative KIAA1157 protein.
SEQ ID NO: 13: an oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence of KIAA1157 as a primer for preparing a KIAA57 variant encoding a dominant negative KIAA1157 protein.
SEQ ID NO: 14: an oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence of KIAA1157 for use as a primer for preparing a KIAA57 variant encoding a dominant negative KIAA1157 protein.
SEQ ID NO: 15: oligonucleotide designed for PCR primer based on base sequence of CSE1L
SEQ ID NO: 16: oligonucleotide designed for PCR primer based on the base sequence of CSE1L
SEQ ID NO: 17: oligonucleotide designed to make KIAA1157 specific siRNA.
SEQ ID NO: 18: oligonucleotide designed to make KIAA1157 specific siRNA.
SEQ ID NO: 19: oligonucleotide designed for RT-PCR primer based on the nucleotide sequence of KIAA1157
SEQ ID NO: 20: oligonucleotide designed for RT-PCR primer based on the nucleotide sequence of KIAA1157
SEQ ID NO: 21: phosphorylated peptide wherein the fourth threonine is phosphorylated
SEQ ID NO: 21: (4). . (4) Phosphorylation.
SEQ ID NO: 22: Phosphorylated peptide in which the fourth threonine is phosphorylated.
SEQ ID NO: 22: (4). . (4) Phosphorylation.
SEQ ID NO: 23: CSE1L gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24
Claims (4)
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。 A method for identifying a compound having an activity of inhibiting cell growth, comprising contacting a protein encoded by a DNA selected from the following group with a compound (test compound), and CSE1L (chromosome segmentation gene 1 using the protein) -Like) using a system that uses a signal and / or marker that detects dephosphorylation of the like and detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker , A method of identification comprising determining whether to inhibit dephosphorylation :
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 90% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) DNA encoding a protein having a mutation of one to several nucleotides in the base sequence of DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity; and (4) DNA comprising any one of (1) to (3) above.
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）上記（１）から（３）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ。 A method for identifying a compound having an activity of inhibiting dephosphorylation of CSE1L (chromosome segregation gene 1-like) by a protein encoded by a DNA selected from the following group, comprising the protein and a compound with CSE1L (test sample) Compound) and a system using a signal and / or marker that detects dephosphorylation of CSE1L by the protein and detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker, An identification method comprising the step of determining whether a test compound inhibits dephosphorylation of CSE1L by the protein:
(1) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) DNA encoding a protein having at least 90% homology with DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity,
(3) DNA encoding a protein having a mutation of one to several nucleotides in the base sequence of DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibiting dephosphorylation activity; and (4) DNA comprising any one of (1) to (3) above.
ここで、Ａ群は、
（１）次の群より選ばれるＤＮＡ：（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％以上の相同性を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、（ｉｉｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１ないし数個のヌクレオチドの変異を有し、且つ脱リン酸化活性を示す蛋白質をコードするＤＮＡ、および（ｉｖ）上記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ、
（２）上記（１）のＤＮＡによりコードされる蛋白質、
（３）上記（１）のＤＮＡを含有する組み換えベクター、および
（４）上記組み換えベクターを含有する形質転換体、からなり、
Ｂ群は、
ＣＳＥ１Ｌ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ １−ｌｉｋｅ）をコードするＤＮＡ、ＣＳＥ１Ｌ、該ＤＮＡを含有する組み換えベクター、および該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる。 A reagent kit comprising any one selected from the following group A and any one selected from the following group B:
Here, the A group is
(1) DNA selected from the following group: (i) DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, (ii) DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and at least 90% DNA encoding a protein having the above homology and exhibiting dephosphorylation activity, (iii) mutation of one to several nucleotides in the base sequence of DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing have, and DNA encoding a protein showing a dephosphorylation activity, and (iv) DNA containing either DNA from the (i) (iii),
(2) a protein encoded by the DNA of (1) above,
(3) a recombinant vector containing the DNA of (1), and (4) a transformant containing the recombinant vector,
Group B
It consists of DNA encoding CSE1L (chromosome segregation gene 1-like), CSE1L, a recombinant vector containing the DNA, and a transformant containing the recombinant vector.
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